JPS62502305A

JPS62502305A - ポリペプチドの産生を向上する方法

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Publication number: JPS62502305A
Application number: JP61501992A
Authority: JP
Inventors: ブエル，ゲイリー　エヌ; モーバ，ナゲスワララオ
Original assignee: バイオジェンインコーポレイテッド
Priority date: 1985-03-26
Filing date: 1986-03-25
Publication date: 1987-09-10
Anticipated expiration: 2009-11-16
Also published as: DK569886D0; CN1034588C; JP2568383B2; JPH07145200A; WO1986005810A1; AU5665786A; DK175223B1; JPH07143896A; EP0215110A1; IL78278A0; ES8705921A1; ZA862240B; JPH07102152B2; JP2602628B2; DK569886A; CN86102889A; DE3688225D1; JPH07143885A; EP0215110A4; GB8507833D0

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトソマトメジンＣの製造〔発明の技術分野〕本発明は、任意所望の蛋白もしくはポリペプチドを産生するのに最適なりＮＡ配列をこれらにより形質転換された宿主にて産生するＤＮＡ配列の同定方法に関するものである。より詳細には、本発明は、ヒトソマトメジンＣ（ｒｓＭｃＪ’）を産生するのに最適な改変ＤＮＡ配列の同定に関するものである。さらに本発明は、これらＤＮＡ配列を特徴とする組換ＤＮＡ分子および宿主並びにこれらＤＮＡＮ列配列換ＤＮＡ分子および宿主を用いて原核および真核起源のヒトＳＭＣおよびその他の蛋白の産生を向上させる方法に関するものである。

〔発明の背景〕

ソマトメジンＣ（ｒｓＭｃＪ　）はインシュリン様の成長因子であって、下垂体から成長ホルモンを分泌した後に組織成長を指令する重要な蛋白であると思われる。

ヒトＳＭＣのアミノ酸配列はＥ、リンダークネヒトおよびＲ，Ｅ、ハンフ゛ルにより幸艮告された〔ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２５３巻、第２７６９−２７７６頁（１９７８））。これは、３個のジスルフィド結合によって架橋された７０個のアミノ酸よりなる一本鎖ボリペプチドで構成される。計算分子量は７６４９である。このＳＭＣはプロインシュリンに対し著しい類似性を示す。たとえば、ＳＭＣアミノ酸１〜２９はインシュリンＢ鎖に対し同族であり、かつＳＭＣアミノ酸４２〜６２はインシュリンＡ鎖に同族である。しかしながら、ＳＭＣにおける接続連鎖はプロインシュリンのＣペプチドに対する類似性を示さず、またＳＭＣはプロインシュリンには見られないＣ−末端オクタペプチドを有する。

Ｓ　Ｍ　Ｃはインビトロにおいて多くの成長促進作用を示し、たとえばＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白およびプロテオグリカンの合成を刺戟する作用を示す（Ｅ、　リンダークネヒトおよびＲｌＥ、ハングル、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンスＵＳＡ、第７３巻、第２３６５−２３６９頁（１９７６））；Ｂ、モレルおよびＥ、Ｒ，フロエシニ、ヨーロピアン・ジャーナル・クリニカル・インベスティゲーション、第３巻、第１１９−１２３頁（１９７３）　、Ｅ、　Ｒ。

フロエシュ等、Ａｄｖ、Ｍｅｒ＋ｔａ１．Ｄｉｓｏｒｄ　ｓ第８巻、第２１１− ２３５頁（１９７５）；Ａ、Ｅ、チングおよびＥ、　Ｒ，フロエシニ、ダイアベトロシア、第９巻、第４７２−４７６頁（１９７３）；Ｅ、Ｒ，フロエシェ等、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンスＵＳＡ、第７３巻、第２９０４−２９０８頁（１９７６））。さらに、これはオルニチンデカルボキシラーゼおよび細胞増殖をも刺戟するＣＢ。

モレルおよびＥ、Ｒ，フロエシュ、上記；Ｇ、に、ハーゼルバッハーおよびＲ，Ｅ、ハングル、ジャーナル・セルラー・フィジオロジー、第８８巻、第２３９− ２４６頁（１９７６）　）　。

インビボにおいて、ＳＭＣは下垂体切除により成長ホルモンを欠如させたラットにおける成長を刺戟する（Ｅ、シエンル等、ネーチャー、第２９６巻、第２５２ −２５３頁（１９８２）　）。

成長ホルモンと同様に、Ｓ　Ｍ　Ｃは成る程度動物種類に特異性である。しかしながら、成る種の動物からのＳＭＣは、進化論的尺度において低位の他の動物種類でも生物学上活性である。たとえば、ヒ）ＳＭＣは牛、豚およびニワトリにおける成長促進に有用であると思われる。実験動物において、ｓＭｃは天然ヒト成長ホルモンと同様な成長刺戟作用を示した。しかしながら、ＳＭＣは成長反応の中枢媒体であるためヒト成長ホルモンよりも有利であると思われる。したがって、成長ホルモンよりも一層直接的な成長調節剤となる。

たとえば、短小発育症および筋肉アトロビーなどの成る種の成長障害を処置するＳＭＣの用途の他に、ＳＭＣはさらにたとえば外傷および折骨の治癒に関連するような特定領域における組織成長を刺戟するにも有用である。

しかしながらＳＭＣは、ヒト血液からの精製により極く微量しか入手し得ないため、組織成長刺戟剤としてその臨床的能力を果していない。したがって、産業上および臨床上有用な量のＳＭＣにおけるこの欠乏を解消するため、他の方法が要求される。

この種の１つの方策は、ＳＭＣをコードするＤＮＡ配列で形質転換された宿主においてＳＭＣを産生させるための組換ＤＮＡ技術の使用である。しかしながら、この方策は多量のＳＭＣを製造するには有用でないことが判明している。何故なら、各種のイー・コリ宿主におけるＳＭＣの発現収率が極めて低く、経済上または産業上育用な量のＳＭＣを提供し得ないからである。

〔発明の開示〕

本発明は、ＳＭＣ或いはその他任意所望の真核もしくは原核蛋白もしくはポリペプチドを産生ずるのに最適なりＮＡ配列を、これらＤＮＡ配列により形質転換された宿主において産生を行なうために同定する方法を提供することにより上記問題を解決する。この方法により選択される改変ＤＮＡ配列はこれら蛋白、特に本発明の好適実施例においてはＳＭＣの発現をコードし、かつこれらを各種の宿主において効率的に高レベルで産生ずることを可能にする。したがって、本発明によれば、臨床上有用な量でＳＭＣの成金刺戟性および媒介活性を示すポリペプチドを初めて得ることが可能になる。

以下の開示から明らかとなるように、本発明の好適具体例において、本発明の新規なりＮＡ配列および組換ＤＮＡ分子は適当な宿主において多量のＳＭＣおよびＳＭＣ様ポリペプチドの産生を指令することができる。かくして、これらのポリペプチドはヒト並びに牛、豚およびニワトリにおける広範な種類の成長刺戟および媒介活性において有用となる。

したがって・本発明の基本的−面は、Ｓ　Ｍ　Ｃ或いはその他任意所望の真核もしくは原核蛋白もしくはポリペプチドを産生ずるのに最適なりＮＡ配列の同定方法を設計することにあで産生しうる各種の新規なりＮＡ配配列１換換ＤＮＡ子および宿主に関するものである。

