JP2682738B2 - 成長ホルモン融合蛋白質 - Google Patents
成長ホルモン融合蛋白質Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、成長因子、その融合蛋白質としての製造お
よびその使用、ならびに融合蛋白質としての他の蛋白質
の製造に関する。
よびその使用、ならびに融合蛋白質としての他の蛋白質
の製造に関する。
インスリン様成長因子−Ｉ（IGF−Ｉ）は広範囲の培
養細胞の成長を刺激することが明らかにされている小さ
い蛋白質である。動物の成長は、下垂体欠損、正常およ
び異化状態でも刺激を受ける。
養細胞の成長を刺激することが明らかにされている小さ
い蛋白質である。動物の成長は、下垂体欠損、正常およ
び異化状態でも刺激を受ける。
ヒト、ウシおよびブタIGF−１はすべて同一の配列を
有し、それは、単一文字アミノ酸コードおよびアミノ末
端からの番号を用いて示すと次の通りである。
有し、それは、単一文字アミノ酸コードおよびアミノ末
端からの番号を用いて示すと次の通りである。
動物および細胞の成長の結果は、IGF−Ｉが （１）ヒトの成長ホルモン欠乏の処置 （２）ヒトの重篤な異化状態たとえば火傷、感染または
他の外傷後における体蛋白質の喪失の抑制 （３）畜産動物の成長速度の増大、栄養の再分配および
飼料変換効率の向上、および （４）培養細胞の増殖の支持 に有用に適用できるとの解釈をもたらすものであった。
他の外傷後における体蛋白質の喪失の抑制 （３）畜産動物の成長速度の増大、栄養の再分配および
飼料変換効率の向上、および （４）培養細胞の増殖の支持 に有用に適用できるとの解釈をもたらすものであった。
したがって、動物の成長試験、臨床的検討および細胞
培養に使用するための哺乳動物IGF−Ｉには市場の需要
がある。しかしながら、天然原料および／または組換え
DNA合成法からの収率は依然として低いままである。
培養に使用するための哺乳動物IGF−Ｉには市場の需要
がある。しかしながら、天然原料および／または組換え
DNA合成法からの収率は依然として低いままである。
本発明の目的はしたがって、従来技術における１また
は２以上の困難を克服し、また少なくともそれを緩和す
ることにある。
は２以上の困難を克服し、また少なくともそれを緩和す
ることにある。
本発明は、その第一の態様として、 適当な発現ベクター； 成長ホルモン活性を有する第一のポリペプチド、また
はそのフラグメントをコードする第一のDNA配列；およ
び 第一のDNA配列３′末端に連結し、第二のポリペプチ
ドをコードする第二のDNA配列 を包含するプラスミドを提供する。
はそのフラグメントをコードする第一のDNA配列；およ
び 第一のDNA配列３′末端に連結し、第二のポリペプチ
ドをコードする第二のDNA配列 を包含するプラスミドを提供する。
このような構造体は、封入体内に高収率で融合蛋白質
を発現し、これは成長ホルモン単独について開発された
従来技術の場合に匹敵する生物学的活性を示すことが明
らかにされた。生物体の破壊、封入体からの融合蛋白質
の単離、正しいジスルフィド結合を作るための酸化およ
び精製により、延長されたポリペプチド、たとえば生物
活性インスリン様成長因子が生成する。切断可能な配列
をコードする配列が第一のDNA配列の３′末端に導入さ
れていれば、切断工程の付加により、延長されていない
ポリペプチドを得ることもできる。
を発現し、これは成長ホルモン単独について開発された
従来技術の場合に匹敵する生物学的活性を示すことが明
らかにされた。生物体の破壊、封入体からの融合蛋白質
の単離、正しいジスルフィド結合を作るための酸化およ
び精製により、延長されたポリペプチド、たとえば生物
活性インスリン様成長因子が生成する。切断可能な配列
をコードする配列が第一のDNA配列の３′末端に導入さ
れていれば、切断工程の付加により、延長されていない
ポリペプチドを得ることもできる。
適当なクローニングベクターはプラスミドクローニン
グベクターから選択することができる。プラスミドクロ
ーニングベクターは、以下に延べるように、インスリン
様成長因子融合蛋白質の高収率での製造過程に利用する
ことができる。プラスミドクローニングベクターは、強
力なtrcプロモーターの下流に、改良RBS/スペーサーお
よび戦略的な５′−コドン変化を有するプラスミドpGHX
C、４（J.Brosiusら:J.Biol Chem.260,3539,1985;P.D.V
ize＆J.R.E.Wells:FEBS Lett,213,155,1987）であって
もよい。
グベクターから選択することができる。プラスミドクロ
ーニングベクターは、以下に延べるように、インスリン
様成長因子融合蛋白質の高収率での製造過程に利用する
ことができる。プラスミドクローニングベクターは、強
力なtrcプロモーターの下流に、改良RBS/スペーサーお
よび戦略的な５′−コドン変化を有するプラスミドpGHX
C、４（J.Brosiusら:J.Biol Chem.260,3539,1985;P.D.V
ize＆J.R.E.Wells:FEBS Lett,213,155,1987）であって
もよい。
成長ホルモン活性を有するペプチドまたはそのフラグ
メントをコードする第一のDNA配列は、ブタ成長ホルモ
ン（pGH）活性を有するペプチドをコードするものであ
ってもよい。メチオニンブタ成長ホルモン（metpGHまた
はMpGH）配列が好ましい。第一のDNA配列は、metpGHの
すべての191個のＮ−末端アミノ酸、またはその任意の
フラグメントをコードするものであってもよい。第一の
DNA配列は、metpGHのほぼ最初の100個のＮ−末端アミノ
酸をコードするものであり、さらに好ましくはmetpGHの
最初のほぼ46個のＮ−末端アミノ酸、とくに好ましくは
metpGHの最初の11個のＮ−末端アミノ酸をコードするも
のである。
メントをコードする第一のDNA配列は、ブタ成長ホルモ
ン（pGH）活性を有するペプチドをコードするものであ
ってもよい。メチオニンブタ成長ホルモン（metpGHまた
はMpGH）配列が好ましい。第一のDNA配列は、metpGHの
すべての191個のＮ−末端アミノ酸、またはその任意の
フラグメントをコードするものであってもよい。第一の
DNA配列は、metpGHのほぼ最初の100個のＮ−末端アミノ
酸をコードするものであり、さらに好ましくはmetpGHの
最初のほぼ46個のＮ−末端アミノ酸、とくに好ましくは
metpGHの最初の11個のＮ−末端アミノ酸をコードするも
のである。
本発明の好ましい態様においては、第一のDNA配列は
その３′末端に切断可能な配列を包含する。
その３′末端に切断可能な配列を包含する。
とくに、本発明の好ましい態様においては、第一のDN
A配列は MFPAMPLSSLFANAVLRAQHLHQLAADTYKEFERAYIPEGQRYSIQ−， MFPAMPLSSLFANAVLRAQHLHQLAADTYKEFERAYIPEGQRYSIQVN−
または MFPAMPLSSLFANAVLRAQHLHQLAADTYKEFERAYIPEGQRYSIQVNFA
HY−， から選ばれるアミノ酸配列をコードする。
A配列は MFPAMPLSSLFANAVLRAQHLHQLAADTYKEFERAYIPEGQRYSIQ−， MFPAMPLSSLFANAVLRAQHLHQLAADTYKEFERAYIPEGQRYSIQVN−
または MFPAMPLSSLFANAVLRAQHLHQLAADTYKEFERAYIPEGQRYSIQVNFA
HY−， から選ばれるアミノ酸配列をコードする。
これらの配列には、順次、開始メチオニン、pGHの最
初の45個のアミノ酸、バリン、アスパラギン、フェニル
アラニン、アラニン、ヒスチジンおよびチロシンが存在
する。
初の45個のアミノ酸、バリン、アスパラギン、フェニル
アラニン、アラニン、ヒスチジンおよびチロシンが存在
する。
本発明の別の好ましい態様においては、第一のDNA配
列は MFPAMPLSSLF−， MFPAMPLSSLFVN−， MFPAMPLSSLFVNFAHY−または MFPAMPLSSLFVNGFAHY− から選ばれるアミノ酸配列をコードする。
列は MFPAMPLSSLF−， MFPAMPLSSLFVN−， MFPAMPLSSLFVNFAHY−または MFPAMPLSSLFVNGFAHY− から選ばれるアミノ酸配列をコードする。
これらの配列には、順次、開始メチオニン、pGHの最
初の10個のアミノ酸、バリン、アスパラギン、グリシ
ン、フェニルアラニン、ヒスチジンおよびチロシンが存
在する。
初の10個のアミノ酸、バリン、アスパラギン、グリシ
ン、フェニルアラニン、ヒスチジンおよびチロシンが存
在する。
これらの例において、Ｃ−末端アスパラギンは、Ｎ−
末端グリシンを有するペプチドと連結すると、ヒドロキ
シルアミン切断可能部位を与えることは、本技術分野の
熟練者には自明であろう。このようなペプチドはIGF−
Ｉである。また、フェニルアラニン−アラニン−ヒスチ
ジン−チロシン（FAHY）ペプチドは大部分のＮ−末端ア
ミノ酸をもつペプチドに連結した場合、切断可能部位を
与えることが知られている（P.Carterら:Protein−Stru
cture Function and Genetics、６:240,1989）。この部
位は、変異体ズブチリシン酵素、ズブチリシン−BPN′
によってＣ−末端側で切断される。
末端グリシンを有するペプチドと連結すると、ヒドロキ
シルアミン切断可能部位を与えることは、本技術分野の
熟練者には自明であろう。このようなペプチドはIGF−
Ｉである。また、フェニルアラニン−アラニン−ヒスチ
ジン−チロシン（FAHY）ペプチドは大部分のＮ−末端ア
ミノ酸をもつペプチドに連結した場合、切断可能部位を
与えることが知られている（P.Carterら:Protein−Stru
