JPH07145200A - Ｓｍｃ様ポリペプチド及びその産生方法 - Google Patents

Ｓｍｃ様ポリペプチド及びその産生方法

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JPH07145200A
JPH07145200A JP6117443A JP11744394A JPH07145200A JP H07145200 A JPH07145200 A JP H07145200A JP 6117443 A JP6117443 A JP 6117443A JP 11744394 A JP11744394 A JP 11744394A JP H07145200 A JPH07145200 A JP H07145200A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 組換ＤＮＡ分子及び単細胞宿主を用いてＳＭ
Ｃ様ポリペプチド及びその産生方法を得る。 【構成】 ＳＭＣ様ポリペプチドは、発現のためにＤＮ
Ａ配列によりコードされたＳＭＣ様ポリペプチドにおい
て、前記ＤＮＡ配列が、ｐＬＣ２４ｍｕＳＭＣ１〜ｐＬ
Ｃ２４ｍｕＳＭＣ１０のＤＮＡ挿入物から選択されるこ
とを特徴とし、その産生方法は、組換ＤＮＡ分子により
形質転換された単細胞宿主を培養する工程を特徴とする
ＳＭＣ様ポリペプチドの産生方法において、前記組換Ｄ
ＮＡ分子が、ｐＬＣ２４ｍｕＳＭＣ１〜ｐＬＣ２４ｍｕ
ＳＭＣ１０よりなる群から選択されることを特徴とす
る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、任意所望の蛋白もしく
はポリペプチドを産生するのに最適なＤＮＡ配列をこれ
らにより形質転換された単細胞宿主にて産生するＤＮＡ
配列の同定方法に関し、より詳細には、本発明は、ヒト
ソマトメジンＣ（「ＳＭＣ」）を産生するのに最適な改
変ＤＮＡ配列の同定に関し、さらに本発明は、これらＤ
ＮＡ配列を特徴とする組換ＤＮＡ分子および単細胞宿主
を用いて原核および真核起源のヒトＳＭＣおよびその産
生方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】ソマトメジンＣ（「ＳＭＣ」）はインシ
ュリン様の成長因子であって、下垂体から成長ホルモン
を分泌した後に組織成長を指令する重要な蛋白であると
思われる。
【０００３】ヒトＳＭＣのアミノ酸配列はＥ．リンダー
クネヒトおよびＲ．Ｅ．ハンブルにより報告された〔ジ
ャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２５３
巻、第２７６９−２７７６頁（１９７８）〕。これは、
３個のジスルフィド結合によって架橋された７０個のア
ミノ酸よりなる一本鎖ポリペプチドで構成される。計算
分子量は７６４９である。このＳＭＣはプロインシュリ
ンに対し著しい類似性を示す。たとえば、ＳＭＣアミノ
酸１〜２９はインシュリンＢ鎖に対し同族であり、かつ
ＳＭＣアミノ酸４２〜６２はインシュリンＡ鎖に同族で
ある。しかしながら、ＳＭＣにおける接続連鎖はプロイ
ンシュリンのＣペプチドに対する類似性を示さず、また
ＳＭＣはプロインシュリンには見られないＣ−末端オク
タペプチドを有する。
【０００４】ＳＭＣはインビトロにおいて多くの成長促
進作用を示し、たとえばＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白およびプ
ロテオグリカンの合成を刺戟する作用を示す〔Ｅ．リン
ダークネヒトおよびＲ．Ｅ．ハンブル、プロシーディン
グ・ナショナル・アカデミー・サイエンスＵＳＡ、第７
３巻、第２３６５−２３６９頁（１９７６）〕；Ｂ．モ
レルおよびＥ．Ｒ．フロエシュ、ヨーロピアン・ジャー
ナル・クリニカル・インベスティゲーション、第３巻、