要約して、所望の真核もしくは原核蛋白もしくはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列により形質転換された宿主において、これら所望の蛋白もしくはポリペプチドの産生を向上させる本発明の方法は、容易に分析しうる蛋白もしくはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列のＮ−末端の１部を、所望の真核もしくは原核蛋白もしくはポリペプチドのＮ−末端の１部をコードするＤＮＡ配列の縮退シリーズで置換し；得られたシリーズの所望発現制御配列に作用結合したハイブリッドＤ　Ｎ　Ａ配列を適当な宿主で発現させ；容易に分析しうる蛋白もしくはポリペプチドの最適な産生を可能にする特定ハイブリッドＤＮＡ配列を選択し；かつ所望のポリペプチドもしくは蛋白のＮ−末端部分をコードするこれら選択されたハイプリントＤＮＡ配列のＮ−末端の１部を所望ポリペプチドもしくは蛋白の発現に使用することからなっている。を利には、この方法は、所望の蛋白もしくはポリペプチドの最適産生を可能にする。

〔図面の簡単な説明〕

第１図は概要においてｆ−Ｍｅｔ−ＳＭＣをコードする合成りＮＡ配列並びにｍｕおよびＰ、プロモータから誘導される配列の下流に前記ＤＮＡ配列ををするプラスミドｐＬｃ２４ｍｕＳ　Ｍ　Ｃｏｒｉの一つの製造方法を示し、第２図はｆ −Ｍｅ　ｔ−ＳＭＣをコードする合成りＮＡ配列を製造するための本発明による方法の１実施例に使用する２種の断片（ＳＭＣＡ（断片Ａ）およびＳＭＣＢ（断片Ｂ））の合成ヌクレオチド配列（両者ともストランド）を示し、さらにこの第２図はこれら断片を製造するために使用する断片ＳＭＣＡおよびＳＭＣＢ並びに各種のオリゴヌクレオチド配列１−１１．Ｘ、ＹおよびＺのアミノ酸配列をも示し、第３図は概要においてプラスミドｐ　ＬＩＣｍｕＳＭＣＡｏｒｉ　。

ｐ　ＵＣｍｕＳＭＣＡ　１　１８およびｐ　ＵＣｍｕＳＭＣ１１８の１製造方法を示し、第３図の中央に図示された５１２倍縮退した合成リンカの配列においてｒＮＪは４種の全ての塩基の可能性を示し、「Ｐ」はプリンを示しかつｒＹＪはピリミジンを示す。

〔発明を実施する最良方式〕

ここに記載する本発明を充分理解しうるよう、以下詳細に説明する。

説明において次の用語を使用する：ヌクレオチド：糖成分（ペントース）と燐酸と含窒素複素　−環塩基とよりなるＤＮＡもしくはＲＮＡの単量体単位である。

塩基はグリコシド炭素（ペントースの１′炭素）を介して糖成分に結合される。

塩基と糖とのこの組合せをヌクレオシドと呼ぶ。各ヌクレオチドはその塩基を特徴とする。４種のＤＮＡ塩基はアデニン（ｒＡＪ）、グアニン（ｒＧＪ　）、　シトシン（ｒＣＪ）およびチミン（ｒＴＪ）である、４種のＲＮＡ塩基はＡ、　Ｇ、　Ｃおよびウラシル（ｒＵＪ）である。

ＤＮＡ配列】隣接するペントースの３′炭素と５゛炭素との間でホスホジエステル結合により互いに連結されたヌクレオチドの線状列である。

コドン：３個のヌクレオチド（トリプレット）のＤＮＡ配列であって、ｍＲＮＡを介しアミノ酸、翻訳開始信号また番よ翻訳停止信号をコードする。

遺伝子＝Ｉｌｌｉ型またはメツセンジ＋−ＲＮＡ　（ｒｍＲＮＡＪ　）を介し、特定ポリペプチドに特徴的なアミノ酸の配列をコードするＤＮＡ配列である。

遺伝子により行われる過程。これは転写と翻訳との組合せである。

プラスミド；プラスミドが宿主細胞で複製されるような完全「レプリコン」からなる非染色体二重鎮ＤＮＡ配列である。

プラスミドが単細胞生物内に挿入されると、この生物の特性がこのプラスミドのＤＮＡの結果として変化し或いは形質転換しうる。たとえばテトラサイタリン耐性（７ｅｔ）に関する遺伝子を有するプラスミドは、テトラサイタリンに対し感受性であった細胞をテトラサイタリンに対し耐性である細胞に形質転換する。プラスミドにより形質転換された細胞を「形質転換体」と呼ぶ。

ンベロブもしくはコート蛋白（「カプシド」）にカプセル化されたＤ　Ｎ　Ａ配列よりなる細菌性ウィルスである。

ファージＤ　Ｎ　Ａもしくはその他のＤＮＡ配列であって、この種のＤＮＡ配列がＤ　Ｎ　Ａの本質的な生物学機能、たとえは複製、コート蛋白の産生などの損失を伴なわずに或いはプロモータもしくは結合部位の損失を伴なわずに決定可能に切断されうるＮＩＭもしくは少数のエンドヌクレアーゼ認識部位を特徴とし、さらに形質転換細胞の同定に使用するのに適した標識、たとえばテトラサイクリン両性もしくはアンピシリン耐性を有する。クローン化ベヒクルはしばしばベクターと呼ばれる。

列から誘導される、これら生物もしくはＤＮＡ配列の集団を得る過程である。

組換ＤＮＡ分子、すなわちハイブリッドＤＮＡ：互いに末端結合されかつ成る種の宿主細胞に感染してそこに維持される能力ををする種々異なるゲノムからのＤＮＡ断片よりなる分子である。

発現制御配列：遺伝子の発現を、これら遺伝子に作用結合された際に制御しかつ調整するヌクレオチドの配列である。

これらはｌａｃ系、ｔｒｐ系、ｔａｃ系、ｔｒｃ系、ファージλの主オペレータおよびプロモータ領域、ｆｄコート蛋白の制御領域、ＳＶ４０の早期および後期プロモータ、ポリオーマ、アデノウィルスおよび猿ウィルスから誘導されるプロモータ、３−ホスホグリセレートキナーゼまたはその他の糖分解酵素のプロモーフ、酵母酸ホスファターゼのプロモータ、たとえばＰｂｏ２．ｆＩＩ母α−接合因子のプロモータ、並びに原核もしくは真核細胞およびそのウィルスの遺伝子の発現を制御することが知られたその他の配列、或いはその組合せを性を示すポリペプチドである。たとえばＳＭＣ様ポリペプチドは成熟ｓ　Ｍｃの第１グリシンに融合したＮ−末端メチオニンまたはその他のペプチドを含むことができる。さらに、これはアミノ酸位置５９にメチオニンの代りにスレオニンを含むこともできる。さらに、ＳＭＣ様ポリペプチドは、成熟ＳＭＣのアミノ酸配列に対しその他各種の置換、付加または欠失を含むこともできる。

本発明は幾つかの局面を有する。第１に、本発明は任意の真核もしくは原核蛋白もしくはポリペプチドの発現をコードするＤＮＡ配列で形質転換された宿主細胞において、これら蛋白もしくはポリペプチドを産生される改良方法に関する。

さらに本発明は、これらＤＮＡ配列により形質転換された宿主細胞において任意の真核もしくは原核蛋白もしくはポリペプチドの最適産生を可能にするＤＮＡ配列の選択方法にも関する。さらに本発明は、前記方法により選択されるＤＮＡ配列およびこれらによりコードされる蛋白およびポリペプチドの産生におけるその使用に関する。最後に１つの好通例において、本発明はＳＭＣ様ポリペプチドをコードするＤ　Ｎ　Ａ配列、並びにこれらＤＮＡ配列を選択しかつこれらにより形質転換された宿主にてＳＭＣの産生を最適化する際に使用する方法に関するものである。

