RU2094439C1 - Рекомбинантный полипептид pgh(a) с n-концевым аланином - Google Patents
Рекомбинантный полипептид pgh(a) с n-концевым аланином Download PDFInfo
- Publication number
- RU2094439C1 RU2094439C1 SU5052718/13A SU5052718A RU2094439C1 RU 2094439 C1 RU2094439 C1 RU 2094439C1 SU 5052718/13 A SU5052718/13 A SU 5052718/13A SU 5052718 A SU5052718 A SU 5052718A RU 2094439 C1 RU2094439 C1 RU 2094439C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dna
- sequence
- protein
- coding
- bgh
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 52
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 50
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 50
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 title claims abstract description 33
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 title claims abstract description 21
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims abstract description 50
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims abstract description 49
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 34
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims abstract description 30
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 claims abstract 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 claims description 24
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 16
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 47
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 25
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 abstract description 23
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 abstract description 23
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 abstract description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 107
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 76
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 71
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 70
- 238000000034 method Methods 0.000 description 52
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 51
- 235000006109 methionine Nutrition 0.000 description 48
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 47
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 36
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 34
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 29
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 28
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 24
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 23
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 18
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 18
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 16
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 14
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 13
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 12
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 11
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 11
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 9
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 9
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 9
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 8
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 8
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 7
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 7
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 7
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 7
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 6
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 6
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 6
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 6
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 6
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 5
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 5
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 5
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 description 5
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 5
- 235000005772 leucine Nutrition 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 5
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 5
- 101150069452 z gene Proteins 0.000 description 5
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 4
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- ORTFAQDWJHRMNX-UHFFFAOYSA-N hydroxidooxidocarbon(.) Chemical compound O[C]=O ORTFAQDWJHRMNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 4
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 4
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 4
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 3
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 3
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 3
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000932124 Bos taurus Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 2
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 238000011141 high resolution liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 150000002614 leucines Chemical group 0.000 description 2
- 238000007169 ligase reaction Methods 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- YLNWGJKBPYINAK-DKBVGWADSA-N 2-[(z)-[(8s,9s,10s,11s,13s,14s,17r)-17-[(e)-n-(diaminomethylideneamino)-c-(hydroxymethyl)carbonimidoyl]-11,17-dihydroxy-8,9,10,13,14-pentamethyl-6,7,11,12,15,16-hexahydrocyclopenta[a]phenanthren-3-ylidene]amino]guanidine Chemical compound NC(N)=N\N=C/1C=C[C@]2(C)[C@@]3(C)[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(\CO)=N\N=C(N)N)[C@]4(C)[C@]3(C)CCC2=C\1 YLNWGJKBPYINAK-DKBVGWADSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 241000208140 Acer Species 0.000 description 1
- OMNVYXHOSHNURL-WPRPVWTQSA-N Ala-Phe Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 OMNVYXHOSHNURL-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 101100148606 Caenorhabditis elegans pst-1 gene Proteins 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- YAHZABJORDUQGO-NQXXGFSBSA-N D-ribulose 1,5-bisphosphate Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)C(=O)COP(O)(O)=O YAHZABJORDUQGO-NQXXGFSBSA-N 0.000 description 1
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 1
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 239000002714 Extracts of rosemary Substances 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 102000018932 HSP70 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010027992 HSP70 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- JHKXZYLNVJRAAJ-WDSKDSINSA-N Met-Ala Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O JHKXZYLNVJRAAJ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- WYEXWKAWMNJKPN-UBHSHLNASA-N Met-Ala-Phe Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)N WYEXWKAWMNJKPN-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- FMYLZGQFKPHXHI-GUBZILKMSA-N Met-Met-Ala Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O FMYLZGQFKPHXHI-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- VWWGEKCAPBMIFE-SRVKXCTJSA-N Met-Met-Met Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O VWWGEKCAPBMIFE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- DZMGFGQBRYWJOR-YUMQZZPRSA-N Met-Pro Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O DZMGFGQBRYWJOR-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- PYUSHNKNPOHWEZ-YFKPBYRVSA-N N-formyl-L-methionine Chemical group CSCC[C@@H](C(O)=O)NC=O PYUSHNKNPOHWEZ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000724220 Phage M13mp8 Species 0.000 description 1
- 108010064851 Plant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- ZUZINZIJHJFJRN-UBHSHLNASA-N Pro-Phe-Ala Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1NCCC1)C1=CC=CC=C1 ZUZINZIJHJFJRN-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- 102000002278 Ribosomal Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000605 Ribosomal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 108010011559 alanylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 125000004202 aminomethyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000013602 bacteriophage vector Substances 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- -1 dPTF Chemical compound 0.000 description 1
- 238000001085 differential centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 230000001483 mobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- DQCKKXVULJGBQN-XFWGSAIBSA-N naltrexone Chemical compound N1([C@@H]2CC3=CC=C(C=4O[C@@H]5[C@](C3=4)([C@]2(CCC5=O)O)CC1)O)CC1CC1 DQCKKXVULJGBQN-XFWGSAIBSA-N 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 235000021118 plant-derived protein Nutrition 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 229940110294 revia Drugs 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000009645 skeletal growth Effects 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000000856 sucrose gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 108010036387 trimethionine Proteins 0.000 description 1
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
- A23K20/10—Organic substances
- A23K20/168—Steroids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
- A23K20/10—Organic substances
- A23K20/184—Hormones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
- A23K50/10—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for ruminants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
- A23K50/30—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for swines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/27—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Birds (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Использование: биотехнология, сельское хозяйство. Сущность изобретения: из штамма E.coli, предварительно трансформированного рекомбинатным вектором, в котором непосредственно после сайта инициации трансляции, представленного метиониновым кодоном, встроен фрагмент ДНК, кодирующий свиной гормон роста с N-концевым аланином pGH (А), получен без дополнительной обработки полипептид pGH(A), не содержащий на N-конце остатка метионина. 8 ил., 2 табл.
Description
Изобретение относится к pGH(A), полученному путем стадий:
а) культивирования одноклеточного организма, содержащего рекомбинатный вектор, включающий фрагмент ДНК, кодирующий указанный гормон, и
б) выделения указанного гормона из культуры.
а) культивирования одноклеточного организма, содержащего рекомбинатный вектор, включающий фрагмент ДНК, кодирующий указанный гормон, и
б) выделения указанного гормона из культуры.
Экспрессия генов эукариотами и прокариотами, хотя и использует одни и те же основные стадии транскрипции генов в информационную PHK (иPHK) и последующей трансляции этой иРНК в протеины, использует при этом различные совокупности внутриклеточных регуляторов для этих стадий.
Кроме того, у эукариотов многие зрелые протеины сначала транслируются как предпротеины, то есть как полипептиды, содержащие последовательность зрелого протеина, слитую с сигнальной последовательностью. Эукариотная иPHK кодирует полный предпротеин, в котором после трансляции удаляется предпоследовательность и получается "зрелый" протеин. Несмотря на то, что эукариотные клетки снабжены всем необходимым для того, чтобы специальной обработкой превратить такие предпротеины в зрелые протеины, прокариотические клетки в общем случае не способны распознавать сигналы обработки, содержащиеся в эукариотических протеинах. Таким образом, если полные транскрипты комплементарной ДНК (кДНК) эукариотической иРНК используются в качестве ДНК-последовательностей для экспрессии в прокариотах, то получают в результате предпротеин, а не зрелый протеин. Имеется возможность превратить предпротеин в зрелые протеины в лабораторных условиях, но эта стадия требует значительных затрат.
В том случае, когда для экспрессии зрелого протеина в прокариотах используют ДНК-последовательность, кодирующую зрелый протеин, эта последовательность не содержит эукариотических сигналов послетрансляционной обработки. Следовательно, для экспрессии клонированных эукариотических генов или других последовательностей гетерологичной ДНК в прокариотических системах, как было установлено, желательно использовать прокариотические контрольные сигналы ввиду их эффективности и вследствие того, что эукариотические сигналы не могут распознаваться прокариотической клеткой-хозяином.
Термин "гетерологичная ДНК", как он используется в соответствии с настоящим изобретением, означает ДНК, по крайней мере часть которой не содержится в общем случае внутри генома клетки-хозяина. Примеры гетерологичной ДНК включают, но ими не исчерпывается полный список, вирусные и эукариотические гены, фрагменты генов, аллели и синтетические последовательности ДНК. Термин "гетерологичный протеин" или "гетерологичный полипептид" означает здесь протеин или полипептид, по крайней мере часть которого в общем случае не кодируется геном клетки-хозяина.
Прокариотические регуляторные сигналы содержат промотор, который способствует инициации транскрипции, регулирующие трансляцию сигналы, содержащие сайт связывания рибосомы, сигнал начала трансляции и сигнал завершения трансляции. Все эти сигналы, за исключением сигнала завершения трансляции, должны быть расположены перед геном или другой ДНК, которые должны быть экспрессированы.
Известны несколько подходов с целью экспрессии гетерологичной ДНК (например, эукариотических генов) в прокариотах. В соответствии с одним из подходов сегмент ДНК, кодирующий искомый протеин, подвергают лигированию с ДНК, кодирующей полный бактериальный протеин или его некоторую часть под контролем бактериального промото ра. Эндогенная прокариотическая ДНК обязательно содержит также сайт связывания с рибосомой и сигнал начала трансляции. Экспрессия такой лигированной ДНК дает то, что называют протеином слияния, содержащим эукариотический полипептид, связанный с полным или частью бактериального протеина. Выделение эукариотического протеина затем можно осуществлять при помощи ориентированного на определенный сайт ферментного или химического расщепления в сайте слияния.
Примерами опубликованных работ, касающихся получения в бактериях эукариотических протеинов слияния, являются: Европейская патентная заявка N 47600 (опубликованная 17 марта 1982г.), которая относится к протеинам слияния и "однородным" протеином, содержащим бычий предгормон роста или бычий гормон роста ("бГР") на карбокси (С-) конце с порцией прокариотического протеина на амино (N)-конце; патентная заявка Великобритании N 2073245А (опубликованная 14 октября 1981г. ), касающаяся протеинов слияния бГР и β-лактамазы Е. соIi; (Кешент и др. Nucleic Acid Research, 9:19 30 (1981), касающаяся протеина слияния бГР и b-лактамазы Е.coli; Европейская патентная заявка N 95361 (опубликованная 30 ноября 1983г.), касающаяся протеина слияния, содержащего последовательно эндогенный протеин на N-конце, аминокислоту сигнала начала трансляции, сайт расщепления энтерокиназой и экзогенный протеин (например, гормон роста) на C-конце.
Однако преимущества этого подхода оказываются недостаточными ввиду необходимости в последующем расщеплять гетерологичный протеин из эндогенного полипептида в соответствии с описанием, приведенным выше.
В соответствии с другим подходом сигнал начала трансляции, ATG, под контролем бактериального промотора расположен непосредственно перед ДНК-последовательностью, кодирующей гетерологичный (например, эукариотический) протеин. Хотя протеины, полученные при помощи таких генных конструкций, не требуют последующего расщепления для образования искомого протеина, они в общем случае включают метионин (в некоторых случаях формилметионин) на N-конце, так как стартовый сигнал ATG также является кодоном метионина. Таким образом, если целевой зрелый протеин не начинается с метионина, то такой протеин будет иметь N-конец, измененный включением метионинового остатка.
