JPH07309890A - アミノ末端アラニンをもつ牛又は豚ソマトトロピンの製法 - Google Patents

アミノ末端アラニンをもつ牛又は豚ソマトトロピンの製法

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Abstract

(57)【要約】 【構成】 翻訳開始シグナル／メチオニンコドンを含有
する１〜約３個の連続したメチオニンコドンが直前にあ
るアミノ末端アラニンのコドンを有する牛又は豚ソマト
トロピンをコードするＤＮＡ配列を遺伝子工学的にバク
テリア内で発現させて、アミノ末端アラニンをもつ牛又
は豚ソマトトロピンを産生し、回収するソマトトロピン
の製造方法、並びに、このＤＮＡ配列を含有する遺伝子
及び組換えＤＮＡベクター。 【効果】 アミノ末端にアラニンをもつ牛又は豚ソマト
トロピンの遺伝子工学的製法を可能にする。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、Ｎ−末端にアラニンを
もつ牛又は豚ソマトトロピンを原核生物内で製造する方
法、並びに、この方法に有用な組換えＤＮＡベクター及
び遺伝子に関する。
【０００２】
【発明の背景】遺伝子の発現は、真核生物と原核生物と
で、遺伝子をメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写
し、その後そのｍＲＮＡを蛋白質に翻訳するという共通
の基本的過程を有するが、これら過程での細胞内制御機
構は違ったものが用いられる。
【０００３】更に、真核生物においては、成熟蛋白質の
多くが、最初は成熟蛋白質のアミノ酸配列を含んだリー
ダー配列又はシグナル配列と融合したポリペプチドであ
る前駆蛋白質として翻訳される。真核生物のｍＲＮＡは
前駆蛋白質の全長をコードし、この全長コードの翻訳後
にリーダーアミノ酸配列部分が除去されて成熟蛋白質と
なる。真核生物細胞においては、そのような前駆蛋白質
を、特定の成熟蛋白質にプロセシングするようになって
いるが、原核生物細胞は、そのような真核生物にあるプ
ロセシングシグナルを通常は認識しない。このため、若
し真核生物のｍＲＮＡの完全転写体である相補ＤＮＡ
（ｃＤＮＡ）を、原核生物内での発現のためのＤＮＡ配
列として使用したならば、成熟蛋白質ではなくて、前駆
蛋白質が作られてしまう。前駆蛋白質をｉｎ ｖｉｔｒ
ｏで成熟蛋白質に変換することは可能であるが、かなり
高価なものとなる。
【０００４】原核生物において、成熟蛋白質のＤＮＡ配
列を発現させる場合、この配列は、リーダー配列をコー
ドするＤＮＡ配列内に通常含まれている真核生物の翻訳
後プロセシングシグナルと翻訳シグナルとを欠いてい
る。従って、クローン化した真核生物遺伝子又は他の外
来性ＤＮＡ配列を原核生物内で発現させるためには、効
率の悪さと、真核生物に特異的なシグナルが原核生物の
宿主細胞で認識されない可能性のために、原核生物の制
御シグナルを用いねばならないことが確かめられてい
る。
【０００５】本明細書中では、“外来性ＤＮＡ”とう用
語は、少くとも一部分が宿主細胞のゲノムに通常含まれ
ていない組成を持つＤＮＡであると定義づけられる。外
来性ＤＮＡの例としては、ウイルス又は真核生物の遺伝
子、遺伝子断片、対立遺伝子および合成ＤＮＡ配列等を
含むが、それらに限定されるわけではない。“外来性蛋
白質”又は“外来性ポリペプチド”という二つの用語
は、本明細書中では、組成の少くとも一部が、宿主ゲノ
ムに通常はコードされていない蛋白質又はポリペプチド
であると定義づけられる。
【０００６】原核生物の制御シグナルには、転写開始を
指令するプロモーターと、リボソーム結合部位、翻訳開
始シグナルおよび翻訳停止シグナルよりなる翻訳制御シ
グナルが含まれる。翻訳停止シグナル以外のこれらの諸
シグナルは、真核生物の遺伝子、或いは発現すべき他の
ＤＮＡの前に位置しなければならない。
【０００７】外来性ＤＮＡ（例えば真核生物遺伝子）を
原核生物で発現させる方法には、幾つかのアプローチが
応用されている。１つの方法は、産物である蛋白質をコ
ードするＤＮＡ断片を、バクテリア蛋白質の全部又は一
部をコードするＤＮＡに、そのバクテリアのプロモータ
ーの制御下で連結することである。その上、原核生物の
内在性ＤＮＡは、リボソーム結合部位と翻訳開始シグナ
ルとを持つ必要がある。このように連結されたＤＮＡが
発現されると、真核生物のポリペプチドがバクテリア蛋
白質の全部又は一部と結合又は融合して含まれる融合蛋
白質と呼ばれるものが作られる。真核生物の蛋白質をこ
れから分離することは、位置特異的酵素又は化学分解
を、内在する真核生物蛋白質の融合位置に適用すること
によって、又は原核生物ポリペプチドのアミノ酸配列を
選択的に分解することによって達成できる。
【０００８】真核生物の融合蛋白質をバクテリアで産生
することに関連した公表された文献としては例えば以下
のものがある。即ち、融合、非融合蛋白質で牛のプレ成
長ホルモン又は牛の成長ホルモン（“ｂＧＨ”）をカル
ボキシ（Ｃ−）末端に含み、原核生物蛋白質をアミノ
（Ｎ−）末端に含むか又は含まないものについて、ヨー
ロッパ特許出願公開第４７，６００号（１９８２年３月
１７日公開）；ｂＧＨと大腸菌のβ−ラクタマーゼの融
合蛋白質に関した英国特許出願公開第２，０７３，２４
５号（１９８１年１０月１４日公開）；ｂＧＨと大腸菌
のβ−ラクタマーゼの融合蛋白質に関したイー・ケシェ
ット（E. Keshet ）らによるNucleic Acid Research，
9：19−30（1981）；配列中にＮ−末端に内在性蛋白質
１つをもち、翻訳開始シグナルアミノ酸１つ、エンテロ
キナーゼ開裂部位１つ、及び外来性蛋白質（例えば成長
ホルモン）１つをＣ−末端にもつような融合蛋白質に関
するヨーロッパ特許出願第９５，３６１号（１９８３年
１１月３０日公開）。この融合蛋白質による方法は、し
かし、純化の後に行うイン ビトロでの精製を必要とす
ること、商業的量産に用いる酵素の価格がはなはだ高価
となるために厄介である。
【０００９】それでも、融合蛋白質は、幾つかの真核生
物遺伝子、又は他の原核細胞内の異種ＤＮＡを発現させ
る場合に、融合して生成した産物である融合蛋白質が、
産物として生成した外来性蛋白質を細胞内分解から保護
するために魅力的なシステムになって来ている。バクテ
リア細胞は、自己の細胞で産生された真核生物蛋白質の
幾つかを異物と認識して、それらが産生後直ちに又は産
生後短時間で分解のための処置をするようである。防護
のために、遺伝子操作された融合蛋白質として、アミノ
末端又はカルボキシル末端のいずれか一方に内在性ポリ
ペプチド配列を配置したものを採用することである。後
者の方法の例は、ヨーロッパ特許出願公開第１１１，８
１４号（１９８４年６月２７日公開）であり、これは合
成前端部（アミノ末端）と、Ｃ−末端に大腸菌のβ−ガ
ラクトシダーゼを持つｂＧＨの形態よりなる融合蛋白質
を記載している。しかしこれのもつ利点は、前述のよう
に、外来性蛋白質を内在性ポリペプチドから切り離さな
ければならないことのために、消去されてしまう。
【００１０】もう一つの試みでは、バクテリアのプロモ
ーター支配下での翻訳開始シグナルであるＡＴＧを、外
来性（例えば真核生物の）蛋白質で、Ｎ−末端もＣ−末
端も内在性蛋白質と繋がっていないものをコードするＤ
ＮＡ配列の直前に配置することである。このような遺伝
子構築で産生された蛋白質は、後に開裂操作により希望
する蛋白質に必ずしもする必要はないけれども、このよ
うな蛋白質は、典型的な場合にはメチオニン（時にはフ
ォルミルメチオニン）をＮ−末端にもつ。この現象は開
始シグナルであるＡＴＧが、メチオニンのコドンでもあ
ることに基づくものである。このようなわけで、所望の
成熟蛋白質がメチオニンで始まる配列を持たない限り、
この蛋白質はＮ−末端がメチオニン残基の追加で変更さ
れていることとなる。
【００１１】上記のような遺伝子構築の例には、ギャラ
ンテ（Guarente）ら（Cell (1980)20:543-553）よるも
のがあり、これによると、Ｎ−末端にバリンを持つ兎の
β−グロビン遺伝子がいま述べた方法で構築した遺伝子
を用いて大腸菌中で発現されている。この場合“兎のβ
−グロビンではメチオニン末端を持たず、ロイシンが３
番、１４番、２８番、３１番、３２番………の位置にあ
るのに対して、（放射能で）標識した蛋白質では、ロイ
シンが４番、１５番、２９番、３２番及び３３番にあ
り、メチオニンが１番にあることを当該研究者らは発見
した。このことは、この蛋白質が、兎のβ−グロブリン
にメチオニンのアミノ末端をが付加され、大腸菌の中で
除去されなかったものであることを示す。この文献の第
５４６−５４７頁参照。
【００１２】もう１つの例は、上記の遺伝子構築でバク
テリア細胞内での成長ホルモン産生に関するものであ
る。ショウナー等（Schoner et al.、Proc. Natl. Aca
d. Sci.U.S.A. （1984) 81：5403-5407 ）によると、バ
クテリアによるｂＧＨの高度発現系は、Ｎ−メチオニル
ｂＧＨを産生する、即ち天然産のｂＧＨのアミノ酸配列
を持つ化合物のＮ−末端にメチオニンが付加されたもの
に外ならない。バクテリア中で産生された、種々の成長
ホルモン類のＮ−末端にメチオニンが付加されること
は、ヨーロッパ特許出願公開第１０３，３９５号（１９
８４年３月２１日公開）とヨーロッパ特許出願公開第７
５，４４４号（１９８３年３月３０日公開）でｂＧＨに
ついて論じられ、シーバーグ（Seeburg ）らによりＤＮ
Ａ (1983) 2:37-45 で、ｂＧＨと豚の成長ホルモン
（“ｐＧＨ”）で論じられている。
【００１３】天然物のＮ−末端に、Ｎ−末端メチオニン
が付加することは、幾つかの理由で望ましくない。第一
は、そのメチオニンの存在する蛋白質は、Ｎ−末端メチ
オニンの無い形態のものを内在性蛋白質としている生物
で抗原として働くかもも知れない（現時点では、あり得
そうもないと信じられているが）ことである。第二は、
Ｎ−末端にメチオニンが付加すると、その蛋白質の生理
活性又は物理的な性質に好ましくない影響を与える可能
性があることである。第三は、蛋白質の形状が変更され
ているため、天然蛋白質の機能と構造との関係を決定す
る科学的努力を妨げるかも知れないことである。更に、
生合成蛋白質を、天然産物蛋白質と出来る限り近似の構
造にして置くことが、医学的、獣医学的使用の為に政府
の承認を得るに際して有利なことである。
【００１４】Ｎ−末端メチオニンを、その蛋白質の産生
中又はその後に蛋白質から取除く能力のあるバクテリア
のような原核生物は、従って非常に興味のある話題であ
る。例えば、ウェラー（Ｗａｌｌｅｒ）は、J. Mol. Bi
ol. (1963) 7:483-496で無細胞大腸菌抽出液から得た
“可溶性”蛋白質およびリボソーム蛋白質についてＮ−
末端アミノ酸配列を調査している。また、ヨーロッパ特
許出願公開第１０３，３９５号（１９８４年３月２１日
公開）は、大腸菌で産生された真核生物蛋白質から、Ｎ
−末端メチオニンが除去されることを明らかにした。即
ち、バクテリアで産生された二種のｂＧＨでどちらも元
来あるＮ−末端メチオニンの直後にセリンを持つものの
うちの一つからメチオニンが特異的に取除かれている。
この研究に用いられた遺伝子構築では、しかし、５′−
メチオニン−セリン−ロイシン−３′の為の開始シグナ
ルをコードする部分を合成して、ｂＧＨの５′端に接し
て挿入されていて、その挿入部では、天然にある蛋白質
で最初の４分子又は９分子に当る諸アミノ酸をコードす
る部分が欠けている。こうして大腸菌で産生される蛋白
質は、天然には産生されない蛋白質であった。英国特許
出願公開第２，０７３，２４５号（１９８１年１０月１
４日公開）は、成熟ｂＧＨ蛋白質で、メチオニンとプロ
リンがアラニンと入れ換っている時、“メチオニンはバ
クテリアで、アミノ酸配列、プロリン、フェニルアラニ
ン、アラニン、プロリンで始まる改変されたｂＧＨとし
て産生される”ことを明らかにした。
【００１５】このように、バクテリアのような微生物に
異種（例えば真核生物の）蛋白質を、Ｎ−末端メチオニ
ンを持たせずに製造するための経済的でかつありふれた
手段の開発が必要である。更に、バクテリアで作られた
蛋白質が、細胞外での発酵後の処理を必要とせず、しか
も天然物に無いＮ−末端メチオニンの付加が起らない方
法の開発が特に望まれる。
【００１６】成長ホルモン（ソマトトロピンとも呼ばれ
る）は脳下垂体細胞で作られ分泌されるポリペプチドで
あり、その作用は多くの場合、種特有である。それは骨
格の生育を促す役割の外に、乳汁分泌促進、膵臓からの
インシュリン分泌とグルカゴンの分泌増大などの代謝過
程への作用、更に脂質移動の作用を発揮する。例えば牛
にｂＧＨを外部投与すると、産乳量、飼料効率および／
又は成長率が増し、肥育期間を短縮し、赤身／脂肪比を
良くする。しかし、ホルモンがどうしてこれらの多重的
な効果を発揮するのかは未だ十分には判明していない。
【００１７】ヒトの成長ホルモン（ｈＧＨ）の広範な研
究によって、このホルモンが脳下垂体から分泌されると
きは、１種類の分子としてではなく、幾つかのポリペプ
チドの混合物であることが確認されている。種々のｈＧ
Ｈ種を分画すると、そのうち幾つかの画分は、糖尿病誘
発性作用もなく油脂分解作用もない。
【００１８】同様に、牛のｂＨＧでも、複数の種類が産
生される。特に、これら４種のｂＧＨは、蛋白質の２ケ
所が相互に違って産生される。Ｎ−末端のアミノ酸は、
シグナルペプチド（リーダーペプチド）アミノ酸配列の
除去における予想される多様性からみて、変わりうるも
のであって、その結果成熟蛋白質はＮＨ2 −フェニルア