第１１９−１２３頁（１９７３）；Ｅ．Ｒ．フロエシュ
等、Ａｄｖ．Ｍｅｎｔａｌ．Ｄｉｓｏｒｄ、第８巻、第
２１１−２３５頁（１９７５）；Ａ．Ｅ．チングおよび
Ｅ．Ｒ．フロエシュ、ダイアベトロジア、第９巻、第４
７２−４７６頁（１９７３）；Ｅ．Ｒ．フロエシュ等、
プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエン
スＵＳＡ、第７３巻、第２９０４−２９０８頁（１９７
６）〕。さらに、これはオルニチンデカルボキシラーゼ
および細胞増殖をも刺戟する〔Ｂ．モレルおよびＥ．
Ｒ．フロエシュ、上記；Ｇ．Ｋ．ハーゼルバッハーおよ
びＲ．Ｅ．ハンブル、ジャーナル・セルラー・フィジオ
ロジー、第８８巻、第２３９−２４６頁（１９７
６）〕。インビボにおいて、ＳＭＣは下垂体切除により
成長ホルモンを欠如させたラットにおける成長を刺戟す
る〔Ｅ．シェンル等、ネーチャー、第２９６巻、第２５
２−２５３頁（１９８２）〕。
【０００５】成長ホルモンと同様に、ＳＭＣはある程度
動物種類に特異性である。しかしながら、ある種の動物
からのＳＭＣは、進化論的尺度において低位の他の動物
種類でも生物学上活性である。たとえば、ヒトＳＭＣは
牛、豚およびニワトリにおける成長促進に有用であると
思われる。実験動物において、ＳＭＣは天然ヒト成長ホ
ルモンと同様な成長刺戟作用を示した。しかしながら、
ＳＭＣは成長反応の中枢媒体であるためヒト成長ホルモ
ンよりも有利であると思われる。したがって、成長ホル
モンよりも一層直接的な成長調節剤となる。
【０００６】たとえば、矮小発育症および筋肉アトロピ
ー等のある種の成長障害を処置するＳＭＣの用途の他
に、ＳＭＣはさらにたとえば外傷および骨折の治癒に関
連するような特定領域における組織成長を刺戟するにも
有用である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】しかしながらＳＭＣ
は、ヒト血液からの精製により極く微量しか入手し得な
いため、組織成長刺戟剤としてのその臨床的能力を果し
ていない。したがって、産業上および臨床上有用な量の
ＳＭＣにおけるこの欠乏を解消するため、他の方法が要
求される。
【０００８】この種の１つの方策は、ＳＭＣをコードす
るＤＮＡ配列で形質転換された宿主においてＳＭＣを産
生させるための組織ＤＮＡ技術の使用である。しかしな
がら、この方策は多量のＳＭＣを製造するには有用でな
いことが判明している。なぜなら、各種のイー・コリ宿
主におけるＳＭＣの発現収率が極めて低く、経済上また
は産業上有用な量のＳＭＣを提供し得ないからである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、ＳＭＣあるい
はその他任意所望の真核もしくは原核蛋白もしくはポリ
ペプチドを産生するのに最適なＤＮＡ配列を、これらＤ
ＮＡ配列により形質転換された宿主において産生を行う
ために同定する方法を提供することにより上記問題を解
決する。この方法により選択される改変ＤＮＡ配列はこ
れら蛋白、特に本発明の好適な実施例においてはＳＭＣ
の発現をコードし、かつこれらを各種の宿主において効
率的に高レベルで産生することを可能にする。したがっ
て、本発明によれば、臨床上有用な量でＳＭＣの成長刺
戟性および媒介活性を示すポリペプチドを初めて得るこ
とが可能になる。
【００１０】以下の開示から明らかとなるように、本発
明の好適具体例において、本発明の新規なＤＮＡ配列お
よび組換ＤＮＡ分子は適当な宿主において多量のＳＭＣ
およびＳＭＣ様ポリペプチドの産生を指令することがで
きる。かくして、これらのポリペプチドはヒト並びに
牛、豚およびニワトリにおける広範囲な種類の成長刺戟
および媒介活性において有用となる。
【００１１】したがって、本発明の基本的一面は、ＳＭ
Ｃあるいはその他任意所望の真核もしくは原核蛋白もし