К примерам таких генных конструкций относятся: работа Гарента и др. Cell, (1980), т. 20, с. 543-553, в соответствии с которой ген b-глобина кролика, который обладает N-концевым валином, экспрессируется в Е.coli с использованием только что описанной генной конструкции. В результате исследований ими было установлено, что, в то время, как в b-глобине кролика отсутствует амино-концевой метионин, а лейцины содержатся в позициях 3, 14, 28, 31, 32, в меченом протеине лейцины были обнаружены в позициях 4, 15, 29, 32 и 33, а метионин был найден в позиции I. Этот результат показывает, что этот протеин является b-глобином кролика плюс амино-концевой метионин, которые не удаляются в Е.coli (см. там же, с.546-547).
Другой пример относится к получению гормонов роста в бактериях с использованием описанной выше генной конструкции. Номер и др. Proc. Nat'L Acad. Sci. USA, (1984) т.81, с. 5403-5407 описывают систему с высокой степенью экспрессии в бактерии для получения бГР, которая приводит к получению N-Met бГР, то есть соединения, содержащего аминокислотную последовательность, подобную аминокислотной последовательности одного из встречающихся в природе видов бГР плюс метионин на его N-конце. Присоединение N-концевого метионина к различным видам гормона роста, производимого бактериями, уже обсуждалось в Европейской патентной заявке N 103395, опубликованной 21 марта 1984г.) и Европейской патентной заявке N 74444 (опубликованной 30 марта 1983г.) для бГР Сибургом и др. DNA (1983) т.2, с.37-45, для бГР и свиного гормона роста ("сГР").
Присоединение N-концевого метионина к природному N-концу может быть нежелательным по нескольким причинам. Во-первых, вполне возможно (хотя в настоящее время представляется мало правдоподобным), что метионин имеет тенденцию превращать протеин в антигенный в организме, в котором протеин без N-метионина является эндогенным. Во-вторых, присоединение метионина к N-терминальной части протеина может оказать нежелательный эффект на его биологическую активность или его физические свойства. В-третьих, эта измененная форма протеина может служить препятствием для научных исследований, направленных на определение связи между функцией природного протеина и его структурой.
Способность таких прокариотов, как бактерии удалять N-концевой метионин из протеинов либо во время их получения, либо уже после их получения, привлекает в последнее время большое внимание. Например, Уоллер, J. Mol. Biol. (1963), т. 7, с. 483-496 исследовал состав N-терминальных аминокислот "растворимых" и рибосомальных протеинов их экстракта Е.coli, не содержащего клеток, а в Европейской заявке N 103395 (опубликованной 21 марта 1984г.) предложен способ удаления N-концевого метионина из эукариотического протеина, синтезированного культурой Е.coli. В частности, метионин удаляется из одного из двух упомянутых, производимых бактериями протеинов бГР, причем оба они содержат остаток серина сразу же после содержащегося с самого начала N-концевого метионина. Генная конструкция, которая была использована в этих исследованиях, однако содержала синтетическую стартовую последовательность, кодирующую 5'-метионин-серин-лейцин-3', восстановленную непосредственно рядом с 5'-концом бГР-кодирующей последовательности, в которой предварительно были удалены основания, кодирующие первые 4 или 9 встречающихся в естественных условиях аминокислот. Таким образом, полученный в результате протеин, синтезированный в культуре Е.coli отличался от природного. В патентной заявке Великобритании N 2073245А (опубликованной 14 октября 1981г.) указано, что если met pro заменить ala в зрелом бГР-протеине, то "Met" может быть переработан бактерией таким образом, что в результате получается модифицированный бГР, начинающийся в аминокислотной последовательности Pro Phe Ala Pro.
Таким образом, имеется необходимость в экономическом и предсказуемом средстве для получения в таких микроорганизмах, как бактерии гетерологичных (например, эукариотических) протеинов, которые не содержат N-концевого метионина. Особенно желательно разработать такой способ, в соответствии с которым такие протеины, полученные в бактериях, не требовали бы в лабораторных условиях обработки после ферментации и не содержали бы дополнительного, неприродного N-концевого метионина.
Гормоны роста (называемые также самототропинами) представляют собой полипептиды, продуцируемые и секретируемые клетками гипофиза и в значительной степени видоспецифичные. Наряду с их ролью в ускорении роста скелета, гормоны роста оказывают влияние на многочисленные метаболические процессы, включая стимулирование выделения молока, увеличение высвобождения инсулина из поджелудочной железы и выделения глюкогона, кроме того, они оказывают эффект мобилизации липидов. Экзогенное применение бГР к крупному рогатому скоту, например, приводило к увеличению надоев молока, эффективности корма и/или скорости роста, снижению времени откармливания и увеличению отношения: постная часть мяса/жир. Однако до сих пор не полностью ясно, как этот гормон вызывает столь многочисленные эффекты.
Известно, что бГР (бычий гормон роста) имеет несколько форм. В частности, синтезируется четыре вида бГР, которые отличаются в двух позициях протеина N-концевая аминокислота может варьировать из-за вероятной неоднозначности при удалении сигнальной пептидной последовательности таким образом, что зрелый протеин начинается с NH2-phe-pro, либо с NH2-ala-phe-pro. Кроме того, имеется некоторая неоднородность в аминокислоте 126, которая является либо лейцином, либо валином.
Четыре молекулярные формы (вида) гипофизарного бГР здесь обозначаются и эти обозначения сокращаются следующим образом:
Сокращения Структура
бГР (Л) NH2-phe (I)-pro (2).Leu(126).COOH
бГР (А,Л) NH2-ala (-I)-phe (I) -pro(2). Leu(126).COOH
бГР (В) NH2-phe(I)-pro(2).Val(126).COOH
бГР (A,В) NH2-ala(-I)-phe(I)-pro(2).Val(126).COOH
Миллс и др. (1970) J. Biol. Chem, 245, с.3407-3415, в точности так же идентифицировал два N-концевых фрагмента свиного гормона роста (сГР). В частности, один фрагмент содержал N-концевой фенилаланин, а другой - дополнительный N-концевой аланин. Эти молекулярные формы сГР в дальнейшем коротко обозначаются через сГР(Ф) и сГР(А) соответственно.
Сокращения Структура
бГР (Л) NH2-phe (I)-pro (2).Leu(126).COOH
бГР (А,Л) NH2-ala (-I)-phe (I) -pro(2). Leu(126).COOH
бГР (В) NH2-phe(I)-pro(2).Val(126).COOH
бГР (A,В) NH2-ala(-I)-phe(I)-pro(2).Val(126).COOH
Миллс и др. (1970) J. Biol. Chem, 245, с.3407-3415, в точности так же идентифицировал два N-концевых фрагмента свиного гормона роста (сГР). В частности, один фрагмент содержал N-концевой фенилаланин, а другой - дополнительный N-концевой аланин. Эти молекулярные формы сГР в дальнейшем коротко обозначаются через сГР(Ф) и сГР(А) соответственно.
Полные ДНК-кодирующие последовательности и соответствующие аминокислотные последовательности для бГР(Л) и сГР(Ф) были опубликованы Сибургом и др. DNA(1983), 2, с.37-45 и эта работа используется здесь в качестве ссылки.
Целью настоящего изобретения является получение в бактериях аланиновой формы свиного гормона роста pGH(A), не содержащей дополнительного N-концевого метионина и свободной от формы с phe на N-конце. При этом осуществляют следующие стадии:
а) культивирования одноклеточного организма, содержащего рекомбинантный вектор, включающий фрагмент ДНК, кодирующий указанный гормон, и
б) выделения указанного гормона из культуры.
а) культивирования одноклеточного организма, содержащего рекомбинантный вектор, включающий фрагмент ДНК, кодирующий указанный гормон, и
б) выделения указанного гормона из культуры.
На приведенных фигурах штриховым контуром изображена кодирующая последовательность ДНК бактериального промотора, зачерненный контур представляет кодирующую последовательность гетерологичной ДНК, черточками изображены дополнительные кодирующие последовательности ДНК (они конкретно указаны на рисунках), а направленная стрелка указывает на ориентацию от 5' и 3' кодирующих последовательностей ДНК. Указаны также соответствующие сайты рестрикции эндонуклеаз. Отмеченные области ДНК приведены только с целью наглядного представления и они не связаны с реальными размерами этих областей.
На фиг.1 представлена конструкция M13mp8/Xbal, содержащая вектор M13mp8, имеющий вставленный в сайт рестрикции Sma I сайт рестрикции Xbal.
На фиг. 2 представлена конструкция M13mp 8/BG Hex-I, содержащая M13mp8/Xbal, несущую кодирующую бГР(Л) последовательность ДНК.
На фиг.3 представлена конструкция кодирующей бГР(А,Л) последовательности ДНК, полученная при помощи сайт-направленного мутагенеза.
На фиг. 4 представлена конструкция кодирующей бГР(А,B) последовательности ДНК, полученной при помощи сайт-направленного мутагенеза.
На фиг. 5 представлена конструкция M13mp9/PG Hex-I, содержащая M13mp 9 и кодирующую сГР(Ф) последовательность ДНК.
На фиг. 6 представлена конструкция кодирующей сГР(А) последовательности ДНК, полученной при помощи сайт-направленного мутагенеза.
На фиг. 7 представлена конструкция pBGH , соответствующая pBGHex-I, в которой сайт рестрикции EcoRI, расположенный по направлению вверх от 5' - конца кодирующей ptrp последовательности ДНК, был предварительно удален.
На фиг. 8 представлена конструкция вектора экспрессии pMON 3213, содержащего вектор pBGHex-I, несущий кодирующую сГР(А) последовательность ДНК вместо кодирующей бГР(Л) последовательности ДНК.
Настоящее изобретение представляет важный способ получения в прокариотах гетерологичного полипептида такого, как эукариотический (например, млекопитающего или птиц) протеин, который содержит N-концевой аланин. Таким образом, непосредственно получают полипептид без N-концевого метионина, что исключает необходимость в обработке предшественника в лабораторных условиях. Устойчивое получение такого полипептида без N-концевого метионина, не содержащегося в исходно кодирующей последовательности гена, является новым и совершенно неожиданным результатом.
Настоящее изобретение представляет весьма эффективный способ получения существенно чистых протеинов, которые имеют N-концевой аланин. К таким протеинам относятся без каких-либо ограничений упомянутые виды бычьего и свиного самототропина и его варианты, растительные протеины, а именно, малая субъединица рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы, S-трансфераза глутатиона и протеин 70 теплового шока. Кроме того, настоящее изобретение можно эффективно использовать для получения других полипептидов, когда желательно иметь на N-конце аланин, а не метионин.
До сих пор во всех работах, посвященных экспрессии бГР и сГР в бактериальных клетках, в которых N-конец содержит N-концевую аминокислотную последовательность, гомологичную встречающимся в природе бГР, описано присутствие N-концевого метионина.
В статье Сибурга и др. DNA (1983) 2, с.37-45, на с.44 указано, что последовательность гена для N-концевых фенилаланиновых видов бГР, например бГР(Л), умышленно выбирается для экспрессии в культуре E.coli частично, чтобы избежать ожидаемого присоединения второй гидрофобной аминокислоты (метионина) к гидрофобному N-концевому аланину. Таким образом, доступные до настоящего времени исследования указывают на наличие N-концевого метионина в синтезированных бактериями видах ГР.