本発明のハイブリ７ドＤ　Ｎ　Ａ配列および所望の真核もしくは原核蛋白もしくはポリペプチドの最適産生を可能にする選択ＤＮＡ配列の両者を発現させる際、広範な種類の宿主／発現ベクター組合せを用いることができる。たとえば、有用な発現ベクターは染色体、非染色体および合成りＮＡ配列の断片、たとえばＳＶ４０の各種公知の誘導体および公知の細菌性プラスミド、たとえばＣｏ１Ｅ１．ｐｃＲｌ、　ｐＢＲ３２２゜ｐ　Ｍ　Ｂ　９およびその誘導体を含むイー・コリからのプラスミド、広範な宿主範囲のプラスミド、たとえばＲＰ４．ファージＤＮＡ、たとえばファージλの多数の誘導体、たとえばＮＭ９８９およびその他のＤＮＡファージ、たとえばＭ１３並びにフィラメント状−重鎖ＤＮＡファージ、酵母に有用なベクター、たとえば２μプラスミド、真核細胞および動物細胞に有用なベクター、たとえばＳＶ４０から誘導されたＤＮＡ配列を含むもの、並びにプラスミドとファージＤＮＡとの組合せから誘導されるベクター、たとえばファージＤＮＡもしくはその他の誘導体を使用すべく改変されたプラスミドで構成することができる。

この種の有用な発現ベクターには、真核宿主（たとえば動物およびヒト細胞）においてクローン化ＤＮＡ配列の発現を可能にするベクター〔たとえばＰ、Ｊ、サンザーンおよびＰ。

ベルク、ジャーナル・モレキュラー・アプライド・ジェネティックス、第１巻、第３２７−３４１頁（１９８２）；ｓ。

号プラマニ等、モレキュラ・セルラー・バイオロジー、第１巻、第８５４−８６４頁（１９８１）；Ｒ，Ｊ、カウフマンおよびｐ、Ａ、シャープ、「モジュール・ジヒドロホレート・レダクターゼ相補性Ｄ　Ｎ　Ａ遺伝子を組込んだ配列の増殖および発現」、ジャーナル・モレキュラー・バイオロジー、第１５９巻、第６０１−６２１頁（１９８２）；Ｒ，Ｊ、カウフマンおよびＰ、Ａ、シャープ、モレキュラ・セルラー・ノくイオロジー、第１５９巻、第６０１−６６４頁（１９８２）；Ｓ、１．スカヒル等、「支那ノλムスター卵細胞にお番するヒト免疫インクフェロンＤＮＡ遺伝子の産生物の発現および特性化」、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンスＵＳＡ、第８０巻、第４６５４−４６５９頁（１９８３）；Ｇ、ウルラウプおよびり、Ａ、ケーシン、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンスＵＳＡ、第７７巻、第４２１６−４２２０頁（１９８０））がある。

さらに、この種の発現ベクターは、特定のＤ　Ｎ　Ａ配列に作用結合されてクローン化ＤＮＡ配列の発現を制御しかつ調整する少な（とも一種の発現制御配列を特徴とする。有用な発現制御配列の例はと上正系、エエヱ系、上土正系、ｔｒ丘系。

ファージλΦ主オペレータおよびプロモータ領域、ｆｄコート蛋白の制御領域、酵母の糖分解プロモータ、たとえば３−ホスホグリセレートキナーゼのプロモータ、酵母酸ホスファターゼのプロモータ、たとえばＰｂｏ２．酵母α−接合因子のプロモータ、並びにポリオーマ、アデノウィルスおよび猿ウィルスから誘導されるプロモータ、たとえばＳＶ４０の早期および後期プロモータ、□並びに原核もしくは真核細胞の遺伝子およびそれらのウィルスの発現を制御することが知られたその他の配列、或いはその組合せである。

有用な発現宿主は周知の真核および原核宿主、たとえばイー・コリＨＢ　１０１．イー・コリＸ１７７６、イー・コリＸ２２８２、イー・コリＤＨＩ（λ）およびイー・コリＭ　ＲＣ１のようなイー・コリ、シュードモナス、バチルス（たとえばバチルス・ズブチリス）、ストレプトミセス、酵母およびその他の真苫類の凹株、動物のたとえばＣｏＳ細胞およびＣＨＯ細胞、並びに組織培養におけるヒト細胞および植物細胞を包含する。

勿論、必ずしも全ての宿主／発現ベクター組合せが同等な効率をもって本発明におけるＤ　Ｎ　Ａ配列の発現或いは本発明のポリペプチドの産生に機能するとは限らない。しかしながら、宿主／発現ベクター組合せの特定の選択は、以下説明する原理を考慮して、本発明の範囲を逸脱することなく当業者により行なうことができる。たとえば、この選択は多数の因子のバランスに基づいている。たとえば、これらは宿主およびベクターの適合性、ＤＮＡ配列によりコードされた蛋白の宿主に対する毒性、所望蛋白の回収容易性、ＤＮＡ配列の発現特性、並びにこれらに作用結合された発現制御配列、生物安全性、コストおよび所望蛋白の重なり、形態或いはその他の任意の必要とする発現後の改変を包含する。

さらに、各特定発現ベクターには、本発明のＤＮＡ配列を挿入するため各種の部位を選択することができる。これらの部位は、一般にこれらを切断する制限エンドヌクレアーゼにより命名され、当業者に充分認１されている。勿論、本発明に有用な発現ベクターは、選択ＤＮＡ断片を挿入するための制限エンドヌクレアーゼ部位ををする必要がないことを了解すべきである。寧ろ、このベクターは他の手段によって断片に結合させうる。発現ベクター、特に選択ＤＮＡ断片を挿入して、ここで発現制御配列に作用結合させるための選択部位は各種の因子、たとえば特定制限酵素に感受性の部位の個数、発現すべき蛋白の大きさ、宿主細胞酵素による蛋白分解に対する所望蛋白の感受性、宿主細胞により発現されて精製の際に除去するのが困難な蛋白の汚染もしくは結合、発現特性、たとえばベクター配列に対する開始コドンおよび停止コドンの位置、並びに当業者に認２人されたその他の因子により決定される。ＤＮＡ配列のためのベクターおよび挿入部位の選択　・はこれら因子のバランスによって決定され、必らずしも全ての選択が所定の場合に同等に有効であるとは以らない。

さらに、容易に分析しうる蛋白もしくはポリペプチドをコードする各種ＤＮＡ配列も、本発明に使用することができる。

たとえば、本発明の好適具体例においてはβ−ガラクトシダーゼを使用する。何故なら、この蛋白の産生は周知の比色ブレート分析を用いて容易に監視しうるからである。さらに、たとえばガラクトキナーゼもしくは薬品耐性の遺伝子、たとえばアンピシリン耐性などを用いることもできる。

最後に、本発明の方法並びにこれにより選択されかつ使用されるＤＮＡ配列は、任意の原核もしくは真核蛋白もしくはポリペプチドに適用することができる。これらのうちには、ヒトおよび動物リンホキン、たとえばインクフェロン、インタロイキンおよびＴＮＦ、　ヒトおよび動物ホルモン、たとえば成長ホルモンおよびインシュリン、ヒトおよび動物血液ファクタ、たとえばファクタ■およびｔｐＡ、ｉＭ素、抗原並びに興味あるその他の蛋白およびポリペプチドがある。ここに説明する１好適具体例においては、本発明の方法を用いてＳＭＣ様ポリペプチドの産生を最適化させた。

本発明を一層充分に理解しうるよう、以下実施例につき説明する。これらの実施例は例示の目的であって、決して本発明をこれら特定実施例に望定すると解釈すべきでないことを了解すべきである。