くはポリペプチドを産生するのに最適なＤＮＡ配列の同
定方法を設計することにあることが了解されよう。本発
明の第二の基本的面はこれら蛋白、特にＳＭＣおよびＳ
ＭＣ様ポリペプチドを向上した収率で産生しうる各種の
新規なＤＮＡ配列、組換ＤＮＡ分子および宿主に関する
ものである。
【００１２】要約して、所望の真核もしくは原核蛋白も
しくはポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列により形
質転換された宿主において、これら所望の蛋白もしくは
ポリペプチドの産生を向上させる本発明の方法は、前記
ＤＮＡ配列が容易に分析しうる蛋白もしくはポリペプチ
ドのＮ−末端部分をコード化するＤＮＡ配列を、所望の
真核もしくは原核蛋白もしくはポリペプチドのＮ−末端
部分をコード化するＤＮＡ配列の縮重シリーズで置換
し；得られたシリーズの所望発現制御配列に作用結合し
たハイブリッドＤＮＡ配列を適当な宿主で発現させ；容
易に分析しうる蛋白もしくはポリペプチドの最適な産生
を可能にする特定ハイブリッドＤＮＡ配列を選択し；か
つ所望のポリペプチドもしくは蛋白のＮ−末端部分をコ
ードするこれら選択されたハイブリッドＤＮＡ配列を所
望ポリペプチドもしくは蛋白の発現において使用する諸
工程からなっている。有利には、この方法は、所望の蛋
白もしくはポリペプチドの最適産生を可能にする。本発
明は、特に発現のためにＤＮＡ配列によりコードされた
ＳＭＣ様ポリペプチドにおいて、前記ＤＮＡ配列が、ｐ
ＬＣ２４ｍｕＳＭＣ１〜ｐＬＣ２４ｍｕＳＭＣ１０のＤ
ＮＡ挿入物から選択されることを特徴とする。
【００１３】ここに記載する本発明を充分理解しうるよ
う、以下詳細に説明する。
【００１４】説明において次の用語を使用する。
【００１５】ヌクレオチド：糖成分（ペントース）と燐
酸と含窒素複素環塩基とよりなるＤＮＡもしくはＲＮＡ
の単量体単位である。塩基はグリコシド炭素（ペントー
スの１′の炭素）を介して糖成分に結合される。塩基と
糖とのこの組合せをヌクレオシドと呼ぶ。各ヌクレオチ
ドはその塩基を特徴とする。４種のＤＮＡ塩基はアデニ
ン（「Ａ」）、グアニン（「Ｇ」）、シトシン
（「Ｃ」）およびチミン（「Ｔ」）である。４種のＲＮ
Ａ塩基はＡ、Ｇ、Ｃおよびウラシル（「Ｕ」）である。
【００１６】ＤＮＡ配列：隣接するペントースの３′炭
素と５′炭素との間でホスホジエステル結合により互い
に連結されたヌクレオチドの線状列である。
【００１７】コドン：３個のヌクレオチド（トリプレッ
ト）のＤＮＡ配列であって、ｍＲＮＡを介しアミノ酸、
翻訳開始信号または翻訳停止信号をコードする。
【００１８】遺伝子：雛型またはメッセンジャーＲＮＡ
（「ｍＲＮＡ」）を介し、特定ポリペプチドに特徴的な
アミノ酸の配列をコードするＤＮＡ配列である。
【００１９】転写：遺伝子からｍＲＮＡを生成する過
程。
【００２０】翻訳：ｍＲＮＡからポリペプチドを生成す
る過程。
【００２１】発現：ポリペプチドを産生するためにＤＮ
Ａ配列もしくは遺伝子により行われる過程。これは転写
と翻訳との組合せである。
【００２２】プラスミド：プラスミドが宿主細胞で複製
されるような完全「レプリコン」からなる非染色体二重
鎖ＤＮＡ配列である。プラスミドが単細胞生物内に挿入
されると、この生物の特性がこのプラスミドのＤＮＡの
結果として変化しあるいは形質転換しうる。たとえばテ
トラサイクリン耐性（Ｔｅｔ Ｒ）に関する遺伝子を有す
るプラスミドは、テトラサイクリンに対し感受性であっ
た細胞をテトラサイクリンに対し耐性である細胞に形質
転換する。プラスミドにより形質転換された細胞を「形
質転換体」と呼ぶ。
【００２３】ファージもしくはバクテリオファージ：そ
の多くが蛋白エンベロプもしくはコート蛋白（「カプシ
ド」）にカプセル化されたＤＮＡ配列よりなる細菌性ウ
イルスである。
