CN111217902A - 一种鲤鱼胰岛素样生长因子igf3重组蛋白的制备与应用 - Google Patents

一种鲤鱼胰岛素样生长因子igf3重组蛋白的制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种鲤鱼胰岛素样生长因子IGF3重组蛋白的制备与应用，属于生物技术领域中的分子生物学范畴。对福瑞鲤的IGF3蛋白氨基酸序列进行优化，采用全基因合成并通过限制性酶切位点Nde‑HindIII将IGF3插入到表达载体pET30a+中，并通过酶切法和测序确认最终表达载体的准确性，最终分别转到表达菌株中，通过IPTG诱导表达IGF3蛋白，之后通过亲和层析Ni‑IDA树脂纯化IGF3蛋白。获得的重组蛋白经初步验证，可显著影响雌鱼的性腺指数，并影响福瑞鲤脑‑垂体‑性腺轴中的igf3基因的表达水平。可以应用于鱼类等水产动物的遗传育种过程。

Description

一种鲤鱼胰岛素样生长因子IGF3重组蛋白的制备与应用
技术领域
本发明涉及一种鲤鱼胰岛素样生长因子IGF3重组蛋白的制备与应用，应用于水产动物遗传育种领域，属于生物技术领域中的分子生物学范畴。
背景技术
自从igf3基因在鱼类性腺中被发现后，其在鱼类性腺发育中的功能越来越受到关注，人们对鱼类GH-IGFs轴的视角也开始由生长转向生殖。目前，igf3基因仅在少数鱼类和两栖类中被发现，并且igf3 mRNA都是最高表达于性腺组织。研究表明，其对鱼类的精原细胞的增殖与分化、精子发生、促进卵母细胞成熟和促进排卵等方面都有重要作用。
随着生物技术的飞速发展，基因工程技术已经广泛的运用在生物领域。利用基因工程外源表达功能蛋白或一些具有特定功能的蛋白质，是研究基因功能的重要技术手段，在水产动物疾病、营养调控和个体发育中也有广泛应用。重组蛋白目前主要通过外源表达系统获得，并且主要有原核表达系统和真核表达系统两种。原核表达系统是最早应用于外源蛋白表达的生物系统，其过程包括目的基因的克隆、载体与目的基因的连接与转化、诱导后重组蛋白的表达及纯化，进而获得目的蛋白。常见的原核表达细胞主要有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和链霉菌。真核表达系统表达的蛋白或多肽可进行翻译后的加工修饰，包括二硫键的形成、蛋白磷酸化和糖基化等，从而使表达的重组蛋白更接近蛋白自然存在的形式，昆虫、酵母和哺乳动物细胞等表达系统是常见的真核表达系统。不同的表达系统存在不同的优势，与真核表达系统相比，原核表达系统因其成本低廉、技术条件成熟以及蛋白表达量高等优势成为外源蛋白表达的主要手段。
鲤(Cyprinus carpio)是中国主要的淡水养殖鱼类之一，也是常用于研究淡水鱼类内分泌调控的模式生物之一。本发明所用的鲤鱼为新品种福瑞鲤2号。其是以黄河鲤、黑龙江野鲤与建鲤进行3×3完全双列杂交，建立基础群体，然后运用混合模型估算育种值进行选育，经过连续5代选育而获得的。具有生长速度快、成活率高、体型好等稳定遗传性状。但选育获得优良性状的分子机制仍不清楚。本发明率先构建了鲤鱼性腺特异性基因胰岛素样生长因子3的重组表达载体，建立了重组蛋白的制备方法。IGF3重组蛋白在控制鱼类性腺发育方面有很好的潜在应用前景。相关研究目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的是克服上述不足之处，提供一种鲤鱼胰岛素样生长因子IGF3 重组蛋白的制备与应用，从而为探究igf3基因在鱼类生长发育中调控机制提供重要参考，并为相关产品的研制提供基础。
本发明的技术方案，一种鲤鱼胰岛素样生长因子IGF3重组蛋白的制备方法，对福瑞鲤的IGF3蛋白氨基酸序列进行优化，采用全基因合成并通过限制性酶切位点Nde-HindIII将IGF3插入到表达载体pET30a+中，并通过酶切法和测序确认最终表达载体的准确性，最终分别转到表达菌株中，通过IPTG诱导表达IGF3 蛋白，之后通过亲和层析Ni-IDA树脂纯化IGF3蛋白。
进一步地，所述表达载体的制备步骤具体如下：
(1)IGF3基因合成：对福瑞鲤IGF3蛋白氨基酸序列进行优化，并设计引物对，上游引物SEQ ID No.1，下游引物SEQ ID No.2，采用50μL总反应体积进行PCR扩增；