ＳＭＣ様ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を持った組換ＤＮＡ分子の作成次に第１図を参照すれば、ここには組換Ｄ　Ｎ　Ａ分子（ｐＬｃ２４　ｍｕｓＭｃｏｒｉ　）の製造方法の１具体例が概要として示されており、これはｍｕから誘導されたＤＮＡ配列に融合しかつｍｕからのシャイン・ダルガルノ配列を有するヒトｆ−Ｍｅｔ−３ＭＣをコードするＤＮＡ配列を有し、この組合せＤＮＡ配列はバタテリオファージλから誘導されたＰＬプロモークに作用結合されていることを特徴とする。

ｐ　Ｌ　ｃ　２４　ｍｕＳＭＣｏｒ＋を作成するため、先ず報告されているヒトＳＭＣのアミノ酸配列〔リンダークネヒトおよびハングル、上記、Ｄ、Ｇ、フラッパー等、Ｅｎｄｏｃｒｉｎａｌ、第１１２巻、第２２１５−２２１７頁（１９８３））を用いて１４種のオリゴデオキシヌクレオチドを合成した（第１図および第２図の配列１−１１．Ｘ、ＹおよびＺ参照）。合成には面相のホスホトリエステル法を用いた（Ｈ，イト−等、ヌクレインク・アシッド・リサーチ、第１０巻、第１７５５−１７６９頁（１９８２））。粗製オリゴマを除蛋白した後、これらをセファデックスＧ−５０でのゲル濾過によって脱塩し、かつ尿素を含有する変性ボ、リアクリルアミド調製用スラブゲルでの電気泳動によって精製した（Ｔ、マニアチス等、バイオケミストリー、第１４巻、第３７８７−３７９４頁（１９７５）　）　。

ＬＪＶ分析によってバンドの位置決定を行ない、かつ電気溶出によってゲルスライス物からオリゴデオキシヌクレオチドを１１離した。次いで、ゲル端層したオリゴデオキシヌクレオチドをＴ、ポリヌクレオチドキナーゼによって燐酸化し、かつ１５％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルにて再精製し、電気溶出でＤＮＡを回収したＣＴ、マニアチス等、モレキュラ・クローニング、コールド・スプリング・八−バー・ラボラトリ−（１９８２））、これら１４種のオリゴデオキシヌクレオチドは、寸法において１３塩基から３７塩基まで変化した。

これらの合成において、イー・コリの高度発現した遺伝子におけるコドンの使用（Ｒ，グランタム等、ヌクレインク・アシッド・リサーチ、第８巻、第１９８３ −１９９２頁（１９８０））およびイー・コリ）ｔＲＮＡ発生（Ｔ、イケムラ、ジャーナル・モレキエラ・バイオロジー、第１５１巻、第３８９−４０９頁（１９８１））を考慮した。さらに、各種の便利なエンドヌクレアーゼｔ？！識部位を、これらオリゴヌクレオチド配列に沿った種々の位置に含ませた。

次いで、配列１−４並びにＸ、ＹおよびＺと配列５−１１とを結合させ、かつこれらをケレノーボリメラーゼで延長化させて２種の複合ＤＮＡ配列、すなわち断片Ａとしての９８塩基対の平滑末端断片（ｒｓＭｃ　ＡＪ　）および断片Ｂとしての１３８塩基対の平滑末端断片（ｒＳＭＣＢＪ）を形成させた（Ｊ、Ｒ，ロッジ等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２５７巻、第９２２６− ９２２９頁（１９８２））（第１図および第２図参照）。断片ＡはＳＭＣのＮ− 末端をコードし、かつ断片ＢはＳ　Ｍ　Ｃの残部をコードする（第２図）。

配列１−４．　Ｘ、　ＹおよびＺのそれぞれ２００ｐモルを２０ｐｉの再融合用緩衝液（５０ｍＭ）リス−ＨＣ１（ｐＨ７，６）、１０ｍＭ　ＭｇＣ１２）中にて９５℃まで加熱することにより断片ＳＭＣＡを作成し、次いでこの混合物を４ ℃まで徐々に冷却した。ジチオスレイトールとＡＴＰとＴ４ＤＮＡリガーゼとを最終濃度５ｍＭ、７０μＭおよび２０μ／ｍｌまでそれぞれ添加し、次いでこの反応混合物を４℃にて１０時間培養した。エタノール沈澱の後、この混合物を８％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルに加え、かつ７７−および７８−塩基対のストランドを溶出させた。次いで、各ストランド２５ｐモルを５μｉの再融合用緩衝液中にて組合せ、反応混合物を９５℃まで加熱し、次いで１５℃まで徐々に冷却した。次いで、ジチオスレイトールとｄＮＴＰとＤ　Ｎ　Ａポリメラーゼのクレノー断片とをそれぞれ５　ｍ　Ｍ、２５０μｍおよび２単位の濃度まで添加し、次いで混合物を室温にて３０分間静置した。上記のように反応生成物を精製し、かつ７μモルの９８塩基対ＳＭＣＡを単離した。配列５−１１のそれぞれ２００ｐモルを用いてほぼ同様な方法で、２０ｐモルの１１４塩基対ＳＭＣＢを作成した。

次いで、これらの断片のそれぞれを、ＢａｍＨＩ　（断片Ａにつき）並びにＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩ［［（断片Ｂにつき）で２μｇのＲＦ　ＤＮＡを制限することにより作成された平滑床＃Ｍ１３ｍｐ８ベクターに挿入し、交差末端を４種のデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）の存在下にＩＭ７／Ｌ位のイー・コリＤＮＡポリメラーゼ（クレノー断片）により修復し、エタノールで沈澱させ、かつ牛腸内ホスファターゼ（１０ｍ　Ｍ　）リス−ＨＣ１（ｐＨ９，２）および０．２ｍＭＥＤＴＡにおける２０単位）によって３０分間にわたり５′−脱燐酸した（Ｊ、メンシング、メソ７ズ・イン・エンチモロジー、第１０１Ｓ、第２０−７８頁（１９８３））、結合させるため２０ｎＨの線状化したベクターと０．１　ｐモルのＤＮＡ断片とを１０μｌの結合用緩衝液および４０４１位のＴ４ＤＮＡポリメラーゼにおいて１５℃にて２４時間用いた（第１図）。

゛断片Ａを平滑末端のＭ１３ｍｌ）８ベクターに結合させて、Ｓ　Ｍ　Ｃｉ片の末端にＢａｍＨＩ部位を再生成し、かつさらに−ジを得た（ｍｐ８３ＭＣＡ）（第１図）。断片Ｂを二重平滑末端Ｍ　１３　ｍ　ｐ　８ベクターに結合させて、５　Ｍ　ＣＩｊｆｒ片の末端ニ旦ａ　ｍ　ＨＴおよび）ｌｉｎｄｌｌ［部位を再生成した組換ファージ（ｍｐ８５Ｍｃ　Ｂ）を得た（第１図）。

次いで、これら組換ファージのそれぞれによりイー・コリＪＭＩＯＩ（Ｊ、メフシングおよびＪ、ビエイラ、ジイーン、第１９巻、第２６９−２７６頁（１９８２））を形質転換させ、そして形質転換宿主を５−ブロモ−４−クロル−３−インドリル−β−ガラクトピラノンド（Ｘ−ＧＡＬ）を含有するし一プロスプレートに塗抹した。次いで、ｍｐ８ｓＭｃＡおよびｍｐ８３ＭＣＢで形質転換されたイー・コリＪＭ１０１の２４個の白色プラークからファージＤＮＡを＄Ｗ製し、ジデオキシ一連鎖末端によりＤＮＡを配列決定した（Ａ、Ｊ。

Ｈ，スミス、メソフズ・イン・エンチモロジー、第６５巻、第５６０−５８０頁（１９８０））、次いで、ｍｐ８ＳＭＣＡおよびｍｐ８ＳＭＣＢから細胞内ＲＦ　ＤＮＡを作成し、前者をＮｃｏｌ／ＢａｍＨＩで、後者をＢａｍＨＴ／Ｈｉｎｄｌ［でそれぞれ切断し、かつゲル電気泳動によってＳ　Ｍ　Ｃ関連断片を単離した（第１図）、。

