JPS63105681A - Ｄｎａ塩基配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、新規なりＮＡ塩基配列、より詳しくは各種細
胞内で生産されるポリペプチドを細胞外に成熟ポリペプ
チドとして分泌させる働きを行なうシグナルペプチドの
新しい誘導体をコードするＤＮＡ塩基配列、殊にｂｌａ
シグナルペプチドの＝６位のアミノ酸残基を他の特定の
アミノ酸残基に置換させた新規なシグナルペプチド誘導
体を］−ドするＤＮＡ塩基配列に関している。

また本発明は、上記シグナルペプチド誘導体自体並びに
該誘導体のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ塩基配列を
含むベクター、特に上記ＤＮＡ塩基配列と共に仙の有用
ポリペプチドをコードする外来ＤＮＡ塩基配列を含み該
有用ポリペプチド発現能を有するベクター、該ベクター
を保有する微生物及び該微生物の培養による有用ポリペ
プチドの製造技術にも関している。

従来の技術 大腸菌等の原核生物においても、高等動植物等の真核生
物においても、細胞内で産生されたポリペプチド乃至蛋
白が細胞外に分泌されまた膜蛋白として膜に埋め込まれ
るためには、シグナル配列と総称される疎水性に富んだ
特異なアミノ酸配列（シグナルペプチド）の存在するこ
とが必須で必り、該シグナルペプチドが上記作用の重要
な役割を担っている（Ｗ、　Ｔ、　Ｗｉｃｋｎｅｒ　ａ
ｎｄ　　Ｈ３Ｐ。

１−ｏｄｉｓｈ、　（’ｌ　９８５）　、　５ｃｉｅｎ
ｃｅ、　　２３０゜４００−４０７））。

上記細胞内で産生され、細胞外に分泌されるポリペプチ
ドにおっては、通常極めて疎水性の高いアミノ酸残基か
らなる領域を含む士数個乃至数十個のアミノ酸配列（シ
グナルペプチド）が、上記ポリペプチドのＮ末端に付加
された前駆体として、細胞質内で合成されるが、分泌さ
れるポリペプチドにはこのシグナルペプチドは見出せな
いＣＭ。

Ｆ、　Ｅ、　Ｗａｔｓｏｎ、　（１９８４）　、　Ｎｕ
ｃｌ、Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、、”１２．５１４５−５１６
４）。

しかして、一般に分泌とは、ポリペプチドがその産生細
胞により、能動的に機能蛋白として、細胞外に放出され
る現象を云うカベより広義にはグラム陽性細菌における
ポリペプチドのペリプラズムへの局在化等をも含んでい
る。上記シグナルペプチドの機能は、この分泌過程の最
初の且つ最も重要な段階に係わることである。即ち、細
胞質において合成途上の、もしくは合成後のポリペブチ
ド前駆体を、リン脂質の二重膜により隔てられた別の部
分に移行させることがシグナルペプチドの最大の機能で
必る。上記機能は、細胞の種類、構造等により多様であ
り、例えば枯草菌等のグラム陽性細菌では、ポリペプチ
ドはシグナルペプチドの作用により、直接細胞外に分泌
される。大腸菌等のグラム陽性細菌では、ポリペプチド
はシグナルペプチドの作用によって、細胞の内膜を通過
して内膜と外膜とに囲まれたペリプラズム空間に移行し
、しかる後に、該ポリペプチドの性質に応じて、ペリプ
ラズム空間に留まって機能を発揮する（酵素類等）か、
膜蛋白として機能するか、更に別のメカニズムにより外
膜を経て細胞外に分泌されるかのいずれかの局在化が起
こる。また真核細胞では、一般に分泌ポリペプチドは、
シグナルペプチドの作用により粗面小胞体内に移行し、
ここからゴルジ体を経て細胞外に分泌され、その過程で
糖鎖付加等の修飾を受けると考えられている（Ｗ、王、
　Ｗｉｃｋｎｅｒ　ａｎｄ　　Ｈ，Ｆ、　Ｌｏｄｉｓｈ
、前記文献及び田村塾造編「細胞表層」、（１９８６）
、学会出版センター参照〕。

近年、上記シグナルペプチドの作用を利用して、大腸菌
、枯草菌等のバクテリアより、遺伝子工学的手法により
、有用ポリペプチドを量産しようとする試みが盛んに行
なわれつつおり、本発明者らも例えば大腸菌β−ラクタ
マーゼ（ｂｌａ　）のシグナルペプチド（Ｊ、　Ｇ、　
５ｕｔｃｌｉｆｆｅ、　　（１９７８）Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、　７５゜３７３７
−３７４．１）を利用して、β−ウロガストロン（ヒト
上皮細胞生長因子）を、不用なアミノ酸配列を一切含ま
ない天然型ポリペプチド（成熟ポリペプチド）として、
大腸菌ペリプラズムに分泌生産させる技術を先に確立し
た〔特開昭６１−１４．９０８９号公報〕。またこれに
引続いて同様にして有用ポリペプチドを枯草菌の菌体外
及び大腸菌の菌体外に、それぞれ分泌生産させる技術を
確立し、これらの技術に係わる発明を特許出願した〔特
願昭６Ｃ）−２２５３９３号及び特願昭６１−２０１３
２号〕。

上記各出願に係わる発明に利用されるシグナルペプチド
及びそのＤＮＡ塩基配列は、いずれも自然界に見出され
るものをそのまま利用したものであった。現在までかか
るシグナルペプチドに改良を加えようとする研究は殆ん
ど行なわれておらず、わずかに報告されたものもシグナ
ルペプチドのアミノ酸配列の一部を変化させれば、その
分泌機能が著しく損われるか又は変化しないという結果
を示したものに過ぎなかったＣＧ、　Ｄ、　Ｄｕｆｆａ
ｕｄｅｔ　ａｌ、、　（１９８５）　、　Ｃｕｒｒｅｎ
ｔ　　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎＭｅｍｂｒａｎｅｓ　ａｎｄ
　　Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ　、’２４．６５−１０４〕。

このようにシグナルペプチドは、その遺伝子工学手法へ
の応用による有用性が明確であるにもかかわらず、その
著しい多様性のために改良研究が殆んどなされず、遅れ
ている現状にある。事実、上記シグナルペプチドは、各
微生物毎に、また分泌を誘導される各ポリペプチド毎に
、それぞれ異なってあり、之等はただ疎水性アミノ酸残
基に富む領域を含むという点のみが、はぼ共通している
のみである。尚、シグナルペプチドについて荷電アミノ
酸残基の存在、アミノ酸残基の側鎖の大きざ等の共通性
も報告されているが、少ながらず例外が存在している（
Ｇ、　Ｄ、　Ｄｕｆｆａｕｄら、前記文献参照〕。

以上のことより、天然に存在するシグナルペプチドは、
それに続くポリペプチドの分泌にとり都合のよいように
進化の過程で変異して淘汰された結果、それぞれに固有
のものとして現存すると考えられ、かかるシグナルペプ
チドの一つを用いて、それが本来分泌させるものとは異
なる別の外来ポリペプチドを分泌させるように遺伝子組
換えを行なえば、この組合せは、最適な組合せではない
可−９＝ 能性が非常に強い。

発明が解決しようとする問題点 以上の現状を踏まえ、本発明者らは、本発明者らが先に
確立した前記発明の残された課題であるシグナルペプチ
ドの改良研究を目的として鋭意研究を重ねた。その過程
において、特にｂｌａシグナルペプチドの一６位アミノ
残基がＣｙｓ残基である点に着目し、これをβ−ウロガ
ストロンのようにＣｙＳ残基を多く含むポリペプチドと
連結させれば、上記−６位のＣｙＳ残基とβ−ウロガス
トロンのＣｙＳ残基のうちの一つとの間でジスルフィド
結合（Ｓ−８結合）が形成されるおそれがあり、このＳ
−８結合の形成を回避するようにシグナルペプチドのア
ミノ酸残基を改変すれば、目的ポリペプチドの分泌量を
更に一層向上できると考えた。

本発明の目的は、上記ｂｌａシグナルペプチドのアミノ
酸配列を改変された新しいシグナルペプチド誘導体及び
そのアミノ酸配列をコードし、遺伝子組換え技術への応
用によって、外来ポリペプチドの分泌発現を行ない得、
しかもその分泌発現量の増大を計り得る新しいＤＮＡ塩
基配列を提供することにある。

また、本発明の目的は、上記改変されたシグナルペプチ
ド誘導体のアミノ酸配列を］−卜するＤＮＡ塩基配列を
含み、有用ポリペプチドの分泌発現のために利用できる
ベクターを提供することにある。

更に、本発明の他の目的は、上記ベクター上に］−ドさ
れているシグナルペプチド誘導体のＤＮＡ塩基配列を利
用して、有用ポリペプチドを分泌生産させ得る新しい発
現ベクターを提供することにある。

加えて、本発明は上記発現ベクターにより形質転換され
た微生物、該微生物の培養による有用ポリペプチドの製
造技術の確立をもその目的としている。

問題点を解決するための手段 本発明によれば、一般式 ％式％ （式中ＸはＣｙｓ以外の中性親水性アミノ酸残基を示す
。〕 で表されるポリペプチドをコードする［）ＮＡ塩基配列
が提供される。