cture Function and Genetics、６:240,1989）。この部
位は、変異体ズブチリシン酵素、ズブチリシン−BPN′
によってＣ−末端側で切断される。
ポリペプチドをコードする第二のDNA配列は、生物活
性を有するポリペプチドをコードしていてもよい。第二
のDNA配列はインスリン様成長因子活性をもつペプチド
をコードしていてもよい。インスリン様成長因子はイン
スリン様成長因子−Ｉ（IGF−Ｉ）であってもよい。IGF
−Ｉ以外のペプチドも使用でき、以下のIGF−Ｉについ
ての言及は単なる例示と理解すべきである。たとえば、
ポリペプチドをコードする第二のDNA配列は、 ヒトIGF−Ｉおよびヒト以外の種からのIGF−Ｉを含む
IGF−Ｉ、 アミノ酸置換または欠失によって形成される類縁体た
とえば共有の国際特許出願、PCT/AU86/00246およびPCT/
AU88/00485に特定されているようなIGF−Ｉ類縁体 インスリン様成長因子−II（IGF−II）またはそのIGF
−II類縁体 ニワトリヒストン H2A.1、または ヒト転写因子SP1−1acZ融合蛋白質から選ばれ、使用
される。
性を有するポリペプチドをコードしていてもよい。第二
のDNA配列はインスリン様成長因子活性をもつペプチド
をコードしていてもよい。インスリン様成長因子はイン
スリン様成長因子−Ｉ（IGF−Ｉ）であってもよい。IGF
−Ｉ以外のペプチドも使用でき、以下のIGF−Ｉについ
ての言及は単なる例示と理解すべきである。たとえば、
ポリペプチドをコードする第二のDNA配列は、 ヒトIGF−Ｉおよびヒト以外の種からのIGF−Ｉを含む
IGF−Ｉ、 アミノ酸置換または欠失によって形成される類縁体た
とえば共有の国際特許出願、PCT/AU86/00246およびPCT/
AU88/00485に特定されているようなIGF−Ｉ類縁体 インスリン様成長因子−II（IGF−II）またはそのIGF
−II類縁体 ニワトリヒストン H2A.1、または ヒト転写因子SP1−1acZ融合蛋白質から選ばれ、使用
される。
すなわち、本発明の好ましい態様においては、プラス
ミド pMpGH（46）VN/IGF−Ｉ pMpGH（46）VN/G3IGF−Ｉ pMpGH（46）VN/R3IGF−Ｉ pMpGH（46）VNFAHY/ニワトリヒストンH2A.1 pMpGH（46）／ヒト転写因子Sp1−lacZ融合蛋白質 pMpGH（42）FAHY/des（１−３）IGF−Ｉ pMpGH（11）VN/IGF−Ｉ pMpGH（11）VN/G3IGF−Ｉ pMpGH（11）VN/R3IGF−Ｉ pMpGH（11）VNGFAHY/des（１−３）IGF−Ｉ pMpGH（11）VNGFAHY/IGF−Ｉ pMpGH（11）VNFAHY/ニワトリヒストンH2A.1 pMpGH（11）／ヒト転写因子Sp1−lacZ融合蛋白質 を提供する。
ミド pMpGH（46）VN/IGF−Ｉ pMpGH（46）VN/G3IGF−Ｉ pMpGH（46）VN/R3IGF−Ｉ pMpGH（46）VNFAHY/ニワトリヒストンH2A.1 pMpGH（46）／ヒト転写因子Sp1−lacZ融合蛋白質 pMpGH（42）FAHY/des（１−３）IGF−Ｉ pMpGH（11）VN/IGF−Ｉ pMpGH（11）VN/G3IGF−Ｉ pMpGH（11）VN/R3IGF−Ｉ pMpGH（11）VNGFAHY/des（１−３）IGF−Ｉ pMpGH（11）VNGFAHY/IGF−Ｉ pMpGH（11）VNFAHY/ニワトリヒストンH2A.1 pMpGH（11）／ヒト転写因子Sp1−lacZ融合蛋白質 を提供する。
また、本発明は他の態様として、 適当な発現ベクター； 成長ホルモン活性を有する第一のポリペプチド、また
はそのフラグメントをコードする第一のDNA配列；およ
び 第一のDNA配列の３′末端に接合し、第二のポリペプ
チドをコードする第二のDNA配列 を包含するプラスミド、ならびに単細胞生物体を準備
し、 上記プラスミドを上記単細胞生物体中に導入し、 得られた生物体を培養し、 上記DNA配列によってコードされたポリペプチドを発
現させ、ついで 上記ポリペプチドを培養液から単離することを包含す
る融合蛋白質の製造方法を提供する。
はそのフラグメントをコードする第一のDNA配列；およ
び 第一のDNA配列の３′末端に接合し、第二のポリペプ
チドをコードする第二のDNA配列 を包含するプラスミド、ならびに単細胞生物体を準備
し、 上記プラスミドを上記単細胞生物体中に導入し、 得られた生物体を培養し、 上記DNA配列によってコードされたポリペプチドを発
現させ、ついで 上記ポリペプチドを培養液から単離することを包含す
る融合蛋白質の製造方法を提供する。
本発明のこの態様による方法では、単細胞生物体は原
核生物であってよい。原核生物は細菌株たとえば大腸菌
株であってもよい。大腸菌株、大腸菌JM101はとくに適
当であることがわかっている。
核生物であってよい。原核生物は細菌株たとえば大腸菌
株であってもよい。大腸菌株、大腸菌JM101はとくに適
当であることがわかっている。
本発明のこの態様に用いられるプラスミドは上述の任
意のプラスミドとすることができる。
意のプラスミドとすることができる。
本明細書に特記したプラスミドを包含する大腸菌のサ
ンプルはアデレード大学の細胞培養収集機関（North Te
rrace,Adelaide,South Australia,豪州）に維持されて
いる。
ンプルはアデレード大学の細胞培養収集機関（North Te
rrace,Adelaide,South Australia,豪州）に維持されて
いる。
本発明の方法の製造工程はよく知られた方法、たとえ
ば以下の実施例に例示するような方法を用いて実施でき
る。
ば以下の実施例に例示するような方法を用いて実施でき
る。
プラスミドはそれ自体公知の任意の方法で単細胞生物
体中に導入できる。たとえば、トランスホーメーショ
ン、トランスダクションまたはトランスフェクション技
術が使用できる。
体中に導入できる。たとえば、トランスホーメーショ
ン、トランスダクションまたはトランスフェクション技
術が使用できる。
ポリペプチド生成物の単離が望ましい場合には、細胞
をたとえば細胞溶解によって破壊後に、慣用操作を使用
することができる。融合蛋白質の単離工程は、たとえ
ば、イオン交換、アフィニティー、逆相もしくはサイジ
ング技術によるクロマトグラフィーを用いて、および／
または沈降たとえば遠心分離によって、またポリペプチ
ドの精製のための他の公知技術によって実施できる。
をたとえば細胞溶解によって破壊後に、慣用操作を使用
することができる。融合蛋白質の単離工程は、たとえ
ば、イオン交換、アフィニティー、逆相もしくはサイジ
ング技術によるクロマトグラフィーを用いて、および／
または沈降たとえば遠心分離によって、またポリペプチ
ドの精製のための他の公知技術によって実施できる。
融合蛋白質が不溶性の凝集体として発現されたり変性
している場合には、慣用技術を用いて可溶化および／ま
たは再生を行うことができる。
している場合には、慣用技術を用いて可溶化および／ま
たは再生を行うことができる。
本発明の方法の好ましい態様においては、したがっ
て、 適当な発現ベクター、成長ホルモン活性を有する第一
のポリペプチドをコードする第一のDNA配列またはその
中に含まれるそのフラグメント；および第一のDNA配列
の３′末端に連結し第二のポリペプチドをコードする第
二のDNA配列を包含するプラスミドを準備し； プラスミドDNAを消化して発現ベクターおよび第一のD
NA配列を包含するDNAのフラグメントを単離し； 第一のDNA配列を突然変異に付してその３′末端に切
断可能な配列を導入し；ついで 発現ベクターと第一のDNA配列を含有するフラグメン
トを第二のDNA配列にリゲートする予備的工程がさらに
包含される。
て、 適当な発現ベクター、成長ホルモン活性を有する第一
のポリペプチドをコードする第一のDNA配列またはその
中に含まれるそのフラグメント；および第一のDNA配列
の３′末端に連結し第二のポリペプチドをコードする第
二のDNA配列を包含するプラスミドを準備し； プラスミドDNAを消化して発現ベクターおよび第一のD
NA配列を包含するDNAのフラグメントを単離し； 第一のDNA配列を突然変異に付してその３′末端に切
断可能な配列を導入し；ついで 発現ベクターと第一のDNA配列を含有するフラグメン
トを第二のDNA配列にリゲートする予備的工程がさらに
包含される。
消化に続いて所望により精製工程を含めて精製DNAフ
ラグメントを得ることができる。
ラグメントを得ることができる。
適当なプラスミド発現ベクターは任意の適当なタイプ
であってよい。プラスミドpGHXSC.4が使用できる。プラ
スミドpGHXSC.4はpGHコード領域を包含する。
であってよい。プラスミドpGHXSC.4が使用できる。プラ
スミドpGHXSC.4はpGHコード領域を包含する。
第二のDNA配列は天然または合成起源から得られる。
すなわち、本発明のさらに好ましい態様によれば、本発
明の方法はさらに、第二のDNA配列を化学的に合成する
予備工程を包含する。
すなわち、本発明のさらに好ましい態様によれば、本発
明の方法はさらに、第二のDNA配列を化学的に合成する
予備工程を包含する。
化学的合成は任意の慣用方法で行うことができる。
消化およびリゲーション工程は任意の慣用方法で行う
ことができる。
ことができる。
突然変異工程はin vitro突然変異とすることができ
る。in vitro突然変異反応では適当なオリゴマーヌクレ
オチドを用いて第一および第二のDNA配列の間に切断可
能な結合を導入できる。ヒドロキシルアミン切断可能な
結合が導入できる。別法として、またはさらに、ズブチ
リシン切断可能結合を導入してもよい。
る。in vitro突然変異反応では適当なオリゴマーヌクレ