(2)质粒构建：用NdeI-HindIII处理pET-30a+质粒；挑取过夜平板中单菌落，用T7/T7terminator引物进行菌落PCR，摇床培养过夜，将过夜菌液提取质粒，并送测序；阳性菌液用T7terminator引物测序；获得正确质粒；重组质粒使用限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切，得到鲤鱼胰岛素样生长因子IGF3表达载体。
所述上游引物SEQ ID No.1的序列为：5’-TTCCAGGGGC CCCTGGGATC CCCGGAATTCATGCCGTCTG ACGGTATGCC-3’；下游引物SEQ ID No.2的序列为：5’-CGTCAGTCAG TCACGATGCGGCCGCTCGAG TTACAGGGTC CAAACGCTAC-3’。
进一步地，所述表达菌株具体为BL21 plysS(DE3)表达菌株。
采用BL21 plysS(DE3)表达菌株时，载体转化及诱导表达过程如下：将构建好的含有IGF3基因的质粒转化到BL21 plysS(DE3)感受态细胞中，然后均匀涂布到LB平板上，之后倒置于37℃培养箱过夜；从转化的平板中挑选单克隆，接种到LB培养基中，待培养至OD600为0.5-0.8，向试管培养液中加入终浓度 0.1mM IPTG，之后分别置于15℃、37℃诱导表达。
进一步地，纯化蛋白的具体过程为：亲和层析Ni-IDA树脂纯化IGF3蛋白，收集纯度较高菌液，将其加入到处理后的透析袋中，4℃环境下，透析到缓冲液中复性，复性后IGF3蛋白最终透析于储存液6-8h；透析复性结束后，上清用 0.22μm滤器过滤后分装，并将其冻存至-80℃。
本发明的另一技术方案，鲤鱼胰岛素样生长因子IGF3重组蛋白的应用，将其应用于鱼类遗传育种中。
进一步地，将其应用于制备控制鱼类性腺发育的生物制剂。
本发明的有益效果：本发明获得的重组蛋白可显著影响雌鱼的性腺指数，并影响福瑞鲤脑-垂体-性腺轴中的igf3a和igf3b基因的表达水平。可以应用于鱼类等水产动物的遗传育种过程。本发明的技术方法也可在其它鱼类上进行推广应用。
附图说明
图1福瑞鲤igf3基因PCR扩增产物。
1、2：目的基因；M：5000DNA marker。
图2福瑞鲤IGF3重组表达载体结构示意图。
图3重组质粒酶切电泳图。
1：pGEX-6P-1-Igf3 EcoR I/Xho I双酶切；2：质粒DNA；M：5000DNA marker
图4福瑞鲤IGF3蛋白诱导表达结果。
M:SDS-PAGE Protein marker；0:对照；1:15℃诱导16h；2:37℃诱导16h。
图5SDS-PAGE分析IGF3蛋白上清纯化结果。
M:SDS-PAGE蛋白marker；1：全菌破菌离心后上清；2：上清同Ni-IDA 孵育后流出液；3-4：50mM咪唑的洗脱组分；5-7：100mM咪唑的洗脱组分； 8-10：300mM咪唑的洗脱组分。
图6SDS-PAGE分析包涵体中IGF3蛋白纯化结果。
M:SDS-PAGE蛋白marker；1：全菌溶解离心后上清；2：上清同Ni-IDA 孵育后流出液；3-4：50mM Imidazole的洗脱组分；5-7：100mM Imidazole的洗脱组分；8-12：500mMImidazole的洗脱组分。
图7：注射IGF3重组蛋白对福瑞鲤性腺指数的影响
图8：注射IGF3重组蛋白对福瑞鲤igf3a和igf3b mRNA相对表达情况。
EG：实验组；CG：对照组。
图9：注射IGF3重组蛋白后，鲤脑-垂体-性腺轴igf3基因的相对表达量。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步说明，但不构成对本发明的限制。
实施例1福瑞鲤IGF3重组蛋白载体构建
(1)IGF3基因合成：采用密码子优化软件MaxCodonTM Optimization Pr ogram(V13)对福瑞鲤IGF3蛋白氨基酸序列进行优化，并设计引物，上游引物序列为：5’-TTCCAGGGGC CCCTGGGATC CCCGGAATTC ATGCCGTCTG ACGGTATGCC-3’，下游引物序列为：5’-CGTCAGTCAG TCACGATGCG GCC GCTCGAG TTACAGGGTC CAAACGCTAC-3’。采用50μL总反应体积进行P CR扩增，反应体系如表1所示：
表1
模板 1μL
上游引物 1μL
下游引物 1μL
聚合酶(Pfu) 1μL
10×pfu buffer 5μL
10mM dNTP mix 4μL
ddH2O 加至50μL