本明細書において、アミノ酸、核酸塩基、その他に関す
る略号は、ＩＵＰＡＣ，ＩｔＪＢの規定乃至当該分野に
お（プる慣用記号に従うものとし、その例を次に挙げる
。

Ａｌａ・・・アラニン　　　　　Ａｒｃ＋・・・アルギ
ニンＡＳｎ・・・アスパラギン　　　ＣｙＳ・・・シス
ティンＧｌｎ・・・グリタミン　　　　Ｈｔｓ・・・ヒ
スチジン１１ｅ・・・イソロイシン　　　１−ｅｕ・・
・ロイシンＭｅｔ・・・メチオニン　　　　ｐｒｏ・・
・プロリンＰｈｅ・・・フェニルアラニン　３ｅｒ・・
・セリンｌｈｒ・・・スレオニン　　　　Ｖａｔ・・・
バリンＡ・・・アデニン　　　　　　Ｔ・・・チミンＧ
・・・グアニン　　　　　　Ｃ・・・シトシン上記一般
式（１）中、Ｘで示される中性親水性アミノ酸残基とし
ては、Ｔｈｒ、　Ｓｅｒ、　ＴＶｒ、　Ａｓｎ及び（３
Ｉｎ、特に好ましくはＴｈｒ及びＳｅｐを例示できる。

また、上記シグナルペプチド誘導体（１）におけるアミ
ノ酸番号は、この種ポリペプチドに慣用されるように、
そのカルボキシ末端（Ａｌａ）を「−１」とし、アミノ
末端（Ｍ　ｅｔ　）をｒ−２３Ｊとして示すものである
。これは−１位のＡｌａの直後で、シグナルペプチド−
被分泌ポリペプチドの連結がシグナルペプチダーゼによ
る切断を受けて切り離されることを示している。

上記一般式（１）で表されるシグナルペプチド誘導体は
、大腸菌目ａシグナルペプチドの誘導体であって、該大
腸菌目ａシグナルペプチドの一６位のｃｙｓ残基が伯の
中性親水性アミノ酸残基、好ましくはＴｈｒ又は３ｅｒ
で置換されていることを特徴とする。該誘導体は、より
詳しくは以下の各ポリペプチドを包含する。

〈１〉ＸがＴｈｒであるポリペプチド （以下これを「（Ｔｈｒ−６）−ｂｌａシグナルペプチ
ドという）及び 〈２〉Ｘが３ｅｒでおるポリペプチド （以下これをｒ　（Ｓｅｒ−６）−ｂｌａシグナルペプ
チドという） 本発明の上記シグナルペプチド誘導体のアミノ酸配列を
コードするＤＮＡ塩基配列は、該アミノ酸配列を構成す
る各アミノ酸に対応する１〜６通りのコドンの中から任
意に選択して組合せ得るものであり、例えば用いられる
宿主に利用される頻度の高いコドンが優先的に選択され
る。また、該ＤＮＡ塩基配列は、その配列中又は該配列
とこれに隣接するＤＮＡ塩基配列との間で、転写終結信
号様の配列が生じないように選択される。

特に好ましい本発明ＤＮＡ塩基配列の具体例としては、
下記式（２）及び（３）で表されるものを例示できる。

ｏ　（Ｔｈｒ−６）　−ｂｌａシグナルペプチドのＤＮ
Ａ塩基配列 ５’　ＡＴＧＡＧＴＡＴＴＣＡＡＣＡＴＴＴＣＣＧＴＧ
ＴＣＧＣＣＣＴＴＡＴＴＣＣＣＴＴＴ丁ＴＴＧＣＧＧＣ
ＡＴＴＣＡＣＴＣＴＧＣＣＧＧＴＴＴＴＣＧＣＧ　　３
’　　　　　　（２）ｏ　［５ｅｒ−６）−ｂ！ａシグ
ナルペプチドのＤＮＡ塩基配列 ５’　ＡＴＧＡＧＴＡＴＴＣＡＡＣＡＴＴＴＣＣＧ丁Ｇ
ＴＣＧＣＣＣＴＴＡＴＴＣＣＣＴＴＴＴＴＴＧＣＧＧＣ
ＡＴＴＣ丁ＣＴＣＴＧＣＣＧＧＴＴＴＴＣＧＣＧ　　３
’　　　　　　（３）本発明のＤＮＡ塩基配列は、上記
シグナルペプチド誘導体（１）のアミノ酸配列をコード
するものであって、該誘導体のアミノ酸配列に対応して
、天然のそれとは異なるＤＮＡ塩基配列を有しているで
いるにもかかわらず、これに、被分泌ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ塩基配列を連結させて適当なベクターに
組込み、該ベクターを適当な宿主細胞に保持させて、該
細胞を培養する時には、シグナルペプチドの機能を発現
し、被分泌ポリペプチドを分泌させることができる。即
ち、本発明のＤＮＡ塩基配列は、これを遺伝子組換え技
術に利用することにより、有用ポリペプチドを著量分泌
生産させ得る。この有用ポリペプチドの分泌生産量は、
天然のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列を
利用する場合に比しても顕著に増大される。

従って、本発明は、かかる有用ポリペプチドの製造技術
、これに利用する有用ポリペプチド発現ベクター及び該
ベクターを組込んで形質転換した微生物をも提供するも
のである。

本発明のＤＮＡ塩基配列は、これを利用して遺伝子組換
え技術に従い有用ポリペプチドを分泌生産させるために
は、該配列に、好ましくはその両端に、制限酵素認識配
列が付加されているのが望ましい。即ち、本発明ＤＮＡ
塩基配列は、これに有用ポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ塩基配列を連結させて微生物細胞内でその発現を行な
わせるのに有用であり、これは上記有用ポリペプチドの
ＤＮＡ塩基配列との連結を容易にするために、制限酵素
認識配列を有するのが望ましい。また上記ＤＮＡ塩基配
列の発現には、該配列の上流にプロモーター、リボゾー
ム結合部位（ＲＢＳ）等の各種の調節因子を結合させる
必要があり、之等との結合を容易にするためにも、上記
制限酵素認識前列の存在は好適である。

かかる制限酵素認識配列は、本発明ＤＮＡ塩基配列と結
合される有用ポリペプチド（これをコードするＤＮＡ塩
基配列）や各種調節因子の種類、その配列を認識する酵
素の種類等に応じて適宜選択でき、特に限定されるもの
ではない。この制限酵素認識配列を更に付加した本発明
ＤＮＡ塩基配列の具体例としては、例えば次のものを例
示できる。

０制限酵素認識前列を付加した（Ｔｈｒ’）　−ｂ！ａ
シグナルペプチドのＤＮＡ塩基配列 ５’　ＧＴＣＧＡＣＡＡＴＧＡＧＴＡＴ丁ＣＡＡＣ−３
訂ｒ ＡＴＴＴＣＣＧＴＧＴＣＧＣＣＣＴＴＡＴＴＣＣＣＴＴ
ＴＴＴＴＧＣＧＧＣＡＴＴＣＡＣＯ制限酵素認識配列を
付加した（Ｓｅｒ−６）　−ｂｌａシグナルペプチドの
ＤＮＡ塩基配列 Ａ丁ＴＴＣＣＧＴＧＴＣＧＣＣＣＴＴＡＴＴＣＣＣＴＴ
ＴＴＴＴＧＣＧＧＣＡＴＴＣＴＣ上記式（２′　）及び
（３′）に示した具体例では、制限酵素認識配列として
３ａｌＩ及びＮｒｕ■の認識配列を付加されているが、
本発明のＤＮＡ塩基配列に付加される制限酵素認識配列
は、之等に限定されるものではなく、他の公知の各種制
限酵素の認識配列であることができる。また該ＤＮＡ塩
基配列は、その内部にも制限酵素認識配列を含有するも
のであってもよい。

本発明ＤＮＡ塩基配列は、例えば市販の全自動ＤＮＡ合
成装置等を用いて、上記配列に従い容易に全合成するこ
とができる。また之等は、すでに確立された公知のプラ
スミド、例えばプラスミド１）ＢＲ３２２（Ｈ，Ｗ、　
ＢＯＶｅｒ　ａｎｄ　　Ｄ。

Ｒｏｕｌｌａｎｄ−［）ｕｓｓｏｉｘ、　　（１９６９
）　、　Ｊ、　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、、土１，４５９−４７２）、プラスミド１）
ＧＨ５４及びｐＧＨ５５（特開昭６１−１４９０８９号
公報〕等に含まれる天然型のｂｌａシグナルペプチドを
コードするＤＮＡ塩基配列を利用して、之等をインビト
ロ点突然変異法（Ｍ。

Ｊ、　Ｚｏｌｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍ、　Ｓｍ１ｔｈ、　　
（１９８３）　。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、１００．４６８
−５００）等の通常の方法により、その一部の塩基配列
を改変させて得ることもできる。

かくして得られる本発明ＤＮＡ塩基配列は、これを適当
な起源ベクターに組込むことにより、遺伝子工学手法に
より、有用ポリペプチドを分泌発現させるための本発明
ベクターとすることができる。該ＤＮＡ塩基配列を保持
させる起源ベクターとしては、特に制限はなく、従来よ
り外来遺伝子のクローニングに用いられている各種のも
の、例えばプラスミド、バクテリオファージ、ウィルス
ＤＮＡ、コスミド等をいずれも利用できる。特に好適な
上記起源ベクターの具体例としてはｐＢＲ３２２を例示
できる。