Как это более подробно описано в примерах реализации настоящего изобретения, подход заявителя с целью получения с ГР(А) или pGH(A) в бактериях, если очень коротко, заключается в следующем. Кодирующие вышеупомянутые протеины последовательности ДНК получают при помощи сайт-направленного мутагенеза последовательностей ДНК, кодирующих бычьи и свиные виды самототропина, содержащие N-концевой фенилаланин, как это показано на фиг. 3, 4 и 6. Затем полученные последовательности вставляют в векторы экспрессии таким образом, что окончательная последовательность содержит последовательно промотор, сайт связывания с рибосомами, стартовый кодон ATG (метионин), непосредственно примыкающий к последовательности ДНК, кодирующей pGH(A), и, наконец, стоп-кодон трансляции. Культуру E.coli затем подвергают трансфекции полученным вектором экспрессии, несущим искомую последовательность гена, и культивируют при условиях, которые позволили бы осуществить экспрессию искомой гетерологичной ДНК, и получить тем самым искомый гетерологичный протеин. Затем полученные таким образом протеины анализируют с точки зрения анализа их последовательности и соответствующей биологической активности.
Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением устанавливается что, когда ДНК-последовательность, содержащая стартовый кодон (метионин), а затем сразу же кодоны гетерологичного N-аланилового полипептида, подвергаемого экспрессии, то протеин, выделенный из прокариотического организма, действительно содержит аланин на N-конце, а не метионин. Представляется правдоподобным, что аналогичный результат может быть получен, если этот аланиновый кодон расположен вслед за примерно тремя соседними метиониновыми кодонами, которые включают сигнал начала трансляции иРНК, кодирующей целевой полипептидный продукт. Например, ДНК, включающая этот сигнал начала трансляции и кодоны целевого полипептидного продукта, может включать любую последовательность, которая соответствующим образом кодирует met ala, met met ala, met met met ala или любой его функциональный эквивалент.
В предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения три различных штамма E. coli K12, каждый из которых был депонирован в Американской коллекции Типов Культур, Роквил, Мерилэнд, под номерами ATCC 39936, 53010 и 53009 соответственно обладают способностью удалять N-концевые метионины в том случае, когда после вышеупомянутых N-концевых метионинов следует сразу же аланин.
Это открытие представляется значительным, так как оно дает способ получения в прокариотах гетерологичных полипептидов, которые содержат N-концевые аланины.
В одном из предпочтительных вариантов осуществления способа, являющегося предметом настоящего изобретения он используется для получения двух видов бГР, бГР(А,Л) и бГР(А,В), и особенно одного вида сГР(А), которые не содержат других бычьих и свиных протеинов и/или сГР видов соответственно. В частности, этот способ обеспечивает получение pGH(A), как одного единственного вида.
В соответствии с одной из своих самых широких реализаций настоящее изобретение представляет собой углубление в использовании технологии рекомбинантной ДНК с целью непосредственного получения в прокариотах гетерологичных полипептидов.
Таким образом, описание настоящего изобретения предполагает знакомство с основными приемами, которые используются в технологии рекомбинантной ДНК с целью изоляции и клонирования последовательностей ДНК, кодирующих полипептид, с перераспределением или изменением клонированных последовательностей ДНК и экспрессией клонированных или модифицированных последовательной ДНК в трансформированных микроорганизмах. С приемами знаком любой специалист в этой области техники (например, Молекулярное клонирование. Лабораторное Руководство, под ред. Маниатиса и др. 1982г.).
Выделение или/и конструирование гетерологичной ДНК
В соответствии с одним из воплощений настоящего изобретения ДНК-последовательность, кодирующую искомый гетерологичный полипептид, подлежащий продуцированию в прокариоте, выбирают и выделяют, или ДНК-последовательность, которая его кодирует, конструируют или синтезируют химически. Во многих важных вариантах воплощения таким полипептидом является эукариотический протеин. Если полипептид является небольшим и известна полная аминокислотная последовательность, то можно построить синтетическую ДНК-молекулу или последовательность, кодирующую этот полипептид. Если аминокислотная последовательность полипептида неизвестна или ее размеры слишком велики для того, чтобы практически реализовать синтез соответствующей ДНК-последовательности, можно получить последовательность кДНК при помощи обратной транскрипции из соответствующей иРНК, полученной из тканей или клеток, экспрессирующих этот полипептид. Например, в одной из реализаций настоящего изобретения такая последовательность для бГР может быть получена из бычьих гипофизов при помощи известных в настоящее время приемов, описанных Гудмэном и др. в Методах Ферментологии, т.68, с.75-90 (1979). В качестве альтернативы кДНК-последовательность может быть получена из иРНК, выделенной из клеток, трансформированных геномной ДНК, выделенной из нативного генного белка при помощи соответствующего зонда. Геномная ДНК может быть также модифицирована в различных векторных системах таким образом, что ДНК может быть экспрессирована в прокариотах. Эти приемы известны каждому специалисту в этой области техники.
В соответствии с одним из воплощений настоящего изобретения ДНК-последовательность, кодирующую искомый гетерологичный полипептид, подлежащий продуцированию в прокариоте, выбирают и выделяют, или ДНК-последовательность, которая его кодирует, конструируют или синтезируют химически. Во многих важных вариантах воплощения таким полипептидом является эукариотический протеин. Если полипептид является небольшим и известна полная аминокислотная последовательность, то можно построить синтетическую ДНК-молекулу или последовательность, кодирующую этот полипептид. Если аминокислотная последовательность полипептида неизвестна или ее размеры слишком велики для того, чтобы практически реализовать синтез соответствующей ДНК-последовательности, можно получить последовательность кДНК при помощи обратной транскрипции из соответствующей иРНК, полученной из тканей или клеток, экспрессирующих этот полипептид. Например, в одной из реализаций настоящего изобретения такая последовательность для бГР может быть получена из бычьих гипофизов при помощи известных в настоящее время приемов, описанных Гудмэном и др. в Методах Ферментологии, т.68, с.75-90 (1979). В качестве альтернативы кДНК-последовательность может быть получена из иРНК, выделенной из клеток, трансформированных геномной ДНК, выделенной из нативного генного белка при помощи соответствующего зонда. Геномная ДНК может быть также модифицирована в различных векторных системах таким образом, что ДНК может быть экспрессирована в прокариотах. Эти приемы известны каждому специалисту в этой области техники.
После того, как получена гетерологичная ДНК-последовательность, содержащая кодоны искомого полипептида, может оказаться желательным осуществить некоторые модификации в нуклеотидной последовательности этой молекулы. Например, если эта молекула была получена при помощи обратной транскрипции из матрицы иРНК, то она будет часто содержать по крайней мере часть ДНК, кодирующую главную последовательность предпротеина. Таким образом, необходимо удалить всю ДНК главной последовательности перед первым кодоном искомого протеина. В некоторых случаях может оказаться необходимым добавить или включить кодон аланина взамен другого кодона в начале последовательности, кодирующей искомый протеин, если он еще имеет кодона N-концевого аланина. Затем вводят сигнал начала трансляции (который также является кодоном метионина) перед и непосредственно рядом с кодоном аланина. Несмотря на то, что комплекс стартовый сигнал/кодон метионина будет в общем случае и в предпочтительном варианте нуклеотидной последовательности ATG, последовательность GTC может также иногда служить в качестве комплекса стартовый сигнал/кодон метионина. Кроме того, присутствие более одного кодона метионина, например, двух, трех, и может быть еще большего количества соседних кодонов метионина, необходимо рассматривать как незначительную модификацию в рамках способа, предлагаемого в соответствии с настоящим изобретением.
По крайней мере один сигнал прекращения трансляции должен быть введен после кодона-C-концевой аминокислоты, если его там не было до этого. Примерами сигналов прекращения трансляции являются дезоксинуклеотидный триплет TAA, TGA, TAG. Таким образом, по существу, применяются методы рекомбинантной ДНК с целью конструирования последовательности рекомбинантной ДНК, содержащей последовательно сигнал начала трансляции/кодон метионина, кодоны для искомого полипептида с кодоном N-концевого аналина, примыкающим к стартовому сигналу, и по крайней мере один сигнал прекращения трансляции, примыкающий к кодону C-концевой аминокислоты.
Было установлено, что эффективной экспрессии иРНК могут препятствовать вторичные структуры, образованные водородом, связывающим две комплементарные серии нуклеотидов внутри иРНК. Исключение этих комплементарных последовательностей, в частности, в той части молекулы, которая кодирует N-конец, упрощает связывание рибосом с иРНК и, следовательно, увеличивает степень экспрессии. Может оказаться, следовательно, желательным заменить кодоны, которые участвуют в образовании таких вторичных структур, кодонами той же аминокислоты, но состоящими из другого нуклеотидного триплета (см. ЕП N 75444, опубликованный 30 марта 1983, Сибург и др. 1983, DNA 2, с.37-45, и Шонер и др. 1984, Proc. Nat'l. Acad Sci.USA, 81, с.5403-5407).
Другие подходы к построению гетерологичных последовательностей ДНК будут очевидны каждому специалисту в этой области техники. Например, если имеется в распоряжении молекула ДНК, которая кодирует полипептид, который подвергается экспрессии N-концевой структурой типа NH2-met-X-y. где x является аминокислотой, отличной от аланина, то кодон аланина может быть вставлен между комплексом сигнал начала трансляции/кодон метионина и кодоном для x. В качестве альтернативы, кодон для x может быть изъят, а кодон аланина вставлен вместо него. Таким образом, при помощи способа, являющегося предметом настоящего изобретения, получили бы протеин, имеющий N-концевую структуру NH2-ala-x-y, или NH2-ala-y, соответственно.
В точности так же можно осуществить удаления, добавления и/или замены в любом из кодонов аминокислоты внутри данной последовательности гена таким образом, что при помощи способа, являющегося предметом настоящего изобретения, можно осуществить экспрессию вариантного полипептида. "Вариантный" полипептид, содержит один или несколько аминокислотных пробелов, замен и/или добавлений по сравнению с встречающейся в природе аминокислотной последовательностью данного полипептида. Примеры таких вариантов включают (но ими не ограничивается весь список) е бГР/Л и е бГР(В), в которых аминокислотная последовательность этих вариантных видов бГР идентична бГР(Л) и бГР(В) соответственно полученным при помощи бычьих гипофизарных клеток, за исключением присутствия дополнительного метионина на N-конце. Эти вариантные полипептиды получают как имеющие аминокислотную последовательность, существенно такую же, что и аминокислотная последовательность встречающегося в природе полипептида, если только биологическая активность не снижается до недопустимого предела. Конструирование и экспрессия вариантных полипептидов может оказаться желательной для того, чтобы добиться более значительного накопления, более высокой стабильности протеина, чтобы упростить стадию очистки полипептида и/или оптимизировать его биологическую активность.
Описанные выше модификации молекулы ДНК, кодирующей целевой полипептид, могут быть осуществлены с использованием ферментов рестрикции, экзонуклеаз, эндонуклеаз и т. д. при помощи приемов, известных в этой области техники. Можно также использовать общие приемы сайт-направленного мутагенеза с тем, чтобы осуществить вышеуказанные модификации в структуре или последовательности молекулы ДНК, эти приемы также известны каждому специалисту в этой области техники. См. например, Золлер Смит (1982) Nac. Acids. Res. т.10, с. 6487-6500; Золлер и Смит (1983) Meth.Enzymol. 100, с.468-500, Норрис и др. (1983) Nuc. Acids. Res. т.11, с.5103-5112.