ラニン−プロリン又は、ＮＨ2 −アラニン−フェニルア
ラニン−プロリンのどちらかで始まることとなる。更
に、１２６番のアミノ酸がロイシンであるかバリンであ
るかによる不均一性もある。この現象は明らかに、牛の
集団中にある対立遺伝子の変異によるものである。ウォ
ーリス（Wallis (1969) FFBS Letters 3：118-120 ）；
フェローズ及びロゴール（Fellows & Rogol(1969) J. B
iol. Chem244:1567-1575 ）；フェルナンデス等（Ferna
ndez et al (1971) FEBS Letters18:53-54 ）、フェロ
ーズ（Fellows (1973) Recent Progress in Hormone R
esearch 29:404）の私的論評；サントム（Santome (1
973) Eur. J. Biochem 37:164-170）；グラフ及びリー
（Graf & Li (1974) Biochem. Biophys. Res. Comm. 5
6:168-176 ）参照。脳下垂体のｂＧＨの４つの型（種）
は、本明細書中では次のように定義し、略称する：
【００１９】
【表１】
【００２０】尚、上記の式中、Ｐｈｅはフェニルアラニ
ンを、Ｐｒｏはプロリンを、Ｌｅｕはロイシンを、Ａｌ
ａはアラニンを、Ｖａｌはバリンを示す。
【００２１】ｂＧＨ（Ａ，Ｖ）およびｂＧＨ（Ｖ）種は
ときとして集合的に本明細書中では、バリン“対立形質
ｂＧＨ種”または“バリンｂＧＨ種”と称する。同様
に、ｂＧＨ（Ａ，Ｌ）またはｂＧＨ（Ｌ）種は集合的に
“ロイシン対立形質ｂＧＨ種”または“ロイシンｂＧＨ
種”と称する。上述のように該ｂＧＨ中のアミノ酸に割
り当てられた数字は同定と参照の目的のみに使用した。
【００２２】マイルス等（Mills et. al. (1970)、J. B
iol Chem. 245:3407-3415 ）は同様に豚の成長ホルモン
の２つのシアン化ブロム画分が、それぞれのＮ−末端で
非相同であることを確認した。特に、１画分はＮ−末端
がフェニルアラニンであり、もう一方はＮ−末端にアラ
ニンを持つ。これらｐＧＨの分子型は、それぞれｐＧＨ
（Ｐ）とｐＧＨ（Ａ）と略称する。
【００２３】ｂＧＨ（Ｌ）とｐＧＨ（Ｐ）の全ＤＮＡ塩
基配列と、対応するアミノ酸配列は、シーバーグ等（Se
eburg et. al., DNA (1983) 2:37-45）により発表さ
れ、これを本明細書中に参考として取り入れるものとす
る。
【００２４】個々の牛の脳下垂体細胞は、通常、少くと
ｂＧＨ（ＡＬ，Ｌ）とｂＧＨ（Ｌ）との混合物又はｂＧ
Ｈ（Ａ，Ｖ）とｂＧＨ（Ｖ）の混合物を含むことが判明
している。培養脳下垂体細胞中に産生されたｂＧＨ蛋白
のＮ−末端の分析はＮ−末端にフェニルアラニンまたは
アラニンのいずれかを含む分子のほぼ５０：５０の混合
物であることが示されていた。多数の牛個体の脳下垂体
を用いて作られた市販品は、通常脳下垂体ｂＧＨの４型
全部を含んでいる。更に、プールした下垂体から得たｂ
ＧＨ製剤中の分子の約３０％は１２６位にロイシンにか
わりバリンを含むことが報告されている。フェランデツ
（Ferandez）等FEBS Letters 18：53-54(1971) 参照。
これらの既知４型の生物学的活性の差異をしらべること
と、それぞれの型を実質的に他の３つの型のひとつまた
はそれ以上を含まないものの形態で、及び又はウシ由来
の他の蛋白を含まないものを市販できるようにすること
が望まれる。本明細書中で特定の蛋白を表すのに使用す
る用語“実質的に純粋”とは、天然の環境下またはソー
スでは該蛋白と結合している蛋白および／または他の物
質を実質的に含有しないことを意味する。上記の目的及
びその他の目的から、本発明には、少くともこれらの個
々のｂＧＨを若干でも容易に生産できるようにする方法
も含むものである。
【００２５】従って、真核生物またはその他の外来性ポ
リペプチドであって、Ｎ−末端にメチオニンを有しない
ものを原核生物で産生させることが本発明の目的の１つ
である。
【００２６】本発明のもう１つの目的は、Ｎ−末端メチ
オニンを除去するためにイン ビトロ操作を必要としな
い、真核生物又はその他の外来性ポリペプチドを原核生
物で産生することである。
【００２７】本発明の更にもう１つの目的は、イン ビ
トロ操作を必要とせずに、Ｎ−末端にアラニンを持つ真
核生物又はその他の外来性ポリペプチドを、原核生物で
産生する方法を提供することである。
【００２８】本発明のもう１つの目的は、アミノ酸配列
が、Ｎ−末端メチオニンを持たない天然のものと実質的
に同一である真核生物又はその他の外来性ポリペプチド
を原核生物で産生することである。
【００２９】本発明がさらに目的とするものの１つは、
ｂＧＨ（Ａ，Ｌ）、ｂＧＨ（Ａ，Ｖ）及びｐＧＨ（Ａ）
など、真核生物の成熟ポリペプチドで見出されるものの
アミノ酸配列を有するポリペプチドを原核生物で産生す
る方法を提供することである。
【００３０】本発明の更に次の目的は、牛や豚起源の蛋
白質を実質的に含まないｂＧＨ（Ａ，Ｌ）、ｂＧＨ
（Ａ，Ｖ）又はｐＧＨ（Ａ）を提供することである。
【００３１】本発明の更にもう１つの目的は、乳牛の産
乳量を有利に著しく増加させる一連のｂＧＨ種を提供す
ることである。
【００３２】本発明の方法で産生したｂＧＨポリペプチ
ドは、乳汁分泌量の増加、成長率及び／又は飼糧効率向
上などのソマトトロピン活性を可能にする手段を提供す
る。
【００３３】本発明の上記およびその他の目的は、以下
に示す説明から明らかであろう。
【００３４】
【発明の要約】本発明のこれらの目的は、一つの実施態
様において１〜約３連続のメチオニンコドンを有し、か
つ、開始シグナルを一つ含有するものと、その直後に続
く外来性ポリペプチド用のコドンと、更にその後に翻訳
停止シグナルコドン１つを有するゲノムＤＮＡを特定の
バクテリアで発現させ、該バクテリア中に生成したＮ−
末端アラニンを有する外来性ポリペプチドを回収するこ
とよりなる該Ｎ−末端アラニンを有する外来性ポリペプ
チドを産生する方法によって達成される。
【００３５】もう１つの実施態様としては、本発明は特
定のバクテリア中で翻訳開始シグナル／メチオニン コ
ドン１つと、その直後に続く外来性ポリペプチドのコド
ンと、更にその後に続く翻訳停止シグナル１つを含有す
るゲノムＤＮＡを発現させ、該バクテリア中に生成した
Ｎ−末端アラニンを有する外来性ポリペプチドを回収す
ることよりなる該Ｎ−末端アラニンを有する外来性ポリ
ペプチドを産生する方法を提供するものである。
【００３６】更に他の実施態様として、本発明はバクテ
リア内で天然の真核生物ポリペプチドと実質的に同一の
アミノ酸配列を有する外来性ポリペプチドを生産する方
法を提供するものである。
【００３７】その他の実施態様としては、本発明はｂＧ
Ｈ（Ａ，Ｌ）、ｂＧＨ（Ａ，Ｖ）、ｐＧＨ（Ａ）又はｂ
ＧＨ（Ａ，Ｌ）とｂＧＨ（Ａ，Ｖ）の混合物から選ばれ
たもので、かつそれぞれ、牛若しくは豚起源の、又はそ
の他のソマトトロピン種のポリペプチドを含まない一つ
のソマトトロピンを含有する組成物を提供するものであ
る。
【００３８】また、他の実施態様としては、ロイシンを
含有すること以外は同等であるロイシンｂＧＨ種または
ｂＧＨ（Ａ，Ｌ）よりも著しく乳牛の産乳量を増加させ
る一連のバリンｂＧＨ種よりなる組成物を見いだしたこ
とである。好ましい一態様としては、実質的に純粋なｂ
ＧＨ種よりなり、かつかかる産乳量の増加を可能とする
ための組成物を提供せんとするものである。
【００３９】その他の実施態様としては、牛及び／又は
豚の乳汁分泌を促進し、成牛又は成豚前の成長、及び／
又は飼糧転換効率を高めるために前述の組成物を使用す
る方法並びに前述の方法に有用な種々の遺伝子、ＤＮＡ
ベクター及び形質転換されたバクテリアが含まれる。
【００４０】以下図面を参照しながら更に本発明につい
て説明する。
【００４１】以下の各図面において、斜線の入った箱形
は、バクテリア プロモーターのＤＮＡコーディング配
列を示し、黒塗りの箱形は、異種ＤＮＡのコーディング
配列、棒形は標識しているように、追加ＤＮＡコーディ
ング配列、そして方向矢はＤＮＡコーディング配列の
５′から３′への方向を示す。関連制限酵素の作用部位
も又示してある。ＤＮＡ上の位置で、しかるべくマーク
してある部分は、表示の目的で行ったもので、比例尺に
合わせて描いたものではない。
【００４２】第１図は、Ｍ13ｍｐ８／ＢＧＨex-1の構築
を示し、このものは、Ｍ13ｍｐ８ベクターのそのＳｍａ
Ｉ制限酵素（開裂）部位に１つのＸｂａＩ制限酵素（開
裂）部位を挿入したものよりなる。
【００４３】第２図は、Ｍ13ｍｐ８／ＢＧＨex-1の構築
を示し、このものは、ｂＧＨ（Ｌ）ＤＮＡコーディング
配列を保持するＭ13ｍｐ８／ＸｂａＩよりなる。
【００４４】第３図は、ｂＧＨ（Ａ，Ｌ）ＤＮＡコーデ
ィング配列の、オリゴヌクレオチド部位特異的突然変異
誘発による作製を示す。
【００４５】第４図は、ｂＧＨ（Ａ，Ｖ）ＤＮＡコーデ
ィング配列の、オリゴヌクレオチド部位特異的突然変異
誘発による作製を示す。
【００４６】第５図は、ｐＭＯＮ３２０８発現ベクター
の構築を示し、このものはｂＧＨ（Ｌ）ＤＮＡコーディ
ング配列の代わりにｂＧＨ（Ａ，Ｌ）ＤＮＡコーディン
グ配列を含むｐＢＧＨex-1よりなる。
【００４７】第６図は、ｐＭＯＮ３２１５発現ベクター
の構築を示し、ｂＧＨ（Ｌ）ＤＮＡコーディング配列の
代わりに、ｂＧＨ（Ａ，Ｖ）ＤＡＮコーディング配列を
持つｐＢＧＨex-1である。
【００４８】第７図は、Ｍ13ｍｐ９／ＰＧＨex-1の構築
を示し、このものはｐＧＨ（Ｐ）ＤＮＡコーディング配
列を保持するＭ13ｍｐ９よりなる。
【００４９】第８図は、ｐＧＨ（Ａ）ＤＮＡコーディン
グ配列の、オリゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘発
による作製を示す。
【００５０】第９図は、ｐＢＧＨex-1* の構築を示し、
このものは、ｐｔｒｐＤＮＡコーディング配列の５′端
の上流に位置するＥｃｏＲＩ制限酵素作用部位が除去さ
れているｐＢＧＨex-1よりなる。
【００５１】第１０図は、ｐＭＯＮ３２１３発現ベクタ
ーの構築を示し、このものは、ｂＧＨ（Ｌ）ＤＮＡコー
ディング配列の代わりにｐＰＧＨ（Ａ）ＤＮＡコーディ
ング配列を有するｐＢＧＨex-1* よりなる。
【００５２】
【詳細な説明】本発明は、真核生物（例えば、哺乳動物
や鳥類）由来のものでＮ−末端にアラニンを持つ外来性
ポリペプチド蛋白質を原核生物内で生産する方法を提供
せんとするものである。このようにして生産されるポリ
ペプチドは、Ｎ−末端メチオニンを持たないので、Ｎ−
末端メチオニンの無いポリペプチドを得る為のイン ビ
トロ操作が不要である。遺伝子コーディング配列には存
在するのに、Ｎ−末端にメチオニンを欠くポリペプチド
を一貫生産することは新規で、かつ、全く予期しなかっ
た結果である。
【００５３】本発明は、Ｎ−末端にアラニンを有する実
質的に純粋な蛋白質を生産する価値高い方法を提供せん
とするものである。そのような蛋白質には、牛又は豚の
ソマトトロピンの一定種とその変異体、植物蛋白質のリ
ブロース−１，５−二燐酸カルボキシラーゼの小サブユ
ニット、グルタチオンＳ−トランスファラーゼ、及び熱
ショック蛋白７０などがあるが、これらに限定されるも
のではない。本発明はまた、その他のポリペプチドで、
Ｎ−末端にメチオニンではなく、アラニンがあることが
望ましいものを生産するのに有用である。Ｎ−末端がメ
チオニンではなくアラニンであることが望まれる場合は
あり得る。とりわけ、Ｎ−アラニル型のポリペプチドは
免疫原性が弱く、又は異なった物理特性を持ったり生物
学的作用が改変されたりすることが少ない。
【００５４】ｂＧＨ又はｐＧＨの実質的に純粋な種をバ
クテリアによって産出する本発明の具体例に関して、従
来技術はＮ−末端からのメチオニンの除去に関する証拠
も教示も明らかに欠いている。実際、バクテリア内でｂ
ＧＨを作らせた文献でＮ−末端が天然に存在するｂＧＨ
種と同類のＮ−末端アミノ酸配列よりなるＮ−末端は、
全部Ｎ−末端にメチオニンを持つと報告している。シー
ブルグ等（Seeburg et. al. DNA (1983) 2:37-45の４４
頁）は、ｂＧＨの一種、例えば、Ｎ−末端がフェニルア
ラニンになる遺伝子配列をこと更にｂＧＨ（Ｌ）の大腸
菌内での発現のために選んでいるが、これは１つには、
他のｂＧＨ種であるｂＧＨ（Ａ，Ｌ）の疎水性のＮ−末
端アラニンに更に２つ目の疎水性のアミノ酸（メチオニ
ン）を付加することを避けるためである。このように今
日迄に知られている研究結果は、バクテリアを用いて作
られたｂＧＨのＮ−末端にメチオニンが保持されること
を教示している。これらの報告に満足できず、前述の理
由でｂＧＨの２種、ｂＧＨ（Ａ，Ｌ）とｂＧＨ（Ａ，
Ｖ）とｐＧＨの１種ｐＧＨ（Ａ）を生産する必要がある
と本発明者は判断した。しかし、これらソマトトロピン
種をバクテリア内で産生するには、産生されるポリペプ
チドがＮ−末端メチオニンを持つものと予測しなければ
ならなかった。
【００５５】本発明の実施例で詳述するように、本発明
者が行ったバクテリアでのｂＧＨ（Ａ，Ｌ）、ｂＧＨ
（Ａ，Ｖ）及びｐＧＨ（Ａ）の産生へのアプローチは、
次のように要約される。
【００５６】前記の蛋白質をコードするＤＮＡ配列は、
オリゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘発を、フェニ
ルアランをＮ−末端に持つ牛及び豚ソマトトロピンＤＮ
Ａコーディング配列中に、第３図、第４図、第８図に示
すように生起させて構築した。その後に、ｂＧＨ（Ａ，