【００２４】クローン化ベヒクル：宿主細胞で複製しう
るプラスミド、ファージＤＮＡもしくはその他のＤＮＡ
配列であって、この種のＤＮＡ配列がＤＮＡの本質的な
生物学機能、例えば複製、コート蛋白の産生などの損失
を伴なわずにあるいはプロモータもしくは結合部位の損
失を伴なわずに決定可能に切断されうる１個もしくは少
数のエンドヌクレアーゼ認識部位を特徴とし、さらに形
質転換細胞の同定に使用するのに適した標識、たとえば
テトラサイクリン耐性もしくはアンピシリン耐性を有す
る。クローン化ベヒクルはしばしばベクターと呼ばれ
る。
【００２５】クローン化：無性繁殖により１種の生物も
しくはＤＮＡ配列から誘導される、これら生物もしくは
ＤＮＡ配列の集団を得る過程である。
【００２６】組換ＤＮＡ分子、すなわちハイブリッドＤ
ＮＡ：互いに末端結合されかつある種の宿主細胞に感染
してそこに維持される能力を有する種々異なるゲノムか
らのＤＮＡ断片よりなる分子である。
【００２７】発現制御配列：遺伝子の発現を、これら遺
伝子に作用結合された際に制御しかつ調整するヌクレオ
チドの配列である。これらはｌａｃ系、ｔｒｐ系、ｔａ
ｃ系、ｔｒｃ系、ファージλの主オペレータおよびプロ
モータ領域、ｆｄコート蛋白の制御領域、ＳＶ４０の早
期および後期プロモータ、ポリオーマ、アデノウイルス
および猿ウイルスから誘導されるプロモータ、３−ホス
ホグリセレートキナーゼまたはその他の糖分解酵素のプ
ロモータ、酵母酸ホスファターゼのプロモータ、たとえ
ばＰｈｏ５、酵母α−接合因子のプロモータ、ならびに
原核もしくは真核細胞およびそのウイルスの遺伝子の発
現を制御することが知られたその他の配列、あるいはそ
の組合せを包含する。
【００２８】ＳＭＣ：ソマトメジンＣ。
【００２９】ＳＭＣ様ポリペプチド：ＳＭＣの成長刺戟
もしくは媒体活性を示すポリペプチドである。たとえば
ＳＭＣ様ポリペプチドは成熟ＳＭＣの第１グリシンに融
合したＮ−末端メチオニンまたはその他のペプチドを含
むことができる。さらに、これはアミノ酸位置５９にメ
チオニンの代りにスレオニンを含むこともできる。さら
に、ＳＭＣ様ポリペプチドは、成熟ＳＭＣのアミノ酸配
列に対しその他各種の置換、付加または欠失を含むこと
もできる。
【００３０】本発明の幾つかの局面を有する。第１に、
本発明は任意の真核もしくは原核蛋白もしくはポリペプ
チドの発現をコードするＤＮＡ配列で形質転換された宿
主細胞において、これら蛋白もしくはポリペプチドを産
生される改良方法に関する。さらに本発明は、これらＤ
ＮＡ配列により形質転換された宿主細胞において任意の
真核もしくは原核蛋白もしくはポリペプチドの最適産生
を可能にするＤＮＡ配列の選択方法にも関する。さらに
本発明は、前記方法により選択されるＤＮＡ配列および
これらによりコードされる蛋白およびポリペプチドの産
生におけるその使用に関する。最後に１つの好適例にお
いて、本発明はＳＭＣ様ポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ配列、ならびにこれらＤＮＡ配列を選択しかつこれら
により形質転換された宿主にてＳＭＣの産生を最適化す
る際に使用する方法に関するものである。
【００３１】本発明のハイブリッドＤＮＡ配列および所
望の真核もしくは原核蛋白もしくはポリペプチドの最適
産生を可能にする選択ＤＮＡ配列の両者を発現させる
際、広範な種類の宿主／発現ベクター組合せを用いるこ
とができる。たとえば、有用な発現ベクターは染色体、
非染色体および合成ＤＮＡ配列の断片、たとえばＳＶ４
０の各種公知の誘導体および公知の細菌性プラスミド、
たとえばＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ
９およびその誘導体を含むイー・コリからのプラスミ
ド、広範な宿主範囲のプラスミド、たとえばＲＰ４、フ