В соответствии с известными приемами технологии рекомбинантных ДНК после того, как получена искомая последовательность гетерологичной ДНК, далее эту последовательность вставляют в соответствующий клонирующий вектор, который обеспечивает средство для репликации ДНК-последовательности. При этом можно использовать любой подходящий клонирующий вектор в предпочтительном варианте, содержащий маркерную функцию, например, плазмидные векторы E.coli, которые содержат Col EI Херифилд и др. Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, (1974), т. 71, с.3455, pEP322; Боливар и др. Gene, (1977), т.2, с.95, pBP325; Себерон и др. Gene, (1978), т.4, с.122, и pkc7; Рао и др. Gene (1979), т.7 с.79; и векторы бактериофага E.coli, которые включают λL 47.1, Шарон, Лоенен и др. Gene, (1980), т.10, с.249; и M13mp8 и M13m p9, Мессинг и др. Gene (1982), т. 19, с. 269. Общие приемы введения вышеупомянутой последовательности ДНК в клонирующий вектор с целью создания рекомбинантного вектора известны каждому специалисту в этой области техники. См. например, книгу "Молекулярное клонирование Лабораторное Руководство", под ред. Маниатиса, и др. 1982 г.
После того, как получены несколько копий искомой последовательности гетерологичной ДНК, эти последовательности можно выделить из рекомбинантных векторов и вставить в систему экспрессии с целью получения и выделения целевого гетерологичного протеина в соответствии с описанием, которое более детально дано ниже. Перед вставкой этих последовательной ДНК в вектор экспрессии можно осуществить различные модификации последовательности гетерологичной ДНК при помощи приемов, известных каждому специалисту в этой области техники, при помощи известных приемов модификации можно также осуществить уже после вышеупомянутой вставки.
В примерах реализации настоящего изобретения наряду с M13mp9, описанным Мессингом и др. Gene (1982), т.19, с.269, а качестве клонирующего вектора был выбран M13mp8, описанный там же, модифицированный таким образом, чтобы он содержал сайт рестрикции Xbal, как это указано на фиг. 1. Векторы M13mp8 и M13mp9, которые вместе именуются как "векторы M13", позволяют изолировать рекомбинантные векторы как в двухнитевой или репликативной форме (РФ), так и однонитевой форме ДНК. Изоляция рекомбинантных векторов РФ ДНК упрощает последующее введение искомых последовательностей ДНК после репликации в векторы экспрессии, как это показано например, на фиг. 8. В качестве альтернативы изоляция однонитевой формы этих рекомбинантных векторов упрощает как изоляцию рекомбинантных векторов, которые содержат искомую последовательность ДНК с правильной 5' --> 3' ориентацией для экспрессии, так и построение любой модификации последовательности ДНК при помощи таких приемов, как сайт-направленный мутагенез, как это показано на черт. 2, 4 и 6. Кроме того, эти векторы M13 могут "согласовывать" фрагменты ДНК или гены длиной до 4 килооснований (кб), которые обеспечивают клонирование типичной, полной, эукариотической генетической последовательности.
Маркерная функция, используемая в векторах M13, как это описано Мессингом и др. Gene, (1982), т.19, с.269, включает фермент β галактозидазу. В частности, искомую последовательность гетерологичной ДНК вставляют во фрагмент lac z гена, который содержится на векторе M13, что нарушает нормальную комплектацию фрагмента lac z гена, содержащегося на векторе M13, частичным фрагментом lac z гена, содержащегося в хромосомной ДНК клетки-хозяина (например, jMIOI E. coli), так, что вышеупомянутый хозяин уже не способен включать в обмен веществ лактозу, содержащуюся в среде для роста бактерий E.coli после инфицирования векторами M13, которые не содержат инородной генетической последовательности, вставленной во фрагмент lac z гена, способны включать в обмен веществ лактозу, содержащуюся в среде для выращивания бактерий, и вырабатывают характерные голубые бляшки, если эти бактерии выращиваются на агаре, включающем среду I x YT, содержащую 0,8% (в/о) триптона, 0,5% (в/о) экстракта дрожжей, 0,5% (в/во) NaCl и цветовой индикатор для b галактозидазы. Когда бактерии растут на вышеупомянутой среде, бляшки E. coli после инфицирования рекомбинантными векторами, несущими вставленную последовательность гетерологичной ДНК в генном фрагменте lac z вектора M13, прозрачны или бесцветны. Следовательно, положительная вставка последовательности гетерологичной ДНК в эти клонирующие векторы устанавливается в результате образования бесцветных бляшек инфицирования клетки-хозяина E.coli рекомбинантным вектором. Вставка последовательностей ДНК, кодирующих бГР(Л) и сГР(Ф), в векторы М13 представлена на фиг. 2 и 7, соответственно.
В предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения последовательности ДНК, кодирующие бГР(Л) и сГР(Ф), содержащиеся на бактериальных плазмидах pBGHex-I и pPGHex-I соответственно, как это описано у Сибурга и др. DNA (1983), 2(1), с. 37-45, выделяют из этих плазмид при помощи рестриктазы в специальном сайте. Необходимо отметить, что бактерии после трансфекции бактериальными плазмидами pBGHex-I или pPGHex-I соответственно и последующего культивирования при условиях, которые позволяют получить экспрессию последовательностей, кодирующих бГР(Л) и сГР(Ф) соответственно продуцируют соматотропин с N-концевым метионином (например, met-бГР(Л)met-сГР(Ф) соответственно). Соответствующие последовательности затем вставляют в РФ ДНК модифицированного вектора М13mp8 (M13mp8/Xbal) и вектора М13mp9, как это показано на фиг. 2 и 5, соответственно. Вставка искомых последовательностей ДНК бГР(Л) и сГР(Ф) и РФ ДНК M13mp8/Xbal и М13mp9 подтверждалась при помощи рестрикционного анализа, как это снова показано на фиг. 2 и 5 соответственно jMIOI E.coli затем подвергают трансфекции одним из этих рекомбинантных векторов, как это описано Мессингом и др. Methods in Enzymology (1983), т.101, с. 20, и однонитевую ДНК рекомбинатных векторов изолируют в соответствии с описанием, данным Мессингом и др. Gene (1982), т.19, с.269. Соответствующие абзацы этих работ Мессинга и др. используются здесь в качестве ссылок.
После выделения различные однонитевые ДНК этих рекомбинантных векторов модифицируют при помощи сайт-направленного мутагенеза с тем, чтобы получить кодирующие последовательности ДНК для бГР(А,В), бГР(А,Л), бГР(В) и сГР(А). В частности, бГР(Л) модифицируют добавлением кодона аланина, например, GCC, на 5' конце кодирующей бГР(Л) последовательности, как это показано на фиг. 3. Следует ожидать, что таким образом можно добавлять любой из четырех кодонов аланина. Предпочтительным кодоном аланина для оптимального выхода соматотропина в системе экспрессии, используемой в соответствии с настоящим изобретением, является GCC. Подтверждение присоединения кодона аланина при конструировании кодирующей бГР(А, Л) последовательности достигается в результате анализа полной последовательности ДНК бГР(А,Л) или ее 5'-конца с использованием метода Сэнгера и др. Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, (1077), т.74, с.5468.
Кодирующая бГР(А,В) последовательность конструируется при помощи сайт-направленного метагенеза кодирующей бГР(А, Л) последовательности, как это показано на фиг. 4, при помощи превращения кодона лейцина в аминокислотной позиции 127 [в бГР(А,Л)] в кодон валина, например, GTG. Снова можно ожидать, что при таком превращении можно использовать любой кодон для валина. Правильность конструкции кодирующей бГР(А,В) последовательности снова подтверждается при помощи анализа результирующей кодирующей бГР(А,В) последовательности.
Кодирующая бГР(В) последовательность, которая проявляется в синтезе протеинов met-бГР(В) бактериями после трансфекции векторами экспрессии, содержащими кодирующую бГР(В) последовательность, конструируется аналогично при помощи сайт-направленного мутагенеза кодирующей бГР(Л) последовательности при помощи превращения кодона лейцина в аминокислотной позиции 126[бГР(Л)] в кодон валина, например, GTG.
Конструирование кодирующей сГР(А) последовательности при помощи сайт-направленного мутагенеза кодирующей сГР(В) последовательности осуществляют в точности так же, как это показано на фиг. 6 и описано более полно ниже, а правильность конструкции подтверждается анализом последовательности ДНК.
После выделения и конструирования искомых последовательностей гетерологичной ДНК по аналогии с примерами для бГР(А,Л), бГР(А,В) и сГР(А), эти последовательности могут быть подвернуты репликации и получены многочисленные копии в результате амплификации соответствующих рекомбинантных векторов с использованием приемов, известных каждому специалисту в этой области техники, и которые уже были указаны выше. Такие последовательности гетерологичной ДНК могут быть вставлены в любые подходящие векторы экспрессии с целью продуцирования в прокариотах искомых гетерологичных полипептидов.
Получение полипептидов с N-концевым аланином.
Как уже было указано выше, подходящий вектор экспрессии должен содержать необходимые сигналы транскрипции и трансляции с целью получения гетерологичного протеина в выбранной клетке-хозяине вместе с маркерной функцией для идентификации тех векторов экспрессии, в которых были вставлены искомые последовательности гетерологичной ДНК. При помощи использования прокариотического вектора экспрессии последовательности рекомбинантной ДНК могут быть добавлены к генетическому комплементу прокариотического организма через трансдукцию, трансформацию или трансфекцию (все эти приемы в дальнейшем именуются одним термином "трансфекция") и затем вышеупомянутый организм можно культивировать при условиях (которые в общем случае диктуются используемыми промоторами и хозяином), которые стимулируют продуцирование целевого полипептида. Таким образом, "геномные" ДНК организмов, используемых в соответствии с настоящим изобретением, содержат как хромосомную ДНК, так и эписомную ДНК.
Известно несколько векторов экспрессии для экспрессии гетерологичного гена и продуцирования гетерологичного протеина в прокариотической клетке-хозяине, они известны теперь каждому специалисту в этой области техники.
В одном из предпочтительных вариантов воплощения настоящего изобретения использовали экспрессии pBGHex-I, см. Сибург и др, DNA (1983), 2 (1), с. 37-45, и модифицированный вектор pBGHex-I.
Вектором экспрессии pBGHex-I является бактериальная плазмида pBR322, несущая ген для бГР(Л). Этот ген содержит последовательно триптофановый промотор (ptrp), последовательность Шайн-Дольгарно, комплекс стартовый сигнал трансляции ATG /кодон метионина, примыкающий непосредственно к кодирующей последовательности N-концевого фенилаланина, первую аминокислоту полипептида бГР(Л), кодирующую бГР(Л) последовательность и стоп-кодон трансляции. Маркерной функцией на векторе экспрессии pBGHex-1 является устойчивость к антибиотику. В частности, pBGHex-1 несет два гена устойчивости к антибиотику, один ген устойчивости к ампициллину (ampr и второй устойчивости в тетрациклину (tetr), которые переносят специфическую устойчивость к антибиотику чувствительной к другим антибиотикам клетке-хозяину, стабильно трансформированной вектором экспрессии. Таким образом, стабильные трансформированные клетки могут быть выбраны по росту в среде, содержащие либо тетрациклин, либо ампициллин, либо оба этих антибиотика.