次いで、２種の断片（ＳＭＣＡおよびＳＭＣＢ）をバクテリオファージｍｕ（Ｅ、アレント氏の寄贈物）のｎｅｔ遺伝子からの６７塩基対断片と混合したＣＧ、クレー等、ジイーン、第３２巻、出版中〕、この断片はヌクレオチド１０４３− ９６で構成され（Ｈ，プリース等、モレキュラ・ゼネラル・ジェネティフクス、第１８６巻、第３１５−３２１クレア一ゼ制限部位が存在し、かつ後にはＮｃｏ１部位訳開始コドンを形成する。さらに、この断片はほぼ最適なリポソーム結合部位をも有する（Ｊ、シャインおよびり、ダルガルノ、ネイチャー、第２５４巻、第３４−３８頁（１９７５）　）。

この結合の結果として、ｍｕ遺伝子断片とＳＭＣＡとＳＭＣＡＴＧ開始コドンが直接融合しかつ正確な読み枠内でＳＭＣた１）ＬＣ２４に導入しくＥ、レムート等、ジーン、第１５巻、第８１−９３頁（１９８１）　）　、プラスミドｐ　Ｌ　ｃ　２４　ｍｕＳＭＣｏｒ＋を生成させた。このプラスミドは、ＳＭＣ遺伝子とその開始ＡＴＧコドンとをバクテリオファージλのＰＬプロモータの制御下で有することを特徴とする（第１図）。

ｐ　Ｌ　ｃ　２４ｍｕＳＭＣｏｒｉとｐｃＩ８５７、すなわち九の温度感受性リブレフサをコードするｐＡｃＹｃｌ　８４の誘導体（Ｅ、レムート等、ジーン、第２２巻、第１０３−１１３頁（１９８３））を用いてイー・コリＨＢＩＯＩを形質転換させた（Ｔ、マニアチス等、モレキュラ・クローニング（コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−）　（１９８２）　）。

これら２種のプラスミドは異なる抗生物質耐性遺伝子、すなわちペニシリナーゼ（ｐ　Ｌ　Ｃ２４ｍｕｓＭｃｏｒｉ　）およびカナマイシン（ｐ　ｃ　Ｉ　８５７）を有するので、正確に形質転換された培養物は５０μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび４０μｌｇ／ｍｒのカナマイシンで増殖させることにより選択することができる。

５０μｇ／ｍｌのアンピシリンと４０μｇ／ｍｌのカナマイシンとを含有するし一プロス中に、正確に形質転換されたイー・コリＨＢＩＯＩ　（ｐＬｃ２４ｍｕｓＭｃｏｒｔ）　（ｐｃ１８５７）を含有するプレートからの培養物５＋ｉｌを接種し、この培養物を２８℃にて１晩増殖させた。次いで、２ＩＩ１１の１晩培養物を４２°Ｃまで加温された１０ｍ１のし一プロスに添加し、この培養物を１００＋ｎｌの三角フラスコ中で４２℃にて２時間にわたり激しく攪拌した。

ＳＭＣ様ポリペプチドの産生につき分析するため、培養物１ｍｌ当りから細胞を遠心分離しくＡ５゜＝２０）、かつこれらを５０μｌの５ＤＳ−β−メルカプトエタノール熔解緩衝液（Ｕ、に、レムリ、ネイチャー、第２２７巻、第６８０− ６８５頁（１９７０））において１０分間沸とう（１００℃）させることにより熔解させた。次いで、市販の分析キットにコルス・インスティチュート・ダイアグノスティックス社）を用いる放射免疫分析により、全てのＳＭＣ活性を分析し、その標準については精製ＩＣＦ−１（Ｒ，ハングルの寄贈物）を用いて予め証明した０分析用としてゲル電気泳動用と同様に溶解物を含有するＳ　Ｍ　Ｃを作成し、これを分析用緩衝液に少な（とも２０倍希釈し、かつ２反復で分析した。

標準溶解条件下で変性させたヒトＳＭＣはこのＲＩＡにおいて天然ホルモンと同様な反応性を有することが観察された。

この分析は、温度誘発に際しイー・コリＨＢＩＯＩ　（ｐＬＣ２４ｍｕｓＭｃｏｒｉ　）　（ｐ　ｃ　Ｉ　８５７）が極めて少量のＳＭＣ活性（ＲＩＡにより１６４μｇ／ｍｌ）を生成したことを示し、この量は蛋白ゲルにおけるクーマシー青染色によって検出しえない量である。したがって、この形質転換宿主におけるＳ　Ｍ　Ｃｔ−１ポリペプチド産生のレベルは細胞１個当り僅か数１００分子であると推定された。

ＳＭＣ様ポリペプチドの産生を向上させる試みｐ　Ｌ　ｃ　２４　ｍｕＳＭＣｏｒｉを用いるＳ　Ｍ　Ｃｆｆａポリペプチド産生のレベルが極めて低かったので、向上したレベルの発現を有する他の各種のプラスミドを作成すべく試みた。

１つの方法において、他の蛋白をコードするＤＮＡ配列に融合されたＳＭＣをコードするＤＮＡ配列を備えた発現ベクターを作成した。この方法において、アミノ末端における非ＳＭＣ蛋白とカルボキシ末端におけるＳＭＣ様ポリペプチドとよりなる融合蛋白を作成した。この融合蛋白は前記ベクターから高収率で産生されうるが、これらは動物およびヒト治療においてｆ−ｍｅｔ−ＳＭＣまたはＳＭＣ自身程好適でない。その結果、最も有利な使用には、この融合蛋白は非−３ＭＣ蛋白をこれらから除去する追加処理を必要とする。この種の方法は公知であるが（たとえば米国特許第４，４２５．４３７号、第４．３３８，３９７号および第４，３６６．２４６号参照）、これらは直接的分泌および成熟の場合を除いて所望のＳＭＣ様ポリペプチドの直接的発現はど好適でない。

したがって、ＳＭＣ様ポリペプチドの産生を向上させる第２の試みにおいて、中成長ホルモンおよび豚成長ホルモンの発現レベルを向上させるのに有用であることが証明されている削除技術を採用した〔たとえば、ヨーロッパ特許出願第１０３．３９５号および第１０４，９２０号参照〕。これらの方法を用いてＳＭＣ様ポリペプチドを産生し、アミノ末端の欠失を特徴とする各種の改変ＳＭＣコード配列を作成した。たとえば、ｆｅｅｔ−Δ３−　Ｓ　Ｍ　Ｃおよびｆ−Ｍｅｔ− △６−３ＭＣを産生する発現ベクターを作成した。これら改変ＳＭＣの産生レベルはベクターｐ　Ｌ　ｃ　２４　ｍｕＳＭＣｏｒｉからのｆ−Ｍｅｔ−ＳＭＣの産生レベルより若干高いものであったが、この発現レベルはまだ極めて低いものである。

最後に、第３の方法としてプロモータとリポソーム結合部位との各種組合せを用いて、ＳＭＣコード配列の発現を制御した。しかしながら、いずれにせよ、これらの改変はＳＭＣ産生の点でＩ）　Ｌ　ｃ　２４ｍｕＳＭＣｏｒｉよりも貧弱であった。

と距免え二しニエ九旦血鳳生至ユニヱ囮工玉見亘旦上玉配列の選択上記２種の方法はいずれも成功せず或いは多くの場合ＳＭＣ様ポリペプチドの大して好適でない産生をもたらしたので、任意の蛋白の産生をコードする最適配列、より詳細にはＳＭＣ様ポリペプチドの産生をコードする最適ＤＮＡ配列を選択しうるような方法を設計することに決定した。