該起源ベクターへの本発明ＤＮＡ塩基配列の導入操作は
、従来よりこの種外来遺伝子をベクターに組込む際に用
いられている通常の操作、例えば制限酵素を利用したＤ
ＮＡ断片の切断、単離方法、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等を用
いたＤＮＡ断片の連結乃至結合方法等に従うことができ
る。

かくして得られる本発明ベクターの具体例としては、後
記実施例に詳述するプラスミドＩ）ＧＨ６３及びｐＧＨ
６８を例示できる。

プラスミドｐＧＨ６３は、前記式（２）に示した（Ｔｈ
ｒ’）−ｂｌａシグナルペプチドをコードするＤＮＡ塩
基配列を含むプラスミドであり、これは、前記式（２′
　〉のＤＮＡ塩基配列を全合成した後、得られるＤＮＡ
断片をプラスミド１）ＢＲ３２２の５ａｌＩ、Ｎｒｕ■
サイト間に挿入することにより得られる。該プラスミド
ｐＧＨ６３は、大きさ約４．１キロベース（ｋｂ）であ
り、アンピシリン耐性遺伝子を有している。このプラス
ミドｐＧＨ６３は、これを大腸菌Ｈ８１０１株に保有さ
せて、該株を通商産業省工業技術院微生物工業技術研究
所（以下「微工研」という）に、ｒＨＢｌｏｌ　〔ｐＧ
Ｈ’６３）Ｊなる表示で、微工研条奇第１１８５号（Ｆ
ＥＲＭ　　ＢＰ−１１８５＞として寄託されている。

また、プラスミドｐＧＨ６８は、前記式（３）に示した
（Ｓｅｐ−６）−ｂｌａシグナルペプチドをコードする
ＤＮＡ塩基配列を含むプラスミドであり、これは、上記
ｐＧＨ６３と同様に前記式（３′）のＤＮＡ塩基配列を
全合成後、プラスミドｐＢＲ３２２に挿入して得られた
ものであり、大きざ約４．１ｋｂで、アンピシリン耐性
遺伝子を有している。このプラスミドＤＧＨ６８は、こ
れを大腸菌Ｈ８１０１株に保有させて、該株を微工研に
、ｒＨＢｌＱｌ　（ｐＧＨ６８）Ｊなる表示で、微工研
条奇第１１８６号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１１８６＞とし
て寄託されている。

本発明のシグナルペプチド誘導体をコードするＤＮＡ塩
基配列を保有するベクターは、これを利用して目的とす
る有用ポリペプチド分泌発現ベクターを構築することが
できる。即ち、該ベクターの保有するシグナルペプチド
誘導体をコードするＤＮＡ塩基配列の下流に、有用ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列（終止コドンを含
む）を挿入して両□者を連結させ、上記融合蛋白をコー
ドするＤＮＡ塩基配列の上流及び下流に遺伝子の転写、
翻訳等を調節するのに必要な各種の因子（ＤＮＡ塩基配
列）を連結させることにより、目的とする有用ポリペプ
チド分泌発現ベクターを収得することができる。

上記調節因子としては、得られる分泌発現ベクターを組
込む宿主細胞の種類等に応じて適宜選択され、特に限定
されるものではないが、例えば宿主細胞として大腸菌を
用いる場合を例にとれば、上記融合蛋白をコードするＤ
ＮＡ塩基配列の上流に存在させるべき因子としては、大
腸菌ラクトースオペロン、トリプトファンオペロン等の
プロモーターやβ−ガラクトシダーゼのＳＤ配列等のＲ
ＢＳ等を例示できる。またその下流に存在させるべき因
子としては通常の転写終結信号、ポリＡ鎖付加信号等を
例示できる。之等の調節因子は、前記起源ベクター（例
えばｐＢＲ３２２）に含まれているものをそのまま使用
することもでき、また之等の各調節因子を含むＤＮＡよ
り別途に常法に従い取り出したものを通常の方法に従い
ベクターに導入してもよい。

また上記有用ポリペプチド及びこれをコードするＤＮＡ
塩基配列としては、公知の任意のものをいずれも使用す
ることができる。上記ポリペプチドとしては、例えば上
皮細胞成長因子、ソマトスタチン、インシュリン、ＧＩ
Ｐ、Ｒ−ＭＳＡ、サイモシンβ４、成長ホルモン、成長
ホルモン放出因子等のホルモン類及び成長因子類、イン
ターフェロン、インターロイキン１、インターロイキン
２、腫瘍壊死因子等のリンフ才力イン類乃至免疫調節物
質等、血清アルブミン、プラスミノーゲンアクチベータ
ー、アポリホプフロティン等の血液構成物質、Ｂ型肝炎
ウィルス表面抗原等のワクヂン用抗原蛋白質等を例示で
きる。之等の各種ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基
配列は、それ自体物質として入手できるか、又はそれら
を含む細胞等から常法に従い抽出単離することができ、
更に之等のアミノ酸配列に従って化学合成することもで
きる。

上記有用ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列と本
発明シグナルペプチド誘導体をコードするＤＮＡ塩基配
列との連結操作、ベクターへの各種調節因子の導入操作
等は、この種遺伝子組換え操作に慣用される方法、例え
ば制限酵素を用いたＤＮＡの切断操作、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ等を用いたＤＮＡの結合操作等に従うことができる
。

本発明のシグナルペプチド誘導体と有用ポリペプチドと
の融合蛋白をコードするＤＮＡ塩基配列及びその発現の
ための各種調節因子を保有する有用ポリペプチド分泌発
現ベクターの好ましい具体例としては、後記実施例に詳
）ホするプラスミドｐＵＧ２１４及び１）ＵＧ２２９を
例示できる。

プラスミドＩ）ＵＧ２１４は、前記式（２′）で示され
、前記プラスミドｐＧＨ６３に含まれる〔丁ｈｒ−６）
−ｂｌａシグナルペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列
とβ−ウロガスｉ〜ロンをコードするＤＮＡ塩基配列と
が直接連結されてなるＤＮＡ塩基配列を含み、更にその
上流にｔａｃプロモーター、Ｉａｃオペレーター及びβ
−ガラクトシダーゼのＲＢＳが連結されてあり、またそ
の下流にはβ−ラクタマーゼの転写終結信号が含まれて
いる。

該プラスミドｐＵＧ２１４は、大きざ約３，９ｋｂであ
り、上記ＤＮＡ塩基配列の外にテトラサイクリン耐性遺
伝子を有している。このプラスミドｐＬＪＧ２１４は、
これを大腸菌ＪＭ１０７株に保有させた形態で微工研に
寄託されており、該株の表示は、ｒＪＭ１０７　（ｐＵ
Ｇ２１４）Ｊであり、寄託番号は微工研条奇第１１８７
号（ＦＥＲＭＢＰ−１１８７＞である。

また、プラスミドｐＵＧ２２９は、上記ｐＵＧ２１４と
同様のプラスミドであり、ただ（Ｔｈｒ−６）−ｂｌａ
シグナルペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列の代りに
（Ｓｅｒ’）−ｂｌａシグナルペプチドをコードするＤ
ＮＡ塩基配列を含んでいる点で異なっている。該ｐＵＧ
２２９は、ｐＬＪＧ２１４と同様に大きさ約３．９ｋｂ
であり、テトラサイクリン耐性遺伝子を含む点も同一で
ある。このプラスミドＩ）ＵＧ２２９は、これを大腸菌
ＪＭ１０７株に保有させた形態で微工研に寄託されてお
り、該株の表示は、ｒＪＭ１０７　（ＤＬＪＧ２１４）
Ｊで市り、寄託番号は微工研条奇第１１８８号（ＦＥＲ
Ｍ　　ＢＰ−１１８８）である。

上記例示の有用ポリペプチド分泌発現ベクターは、共に
有用ポリペプチドとしてβ−ウロガストロンを発現する
ものであり、かかるβ−ウロガストロン発現ベクターと
して、本発明者らは先にプラスミドｐＵＧ丁１５０を確
立している〔特願昭６１−３１４１５号〕。該ｐＵＧＴ
１５０は、大きさ約３．９ｋｂであり、ｔａｃプロモー
ター、ｌａｃオペレーター、β−ガラクトシダーゼのＲ
ＢＳ。

ｂｌａシグナルペプチドのＤＮＡ塩基配列とβ−ウロガ
ストロンのＤＮＡ塩基配列、その停止コドン及び転写終
結信号をこの順序で正確に連結されたＤＮＡ塩基配列を
保有している。従って、本発明の上記ＤＵＧ２１４及び
ｐＵＧ２２９の創製に当　２８　一 つては、このプラスミドｐＵＧＴ１５０を利用するのが
より簡単であり且つ有利である。即ち、該プラスミドｐ
ＵＧＴ１５０の有するｂｌａシグナルペプチドをコード
するＤＮＡ塩基配列部分のみを、前述したこの種遺伝子
組換え操作に慣用される方法に従い、本発明のシグナル
ペプチド誘導体をコードするＤＮＡ塩基配列、例えば前
記ｐＬＪＧ６３又はｐＬＪＧ６８の保有するシグナルペ
プチド誘導体をコードするＤＮＡ塩基配列に変換させる
ことにより、非常に容易に目的とする有用ポリペプチド
分泌発現ベクターを構築できる。しかして上記プラスミ
ドｐＵＧＴ１５０は、これを大腸菌ＪＭ１０３に保有さ
せ、該株をｒＪＭ１０３　（ｐＵＧＴ１５０）Ｊなる表
示で、微工研に微工研条奇第９７４号（ＦＥＲＭ　　Ｂ
Ｐ−９７４＞として寄託されている。