В примере реализации настоящего изобретения при получении вектора экспрессии pMON3213, несущего кодирующую сГР(А) последовательность вместо кодирующей бГР(Л) последовательности, использовали pBGH , содержащий вектор pBGHex-1, модифицированный при помощи удаления сайта рестрикции E.coRI, расположенного вверх 5' конца кодирующей ptrp последовательности. Полученный в результате вектор pBGH содержит только один сайт E.coRI, как это показано на фиг. 7. Замена кодирующей бГР(Л) последовательности на кодирующую последовательность сГР(А) в pBGHex-I с целью создания вектора экспрессии pMON3213 представлена на фиг. 8. Далее вышеупомянутой смесью трансформировали культуру E. coli и трансформированные клетки отбирали по росту в содержащей антибиотик среде. Плазмиды экспрессии, содержащиеся в трансформированных бактериях, затем анализировали на присутствие кодирующих сГР(А) последовательностей при помощи ферментов рестрикции.
Продуцирование бГР(А,Л), бГР(А,В) или сГР(А) в культуре E.coli осуществляли в результате трансформации либо E.coli W3110, либо E.coli E392, E.coli штамма 294, которые депонированы под номерами ATCC 39936, 53010 и 53009, соответствующим вектором экспрессии, используя приемы, которые более подробно описаны ниже. Трансформированные клетки E.coli W3110 затем культивируют при условиях, которые позволяют осуществить экспрессию генов соматотропина и продуцирование искомых гетерологичных полипептидов.
Очистка полученного гетерологичного пептида будет зависеть как от типа протеина, так от клетки-хозяина. Было, например, замечено, что гетерологичные протеины, полученные в такой бактерии, как E.coli очень часто осаждаются внутри клетки в форме "преломляющих" тел. Здесь используют термин "преломляющий" ввиду того, что эти тела можно действительно наблюдать с использованием фазово-контрастного микроскопа. Способ, который используют для выделения гетерологичных протеинов в биологически активной форме, описан в Европейской патентной заявке N 114506 (опубликованной 1 августа 1984г.), которая здесь используется в качестве ссылки. Очень коротко, этот способ очистки содержит концентрирование клеток-хозяев, лизирование этих клеток с целью получения экстракта или гомогената клеток и, наконец, выделение преломляющих тел при помощи дифференциального центрифугирования: все эти стадии хорошо известны каждому специалисту в этой области техники. Выделенные преломляющие тела растворяют в сильном денатурирующем средстве таком, как хлоргидрат гуанидина и солюбилизированный протеин, затем подвергают реакции обмена в подходящем растворителе (например, мочевине), подвергают очистке при помощи хроматографии и, наконец, биологической активности, то есть заставляют принять их активную конфигурацию, а затем окисляют так, чтобы сохранить эту конфигурацию, поддерживая дисульфидные связи между их цистеиновыми остатками, как описано в Европейской патентной заявке N 114506. Более детальное описание такой очистки гетерологичных протеинов дано в двух одновременно находящихся в стадии рассмотрения патентных заявках США, одной, поданной С.Б. Сторрсом и озаглавленной "Способ солюбилизации соматотропинов", и второй, поданной Л. Э. Бентлом, С.Б.Сторрсом и Дж. Митчелом и озаглавленной "Способ натурализации соматотропина", которые здесь используются а качестве ссылок. Две вышеупомянутые одновременно находящиеся на стадии рассмотрения патентные заявки США и настоящая заявка поданы от имени фирмы Монсанто Компани. Последующая очистка гетерологичного полипептида с целью его освобождения от загрязняющих бактериальных протеинов может быть осуществлена с использованием известных методов хроматографии таких, как гелевая фильтрация или ионообменная хроматография. В общем случае полученная в результате очистки композиция будет содержать по массе от примерно 90% до примерно 99,5% N-аланинового полипептида и от примерно 0,5% до примерно 10% протеина, родственного бактерии или другому прокариотическому хозяину, в котором полипептид был синтезирован.
Было установлено, что в общем случае по крайней мере примерно 80% гетерологичного пептида, экспрессированного по способу настоящего изобретения, имеет N-концевую структуру типа NH2-ala. Оставшийся полипептид в общем случае имеет метиониловую форму и содержит N-концевую структуру типа NH2-met -ala. Однако варьируя условия роста и/или время индукции экспрессии гена можно увеличить долю полипептида с аланином на N-конце до по крайней мере 95% и даже больше.
В особенности предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения соматотропиновые полипептиды, продуцированные и выделенные в соответствии с описанием, приведенным выше, как было показано, проявляют биологическую активность, подобную активности соматотропина; этот факт был установлен при помощи анализа реакции рецептора печени кролика, осуществленного в соответствии с описанием, приведенным Пушима и Фризеном, J. Clin. Endocrinol. Metab. (1973), т.37, с. 334-337, и биоанализа на прирост веса крыс. В соответствии с последним анализом биоактивности соматотропинов, продуцированных клетками E.coli, определялись относительно известной партии соматотропина (например, бычьего или свиного гипофизарного соматотропина), связывая прирост веса крыс с удаленными гипофизами с изменением количества вводимого соединения. В частности, титрованные дозы (от 0 до 60 мкг) неизвестного или стандартного источника соматотропина вводились крысам с удаленными гипофизами (95 135 г) в форме инъекций на основе ежедневной дозы в течение 7 и более дней. Используя множественную регрессию, составляли регрессионное уравнение для прироста веса тела животных, получающих известные и неизвестные партии гормона, в зависимости от логарифмических доз. Наклоны контролировали с тем, чтобы гарантировать непараллелизм и обеспечить пересечение полученных множеств. Биоактивности представляли в виде отношения наклонов, умноженного на активность стандарта.
Приводимые ниже примеры служат иллюстрацией предпочтительных вариантов воплощения настоящего изобретения и их не следует рассматривать в качестве его ограничения. Несмотря на то, что настоящее изобретение было описано в связи с предпочтительными вариантами его воплощения, каждому специалисту в этой области техники ясно, что на основе приведенного выше патентного описания можно осуществить различные модификации, не выходя за область, охватываемую формулой изобретения.
Микроорганизмы и плазмиды.
Следующие микроорганизмы могут быть получены из Американского Собрания Типов Культур (ATCC), 12301 Парклаун Драйв, Роквилл, Мериленд, 20652, США:
ATCC 38835 E.coli W3110
ATCC 53010 E.coli LK392
ATCC 53009 E.coli W3110 штамм 294
ATCC 53024 E.coli W3110/pMO N 3209/
ATCC 53022 E.coli W3110/pMO N 3215/
ATCC 53023 E.coli W3110/pMO N 3213/
Эти депонированные организмы могут быть получены после выдачи патента США подателю настоящей заявки, фирме Монсанто Компани. Эти депонированные организмы будут доступны после выдачи любого патента США по патентной заявке, для которой будет установлен приоритет по дате подачи настоящей заявки. Однако следует иметь в виду, что доступность депонированного организма не дает право на лицензию с целью реализации целей настоящего изобретения, умаляющего патентные права заявителя, гарантированные патентными законодательствами. Кроме того, настоящее изобретение не ограничивается теми микроорганизмами, которые были депонированы, так как депонированные организмы только иллюстрируют предмет настоящего изобретения.
ATCC 38835 E.coli W3110
ATCC 53010 E.coli LK392
ATCC 53009 E.coli W3110 штамм 294
ATCC 53024 E.coli W3110/pMO N 3209/
ATCC 53022 E.coli W3110/pMO N 3215/
ATCC 53023 E.coli W3110/pMO N 3213/
Эти депонированные организмы могут быть получены после выдачи патента США подателю настоящей заявки, фирме Монсанто Компани. Эти депонированные организмы будут доступны после выдачи любого патента США по патентной заявке, для которой будет установлен приоритет по дате подачи настоящей заявки. Однако следует иметь в виду, что доступность депонированного организма не дает право на лицензию с целью реализации целей настоящего изобретения, умаляющего патентные права заявителя, гарантированные патентными законодательствами. Кроме того, настоящее изобретение не ограничивается теми микроорганизмами, которые были депонированы, так как депонированные организмы только иллюстрируют предмет настоящего изобретения.
Пример 1. Все олигонуклеотиды синтезировали в отделе Биологических наук фирмы Монсанто, используя синтезаторы ДНК фирмы Апплайд Биосистемз, в соответствии с процедурой, преложенной производителем, фирмой Апплайд Биоситемз Инк, Фостер Сити, Калифорния, ферменты рестрикции и ферменты, модифицирующие ДНК, были получены от фирмы Нью Инглэнд Биолэбо (Беверли, Массачусетс), от фирмы Нью Ниглэнд Нюклса, (Бостон, Массачусетс) и от фирмы Бетесда Рисеч Лабораториз (БРЛ) (Гайтерсбург, Мэриленд), Линкер Xbal получали от фирмы Коллаборэтив Рисеч, Инк. (Лексингтон Массачутес), ДНК лигазу Т4 получали от фирмы БРЛ (Гайтерсбург, Мэрилэнд), Днк-лигазу Т4 получали от фирмы Нью-Ниглэнд Биолюбо (Беверли, Массачутес). Меченые 32P нуклеотиды получали от фирмы Амернэм (Арлингтон Хайтс, Иллинойз). Фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I E. coli получали от фирмы Нью Инглэнд Нюклеа (Бостон, Массачутесе), vMIOI E. coli получали от доктора Джо Мессинга, Университет Миннесоты (Сент Паул, Миннесота).
Расщепление рестриктазами реакции ДНК-лигазы Т4 и фрагмента Кленова ДНК полимеразы I Ecoli могут быть осуществлены в соответствии с приемами, предложенными производителями этих препаратов. Предпочтительными буферами для описываемых ниже ферментов рестрикции являются следующие: для Xbal: 100 мМ NaCl, 50 мМ трис, pH 7,5, 10 мМ MgSO4, для PeoPl, Hind III и Sma 1:50 мМ NaCl, 10 мМ Трис, pH 7,5, 10 мМ MgSO4.
Реакцию ДНК-лигазы Т4 осуществляли в буферах, содержащих 25 мМ Трис, pH 8,0, 10мМ MgCl2, 10 мМ дитиотриола (ДТТ), 2 мМ спермидина и 0,2 мМ АТФ. Фрагмент Кленова ДНК полимеразы I E.coli использовали в буфере, содержащем 20 мМ Трис, pH 7,2 10 мМ MgCl2, 10 мМ (ДТТ), 1 мМ АТФ и 1 мМ каждого ДАТФ, дГТФ, дПТФ, дГТФ. Если необходимо было получить меченую, вновь синтезированную нить ДНК, то в реакции Кленова добавляли комплекс альфа 32P-ДАТФ (400 Ки/ммоль).
Меченые олинуклеотиды получали с использованием гамма-32P-АТФ (уд.акт. более 5000 Ки/ммоль) и ДНК-киназы Т4 в 100 мМ Трис, pH 8,0, 10 мМ MgCl2, 5 мМ ДТТ.
Плазмиды, несущие последовательности ДНК, кодирующие бГР(Л) и сГР (pBGHex-I и pPGHex-I соответственно), были получены от фирмы Генетек Инк, Сан-Франциско, Калифорния. Эти плазмиды могут быть получены в соответствии с описанием, приведенным в Европейской патентной заявке N 75444 (опубликованной 30 марта 1983 г.); Сибург и др. DNA (1983), 2(1), с. 37-45; Геддел и др. Nature (1979), т. 281, с. 544-548; Деббер и др. книга "Промоторы: Структура и функция (1982), редакторы: м. Дж. Чемберлин и Р. Родригес. Гл. 293; Миоццери и Янофски, J. Bacteriol (1978), т.133, с. 1457-1466; и Розенберг и Курт Annual Revia of Genetics т.13, с. 319-353.