この方法は、遺伝子のＮ−末端部分をコードするＤＮＡ配列およびこの実施例に記載した特定具体例におし）て【ま、ｆ−Ｍｅｔ−ＳＭＣをコードする遺伝子における暗黙の突然変異が改良されたＲＮＡ二次構造を与え、したがって選択宿主においてより高レベルの発現をもたらしうるという本発明の仮説に基づいている。しかしながら、最適コード配列を選択するには発現に際し存在するどの作用を決定するかにつき分析せねばならない多くの可能な暗黙突然変異が存在するため、これら配列に対する迅速かつ簡単なスクリーニング法を設計する必要がある。

このような方法がなければ、クローンのスクリーニングは全く不可能でないとしても面倒であり、その方法は失格である。

千生産物を分析せずに蛋白の産生を監視した（Ｌ、グアレンチ等、セル、第２０巻、第５４３−５５３頁（１９８０）；Ｂ、Ａ、カスチルホ等、Ｊ、バクテリオロジー、第１５８巻、第４８８−４９５頁（１９８４））。さらに、β−ガラクトシダーゼ産生は、比色プレート分析によって容易に監視することができる。したがって、このスクリーニング法を用いて本発明による最適ＤＮＡコード化配列を選択することに決定した。勿論、好適ではないにせよ、他のスクリーニング法も本発明の最適ＤＮＡ配列を選択する際に用いうろことを了解すべきである。

本発明による方法のこの実施例にてＳＭＣコード化配列の二次構造を変化させるため、Ｓ　’ｖＩ　Ｃのアミノ酸２−６をコードする２５６種の可能なりＮＡ配列からなる一連の合成リンカを作成した。ＳＭＣのアミノ酸２−６は２５６種の異なる配列によってコードされうるが、フェニルアラニンをコードするＴＴＹを含め全ての可能なロイシンコドン（ＳＭＣ位ｉ５）を可能にする５１２倍の縮退リンカを使用した（第３図）。

勿論、本発明の方法にはそれより長いまたは短いオリゴヌクレオチドも使用しうろことを了解すべきである。たとえば、ＳＭＣアミノ酸２０までをコードするような長い合成リンカを、ＳＭＣの発現に際しこれらの長い配列の作用を決定するために有利に使用することかできる。これら一連の５１２−リンカの余分なりＮＡ配列を第３図に示す。

第３図を参照して、ここにはＳＭＣ産生におけるこれら余分なり　Ｎ　Ａ配列を用いる方法の１具体例が図示されている。

第３Ｉ２１に示したように、先ず最初にｐ　Ｌ　ｃ　２４　ｍｕｓきＡ　Ｃｏｒｉの１６５塩基対のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片をＥｃｏＲＩ−３ａｍＨＩ切断されたｐＵｃ８にサブクローン化して、工ａｃＺとＳＭＣとの間の１３ａｍＨ１部位における相内融合を生ぜしめた。このベクターをｐＵｃｍｕｓＭｃ　Ａｏｒｉと呼ぶ（第３図）。ｐＵＣ８を選択した理由は、その小さい寸法およびＬにＺとＩａｃｌ−宿主を中ピするその独特な制限部位を有するからである。しかしながら、１ａｃＺ遺伝子を有する他のプラスミドもこのスクリーニング法に用いうることを了解すべきである。

ＳＭＣコード配列をＬ土ｃＺ遺伝子のプロモータ近接領域に挿入して融合体を作成したので、このハイブリッド遺伝子の発現はｐＵｃ８の上土！プロモータの制御下にある。

リポソームは、ｌａｃリポソーム結合部位において、ｐＵＣｍｕｓ　Ｍ　ＣＡ　ｏｒｉでの翻訳を開始することができる。しかしながら、この種の翻訳はｐ　Ｌ　ｃ　２４ｍｕＳＭＣｏｒｉから誘導されたｍｕ断片の枠内停止コドンにて急速に停止する。或いはこれらリポソームはｍｕリポソーム結合部位で翻訳を開始して、ＳＭＣからのアミノ末端部分と１ａｃＺからのカルボキシ末端部分とよりなる融合蛋白を生成することもできる。

ｐＵＣｍｕＳＭＣｏｒｉにおけるＳＭＣ−β−ガラクトシダーゼ融合体は、Ｎ− 末端にＳＭＣの３５個のアミノ酸を含有した。

ｐＵＣｍｕＳＭＣＡｏｒｉにおける融合遺伝子は相内にあるが、イー・コリＪＭ８３　（Ｊ、　ビエイラおよびＪ、メンシエング、ジーン、第１９巻、第２５９ −２６８頁（１９８２））をプ　□ラスミドでトランスフェクトしかつ形質転換宿主を５−ブロモ−４−クロル−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ＧＡＬ）を含有するＬＢ−寒天板で培養した際、３７℃にて１６時間後に白色コロニーのみが観察された。これらのコロニーは４０時間後に最終的に極めて淡い青色となったが、１６時間後におけるその白色はこれらが極めて少量のＳＭＣ−β−ｇａｌ融合蛋白しが産生しながったことを示している。勿論、この結果はｐＬ　Ｃ２４ｍｕＳＭＣｏｒ＋における低発現レベルという本発明者等の従前の観察と一致する。

次イテ、プラスミドｐＵＣｔａｕＳＭＣＡｏｒｉ中へ、ＳＭＣのアミノ酸２−６をコードする５１２倍縮退合成りＮＡリンカ（Ａｖａ　Ｕ　−Ｈａ　ｅ　Ｕ断片）よりなる各保存物を、原プラスミドにおけるこれらアミノ酸のコード配列に対する置換体として導入した。リンカ結合体を回避するため、結合前にこれらリンカを埴酸化しなかった。これらの配列をプラスミドｐＵＣｍｕＳＭＣＡｏｒｉ中に導入し、その際各配列をｍｕリポソーム結合部位とＳＭＣアミノ１１２１　（ｐＵＣｍｕＳＭＣＡｏｒｉの７０ｂｐ　Ｅ五ユＲＩ−Δヱ土■断片）とをコー、ドする断片およびＳ　Ｍ　Ｃのアミノ酸７−３２をコードする断片Ａｏｒｉに導入した（第３図参照）。

上記プラスミドの混合体で形質転換させたイー・コリＪＭ８３の５０００個のコロニーをＸ−ＧＡＬを含有するし一ブロス板に塗抹した。得られたコロニーの約１０％は、３７°Ｃにて４０時間後にｐＵｃ８ｍｕｓＭｃ　Ａｏｒｉよりも暗青色であった０次いで、５ｏｏｏ個のコロニーのうち１４（固（青色および白色の両者）（イー・コリＪＭ８３　（ｐ　ＵＣｍｕＳＭＣＡｌ−１４））を各種の方法で分析した。すなわち、縮退領域のＤＮＡ配列決定、β−ガラクトシダーゼの酵素活性、およびイー・コリＣ６００におけるＳ　Ｍ　Ｃ発現（Ｔ、マニアチス等、モレキュラ・クローニング（コールド・スプニングハーバー・ラボラトリ− ）（１９８２）〕。これらの分析シよ行なった・これら後者のプラスミドを、第３図においてｐＬｃ２４　ｍｕｓＭｃ　１　１８と呼ぶ０分析用に選択した１４個のコロニーのうち、１０個は青色であり、４個はＸ−ＧＡＬ板上で白色であった。第１表はこれら各種の分析の結果を示している。