Ｌ）、ｂＧＨ（Ａ，Ｖ）及びｐＧＨ（Ａ）をコードする
配列を発現ベクターに挿入し、遺伝子の配列順が、プロ
モーター１つ、リボソーム結合部位１つ、ＡＴＧ開始／
メチオニン コドン１つを、ｂＧＨ（Ａ，Ｌ）、ｂＧＨ
（Ａ，Ｖ）又はｐＧＨ（Ａ）のコーディング配列に直接
に接して先行させ、最後に翻訳停止コドンを配置させた
ものよりなる。次に一定の発現ベクターで、所望の遺伝
子配列を持ったものを大腸菌に感染させ、それを所望の
外来性ＤＮＡが発現され、所望の異種蛋白質が産生され
る条件で培養した。こうして産生された蛋白質は、アミ
ノ酸配列を確認し、適切な生物学的活性について検査し
た。
【００５７】このようにして、開始シグナル／メチオニ
ン コドンを有し、その直後に外来性Ｎ−アラニル ポ
リペプチドをコードする配列が続いているＤＮＡ配列を
発現させると、原核生物から回収される蛋白質は、メチ
オニンではなく、アラニンをＮ−末端に実際に有するこ
とを見出した。アラニンのコドンの直前に、３つ以下の
連続したメチオニンのコドンがあり、そのメチオニン
コドンに所望のポリペプチド産物のコードを転写したｍ
ＲＮＡが翻訳開始シグナルコドンを含むときには、同様
の結果が得られるものと信じられている。例えば、翻訳
開始シグナルと、所望のポリペプチド産物をコードする
ＤＮＡは、適切にメチオニン アラニン、メチオニン
メチオニン アラニン、メチオニン メチオニン メチ
オニンアラニン又はそれらのものの機能的な均等物であ
ればどんなコーディング配列でも差支えない。
【００５８】本明細書においてＮ−アラニル ポリペプ
チドは、アラニンをアミノ末端に持ったポリペプチドと
定義する。本発明者は下記の機構の説にしばられること
を好まないが、翻訳の後に、メチオニンのＮ−末端が、
次のアミノ酸がアラニンか又はＮ−メチオニン除去を容
易にする類似の性質を有するもの（例えば極性や疎水性
において）であれば、原核生物によって酵素的に除去が
行われるものと信じられる。更に、外来性及び／又は内
在性のポリペプチドで該Ｎ−末端メチオニンが直接アラ
ニンの隣りにあるときには、どんな原核生物でもＮ−末
端メチオニンを除去することができると信じられてい
る。
【００５９】このような原核生物（例えば、ＡＴＣＣな
どの良く知られた微生物寄託機関から一般大衆が入手可
能な種々の既知バクテリア）には、大腸菌及びその種々
の菌株を含むが、これに限定されるものではない。実
際、Ｎ−末端アラニンを有するポリペプチドを、１から
約３の連続メチオニン コドンで始りその直後にアラニ
ンのコドンが続くＤＮＡコーディング配列から作ること
の能力を有する原核生物は、本明細書において開示した
本発明の実施に潜在的に使用可能である。市販され又は
それ以外の方法で入手可能な原核生物は、そのようなＮ
−アラニル ポリペプチド生産能力について、該生物の
ゲノムに該生物で作用するプロモーター、リボソーム結
合部位をコードしたＤＮＡ、１から約３個の連続メチオ
ニン コドンで、その中に翻訳開始シグナルを持ち、そ
の直後に外来性Ｎ−アラニル ポリペプチドをコードす
る配列と翻訳停止シグナルが続く遺伝子を挿入し、次い
で該遺伝子を発現させ、そして、このように産生された
ポリペプチドのＮ−末端アミノ酸配列を同定することに
よってスクリーニングすることができる。このような外
来性Ｎ−アラニル ポリペプチドをこのような原核生物
が内部産生するのを見出した場合には、該生物は、本明
細書の記載中でいうところの“選抜された”と定義され
た部類に属するものである。
【００６０】本発明の実施に際して好ましい菌として
は、大腸菌Ｋ１２株由来の３種の単離体があり、いずれ
も、メリーランド州ロックビル市のアメリカ タイプ
カルチャー コレクションに寄託されて居り、寄託番号
としてＡＴＣＣ ３９９３６、５３０１０、および５３
００９が割り当てられていて、該Ｎ−末端メチオニンの
直後にアラニンが続いている場合にＮ−末端メチオニン
を除去する能力を示す。
【００６１】このことは原核生物で、Ｎ−末端がアラニ
ンである外来性ポリペプチドを作らせる方法を提供する
こととなるので有意義なことである。
【００６２】本発明の方法の好ましい実施態様の１つ
に、２つのｂＧＨ種、ｂＧＨ（Ａ，Ｌ）とｂＧＨ（Ａ，
Ｖ）及び１つのｐＧＨ種であるｐＧＨ（Ａ）を、牛や豚
の他の蛋白質や他種のｂＧＨ又はｐＧＨを含まない形で
それぞれ産生させる方法がある。特に、この方法はｂＧ
Ｈ（Ａ，Ｌ）、ｂＧＨ（Ａ，Ｖ）又はｐＧＨ（Ａ）を単
一種として生産することを可能にする。天然のソマトト
ロピンと同類のアミノ酸配列を有するｂＧＨ又はｐＧＨ
種を夫々単独に生産する能力は、各ｂＧＨやｐＧＨ種の
既に一般的に述べたｂＧＨ種とｐＧＨ種との潜在的機能
によってもたらされる生物学的反応性を正確に決める上
で大きな意義を有し、実際、２つのＮ−アラニルｂＧＨ
種のどちらか一方だけの投与で、例えば、産乳のような
ｂＧＨの機能を発揮することを見出した報告がある。更
に、ある研究では、本発明に従って産生したｂＧＨ
（Ａ，Ｖ）を乳汁分泌促進量投与することで、同様に作
出したｂＧＨ（Ａ，Ｌ）を投与した場合より、乳牛の産
乳量が統計学的に（例えば、Ｐ＜０．０５）著しく増進
することが見出された。
【００６３】産乳中の哺乳動物の産乳量増加についての
特定のｂＧＨの形態（種）に関する相対的効果に対する
教示は今までのところ無い。更に、ｂＧＨ種間の生物活
性についての差異に関して、イン ビトロ、イン ビボ
共に示唆する先行文献は無い。よって、バリン対立形質
のｂＧＨ種がロイシン対立形質のｂＧＨ種よりも産乳量
の増加効果がより大きいと言う知見は驚くべきことであ
り、又予期せざるものである。この所見は更に飼料効率
増加や成育促進のような他の成長ホルモンとしての性質
を増強する作用についてもｂＧＨ種の相対的効果の差異
を同様に明確化できることを示唆している。このよう
に、実質的に純粋な形態で脳下垂体のｂＧＨの少なくと
も二種の分子形態をバクテリア中で産生させる本発明の
方法を用い、及び／又は他の利用可能な技術を用いて、
特定の成長ホルモンにより誘導化された反応を達成する
のに最も効果的なｂＧＨ種が得られる。そのような利用
可能な技術には、全ｂＧＨ蛋白又はその断片の化学合
成、及び／又は既知の組換えＤＮＡ技術を使用した酵母
などの他の微生物又は哺乳動物の細胞中での産生も含む
が、これらに限定される訳では無い。
【００６４】加えて、天然に存在する夫々の種の生物活
性が一度決定されると、各種毎に既存のものより、ソマ
トトロピン活性が増大したポリペプチド変異体を作るこ
とが可能となると考えられる。従ってソマトトロピンの
変異体を、ヌクレオチドかアミノ酸の欠失、置換及び／
又は付加により作製することにより、ここで開示した組
成物に相当する有用なものを種々作製できるものと思わ
れる。そのような変異体としては、ｂＧＨ（Ｖ）の変異
型で、メチオニンをアミノ末端に付加することをも含
む。そしてこのような変異体は、遺伝的に形質転換され
たバクテリアで作られ、乳汁分泌を促進する量投与する
ことで乳牛の乳汁分泌を驚く程増大することが見出され
た。
【００６５】更に、ｂＧＨ（Ｖ）変異体の投与に関連し
産乳について観察された増加の程度は、１２６位のアミ
ノ酸がロイシンであることを除きその他の点では同等で
ある変異体の投与に関連して観察された産乳量の増加よ
りも測定可能な程に著しいことが判明した。
【００６６】本出願人は以下の機序に関する理論に拘束
されることを望まないが、１２６位のロイシンの代わり
にバリンで置換すると有意にこのようなソマトトロピン
蛋白のバイオアビリティ及び／又は生物反応性を増加さ
せるようである。特に、ソマトトロピン蛋白について実
施したＸ線結晶学は、該蛋白のアミノ酸約９０位から約
１３５位の領域は比較的（構造的に）柔軟性に富む領域
を構成していることを示している。その他の蛋白の研究
から柔軟性に富む領域はしばしば生物反応性部位（即
ち、生物活性形態を達成するために、生物学的受容体及
び／又は同一の蛋白の他の部分と相互に反応する部位）
よりなる。かくして、ｂＧＨ（Ａ，Ｖ）の追加の変異
体、例えば、ここに記載の柔軟性に富む領域内及び／又
はこの領域外で（ロイシン以外の点を除き）その他の点
では同等であるロイシンｂＧＨ種又はｂＧＨ（Ａ，Ｌ）
よりも多く乳汁分泌（即ち、産乳量）を測定可能な程増
加させる結果となるアミノ酸の置換、欠失、付加及び／
又は逆位よりなる変異体が作製可能である。例えば、上
述の産乳量の増大を耐え難いほどは減退させないで、１
２６位又はその付近のアミノ酸を替えることの中には
（ロイシンに比較して）他のより疎水性及び／又はより
小さいアミノ酸による置換をも含むものである。
【００６７】更に、Ｎ−末端ｐｈｅ1 又はＮ−末端ａｌ
ａ-1を有するバリンｂＧＨ種は、乳牛に投与すると上述
の如く産乳量を増加させることができることが想起され
る。また、天然に存在するｂＧＨの末端と実質的には差
異のないアミノ末端における変更（例えばｍｅｔ-1）
は、（ロイシン以外の点を除き）その他の点では同等で
あるロイシンｂＧＨ種又はｂＧ（Ａ，Ｌ）よりも測定可
能なほどに著しく産乳量を増大させるバリンｂＧＨ種の
能力について耐え難いほどには阻害しないであろうこと
もまた想起されうることである。更に、プールした脳下
垂体ｂＧＨ調製物中のバリンｂＧＨ濃度が、（その中に
含まれる）全ｂＧＨの重量にもとづいて（比較すると
き）、同様にロイシンを含むものの濃度より実質的に高
い濃度であるｂＧＨ組成物は、上記の結果を同様に達成
するであろうことも容易に想起されることである。
【００６８】最も広範囲な本発明の実施態様としては、
組換えＤＮＡ技術の手法を、原核生物内で外来性ポリペ
プチドを直接生産できるように極限まで改良したことで
ある。本明細書中の記載では、ポリペプチドをコードす
るＤＮＡを分離し、クローン化し、クローン化ＤＮＡの
塩基配列を再配列したり改変したりしたが、これらはク
ローン化したり改変したりしたＤＮＡ配列で微生物を形
質転換する基礎技術の知識を前提とするものである。こ
のような技術は、この分野における常套手段である。
（例えばマニアチス、フリシュ、サムブルック）編 Man
iatis, Fritsch及びSambrook, Molecular Cloning:A La
oratory Manual；1982年を参照）。
【００６９】外来性ＤＮＡの分離及び／又は構築 本発明の実施態様の一つとして、原核生物内で作らせる
所望の外来性ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を選
抜分離するか、そのコーディング配列のＤＮＡを構築す
るか或いは化学合成をする。多くの重要な実施態様にお
いては、そのポリペプチドは真核生物蛋白質である。若
しこのポリペプチドが小さく、アミノ酸配列が既知の場
合、合成ＤＮＡ分子、換言すれば、そのポリペプチドを
コードする配列を有するＤＮＡは合成できる。若しその
ペプチドのアミノ酸配列が未知であり、又は対応するＤ
ＮＡ配列が長過ぎて合成には向かない場合には、ｃＤＮ
Ａ（相補ＤＮＡ）を該ポリペプチドを発現する組織や細
胞から得た対応するｍＲＮＡから逆転写して調製するこ
とができる。例えば、本発明の実施態様の１つに、グッ
トマン等（Goodman et al ：Methods in Enzymology
68:75-90 (1979) ）に説明され、今では常法になってい
る方法で、牛の脳下垂体から得たものを用いてｂＧＨＤ
ＮＡ配列を作製することができる。或いは、ｃＤＮＡ配
列は、天然ジーンバンクからゲノムＤＮＡを分離して、
それによって形質転換を受けた細胞からｍＲＮＡを適当
なプローブを用いて単離し、それからの逆転写で作製す
ることができる。ゲノムＤＮＡは、原核生物でＤＮＡが
発現されるような種々のベクター系の中で改変すること
ができる。これらの技術は、常套手段の範囲内にある。
【００７０】一度所望のポリペプチドに関する諸コドン
を揃えた外来性ＤＮＡ配列が手に入ると、その分子の核
酸配列を改変しようと言う欲求が生じるだろう。例え
ば、ｍＲＮＡの鋳型からＤＮＡ分子を逆転写で作製した
とすると、少なくとも蛋白質のリーダー配列をコードし
たＤＮＡ部分が含まれることがしばしば起こる。こうな
ると、所望の蛋白質に関する最初のコドンより前の部分
に当るリーダー配列ＤＮＡ部分を全部取り除くことが必
要となる。場合によっては、所望の蛋白質のＮ−末端の
コドンがアラニン コドンである場合以外は、アラニン
コドンを所望の蛋白質に関する諸コドンの先端部に付
加したり、又はその先端部を置換したりする必要が生じ
ることがある。その時には、翻訳開始シグナル（それ
は、メチオニンのコドンでもある）がアラニン コドン
に接して直ぐ上流に挿入される。その開始／メチオニン
のコドンは通常（そして好ましくは）ヌクレオチド配列
ＡＴＧであるが、時にはＧＴＧが開始／メチオニンのコ
ドンに使われることがある。その上、１つ以上２、３又
は更に多くの連続したメチオニン用諸コドンがあって
も、本発明の方法の範囲内に含まれるものであることは
言うまでもない。
【００７１】若し既に存在していないならば、最少１個
の翻訳停止シグナルが、Ｃ−末端アミノ酸用コドンの後
に挿入されていなければならない。停止シグナルの例と
しては、デオキシ核酸トリプレットのＴＡＡ、ＴＧＡ、
及びＴＡＧである。従って、主要点は、翻訳開始シグナ
ル／メチオニン コドンに、所望のポリペプチドでＮ−
末端がアラニンである諸コドン連鎖が直ちに従い、それ
のＣ−末端アミノ酸用コドンの後に続いて最少１つの停
止シグナルが来ると言う順序になるような組換えＤＮＡ
を、ＤＮＡ組換え技術を用いて構築すると言うことであ
る。
【００７２】ｍＲＮＡの中に、二つの核酸塩基の相補的
なシリーズの水素結合によって形成される二次構造を作