PCR反应条件为：95℃，5min；95℃，15s，55℃，30s，72℃，1min，25 个循环；72℃，10min，4℃无限长。反应结束后，经1％琼脂糖凝胶电泳，观察到产物大小约为700bp，和预期的大小相符(图1)。
(2)质粒构建：PCR的同时，用NdeI-HindIII处理pET-30a+质粒。重组反应体系如下：PCR回收产物4μL，pET-30a+(线性化载体)3.5μL，重组酶2.5μL。 50℃水浴25min，放置2-3min使温度降低，进行转化及菌液涂布实验，37℃温育过夜。挑取过夜平板中单菌落；用T7/T7terminator引物进行菌落PCR；电泳鉴定阳性克隆；随机选择4个阳性菌用4ml单管37℃摇床培养过夜。将过夜菌液提取质粒，并送测序。阳性菌液用T7terminator引物测序。获得正确质粒。其重组表达载体图谱如图2所示，其中深色为插入片段。重组质粒使用限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳结果显示，双酶切后出现两条条带，一条约为700bp，另一条大小接近载体大小，和预期结果相符合(图3)。将经酶切鉴定后正确的阳性克隆送测序公司进行测序，测序结果与目的序列一致。
实施例2福瑞鲤IGF3蛋白在大肠杆菌系统中表达与鉴定
1、表达载体转化及诱导表达
将构建好的含有IGF3基因的质粒转化到BL21 plysS(DE3)感受态细胞中，然后均匀涂布到LB平板上(含20μg/mL的氯霉素+50μg/mL的硫酸卡那霉素)，之后倒置于37℃培养箱过夜。从转化的平板中挑选单克隆，接种到4mL 的LB培养基中(含20μg/mL的氯霉素+50μg/mL的硫酸卡那霉素)，待培养至OD600为0.5-0.8，向试管培养液中加入终浓度0.1mMIPTG，之后分别置于15℃、37℃诱导表达。
2、SDS-PAGE分析鉴定诱导表达结果
取诱导后的培养液12000rpm离心5min，去除上清液，加入PBS液重悬沉淀，最后加入SDS-PAGE上样缓冲液于100℃下加热样品10min，然后离心取上清电泳。电泳前10min时，100V稳压电泳，待溴酚蓝指示剂进入分离胶后200V稳压电泳至溴酚蓝带迁移至离凝胶底部1cm，取出凝胶用考马斯亮兰染色液染色，随后转入脱色液中，脱色至背景清晰。结果见图4。
1、IGF3蛋白放大培养
培养10L的表达菌，生长至OD600＝0.8时，加终浓度0.1mM IPTG，37℃诱导16h后收集菌体。(如果当天不做纯化操作，将菌体冻于-20℃)。
实施例3福瑞鲤IGF3蛋白纯化
1、上清中亲和层析纯化IGF3蛋白(整个纯化过程在低温下操作)
全菌采用50mM Tris(pH8.0)，150mM NaCl含1％Triton X-100，1ug/mL PepstatinA，1ug/mL Leupeptin超声裂解，同时以50mM Tris(pH8.0)，150mM NaCl缓冲液平衡Ni-IDA亲和层析柱，之后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行SDS-PAGE分析检测。分析结果见图5。经Ni-IDA亲和层析纯化,上清中未获得目标蛋白IGF3，下一步纯化包涵体。
2、全菌通过亲和层析纯化IGF3蛋白
全菌采用50mM Tris(pH8.0)，300mM NaCl，8M Urea，20mM Imidazole,2 mM DTT溶解后，以50mM Tris(pH8.0)，300mM NaCl，8M Urea，20mM Imidazole缓冲液溶解包涵体同时平衡Ni-IDA柱，最后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行SDS-PAGE分析检测。分析结果见图6。
经Ni-IDA亲和层析纯化分析，收集纯度较高的Lane 9-11，将其加入到处理后的透析袋中，4℃环境下，透析到缓冲液[1×PBS(pH 7.4)，4mM GSH，0.4 mM GSSG，2mM EDTA，0.4M L-Arginine]中复性，复性后IGF3蛋白最终透析于储存液1×PBS(pH7.4)，10％Glycerol溶液约6-8h。透析复性结束后，上清用0.22μm滤器过滤后分装，并将其冻存至-80℃。
实施例4福瑞鲤IGF3蛋白质检
1、IGF3蛋白稳定性测试(冻融实验)
取一支分装后冻于-80℃的IGF3蛋白，放置于冰水混合物中待其缓慢融化，融化后无异常现象，说明IGF3蛋白冻融实验是正常的。