上記のごとくして得られる本発明の有用ポリペプチド分
泌発現ベクターは、これを適当な宿主細−２９＝ 胞に導入して該細胞を形質転換させ、得られる形質転換
株を培養することにより、目的とする有用ポリペプチド
を成熟ポリペプチドとして分泌発現させることができる
。

上記ベクターの宿主細胞への導入は、通常の方法、例え
ば前述した本発明者らの出願に係わる特開昭６１−１４
９０８９号公報に記載の方法に準じることができる。

本発明者らの研究によれば、本発明シグナルペプチド誘
導体の起源である旧ａシグナルペプチドは、本来大腸菌
由来のものであるが、枯草菌においても機能することが
確認されている［前記特願昭６０−２２５’３９３号参
照）。またこれは、酵母や動物細胞においても機能する
ことが報告されている（ＲｏＲｏｇｇｅｎｋａｍｐ　ｅ
ｔ　ａｔ、　（１９８１）　。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、　
７８゜４４６６−４．４７０及びＭ、　Ｍｕｌ！ｅｒ　
ｅｔ　ａｔ。

（１９８２）、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５７゜１
１８６０−１１８６３参照〕。本発明シグナルペプチド
誘導体もまた、上記起源とするｂｌａシグナルペプチド
と同様に、各種の宿主細胞内で機能するものであり、従
って、本発明の上記有用ポリペプチド分泌発現ベクター
を導入する宿主細胞は、大腸菌等のダラム陰性細菌に限
らず、枯草菌等のグラム陽性細菌、放線菌、酵母、動物
細胞等のいずれでもよい。

上記本発明分泌発現ベクターの導入により形質転換され
た細胞の培養は、通常の細胞培養用培地を用いて実施さ
れる。該培地としては、例えばＬ培地、Ｅ培地、Ｍ９培
地、Ｍ６３培地等を例示できる。また之等の培地には、
通常知られている各種の炭素源、窒素源、無機塩、ビタ
ミン類、天然抽出物、生理活性物質等を添加することも
できる。

かかる培地を利用した形質転換株の培養は、該株の生育
に適したｐＨ，温度、通気、撹拌等の条件を採用した各
種方法に従うことができる。例えば大腸菌の場合は、ｐ
Ｈ約５〜８、好ましくは約７付近で、約２０〜４３°Ｃ
で、通気撹拌条件下に培養するのがよい。上記培養によ
り、目的とする有用ポリペプチドが分泌産生される。

上記有用ポリペプチドは、常法に従いこれを分離精製す
ることができる。この分離精製操作としては、培養上清
、浸透圧ショック法により調製したペリプラズム画分等
から、グルか過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換
クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等を
適宜組合せた方法により実施できる。特に本発明によれ
ば、目的とするポリペプチドは、成熟ポリペプチドとし
て分泌されるため、その分離、精製が比較的容易である
利点がある。かくして、本発明によれば、遺伝子組換え
技術により、有用ポリペプチド、殊にβ−ウロガストロ
ンを製造できる。

丈−厘−Ｌ 以下、本発明を更に詳しく説明するため、実施例を挙げ
る。尚、各側において用いられる各方法及び操作は、特
に明記しない限り、以下の通り行なわれたものとする。

１、制限酵素によるＤＮＡの切断操作 ＤＮＡは、下記第１表に示した各緩衝液中にて、３７°
Ｃの水浴中で３時間静置して反応させた。各緩衝液は、
ＤＮＡ１μｇに対して１０μＱ以上使用し、また制限酵
素は、ＤＮＡ１μｇに対して１ユニツト使用した。

第１表 組　　成　　　高塩濃度　５ａｌＩ　　　ＮｒｕＩ（ｍ
Ｍ＞　　　　緩衝液　　緩衝液　　緩衝液塩化ナトリウ
ム　　１００　　１５０　　　５０塩化カリウム　　　
　　　　　　　　　　　５０トリス塩酸 （ｐＨ７，５）　　　　５０　　　　６　　　５０塩化
マグネシウム　　１０　　　　６　　　１０ジチオスレ
イトール　　１　　　１　　　１２、フェノール抽出法 酵素反応の終了後、酵素を失活させ反応を停止させるた
めにこの抽出法を行なった。即ち、反応液に、その液量
の半量となるＴＥ飽和フェノール（１ｍＭ　　ＥＤＴＡ
を含む１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８，０＞緩衝液をフェ
ノールに飽和させたもの）を加えて充分混和した後、同
じく半量のクロロホルムを加えて更に混和し、次いで遠
心分離してＤＮＡの含まれる緩衝液層を取り、更に０．
１倍量の３ＭＷ￥酸ナトツナトリウム緩衝液５．０）と
２倍量の冷エタノールとを加えて混和して、−２０’Ｃ
で１時間以上放置してＤＮＡを沈澱として回収すること
によりフェノールを完全に除去した。

３、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡ断片の結合（環状
化）操作 ６６ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７，５＞、６．６ｍＭ塩化マ
グネシウム、１０ｍＭジチオスレイト−ル及び１ｍＭＡ
丁Ｐに０．０１％の牛血清アルブミンを添加した水溶液
中で、ＤＮＡ断片と、その１μＱ当り３ユニツトとなる
量の丁４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造■製）とを、１２°Ｃ
で５時間以上反応させることによりＤＮＡを結合（環状
化）させた。

４、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによるＤＮＡ５′端
のリン酸化 １〜１０μｇのＤＮＡを、１０ｍＭ塩化マグネシウム、
５ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰを含む５０ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９，５＞５０μＱに溶かし、
これにＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ５ユニットを加え
、３７°Ｃで３０分間反応させ、次いでフェノール抽出
により酵素を失活させた。

５、形質転換方法 宿主細胞としては、大腸菌に１２株由来のＨ８１０１株
又はＪＭｌ　０７株を用いた。

宿主細胞株を、ＬＢ培地（１％バタトトリプトン、０．
５％バクトイ−ストエキス、０．５％塩化ナトリウム）
で、３７°Ｃ下、６１０１ｍの吸光度が０．２５になる
まで増殖させた。この培養液４０＋ｎＱを遠心分離（６
０００回転／分Ｘ１０分）して菌体を回収し、次いで水
冷後、０．１Ｍ塩化マグネシウム２０ｍＱで洗浄し、続
いて氷冷した０、１Ｍ塩化カルシウム及び０．０５Ｍ塩
化マグネシウム溶液２０ｍ（２に懸濁させ、１時間氷冷
した。

遠心分離（６０００回転／分Ｘ１０分）後、菌体を氷冷
した０、１Ｍ塩化カルシウム及び０．０５Ｍ塩化マグネ
シウム溶液２鵬に再懸濁させ、この懸濁液０．２ｍＧに
、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させたＤＮＡ断片の
反応組成液０．０１ｍＧを加え、１時間氷冷した。次い
で４２．５°Ｃの水浴で９０秒間加温し、ＬＢ培地２．
８ｒｎＱを加え、これを３７°Ｃの水浴中で１時間静置
した。

かくして得られる形質転換株（反応組成液の溶液各０．
３＋ｎＱずつ）を、１．５％寒天を含むＬＢ培地にアン
ピシリン５０μｇ／ｍｏ又はテトラサイクリン２０μｇ
／ｎ＋Ｑを添加して調製した平板培地に拡げ、これを３
７°Ｃで一晩培養し、生育する大腸菌コロニーを分離し
た。

６、プラスミドの単離 プラスミドを保有する菌株を、アンピシリン５０１１０
／ｍＱ又はテトラサイクリン２０μＣＪ／ｍＱを添加し
たＬＢ培地５００ｍＱで、６１０ｎｍでの吸゛光度が約
０．６になるまで３７°Ｃで振盪培養した。

次いでクロラムフェニコール８０ｍｇを加え、３７℃で
１２〜１６時間振盪培養し、これを遠心分離（６０００
回転／分Ｘ１０分）して菌体を集め、０．８５％塩化ナ
トリウム水溶液で洗浄後、菌体を２０％蔗糖を含む５０
ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８，０）緩衝液２．５ｎ＋Ｑに懸
濁させ、１％リゾチームを含む０．２５Ｍトリス塩酸（
ｐＨ８，０）緩衝液０．５ｍ２を加え、１０分間氷冷し
た。更に０．２５Ｍ　　ＥＤＴＡ　（ｐｔ−４８，０）
１＋ｎＱを加え、１０分間氷冷した後、６ｍＭトリス塩
酸（ｐＨ８，０）　、６０ｍＭ　　ＥＤＴＡ及び　０．
１％トリトンＸ−１００の溶液４ｍＱを加え、超遠心（
２５０００回転／分Ｘ９０分）して上清を採取した。こ
の上清８．２ｎ＋Ｑに塩化セシウム９．○Ｑを加えて溶
かし、次いで１％エチジウムブロマイド溶液０．８ｍＧ
を加え、遠心分離（２０００回転／分Ｘ１０分）して浮
遊物を除き、溶液を超遠心（５００００回転／分×１５
時間）した。次いで紫外線照射により螢光を発するプラ
スミド部分を分離し、これを５Ｍ塩化ナトリウム溶液で
飽和したインプロパツールで５〜６回抽出しエチジウム
ブロマイドを除去した。最後に１ｍＭ　　ＥＤＴＡを含
む１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８，０＞緩衝液に対して透
析して塩化セシウムを除去した。