オチドを用いて第一および第二のDNA配列の間に切断可
能な結合を導入できる。ヒドロキシルアミン切断可能な
結合が導入できる。別法として、またはさらに、ズブチ
リシン切断可能結合を導入してもよい。
所望により、突然変異工程は、成長ホルモンのコード
配列のサイズの低減および／またはさらに突然変異工程
を行うことを容易にする認識部位の導入を包含すること
もできる。
配列のサイズの低減および／またはさらに突然変異工程
を行うことを容易にする認識部位の導入を包含すること
もできる。
すなわち、本発明のさらに好ましい態様においては、
本発明の方法はさらに、 適当な発現ベクター；成長ホルモン活性を有する第一
のポリペプチドをコードする第一のDNA配列またはそれ
に含まれるそのフラグメント；および第一のDNA配列の
３′末端に連結し、第二のポリペプチドをコードする第
二のDNA配列を包含するプラスミドを準備し； このプラスミドDNAを消化して、発現ベクターと第一
のDNA配列を包含するDNAのフラグメントを単離し； 第一のDNA配列を突然変異に付して成長ホルモンコー
ド配列のサイズの低減および／または認識部位の導入を
行い；ついで 発現ベクターと第一のDNA配列を含有するフラグメン
トを第二のDNA配列にリゲートする予備的工程を包含す
る。
本発明の方法はさらに、 適当な発現ベクター；成長ホルモン活性を有する第一
のポリペプチドをコードする第一のDNA配列またはそれ
に含まれるそのフラグメント；および第一のDNA配列の
３′末端に連結し、第二のポリペプチドをコードする第
二のDNA配列を包含するプラスミドを準備し； このプラスミドDNAを消化して、発現ベクターと第一
のDNA配列を包含するDNAのフラグメントを単離し； 第一のDNA配列を突然変異に付して成長ホルモンコー
ド配列のサイズの低減および／または認識部位の導入を
行い；ついで 発現ベクターと第一のDNA配列を含有するフラグメン
トを第二のDNA配列にリゲートする予備的工程を包含す
る。
好ましくは、突然変異工程は、 “OLIGO 42 mer": ５′−CAGGGTTTCCGGGCCGTTGAAGGCACAGCTGCTCTCCACGAA−
３′ “OLIGO−46": ５′−GCACAGGGTTTCCGGGCCGTTAACCTGGATGGAGTACCTCTGTC
C−３′ “OLIGO−11": ５′−GCACAGGGTTTCCGGGCCGTTAACAAATAGGCTGGACAAGGGCA
T−３′ “OLIGO−756": ５′−ACCGCACAGGGTACGCGGGCCGTTAAC−３′ “OLIGO−713": ５′−AGCACCGCACAGGGTATAATGGGCGAACCTCTGTCCCTCCGGGA
T−３′ “OLIGO−818": ５′−ATAATGGGCGAAACCGTTAACCCTCTGTCCCTC−３′およ
び “OLIGO": ５′−TTCAGTCGCTGCGATGTTAACTTCGCCCATTATTCGGGGCGCGG
AAAG−３′ から選択されるオリゴマーヌクレオチドを使用するin v
itro突然変異に第一のDNA配列を付すことを包含する。
３′ “OLIGO−46": ５′−GCACAGGGTTTCCGGGCCGTTAACCTGGATGGAGTACCTCTGTC
C−３′ “OLIGO−11": ５′−GCACAGGGTTTCCGGGCCGTTAACAAATAGGCTGGACAAGGGCA
T−３′ “OLIGO−756": ５′−ACCGCACAGGGTACGCGGGCCGTTAAC−３′ “OLIGO−713": ５′−AGCACCGCACAGGGTATAATGGGCGAACCTCTGTCCCTCCGGGA
T−３′ “OLIGO−818": ５′−ATAATGGGCGAAACCGTTAACCCTCTGTCCCTC−３′およ
び “OLIGO": ５′−TTCAGTCGCTGCGATGTTAACTTCGCCCATTATTCGGGGCGCGG
AAAG−３′ から選択されるオリゴマーヌクレオチドを使用するin v
itro突然変異に第一のDNA配列を付すことを包含する。
本発明のこの態様によって形成された融合蛋白質は、
操作された単細胞生物体内に封入体として単離される。
この融合蛋白質は所望によりさらにプロセッシング工程
に付すことができる。
操作された単細胞生物体内に封入体として単離される。
この融合蛋白質は所望によりさらにプロセッシング工程
に付すことができる。
所望により、本発明のさらに他の態様では、本発明の
方法はさらに、第一および第二のDNA配列の間の切断可
能な結合を切断する工程を包含する。
方法はさらに、第一および第二のDNA配列の間の切断可
能な結合を切断する工程を包含する。
この切断は任意の慣用方法で実施できる。生成した融
合蛋白質を封入体から抽出し、ヒドロキシルアミンで切
断可能なアスパラギン／グリシン結合または配列FAHYに
続くズブチリシンで切断で可能な結合で切断し、得られ
たIGF−Ｉまたは置換体ペプチドを酸化し、従来技術に
ついて知識ある者にはよく知られた技術で精製される。
合蛋白質を封入体から抽出し、ヒドロキシルアミンで切
断可能なアスパラギン／グリシン結合または配列FAHYに
続くズブチリシンで切断で可能な結合で切断し、得られ
たIGF−Ｉまたは置換体ペプチドを酸化し、従来技術に
ついて知識ある者にはよく知られた技術で精製される。
上述の方法によれば、生物学的に活性なインスリン様
成長因子が高収率で生成することが明らかにされた。
成長因子が高収率で生成することが明らかにされた。
しかしながら驚くべきことに、成長ホルモン残基を除
去する配列切断は、成長ホルモンフラグメントが小さい
場合、適当な生物学的活性の達成には必要でないこと
が、明らかにされた。たとえば、成長ホルモン配列が約
10個のアミノ酸を包含する場合には、成長ホルモン残基
の切断は必要ではない。
去する配列切断は、成長ホルモンフラグメントが小さい
場合、適当な生物学的活性の達成には必要でないこと
が、明らかにされた。たとえば、成長ホルモン配列が約
10個のアミノ酸を包含する場合には、成長ホルモン残基
の切断は必要ではない。
このようにして形成された融合蛋白質は、そのような
ポリペプチドたとえばインスリン様成長因子−Ｉにそれ
自体知られている様々の任意の適用において使用でき
る。すなわち、本発明はさらに他の態様として、 成長ホルモン活性を有する第一のアミノ酸配列または
そのフラグメント；および生物学的活性を有し、第一の
アミノ酸配列のＣ末端に連結した第二のアミノ酸配列を
包含する融合蛋白質を提供する。
ポリペプチドたとえばインスリン様成長因子−Ｉにそれ
自体知られている様々の任意の適用において使用でき
る。すなわち、本発明はさらに他の態様として、 成長ホルモン活性を有する第一のアミノ酸配列または
そのフラグメント；および生物学的活性を有し、第一の
アミノ酸配列のＣ末端に連結した第二のアミノ酸配列を
包含する融合蛋白質を提供する。
好ましい形態においては、第一のアミノ酸配列は、メ
チオニンブタ成長ホルモン配列、またはそのフラグメン
トである。
チオニンブタ成長ホルモン配列、またはそのフラグメン
トである。
さらに好ましい形態においては、第二のアミノ酸配列
は、 インスリン様成長因子−Ｉ（IGF−Ｉ）、 IGF−Ｉ類縁体、 インスリン様成長因子−II（IGF−II）もしくはそのI
GF−II類縁体、 トリヒストンH2A.1、または ヒト転写因子SP1−1acZ融合蛋白質 から選択される。
は、 インスリン様成長因子−Ｉ（IGF−Ｉ）、 IGF−Ｉ類縁体、 インスリン様成長因子−II（IGF−II）もしくはそのI
GF−II類縁体、 トリヒストンH2A.1、または ヒト転写因子SP1−1acZ融合蛋白質 から選択される。
とくに好ましい形態においては、インスリン様成長因
子活性を示し、 成長ホルモン活性を有する第一のアミノ酸配列、また
はそのフラグメント、および インスリン様成長因子活性を有する第二のアミノ酸配
列またはその類縁体で第一のアミノ酸配列に連結した配
列を包含する、 融合蛋白質を提供する。
子活性を示し、 成長ホルモン活性を有する第一のアミノ酸配列、また
はそのフラグメント、および インスリン様成長因子活性を有する第二のアミノ酸配
列またはその類縁体で第一のアミノ酸配列に連結した配
列を包含する、 融合蛋白質を提供する。
第一および第二のアミノ酸配列は、切断可能な結合、
好ましくはヒドロキシルアミンで切断可能な結合または
ズブチリシンで切結可能な結合によって互いに連結して
いてもよい。
好ましくはヒドロキシルアミンで切断可能な結合または
ズブチリシンで切結可能な結合によって互いに連結して
いてもよい。
第二のアミノ酸配列は、インスリン様成長因子−Ｉま
たはII活性を示してもよい。また、第二のアミノ酸配列
は、インスリン様成長因子−Ｉの配列に欠失または置換
を有するその類縁体の活性を示してもよい。このような
欠失または置換は、それに限定されるものではないが、
インスリン様成長因子−Ｉ（IGF−Ｉ）のＮ−末端近く
に存在する。たとえば、ある種の類縁体は、インスリン
様成長因子−Ｉに比べて生物学的効力の増強を示すこと
が明らかにされている（たとえば、本出願人の国際特許
出願PCT/AU86/00246およびPCT/AU88/00485参照）。イン
スリン様成長因子−Ｉは哺乳動物インスリン様成長因子
であってよい。ヒト、ウシまたはブタインスリン様成長
因子−Ｉが使用できる。
たはII活性を示してもよい。また、第二のアミノ酸配列
は、インスリン様成長因子−Ｉの配列に欠失または置換
を有するその類縁体の活性を示してもよい。このような
欠失または置換は、それに限定されるものではないが、
インスリン様成長因子−Ｉ（IGF−Ｉ）のＮ−末端近く
に存在する。たとえば、ある種の類縁体は、インスリン
様成長因子−Ｉに比べて生物学的効力の増強を示すこと