ＬＬＬ２　３　４　５　６　ｐＨｃ８融合　ｐＬプラスミドプラスミド　ｐｒｏ、ｇｌｕ、ｔｈｒ、ｌｅｕ、ｃｙｓ　１１位β−ｇａｌ＊μｇ　／ｍｌｓＭｃＯＤ、。

７８解物初期２−６配列　ＣＣＡ　ＧＡＡ　ＡＣＣＣＴＧ　ＴＧＣＯ，４１，４ｐＵｃｍｕｓＭｃＡｏｒｉ青色コロニーｐＬＩｃｍｕｓｌ’ｌｃＡ　Ｉ　ＣＣＣＧＡＡ　ＡＣＴ　ＣＴＧ　ＴＧＴ　３．１　３３２　ＣＣＴ　ＧＡＡ　ＡＣＴ　ＴＴＧ　ＴＧＣ２，６４５３ＣＣＡ　ＧＡＧ　ＡＣＧ　ＴＴＧ　ＴＧＣＯ，９３５４ＣＣＡ　ＧＡＧ　ＡＣＩＩ；　ＴＴＧ　Ｔｆ；Ｔ　Ｏ，９４３５ＣＣＴ　ＧＡＡ　ＡＣＴ　ＴＴＧ　ＴＧＴ　２．９　３３６　ＣＣＴ　ＧＡＧ　ＡＣＧ　ＴＴＧ　ＴＧＴ　１．２　５８７　ＣＣＧ　ＧＡＡ　ＡＣＧ　ＴＴＡ　ＴＧＴ　１．９　５０８　ＣＣＧ　ＧＡＡ　ＡＣＡ　ＴＴＧ　ＴＧＴ　１．２　６５９　ＣＣＡ　ＧＡＡ　ＡＣＧ　ＴＴＧ　ＴＧＴ　１．１　３２１０　ＣＣＴ　ＧＡＧ　ＡＣＴ　ＣＴＡ　ＴＧＴ　２．３　４２白色コロニーｐＬＩＣｍｕＳＭＣＡ　１１　ＣＣＣＧＡＡ　ＡＣＣＣＴＣＴＧＴ　＜　０．１　０．１０１２　ＣｃＴ　ｃＡＡ　ＡｃＣＣＴＣＴＧＴ　＜　０．１　０．１１１３　ＣＣＧ　ＧＡＡ　ＡＣＣＣＴＣＴＧＴ　＜　０．１　０．１０１４　ＣＣＡ　ＧＡＡ　ＡＣＣＣＴＣＴＧＴ　＜　０．１　０．０９＊　β−ガラクトシダーゼ活性については、Ｊ、Ｈ，ミラーによりエキスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジエネティックス（コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラドリース出版）（１９７２）に実質的に記載されたように○−ニトロフェニルーβ−Ｄ−ガラクトシド（ＯＮ　Ｐ　Ｇ）を用いて分析した。

第１表に示したように、ｐＵｃ８ｍｕｓＭｃ　Ａｌ−１０を含有する青色コロニーは、イー・コリＪＭ８３　（ｐＵｃ８ｍｕＳＭＣＡｏｒｉ）よりも２．５〜８倍多しイβ−ガラクトシダーゼ単位を生成した。これに対し、ｐ　ＵＣＩＩｌｕＳＭＣＡ　１１−１４を含有する白色コロニーは、検出しうるβ−ガラクトシダーゼを生成しなかった。驚くことにｐＵＣ８＋ＩｌｕＳＭＣＡ１−１０のβ−ガラクトシダーゼ生成は原プラスミドよりも２．５〜８倍高かったが、これらプラスミドからのＥｌ：ＯＲＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐ　Ｌ　ｃ　２４　ｍｕｓＭｃｏｒｉに挿入した際これらプラスミドはイー・コリ）ＩＢＩＯＩにおいて原プラスミドにおけるよりも２３〜４６倍多いＳＭＣ活性を与えた。さらに、所定の融合体に対するβ−ガラクトシダーゼ単位とＰＬ制御下における対応の発現に対するＳＭＣのマイクログラムとの間には明らかな特異的相関関係が存在しなかった。

しかしながら、Ｘ−ＧＡＬ板におけるこれらコロニーの青色／白色の差は、ＳＭＣの高度発現をコードするＤＮＡ配列の選択を簡単に可能にした。したがって、この方法を一般的に使用して、任意所望の真核もしくは原核ポリペプチドの産生につき最適なり　Ｎ　Ａ配列を選択することができる。

特定理論に拘束されるものでないが、本発明による縮退ＤＮＡ配列により示される発現レベルの差はＳＭＣのＮ−末端アミノ酸をコードするヌクレオチドのＲＮＡ二次構造に関連すると思われる。たとえば、本発明による結果は、スレオニン −ロイシンに対するコドン（ＡＣＮ−ＣＴＮ）により形成される可能なＣＣＣ（ＳＭＣ位面４および５）がＳＭＣ合成に対し特に悪影響があることを示している。ここで分析した白色コロニーおよびｐＵｃｍｕｓＭｃｏｒｉは全てｐＬｃ２４ｍｕｓＭｃにおけるリポソーム結合部位に対し水素結合を形成しうろこの配列を特徴とする。

上記本発明の実施例においては、Ｎ−末端にＳＭＣの３５個のアミノ酸を有する融合蛋白を産生するような所望の蛋白−ＩａｃＺ融合体をコードするＤＮＡ配列を使用したが、融合蛋白における２つの部分の相対的長さはこの方法における最も有効なスクリーニングにつき実験的に決定せねばならない、この実験結果は、この選択を可能にすると考えられる幾つかのファクタを確認した。たとえば、リポソーム結合部位の強度が重要である。ｍｕからのものでな（ｔｒｐリポソーム結合部位を使用すると、ＳＭＣの３５個のアミノ酸を含有する融合体は青色コロニーを生成しなかった。融合蛋白におけるβ−ガラクトシダーゼと選択蛋白との相対的割合も重要である。たとえば、Ｎ−末端に１４個のみのＳＭＣアミノ酸を有する融合蛋白を生成した遺伝子融合体は、青色／白色の選択を可能にしなかった。この場合、融合蛋白のβ−ガラクトシダーゼ活性が高過ぎて、最適Ｎ−末端コード配列の検出を可能にしなかったことが明らかである。最後に、検出系の感度も重要である。このスクリーニング法で有用なβ−ガラクトシダーゼ活性範囲は、原ｐＵＣ８により生成されるβ−ガラクトシダーゼレベルの１〜８％であることを確認した。

これらファクタ並びに上記のように同様に決定しうるファクタを相応に考慮して、当業者は適当な融合蛋白並びにここに説明した方法によるスクリーニング分析を本発明の範囲を逸脱することなく選択することができる。

上記実施例で産生された特定のＳ　Ｍ　Ｃ様ポリペプチドはｆ−Ｍ　ｅ　ｔ　Ｓ　Ｍ　Ｃであるが、各種の可能な手段によってこのＳＭＣからｆ−Ｍｅ　ｔを除去しうろことも了解すべきである。

本発明の方法により産生されるＳＭＣ１ポリペプチドは、常法を用いて医薬上有用な組成物に配合することができる。

これらの組成物は、所望の組織成長刺戟を行なうのに医薬上有効量のＳＭＣ様ポリペプチドと、好ま°しくは医薬上許容しうるキャリヤとからなっている。適するキャリヤは周知されている。上記したように、これら組成物は組織成長を刺戟す′る方法、並びに短小発育症、筋肉アトロピー、骨折、外傷あるいは組織に対するその他の傷を治療するのに有用である。