７、ＤＮＡ塩基配列の分析 ＤＮＡ塩基配列の分析は、メシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）
の方法〔Ｍ２Ｓ法、Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｌ：ｎｚｙｍｏ
ｌ、、１０１゜２０　（１９８３））に従い、以下のよ
うに行なった。即ち、まずＤＮＡ断片を制限酵素により
切出し、１％アガロースゲル電気泳動により分離した。

このＤＮＡ断片をＭ１３ｍｐ８ＲＦ（アマ−ジャム社製
）をベクターとしてクローニングし、得られる組換えフ
ァージＤＮＡをマンデル（Ｍａｎｄｅｌ　）とヒガ（Ｈ
ｉｇａ）の方法（Ｊ、　ＭＯ＋、　［３ｉｏ１．。

互ユ、１５４　（１９７０））により、大腸菌ＪＭ１０
７株へ形質導入した。この菌体懸濁液０．２ｍＱに、２
５ｍＭ戒のイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（
以下ｒＩＰ丁Ｇ」という）２５μＱ及び２０ｍＭｍＱの
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガ
ラクトシド４０μＱを加え、次に予め加熱溶解させ次い
で５０’Ｃで保温したＨ−トップアガー液（１％バクト
ドリプトン、０．８％塩化ナトリウム及び０．５％寒天
）３１Ｔｌ１２を加え、１．５％寒天を加えて固化させ
た２ＸＹＴ培地（１，６％バクトドリプトン、１％酵母
エキス及び０．５％塩化ナトリウム）の平板に重層し、
３７°Ｃで一晩培養した。ＤＮＡ断片の挿入された組換
えファージは無色のプラークを生じるのに対し、親株Ｍ
１３ｍｌ）８は青色のプラークを生じるので、目的の組
換えファージは容易に選別できる。

次に、甲−の無色プラークをパスツールピペットにて取
出し、これとＪＭ１０７株の培養液０．０１ｍＱとを２
ＸＹＴ培地１　ｍＱに加え、約５時間、３７°Ｃで振盪
培養して組換えファージを増殖させた。培養後、遠心に
て菌体を除き、上清に２０％ポリエチレングリコール６
０００の０．２ｍＱを混合し、室温で１５分以上静置し
た後、遠心にて沈澱するファージを集め、フェノール抽
出によって、ファージから一本鎖ＤＮＡを抽出し、これ
を鋳型−重鎖ＤＮＡとして用いた。

鋳型−重鎖ＤＮＡと、プライマー（宝酒造＠製、Ｍ１３
の１５塩基プライマー（５’　ＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴ
ＴＧＴＡ　３’　））との各々０．５ｐｍｏｌずつを混
合し、６０’Ｃで２０分間熱処理後、徐冷した。次にこ
の混合液にα３２Ｐ−ｄ　ＣＴＰ（アマジャム社製、４
００Ｃｉ　／ｍ　ｍｏｌ　）　２ｕＱとＤＮＡポリメラ
ーゼ■（クレノー、宝酒造銖製）２ユニツトとを加え、
充分に混合した後、その３．２μＱずつを、下記第２表
に示した４種のｄ　ＮＴＰ−ｄｄＮＴＰ混合液のそれぞ
れ２μＱを含む反応管に加え、室温で２０分間反応させ
た後、チェース反応液（ｄ　ＡＴＰ、ｄ　ＣＴＰ、ｄ　
ＧＴＰ及びｄＴＴ２Ｏ各１ｍＭ＞の１μＱをそれぞれに
加え、更に２０分間反応させた。ホルムアミド停止液（
９５％Ｖ／Ｖホルムアミド、０．１％キシレンシアツー
ル及び０．１％ブロムフェノールブルー）を６μＱずつ
加え、９５°Ｃで３分間加熱した後、急冷した。次にサ
ンプル２μΩずつを６％又は８％ポリアクリルアミドゲ
ルにより電気泳動（１８００Ｖ、３０ｍＡ、２〜３時間
）を行なった。泳動後、ゲルを濾紙（ワットマン３ＭＭ
）に移し、ゲル乾燥器にて乾燥し、オートラジオグラム
をとり、ＤＮＡ塩基配列を解読した。

第　　２　　表 （単位：μＱ） 但し第２表中、ｄｄＡはジデオキシアデノシンを、ｄｄ
Ｃはジデオキシシチジンを、ｄｄＧはジデオキシグアノ
シンを、またｄｄＴはジデオキシチミジンをそれぞれ示
す。

８、アガロースゲル電気泳動 シュライフとウエンシンク（Ｓｃｈｌｅｉｆ　ａｎｄＷ
　ｅｎｓ　ｒ　ｎｋ　）の手引書（”Ｐｒａｃｔｉｃａ
ｌ　　Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　
Ｂｉｏｌｏｇｙ”　　、　（１９８１）　。

Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−１／ｅｒｌａｇ社、１）ｌ）１１４
ｉ２５）に記載の方法に従って、アガロースゲル電気泳
動及び泳動後のゲルからのＤＮＡ断片の分離を行なった
。泳動用電源としては、アトー社製コンスターパワー５
Ｊ１０６５型を、泳動槽としては１２Ｘ１５Ｃｍのプラ
スチック製水槽（白金型極付）を、アガロースとしては
アガロース■（聞伝化学研究所製）を、また泳動用緩衝
液としては４０ｍＭトリス塩酸（５ｍＭ酢酸ナトリウム
及び１ｍＭＥＤＴＡ含有、ｐＨ７，９）をそれぞれ用い
た。

９、ポリアクリルアミドゲル電気泳動 上記手引書の第７８−８７頁及び第１１４−１２５頁に
記載の方法に従い、ポリアクリルアミドゲル電気泳動及
び泳動後のゲルからのＤＮＡ断片の分離を行なった。泳
動用電源としてはアトー社製コンスターパワー５Ｊ１０
６５型を、泳動槽としてはアト−社製５Ｊ１０６０ＳＤ
型を用いた。

アクリルアミド溶液としてはアクリルアミドとＮ。

Ｎ′−メチレンビスアクリルアミド（２９：　１　）と
の水溶液を、重合促進剤としてはＮ、Ｎ、Ｎ’　。

Ｎ′−テトラメチレンエチレンジアミンを、重合触媒と
しては過硫酸アンモニウムをそれぞれ用いた。また泳動
用緩衝液としては２．５ｍＭＥＤＴＡを含有する９０ｍ
Ｍトリスホウ酸緩衝液（ｐＨ８，３＞を用いた。

実施例１ （Ｔｈｒ−６）−ｂｌａシグナルペプヂドをコードする
ＤＮＡ塩基配列を有するベクターｐＧＨ６３の構築 ■　オリゴヌクレオチドの合成 以下の塩基配列を有する４種のオリゴヌクレオチドＬＳ
−１、［Ｓ−２、ＬＳ−３及びＬＳ−４のそれぞれを、
アプライドバイオシステムズ社製ＤＮＡ合成機モデル３
８１Ａを用いて合成した。

上記オリゴヌクレオチドＬＳ−２及びＬＳ−３（各１μ
ｇ°）の５′端を、それぞれＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼ（宝酒造社製）を用いてリン酸化した。

■　クローニングベタターの調製 プラスミドｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖａｒ　　ｅｔ　　
ａｌ。

Ｇｅｎｅ　、　２．９５−１１３　（１９７７）　）　
５μｇを、Ｎｒｕ■緩衝液中にて制限酵素ＮｒｔＪＩに
ツポンジーン社製）を用いて切断し、次いで５ａｌＩ緩
衝液中にて、制限酵素５ａｌＩ（宝酒造社製）を用いて
切断後、１．０％アガロースゲル電気泳動を行ない、約
４．ＯｋｂのベクターＤＮＡフラグメントを得た。

■　本発明ベクター１）ＧＨ６３の構築上記■で得たベ
クターＤＮＡフラグメントを、上記■で調製されたリン
酸化したオリゴヌクレオチドＬＳ−２及びＬＳ−３並び
にリン酸化していないオリゴヌクレオチドＬＳ−１及び
ＬＳ−４のそれぞれ約０．２μＱずつと混合し、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼで結合反応させた。反応終了後、この反応
組成物で大腸菌Ｈ８１０１株を形質転換させて、アンピ
シリン耐性で且つテトラサイクリン感受性を示すコロニ
ーを得、これより一株を選択し、これからプラスミドを
単離して、目的のプラスミドｐＧＨ６３を得た。