が明らかにされている（たとえば、本出願人の国際特許
出願PCT/AU86/00246およびPCT/AU88/00485参照）。イン
スリン様成長因子−Ｉは哺乳動物インスリン様成長因子
であってよい。ヒト、ウシまたはブタインスリン様成長
因子−Ｉが使用できる。
第一のアミノ酸配列はブタ成長ホルモン活性を示して
もよい。ブタ成長ホルモンはメチオニンブタ成長ホルモ
ン（metpGHまたはMpGH）であってもよい。アミノ酸配列
は、成長因子配列のＮ−末端にそのＣ−末端が連結した
metpGHの全191個のＮ−末端アミノ酸を包含してもよ
く、またそのフラグメントを包含してもよい。
もよい。ブタ成長ホルモンはメチオニンブタ成長ホルモ
ン（metpGHまたはMpGH）であってもよい。アミノ酸配列
は、成長因子配列のＮ−末端にそのＣ−末端が連結した
metpGHの全191個のＮ−末端アミノ酸を包含してもよ
く、またそのフラグメントを包含してもよい。
第一のアミノ酸配列はmetpGHの最初のほぼ100個のＮ
−末端アミノ酸を包含してもよく、さらに好ましくはme
tpGHの最初のほぼ46個のＮ−末端アミノ酸またはmetpGH
の最初のほぼ42個のＮ−末端アミノ酸、とくに好ましく
はmetpGHの最初のほぼ11個のＮ−末端アミノ酸を包含す
る。とくに、本発明の好ましい態様においては、第一の
アミノ酸配列は以下の配列から選択される。
−末端アミノ酸を包含してもよく、さらに好ましくはme
tpGHの最初のほぼ46個のＮ−末端アミノ酸またはmetpGH
の最初のほぼ42個のＮ−末端アミノ酸、とくに好ましく
はmetpGHの最初のほぼ11個のＮ−末端アミノ酸を包含す
る。とくに、本発明の好ましい態様においては、第一の
アミノ酸配列は以下の配列から選択される。
MFPAMPLSSLF−， MFPAMPLSSLFVN−， MFPAMPLSSLFVNFAHY−または MFPAMPLSSLFVNGFAHY− 融合蛋白質は生物学的に純粋な形で提供することもで
きる。
きる。
本発明の好ましい態様における融合蛋白質は、 （１）ヒトの成長ホルモン欠乏の処置、 （２）ヒトの重篤な異化状態たとえば火傷、感染または
他の外傷後における体蛋白質の喪失の抑制、 （３）畜産動物の成長速度の増大、栄養の再分配および
飼料変換効率の向上、および （４）培養細胞の増殖の支持 に、IGF−Ｉの適当な置換体とすることができる。
他の外傷後における体蛋白質の喪失の抑制、 （３）畜産動物の成長速度の増大、栄養の再分配および
飼料変換効率の向上、および （４）培養細胞の増殖の支持 に、IGF−Ｉの適当な置換体とすることができる。
さらに詳しくは、融合蛋白質は、ウシ、ヒツジ、ブタ
およびニワトリを含めた畜産用温血動物の成長促進およ
び飼料変換効率の向上のために投与することができる。
改良融合蛋白質は、単独で、または意図された投与方法
に関連して選択された各種の希釈剤、担体または賦形剤
とともに投与できる。
およびニワトリを含めた畜産用温血動物の成長促進およ
び飼料変換効率の向上のために投与することができる。
改良融合蛋白質は、単独で、または意図された投与方法
に関連して選択された各種の希釈剤、担体または賦形剤
とともに投与できる。
したがって、本発明は、さらに他の態様として、哺乳
動物における蛋白質の蓄積欠乏または蛋白質喪失の処置
用の （ａ）成長ホルモン活性を有する第一のアミノ酸配列ま
たはそのフラグメント、およびインスリン様成長因子活
性を有する第二のアミノ酸配列またはその類縁体であっ
て第一のアミノ酸配列のＣ−末端に連結した配列を包含
するインスリン様成長因子活性を示す融合蛋白質の有効
量；ならびに （ｂ）医薬用または獣医薬用として許容される希釈剤、
担体または賦形剤 を含む医薬または獣医薬組成物を提供する。
動物における蛋白質の蓄積欠乏または蛋白質喪失の処置
用の （ａ）成長ホルモン活性を有する第一のアミノ酸配列ま
たはそのフラグメント、およびインスリン様成長因子活
性を有する第二のアミノ酸配列またはその類縁体であっ
て第一のアミノ酸配列のＣ−末端に連結した配列を包含
するインスリン様成長因子活性を示す融合蛋白質の有効
量；ならびに （ｂ）医薬用または獣医薬用として許容される希釈剤、
担体または賦形剤 を含む医薬または獣医薬組成物を提供する。
所望により、第二のアミノ酸配列は第一のアミノ酸配
列から切断されてもよい。
列から切断されてもよい。
本発明はさらに好ましい形態として、融合蛋白質が、
約0.01〜10、好ましくは0.1〜1mg/Kg体重／日の用量比
を与えるのに十分な量含まれる組成物を提供する。融合
蛋白質は、約0.02〜2000mgの量を、単位投与量形態とし
て含有されてもよい。
約0.01〜10、好ましくは0.1〜1mg/Kg体重／日の用量比
を与えるのに十分な量含まれる組成物を提供する。融合
蛋白質は、約0.02〜2000mgの量を、単位投与量形態とし
て含有されてもよい。
畜産的に重要な動物に対する好ましい投与方法として
は、慣用実務において応用されている徐放性ペレット移
植体がある。
は、慣用実務において応用されている徐放性ペレット移
植体がある。
したがって、本発明はさらに他の態様として、処置す
べき対象に、 成長ホルモン活性を有する第一のアミノ酸配列または
そのフラグメント；およびインスリン様成長因子活性を
有する第二のアミノ酸配列またはその類縁体であって第
一のアミノ酸配列のＣ−末端に連結された配列を含有
し、インスリン様成長因子活性を示す融合蛋白質の有効
量を投与する、哺乳動物における蛋白質蓄積の欠乏の処
置方法を提供する。
べき対象に、 成長ホルモン活性を有する第一のアミノ酸配列または
そのフラグメント；およびインスリン様成長因子活性を
有する第二のアミノ酸配列またはその類縁体であって第
一のアミノ酸配列のＣ−末端に連結された配列を含有
し、インスリン様成長因子活性を示す融合蛋白質の有効
量を投与する、哺乳動物における蛋白質蓄積の欠乏の処
置方法を提供する。
処置はまた、哺乳動物における蛋白質の喪失にも適用
できる。
できる。
本発明の融合蛋白質は、成長ホルモン不全およびソマ
トメジン不全を包含する慢性的成長障害に対する処置と
してヒトに投与することができる。改良IGF−Ｉは、こ
の目的では、非経口的に、または畜産動物での使用につ
いて上に概述した操作を用いて投与できる。
トメジン不全を包含する慢性的成長障害に対する処置と
してヒトに投与することができる。改良IGF−Ｉは、こ
の目的では、非経口的に、または畜産動物での使用につ
いて上に概述した操作を用いて投与できる。
融合蛋白質は、不十分な成長または組織の消耗を伴う
疾患、それらに限定されるものではないがたとえば癌、
膵嚢胞性線維症、デュシエンヌ型筋ジストロフィー、ベ
ッカー型ジストロフィー、常染色体ジストロフィー、多
発性筋炎ならびに他のミオパシーに対する処置として、
ヒト対象に投与することができる。改良IGF−Ｉペプチ
ドは、成長障害について上述した操作を用いて投与でき
る。
疾患、それらに限定されるものではないがたとえば癌、
膵嚢胞性線維症、デュシエンヌ型筋ジストロフィー、ベ
ッカー型ジストロフィー、常染色体ジストロフィー、多
発性筋炎ならびに他のミオパシーに対する処置として、
ヒト対象に投与することができる。改良IGF−Ｉペプチ
ドは、成長障害について上述した操作を用いて投与でき
る。
融合蛋白質は、それらに限定されるものではないがた
とえば火傷、骨格筋外傷および感染を包含する貧弱な窒
素状態に伴う急性症状の処置としてヒトに投与すること
ができる。これらの重篤な保護状態では非経口的液体へ
の添加を介して投与する方法が好ましいが、他の操作、
たとえば成長障害について上述した方法も適当である。
とえば火傷、骨格筋外傷および感染を包含する貧弱な窒
素状態に伴う急性症状の処置としてヒトに投与すること
ができる。これらの重篤な保護状態では非経口的液体へ
の添加を介して投与する方法が好ましいが、他の操作、
たとえば成長障害について上述した方法も適当である。
本発明の融合蛋白質は、成長を促進するため、窒素状
態を改良するためおよび異化疾患を処置するため、ヒト
未熟児または他の小児に投与することができる。蛋白質
は、急性のヒトの症状について上に概述したようにまた
は経腸的経路で投与できる。
態を改良するためおよび異化疾患を処置するため、ヒト
未熟児または他の小児に投与することができる。蛋白質
は、急性のヒトの症状について上に概述したようにまた
は経腸的経路で投与できる。
融合蛋白質のヒト対象への投与の用量比および回数
は、約0.01〜10mg/kg/日にセットできる。約0.1〜1mg/k
g/日の用量が好ましい。
は、約0.01〜10mg/kg/日にセットできる。約0.1〜1mg/k
g/日の用量が好ましい。
次に、本発明を以下の実施例によってさらに詳細に説
明する。しかしながら、以下の記述は、単に例示の目的
のものであって、上述の一般的な記述をいかなる意味に
おいても限定するものではないことを理解すべきであ
る。
明する。しかしながら、以下の記述は、単に例示の目的
のものであって、上述の一般的な記述をいかなる意味に
おいても限定するものではないことを理解すべきであ
る。
図面中、 図１は、（Ａ）MpGH（46）VN/IGF−Ｉ（例４）、
（Ｂ）MpGH（11）VN/R3IGF−Ｉ （例６）、（Ｃ）MpGH（11）VNFAHY/des（１−３）IGF
−Ｉ（例８）および（Ｄ）MpGH（42）FAHY/des（１−
３）IGF−Ｉ（例７）を含有する封入体のSDSPAGEを示
す。矢印は誘導されたバンドを示す。
（Ｂ）MpGH（11）VN/R3IGF−Ｉ （例６）、（Ｃ）MpGH（11）VNFAHY/des（１−３）IGF
−Ｉ（例８）および（Ｄ）MpGH（42）FAHY/des（１−
３）IGF−Ｉ（例７）を含有する封入体のSDSPAGEを示
す。矢印は誘導されたバンドを示す。