って、それがｍＲＮＡの効率良い発現を妨げる場合があ
ることが知られている。このような相補的配列が、特に
Ｎ−末端部分をコードしている場所に存在すると、それ
を除去することがリボソームのｍＲＮＡへの結合を助け
るので、これにより発現の水準が高められる。
【００７３】このことから、このような二次構造に関与
する諸コドンを、同じアミノ酸を意味するが、他の塩基
組合せの核酸トリプレットと交換することが望ましい。
ヨーロッパ特許出願公開第７５，４４４号（１９８３年
３月３０日公開）：シーブルク等（Seeburg et al 、(1
983) DNA 2:37-45）及びショーナー等（Shoner etal
(1984) Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 81:5403-540
7）参照。
【００７４】他の外来性ＤＮＡ配列構築の方策はこの分
野において通常の知識を有する者にとって自明のことで
ある。例えばＮ−末端が、ＮＨ2 −ｍｅｔ−ｘ−ｙ……
の構造で、ｘがアラニン以外のアミノ酸であるようなポ
リペプチドをコードするＤＮＡがある場合、翻訳開始シ
グナル／メチオニン コドンと、ｘ用のコドンとの間に
アラニン コドンを挿入するとができる。こうして、Ｎ
−末端構造がＮＨ2 −ａｌａ−ｘ−ｙ……又はＮＨ2 −
ａｌａ−ｙ……になったポリペプチドが、本発明による
方法を使って、夫々生産できる。
【００７５】同様にして、任意のアミノ酸用のコドンの
欠失、付加及び／又は置換を所定の遺伝子配列内で行う
ことが可能で、このことにより本発明は、かかる方法に
よって変異ポリペプチドを発現することができる。“変
異”ポリペプチドは、本明細書中では、所定のポリペプ
チドが天然に持つアミノ酸配列に対し、１つ又は複数の
アミノ酸の欠失、置換及び／又は付加をもつポリペプチ
ドと定義する。そのような“変異体”の例は、ｍｅｔ−
ｂＧＨ（Ｌ）およびｍｅｔ−ｂＧＨ（Ｖ）を含み、しか
しそれだけに限定されるものではないが、これらの変異
ｂＧＨ種のアミノ酸配列が、Ｎ−末端に付加されたメチ
オニン以外は天然に牛の脳下垂体細胞で生産されるｂＧ
Ｈ（Ｌ）及びｂＧＨ（Ｖ）と同一のものである。これら
変異ポリペプチドは、その生物活性が許容できない程に
消滅しない限り、天然ポリペプチドと実質的に同一アミ
ノ酸配列を有するように構築される。変異ポリペプチド
の作出とその発現は、蓄積量の増加、蛋白安定性の増
大、ポリペプチド純化の助長、及び／又は生物活性を最
適にすることなどのために望まれる。
【００７６】上記した、所望のポリペプチドをコードす
る配列を持つＤＮＡの構築は、制限酵素、エキソヌクレ
アーゼ、エンドヌクレアーゼなどを用いて、この分野に
おける通常の知識を有するものが既に知っている方法で
達成できる。オリゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘
発の一般技術も、上記の、ＤＮＡ構造又は配列の改変を
実施するのに使用することができ、この分野における通
常の知識を有するものは既に知っていることである。例
えば、ゾーラー及びスミス（Zoller & Smith (1982) Nu
c. Acids Res. 10：6487-6500 ）；ゾーラー及びスミス
（Zoller & Smith，(1983) Meth. Enzymol. 100：468-
500 ）；ノーリス等（Norris et al，(1983) Nuc. Aci
ds Res. 11：5103-5112)参照。
【００７７】組換ＤＮＡ技術により、所望の異種ＤＮＡ
配列が得られれば、この配列は、ＤＮＡ配列を増やす手
段となる適切なクローニング ベクターに挿入される。
適切なクローニング ベクターを使用する場合、どれで
もマーカー機能があることが望ましく、その例として、
大腸菌プラスミド ベクターでＣｏｌＥＩを持つものに
ついては、ハーシフィールド等(Hershfield et. al，Pr
oc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. (1974) 71：3455；pBR3
22) 、ボリバー等(Boliber et al，Gene(1977)2：95；p
BR325) 、ソベロン等(Soberon et. al ，Gene(1978)
4：121)に；及びpKC７については、ラオ等(Rao et al，
Gene(1979) 7：79) に；及び大腸菌バクテリオファージ
ベクターでシャロン(Charon)λＬ47.1を含むものにつ
いては、ローネン等(Loenen et al ，Gene(1980)10：24
9)に；更に、Ｍ13ｍｐ８とＭ13ｍｐ９については、メッ
シング等(Messing et al，Gene(1982)19：269)に記載さ
れている。該ＤＮＡ配列をクローニング用ベクターに挿
入して、組換ベクターとする一般技術は、この分野にお
ける通常の知識を有するものにとっては常套手段であ
る。例えば、フリッシュ及びサムブルック(Fritsch & S
ambrook)編MolecularCloning ：A Laboratory Manual
；Maniatis，(1982)参照のこと。
【００７８】所望の外来ＤＮＡ配列の複製物が沢山得ら
れれば、これらの配列を以下に詳述する如く組み換えベ
クターから除去して所望の外来性蛋白を産生させ単離す
るための発現システムへと挿入できる。該外来性ＤＮＡ
配列の改変は、発現ベクターへの該配列の挿入に先立っ
て、あるいは該挿入にひきつづいて、この分野における
通常の知識を有するものに知られた方法により行なうこ
とが可能である。
【００７９】本発明における実施例においては、メッシ
ング等(Messing et al，Gene(1982)19：269)が記述して
いる如く第１図に示すＸｂａＩ制限（酵素）部位を含む
ように改変したＭ13ｍｐ８と、同上文献に記載されてい
るＭ13ｍｐ９を共に、クローニング ベクターとして用
いた。これらを総称して“Ｍ13ベクター”と呼ぶ。Ｍ13
ｍｐ８及びＭ13ｍｐ９ベクターは、組換ベクターを、二
重鎖（ｄｓ）又は複製型（ＲＦ）の、及び一重鎖（Ｓ
Ｓ）型のＤＮＡとしてでも分離できる。ＲＦ型ＤＮＡ組
換ベクターを単離すれば、後に複製した所望のＤＮＡ配
列を、第５図、第６図、第１０図に示すように、発現ベ
クターに挿入することも可能になる。一方、一重鎖型の
組換ＤＮＡを単離すれば、所望のＤＮＡの配列決定、発
現に際して正しい５′→３′方向性を有するベクターの
単離、オリゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘発技術
によるＤＮＡ配列改変が、第３図、第４図及び第８図に
示すように可能になる。更に、これらのＭ13ベタクー
は、真核生物の遺伝子塩基配列の標準的な全長をクロー
ニングするのに十分な、４キロベースに亘る遺伝子断片
を収容することができる。
【００８０】Ｍ13ベクターに採用された標識機能には、
メッシング等(Messing et al，Gene(1982)19：269)が述
べたように、β−ガラクトシダーゼについての酵素が含
まれる。特に、所望の外来性ＤＮＡ配列が、Ｍ13上のｌ
ａｃＺ遺伝子断片に挿入され、その結果、このＭ13上の
ＬａｃＺ断片は、宿主細胞（例えば大腸菌ＪＭ１０１）
の染色体ＤＮＡが持つｌａｃＺ遺伝子断片の一部との正
常な相補関係が乱され、そのため該宿主は、バクテリア
成育培地に含まれているラクトースを、もはや代謝する
ことができなくなる。ベクターにあるｌａｃＺ遺伝子断
片に外来遺伝子配列が挿入されていないＭ13ベクターで
大腸菌を感染させたときには、バクテリア成育培地に含
まれているラクトースは代謝することができるので、そ
のバクテリアが０．８％（ｗ／ｖ）のトリプトン、０．
５％（ｗ／ｖ）の酵母エキス、０．５％の食塩及びβ−
ガラクトシダーゼ指標色素を含んだ１×ＹＴ寒天培地上
で生育させると、特徴ある青のプラークを作る。Ｍ13ｌ
ａｃＺ遺伝子断片に外来性ＤＮＡ配列が挿入された組換
ベクターで感染させた大腸菌のプラーク発色は、該バク
テリアを同一培地で生育させたとき、透明又は無色であ
る。従って、クローニング用ベクターに外来性ＤＮＡ配
列を挿入すると、大腸菌宿主が組換ベクターに感染した
後に無色のプラークができることで判定できる。ｂＧＨ
（Ｌ）又はｐＧＨ（Ｐ）コーディング配列を持つＤＮＡ
をＭ13ベクターに挿入する手順は第２図と第９図に夫々
示してある。
【００８１】好ましい実施態様としては、シーブルグ等
(Seeburg et al，ＤＮＡ(1983)２(1) ：37-45)により記
載されているように、バクテリア プラスミドのｐＢＧ
Ｈex-1及びｐＰＧＨex-1′ の各々が持つｂＧＨ（Ｌ）
又はｐＧＨ（Ｐ）ＤＮＡコーディング配列が、特定位置
での制限エンドヌクレアーゼによる開裂により、これら
のプラスミドから単離された。バクテリア性プラスミド
ｐＢＧＨex-1またはｐＰＧＨex-1でそれぞれトランスフ
ェクトしたバクテリアを、続いてｐＧＨ（Ｌ）及びｐＧ
Ｈ（Ｐ）をコードしている配列をそれぞれ発現させ、Ｎ
−末端メチオニンを伴うソマトトロピン（例えば、それ
ぞれｍｅｔ−ＰＧＨ（Ｐ）またはｍｅｔ−ＰＧＨ
（Ｐ））を産生する条件下で培養させたと言うことに着
目しなければならない。該当する配列は、次に、第２図
と第７図に示したように、改変したＭ13ｍｐ８ベクター
（Ｍ13ｍｐ８／ＸｂａＩ）とＭ13ｍｐ９ベクターのＲＦ
ＤＮＡの中にそれぞれ挿入した。再び第２図と第７図
に示すように、所望のｂＧＨ（Ｌ）又はｐＧＨ（Ｐ）を
コードするＤＮＡ配列のＭ13ｍｐ９ＲＦ ＤＮＡへの挿
入は、特定部位制限エンドヌクレアーゼを用いた開裂に
より確認した。大腸菌ＪＭ１０１は、メッシング等(Mes
sing et al，Method in Enzymology(1983)101：20) の
記述と同様にして、これら組換ベクターの１つで導入感
染させ、そしてメッシング等(Messing et al，Gene(198
2)19：269)の記載と同様に、組換ベクターのＳＳ ＤＮ
Ａを分離した。メッシング等(Messing et al) の文献の
関連部分を、ここに引用として挿入する。
【００８２】組換ベクターの一重鎖ＤＮＡは、一旦単離
されると、オリゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘発
によって、ｂＧＨ（Ａ，Ｖ）、ｂＧＨ（Ａ，Ｌ）、ｂＧ
Ｈ（Ｖ）及びｐＧＨ（Ａ）をコードするＤＮＡ配列にな
るように改変された。特に、ｂＧＨ（Ｌ）は第３図に示
すように、ｂＧＨ（Ｌ）コーディング配列の５′末端に
アラニンのコドン、例えば、ＧＣＣを付加して改変し
た。ここで採用した発現系での最適ソマトトロピンの収
量にとって好ましいアラニン コドンはＧＣＣである。
アラニン用の４種のコドンは、どれでもこのように付加
できることが期待される。アラニンのコドンが付加され
て、ｂＧＨ（Ａ，Ｌ）コーディング配列が出来たことの
確認は、サンガー等（Sanger等、Proc. Nat'l. Acad. S
ci., U. S.A. (1977)74：5463）の方法に従って、ｂＧ
Ｈ（Ａ，Ｌ）をコードするＤＮＡ配列の５′の末端の全
部をＤＮＡ配列分析することで達成できる。
【００８３】ｂＧＨ（Ａ，Ｖ）コーディング配列は、オ
リゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘発により、第４
図に示すように、アミノ酸位置１２７［ｂＧＨ（Ａ，
Ｌ）における］のロイシンコドンを、バリン コドン、
例えば、ＧＴＧに変換することにより、ｂＧＨ（Ａ，
Ｌ）コーディング配列に生起させて作製した。この場合
も同様に、どのバリン用コドンでも、この変換に採用で
きるものと考えられる。ｂＧＨ（Ａ，Ｖ）コーディング
配列の作製については、産生したｂＧＨ（Ａ，Ｖ）コー
ディング配列のＤＮＡ配列分析で、同様に確認された。
【００８４】該ｂＧＨ（Ｖ）コーディング配列を含む発
現ベクターでトランスフェクトさせたバクテリア中でｍ
ｅｔ−ｂＧＨ（Ｖ）蛋白を産生するｂＧＨ（Ｖ）コーデ
ィング配列は、同様にして該ｂＧＨ（Ｌ）コーディング
配列をオリゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘発で
［ｂＧＨ（Ｌ）中の］アミノ酸の位置１２６のロイシン
コドンをバリン コドン、例えば、ＧＴＧに変えること
により作製した。
【００８５】ｂＧＨ（Ｐ）コーディング配列からの、オ
リゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘発によるｐＧＨ
（Ａ）コーディング配列の作製は、第８図と、以下に更
に詳述するように行われ、ＤＮＡ配列分析によって確認
された。
【００８６】今、ｂＧＨ（Ａ，Ｌ）、ｂＧＨ（Ａ，
Ｖ）、ｂＧＨ（Ｖ）及びｐＧＨ（Ａ）について例示した
如く所望の外来性ＤＮＡ配列を、単離し、構築したがこ
の分野において通常の知識を有する者にとって常套手段
でありかつ引用した方法によりこれらの配列を複製し、
多数のコピーを産生できる。これらの外来性ＤＮＡ配列
は、所望の外来性ポリペプチドを原核生物内で産生させ
るのに適したベクターに挿入される。
【００８７】Ｎ−末端がアラニンのポリペプチドの産生 既に述べた如く、適切な発現ベクターは、外来性ポリペ
プチドを、選ばれた宿主細胞内で生産するのに必要な転
写及び翻訳用諸シグナルを備えていなければならないだ
けでなく、これら発現ベクターに所望の外来性ＤＮＡ配
列が挿入されていることを識別するマーカー機能もあわ
せて有していなければならない。原核生物の発現ベクタ