ァージＤＮＡ、たとえばファージλの多数の誘導体、た
とえばＮＭ９８９およびその他のＤＮＡファージ、たと
えばＭ１３ならびにフィラメント状一本鎖ＤＮＡファー
ジ、酵母に有用なベクター、たとえば２μプラスミド、
真核細胞および動物細胞に有用なベクター、たとえばＳ
Ｖ４０から誘導されたＤＮＡ配列を含むもの、ならびに
プラスミドとファージＤＮＡとの組合せから誘導される
ベクター、たとえばファージＤＮＡもしくはその他の誘
導体を使用すべく改変されたプラスミドで構成すること
ができる。
【００３２】この種の有用な発現ベクターには、真核宿
主（たとえば動物およびヒト細胞）においてクローン化
ＤＮＡ配列の発現を可能にするベクター〔たとえばＰ．
Ｊ．サンザーンおよびＰ．ベルク、ジャーナル・モレキ
ュラー・アプライド・ジェネティックス、第１巻、第３
２７−３４１頁（１９８２）〕；Ｓ．サブラマニ等、モ
レキュラ・セルラー・バイオロジー、第１巻、第８５４
−８６４頁（１９８１）；Ｒ．Ｊ．カウフマンおよび
Ｐ．Ａ．シャープ、「モジュール・ジヒドロホレート・
レダクターゼ相補性ＤＮＡ遺伝子を組込んだ配列の増殖
および発現」、ジャーナル・モレキュラー・バイオロジ
ー、第２（１１）巻、第１３０４−１３１９頁（１９８
２）；Ｒ．Ｊ．カウフマンおよびＰ．Ａ．シャープ、モ
レキュラー・セルラー・バイオロジー、第１５９巻、第
６０１−６６４頁（１９８２）；Ｓ．Ｉ．スカヒル等、
「支那ハムスター卵細胞におけるヒト免疫インタフェロ
ンＤＮＡ遺伝子の産生物の発現および特性化」、プロシ
ーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンスＵＳ
Ａ、第８０巻、第４６５４−４６５９頁（１９８３）；
Ｇ．ウルラウブおよびＬ．Ａ．ケーシン、プロシーディ
ング・ナショナル・アカデミー・サイエンスＵＳＡ、第
７７巻、第４２１６−４２２０頁（１９８０）〕があ
る。
【００３３】さらに、この種の発現ベクターは、特定の
ＤＮＡ配列に作用結合されてクローン化ＤＮＡ配列の発
現を制御しかつ調整する少なくとも一種の発現制御配列
を特徴とする。有用な発現制御配列の例はｌａｃ系、ｔ
ｒｐ系、ｔａｃ系、ｔｒｃ系、ファージλの主オペレー
タおよびプロモータ領域、ｆｄコート蛋白の制御領域、
酵母の糖分解プロモータ、たとえば３−ホスホグリセレ
ートキナーゼのプロモータ、酵母酸ホスファターゼのプ
ロモータ、たとえばＰｈｏ５、酵母α−接合因子のプロ
モータ、ならびにポリオーマ、アデノウイルスおよび猿
ウイルスから誘導されるプロモータ、たとえばＳＶ４０
の早期および後期プロモータ、ならびに原核もしくは真
核細胞の遺伝子およびそれらのウイルスの発現を制御す
ることが知られたその他の配列、あるいはその組合せで
ある。
【００３４】有用な発現宿主は周知の真核および原核宿
主、たとえばイー・コリＨＢ１０１、イー・コリＸ１７
７６、イー・コリＸ２２８２、イー・コリＤＨＩ（λ）
およびイー・コリＭＲＣ１のようなイー・コリ、シュー
ドモナス、バチルス（たとえばバチルス・ズブチリ
ス）、ストレプトミセス、酵母およびその他の真菌類の
菌株、動物細胞、たとえばＣＯＳ細胞およびＣＨＯ細
胞、ならびに組織培養におけるヒト細胞および植物細胞
を包含する。
【００３５】勿論、必ずしも全ての宿主／発現ベクター
組合せが同等な効率をもって本発明におけるＤＮＡ配列
の発現あるいは本発明のポリペプチドの産生に機能する
とは限らない、しかしながら、宿主／発現ベクター組合
せの特定の選択は、以下説明する原理を考慮して、本発
明の範囲を逸脱することなく当業者により行うことがで
きる。たとえば、この選択は多数の因子のバランスに基
づいている。たとえば、これらは宿主およびベクターの
適合性、ＤＮＡ配列によりコードされた蛋白の宿主に対
する毒性、所望蛋白の回収容易性、ＤＮＡ配列の発現特