図２は、（Ａ）MpGH（46）VNFAHY/H2A、１（例９）お
よび（Ｂ）MpGH（46）/1aczSp1（例10）の、（Ｕ）非誘
導および（Ｉ）IPTG−誘導JM101培養体の溶解物中での
発現を示す。矢印は誘導されたバンドを示す。
よび（Ｂ）MpGH（46）/1aczSp1（例10）の、（Ｕ）非誘
導および（Ｉ）IPTG−誘導JM101培養体の溶解物中での
発現を示す。矢印は誘導されたバンドを示す。
図３、（Ａ）IGF−Ｉ（Kabi）、（Ｂ）MpGH（46）VN/
IGF−Ｉから切断されたIGF−Ｉ（例４）および（Ｃ）Mp
GH（11）VN/R3IGF−Ｉ（例６）の用量−反応曲線を示
す。
IGF−Ｉから切断されたIGF−Ｉ（例４）および（Ｃ）Mp
GH（11）VN/R3IGF−Ｉ（例６）の用量−反応曲線を示
す。
図４は、IGF−Ｉラジオイムノアッセイを示す。
（Ａ）IGF−Ｉ（Kabi）、（Ｂ）MpGH（46）VN/IGF−Ｉ
から切断されたIGF−Ｉ、および（Ｃ）MpGH（11）VN/R3
IGF−Ｉ（例６）のIGF−I RIAである。
（Ａ）IGF−Ｉ（Kabi）、（Ｂ）MpGH（46）VN/IGF−Ｉ
から切断されたIGF−Ｉ、および（Ｃ）MpGH（11）VN/R3
IGF−Ｉ（例６）のIGF−I RIAである。
例１ IGF−Ｉ配列のpGHXSC.4中pGH配列へのクローニング 修飾RBS/スペーサー領域および戦略的５′−コドン変
化を有するプラスミドpGHXSC.4（P.D.Vize＆J.R.E.Well
s:FEBS Lett.213:155,1987）を含有する大腸菌JM101細
胞中で、metpGHを封入体として高収率に発現させる。
化を有するプラスミドpGHXSC.4（P.D.Vize＆J.R.E.Well
s:FEBS Lett.213:155,1987）を含有する大腸菌JM101細
胞中で、metpGHを封入体として高収率に発現させる。
pGHXSC.4 DNAをPvu IIで消化して位置563でmetpGH DN
A配列を切断し、Hind IIIで消化して、pGH遺伝子がクロ
ーン化されているpkk233.2（E.Amman＆J.Brosius:Gene
40:183,1985）から誘導される細菌発現ベクター、PKT52
のポリリンカー中で切断した。ベクターおよびpGH遺伝
子の大部分を含有する3.4kbフラグメントを精製した
（ａ）。
A配列を切断し、Hind IIIで消化して、pGH遺伝子がクロ
ーン化されているpkk233.2（E.Amman＆J.Brosius:Gene
40:183,1985）から誘導される細菌発現ベクター、PKT52
のポリリンカー中で切断した。ベクターおよびpGH遺伝
子の大部分を含有する3.4kbフラグメントを精製した
（ａ）。
細菌のコドン利用について至適化した化学合成metIGF
−Ｉ構造遺伝子（B.Sproat ＆ M.Gait:Nucl.Acids Res.
13:2959,1985）をM13mp8中、in vitro突然変異で修飾し
て、開始コドンに隣接したNcoI部位（Ｃ↓CATGG）を導
入した： TCＣ ATG GGC CCG−−− Met.Gly.Pro このM13中修飾metIGF−ＩをNcoIで消化し、粘着端を
クレノーで末端充填し、ついでDNAをHindIIIで消化す
る。ブラントHindIIIフラグメントを精製し、これをベ
クター（ａ）にリゲーションすると、metpGHの最初の18
8個のアミノ酸のコード領域にmetIGF−Ｉのコード領域
が続く配列が生成する。この構築体はpMpGH（188）MIGF
−Ｉと命名され、以下の境界配列を有する。
−Ｉ構造遺伝子（B.Sproat ＆ M.Gait:Nucl.Acids Res.
13:2959,1985）をM13mp8中、in vitro突然変異で修飾し
て、開始コドンに隣接したNcoI部位（Ｃ↓CATGG）を導
入した： TCＣ ATG GGC CCG−−− Met.Gly.Pro このM13中修飾metIGF−ＩをNcoIで消化し、粘着端を
クレノーで末端充填し、ついでDNAをHindIIIで消化す
る。ブラントHindIIIフラグメントを精製し、これをベ
クター（ａ）にリゲーションすると、metpGHの最初の18
8個のアミノ酸のコード領域にmetIGF−Ｉのコード領域
が続く配列が生成する。この構築体はpMpGH（188）MIGF
−Ｉと命名され、以下の境界配列を有する。
例２ 突然変異：失われたpGHアミノ酸の返還、metの除去およ
びasnの導入によるヒドロキシルアミン切断可能metpG
H、asn IGF−Ｉ構築体、mMpGH（191）N/IGF−Ｉの生成 in vitro部位特定の突然変異を実施するためには、関
連配列をまず、細菌発現ベクターから一本鎖ベクターた
とえばM13mp8中にクローン化しなければならなかった。
びasnの導入によるヒドロキシルアミン切断可能metpG
H、asn IGF−Ｉ構築体、mMpGH（191）N/IGF−Ｉの生成 in vitro部位特定の突然変異を実施するためには、関
連配列をまず、細菌発現ベクターから一本鎖ベクターた
とえばM13mp8中にクローン化しなければならなかった。
この目的では、pMpGH（188）MIGF−１のEcoRI−HindI
IIフラグメント（発現ベクターのtrcプロモーター、お
よびpGH−IGF融合蛋白質の構造遺伝子を含有）をEcoRI
−HindIII切断M13mp8中にクローン化した。
IIフラグメント（発現ベクターのtrcプロモーター、お
よびpGH−IGF融合蛋白質の構造遺伝子を含有）をEcoRI
−HindIII切断M13mp8中にクローン化した。
このリゲーションからの組換えファージを突然変異反
応に対する鋳型として使用した。42塩基長のオリゴヌク
レオチド、 ５′−CAGGGTTTCCGGGCCGTTGAAGGCACAGCTGCTCTCCACGAA−
３′ を標準操作で使用して、pGHおよびIGFコード配列の連結
部における所望の配列を以下のように生成させた。
応に対する鋳型として使用した。42塩基長のオリゴヌク
レオチド、 ５′−CAGGGTTTCCGGGCCGTTGAAGGCACAGCTGCTCTCCACGAA−
３′ を標準操作で使用して、pGHおよびIGFコード配列の連結
部における所望の配列を以下のように生成させた。
この構築体はmMpGH（191）N/IGF−Ｉと呼ばれる。そ
れは、metpGHの全配列、IGF−Ｉ配列のＮ−末端、およ
び連結部にヒドロキシルアミンで切断可能な結合をコー
ドしている。
れは、metpGHの全配列、IGF−Ｉ配列のＮ−末端、およ
び連結部にヒドロキシルアミンで切断可能な結合をコー
ドしている。
例３ mMpGH（191）N/IGF−ＩからＣ−末端pGHコード配列の制
限酵素欠失 mMpGH（191）N/IGF−Ｉによってコードされる融合蛋
白質pGH−IGFからpGHの末端部分の大部を除去するため
には、pGH DNA配列300bpを除去するのに限制エンドヌク
レアーゼAvaIおよびPvuIIを使用した。
限酵素欠失 mMpGH（191）N/IGF−Ｉによってコードされる融合蛋
白質pGH−IGFからpGHの末端部分の大部を除去するため
には、pGH DNA配列300bpを除去するのに限制エンドヌク
レアーゼAvaIおよびPvuIIを使用した。
M13mp8は２個のAvaI部を含有するので、mpMpGH（19
1）NIGF−ＩからのEcoRI−HindIIIフラグメントをま
ず、pKT52のEcoRI−HindIII切断部に再クローニングし
た。この組換体からのDNAをAvaIで消化し、５′突出端
をクレノー酵素で充填し、ついでPvuIIで消化した。ベ
クター、Ｎ−末端pGH配列およびIGF配列を含む3.3kbフ
ラグメント（ブラント末端）を精製し、リゲーションす
るとpMpGH（91）N/IGF−Ｉが得られる（これは、metpGH
の最初の88個のアミノ酸、ついで最後の３個、およびas
n−IGF−Ｉをコードする）。
1）NIGF−ＩからのEcoRI−HindIIIフラグメントをま
ず、pKT52のEcoRI−HindIII切断部に再クローニングし
た。この組換体からのDNAをAvaIで消化し、５′突出端
をクレノー酵素で充填し、ついでPvuIIで消化した。ベ
クター、Ｎ−末端pGH配列およびIGF配列を含む3.3kbフ
ラグメント（ブラント末端）を精製し、リゲーションす
るとpMpGH（91）N/IGF−Ｉが得られる（これは、metpGH
の最初の88個のアミノ酸、ついで最後の３個、およびas
n−IGF−Ｉをコードする）。
例４ pMpGH（46）VN/IGF−Ｉを創成する突然変異 pMpGH（91）N/IGF−ＩからのEcoRI−HindIIIフラグメ
ントをEcoRI−HindIII切断M13mp8にクローニングした。
ントをEcoRI−HindIII切断M13mp8にクローニングした。
45mer "OLIGO−46" ５′−GCACAGGGTTTCCGGGCCGTTAACCTGGATGGAGTACCTCTGTC
C−３′ を合成して、pMpGH（91）N/IGF−Ｉ中のpGHのＣ−末端
配列部分をさらに欠失させ、HpaI認識部位（GTT AAC）
を導入し、IGF−Ｉ中のAsnの−１位置を保持させた。こ
の方法でmMpGH（46）VN/IGF−Ｉが作成された。
C−３′ を合成して、pMpGH（91）N/IGF−Ｉ中のpGHのＣ−末端
配列部分をさらに欠失させ、HpaI認識部位（GTT AAC）
を導入し、IGF−Ｉ中のAsnの−１位置を保持させた。こ
の方法でmMpGH（46）VN/IGF−Ｉが作成された。
mMpGH（46）VN/IGF−Ｉから増殖したDNAの複製可能型
からのEcoRI−HindIII挿入体を、EcoRI−HindIII切断pK
T52にクローニングするとpMpGH（46）VN/IGF−Ｉが得ら
れる。