M13mp8 и M13mp9 были получены от доктора Джо Мессинга из Университета Миннесоты (сент Паул, Миннесота).
Все компоненты среды для выращивания бактерий и антибиотики получали либо от фирмы Сигма (сент Луис, Мо), либо от фирмы Дифко Лабораториз (Дейтрот, Мичиган).
Пример 2. Приводимые ниже примеры иллюстрируют конструирование кодирующих последовательностей ДНК, которые в результате экспрессии обеспечивают прямое продуцирование в бактерии полипептидов, содержащих N-концевой аланин. В частности, кодирующие последовательности ДНК конструировали таким образом, что комплекс начало трансляции/кодон метионина (ATG) содержится непосредственно перед кодоном аланина (например, GCC). Эти три кодирующие последовательности, содержащие бГР(А, Л), бГР(А,В) и сГР(А), конструировали при помощи сайт-направленного мутагенеза в ранее выделенных последовательностях ДНК соматотропина.
а. Конструирование кодирующей бГР(А,Л) последовательности ДНК.
Последовательность ДНК, кодирующую соматотропин бГР(Л), выделяли из pBGHex-I, как Xba I-фрагмент и клонировали в сайт Xbal модифицированного вектора M13mp8 (M13mP8/Xbal). Конструкция вектора M13mp8/Xbal, который содержит линкер Xbal в исходном сайте Smal, представлена на фиг.1. Как показано на фиг. 2 Xbal отщепляет на одном из концов кодирующую бГР(Л) последовательность ДНК, "вырезая" таким образом полную кодирующую бГР(Л) последовательность. Плазмиду pBGHex-I после обработки ферментом Xbal смешивали в присутствии ДНК-лигазы Т4 с РФ ДНК M13mP8/Xbal, линеаризованной при помощи расщепления ферментом рестрикции Xbal, и обрабатывали щелочной фосфатазой из кишечника крупного рогатого скота. Затем смесь инкубировали в течение ночи при температуре 14oC. Обработка щелочной фосфатазой из кишечника крупного рогатого скота предотвращает рециркуляризацию вектора M13mP8/Xbal. Вставку кодирующей бГР(Л) последовательности ДНК в вектор M13mP8/Xbal с целью образования рекомбинантного вектора M13mP8/BGHex-I первоначально контролировали образованием бесцветных бляшек на культуре бактерий, jMIOI E.coli, выращиваемой на среде I x УТ, используя процедуру покрытия мягким агаром, описанную в книге "Молекулярное клонирование: лабораторное руководство", ред. Маниатис и др. (1982), с. 64, который содержит 10 μл 100 мМ МПТТ (изопропил-β-D-тиогалактопиранозида) и 50 mл 2% (в/о) X-GAL (5-бром-4-хлор-3-индолио-β-D галактопиранозида) в 3 мл верхнего агара, и осуществляли трансфекцию вышеупомянутым рекомбинантным вектором, как это было описано выше. Вставку кодирующей бГР(Л) последовательности подтверждали при помощи рестрикции изолированной РФ-формы ДНК, "Молекулярное клонирование: лабораторное руководство", Маниатис и др. (ред.) (1982 г.), гл. 3, рекомбинантного вектора ферментом Xbal, в результате чего получали фрагмент в 590 пар оснований, содержащий вставленную последовательность. Фрагмент в 590 пар оснований идентифицировали при помощи электрофореза на агаровом геле в однопроцентном (в/о) агаре в соответствии с описанием, приведенным в книге "Молекулярное клонирование: лабораторное руководство", Маниатис и др. (ред.), (1982). Все последующие фрагменты после обработки ферментами идентифицировали именно при помощи этой процедуры. Ориентацию вставленных кодирующих бГР(Л) последовательностей контролировали при помощи рестрикции рекомбинантного вектора ферментами Smal и Hind III. Если кодирующие последовательности находятся в правильной 5'-->3' ориентации, в результате расщепления этими ферментами рестрикции должны получить фрагмент в 207 пар оснований. Выделение однонитевой ДНК фага проводили в соответствии с процедурой, предложенной Мессингом и др. Gene(1982), т. 19, с. 269. Затем вектор M13mp8/BGHex-I использовали в качестве матрицы в сайт-направленном мутагенезе по существу в соответствии с описанием, данным Золлером и Смитом, Nucl. Acids. Res. (1982), т. 10, с. 6487-6500; Золлером и Смитом Methods in Enzymol (1983), т. 100, с. 468-500; Норрисом и др. Nuc. Acids. Res. (1983), т. 11, с. 5103-5112, которые используются здесь в качестве ссылок.
На фиг. 3 приведена диаграмма процедуры мутагенеза при конструировании кодирующей бГР(А,Л) последовательности ДНК из кодирующего бГР(Л) последовательности. Если очень коротко, то олигонуклеотидную затравку (смотри табл. 1), содержащую последовательность для искомой мутации, используют для синтеза затравки копии замкнутой кольцевой ДНК матрицы M13mp8/BGHex-I однонитевой ДНК. Полученные таким образом замкнутые кольцевые молекулы двунитевой ДНК отделяли от неполных и однонитевых колец ДНК при помощи центрифугирования в градиенте щелочной сахарозы, как это описано Золлером и Смитом, Methods in Enzymol. (1983), т. 100, с. 468-500. Замкнутые кольцевые молекулы двунитевой ДНК затем использовали для трансформации VM101 E.co1i в соответствии с описанием, данным Мессингом и др. Gene (1982) т. 19, с. 269-276 и полученные в результате бесцветные бляшки переносили на фильтры Палл, полученные от фирмы Палл Ультрафайн Фильтреш Корп, и анализировали путем гибридизации с меченой 32P формой олигонуклеотидной затравки, использованной для осуществления мутагенеза в специальном сайте. Перенос вышеупомянутых бляшек осуществляли в соответствии с методами, описанными производителем фильтром Пэлл. Анализ путем гибридизации осуществляли с использованием нейлоновых фильтров Вилдайн, которые описаны фирмой Пэлл Ультрафайн Вильтрошн Корпорешн (Гленн Коув, Нью-Йорк), "Описательное Руководство для переноса ДНК на Нейлоновые фильтры Пэлл Виодайн ТМ" (1983). Фильтры промывали при увеличивающихся температурах до тех пор, пока не исчезнет радиоактивный сигнал с контрольного фильтра, который приготавливали с использованием фага M13mp8/BGHex-1. Общий протокол промывки фильтров включает промывку при комнатной температуре в 6хSS C/0,9H NaCl и 0,09 М цитрата натрия в течение десяти минут, затем промывку при температуре 50oC в 6хSSC в течение пяти минут и последующие промывки при увеличении температуры на 5oC. Бляшки, которые гибридизировались с меченой радиоактивным элементом олигонуклеотидной затравкой при температурах более высоких, чем контрольные фаги, рассматривали, как несущие новую созданную кодирующую бГР(Л) последовательность и их называли в дальнейшем потенциально положительными. В качестве альтернативы отдельные бесцветные бляшики отбирали из культуры трансформированных клеток jМФ01 E.coli и выращивали в 5 мл среды 2 х УТ (1,6%) (в/о) триптона, 1,0% (в/о) экстракта дрожжей, 0,5% (в/о) NaCl в течение ночи при температурах 37oC в условиях аэрации. ДНК фага, полученную в соответствии с описанием, данным Мессенгом и др. Gene (1982), т. 19, с. 289, затем наносили пятнами на нитроцеллюлозу, подвергали гибридизации с затравкой, меченой радиоактивным элементом, и промывали при увеличении температуры, как это было описано выше. ДНК фага, которые имели температуры гибридизации выше, чем контрольные бляшки M13mp8/BGHex-I, также называли потенциально положительными. Потенциально положительные бляшки из обеих процедур анализа выращивали в соответствии с описанием, приведенным выше, использовали для получения однонитевой ДНК фага, последовательность которой затем анализировали в соответствии с процедурой Сэнгера и др. Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, (1977), т. 74, с. 5463, с тем, чтобы подтвердить, что они действительно несут кодирующую сГР(А, Л) последовательность. РФ ДНК M13mp8/BGHex-I(ala) также анализировали при помощи ферментов рестрикции Hae II с тем, чтобы убедиться в присоединении кодона анализа после комплекса стартовый сигнал/кодон метионина ATG, так как при создании кодона аланина образуется дополнительный сайт рестрикции Hae III.
Вероятность присоединения кодона аланина к кодирующей бГР(Л) последовательности ДНК составляет примерно 2%
б. Конструирование кодирующего сГР(А) последовательности ДНК
Здесь также использовали сайт-направленный мутагенез для того, чтобы присоединить кодон аланина к кодирующей сГР(Ф) последовательности ДНК, описанной Сибургом и др. DNA (1983, 2(1), с. 37-45. Процедуру мутагенеза в соответствии с диаграммой, представленной на фиг. 8 осуществляли следующим образом.
б. Конструирование кодирующего сГР(А) последовательности ДНК
Здесь также использовали сайт-направленный мутагенез для того, чтобы присоединить кодон аланина к кодирующей сГР(Ф) последовательности ДНК, описанной Сибургом и др. DNA (1983, 2(1), с. 37-45. Процедуру мутагенеза в соответствии с диаграммой, представленной на фиг. 8 осуществляли следующим образом.
Кодирующую сГР(Ф) последовательность ДНК в 590 пар оснований, содержащуюся на плазмиде pPGHex-I, выделяли на этой плазмиде при помощи расщепления ферментами рестрикции E. coRI и Hind III, которые расщепляют плазмиду на 5'-3'-концах кодирующей сГР(Ф) последовательности соответственно, как это показано на фиг. 7. Расщепленную плазмиду pPGHex-I затем смешивали с РФ ДНК M13mp9, также после рестрикции ферментами EcoRI и Hi nd III, но дополнительно обработанной щелочной фосфатазой из кишечника крупного рогатого скота, с тем, чтобы предотвратить повторное лигирование рестрикционных фрагментов M13mp9. Затем в вышеупомянутую смесь добавляли ДНК-лигазу Т4. Благодаря наличию липких концов на РФ ДНК фага и кодирующей сГР(Ф) последовательности ДНК, образованных при использовании двух различных ферментов рестрикции, ДНК сГР(Ф) может быть селективно вставлена в РФ ДНК фага и может быть вставлена в правильной 5'-->3' ориентации, как это показано на фиг. 7. Затем осуществляют трансформацию jMIOI E.coIi в соответствии с описанием, приведенным выше для M13mp8/BGHex-I, причем рекомбинантный вектор M13mp9/PGHex-I несет кодирующую сГР(Ф) последовательность ДНК. Затем трансформированные jMIOI E. coIi выращивали на среде I х УТ, содержащей колориметрические реагенты, и выбор осуществляли по образованию бесцветных бляшек, как это было уже описано выше. Вставку кодирующих сГР(Ф) последовательностей ДНК подтверждали следующим образом. Выбирали бесцветные бляшки, а РФ ДНК M13mp9/PGHex-I, выделенную в соответствии с описанием, приведенным выше, затем расщепляли ферментами EcoRI и Hind III и подвергали электрофорезу на агаровом геле, в результате чего получали фрагмент в 590 пар оснований, содержащий вставленную ДНК сГР(Ф). Затем фаг M13mp9/PGHex-I размножали в jMIOI E.coIi, а ДНК фага выделяли в соответствии с описанием, приведенным выше.