性、ならびにこれらに作用結合された発現制御配列、生
物安全性、コストおよび所望蛋白の重なり、形態あるい
はその他の任意の必要とする発現後の改変を包含する。
【００３６】さらに、各特定発現ベクターには、本発明
のＤＮＡ配列を挿入するため各種の部位を選択すること
ができる。これらの部位は、一般にこれらを切断する制
限エンドヌクレアーゼにより命名され、当業者に充分認
識されている。勿論、本発明に有用な発現ベクターは、
選択ＤＮＡ断片を挿入するための制限エンドヌクレアー
ゼ部位を有する必要がないことを了解すべきである。む
しろ、このベクターは他の手段によって断片に結合させ
うる。発現ベクター、特に選択ＤＮＡ断片を挿入して、
ここで発現制御配列に作用結合させるための選択部位は
各種の因子、たとえば特定制限酵素に感受性の部位の個
数、発現すべき蛋白の大きさ、宿主細胞酵素による蛋白
分解に対する所望蛋白の感受性、宿主細胞により発現さ
れて精製の際に除去するのが困難な蛋白の汚染もしくは
結合、発現特性、たとえばベクター配列に対する開始コ
ドンおよび停止コドンの位置、ならびに当業者に認識さ
れたその他の因子により決定される。ＤＮＡ配列のため
のベクターおよび挿入部位の選択はこれら因子のバラン
スによって決定され、必ずしも全ての選択が所定の場合
に同等に有効であるとは限らない。
【００３７】さらに、容易に分析しうる蛋白もしくはポ
リペプチドをコードする各種ＤＮＡ配列も、本発明に使
用することができる。たとえば、本発明の好適具体例に
おいてはβ−ガラクトシダーゼを使用する。なぜなら、
この蛋白の産生は周知の比色プレート分析を用いて容易
に監視しうるからである。さらに、たとえばガラクトキ
ナーゼもしくは薬品耐性の遺伝子、たとえばアンピシリ
ン耐性などを用いることもできる。
【００３８】最後に、本発明の方法ならびにこれにより
選択されかつ使用されるＤＮＡ配列は、任意の原核もし
くは真核蛋白もしくはポリペプチドに適用することがで
きる。これらのうちには、ヒトおよび動物リンホキン、
たとえばインタフェロン、インタロイキンおよびＴＮ
Ｆ、ヒトおよび動物ホルモン、たとえば成長ホルモンお
よびインシュリン、ヒトおよび動物血液ファクタ、たと
えばファクタＶＩＩＩおよびｔＰＡ、酵素、抗原ならび
に興味あるその他の蛋白およびポリペプチドがある。こ
こに説明する一好適具体例においては、本発明の方法を
用いてＳＭＣ様ポリペプチドの産生を最適化させた。
【００３９】
【実施例】本発明を一層充分に理解しうるよう、以下実
施例につき説明する。これらの実施例は例示の目的であ
って、決して本発明をこれら特定実施例に限定すると解
釈すべきでないことを了解すべきである。
【００４０】ＳＭＣ様ポリペプチドをコードするＤＮＡ
配列を持った組換ＤＮＡ分子の作成 次に図１を参照すれば、ここには組換ＤＮＡ分子（ｐＬ
ｃ２４ｍｕＳＭＣｏｒｉ）の製造方法の一具体例が概要
として示されており、これはｍｕから誘導されたＤＮＡ
配列に融合しかつｍｕからのシャイン・ダルガルノ配列
を有するヒトｆ−Ｍｅｔ−ＳＭＣをコードするＤＮＡ配
列を有し、この組合せＤＮＡ配列はバクテリオファージ
λから誘導されたＰ Ｌプロモータに作用結合されている
ことを特徴とする。
【００４１】ｐＬｃ２４ｍｕＳＭＣｏｒｉを作成するた
め、先ず報告されているヒトＳＭＣのアミノ酸配列〔リ
ンダークネヒトおよびハンブル、上記；Ｄ．Ｇ．クラッ
パー等、Ｅｎｄｏｃｒｉｎａｌ、第１１２巻、第２２１
５−２２１７頁（１９８３）〕を用いて１４種のオリゴ
デオキシヌクレオチドを合成した。（図１および図２の
配列１−１１、Ｘ、ＹおよびＺ参照）。合成には固相の
ホスホトリエステル法を用いた〔Ｈ．イトー等、ヌクレ
イック・アッシド・リサーチ、第１０巻、第１７５５−
１７６９頁（１９８２）〕。粗製オリゴマを除蛋白した
後、これらをセファデックスＧ−５０でのゲル濾過によ