からのEcoRI−HindIII挿入体を、EcoRI−HindIII切断pK
T52にクローニングするとpMpGH（46）VN/IGF−Ｉが得ら
れる。
例５ pMpGH（11）VN/IGF−Ｉを創成する突然変異 これは45−mer "OLIGO−11" ５′−GCACAGGGTTTCCGGGCCGTTAACAAATAGGCTGGACAAGGGCA
T−３′ を使うほかは例４に記載したと同様にして、mMpGH（1
1）VN/IGF−Ｉが作成された。
T−３′ を使うほかは例４に記載したと同様にして、mMpGH（1
1）VN/IGF−Ｉが作成された。
例４と同様に、mMpGH（11）VN/IGF−Ｉから生育したD
NAの複成可能型からのEcoRI−HindIII挿入体をEcoRI−H
indIII切断pKT52中にクローニングすると、pMpGH（11）
VN/IGF−Ｉが得られる。
NAの複成可能型からのEcoRI−HindIII挿入体をEcoRI−H
indIII切断pKT52中にクローニングすると、pMpGH（11）
VN/IGF−Ｉが得られる。
例６ pGpGH（11）VN/R3IGF−Ｉを創成する突然変異 mMpGH（46）VN/IGF−Ｉ（例４）の一本鎖DNAを鋳型と
して、および合成27−mer"OLIGO−756" ５′−ACCGCACAGGGTACGCGGGCCGTTAAC−３′ を、in vitro突然変異反応に用いて、mMpGH（46）VN/R3
−IGF−Ｉを作成した。
して、および合成27−mer"OLIGO−756" ５′−ACCGCACAGGGTACGCGGGCCGTTAAC−３′ を、in vitro突然変異反応に用いて、mMpGH（46）VN/R3
−IGF−Ｉを作成した。
このベクターの複製可能型DNAからのHpaI−HindIIIフ
ラグメントを、HpaIおよびHindIIIで切断したpMpGH（1
1）VN/IGF−Ｉ（例５）にリゲーションすると、pMpGH
（11）VN/R3IGF−Ｉが作成された。
ラグメントを、HpaIおよびHindIIIで切断したpMpGH（1
1）VN/IGF−Ｉ（例５）にリゲーションすると、pMpGH
（11）VN/R3IGF−Ｉが作成された。
例７ pMpGH（42）FAHY/des（１−３）IGF−Ｉを創成する突然
変異 mMpGH（46）VN/IGF−Ｉ（例４参照）からの一本鎖DN
A、および合成45−mer、"OLIGO−713" ５′−AGCACCGCACAGGGTATAATGGGCGAACCTCTGTCCCTCCGGGA
T−３′ を用いてin vitro突然変異反応を行うと、mMpGH（42）F
AHY/des（１−３）IGF−Ｉ このベクターの複製可能型DNAからのEcoRI−HindIII
フラグメントをEcoRI−HindIII切断pKT52にリゲーショ
ンすると、pMpGH（42）FAHY/des（１−３）IGF−Ｉが創
成される。
変異 mMpGH（46）VN/IGF−Ｉ（例４参照）からの一本鎖DN
A、および合成45−mer、"OLIGO−713" ５′−AGCACCGCACAGGGTATAATGGGCGAACCTCTGTCCCTCCGGGA
T−３′ を用いてin vitro突然変異反応を行うと、mMpGH（42）F
AHY/des（１−３）IGF−Ｉ このベクターの複製可能型DNAからのEcoRI−HindIII
フラグメントをEcoRI−HindIII切断pKT52にリゲーショ
ンすると、pMpGH（42）FAHY/des（１−３）IGF−Ｉが創
成される。
例８ pMpGH（11）VNGFAHY/des（１−３）を創成する突然変異 mMpGH（42）FAHY/des（１−３）IGF−Ｉ（例７参照）
の一本鎖DNAと、合成33−mer、"OLIGO−818" ５′−ATAATGGGCGAAACCGTTAACCCTCTGTCCCTC−３′ を用いてin vitro突然変異反応を行い、mMpGH（42）VNG
FAHY/des（１−３）IGF−I: を創成した。
の一本鎖DNAと、合成33−mer、"OLIGO−818" ５′−ATAATGGGCGAAACCGTTAACCCTCTGTCCCTC−３′ を用いてin vitro突然変異反応を行い、mMpGH（42）VNG
FAHY/des（１−３）IGF−I: を創成した。
このベクターの複製可能型DNAからのHpaI−HindIIIフ
ラグメントを、HpaIおよびHindIIIで切断したpMpGH（1
1）VN/IGF−Ｉ（例５）にリゲーションすると、pMpGH
（11）VNGFAHY/des（１−３）IGF−Ｉが得られた。
ラグメントを、HpaIおよびHindIIIで切断したpMpGH（1
1）VN/IGF−Ｉ（例５）にリゲーションすると、pMpGH
（11）VNGFAHY/des（１−３）IGF−Ｉが得られた。
例９ プラスミドpMpGH（46）VNFAHY/トリヒストンH2A.1の製
造。
造。
pCH.H2AH（Ｄ′Andreaら:Nucl Acids Res.9:3119,198
1）からのHindIIIフラグメント（約700bp）を、HindIII
で切断したファージミドベクターBluescript KS+（Stra
tagene Inc.）にサブクローニングした。このクローン
から調製した一本鎖DNAを突然変異の鋳型として使用し
た。"OLIGO" ５′−TTCAGTCGCTGCGATGTTAACTTCGCCCATTATTCGGGGCGCGG
AAAG−３′ を使用して突然変異により、指定された配列を次のよう
な鋳型の開始コドンの後に導入した。
1）からのHindIIIフラグメント（約700bp）を、HindIII
で切断したファージミドベクターBluescript KS+（Stra
tagene Inc.）にサブクローニングした。このクローン
から調製した一本鎖DNAを突然変異の鋳型として使用し
た。"OLIGO" ５′−TTCAGTCGCTGCGATGTTAACTTCGCCCATTATTCGGGGCGCGG
AAAG−３′ を使用して突然変異により、指定された配列を次のよう
な鋳型の開始コドンの後に導入した。
変異体クローンを選択し、二本鎖DNAを調製し、HpaI
およびHindIIIで切断し、ついでそのフラグメントを、H
paI−HindIIIフラグメント（IGF−Ｉ配列）を予め除去
したpMpGH（46）VN/IGF−Ｉ（例４）中にクローニング
するとpMpGH（46）VNFAHY/トリヒストンH2A.1が得られ
た。
およびHindIIIで切断し、ついでそのフラグメントを、H
paI−HindIIIフラグメント（IGF−Ｉ配列）を予め除去
したpMpGH（46）VN/IGF−Ｉ（例４）中にクローニング
するとpMpGH（46）VNFAHY/トリヒストンH2A.1が得られ
た。
例10 プラスミドpMpGH（46）／ヒト転写因子Spl−lacZ融合蛋
白質の製造 プラスミドSpl−516C（SplのＣ−末端516アミノ酸部
分をコードする）は、cDNAクローンpSplからのHincII−
HindIIIフラグメント（J.Kadonagaら:Cell,51:1079,198
7）を、SmaIおよびHindIIIによるPUC118切断体中にクロ
ーニングして作成した。pSpl−516CのDNAは以下の配列
を有する。
白質の製造 プラスミドSpl−516C（SplのＣ−末端516アミノ酸部
分をコードする）は、cDNAクローンpSplからのHincII−
HindIIIフラグメント（J.Kadonagaら:Cell,51:1079,198
7）を、SmaIおよびHindIIIによるPUC118切断体中にクロ
ーニングして作成した。pSpl−516CのDNAは以下の配列
を有する。
これをEcoRIで消化し、クレノーで末端を充填し、つ
いでHindIIIで消化するとmet−lacZの配列６−11とSpl
の516C−末端アミノ酸をコードするフラグメント（ブラ
ント−HindIII）が得られた。このフラグメントを、Hap
I−HindIIIフラグメント（IGF−Ｉ配列）を除去したpMp
GH（46）VN/IGF−Ｉ（例４）中にクローニングするとpM
pGH（46）ヒト転写因子Spl−lacZ融合蛋白質： が得られた。
いでHindIIIで消化するとmet−lacZの配列６−11とSpl
の516C−末端アミノ酸をコードするフラグメント（ブラ
ント−HindIII）が得られた。このフラグメントを、Hap
I−HindIIIフラグメント（IGF−Ｉ配列）を除去したpMp
GH（46）VN/IGF−Ｉ（例４）中にクローニングするとpM
pGH（46）ヒト転写因子Spl−lacZ融合蛋白質： が得られた。
例11 大腸菌における封入体としての構築体蛋白質の製造 pMpGH（188）MIGF−Ｉ（例１）、pMpGH（191）N/IGF
−Ｉ（例２）、pMpGH（88）CAFN/IGF−Ｉ（例３）、pMp
GH（46）VN/IGF−Ｉ（例４）、pMpGH（11）VN/IGF−Ｉ
（例５）、pMpGH（11）VN/R3IGF−Ｉ（例６）、pMpGH
（42）FANY/des（１−３）IGF−Ｉ（例７）、pMpGH（1
1）VNGFHY/des（１−３）IGF−Ｉ（例８）、pMpGH（4
6）VNFAHY/トリヒストンH2A.1（例９）またはpMpGH（4
6）／ヒト転写因子Spl−lacZ融合蛋白質（例10）のいず
れかを含有するpKT52発現ベクターを、lacIq宿主JM101
（J.Messing:Recomb.DNA Tech.Bull.２:42,1979）中に
トランスホーメーションした。
−Ｉ（例２）、pMpGH（88）CAFN/IGF−Ｉ（例３）、pMp
GH（46）VN/IGF−Ｉ（例４）、pMpGH（11）VN/IGF−Ｉ
（例５）、pMpGH（11）VN/R3IGF−Ｉ（例６）、pMpGH
（42）FANY/des（１−３）IGF−Ｉ（例７）、pMpGH（1