ーを用いることによって、その組換ＤＮＡ配列は、形質
導入、形質転換又はトランスフェクション（ここでは
“トランスフェクション”と総称する）を通じて原核生
物の遺伝子相補体の中に付加することができ、そうし
て、当該生物を、次に所望のポリペプチド製造を誘起す
る条件で（一般に、プロモーター及び用いる宿主と双方
に支配される）培養する。このように、本発明に用いら
れる生物の“ゲノム”ＤＮＡは、染色体とエピソームＤ
ＮＡとの両方を含有する。
【００８８】多くの発現ベクターの原核生物宿主細胞で
の外来性遺伝子の発現と、外来性蛋白質の産生につい
て、記述されており、これらはこの分野において通常の
知識を有する者に既に知られていることである。
【００８９】本発明の好ましい実施態様の１つにおいて
は、ベクターｐＢＧＨex-1、（ハーバーグ等(Seeburg e
t al，ＤＮＡ(1983)２(1) ：37-45 参照）と、その改変
ｐＢＧＨex-1であるｐＧＨex-1* とが用いられる。
【００９０】ｂＧＨex-1発現ベクターは、ｂＧＨ（Ｌ）
をコードする遺伝子を持つバクテリア プラスミド、ｐ
ＢＲ３２２である。この遺伝子は、順に、トリプトファ
ンのプロモーター(ptrp)1 個、シャイン−ダルガルノ(S
hine-Delgarno)の配列を１個、ＡＴＧの翻訳開始／メチ
オニンのコドンをｂＧＨ（Ｌ）ポリペプチドの第１アミ
ノ酸、Ｎ−末端フェニアラニンをコードする配列の直前
に有し、ｂＧＨ（Ｌ）コーディング配列と翻訳停止コド
ン１個より成っている。ｐＢＧＨex-1発現ベクターのマ
ーカー機能は、抗生物質耐性である。特に、ｐＢＧＨ
ex-1は２つの抗生物質耐性遺伝子を持ち、１つはアンピ
シリンに抗するもの（ａｍｐr ）もう１つはテトラサイ
クリンに抗するもの（ｔｅｔr ）であって、発現ベクタ
ーと一緒に、安定した形で形質転換させた、元来は非耐
性の宿主を、特定の抗生物質への耐性を与える。このよ
うに、安定化した形質転換菌は、テトラサイクリン、ア
ンピシリン又は両方の抗生物質を含む、いずれかの培地
上で成育させて選抜することができる。
【００９１】本発明の具体例により、ｂＧＨ（Ｌ）コー
ディング配列の代わりに、ｂＧＨ（Ａ，Ｌ）又はｂＧＨ
（Ａ，Ｖ）コーディング配列をそれぞれ含む発現ベクタ
ーｐＭＯＮ３２０９とｐＭＯＮ３２１５を第５図及び第
６図に示すようにして構築した。これらの発現ベクター
の１つで、その後大腸菌のようなバクテリアを、安定的
に形質転換し、形質転換菌を適切な抗生物質を含む培地
での成育で選抜した。形質転換したバクテリアに含まれ
る発現ベクターは、次にｂＧＨ（Ａ，Ｌ）又はｂＧＨ
（Ａ，Ｖ）コーディング配列を５′→３′の方向で正し
く存在しているか否かについて、制限酵素切断法によっ
てスクリーニングした。
【００９２】本発明の実施例１において、ptrpコーディ
ング配列の５′−末端の上流にあるＥｃｏＲＩ制限（酵
素）部位除去により改変されたｐＢＧＨex-1であるｐＢ
ＧＨex-1* を、ｂＧＨ（Ｌ）コーディング配列の代わり
にｂＧＨ（Ａ）コーディング配列を保持する発現ベクタ
ーであるｐＭＯＮ３２１３の作製に使用した。産物であ
るｐＢＧＨex-1* は、第９図に示すようにＥｃｏＲＩ
（切断）部位を１つしか含まない。発現ベクターｐＭＯ
Ｎ３２１３を作製する為にｐＢＧＨex-1* のｐＧＨ
（Ａ）コーディング配列のｐＧＨ（Ｌ）コーディング配
列による置換についての工程を、第１０図に示してい
る。該混合物を用いて、次に大腸菌を形質転換し、その
形質転換菌を、抗生物質を含んだ培地上で生育させスク
リーニングした。形質転換菌に含まれた発現プラスミド
は制限（酵素）開裂法によって、ｐＧＨ（Ａ）コーディ
ング配列を有するものをスクリーニングした。
【００９３】大腸菌の中でｂＧＨ（Ａ，Ｌ）、ｂＧＨ
（Ａ，Ｖ）又はｐＧＨ（Ａ）を産生するものは、ＡＴＣ
Ｃに寄託してあり、その寄託番号がそれぞれ３９９３
６、５３０１０及び５３００９である大腸菌Ｗ３１１０
株、大腸菌ＬＥ３９２株又は大腸菌２９４株は、発現ベ
クターｐＭＯＮ３２０９、ｐＭＯＮ３２１５又はｐＭＯ
Ｎ３２１３のいずれかで、下に更に詳述する方法で形質
転換することにより得られた。形質転換した大腸菌Ｗ３
１１０を、そのソマトトロピンが発現され、所望のポリ
ペプチド産生が可能な条件で培養した。
【００９４】生産されたポリペプチドの精製は、選んだ
蛋白質と宿主細胞との両方に依存する。例えば、大腸菌
のようなバクテリアで産生された蛋白質は、細胞内に
“屈光体（refractile）”として沈澱することがしばし
ばあることが観察されている。“屈光”（又は屈折）の
語を使用する理由は、この物体が位相差顕微鏡で実際に
観察できるからである。生物学的活性をもった形で外来
蛋白質を回収するのに有用な方法の１つは、ヨーロッパ
特許出願公開第１１４，５０６号（１９８４年８月１日
公開）に記述され、引用文献としてここに取入れられ
る。要約すれば、この精製法は、宿主細胞を濃縮し、該
細胞を細胞抽出物又はそのホモジネートを作る為に溶菌
し、次に分別遠心分離で屈光体を単離するもので、工程
はすべて、当該技術分野に属する通常の知識を有する者
には既に知られたものである。単離した屈光体は、グア
ニジン塩酸のような強変性剤に溶解し、この可溶化させ
た蛋白質を、次に適当な溶剤（例えば尿素）中に入れ換
え、クロマトグラフィの手段で精製し、最後に生物学的
に活性化、すなわちその活性な構造となるようにし、次
に酸化するとその活性構造は、ヨーロッパ特許出願公開
第１１４，５０６号に記述されているように、適切なシ
スティン残基間のジスルフィド結合によって保持され
る。このような、外来性蛋白質の更に微に入った精製法
の１つが同時に出願された米国特許出願の２件に述べら
れている。１つは、エス・ビイー・ストールズ(S. B. S
torrs)“ソマトトロピンの可溶化法”であって、ここに
引用記載されている。もう１つはエル・エイ・ベントル
(L. A. Bentle)、エス・ビイー・ストールズ(S. B. Sto
rrs)およびジイー・ダブリュウ・ミッチェル(J. W. Mit
chell)によるもので“ソマトトロピンの天然化法”に関
するものであって同様に引用記載している。これら２つ
の同時に出願された米国特許出願と、本出願とは、全部
共通してモンサント社に譲渡されたものである。その後
の外来性ポリペプチドを、夾雑物であるバクテリア蛋白
質から分離精製することは、ゲル濾過や、イオン交換ク
ロマトグラフなど旧来のクロマトグラフィ法で達成でき
る。典型的な場合には、精製後の組成は、重量比でＮ−
アラニル ポリペプチドが約９０％から約９９．５％で
あって、約０．５％から約１０％が、ポリペプチドを産
生する原核生物宿主由来のものである。
【００９５】本発明の方法で発現した外来性ポリペプチ
ドの少なくとも約８０％は、Ｎ−末端構造が、ＮＨ2 −
アラニンである。残余は主としてメチオニル型で、Ｎ−
末端がＮＨ2 −メチオニン−アラニン…である。しかし
培養条件及び／又は遺伝子発現誘発の時期を変更する
と、アラニンをＮ−末端に持つポリペプチドの比率を少
なくとも９５％に高めることができる。
【００９６】本発明の特に好ましい実施態様の１つとし
て、上述したようにして産生、単離されたソマトトロピ
ンのポリペプチド種は、ソマトトロピン様の生物学的活
性を示すことが、ツシマ及びフリーソン(Tsusima & Fri
esen，J. Clin Endoerinol.Metab.(1973)37：334-337)
が述べている兎肝臓の受容体検定とラットの重量増加生
物検定で示されたことである。後者の検定において、大
腸菌生産のソマトトロピンは、既知単位のソマトトロピ
ン（例えば牛又は豚の脳下垂体ソマトトロピン）と比較
して、種々の注射量で起る脳下垂体切除ラットの体重増
加量で検定される。特に、既知又は標準のソマトトロピ
ン試料を、滴定した投与量（０と６０ミリグラムの間）
で脳下垂体を除去したラット（９５〜１３５ｇ）に毎日
７日間又はそれ以上継続し注射した。多重回帰を用いて
既知、未知のホルモン単位を対数変換した投与量に対し
て回帰する。その傾きを調べて、非平行であることと、
切片共通性を確認する。生物学的活性は、傾斜度に、標
準品の活性を乗じたものとして表わされる。
【００９７】本発明によるＮ−アラニンｂＧＨ産物の使
用は、牛の産乳量を増し、（その結果）その牛の一定産
乳量に対する飼糧必要量を減ずるものと考えられる。乳
牛に、ｂＧＨ種で成熟ｂＧＨ蛋白質の１２６位かその付
近にバリンを持つものを乳汁分泌促進量投与すること
は、これら乳牛の産乳促進に特に適切なことである。本
発明によるそのような産物を牛に投与する場合、注射、
輸血、又は重合体に封入し植込むこと等、又は必要な投
与量の循環系への送達を達成できるものであれば他のど
んな方法も用いられる。医薬品用として使用可能な基礎
製剤、例えば溶液、懸濁液又はゲルなどが、カプセル封
入し又は封入せずに用いられる。これらの製剤は、単一
のｂＧＨ種又は変異種、又は天然産及び／又は変異ポリ
ペプチド［例えばｂＧＨ（Ａ，Ｖ）とｂＧＨ（Ａ，Ｌ）
の混合物、及び／又はｂＧＨ（Ａ，Ｖ）とメチオニン−
ｂＧＨ（Ａ）の混合物］の予め調剤された組合せも含む
ものである。投与量は、１頭１日当り、最少０．００５
ｍｇから約２００ｍｇの範囲であるが、１頭１日約５ｍ
ｇから約４０ｍｇが好ましい。産乳量及び／又は飼糧対
乳量効率にもっとも有効な量は、常法の試験で決定でき
るであろう。実際に好ましいｂＧＨ投与量は、特定の動
物の大きさ、一般健康状態と栄養状態などにより決定さ
れる。産乳量は、牛に対するｂＧＨの影響判定に用いる
ことができるが、牛の他の生産性、即ち成育率と、肉生
産性にも同様に使用できる。若し望むなら、ｂＧＨは、
他の生物学的に活性のある蛋白質、抗原、又はそれらの
相当物などの有用物質と共に投与でき、かつ増強効果が
得られる。
【００９８】前述の如く、本発明は、Ｎ−末端にアラニ
ンを有し、かつ欠失、付加、及び／又は置換をポリペプ
チド鎖に沿って有するｂＧＨ変異体の生産も目的とする
ものである。そのような改変で望まれる、乳汁分泌及び
／又は生長促進特性を持つものは、牛で常法のテストを
行って同定できる。
【００９９】以下の実施例は本発明で好ましい実施態様
を示すものであって、本発明の技術的範囲がそれらに限
定されるものでは勿論ない。本発明を好ましい実施態様
との関係で説明するが、本明細書の記載にもとづいてこ
れらの実施態様を種々変更することは、この分野に属す
る技術について通常の知識を有する者にとっては自明の
ことである。
【０１００】微生物とプラスズミド 下記の微生物は米国メリーランド州ロックビル市パーク
ローンのアメリカンタイプ カルチャー コレクション
(American Type Culture Collection （ＡＴＣＣと称
す）、１２３０１、Parklawn Drive, Rockville, Maryl
and ，２０８５２、Ｕ．Ｓ．Ａ．）から入手可能であ
る： ＡＴＣＣ ３９９３６−大腸菌Ｗ３１１０ ＡＴＣＣ ５３０１０−大腸菌ＬＥ３９２ ＡＴＣＣ ５３００９−大腸菌２９４株 ＡＴＣＣ ５３０２４−大腸菌Ｗ３１１０（ｐＭＯＮ３
２０９） ＡＴＣＣ ５３０２２−大腸菌Ｗ３１１０（ｐＭＯＮ３
２１５） ＡＴＣＣ ５３０２３−大腸菌Ｗ３１１０（ｐＭＯＮ３
２１３） これら寄託菌は、この出願の譲渡人モンサント社に、米
国での特許が付与された場合には、一般公衆が入手可能
となる。これら寄託菌は、この特許出願日にもとづく利
益を享受する米国特許の有効期間中は入手可能となる。
しかしながら、この寄託菌が一般公衆が入手できること
が、政府の決定で保証された特許権を減損させてこの主
題の発明の実施権を設定するものではないことを理解す
べきである。更に本発明は、寄託された微生物によって
その技術的範囲が限定されるわけではない。それは、寄
託した実施態様物は、単に、発明のうち特定な例示とし
て意図したものに過ぎないからである。
【０１０１】
【実施例】実施例１ オリゴヌクレオチドは全て、モンサントの生物科学部門
において、アップライド バイオシステムズのＤＮＡ合
成装置を用い、製造元であるアップライド バイオシス
テムズ社（カルホルニア州ホスター市）の定めた手順に
従って合成した。制限酵素とＤＮＡ改変酵素とは、ニュ
ー イングランド バイオラブズ社（マサチュウセッツ
州ビバレー市）、ニュー イングランド ヌクレアー社
（マサチュウセッツ州ボストン市）及びベセスダ リー
サーチ ラボラトリーズ社（ＢＲＬと称す）（メラーラ
ンド州ゲティスバーク市）から購入した。ＸｂａＩリン
カーは、コラボレーティブ リサーチ社（マサチュウセ
ッツ州レキシントン市）から入手した。Ｔ4 ＤＮＡリガ
ーゼはＢＲＬ社から購入した。32Ｐ標識ヌクレオチド
は、アマーシャム（イリノイ州アーリントン ハイツ
市）から購入した。大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレ
ノウ(Klenow)断片は、ニュー イングランド ヌクレア
ー社から購入した。大腸菌ＪＭ１０１はミネソタ大学
（ミネソタ州セントポール市）のジョー メッシング博
士から入手した。
【０１０２】制限酵素での消化、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ反
応、及び大腸菌ポリメラーゼＩ、クレノウ断片での反応
等は、製造業者の定めた手順に従って行うことができ
る。下記制限酵素の反応に好ましい緩衝液は次のようで
ある：ＸｂａＩ用：１００ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭ tr
is，ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＳＯ4 ；ＥｃｏＲＩ