一連の操作の概略は第１図に示す通りである。

得られたＩ）ＧＨ６３は、１．０％アガロースゲル電気
泳動の結果、約４．１ｋｂの大きさを有していた。また
このものの５ａｌＩ、ＮｒｕＩ、ＦｎＵ４Ｈ■等の制限
酵素による切断パターンを調べた結果、該ｐＧＨ６３に
は、上記４種のオリゴヌクレオチドが上記式（４）に示
すごとく正しく連結されてなるＤＮＡフラグメントが含
まれていることが確認された。更にこれは、ＤＮＡ塩基
配列の分析結果からも確認された。該ＤＮＡ配列は、（
Ｔｈｒ’）−ｂｌａシグナルペプチドのアミノ酸配列に
正しく対応するものでおった。

参考例１ β−ウロガストロンをコードするＤＮＡ塩基配列を有す
るプラスミドｐＵＧＴ”ｌ　５０の構築■　この例に従
うＤＬＩＧＴ１５０構築の概略図を第５図に示す。

この例ではｔａＣプロモーターの起源ベクターとしてｐ
ＤＲ５４０（ファルマシア社製）を用いた。

該ＤＤＲ５４０の１５μ（］を、制限酵素ＢａｍＨ■を
用いて、生塩濃度緩衝液［塩化ナトリウム５０ｍＭ１ト
リス塩酸（ｐＨ７，５）１０ｍＭ。

塩化マグネシウム１０ｍＭ及びジチオスレイトール１ｍ
Ｍ含有、以下同じ］中で切断後、得られたＤＮＡ断片の
末端を８１ヌクレアーゼにより平滑末端とし、次いで制
限酵素ＥＣＯＲ工を用いて、高塩濃度緩衝液中で切断し
た。次に５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ない
、約０，３８ｋｂのＤＮＡ断片＜ａ＞を得た。

■　ｐＵＧ２０１　［微工研条奇第６８１号、特開昭６
１−１４９０８９号公報参照］の２２μ９を、制限酵素
ＰｓｔＩ及びＥＣ０ＲＩを用いて、それぞれ生塩濃度緩
衝液中及び高塩濃度緩衝液中で切断し、得られたＤＮＡ
断片の内、２μＱ相当分から、０．９％アガロースゲル
電気泳動により約２、．９７ｋｂのＤＮＡ断片＜ｂ＞を
得た。

■　上記１）ｔＪＧ２０１をＰＳｔＩ及びＥＣ０ＲＩで
切断して得たＤＮＡ断片の残り２０μｇ相当分を、制限
酵素ＭｂＯ■を用いて低塩濃度緩衝液［トリス塩酸（ｐ
Ｈ７，５＞１０ｍＭ、塩化マグネシウム１０ｍＭ及びジ
チオスレイトール１ｍＭを含有コ中で部分切断した。即
ち、ＭｂｏＩＩ（ＮＥＢ社製）の１０ユニツトを反応液
中に加え、３７°Ｃで３０分間反応させることにより、
上記部分切断を行なった。次いで５％ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動を行ない、約０．４９ｋｂのＤＮＡ断片
（Ｃ）を得た。

■　下記オリゴヌクレオチドＩ−３及びＩ−４を、固相
リン酸トリエステル法（Ｈ，Ｉ　ｔｏ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、
１０．１７５５−１７６９　（１９８２））に従い合成
した。

１−３　５’ＴＣＧＡＣＡＡＴＧΔＧＴ　　３’Ｉ−４
３’ＡＧＣＴＧＴＴＡＣＴＣ５’■　上記で得たＤＮＡ
断片Ｃａ＞、＜ｂ＞及び（Ｃ）並びにオリゴヌクレオチ
ドＩ−３及びＩ−４のそれぞれ１μｇを混合し、５０μ
Ｑの反応溶液中にて、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結
させた。次いでこの反応組成液で大腸菌ＪＭ１０３株を
形質転換させ、テトラサイクリン耐性を示す形質転換体
を得た。得られた形質転換体から一株を選び、該株から
プラスミドル１Ｇ丁１５０を単離した。

該ｐＵＧＴ１５０は、１．０％アガロースゲル電気泳動
の結果、約３．９ｋｂの大きさを有していた。またこの
ものの３ａｌＩ、ＨｉｎｄＩ［等の制限酵素による切断
パターンを調べた結果、これは、テトラサイクリン耐性
遺伝子の他、ｐＤＲ５４０の有するｔａｃプロモーター
及びその下流のＳＤ配列、ｐＵＧ２０１の有するβ−ラ
クタマーゼのシグナルペプチドとβ−ウロガストロンと
が直接結合した融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩
基配列及びβ−ラクタマーゼの転写終結信号をこの順序
で含むものであり、上記ＳＤ配列と融合ポリペプチドを
コードするＤＮＡ塩基配列との間には、３ａｌ■サイト
を有することが確認された。

該１）ＵＧＴ１５０を保有する大腸菌ＪＭ１０３株は、
ｒＪＭｌ　０３　（ｐＵＧＴｌ　５０）Ｊなる表示で、
微工研菌奇第９７４号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ９７４）とし
て寄託されている。

実施例２ （丁ｈｒ−６）−ｂｌａシグナルペプチドを利用したβ
−ウロガストロン分泌発現ベクター１）ＵＧ２１４の構
築 このベクタープラスミドの構築の概略図を第２図に示す
。

■　実施例１で得たプラスミドＤＧＨ６３の２０μｇを
、ＮｒｕＩ緩衝液中にて制限酵素ＮｒｕＩを用いて切断
し、次いで３ａｌＩ緩衝液中にて制限酵素５ａｌＩを用
いて切断後、１．５％アガロースゲル電気泳動を行ない
、約０．０７ｋｂのＤＮＡ断片＜Ａ＞を得た。

■　参考例１で得たプラスミドｐＵＧＴ１５０の１５μ
Ｑを高塩濃度緩衝液中にて、制限酵素ＢａｎＨＩ（宝酒
造社製）を用いて切断し、次いでこれを三等分した。

その一方を、高塩濃度緩衝液中にて制限酵素ＰＳｔＩ　
（宝酒造社製）を用いて切断後、１．０％アガロースゲ
ル電気泳動を行なって、約２，６ｋｂのＤＮＡ断片＜８
＞を得た。

また他方を３８１Ｉ緩衝液中にて制限酵素３ａｌＩで切
断し、１．５％アガロースゲル電気泳動により、約０．
７６ｋｂのＤＮＡ断片＜Ｃ＞を得た。

また、別途にプラスミドｐＵＧ丁１５０の１０μｇをＮ
ｒｕ■緩衝液中にて、制限酵素Ｎｒｕ■及びＰｓｔＩを
用いて同時に切断した後、１．５％アガロースゲル電気
泳動を行ない、約０．４３ｋｂのＤＮＡ断片＜Ｄ＞を得
た。

■　上記■及び■で得られた各ＤＮＡ断片を混合し、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼを用いて連結させ、得られた連結物で
大腸菌ＪＭ１０７株（Ｃ，Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏ
ｎ　ｅｔ　ａｌ、、　　（１９８５）　、　Ｇｅｎｅ、
３３゜１０３−１１９）を形質転換させ、テトラサイタ
リン耐性を示すコロニーを分離し、これから−株を選び
、これから目的のプラスミドｐＵＧ２１４を単離した。

得られたｐＬＪＧ２１４は、１．０％アガロースゲル電
気泳動の結果、約３．９ｋｂの大きざを有していた。ま
た、このものはＮｒｕ■、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩ等
の制限酵素による切断パターンを調べた結果、テトラサ
イクリン耐性遺伝子の外に、（Ｔｈｒ’）　−ｂｌａシ
グナルペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列を有し、且
つその３′端に直接β−ウロガストロンをコードするＤ
ＮＡ塩基配列が連結されており、更にその上流には、ｔ
ａｃプロモーター等の調節因子が連結されていることが
確認された。

実施例３ （Ｓｅｒ’）−ｂｌ’ａシグナルペプチドをコードする
ＤＮＡ塩基配列を有するベクター１）ＧＨ６８の構築 ■　オリゴヌクレオチドの合成 以下の塩基配列を有する４種のオリゴヌクレオチドＬＳ
−１、ＬＳ−２、ＬＳ−５及びＬＳ−６のそれぞれを、
アプライドバイオシステムズ社製ＤＮＡ合成機モデル３
８１Ａを用いて合成した。

（５〉 上記オリゴヌクレオチドＬＳ−２及びＬＳ−５（各１μ
ｇ）の５′端を、それぞれ丁４ポリヌクレオチドキナー
ゼ（宝酒造社製）を用いてリン酸化した。

■　本発明ベクターｐＧＨ６３の構築 実施例１の■で調製したベクターＤＮＡフラグメントを
、上記■で調製したリン酸化したオリゴヌクレオチドＬ
Ｓ−２及び［Ｓ−５並びにリン酸化していないオリゴヌ
クレオチドＬＳ−１及び［Ｓ−６のそれぞれ約０．２μ
ｇずつと混合し、Ｔ　４　Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼで結合反
応させた。反応終了後、この反応組成物で大腸菌Ｈ８１
０１株を形質転換させて、アンピシリン耐性で且つテト
ラサイクリン感受性を示すコロニーを得、これより一株
を選択し、これからプラスミドを単離して、目的のプラ
スミド１）ＧＨ６８を得た。