2、IGF3蛋白浓度测定
测定蛋白浓度采用Bradford蛋白浓度测定试剂盒，用BSA做标准品。结果为：0.258mg/ml。
3、IGF3蛋白WB检测
WB实验操作流程参考《蛋白质电泳实验技术》郭尧君著，结果见图7。
获得的福瑞鲤IGF3蛋白，融合N-His标签，来源于大肠杆菌表达系统。可溶性目标蛋白IGF3来源于全菌裂解纯化后复性，通过亲和层析纯化获得，浓度: 0.258mg/ml。纯度:>90％，评估来源于R250染色的SDS-PAGE胶，蛋白储存液为1XPBS,10％Glycerol,pH7.4。
实施例4IGF3蛋白对福瑞鲤性腺发育的影响
1、实验方法
养殖实验分为实验组和对照组，每组三个重复，每个重复20尾鱼，福瑞鲤平均体重为108.91±2.42g。实验组按0.1μg/g的剂量注射IGF3重组蛋白，对照组注射等量的PBS，每周注射两次，进行为期60天的养殖试验，采用循环水养殖系统，水温控制在28±1℃，每天投喂三次，每次饱食投喂。实验结束后禁食 24h后采样。
实验结束后，记录每桶鱼的条数，称重，之后进行解剖采样。解剖后采集两侧性腺并称重，计算性腺指数。每组随机挑选18尾鱼(每个重复组6尾，雌雄各3尾)，分别采集每尾鱼的性腺置于离心管中并立即在液氮中冷冻，之后储存在-80℃冰箱中用于基因表达水平的测定；采集脑、垂体用于检测相关基因表达水平的变化。
采用qRT-PCR技术，以β-actin基因作为内参，检测实验组与对照组脑-垂体-性腺轴中的igf3a和igf3b基因的表达水平。采用原平皓(天津)RNA快速提取试剂盒提取福瑞鲤脑、垂体和性腺组织RNA，并使用Takara公司的PrimeSc riptTM RT Master Mix(PerfectReal Time)试剂盒将RNA反转录成cDNA。
使用Bio-Rad公司的CFX96荧光定量系统和Takara公司的
Figure RE-GDA0002461165870000051
Premix ExTaqTMII试剂盒进行荧光定量分析，qRT-PCR反应体系如表2所示：
表2
SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2×) 12.5μL
PCR Forward Primer(10μM) 1μL
PCR Reverse Primer(10μM) 1μL
DNA模板(<100ng) 2μL
dH2O(灭菌蒸馏水) 8.5μL
Total 25μL
采用两步法进行qRT-PCR反应，反应条件是：步骤1：95℃30s，步骤2：95℃5s，60℃30s，40个循环。对所有样本进行3个重复测定，并对每组试验设阴性对照。结果基于3个生物学重复和3个技术重复，目的基因表达量先由内参基因β-actin 进行标准化，采样2-ΔΔCt法测定目的基因mRNA的相对表达水平。所用引物如表3所示：
表3
igf3a F GGCTTGTGTTTCTGAGGCAA
igf3a R TGTGTCAGTGGAAGGATGCTGT
igf3b F AGCAGCGATACCAGAAGCAT
igf3b R GAGTTCCACCGGTAAAGCGT
β-actin F GCTATGTGGCTCTTGACTTCGA
β-actin R CCGTCAGGCAGCTCATAGCT
2、实验结果
如图8所示，实验组雌雄鱼的性腺指数都比对照组低，并且雌鱼的性腺指数显著低于对照组(P<0.05)。
连续注射IGF3重组蛋白60天后，鲤脑-垂体-性腺轴igf3基因的相对表达量如图9所示。在雌鱼中，实验组igf3a mRNA在脑中的表达量最低，在垂体中次之，在卵巢中的表达量最高(图9A)。与对照组相比，实验组在脑和垂体中的表达都无显著性差异(P>0.05)，只在卵巢中的表达量显著性降低(P<0.05)；实验组igf3b mRNA在脑-垂体-性腺轴的表达趋势与igf3a一致，在脑中的表达量最低，在垂体中次之，性腺中的表达量最高，并且三个组织差异显著(P<0.05，图9C)。与对照组相比，实验组在脑和垂体中的表达量虽然有所下降，但是无显著性差异(P>0.05)，只在卵巢中显著性降低(P<0.05)。在雄鱼中，实验组igf3a mRNA在脑中的表达量最低，在垂体中次之，在精巢中的表达量最高(图9B)。与对照组相比，实验组igf3a mRNA在垂体中的表达显著性升高(P<0.05)，在脑和精巢中都显著性降低(P<0.05)；实验组igf3bmRNA也是在脑中的表达量最低，在精巢中次之，在垂体中的表达量最高(图9D)。与对照组相比，实验组在垂体中的表达显著性升高(P<0.05)，在脑和精巢中的表达无显著性差异 (P>0.05)。