用、ＨｉｎｄIII 用及びＳｍａＩ用：５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、１０ｍＭ tris，ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＳＯ
4 。Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ反応は、２５ｍＭ tris，ｐＨ
８．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１０ｍＭジチオスレイ
トール（ＤＴＴ）、２ｍＭスペルミヂン及び０．２ｍＭ
ＡＴＰの緩衝液中で進行させた。大腸菌ポリメラーゼ
Ｉ、クレノウ断片は、２０ｍＭ tris、ｐＨ７．２、１
０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１０ｍＭＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰ
及び各１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴ
Ｐを含む緩衝液を用いた。アルファ−32Ｐ−ｄＡＴＰ
（４００ｃｉ／ｍｍｏｌ）は、新に合成したＤＮＡ鎖の
標識が望まれるときにクレノウ反応に添加した。
【０１０３】オリゴヌクレオチドは、ガンマ−32Ｐ−Ａ
ＴＰ（比活性５０００ｃｉ／ｍｍｏｌ以上）と１００ｍ
Ｍ tris、ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、５ｍＭ
ＤＴＴの緩衝液中でＴ4 ＤＮＡキナーゼを用いて標識
した。
【０１０４】ｂＧＨ（Ｌ）及びｐＧＨ（Ｐ）コーディン
グ配列をもったプラスミド（それぞれ、ｐＢＧＨex-1及
びｐＰＧＨex-1′）は、ジェネンテック社（カルホルニ
ア州サンフランシスコ市）から入手した。これらプラス
ミドは、次に述べる諸方法に従って調製できる。即ち、
ヨーロッパ特許出願公開第７５，４４４号（１９８３年
３月３０日公開）；シーバーグ等（Seeburg et al., Ｄ
ＮＡ(1983)２(1) ：37-45)；ギオデール等(Goeddel et
al，Nature(1979)281 ：544-548)；エム．ジェー・キャ
ンベリン及びアール・ロドリゲス(M. J. Chamberlin &
R. Rodriguez)編，２９３章デボア等(DeBoer et al)著,
Promoters ：Structure and Function(1982)) ；ミオ
ザリー及びヤノフスキー(Miozzari & Yanofsky, J. Bac
teriol.(1978)133 ：1457-1466)；及びロゼンベルグ及
びコート（Rosenberg & Court ，Annual Review of Gen
etics 13：319-353)；ヨーロッパ特許出願公開第７５，
４４４号（デボア等）、に示されるように、ｂＧＨ
（Ｌ）に関するＤＮＡから翻訳される最初の２１個の諸
コドンは、ＡＴＧ ＴＴＣ ＣＣＡ ＧＣＴ ＡＴＧＴ
ＣＴ ＣＴＡ ＴＣＴ ＧＧＴ ＣＴＡ ＴＴＣ ＧＣ
Ｔ ＡＡＣ ＧＣＴＧＴＴ ＣＴＴ ＣＧＴ ＧＣＴ
ＣＡＧ ＣＡＴ ＣＴＴ又はこれら諸コドンの機能的な
等価物である。（これら諸コンドに相当する機能のもの
は、勿論いずれも代替させて使用できる。）これら諸公
表物の、他の関連部分も、ここに引用している。
【０１０５】Ｍ13ｍｐ８とＭ13ｍｐ９とは、ジョー メ
ッセング博士（ミネソタ大学）から入手した。
【０１０６】バクテリア生育培地の成分全部と、抗生物
質とは、シグマ社（ミゾリー州セントルイス市）又はデ
イフコ ラボラトリーズ社（ミシガン州デトロイト市）
から入手した。
【０１０７】実施例２ 下記の例は、発現させたときに、Ｎ−末端アラニンを有
するポリペプチドがバクテリア中で直接に産生される為
の、三種のＤＮＡコーディング配列の構築を示すもので
ある。特に、そのＤＮＡコーディング配列は、翻訳開始
／メチオニンのコドン（ＡＴＧ）の直後にアラニンのコ
ドン（例えばＧＣＣ）が来るように構築された。この実
施例は、バクテリア中で発現させたとき、ｍｅｔ−ｂＧ
Ｈ（Ｖ）の産生をもたらすｂＧＨ（Ｖ）ＤＮＡコーディ
ング配列の構築についても示すものである。ｂＧＨ
（Ａ，Ｌ）、ｂＧＨ（Ａ，Ｖ）及びｐＧＨ（Ａ）から成
る三種のＤＮＡコーディング配列は、前もって単離して
あるソマトトロピンＤＮＡ配列に、オリゴヌクレオチド
部位特異的突然変異誘発を生起させて構築した。
【０１０８】ａ．ｂＧＨ（Ａ，Ｌ）ＤＮＡコーディング
配列の構築 ソマトトロピン、ｂＧＨ（Ｌ）のＤＮＡコーディング配
列をｐＧＨex-1からＸｂａＩ断片として切り出し、改変
Ｍ18ｍＰ８／ＸｂａＩベクター（Ｍ13ｍｐ８／Ｘｂａ
Ｉ）のＸｂａＩ部位にクローニングした。元来はＳｍａ
Ｉ部位に、ＸｂａＩリンカーを１つ含むＭ13ｍｐ８／Ｘ
ｂａＩベクターの構築は、第１図に示してある。第２図
に示すように、ＸｂａＩは、ｂＧＨ（Ｌ）ＤＮＡコーデ
ィング配列のどちらかの端を切断し、完全ｂＧＨ（Ｌ）
コーディング配列を切り取ってある。ＸｂａＩ制限（酵
素）切断ｐＢＧＨex-1プラスミドを、Ｔ4 ＤＮＡリガー
ゼ存在下でＸｂａＩ制限酵素による開裂により線状にし
たＲＦ Ｍ13ｍｐ８／ＸｂａＩ ＤＮＡと混合し、牛大
腸アルカリフォスファターゼで処理した。この混合物を
１４℃で１夜インキュベートした。牛大腸アルカリフォ
スファターゼ処理すると、Ｍ13ｍｐ８／ＸｂａＩベクタ
ーが環状に戻ることが阻止される。ｂＧＨ（Ｌ）ＤＮＡ
コーディング配列がＭ13ｍｐ８／ＸｂａＩベクターに挿
入され、組換ベクターＭ13ｍｐ８／ＸｂａＩex-1になっ
たことは、マニアチス、フリッシュ、サンブルーク編の
（Maniatis, Fritsch & Sambrook）Molecular Cloning
：A Laboratory Manual ，(1982)64頁、に述べられた
方法、すなわち、１×ＹＴ培地を軟寒天積層法により調
製したものの上に生育した大腸菌ＪＭ１０１が無色のプ
ラークを発生することで確認できる、そしてこの培地
は、１０μｌ １００ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトピラノサイド）及び５０μｌ ２
％（ｗ／ｖ）Ｘ−ＧＡＬ（５−ブロモ−４−クロロ−３
−インドリル−β−Ｄ−ガラクトコラノシド）を３ｍｌ
の最上層寒天に含み、その大腸菌は、前に述べたような
組換ベクターでトランスフェクションさせたものであ
る。ｂＧＨ（Ｌ）コーディング配列の挿入は前述のマニ
アチスら編の、Molecular Cloning ：A Laboratory Man
ual ，第三章に示す、ＸｂａＩを持つ組換ベクターから
単離したＲＦＤＮＡの分断で挿入された配列である５９
０塩基対の断片を得ることから確認できる。この５９０
塩基対断片を、同書で示された１パーセント（ｗ／ｖ）
アガロースのアガロースゲル電気泳動で同定した。その
後の制限（酵素）断片はすべて、引用したこの方法で同
定した。挿入されたｂＧＨ（Ｌ）コーディング配列の方
向性は、ＲＦ組換ベクターをＳｍａＩとＨｉｎｄIII で
切断することにより確認できる。コーディング配列が正
しく５′→３′方向の場合には、これら制限酵素での切
断で２０７塩基対の断片が得られるに違いない。一重鎖
（ＳＳ）のファージＤＮＡ単離は、メッシング等の方法
(Messing et al. Gene(1982)19：269)に従って実施し
た。そのＭ13ｍｐ８／ＢＧＨex-1ベクターは、次にゾー
ラー及びスミス(Zoller & Smith ，Nuc. Acid. Res．(1
982)10：6487-6500)、及びMethodsin Enzymol．(1983)1
00 ：468-500 。）、リーリス等(Norris et al)，Nuc.
Acid Res.(1983)11：5103〜5112) が記述している方法
と、実質的に相同に、オリゴヌクレオチド部位特異的突
然変異誘発に際し鋳型として用い、この文献の関連部分
はここに引用して記述してある。
【０１０９】第３図には、ｂＧＨ（Ａ，Ｌ）ＤＮＡコー
ディング配列をｂＧＨ（Ｌ）ＤＮＡコーディング配列か
ら作製するための突然変異操作手順を示している。簡単
に説明すれば、オリゴヌクレオチドプライマーで（下記
表１参照）、所望の突然変異配列を有するものを、単鎖
ＤＮＡのＭ13ｍｐ８／ＢＧＨex-1の鋳型として使用する
閉環ＤＮＡコピーを作る時の第一次合成に使用する。こ
うして作製された二本鎖ＤＮＡの環は、不完全品や単鎖
ＤＮＡ環のようなものから、ゾーラー及びスミス(Zolle
r & Smith ，Methods in Enzymol，(1983)100 ：468-50
0)に記述されているアルカリ蔗糖勾配遠心分離を用いて
分離される。この閉環二本鎖ＤＮＡ分子で、メッシング
等(Messing et al，Gene(1982)19：269-276)の記載の如
く、大腸菌ＪＭ１０１を形質転換し、得られた無色のプ
ラークを、ポール ウルトラファイン フィルトレーシ
ョン社（ニユー・ヨーク州グレン コウブ市）から入手
した、ポール フィルター上に拾い上げ、部位特異的突
然変異誘発に用いる32Ｐ−標識型オリゴヌクレオチド
プライマーとのハイブリダイゼーションについてスクリ
ーニングした。該プラークの拾い上げは、ポール濾紙製
造業者によって記述された方法に従って実施した。ハイ
ブリダイゼーション スクリーニングは、ナイロンのバ
イダイン フィルターで、ポール ウルトラファイン
フィルトレーション社がその使用方法について記載して
いる手順書“ Protocol Guide for DNA Transfer to Pa
ll BiodyneTM A Nylon Filters”(1983)に従って実施し
た。フィルターは次第に温度を上げながら、放射能シグ
ナルが、Ｍ13ｍｐ８／ｂＧＨex-1ファージを用いて調製
した対照フィルターから消滅するまで洗浄した。典型的
な洗浄のプロトコール（操作手順書）は、室温で、６×
ＳＳＣ（０．９Ｍ ＮａＣｌ及び０．０９Ｍクエン酸ソ
ーダ）中での１０分間洗浄、その後６×ＳＳＣ中での５
０℃５分間洗浄、及びその後の５℃づつ昇温しての洗浄
である。放射性標識したオリゴヌクレオチドプライマー
と、対照のファージよりも高温でハイブリダイゼーショ
ンを起したプラークは、新しく生成したｂＧＨ（Ａ，
Ｌ）コーディング配列を有するものと仮定し、潜在的陽
性と称した。別に、大腸菌ＪＭ１０１の形質転換体から
個別に無色のプラークをつまみとり５ミリリットル（ｍ
ｌ）の２×ＹＴ培地（１．６％（ｗ／ｖ）トリプトン、
１．０％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．５％（ｗ／ｖ）Ｎ
ａＣｌ）で培養した。メッシング等（Messing et al，G
ene(1982)19：269 ）に従って調製したファージＤＮＡ
は、放射性標識をしたプライマーでハイブリダイゼーシ
ョンしたニトロセルローズの上にドットし、上述の昇温
洗浄を行った。ファージのＤＮＡで対照のＭ13ｍｐ８／
ｂＧＨex-1よりもハイブリダイゼーション温度の高かっ
たものは、前と同様に潜在的陽性と命名した。上記２つ
のいずれのスクリーニング手段で得た潜在的陽性のプラ
ークも、上述のように培養し、単一鎖ファージＤＮＡを
つくる為に使用され、それは、その前にサンガー等(San
ger et al 、Proc. Nat'l. Acad. Sci. ，U. S. A.(197
7)74：5463) の手法で、ｂＧＨ（Ａ，Ｌ）に関するコー
ディング配列を有することを確認するために塩基配列決
定を行った。
【０１１０】Ｍ13ｍｐ８／ＢＧＨex-1(ala) のＲＦ Ｄ
ＮＡは同様に、ＨａｃIII を用いた制限酵素分析でスク
リーニングし、１つの付加アラニン コドンが、開始信
号／メチオニンのコドンであるＡＴＧの後にあることを
確認することによりスクリーニングした。というのはア
ラニンのコドンがもう１つ別にＨａｅIII 制限（酵素）
部位を作出するからである。アラニンのコドンが、ｂＧ
Ｈ（Ｌ）ＤＮＡコーディング配列に付加される頻度は約
２％であった。
【０１１１】ｂ．ｂＧＨ（Ａ，Ｖ）ＤＮＡコーディング
配列の構築 ｂＧＨ（Ａ，Ｖ）ＤＮＡコーディング配列、スクリーニ
ング、及び配列確認は、上記と同様の手順で、第４図に
示すように鋳型がＭ13ｍｐ８／ＢＧＨex-1(ala) である
ことと、以下の表１に示すように異なるオリゴヌクレオ
チドプライマーを用いて実施した。ロイシンのコドンが
バリンのコドンに変換される頻度は約１０％であった。
【０１１２】ｃ．ｂＧＨ（Ａ，Ｖ）ＤＮＡコーディング
配列の構築 ｂＧＨ（Ｖ）ＤＮＡコーディング配列の構築、スクリー
ニングおよび配列の確認は上記と同じ手順を使用して実
施した。特に、鋳型はＭ13ｍｐ８／ＢＧＨex -1で、オリ
ゴヌクレオチドプライマーはｂＧＨ（Ａ，Ｖ）を調製す
るのに用いたものと同じものを用いた。ロイシン コド
ンのバリン コドンへの変換率は約１０％であった。
【０１１３】ｄ．ｐＧＨ（Ａ）ＤＮＡコーディング配列
の構築 オリゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘発を、アラニ
ンのコドンをｐＧＨ（Ｐ）ＤＮＡコーディンク配列に付
加する際、シーブーグ等(Seeburg et al，ＤＮＡ(1983)
２(1) ：37-45)の記述に従い行なった。第８図に示した
突然変異誘発の手順は、次のように実施した。