一連の操作の概略は第３図に示す通りで必る。

得られたプラスミド１）ＧＨ６８は、１．０％アガロー
スゲル電気泳動の結果、約４．Ｉｋｂの大きさを有して
いた。またこのものの５ａｌＩ、ＮｒｕＩ、Ｆｎｕ４Ｈ
Ｉ等の制限酵素による切断パターンを調べた結果、該１
）ＧＨ６８には、上記４種のオリゴヌクレオチドが上記
式（５〉に示すごとく正しく連結されてなるＤＮＡフラ
グメントが含まれていることが確認された。更にこのこ
とは、ＤＮＡ塩基配列の分析結果からも確認された。該
ＤＮＡ配列は、（Ｓｅｒ−６）−ｂｌａシグナルペプチ
ドのアミノ酸配列に正しく対応するものでめった。

実施例４ （Ｓｅｐ−６）−ｂｌａシグナルペプチドを用いたβ−
ウロガストロン分泌発現ベクターｐＵＧ２２９の構築 このベクタープラスミドの構築の概略図を第４図に示す
。

■　実施例３で得たプラスミドｐＧＨ６８の２０μｇを
、Ｎｒｕ■緩衝液中にて制限酵素Ｎｒｕ■を用いて切断
し、次いで３ａｌＩ緩衝液中にて制限酵素５ａｌＩを用
いて切断後、１．５％アガロースゲル電気泳動を行ない
、約０．０７ｋｂのＤＮＡ断片＜Ｅ＞を得た。

■　実施例２の■で得た各ＤＮＡ断片＜Ｂ＞、＜Ｃ＞及
び＜０＞と上記■で得たＤＮＡ断片＜Ｅ＞とを混合し、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結させ、得られた連結物
で大腸菌ＪＭ１０７株を形質転換させ、テトラサイクリ
ン耐性を示すコロニーを分離した。そのうちから−株を
選び、これから目的のプラスミド１）ＵＧ２２９を単離
した。

得られたＩ）ＵＧ２２９は、１．０％アガロースゲル電
気泳動の結果、約３．９ｋｂの大きさを有していた。ま
た、このものはＮｒｕＩ、［３μｍＨＩ、ＨｉｎｄＩ［
Ｉ等の制限酵素による切断パターンを調べた結果、テト
ラサイクリン耐性遺伝子の外に、（Ｓｅｒ’）　−ｂｌ
ａシグナルペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列を有し
、且つその３′端に直接β−ウロガストロンをコードす
るＤＮＡ塩基配列が連結されており、更にその上流には
、ｔａＣプロモーター等の調節因子が連結されているこ
とが確認された。

実施例５ 本発明シグナルペプチド誘導体を含む有用ポリペプチド
分泌発現ベクターで形質転換された宿主細胞による有用
ポリペプチドの製造 ■　宿主細胞（形質転換体）の培養 実施例２及び４で得られた各分泌発現ベクター（ｐＵＧ
２１４及び１）ＵＧ２２９）を保有する大腸菌ＪＭ１０
７株を、以下の通り培養した。

培地としては、グルコース、カザミノ酸、サイアミン及
びテトラサイクリンを添加したＥ培地を用いた。その組
成は下記の通りである。

硫酸マグネシウム・７水塩　　　　０．２０ク工ンＭ１
水和物　　　　　　　　２．０ｇ無水リン酸２カリウム
　　　　　１０．０ｇリン酸酸水素アンモニウムドト リム・４水塩　　　　　　　　　　３．５ｇグルコース
　　　　　　　　　　　５．００カザミノ酸　　　　　
　　　　　　５．ＯＱ塩酸サイアミン　　　　　　　　
１６．８５１１１Ｇテトラサイクリン塩　塩　　　　２
０．Ｏｍ！ＱＱ 上記培地５＋ｎＱを含む試験管に菌を接種して、３７°
Ｃにて振盪培養を行なった。培養開始６時間後に、Ｉ　
ＰＴＧを２ｍＭとなるように添加して培養を継続し、そ
の３時間後に、培養液の全量を遠心分離（６００’Ｏ回
転／分Ｘ１０分、４°ｃ＞ｂて、菌体と培養上澄とを分
離した。得られた培養上澄を菌体外画分とする。

また菌体を、ＰＢＳ　（１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含
む２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｌ）■７．０＞１０ｍＱ
に懸濁させ、超音波破砕機（大岳製作所製５２０２型）
を用いて出力１００Ｗにて、３０秒ずつ３回破砕処理し
、遠心分離（１８０００回転／分Ｘ２０分、４°Ｃ）し
て上澄を得た。これを菌体内画分とする。

■　ＲＩＡによるβ−ウロガストロンの測定上記■で得
たそれぞれの両分につき、β−ウロガストロンの存在を
、β−ウロガストロン特異ラジオイムノアッセイ（ＲＩ
Ａ）により検討した。

ＲＩＡの方法は以下の通りである。

まず精製ヒトβ−ウロガストロンを抗原として、家兎を
免疫し抗血清を作成した。即ち、β−ウロガストロン３
００μｇを蒸留水０．２鵬に溶解後、５０％ポリビニル
ピロリドン液１．５＋ｎＱを加え室温で２時間撹拌した
。コンプリート・フロイント・アジュバント２．０ｍｌ
を加えて乳化し、家兎３匹の胸部に皮下注射した。２週
間毎に免疫を４回くり返した後、ざらに５０μｇの抗原
を静注し、３日後に全採血を行ない、血清を分離した。

次にアッセイに用いる抗血清の希釈倍率を求めるタイト
レージョンカーブ、アッセイ条件を最適化するためイン
キュベーション時間、抗体結合標識抗原（バウンド〉と
遊離標識抗原（フリー）の分離方法等の検討を加え、下
記測定条件を設定した。

即ち、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１４０
ｍＭ塩化ナトリウム及び２５ｍＭＥＤＴＡニナトリウム
を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，１＞を希釈液と
して用い、該希釈液４００μＱ１測定試料又は標準ヒト
β−ウロガストロン１００μＱ及び抗ヒトβ−ウロガス
トロン血清１００μＱを加えて４°Ｃにて２４時間イン
キユベートした後、　　■標識ヒトβ−ウロガストロン
１００μＱ（約５０００Ｃｐｍ）を加えた。更に４°Ｃ
にて４８時間インキュベートした後、第２抗体（抗家兎
γ−グロブリンヤギ血清）　（１：２０）１００μＱ１
正常家兎血清（１：　２００）１００μＱ及び５％ポリ
エチレングリコールを含む１０ｍＭ　　ＰＢＳ液９００
μＱを加えて４℃にて３時間インキュベートした。次に
３０００回転／分で３０分間遠心分離し、上清を除き沈
澱物をカウントした。標準ヒトβ−ウロガストロンより
得られた標準曲線より試料中のヒトβ−ウロガストロン
免疫活性物の含量を求めた。

上記ＲＩＡの結果（単位：μＱ　／Ｑ　）を、下記第３
表に示す。

尚、第３表には、比較のため本発明プラスミドに代えて
プラスミドｐＵＧＴ１５０を保有する大腸菌ＪＭ１０７
株を同様に培養した結果を併記する。

第３表 供試菌　　　　β−ウロガストロン免疫活性ＵＧ２２９ 上記第３表より、本発明ベクターｌＧ２１４及びｐｔＪ
Ｇ２２９のそれぞれを保有するＪＭ１０７株は、いずれ
も菌体内及び菌体外にβ−ウロガストロン免疫活性物を
産生じ、それらの産生量（菌体内及び菌体外合計）は、
プラスミド１ＧＴ１５０を保有する同ＪＭ１０７株のそ
れよりも顕著に高く、約２倍にも達することが明らかで
ある。

以上のことより、本発明のシグナルペプチド誘導体［（
Ｔｈｒ−６）　−ｂｌａシグナルペプチド及び（Ｓｅｒ
−６）　−ｂｌａシグナルペプチド］をコードするＤＮ
Ａ塩基配列の利用によれば、該ＤＮＡ塩基配列に続けて
連結されたＤＮＡ塩基配列によりコードされる外来ポリ
ペプチド（β−ウロガストロン）の発現及び分泌を顕著
に向上せしめ、しかもその分泌発現効果は、従来知られ
ているｂｌａシグナルペプチドのそれをも顕著に上回る
ものであることが明らかである。

■　β−ウロガストロンの精製及び同定本発明により得
られるβ−ウロガストロンの精製を以下の方法により実
施した。

即ち、上記で得た菌体内画分及び菌体外画分中のβ−ウ
ロガストロン免疫活性物質を、ブチルトヨパール６５０
Ｃ（東洋曹達社製）を用いた吸着クロマトグラフィー、
ＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍ（同上社製）を用いた陰
イオン交換クロマトグラフィー、ＣＭ−トヨパール６５
０Ｍ（同上社製）を用いた陽イオン交換クロマトグラフ
ィー、ＴＳＫゲル−〇ＤＳ−１２０丁カラム（同上社製
）を用いた高速液体クロマトグラフィー及びセファデッ
クスＧ−２５（ファルマシア社製）を用いたゲルか過ク
ロマトグラフィー操作を順次行なって、それぞれ純度９
９％以上の単一のポリペプチドとして精製した。