1）VNGFHY/des（１−３）IGF−Ｉ（例８）、pMpGH（4
6）VNFAHY/トリヒストンH2A.1（例９）またはpMpGH（4
6）／ヒト転写因子Spl−lacZ融合蛋白質（例10）のいず
れかを含有するpKT52発現ベクターを、lacIq宿主JM101
（J.Messing:Recomb.DNA Tech.Bull.２:42,1979）中に
トランスホーメーションした。
培養体を13lのMinA培地中、37℃、55％CO2、pH7.0
で、グルコースを供給しながら、A600が15になるまで増
殖させた。ついで、培養体を1gのIPTGで５時間誘導し
た。封入体の形成は、位相差顕微鏡でモニタリングし
た。細胞を遠心分離によって収穫し、20mM−Tris,50mM
−NaCL,pH8.5中に40％で懸濁し、9000psiでホモジナイ
ズした。ホモジネートを水で10％に希釈し、封入体を遠
心分離によって収穫した。封入体を200mM−Tris,5mM−E
DTA,0.2％リゾチーム,pH8.0に懸濁して洗浄し、20℃で
３時間インキュベートし、遠心分離によって集め、湿潤
ペレットを20℃で保存した。
で、グルコースを供給しながら、A600が15になるまで増
殖させた。ついで、培養体を1gのIPTGで５時間誘導し
た。封入体の形成は、位相差顕微鏡でモニタリングし
た。細胞を遠心分離によって収穫し、20mM−Tris,50mM
−NaCL,pH8.5中に40％で懸濁し、9000psiでホモジナイ
ズした。ホモジネートを水で10％に希釈し、封入体を遠
心分離によって収穫した。封入体を200mM−Tris,5mM−E
DTA,0.2％リゾチーム,pH8.0に懸濁して洗浄し、20℃で
３時間インキュベートし、遠心分離によって集め、湿潤
ペレットを20℃で保存した。
例４、６、７および８のプラスミドでトランスフェク
ションした培養体からの封入体のSDSポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（SDSPAGE）を図１に示す。それぞれの
融合蛋白質の卓越したバンドが認められる。SDSPAGE後
にインデューサーIPTGの不存在下（Ｕ）および存在下
（Ｉ）に増殖させた細胞からの分解物を、例９および10
について、図２に例示する。誘導されたバンドは矢印で
示す。
ションした培養体からの封入体のSDSポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（SDSPAGE）を図１に示す。それぞれの
融合蛋白質の卓越したバンドが認められる。SDSPAGE後
にインデューサーIPTGの不存在下（Ｕ）および存在下
（Ｉ）に増殖させた細胞からの分解物を、例９および10
について、図２に例示する。誘導されたバンドは矢印で
示す。
例12 pMpGH（46）VN/IGF−Ｉ（例４）でトランスフェクショ
ンした大腸菌からの封入体中で生成した融合蛋白質（例
11）の切断および純粋なIGF−Ｉの単離 例４において特定した構築体蛋白質を含有する湿潤ペ
ーストを可溶化し、蛋白質をAsn/Gly結合で切断し、生
成したIGF−Ｉをフォールディングさせ、先行技術を熟
知した者にはよく知られた方法を用いて精製した。これ
らは、8M尿素、50mMグリシン、10mMEDTAおよび1mMDTE,p
H9.1中への封入体の可溶化;SephadexG−25上8M尿素/50m
MグリシンpH9.2中への脱塩;2.5M NH2OH/HCLおよび2.5mM
LiOHの添加による45℃,pH9.1における４時間の切断；前
述したと同様の脱塩;2M尿素中pH8.25°における1.25mMB
ME/0.1mM酸化BMEによる蛋白質濃度1.25mg/mlでの16時間
の酸化;0.1％TFAおよびプロパン−１−オール勾配を用
いたC4HPLC;pH4.8で酢酸アンモニウム勾配を用いたMono
S上イオン交換クロマトグラフィー;0.13％HFBA中でのC
18HPLCおよびアセトニトリル勾配での溶出、ついで0.1M
酢酸中への最終的脱塩を包含する。pMpGH（46）VN/IGF
−Ｉ構築体から誘導されたIGF−Ｉのこの方法での切断
および精製により、ラットL6筋芽細胞における蛋白質合
成の刺激（G.L.Francisら:Biochem.J.233:207,1986）な
らびにIGF−Ｉラジオイム／アッセイで市販の組換えIGF
−Ｉ（Kabi）と同等の効力を示す物質が生成した（図３
参照）。
ンした大腸菌からの封入体中で生成した融合蛋白質（例
11）の切断および純粋なIGF−Ｉの単離 例４において特定した構築体蛋白質を含有する湿潤ペ
ーストを可溶化し、蛋白質をAsn/Gly結合で切断し、生
成したIGF−Ｉをフォールディングさせ、先行技術を熟
知した者にはよく知られた方法を用いて精製した。これ
らは、8M尿素、50mMグリシン、10mMEDTAおよび1mMDTE,p
H9.1中への封入体の可溶化;SephadexG−25上8M尿素/50m
MグリシンpH9.2中への脱塩;2.5M NH2OH/HCLおよび2.5mM
LiOHの添加による45℃,pH9.1における４時間の切断；前
述したと同様の脱塩;2M尿素中pH8.25°における1.25mMB
ME/0.1mM酸化BMEによる蛋白質濃度1.25mg/mlでの16時間
の酸化;0.1％TFAおよびプロパン−１−オール勾配を用
いたC4HPLC;pH4.8で酢酸アンモニウム勾配を用いたMono
S上イオン交換クロマトグラフィー;0.13％HFBA中でのC
18HPLCおよびアセトニトリル勾配での溶出、ついで0.1M
酢酸中への最終的脱塩を包含する。pMpGH（46）VN/IGF
−Ｉ構築体から誘導されたIGF−Ｉのこの方法での切断
および精製により、ラットL6筋芽細胞における蛋白質合
成の刺激（G.L.Francisら:Biochem.J.233:207,1986）な
らびにIGF−Ｉラジオイム／アッセイで市販の組換えIGF
−Ｉ（Kabi）と同等の効力を示す物質が生成した（図３
参照）。
例13 構築体蛋白質MpGH（11）VN/R3IGF−Ｉの生物活性 例11により封入体として増殖した例６の生成物は、IG
F−Ｉの完全な生物活性を発揮させるために切断を必要
としなかった。
F−Ｉの完全な生物活性を発揮させるために切断を必要
としなかった。
封入体を溶解し、脱塩し、例12の場合のように酸化し
た。再フォールディング混合物を0.1％TFAに調整し、Hc
lでpH2.1とし、濾過し、C18カラム上にポンプで送っ
た。溶出はアセトニトリル勾配で実施した。主蛋白質ピ
ークはさらに、C18カラム上0.13％HFBA中アセトニトリ
ル勾配、mono−Ｓカラム上酢酸アンモニウム勾配および
C18カラム上0.13％HFBA中プロパン−１−オール勾配を
含む連続HPLC工程によって精製した。
た。再フォールディング混合物を0.1％TFAに調整し、Hc
lでpH2.1とし、濾過し、C18カラム上にポンプで送っ
た。溶出はアセトニトリル勾配で実施した。主蛋白質ピ
ークはさらに、C18カラム上0.13％HFBA中アセトニトリ
ル勾配、mono−Ｓカラム上酢酸アンモニウム勾配および
C18カラム上0.13％HFBA中プロパン−１−オール勾配を
含む連続HPLC工程によって精製した。
精製操作により、再フォールディング混合物中の約30
％に相当する単一蛋白質ピークが生成した。Ｎ−末端配
列分析により、配列は期待されたMpGH（11）VN/R3IGF−
Ｉであることが確認された。ラットL6筋芽細胞におけ
る、成長因子を含まない媒体中での刺激を越える蛋白質
合成の刺激百分率としての生物検定（G.L.Francisら:Bi
ochem.J.233:207,1986）では、組換えヒトIGF−Ｉ（Kab
i）での結果以上の効力が認められた（図３参照）。MpG
H（11）VN/R3IGF−Ｉは、IGF−I RIAで弱い交差反応を
示すのみである（図４参照）。
％に相当する単一蛋白質ピークが生成した。Ｎ−末端配
列分析により、配列は期待されたMpGH（11）VN/R3IGF−
Ｉであることが確認された。ラットL6筋芽細胞におけ
る、成長因子を含まない媒体中での刺激を越える蛋白質
合成の刺激百分率としての生物検定（G.L.Francisら:Bi
ochem.J.233:207,1986）では、組換えヒトIGF−Ｉ（Kab
i）での結果以上の効力が認められた（図３参照）。MpG
H（11）VN/R3IGF−Ｉは、IGF−I RIAで弱い交差反応を
示すのみである（図４参照）。
最後に、本明細書にその輪郭を示した本発明の精神か
ら逸脱することなく、様々な他の修飾および／または改
変が可能であることを理解すべきである。
ら逸脱することなく、様々な他の修飾および／または改
変が可能であることを理解すべきである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/06 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＥＲ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 キング，ロバート，マイクル オーストラリア国5061 サウス オース トラリア，アンリィ，アーサー ストリ ート 46 (72)発明者 フランシス，ジョフレイ，レオナード オーストラリア国 5076 サウス オー ストラリア，アセルストン，ジェイリー ン コート ６ (56)参考文献 特開 昭63−233791（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−19493（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−240799（ＪＰ，Ａ) Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｒｇｉｎｅｅｒｉ ｎｇ，Ｖｏｌ．１，Ｎｏ．６, （1987），Ｐ．487−492 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．84，（1987）, Ｐ．2638−2642