【０１１４】ｐＰＧＨex-1プラスミドを有する、ｐＧＨ
（Ｐ）の５９０塩基対ＤＮＡは、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄ
III 制限酵素による切断でプラスミドから切り離され、
これら酵素は、プラスミドを夫々ｐＧＨ（Ｐ）に関する
コーディング配列５′−末端と３′−末端で、第７図に
示すように開裂する。制限酵素切断を受けたｐＰＧＨ
ex-1プラスミドは、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄIII で同様に
切断されたＭ13ｍｐ９ＲＦ ＤＮＡと混合したが、その
時牛の大腸アルカリフォスファターゼで前処理をして、
Ｍ13ｍｐ９の制限酵素切断物が再連結するのを阻止し
た。次に当該混合物にＴ4 ＤＮＡリガーゼを加えた。制
限酵素２つで切断したＲＦファージとｐＧＨ（Ｐ）ＤＮ
Ａコーディング配列とは、両端が乱れている為に、ｐＧ
Ｈ（Ｐ）ＤＮＡは選択的にＲＦファージのＤＮＡに挿入
され、第７図に示すように、５′から３′への正しい挿
入が行われる。Ｍ13ｍｐ８／ＢＧＨex-1′について記述
した如く大腸菌ＪＭ１０１は、次にｐＧＨ（Ｐ）ＤＮＡ
コーディング配列を有する組換Ｍｍ13ｐ９／ＰＧＨex-1
で形質転換した。形質転換した大腸菌ＪＭ１０１は、着
色用試薬を含んだ１×ＹＴ培地上で培養され、前述のよ
うに、無色のプラーク形成の有無によりスクリーニング
した。ｐＧＨ（Ｐ）ＤＮＡコーディング配列の挿入は、
次のようにして確認した。無色のプラークを採取し、前
述のようにして単離したＲＦ Ｍ13ｍｐ９／ＰＧＨex-1
ＤＮＡをＥＲｃｏＲＩとＨｉｎｄIII で切断し、アガ
ロース ゲル電気泳動にかけて、挿入されたｐＧＨ
（Ｐ） ＤＮＡよりなる５９０塩基対断片が得られた。
Ｍ13ｍｐ９／ＰＧＨex-1ファージは、大腸菌ＪＭ１０１
で増殖され、単鎖のファージＤＮＡが上述のように単離
された。
【０１１５】Ｍ13ｍｐ９／ＰＧＨex-1ＤＮＡは、次に第
８図に示すように、オリゴヌクレオチド部位特異的突然
変異誘発の鋳型として、上記の、ｂＧＨ（Ａ，Ｌ）コー
ディング配列の作製に特定のプライマーを使用した（以
下の表１を参照）時の手順に従って使用した。アラニン
のコドン、ここではＧＣＣであるが、ｐＧＨ（Ｐ）コー
ディング配列に付加される頻度は約１２％であった。得
られたｐＧＨ（Ａ）コーディング配列は、再びＤＮＡ配
列分析を行って確認された。
【０１１６】
【表２】
【０１１７】実施例３ ここでは、Ｎ−末端にアラニン１つを有するポリペプチ
ドを、バクテリアの中で直接に産生させる、３種の組換
発現ベクターの構築及び発現について例を挙げて説明す
る。こうして調製された３種のポリペプチドは、ｂＧＨ
（Ａ，Ｌ）、ｂＧＨ（Ａ，Ｖ）及びｐＧＨ（Ａ）であ
る。この実施例では、ｂＧＨ（Ｖ）の構築及び発現並び
にｂＧＨ（Ｌ）の発現についても説明する。こうして調
製されたポリペプチドは、それぞれｍｅｔ−ｂＧＨ
（Ｖ）とｍｅｔ−ｂＧＨ（Ｌ）である。
【０１１８】ａ． ｂＧＨ（Ａ，Ｌ）、ｂＧＨ（Ａ，
Ｖ）、ｂＧＨ（Ｌ）及びｂＧＨ（Ｖ）の発現 組換ベクターＭ13ｍｐ８／ＢＧＨex-1 (ala) 、Ｍ13ｍｐ
８／ＢＧＨex-1 (ala ,val) 及びＭ13ｍｐ８／ＢＧＨex-1
(val) に夫々保持されたｂＧＨ（Ａ，Ｌ）、ｂＧＨ
（Ａ，Ｖ）及びｂＧＨ（Ｖ）ＤＮＡコーディング配列
は、ｐＧＨex-1発現プラスミドに保持されたｂＧＨ
（Ｌ）ＤＮＡコーディング配列を置き変えるのに用いら
れた（第５図と第６図を参照）。これは、夫々該当する
Ｍ13 ＲＦ ＤＮＡをＸｂａＩで消化することで実施さ
れた。発現プラスミドｐＢＧＨex-1ｍもはやＸｂａＩで
消化し、次いで牛大腸アルカリフォスファターゼで制限
切断断片の再連結阻止のため処理した。消化されたＲＦ
ＤＮＡは、夫々別個に消化され、処理されたｐＢＧＨ
ex-1 ＤＮＡと混合し、前述のように１夜１４℃に保っ
て連結させた。こうして形成された組換発現ベクター
は、夫々ｐＭＯＮ３２０９、ｐＭＯＮ３２１５及びｐＭ
ＯＮ３２１４と命名され、夫々ｂＧＨ（Ａ，Ｌ）、ｂＧ
Ｈ（Ａ，Ｖ）及びｂＧＨ（Ｖ）コーディング配列を有す
る。これらｐＭＯＮ３２０９、ｐＭＯＮ３２１４、ｐＭ
ＯＮ３２１５又はｐＢＧＨex-1のいずれかを含む連結混
合物を用いて大腸菌Ｗ３１１０を形質転換し、１％（ｗ
／ｖ）トリプシン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、及
び０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌより成り、１２．５μｇ
／ｍｌテトラサイクリンと、２００μｇ／ｍｌアンピシ
リンを含んだルリア（Lauria）ブロス（ＬＢ）上で培養
した。ｐＭＯＮ３２０９を含む大腸菌Ｗ３１１０はＡＴ
ＣＣ寄託番号５３０２４を有する。大腸菌Ｗ３１１０で
ｐＭＯＮ３２１５を含むものは、ＡＴＣＣ寄託番号５３
０２２を有する。形質転換は、簡単に説明すれば、以下
のように実施された。大腸菌Ｗ３１１０を約５０ｍｌの
ＬＢ培地中でＯＤ＝０．６０となるまで生育させた。
【０１１９】培養細胞を次に遠心沈澱によりペレット化
し、１０ｍｌの２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．６、１０
ｍＭ ＮａＣｌより成る緩衝液Ａに再懸濁させた。これ
らの細胞を、再び遠心沈澱しペレット化し１ｍｌの緩衝
液Ａに再懸濁させた。それに２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ
７．６、１０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＣａＣｌ2の
緩衝液Ｂを１４ｍｌ加え、氷上で３０分培養させた。細
胞を、又遠心沈澱しペレット化し、３ｍｌの緩衝液Ｂに
再懸濁させた。この再懸濁液０．２ｍｌと、０．１ｍｌ
の緩衝液Ｂと、０．１から０．５μｇの所望の発現ベク
ター（ｐＭＯＮ３２０９、ｐＭＯＮ３２１５、ｐＭＯＮ
３２１４又はＢＧＨex-1）と混合し、氷上で６０分間イ
ンキュベートした。
【０１２０】インキュベートした混合物は、次に１分間
３７℃に加温し、その後３ｍｌのＬＢ培地を加え、その
混合物を３７℃で６０分間インキュベートした。この細
胞は、次に遠心沈澱しペレット化し、３００ｍｌのＬＢ
培地に再懸濁させ、既に述べた抗生物質を含むＬＢ平板
培地中で生育させた。耐性コロニーを選抜し、ｐＭＯＮ
３２０９、ｐＭＯＮ３２１４、ｐＭＯＮ３２１５及びｐ
ＢＧＨex-1発現ベクターＤＮＡを前述のマニアチスら編
のMolecular Cloning : A Laboratory Manual,記載の手
順で単離した。そのｐＭＯＮ３２０９、ｐＭＯＮ３２１
４、ｐＭＯＮ３２１５及びｐＢＧＨex-1 ＤＮＡを、ｂ
ＧＨ（Ａ，Ｌ）、ｂＧＨ（Ｖ）及びｂＧＨ（Ａ，Ｖ）用
のＤＮＡコーディング配列の正しい方向での存在を示す
５９０塩基対のＸｂａＩ断片１つと、２００塩基対のＨ
ｉｎｄIII ／ＳｍａＩ断片１つの存在についてスクリー
ニングをした。それらｐＭＯＮ３２０９とｐＭＯＮ３２
１５の発現プラスミドは更に、ＨａｅIII 制限（酵素）
分析によって、新しいＨａｅIII 部位が、ＧＣＣ（アラ
ニン）コドンの添加で出現しているか否かについてスク
リーニングした。最後にｐＭＯＮ３２０９と、ｐＭＯＮ
３２１４及びｐＭＯＮ３２１５のベクターの５９０塩基
対断片を、前述のように、ｂＧＨ（Ａ，Ｌ）、ｂＧＨ
（Ｖ）及びｂＧＨ（Ａ，Ｖ）に関するＤＮＡコーディン
グ配列が、これら発現ベクターに存在することを確認す
るために、前述のように、部分的な配列決定操作を行っ
た。
【０１２１】ｐＭＯＮ３２０９、ｐＭＯＮ３２１４、Ｂ
ＧＨex-1、ｐＭＯＮ３２１５のいずれか一つを保有する
大腸菌Ｗ３１１０単一コロニーを別々に１２．５μｇ／
ｍｌテトラサイクリンを含む５ｍｌののＬＢ培地に接種
し、３７℃で１夜通気し生育させた。この一晩培養物
を、０．５ｍｌづつ、別々に２５０ｍｌのフラスコに、
（培地１リットル中に）１００ｍｌの１０×塩（Ｎａ2
ＨＰＯ4 ７０ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4 ３０ｇ、ＮａＣｌ
５ｇ、ＮＨ4 Ｃｌ １０ｇ、を総量１０００ｍｌ中に含
む）、１．２ｍｌ １Ｍ ＭｇＳＯ4 、０．２５ｍｌ
０．１％ Ｂ1 、１２．５ｍｌ ２０％（ｗ／ｖ）蔗
糖、０．０２５ｍｌ １ＭＣａＣｌ2 を含み、０．５％
カザミノ酸と、６．２５μｇ／ｍｌテトラサイクリンを
補充したＭ9培地を２５ｍｌ入れたものに接種するのに
用いた。接種後は各個別に３７℃で通気し、ＯＤ６００
（光学密度６００ナノメーター）＝１．０になる迄生育
させた。培養液を各０．２ｍｌずつフラスコから取出
し、個別にナトリウム ドデシルサルフェート（ＳＤ
Ｓ）−ポリアクリルアミド電気泳動緩衝液中で溶菌さ
せ、レムリー（Laemmli,Nature（１９７０）２２７：６
８０−９８５９に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて検定
した。どちらの遺伝子構築物を含む大腸菌Ｗ３１１０に
も、２２，０００ダルトンの蛋白質が高濃度にあった。
更に、ウエスタンブロット検定（キリービー及びローウ
ォールド、Hybridoma （１９８４）３：２５２−２６２
を参照）によりモノクローナル抗体Ｆ１１−Ａ１−Ｂ６
で牛脳下垂体ソマトトロピンに対して産生されたもの
（同文献参照）に２２，０００ダルトンの蛋白質がいず
れも結合したので、このポリペプチドが、脳下垂体のソ
マトトロピンに関係あることをこれにより確定した。親
ｐＢＲ３２２プラスミドを保持する大腸菌Ｗ３１１０細
胞は、抗ソマトトロピン抗体に結合する２２，０００ダ
ルトンの蛋白質を産生しない。
【０１２２】発現プラスミドｐＭＯＮ３２０９、ｐＭＯ
Ｎ３２１４、ｐＢＧＨex-1及びｐＭＯＮ３２１５を保有
するバクテリアは、下記のようにして貯蔵した。これら
プラスミド（ｐＭＯＮ３２０９、ｐＭＯＮ３２１５、ｐ
ＭＯＮ３２１４又はｐＢＧＨex-1）のいずれか１つで形
質転換した大腸菌Ｗ３１１０の単一コロニーは、５ｍｌ
のＬＢと１２．５μｇ／ｍｌテトラサイクリン中で３７
℃で通気し、一晩生育させた。その各一晩培養物から１
ｍｌを取出し、それを２５ｍｌＬＢ培地に１２．５μｇ
／ｍｌテトラサイクリンを添加したフラスコに個別に加
え、ＯＤ６００＝１．０に達する迄生育させた。その後
各フラスコの細胞は、次に４℃で５分間、６０００×ｇ
の遠心分離により収集した。それら遠心沈澱により得ら
れたペレットを各個別に１２ｍｌのＬＢに７．５％（ｖ
／ｖ）ＤＭＳＯを加えたものに再懸濁し、直ちに１ｍｌ
ずつに分液してドライアイス上で凍結した。これら細胞
を、次に液体窒素冷凍庫に貯蔵した。加えて、約１０マ
イクログラムの純化プラスミドＤＮＡを−８０℃で貯蔵
した。
【０１２３】ｂ． ｐＧＨ（Ａ）ＤＮＡコーディング配
列の発現 第１０図に示すように、組換ベクターのＭ13ｍｐ９／ｐ
ＧＨex-1 (ala) に保持されたｐＧＨ（Ａ）ＤＮＡコーデ
ィング配列は、改変ｐＢＧＨex-1発現ベクターに保持さ
れたｂＧＨ（Ｌ）ＤＮＡコーディング配列と入れ変える
のに用いた。改変発現ベクターｐＢＧＨex-1* は、ｐＢ
ＧＨex-1発現ベクターのトリプトファンプロモーター
（ptrp）の上流にあるＥｃｏＲＩ制限部位を除去したも
のである（図９参照）。この改変発現ベクターｐＢＧＨ
ex-1* を部分的にＥｃｏＲＩで消化して、その後付着末
端を取除くためのＳＩヌクレアーゼ処理をしたものであ
る。この制限（酵素）切断ｐＢＧＨex-1ベクターは、次
にＴ4 ＤＮＡリガーゼで連結して環状に復元し、総て前
述のように、大腸菌ＪＭ１０１の形質転換に使用した。
単一コロニーからのプラスミドＤＮＡは、次に５９０塩
基対のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIII 断片で、ｐＧＨ（Ａ）
ＤＮＡコーディング配列を有するものと、１０５０塩基
対のＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ断片でｐｔｒｐ配列（図９参
照）のものについてスクリーニングした。このＥｃｏＲ
Ｉ制限（酵素）部位を除去することは、特定部位にｐＧ
Ｈ（Ａ）コーディング配列を、第１０図に示す正しい方
向性でｐＢＧＨex-1* 発現ベクターに挿入することを助
ける。こうして形成された発現ベクターは、以後ｐＭＯ
Ｎ３２１３と称する。ｐＭＯＮ３２１３を含む混合物
で、次に大腸菌Ｗ３１１０を形質転換し、形質転換菌
は、前述のようにスクリーニングした。ｐＭＯＮ３２１
３を保有する大腸菌Ｗ３１１０は、ＡＴＣＣ寄託番号５
３０２３を持つ。ｐＢＧＨex-1* 発現ベクター中のｐＢ
ＧＨ（Ｌ）コーディング配列のｐＧＨ（Ａ）コーディン
グ配列による置換は、ｐＭＯＮ３２１３ＤＮＡを単離
し、当該発現ベクターをＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIII で
切断して、５９０塩基対の断片が生じることと、Ｈａｅ
III での切断により、アラニン コドンがｐＧＨ（Ａ）
ＤＮＡコーディング配列の中に存在することにより、も
う一の別のＨａｅIII の制限部位が存在することにより
確認された。ｐＧＨ（Ａ）コーディング配列がｐＭＯＮ
３２１３発現ベクターに存在することの最終的確認は、
ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIII ５９０塩基対断片を前述のよ
うに、部分的に塩基配列を決定することで達成された。