上記で精製されたポリペプチドと天然β−ウロガストロ
ン（日本ケミカルリサーチ社製）の逆相高速液体クロマ
トグラフィーによる溶出パターンを第６図に示す。第６
図はＴＳＫゲル−〇ＤＳ−１２０Ｔカラム（東洋曹達社
製）を用いて２２％アセトニトリルを含む５０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７，０＞により、毎分１．０鵬の流速で
溶出させた結果であり、図において縦軸は２８０ｎｍで
の吸光度を、横軸は保持時間（分）を示し、（１）は本
発明により得られたβ−ウロガストロンのポリペプチド
を、（２）は天然β−ウロガストロンの結果をそれぞれ
示している。

該図より、両者の保持時間は完全に一致していることが
判る。

■　細胞増殖促進活性の測定 本発明により得られるβ−ウロガストロンの細胞増殖促
進活性を、成熟ラット初代培養肝細胞（Ｔａｎａｋａ　
、　Ｋ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、
８４゜９３７−９４６　（１９７８））を用いて、標識
チミジンのＤＮＡへの取り込みを指標として測定した（
Ｎａｋａｍｕｒａ　、　Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂ、　
Ｂ、　Ｒ，Ｃ，。

１３３、１０４２−１０５０　（１９８５）及びＮａｋ
ａｍｕｒａ　、　Ｔ、ｅｔ　ａｔ、、　ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔ！、Ａｃａｄ。

ｓｃｒ、、ｕｓＡ、旦Ω、７２２９−７２３３（１９８
３））。

即ち、体重的２００ｇのウィスター系雄ラットにネンブ
タール０．４ｍＧを腹腔内投与して麻酔後、開腹し門脈
を露出させた。門脈の切開面からカニユーレを挿入し、
３７°Ｃに保温した前潅流用緩衝液を流した。また、右
心房を切開し、ここから別のカニユーレを上大静脈に挿
入した。次いで、前潅流用緩衝液に代えて、３７℃に保
温したコラ−ゲナーゼ溶液を用いて、１０〜２０分間潅
流を行なった。次いで、肝臓名菓を切り離し、シャーレ
に移してカルシウムを含まないハンクス液を加えて、メ
スで細分し、更にピペットで細胞を分散させた。次いで
１５０メツシユを通過する細胞を集め、これを遠心分離
（６０００ｒｌ）ｍ　、１分間）し、沈降した肝実質細
胞を、５％仔牛血清、１０−９Ｍインスリン、１０−９
Ｍデキサメサゾン、５Ｕ／ｍＱアプロチニンを含むウィ
リアムＥ培地に懸濁させた。その一部を用いトリパンブ
ルー法で染色後、血球計算盤で生細胞数を計測した。

尚、用いた前潅流用緩衝液及びコラ−ゲナーゼ溶液組成
ＩＪ　／Ｑ　）は次の通りである。

成　分　（ｇ／Ｑ　）　　　前潅流用　コラーゲナ緩衝
液　　ナーゼ溶液 塩化ナトリウム　　　　　　　８８ 塩化カリウム　　　　　　　　０．４　　　０．９４塩
化カルシウム　　　　　　　　　　　０．１リン酸−ナ
トリウム ・２水塩　　　　　　　　　０．０７Ｂ　　　０．０７
８リン酸二ナトリウム ・１２水塩　　　　　　　　０．１５１　　０．１５１
ＨＥＰＥ３　　　　　　　　　２．３８　　　２．３８
フエノールレツト　　　　　　０１００６　　０．００
６コラーゲナーゼ　　　　　　　　　　　０．５トリプ
シンインヒビター　　　　　　　　０．０５ＥＧＴＡ　
　　　　　　　　　　Ｏ，１９−炭酸水素ナトリウム　
　　　０．３５　　　０．３５グルコース　　　　　　
　　０．９ １）Ｈ７，２７，５ 上記肝実質細胞を１２穴のプラスチック製ディツシュに
０．５Ｘ１０”個／ウェルとなるように分注し、−夜培
養した後、培地を捨てて、種々の濃度のβ−ウロガスト
ロン又は天然型β−ウロガストロン及び１０−９Ｍイン
スリン、１０−９Ｍデキサメサゾン及び５Ｕ／ｍｆｌ！
アプロチニンを含むウィリアムスＥ培地１　ｒｎＱを加
えた。これを１２時間３７℃に保った後、１．２５μＣ
ｉの〔３日〕−チミジン（０，３Ｃｉ　／ｍ　ｍｏｌ　
）を加え、３７°Ｃで更に２４時間培養した。次いで細
胞をＰＢＳで２回洗浄し、１０％ＴＣＡを加え、４°Ｃ
で一夜放置することにより固定した。固定された細胞に
１　Ｎ−Ｎａ　ＣＱ　Ｏ，５ｗ１２を加え、３７°Ｃに
て３０分間保温して溶解させ、これを試料液とした。

試料液４７５μＱに、’１００％（ｗ／ｖ）ＴＣＡ１５
０μＱを加え、４°Ｃで２時間放置した後、遠心分離（
３０００ｒｌ）ｍ　、１５分間）し、高分子ＤＮＡを沈
澱させた。次いでこれに１０％ＴＣＡ０．５ｍＱを加え
、沸騰水浴中で１５分間加熱し、ＤＮＡを加水分解した
。水冷後、遠心分離（３０００ｐｐｍ　、１５分間）し
て上澄を分離し、液体シンチレーションカウンターで放
射能を測定した。別に、試料液２５μＱ中の蛋白量を、
フォーリン・ローリ−法により定量し、之等の結果から
、蛋白量当りの放射能を求めた。

その結果、本発明により得られるβ−ウロガストロンは
、天然β−ウロガストロンと同等のチミジン取り込み促
進効果、即ち細胞増殖促進活性を有することが判った。

【図面の簡単な説明】

第１図はベクターＤＢＲ３，２２に合成オリゴヌクレオ
チド＜ＬＳ−１＞〜＜　Ｌ　Ｓ　−４＞をクローニング
してプラスミドｐＧＨ６３を得る工程及び得られるプラ
スミドｐＧＨ６３の特徴を示す図であり、図中間は合成
オリゴヌクレオチド由来の塩基配列を示し、ＡＩＤ’は
アンピシリン耐性遺伝子を、ＴＣｒはテトラサイクリン
耐性遺伝子を示し、以下の図でも同様とする。 第２図は１）ＧＨ６３とｐＵＧＴ１５０とからベクター
１）ＵＧ２１４を得る工程及び得られるベクターの特徴
を示す図であり、図中ニコはβ−ウロガストロンをコー
ドするＤＮＡ塩基配列を示し、黒ヌリの矢印はβ−ラク
タマーゼのプロモーターを、斜線を付して示した矢印は
ｔａｃプロモーターをそれぞれ示し、之等は以下の図で
も同様とする。 第３図はベクターｐＢＲ３２２に合成オリゴヌクレオチ
ド＜ＬＳ−１＞、＜ＬＳ−２＞、＜ＬＳ−５〉及び＜Ｌ
Ｓ−６＞をクローニングしてプラスミドＩ）ＧＨ６８を
得る工程及び得られるプラスミドｐＧＨ６８の特徴を示
す図であり、図中謔は合成オリゴヌクレオチド由来の塩
基配列を示す。 第４図はｐＧＨ６８と１ＤＵＧ丁１５０とからベクター
ｐＵＧ２２９を得る工程及び得られるベクターの特徴を
示す図である。 第５図はｐＤＲ５４０，ｐＵＧ２０１並びにオリゴヌク
レオチドＩ−３及び■−４からベクターＤＵＧＴ１５０
を得る工程及び得られるベクターの特徴を示す図であり
、Ｏｒｉは複製開始領域を示す。 第６図は、本発明により得られるβ−ウロガストロン及
び天然β−ウロガストロンの逆相高速液体クロマトグラ
フィーによる溶出パターンを示すグラフでおる。 （以　上）

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）一般式 （アミノ末端）【アミノ酸配列があります】（カルボキ
   シ末端） 〔式中ＸはＣｙｓ以外の中性親水性アミノ酸残基を示す
   。〕 で表されるポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤ
   ＮＡ塩基配列。
2. （２）ＸがＴｈｒ又はＳｅｒである特許請求の範囲第１
   項に記載のポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤ
   ＮＡ塩基配列。
3. （３）【遺伝子配列があります】 である特許請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ塩基配列。
4. （４）【遺伝子配列があります】 である特許請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ塩基配列。
5. （５）特許請求の範囲第１項〜第４項のいずれかに記載
   のＤＮＡ塩基配列を含むベクター。
6. （６）特許請求の範囲第１項〜第４項のいずれかに記載
   のＤＮＡ塩基配列の他に、更に該ＤＮＡ塩基配列の上流
   にリボゾーム結合部位及びプロモーターを有する特許請
   求の範囲第５項に記載のベクター。
7. （７）特許請求の範囲第１項〜第４項のいずれかに記載
   のＤＮＡ塩基配列の他に、更に該ＤＮＡ塩基配列の下流
   に他の有用ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列を
   有する特許請求の範囲第５項又は第６項に記載のベクタ
   ー。
8. （８）特許請求の範囲第５項、第６項又は第７項に記載
   のベクターを保有する微生物。
9. （９）特許請求の範囲第８項に記載の微生物を培養して
   、分泌される有用ポリペプチドを採取するポリペプチド
   の製造方法。