Далее ДНК M13mp9/PGHex-I использовали в качестве матрицы для сайт-направленного мутагенеза, как это показано на фиг. 8, в соответствии с описанием, приведенным выше при конструировании кодирующей бГР(А, Л) последовательности, используя специальную затравку (смотри табл. 1). Вероятность присоединения кодона аланина, в данном случае GCC, к кодирующей сГР(Ф) последовательности составила примерно 12% Полученную в результате кодирующую сГР(Ф) последовательность снова исследовали при помощи анализа ДНК-последовательности.
Пример 3. Служит иллюстрацией способа конструирования рекомбинантных векторов экспрессии, которые обеспечивают прямое продуцирование в бактериях полипептидов, содержащих N-концевой аланин. С помощью сконструированных векторов получают три полипептида соматотропина видов бГР(А,Л), бГР(А,В) и сГР(А). Для сравнения используют прямое получение met-бГР(В) и met-(бГР(А).
а) Экспрессия кодирующей сГР(А) последовательности ДНК.
Как показано на фиг. 10, кодирующую сГР(А) последовательность, содержащуюся на рекомбинантном векторе M13mp9/PGHex-I (ala) использовали для того, чтобы заменить кодирующую бГР(Л) последовательность ДНК, содержащуюся на модифицированном векторе экспрессии pBGHex-I. Модифицированный вектор экспрессии pBGH , содержит вектор экспрессии pBGHex-I, в котором сайт рестрикции EcoRI, расположенный вверх от промотора триптофана (ptrp), был удален (смотри фиг. 9). Модифицированный вектор экспрессии pBGH , конструировали при помощи частичного расщепления ферментом EcoRI pBGHex-I с последующей обработкой нуклеазной SI с тем, чтобы удалить липкие концы.
Вектор pBGHex-I после рестрикции подвергали рециркуляризации (замыканию) с использованием ДНК-лигазы Т4 и затем использовали для трансформации культур E.coli M101; все это осуществляли в соответствии с описаниями, приведенными ранее. ДНК плазмиды из каждой из колоний затем анализировали на присутствие фрагмента EcoRI/Hind III в 590 пар оснований, несущего кодирующую сГР(А) последовательность, и фрагмента EcoRI/Pst 1 в 1050 пар оснований, несущего последовательность Ptrp (смотри фиг. 9). Удаление этого сайта рестрикции EcoRI упрощает вставку в специальный сайт последовательности, кодирующей сГР(А), в вектор экспрессии pBGHex-I в правильной ориентации, как это описано на фиг. 10. Рекомбинантный вектор экспрессии, полученный таким образом, в дальнейшем обозначается pMON3213. Смесь, содержащую pMON3213, далее использовали для трансформации культуры E.coli W 3110, затем трансформированные клетки выращивали и подвергали селекции. Культура E.coli W3110, содержащая pMON3213, депонирована под номером ATCC 53023. Замену кодирующей бГР(Л) последовательности кодирующей сГР(А) последовательностью в векторе экспрессии pBGH , подтверждали при помощи выделения ДНК pMON3214 и последующей рестрикции вышеупомянутого вектора экспрессии ферментами EcoRI и Hind III с тем, чтобы получить в результате фрагмент в 590 пар оснований, а расщепление ферментом Hae III должно показать присутствие дополнительного рестрикционного фрагмента Hae III, который образуется из-за присутствия кодона аланина в кодирующей сГР(А) последовательности ДНК. Окончательное подтверждение присутствия кодирующей сГР(А) последовательности ДНК в векторе экспрессии pMON3213 получали при помощи частичного анализа последовательности фрагмента EcoRI/Hind III в 590 пар оснований.
Экспрессию кодирующей сГР(А) последовательности ДНК и продуцирование сГР(А) в культуре E.coli W3110 осуществляли при помощи традиционных приемов. Были получены высокие концентрации протеинов в 22000 Да, что устанавливали при помощи анализа ДСН/ПАГЭ.
Бактерии, несущие плазмиды экспрессии pMON3209, pMON3214, pBGHex-1 и pMON3215, хранили следующим образом. Каждую колонию культуры E.coli W3110, трансформированную при помощи только одной плазмиды (pMON3209 или pMON3215, pMON3214 или PBGHex-I), выращивали в течение ночи при температуре 37oC в 5 мл БЛ плюс 12,5 μл/мг тетрациклина при аэрации. Порцию в 1 мл каждой культуры после выращивания в течение ночи добавляли отдельно в индивидуальные колбы, содержащие 25 мл БЛ плюс 12,5 мг/мл тетрациклина и выращивали до достижения ОП600= 1,0. Затем клетки из каждой колбы собирали центрифугированием при ускорении 6000 x g при температуре 4oC в течение 5 мин. Осадки отдельно суспендировали снова в 12 мл БЛ плюс 7,5% (в/о) ДМСО и очень быстро замораживали на сухом льду порциями в 1 мл. Далее клетки хранили в холодильнике с жидким азотом. Кроме того, примерно 10 мкм очищенной ДНК плазмиды хранили при температуре -80oC.
Клетки E.coli 3110, несущие вектор экспрессии pMON3213, хранили и далее использовали для получения в больших количествах сГР(А) ферментацией в 10-100-литровых емкостях. Содержание протеина с ГР(А) в реакторе ферментации емкостью 100 л составило приблизительно 1г/л бульона, это факт устанавливали при помощи радиоиммуноанализа Рознера и др. J. Immunol. Methods (1982), т. 52, с. 175-181.
Пример 4. Этот пример осуществляли с тем, чтобы определить N-концевую аминокислотную последовательность гетерологичных протеинов бГР(А,Л), бГР(А, В), met-бГР(АБ), met-бГР(Л) и сГР(А), полученных при помощи бактерий.
Соматотропиновые полипептиды, синтезированные в культуре E.coli, подвергали очистке из неочищенных, солюбилизованных тел включения, содержащих один из бГР(А, Л), бГР(А,В), met-бГР(В), met-бГР(Л) или бГР(А) при помощи иммуносорбентной хроматографии в соответствии с описанием, данным Криви и Роулдом, Hybridoma (1984), т. 3, с. 151-161.
Все три вида соматотропина, очищенные при помощи иммуносорбентной хроматографии, как оказалось, имели чистоту, превышающую 95% этот факт был установлен при помощи анализа ДНС-ПАГЭ с использованием 1 мг очищенного протеина на геле с градиентом 7,5-15% осуществленного в соответствии с процедурой, описанной Лаеммли, Nature (1970), т. 227, с. 680-685.
Концентрации протеинов очищенных видов бГР определяли при помощи известного анализа с использованием высокоразрешающей жидкостной хроматографии.
Протеины, очищенные при помощи хроматографии, основанной на принципе иммунного средства, для использования в анализе на N-концевую последовательность подвергали диализу для полного удаления воды, а затем подвергали лиофилизации. Перед выполнением анализа N-концевой последовательности очищенные протеины снова суспендировали в буфере бикарбоаната аммония, содержащего 50 мМ бикарбоната аммония плюс 0,1% (в/о ДСН и подвергали диализу против того же буфера с тем, чтобы удалить остаточные трис/оксиметил/аминометил/трис/и глицерин. Затем использовали анализатор последовательностей Протеинов Модели 470А фирмы Эпплайд Биосистемз (фирма Эпплайд Тиосистема, Инж. Фостер Сити, Калифорния) для анализа всех N-концевых последовательностей, как это описано Ханкапиллером и др. (1983), Methods in Enzymol. т. 91, с. 486-493.
В табл.2 приведены результаты анализа последовательностей для нескольких препаратов полипептидов бГР(А,Л), бГР(А,В), met-бГР(В), met-бГР(Л) и сГР(А). Количество протеина с N-концевым метионином приведено в процентах от общего содержания соматотропина в пробе. Для определения количества метионина использовали два метода. При помощи непрямого метода количество NH2-met-ala-phe в преобладающей популяции NH2ala-phe. вычисляли, исходя из различий в lag-сигналах. Так как эта процедура зависит от некоторой оценки "нормальной" последовательности lag, которая изменяется от цикла к циклу, она является лишь весьма грубой оценкой для содержащейся последовательности NH2-ala-phe. Прямой метод, содержащий реакцию молекулярной леградации Эдмана, заключается в сравнении мощности сигналов от РТН-met до РТН-ala после отделения pTH-met от химического шума с использованием высокоразрешающей жидкостной хроматографии (ВРЖХ). "РТН" обозначен фенил-тиохидантоин. В частности, реакция последовательной деградации по Эдману заключается во взаимодействии N-концевой аминокислоты с реагентом, который отщепляет эту аминокислоту, и в ее последующем высвобождении в форме РНТ-производиного этой аминокислоты. Последняя процедура будет давать хорошие оценки в для met-ala-phe. в том случае, если загрязнение свободной аминокислоты является низким.
Как показывают результаты относительно N-концевой последовательности, представленные в табл. 2, нет никаких очевидных признаков отщепления метионина, если после N-концевого метионина следует фенилаланин. Однако 80% и более молекул, продуцированных генетическими конструкциями МВ (А,Л) и МВ(А,В), имеют аланин на N-конце, а не метионин. Степень отщепления N-концевого метионина варьирует в клетках от ферментации, но всегда составляет не менее 80% от всех молекул соматотропина. Кроме того, уровни продуцирования и приблизительно 10-15% от общего количества бактериального протеина были достигнуты для соматотропина, синтезированного в трансформированных микроорганизмах.