【０１２４】ｐＧＨ（Ａ）ＤＮＡコーディング配列の発
現と、ｐＧＨ（Ａ）の大腸菌Ｗ３１１０内での産生は、
前述のｂＧＨ（Ａ，Ｌ）とｂＧＨ（Ａ，Ｖ）生産で実施
した方法で達成された。前述のＳＤＳ−ＰＡＧＥで実証
しうる、２２，０００ダルトン蛋白質の高濃度について
も同様に達成された。
【０１２５】ｐＭＯＮ３２１３発現ベクターを保有した
大腸菌Ｗ３１１０を前述のように貯蔵し、これも前述し
たように、ｐＧＨ（Ａ）産生の大量培養（１０〜１００
リットルの発酵）に用いた。１００リットルバッチの発
酵液中に含まれるｐＧＨ（Ａ）蛋白質含量は、ロスナー
等（Rosner et al, J. Immunol, Methods （1982）52：
175−181 ）による放射免疫検定により約１ｇ／培養液
１ｌであった。
【０１２６】実施例４ この実施例は、バクテリ内で産生された外来性蛋白質、
ｂＧＨ（Ａ，Ｌ）、ｂＧＨ（Ａ，Ｖ）、ｍｅｔ−ｂＧＨ
（Ｖ）、ｍｅｔ−ｂＧＨ（Ｌ）及びｐＧＨ（Ａ）のＮ−
末端アミノ酸配列を決定するために、本明の実施態様と
して実施したものである。
【０１２７】大腸菌で生産したソマトトロピン ポリペ
プチドは、粗製の、可溶化した屈光体で、ｂＧＨ（Ａ，
Ｌ）、ｂＧＨ（Ａ，Ｖ）、ｍｅｔ−ｂＧＨ（Ｖ）、ｍｅ
ｔ−ｂＧＨ（Ｌ）又はｐＧＨ（Ａ）のいずれかを含むも
のから、キリビー等（Krivi& Rowold, Hybridoma （198
4） 3： 151−161 ）により記述された、免疫吸着クロ
マトグラフィによって精製した。免疫吸着クロマトグラ
フィにより精製したソマトトロピンは、三種共、レムリ
ー（Laemmli,Nature（1970） 227： 680−６８５）に従
った、７．５から１５％（ｗ／ｖ）の勾配ゲルを用いる
１μｇ純化蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により９５％
よりも高いように思われた。純化されたｂＧＨ種の蛋白
濃度は高速液体クロマトグラフィ分析により測定した。
【０１２８】Ｎ−末端配列分析に用いる、免疫親和性ク
ロマトグラフィで純化された蛋白質は、水に対して徹底
的に透析し、その後凍結乾燥した。Ｎ−末端配列分析の
前に、純化した蛋白質は、５０ｍＭ炭酸アンモニウム
と、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含有する緩衝液に再懸
濁し、残留するトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン（トリスと称する）とグリシンを除く為に、同緩衝液
に対して透析した。アプライド バイオシステムズ蛋白
質配列決定機４７０Ａ型（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ． Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， Ｃ
Ａ）を、ハンカピラー等（Hunkapiller et al , Method
s inEnzymol. 91： 399−413 （1983））及びハンカピ
ラー等、（Methods in Enzymol. 91： 486−493 （198
3））に記述されているようにＮ−末端配列分析の全て
に用いた。
【０１２９】以下の表２は、ｂＧＨ（Ａ，Ｌ）、ｂＧＨ
（Ａ，Ｖ）、ｍｅｔ−ｂＧＨ（Ｖ）、ｍｅｔ−ｂＧＨ
（Ｌ）、及びｐＧＨ（Ａ）のポリペプチドの幾つかの試
料について行ったアミノ酸配列分析の結果を示す。Ｎ−
末端がメチオニンの蛋白質は、この表で、試料中の全ソ
マトトロピンのパーセンテージとして示している。メチ
オニンの定量には、２つの方法が用いられた。間接法で
は、主成分のＮＨ2 −ａｌａ−ｐｈｅ…中のＮＨ2 −ｍ
ｅｔ−ａｌａ−ｐｈｅ…の量を、遅延信号（lagsignals
）の差異から計算した。この手順は、“正常”配列遅
延の推定に準拠し、それは、サイクル毎に変動があっ
て、存在するＮＨ2 −ａｌａ−ｐｈｅ−配列のおおざっ
ぱな推定に過ぎない。エドマン分解反応よりなる直接法
でＰＴＨ−ｍｅｔを高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬ
Ｃ）で、化学的ノイズから分離した後にＰＴＨ−ｍｅｔ
のＰＴＨ−ａｌａに対する信号強度を比較するものであ
る。“ＰＴＨ”は、フェニルチオヒダントインを示す。
特に、エドマン分解配列決定反応は、Ｎ−末端アミノ酸
をアミノ酸の開裂とその後に起るそのアミノ酸のＰＴＨ
−誘導体の遊離を引起す試薬で反応させることである。
後者の手順は、混在する遊離アミノ酸が微少量であれ
ば、％ｍｅｔ−ａｌａ−ｐｈｅ…の評価を良好なものに
するものである。
【０１３０】以下の表２に示したように、Ｎ−末端配列
決定の結果、Ｎ−末端メチオニンの次がフェニルアラニ
ンであるときには、メチオニンのプロセシングの証拠は
ない。しかし、ＭＢＳ（Ａ，Ｌ）とＭＢＳ（Ａ，Ｖ）と
の遺伝子構築から作製された蛋白質分子の８０％又はそ
れ以上がＮ−末端にメチオニンではなくアラニンを有し
ている。Ｎ−末端メチオニンのプロセシングの程度は、
細胞内で、発酵バッチが異なる毎に相異する。しかし、
ソマトトロピン分子の少くとも８０％に起る。加えて、
形質転換した微生物内で生産されるソマトトロピンのレ
ベルは、バクテリア全蛋白質中で概略１０から１５％と
することに成功した。
【０１３１】
【表３】
【０１３２】実施例５ この実施例は、乳牛に於ける産乳の促進に関してバクテ
リア中で産生されたｂＧＨ種の活性の測定を目的として
行ったものである。表３に示す如く、ｂＧＨ（Ａ，Ｖ）
もｍｅｔ−ｂＧＨ（Ｖ）も共にロイシンを含有する類縁
体であるｂＧＨ（Ａ，Ｌ）とｍｅｔ−ｂＧＨ（Ｌ）より
も予想を越えて著しく産乳を促進した。更に、供試した
バリンｂＧＨ種はロイシンｂＧＨ種に対して全体として
比較すると統計学的に（Ｐ＜０．０２）産乳を促進し
た。
【０１３３】要約すればこの試験は以下の如く実施し
た。第二及び第三乳汁分泌期のホルスタイン種乳牛に炭
酸水素ナトリウム溶液ｐＨ９．８±０．５、単独（以後
「対照試料」という）を５ｍｌ又は約２５ｍｇのｂＧＨ
（Ａ，Ｖ）、ｂＧＨ（Ａ，Ｖ）およびｍｅｔ−ｂＧＨ
（Ｌ）（以後総称して「試験ソマトトロピン」という）
を毎日与えた。試験ソマトトロピンと対照試料はいずれ
も２１日間連続して毎日半腱様筋への筋肉内注射により
非経口的に投与した。各乳牛の各産乳量を各午前と午後
に分け最初の注射の６日前から２１日間の投与期間の間
記録した。乳中の脂肪、蛋白および体細胞について毎週
ミズリー州スプリングフィルド市、６５８０３、のディ
エイチ アイ エイ（ＤＨＩＡ）テスティング セン
ターの同試験室で分析した。以下の表３に示した結果
は、乳牛へのｂＧＨ（Ａ，Ｖ）の投与によりｂＧＨ
（Ａ，Ｌ）を使用した場合より約５０％以上、ｍｅｔ−
ｂＧＨ（Ｖ）ではｍｅｔ−ｂＧＨ（Ｌ）より約１７％以
上産乳量が増加したことを示している。本発明のバリン
ｂＧＨ種によりもたらされたこの様な予期しない生産性
の利点は、酪農家にとって潜在的ではあるが大変経済的
な利益を有することは明らかである。
【０１３４】
【表４】
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｍ13ｍｐ８／ＢＧＨex-1の構築を示す。
【図２】Ｍ13ｍｐ８／ＢＧＨex-1の構築を示す。
【図３】ｂＧＨ（Ａ，Ｌ）ＤＮＡコーディング配列がオ
リゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘発によって作製
されることを示す。
【図４】ｂＧＨ（Ａ，Ｖ）ＤＮＡコーディング配列がオ
リゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘発によって作製
されることを示す。
【図５】ｐＭＯＮ３２０９発現ベクターの構築を示す。
【図６】ｐＭＯＮ３２１５発現ベクターの構築を示す。
【図７】Ｍ13ｍｐ９／ＢＧＨex-1の構築を示す。
【図８】ｐＧＨ（Ａ）ＤＮＡコーディング配列がオリゴ
ヌクレオチド部位特異的突然変異誘発によって作製され
ることを示す。
【図９】ｐＢＧＨex-1* の構築を示す。
【図１０】ｐＭＯＮ３２１３発現ベクターの構築を示
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ 9282−4Ｂ // Ａ６１Ｋ 38/27 ＡＥＲ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (13)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 アミノ末端アラニンを有する外来性ポリ
    ペプチドをバクテリアを利用して製造する方法であっ
    て、翻訳開始シグナル／メチオニンコドンを含有する１
    ないし約３個の連続したメチオニンコドンが直前にある
    アミノ末端アラニンのコドンを有する牛ソマトトロピン
    又は豚ソマトトロピンから選ばれた家畜ソマトトロピン
    をコードするＤＮＡ配列であり、かつ本来の遺伝子から
    産生されたｃＤＮＡに比較してポリペプチドアミノ末端
    をコードする部分の核酸配列中に発現を増加させるに有
    効な改変を含有する前記ＤＮＡ配列を、選択されたバク
    テリア中で発現させて前記アミノ末端アラニンを有する
    ソマトトロピンをバクテリア中で産生させること、及び
    産生された前記アミノ末端アラニンを有するポリペプチ
    ドを回収することよりなる前記方法。
  2. 【請求項２】 前記バクテリア内で産生された家畜ソマ
    トトロピンが、牛ソマトトロピンである請求項１に記載
    の方法。
  3. 【請求項３】 前記バクテリアが、大腸菌（Ｅ． ｃｏ
    ｌｉ）である請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記バクテリア内で産生されるソマトト
    ロピンが、１２６位のアミノ酸位置に相当するバリン／
    ロイシン不均一性位置にバリンを有する牛ソマトトロピ
    ン及び前記位置にロイシンを有する牛ソマトトロピンか
    ら選ばれたものである請求項２に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記ソマトトロピンをコードするＤＮＡ
    配列が、選択された牛ソマトトロピンをコードするもの
    である請求項２に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記ソマトトロピンが、１２６位のアミ
    ノ酸位置に相当するバリン／ロイシン不均一性位置にロ
    イシンを有する牛ソマトトロピンであり、前記バクテリ
    アがＡＴＣＣ５３０２２株である請求項２に記載の方
    法。
  7. 【請求項７】 前記ソマトトロピンが、１２６位のアミ
    ノ酸位置に相当するバリン／ロイシン不均一性位置にロ
    イシンを有する牛ソマトトロピンであり、前記バクテリ
    アがＡＴＣＣ５３０２４株である請求項２に記載の方
    法。
  8. 【請求項８】 前記回収されたソマトトロピンが、天然
    に存在する牛ソマトトロピンのアミノ酸配列と本質的に
    同じものである請求項２に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記バクテリア内に産生された家畜ソマ
    トトロピンが、豚ソマトトロピンである請求項１に記載
    の方法。
  10. 【請求項１０】 前記バクテリアが大腸菌である請求項
    ９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記バクテリアがＡＴＣＣ５３０２３
    株である請求項９に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 １から約３の連続するメチオニンの諸
    コドンと、その直後に配置されたアミノ末端アラニンを
    有する豚ソマトトロピンをコードする配列とを含むＤＮ
    Ａにおいて、該豚ソマトトロピンをコードする配列は本
    来の遺伝子から産生されたｃＤＮＡに比較してポリペプ
    チドアミノ末端をコードする部分の核酸配列中に発現を
    増加させるに有効な改変を含有するものであり、かつ該
    メチオニンの諸コドンは翻訳開始シグナル／メチオニン
    コドンを含むものである前記ＤＮＡが、バクテリアプラ
    スミド及びバクテリオファージから選択されたベクター
    内に挿入されており、また該ベクターはバクテリア内で
    該ＤＮＡを発現させる能力のあるものであることを特徴
    とする組換えＤＮＡベクター。
  13. 【請求項１３】 バクテリア内で機能する１つのプロモ
    ーターと、１つのリボソーム結合部位と、１〜約３個の
    連続したメチオニンの諸コドンと、その直後に配置され
    たアミノ末端アラニンを有する豚ソマトトロピンをコー
    ドする配列と、さらにその後に配置された翻訳停止シグ
    ナルとを有する遺伝子であって、該メチオニンの諸コド
    ンは、翻訳開始シグナル／メチオニンコドンを含み、豚
    ソマトトロピンをコードする配列は本来の遺伝子から産
    生されたｃＤＮＡに比較してポリペプチドアミノ末端を
    コードする部分の核酸配列中に発現を増加させるのに有
    効な改変を含有するものである前記遺伝子。
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