序列表
<110> 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心
<120> 一种鲤鱼胰岛素样生长因子IGF3重组蛋白的制备与应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> 上游引物(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
ttccaggggc ccctgggatc cccggaattc atgccgtctg acggtatgcc 50
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> 下游引物(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
cgtcagtcag tcacgatgcg gccgctcgag ttacagggtc caaacgctac 50

Claims (8)

1.一种鲤鱼胰岛素样生长因子IGF3重组蛋白的制备方法，其特征是：对福瑞鲤的IGF3蛋白氨基酸序列进行优化，采用全基因合成并通过限制性酶切位点Nde-HindIII将IGF3插入到表达载体 pET30a+中，并通过酶切法和测序确认最终表达载体的准确性，最终分别转到表达菌株中，通过IPTG诱导表达IGF3蛋白，之后通过亲和层析Ni-IDA 树脂纯化 IGF3 蛋白。
2.如权利要求1所述鲤鱼胰岛素样生长因子IGF3重组蛋白的制备方法，其特征是所述表达载体的制备步骤具体如下：
（1）IGF3基因合成：对福瑞鲤IGF3蛋白氨基酸序列进行优化，并设计引物对，上游引物SEQ ID No.1，下游引物SEQ ID No.2，采用50μL总反应体积进行PCR扩增；
（2）质粒构建：用NdeI-HindIII处理pET-30a+质粒；挑取过夜平板中单菌落，用T7/T7terminator引物进行菌落PCR，摇床培养过夜，将过夜菌液提取质粒，并送测序；阳性菌液用T7terminator引物测序；获得正确质粒；重组质粒使用限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切，得到鲤鱼胰岛素样生长因子IGF3表达载体。
3.如权利要求2所述鲤鱼胰岛素样生长因子IGF3重组蛋白的制备方法，其特征是：所述上游引物SEQ ID No.1的序列为：5’-TTCCAGGGGC CCCTGGGATC CCCGGAATTC ATGCCGTCTGACGGTATGCC-3’； 下游引物SEQ ID No.2的序列为：5’-CGTCAGTCAG TCACGATGCGGCCGCTCGAG TTACAGGGTC CAAACGCTAC-3’。
4.如权利要求1所述鲤鱼胰岛素样生长因子IGF3重组蛋白的制备方法，其特征是：所述表达菌株具体为BL21 plysS (DE3)表达菌株。
5.如权利要求4所述鲤鱼胰岛素样生长因子IGF3重组蛋白的制备方法，其特征是采用BL21 plysS (DE3)表达菌株时，载体转化及诱导表达过程如下：将构建好的含有IGF3基因的质粒转化到BL21 plysS (DE3)感受态细胞中，然后均匀涂布到LB平板上，之后倒置于37℃培养箱过夜；从转化的平板中挑选单克隆，接种到LB培养基中，待培养至OD600为0.5-0.8，向试管培养液中加入终浓度0.1mM IPTG，之后分别置于15℃、37℃诱导表达。
6.如权利要求4所述鲤鱼胰岛素样生长因子IGF3重组蛋白的制备方法，其特征是纯化蛋白的具体过程为：亲和层析Ni-IDA树脂纯化IGF3蛋白，收集纯度较高菌液，将其加入到处理后的透析袋中，4℃环境下，透析到缓冲液中复性，复性后IGF3蛋白最终透析于储存液6-8h；透析复性结束后，上清用0.22μm滤器过滤后分装，并将其冻存至-80℃。
7.鲤鱼胰岛素样生长因子IGF3重组蛋白的应用，其特征是：将其应用于鱼类遗传育种中。
8.根据权利要求7所述鲤鱼胰岛素样生长因子IGF3重组蛋白的应用，其特征是：将其应用于制备控制鱼类性腺发育的生物制剂。
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