ここに説明した方法で作成された微生物および組換ＤＮＡ分子は、１９８５年３月２３日付けで西ドイツ、ゲッチンゲン在、ドイツチェ・ザンムルンク・フォノ・ミクロオルガニスメンの培養物寄託機関に寄託して、ＳＭＣ−１およびＳＭＣ −２として同定された培養物により例示される８３ＭＣ−１：イー・コリＨＢ　１０１　（ｐ　ｃ　ｒ　８５７）（ｐ　Ｌｃ　２４ｍｕＳＭＣｏｒｉ　）ＳＭＣ２：イー・コリＨＢ　１０１　（ｐ　ｃ　ｒ　８５７）（ｐＬｃ２４ｍｕｓＭｃ８　）これらの培養物はそれぞれＤＳＭ３２７６および３２７７の受託番号が付与された。

以上、本発明を多くの実施例につき説明したが、この基本構成を改変して本発明の方法および構成を利用する他の実施例を提供しうろことが了解されよう、したがって、本発明の範囲は、例示した上記特定実施例のみに限定されないことが了解されよう。

手続補正書（支）昭和６２年　２月ｐ日特許庁長官　黒　１）　明　雄　殿１、事件の表示ＰＣＴ／ＵＳ　８６１００５７９２、発明の名称ヒトソマトメジンＣの製造３、補正をする者事件との関係　特許出願人名称　バイオジエン　ナームローズ　ベンノノトシャソプ（国籍）（オランダ領アンチル）６、補正の内容国　際　調　香　鮒　牛１“−°″＠′″ｌ　Ａｏｅ″″ｅｅ　Ｎ＠ｐｃτ／σ５ａ６１００５７９

Claims

【特許請求の範囲】

１．所望のポリペプチドをコードしかつ発現制御配列に作用結合されたＤＮＡ配列により形質転換された宿主において所望ポリペプチドの産生を向上させるに際し、容易に分析可能なポリペプチドをコードするＤＮＡ配列のＮ一末端の１部を所望ポリペプチドのＮ一末端の１部をコードする縮退した一連のＤＮＡ配列で置換し、この置換は分析可能性に実質的に影響を与えず；所望の発現制御配列に作用結合した一連の得られたハイプリッドＤＮＡ配列を宿主中で発現させ；容易に分析しうるポリペプチドの最適産生を可能にする特定ハイブリッドＤＮＡ配列を選択し；かつ所望ポリペプチドのＮ一末端部分をコードする前記選択ハイプリッドＤＮＡ配列のＮ一末端の１部を前記ポリペプチドの発現に使用することを特徴とする所望ポリペプチドの産生を改善する方法。
２．容易に分析しうるポリペプチドをβ−ガラクトシダーゼ、ガラクトキナーゼおよび薬剤性標識よりなる群から選択することを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
３．所望のポリペプチドをインタフェロン，インタロイキンおよびその他のリンホキソ，血液因子，酵素，ウイルス抗原，ＳＭＣ，成長ホルモンおよびその他のホルモン並びに動物およびヒト起源のその他のポリペプチドよりなる群から選択することを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
４．発現制御配列を１ａｃ系，ｔｒｐ系，ｔａｃ系，ｔｒｃ系，ファージλの主オペレータおよびプロモータ領域，ｆｄコート蛋白の制御領域，ＳＶ４０の早期および後期プロモータ，ポリオーマ，アデノウイルスおよび猿ウイルスから誘導されるプロモータ、並びに酵母糖分解酵素、α−接合因子および酸ホスファターゼのプロモータよりなる群から選択することを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
５．宿主をイー・コリ，シュードモナス，バチルス，ストレプトミセス，酵母，その他の真菌類の菌株，動物細胞および植物細胞よりなる群から選択することを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
６．ＤＮＡ配列がＳＭＣ様ポリペプチドをコードし、かつｐＬＣ２４ｍｕＳＭＣ１〜ｐＬＣ２４ｍｕＳＭＣ１０のＤＮＡ挿入物から選択されることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
７．容易に分析しうるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列のＮ一末端の１部を所望ポリペプチドのＮ一末端の１部をコードする縮退した一連のＤＮＡ配列で置換し、この置換は分析可能性に実質的に影響を与えず；得られた所望発現制御配列に作用結合した一連のハイプリッドＤＮＡ配列を宿主にて発現させ；分析しうるポリペプチドの最適産生を可能にする特定ハイプリッドＤＮＡ配列を選択し；かつ所望蛋白をコードするＤＮＡ配列のＮ一末端部分を、所望ポリペプチドのＮ一末端部分をコードする前記選択ハイプリッドＤＮＡ配列のＮ一末端の部分で置換することからなる工程によって産生される、所望ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列。
８．イソタフェロン，インタロイキンおよびその他のリンホキン，血液因子，酵素，ウイルス抗原，ＳＭＣ，成長ホルモンおよびその他のホルモン、並びに動物およびヒト起源の他のポリペプチドよりなる群から選択されるポリペプチドをコードすることを特徴とする請求の範囲第７項記載ののＤＮＡ配列。
９．ＳＭＣ様ポリペプチドをコードし、かつｐＬＣ２４ｍｕＳＭＣ１〜ｐＬＣ２４ｍｕＳＭＣ１０のＤＮＡ挿入物から選択されることを特徴とする請求の範囲第８項記載のＤＮＡ配列。
１０．発現に際しｐＬＣ２４ｍｕＳＭＣ１〜ｐＬＣ２４ｍｕＳＭＣ１０のＤＮＡ挿入物よりなる群から選択されるＤＮＡ配列によってコードされたＳＭＣ様ポリペプチド。
１１．請求の範囲第７項記載のＤＮＡ配列を特徴とする組換ＤＮＡ分子。
１２．ＤＮＡ配列が組換ＤＮＡ分子における発現制御配列に作用結合されている請求の範囲第１１項記載の組換ＤＮＡ分子。
１３．発現制御配列が１ａｃ系，ｔｒｐ系，ｔａｃ系，ｔｒｃ系，ファージλの主オペレータおよびプロモータ領域，ｆｄコート蛋白の制御領域，ＳＶ４０の早期および後期プロモータ，ポリオーマ，アデノウイルスおよび猿ウイルスから誘導されたプロモータ、並びに酵母糖分解酵素，α−接合因子および酸ホスファターゼのプロモータよりなる群から選択される請求の範囲第１２項記載の組換ＤＮＡ分子。
１４．ｐＬＣ２４ｍｕＳＭＣ１〜ｐＬＣ２４ｍｕＳＭＣ１０よりなる群から選択される請求の範囲第１３項記載の組換ＤＮＡ分子。
１５．請求の範囲第１１項記載の少なくとも１種の組換ＤＮＡ分子により形質転換された宿主。
１６．請求の範囲第１１項記載の組換ＤＮＡ分子により形質転換された宿主を培養することを特徴とする所望ポリペプチドの産生方法。
１７．請求の範囲第１４項記載の組換ＤＮＡ分子により形質転換された宿主を培養することを特徴とするＳＭＣ様ポリペプチドの産生方法。
１８．宿主をイー・コリ，シュードモナス，バチルス，ストレブトミセス，酵母，その他の真菌類の菌株，動物細胞および植物細胞よりなる群から選択することを特徴とする請求の範囲第１７項記載の方法。
１９．形質転換された宿主がイー・コリＨＢ１０１（ｐＣＩ８５７）（ｐＬＣ２４ｍｕＳＭＣ８）であることを特徴とする請求の範囲第１８項記載の方法。
２０．請求の範囲第１７項記載の方法により産生されるＳＭＣ様ポリペプチド。
２１．組織成長刺戟剤として有効量の請求の範囲第２０項記載のＳＭＣ様ポリペプチドと、医薬上許容しうるキャリヤとからなることを特徴とする医薬組成物。
２２．哺乳動物を請求の範囲第２１項記載の医薬組成物で処置することを特徴とする、哺乳動物における組織成長の刺戟方法。
２３．組織成長を刺戟するための、医薬上有効量の請求の範囲第２０項記載のＳＭＣ様ポリペプチドの使用。