Claims (5)
- 【請求項１】成長因子活性を示す融合蛋白質をコードす
るプラスミドであって、 発現ベクター； MFPAMPLSSLF−， MFPAMPLSSLFVN−， MFPAMPLSSLFVNFAHY−， MFPAMPLSSLFVNGFAHY−， MFPAMPLSSLFANAVLRAQHLHQLAADTYKEFERAYIPEGQRYSIQ−， MFPAMPLSSLFANAVLRAQHLHQLAADTYKEFERAYIPEGQRYSIQVN
−， MFPAMPLSSLFANAVLRAQHLHQLAADTYKEFERAYIPEGQRYSIQVNFA
HY−および MFPAMPLSSLFANAVLRAQHLHQLAADTYKEFERAYIPEGQRYSIQVNGF
AHY− から成る群から選択されるメチオニンブタ成長ホルモン
（met pGH）の最初の11個又は46個のＮ末端アミノ酸か
ら成る第１のアミノ酸配列をコードする第一のDNA配
列； 及び、第１のアミノ酸配列のＣ−末端に連結し、インス
リン様成長因子−Ｉ（IGF−Ｉ）、インスリン様成長因
子−II（IGF−II）、又はそれらのアミノ酸置換又は欠
失によって形成される類縁体のための第２のアミノ酸配
列をコードする第二のDNA配列； を機能を発揮し得るようにそれぞれ連結された成分とし
て含む上記プラスミド。 - 【請求項２】成長因子活性を示す融合蛋白質の製造方法
であって、 発現ベクター、 MFPAMPLSSLF−， MFPAMPLSSLFVN−， MFPAMPLSSLFVNFAHY−， MFPAMPLSSLFVNGFAHY−， MFPAMPLSSLFANAVLRAQHLHQLAADTYKEFERAYIPEGQRYSIQ−， MFPAMPLSSLFANAVLRAQHLHQLAADTYKEFERAYIPEGQRYSIQVN
−， MFPAMPLSSLFANAVLRAQHLHQLAADTYKEFERAYIPEGQRYSIQVNFA
HY−および MFPAMPLSSLFANAVLRAQHLHQLAADTYKEFERAYIPEGQRYSIQVNGF
AHY− から成る群から選択されるメチオニンブタ成長ホルモン
（met pGH）の最初の11個又は46個のＮ末端アミノ酸か
ら成る第１のアミノ酸配列をコードする第一のDNA配
列、及び、第１のアミノ酸配列のＣ−末端に連結し、イ
ンスリン様成長因子−Ｉ（IGF−Ｉ）、インスリン様成
長因子−II（IGF−II）、又はそれらのアミノ酸置換又
は欠失によって形成される類縁体のための第２のアミノ
酸配列をコードする第二のDNA配列を、機能を発揮し得
るようにそれぞれ連結された成分として含むプラスミ
ド、並びに単細胞生物体を準備し； 上記単細胞生物体に上記プラスミドを導入し； 得られた生物体を培養し； 上記DNA配列によってコードされるポリペプチドを発現
させ； ついで培養体から上記ポリペプチドを単離することを包
含する融合蛋白質の製造方法。 - 【請求項３】（ａ）MFPAMPLSSLF−， MFPAMPLSSLFVN−， MFPAMPLSSLFVNFAHY−， MFPAMPLSSLFVNGFAHY−， MFPAMPLSSLFANAVLRAQHLHQLAADTYKEFERAYIPEGQRYSIQ−， MFPAMPLSSLFANAVLRAQHLHQLAADTYKEFERAYIPEGQRYSIQVN
−， MFPAMPLSSLFANAVLRAQHLHQLAADTYKEFERAYIPEGQRYSIQVNFA
HY−および MFPAMPLSSLFANAVLRAQHLHQLAADTYKEFERAYIPEGQRYSIQVNGF
AHY− から成る群から選択されるメチオニンブタ成長ホルモン
（met pGH）の最初の11個又は46個のＮ末端アミノ酸か
ら成る第１のアミノ酸配列；及び （ｂ）第一のアミノ酸配列のＣ−末端に連結するインス
リン様成長因子−Ｉ（IGF−Ｉ）、インスリン様成長因
子−II（IGF−II）、又はそれらのアミノ酸置換又は欠
失によって形成される類縁体のための第２のアミノ酸配
列；を包含する成長因子活性を示す融合蛋白質。 - 【請求項４】（ａ）MFPAMPLSSLF−， MFPAMPLSSLFVN−， MFPAMPLSSLFVNFAHY−， MFPAMPLSSLFVNGFAHY−， MFPAMPLSSLFANAVLRAQHLHQLAADTYKEFERAYIPEGQRYSIQ−， MFPAMPLSSLFANAVLRAQHLHQLAADTYKEFERAYIPEGQRYSIQVN
−， MFPAMPLSSLFANAVLRAQHLHQLAADTYKEFERAYIPEGQRYSIQVNFA
HY−および MFPAMPLSSLFANAVLRAQHLHQLAADTYKEFERAYIPEGQRYSIQVNGF
AHY− から成る群から選択されるメチオニンブタ成長ホルモン
（met pGH）の最初の11個又は46個のＮ末端アミノ酸か
ら成る第１のアミノ酸配列；及び （ｂ）第一のアミノ酸配列のＣ−末端に連結するインス
リン様成長因子−Ｉ（IGF−Ｉ）、インスリン様成長因
子−II（IGF−II）、又はそれらのアミノ酸置換又は欠
失によって形成される類縁体のための第２のアミノ酸配
列；を包含する成長因子活性を示す融合蛋白質の有効量
を含む、哺乳動物の蛋白質蓄積不全又は蛋白質喪失の処
置用の医薬又は獣医薬組成物。 - 【請求項５】（ａ）MFPAMPLSSLF−， MFPAMPLSSLFVN−， MFPAMPLSSLFVNFAHY−， MFPAMPLSSLFVNGFAHY−， MFPAMPLSSLFANAVLRAQHLHQLAADTYKEFERAYIPEGQRYSIQ−， MFPAMPLSSLFANAVLRAQHLHQLAADTYKEFERAYIPEGQRYSIQVN
−， MFPAMPLSSLFANAVLRAQHLHQLAADTYKEFERAYIPEGQRYSIQVNFA
HY−および MFPAMPLSSLFANAVLRAQHLHQLAADTYKEFERAYIPEGQRYSIQVNGF
AHY− から成る群から選択されるメチオニンブタ成長ホルモン
（met pGH）の最初の11個又は46個のＮ末端アミノ酸か
ら成る第１のアミノ酸配列；及び （ｂ）第一のアミノ酸配列のＣ−末端に連結するインス
リン様成長因子−Ｉ（IGF−Ｉ）、インスリン様成長因
子−II（IGF−II）、又はそれらのアミノ酸置換又は欠
失によって形成される類縁体のための第２のアミノ酸配
列；を包含する成長因子活性を示す融合蛋白質の有効量
を、培養培地に加えることを含む、培養細胞の成長を改
良する方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AU4672 | 1989-06-09 | ||
| AU467289 | 1989-06-09 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04501064A JPH04501064A (ja) | 1992-02-27 |
| JP2682738B2 true JP2682738B2 (ja) | 1997-11-26 |
Family
ID=3695144
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2507683A Expired - Fee Related JP2682738B2 (ja) | 1989-06-09 | 1990-05-22 | 成長ホルモン融合蛋白質 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2682738B2 (ja) |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE8303626D0 (sv) * | 1983-06-23 | 1983-06-23 | Kabigen Ab | A recombinant plasmid a transformant microorganism, a polydoxyrebonucleotide segment, a process for producing a biologically active protein, and the protein thus produced |
| JPH0817708B2 (ja) * | 1986-10-09 | 1996-02-28 | 藤沢薬品工業株式会社 | Ｍｅｔ−インスリン様成長因子Ｉの発現ベクター |
| GB8701848D0 (en) * | 1987-01-28 | 1987-03-04 | Celltech Ltd | Polypeptides |
-
1990
- 1990-05-22 JP JP2507683A patent/JP2682738B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８４，（１９８７），Ｐ．２６３８−２６４２ |
| Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｒｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．１，Ｎｏ．６，（１９８７），Ｐ．４８７−４９２ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04501064A (ja) | 1992-02-27 |
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