Claims (1)
- Рекомбинантный полипепдит pGH(A) с N-концевым аланином, непосредственно полученный в штамме бактерий Escherichia coli, трансформированном рекомбинантной плазмидной ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид pGH(A) и расположенную сразу после сайта инициации трансляции, представленного кодоном для метионина, с мол.м. 22000 Дальтон, не содержащий дополнительного остатка метионина на N-конце.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US06/704,362 US4861868A (en) | 1985-02-22 | 1985-02-22 | Production of proteins in procaryotes |
US06/824,202 US5037806A (en) | 1985-02-22 | 1986-02-04 | Biologically active method using somatotropins |
US824202 | 1986-02-04 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU4830848/13A Division RU2072393C1 (ru) | 1985-02-22 | 1990-08-20 | Способ получения рекомбинантного полипептида со свойствами свиного гормона роста |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2094439C1 true RU2094439C1 (ru) | 1997-10-27 |
Family
ID=27107310
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU4830848/13A RU2072393C1 (ru) | 1985-02-22 | 1990-08-20 | Способ получения рекомбинантного полипептида со свойствами свиного гормона роста |
SU5052718/13A RU2094439C1 (ru) | 1985-02-22 | 1992-08-03 | Рекомбинантный полипептид pgh(a) с n-концевым аланином |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU4830848/13A RU2072393C1 (ru) | 1985-02-22 | 1990-08-20 | Способ получения рекомбинантного полипептида со свойствами свиного гормона роста |
Country Status (22)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5037806A (ru) |
EP (1) | EP0193515B1 (ru) |
JP (3) | JP2583214B2 (ru) |
KR (1) | KR920000849B1 (ru) |
CN (3) | CN1051302A (ru) |
AT (1) | ATE141327T1 (ru) |
AU (2) | AU596575B2 (ru) |
CA (1) | CA1338981C (ru) |
DE (1) | DE3650553T2 (ru) |
DK (1) | DK80886A (ru) |
ES (1) | ES8801851A1 (ru) |
GR (1) | GR860509B (ru) |
HU (1) | HU210671B (ru) |
IE (1) | IE80663B1 (ru) |
IL (4) | IL77950A (ru) |
LT (1) | LT3916B (ru) |
MX (1) | MX9203728A (ru) |
NO (1) | NO300551B1 (ru) |
NZ (1) | NZ215260A (ru) |
PT (1) | PT82070B (ru) |
RO (1) | RO106956B1 (ru) |
RU (2) | RU2072393C1 (ru) |
Families Citing this family (28)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6692941B1 (en) | 1980-08-26 | 2004-02-17 | The Regents Of The University Of California | Bovine growth hormone |
US7101981B1 (en) | 1980-08-26 | 2006-09-05 | Regents Of The University Of California | Bovine growth hormone recombinantly produced in E. coli |
US5141922A (en) * | 1985-02-22 | 1992-08-25 | Monsanto Company | Biologically active proteins and a method for their use |
US4861868A (en) * | 1985-02-22 | 1989-08-29 | Monsanto Company | Production of proteins in procaryotes |
DE3685424D1 (de) * | 1985-06-26 | 1992-06-25 | Upjohn Co | Solubilisation und oxidation von somatotropin aus transformierten mikroorganismen. |
AU599922B2 (en) * | 1985-09-10 | 1990-08-02 | Natinco Nv | Improving carcass quality |
AU597951B2 (en) | 1986-03-27 | 1990-06-14 | Monsanto Company | Enhanced protein production in bacteria by employing a novel ribosome binding site |
GB8701848D0 (en) * | 1987-01-28 | 1987-03-04 | Celltech Ltd | Polypeptides |
US5104806A (en) * | 1987-03-12 | 1992-04-14 | Amgen, Inc. | Porcine growth hormone analogs encoding dna |
US5244882A (en) * | 1987-03-12 | 1993-09-14 | Amgen, Inc. | Porcine growth hormone analogs, and compositions |
US4863736A (en) | 1987-03-16 | 1989-09-05 | Monsanto Company | Somatotropin prolonged release |
WO1989007651A2 (en) * | 1988-02-17 | 1989-08-24 | The Upjohn Company | Methods for controlling norleucine content in polypeptides |
US5130422A (en) * | 1988-08-29 | 1992-07-14 | Monsanto Company | Variant somatotropin-encoding DNA |
US5089473A (en) | 1988-08-29 | 1992-02-18 | Monsanto Company | Somatotropin variants and their use |
EP0482124B1 (en) * | 1989-07-10 | 1993-12-22 | The Upjohn Company | Somatotropin analogs |
US5663305A (en) * | 1989-07-10 | 1997-09-02 | The Upjohn Company | Somatotropin analogs |
DE3930522A1 (de) * | 1989-09-13 | 1991-03-21 | Bayer Ag | Rekombinante aprotinin-varianten - gentechnisches verfahren zur mikrobiellen herstellung von homogen prozessierten aprotinin-varianten sowie die therapeutische anwendung derselben |
US5958879A (en) * | 1989-10-12 | 1999-09-28 | Ohio University/Edison Biotechnology Institute | Growth hormone receptor antagonists and methods of reducing growth hormone activity in a mammal |
US6583115B1 (en) | 1989-10-12 | 2003-06-24 | Ohio University/Edison Biotechnology Institute | Methods for treating acromegaly and giantism with growth hormone antagonists |
US6787336B1 (en) | 1989-10-12 | 2004-09-07 | Ohio University/Edison Biotechnology Institute | DNA encoding growth hormone antagonists |
US5350836A (en) * | 1989-10-12 | 1994-09-27 | Ohio University | Growth hormone antagonists |
US5951972A (en) * | 1990-05-04 | 1999-09-14 | American Cyanamid Company | Stabilization of somatotropins and other proteins by modification of cysteine residues |
US5767080A (en) * | 1996-05-01 | 1998-06-16 | Cargill, Incorporated | Enhanced milk production in dairy cattle |
GB9803424D0 (en) * | 1998-02-18 | 1998-04-15 | Pfizer Ltd | Performance enhancement |
CN1322211A (zh) * | 1998-10-05 | 2001-11-14 | 武田药品工业株式会社 | 除去n-末端蛋氨酸的方法 |
US6890731B1 (en) * | 2000-03-27 | 2005-05-10 | Applera Corporation | Isolated human G-protein coupled receptors that are members of the aminergic subfamily, nucleic acid molecules encoding human GPCR proteins, and uses thereof |
CN101665788B (zh) * | 2009-09-21 | 2011-11-09 | 山西大学 | 人工合成猪生长激素基因及其表达纯化方法 |
CN101907626A (zh) * | 2010-07-20 | 2010-12-08 | 广东省农业科学院兽医研究所 | 一种猪饲料中猪源蛋白的检测方法 |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4443539A (en) * | 1980-02-05 | 1984-04-17 | The Upjohn Company | Process for preparing bovine growth hormone |
IL59690A (en) | 1980-03-24 | 1983-11-30 | Yeda Res & Dev | Production of bovine growth hormone by microorganisms and modified microorganisms adapted to produce it |
IE52755B1 (en) * | 1980-08-26 | 1988-02-17 | Univ California | Bovine pre-growth and growth hormone |
JPS58996A (ja) * | 1981-06-01 | 1983-01-06 | ザ・ボ−ド・オブ・トラステイ−ズ・ミシガンステ−トユニバ−シテイ− | 細菌中での牛成長ホルモン遺伝子のクロ−ン化 |
US4436824A (en) * | 1981-06-09 | 1984-03-13 | Ortho Diagnostic Systems, Inc. | Leukocyte migration through antigen containing agaroses for immunocompetence testing |
EP0085036A1 (en) * | 1982-01-18 | 1983-08-03 | Monsanto Company | Method for improved bovine milk production |
DE3380262D1 (en) | 1982-05-25 | 1989-08-31 | Lilly Co Eli | Cloning vectors for expression of exogenous protein |
CA1224432A (en) * | 1982-08-17 | 1987-07-21 | Gary N. Buell | Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing bovine growth hormone-like polypeptides in high yield |
AU2092983A (en) * | 1982-11-08 | 1984-05-17 | Genentech Inc. | Porcine growth hormone produced by recombinant dna technology |
EP0111814A3 (en) * | 1982-12-16 | 1985-08-14 | Mgi Pharma, Inc. | The cloning and expression of nucleotide sequences encoding bovine growth hormone |
US4661454A (en) * | 1983-02-28 | 1987-04-28 | Collaborative Research, Inc. | GAL1 yeast promoter linked to non galactokinase gene |
CA1340597C (en) * | 1984-08-27 | 1999-06-22 | Haim Aviv | Expression vectors containing pl promoter, and engineered restriction site for convenient replacement of ribosomal binding site, plasmids containing the vectors, hosts containing the plasmids and related methods |
KR890002631B1 (ko) * | 1984-10-04 | 1989-07-21 | 몬산토 캄파니 | 생물학적으로 활성인 소마토트로핀을 지속적으로 유리하는 조성물 |
US4861868A (en) * | 1985-02-22 | 1989-08-29 | Monsanto Company | Production of proteins in procaryotes |
-
1986
- 1986-02-04 US US06/824,202 patent/US5037806A/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-02-20 ES ES552234A patent/ES8801851A1/es not_active Expired
- 1986-02-21 CN CN90108714A patent/CN1051302A/zh active Pending
- 1986-02-21 CN CN86101830A patent/CN1021973C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1986-02-21 DK DK80886A patent/DK80886A/da unknown
- 1986-02-21 CA CA000502495A patent/CA1338981C/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-02-21 AT AT86870024T patent/ATE141327T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-02-21 KR KR1019860001221A patent/KR920000849B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1986-02-21 IL IL7795086A patent/IL77950A/en not_active IP Right Cessation
- 1986-02-21 DE DE3650553T patent/DE3650553T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1986-02-21 IL IL11240386A patent/IL112403A/en not_active IP Right Cessation
- 1986-02-21 EP EP86870024A patent/EP0193515B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-02-21 GR GR860509A patent/GR860509B/el unknown
- 1986-02-21 PT PT82070A patent/PT82070B/pt not_active IP Right Cessation
- 1986-02-21 IL IL11240286A patent/IL112402A/xx not_active IP Right Cessation
- 1986-02-21 NZ NZ215260A patent/NZ215260A/xx unknown
- 1986-02-21 NO NO860658A patent/NO300551B1/no not_active IP Right Cessation
- 1986-02-21 HU HU86742A patent/HU210671B/hu not_active IP Right Cessation
- 1986-02-21 AU AU53854/86A patent/AU596575B2/en not_active Ceased
- 1986-02-21 RO RO133757A patent/RO106956B1/ro unknown
- 1986-02-21 JP JP61037158A patent/JP2583214B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1986-02-24 IE IE46786A patent/IE80663B1/en not_active IP Right Cessation
-
1989
- 1989-10-13 AU AU42825/89A patent/AU632293B2/en not_active Ceased
-
1990
- 1990-08-20 RU SU4830848/13A patent/RU2072393C1/ru not_active IP Right Cessation
-
1992
- 1992-06-29 MX MX9203728A patent/MX9203728A/es active IP Right Grant
- 1992-08-03 RU SU5052718/13A patent/RU2094439C1/ru not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-01-28 LT LTIP1819A patent/LT3916B/lt not_active IP Right Cessation
- 1994-05-10 CN CN94105667A patent/CN1100272A/zh active Pending
-
1995
- 1995-01-20 IL IL11240395A patent/IL112403A0/xx unknown
- 1995-05-26 JP JP7128636A patent/JP2863113B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1995-05-26 JP JP7128637A patent/JP2634390B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Seeburg et al., DNA, v. 2, N 1, p. 37 - 45, 1983. * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2094439C1 (ru) | Рекомбинантный полипептид pgh(a) с n-концевым аланином | |
US5028530A (en) | AraB promoters and method of producing polypeptides, including cecropins, by microbiological techniques | |
CA2033176C (en) | Growth hormone fusion proteins | |
CA2145388C (en) | Method of controlling polypeptide production in bacteria | |
US5206154A (en) | Method of producing cecropins by microbiological techniques | |
EP0211047B1 (en) | Arab promoters and method of producing polypeptides, includinn cecropins, by microbiological techniques | |
IE58317B1 (en) | Human insulin-like growth factor (igf) produced from a recombinant host, process, expression vector and recombinant host therefore, and igf-containing pharmaceutical composition | |
US4861868A (en) | Production of proteins in procaryotes | |
EP0125818A1 (en) | Cloned ovine growth hormone gene | |
US5141922A (en) | Biologically active proteins and a method for their use | |
Chakraborty et al. | Overexpression, purification and characterization of recombinant salmon calcitonin, a therapeutic protein, in streptomyces avermitilis | |
US5268284A (en) | Ribosome binding site | |
AU2016342210A1 (en) | Method for producing a recombinant protein with reduced impurities | |
EP3904520A1 (en) | Gene expression cassette for expressing n-terminal methionine-truncated protein of interest and method for producing n-terminal methionine-truncated protein of interest by using same | |
CN116217699A (zh) | 一种高效表达羊生长激素的方法 | |
Chakraborty et al. | Overexpression and purification of recombinant eel calcitonin and its phylogenetic analysis | |
JPH03503360A (ja) | リボソーム結合部位 | |
JPH02312597A (ja) | 魚類の成長ホルモンの製造法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20040222 |