って脱塩し、かつ尿素を含有する変性ポリアクリルアミ
ド調製用スラブゲルでの電気泳動によって精製した
〔Ｔ．マニアチス等、バイオケミストリー、第１４巻、
第３７８７−３７９４頁（１９７５）〕。ＵＶ分析によ
ってバンドの位置決定を行い、かつ電気溶出によってゲ
ルスライス物からオリゴデオキシヌクレオチドを単離し
た。次いで、ゲル精製したオリゴデオキシヌクレオチド
をＴ ４ポリヌクレオチドキナーゼによって燐酸化し、か
つ１５％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルにて再精製
し、電気溶出でＤＮＡを回収した〔Ｔ．マニアチス等、
モレキュラー・クローニング、コールド・スプリング・
ハーバー・ラボラトリー（１９８２）〕。これら１４種
のオリゴデオキシヌクレオチドは、寸法において１３塩
基から３７塩基まで変化した。
【００４２】これらの合成において、イー・コリの高度
発現した遺伝子におけるコドンの使用〔Ｒ．グランタム
等、ヌクレイック・アシッド・リサーチ、第８巻、第１
９８３−１９９２頁（１９８０）〕およびイー・コリｔ
ＲＮＡ発生〔Ｔ．イケムラ、ジャーナル・モレキュラー
・バイオロジー、第１５１巻、第３８９−４０９頁（１
９８１）〕を考慮した。さらに、各種の便利なエンドヌ
クレアーゼ認識部位を、これらオリゴヌクレオチド配列
に沿った種々の位置に含ませた。
【００４３】次いで、配列１−４ならびにＸ、Ｙおよび
Ｚと配列５−１１とを結合させ、かつこれらをケレノ−
ポリメラーゼで延長化させて２種の複合ＤＮＡ配列、す
なわち断片Ａとしての９８塩基対の平滑末端断片（「Ｓ
ＭＣ Ａ」）および断片Ｂとしての１３８塩基対の平滑
末端断片（「ＳＭＣ Ｂ」）を形成させた〔Ｊ．Ｒ．ロ
ッシ等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、
第２５７巻、第９２２６−９２２９頁（１９８２）〕
（図１および図２参照）。断片ＡはＳＭＣのＮ−末端を
コードし、かつ断片ＢはＳＭＣの残部をコードする（図
２）。
【００４４】配列１−４、Ｘ、ＹおよびＺのそれぞれ２
００ｐモルを２０μｌの再融合用緩衝液（５０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ ２）中
にて９５℃まで加熱することにより断片ＳＭＣ Ａを作
成し、次いでこの混合物を４℃まで徐々に冷却した。ジ
チオスレイトールとＡＴＰとＴ４ＤＮＡリガーゼとを最
終濃度５ｍＭ、７０μＭおよび２０μ／ｍｌまでそれぞ
れ添加し、次いでこの反応混合物を４℃にて１０時間培
養した。エタノール沈澱の後、この混合物を８％ポリア
クリルアミド／７Ｍ尿素ゲルに加え、かつ７７−および
７８−塩基対のストランドを溶出させた。次いで、各ス
トランド２５ｐモルを５μｌの再融合用緩衝液中にて組
合せ、反応混合物を９５℃まで加熱し、次いで１５℃ま
で徐々に冷却した。次いで、ジチオスレイトールとｄＮ
ＴＰとＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片とをそれぞれ
５ｍＭ、２５０μＭおよび２単位の濃度まで添加し、次
いで混合物を室温にて３０分間静置した。上記のように
反応生成物を精製し、かつ７ｐモルの９８塩基対ＳＭＣ
Ａを単離した。配列５−１１のそれぞれ２００ｐモル
を用いてほぼ同様な方法で、２０ｐモルの１３８塩基対
ＳＭＣ Ｂを作成した。
【００４５】次いで、これらの断片のそれぞれを、Ｂａ
ｍＨＩ（断片Ａにつき）ならびにＢａｍＨＩおよびＨｉ
ｎｄ III（断片Ｂにつき）で２μｇのＲＦ ＤＮＡを制
限することにより作成された平滑末端Ｍ１３ｍｐ８ベク
ターに挿入し、交差末端を４種のデオキシヌクレオシド
トリホスフェート（ｄＮＴＰ）の存在下に１単位のイー
・コリＤＮＡポリメラーゼ（クレノー断片）により修復
し、エタノールで沈澱させ、かつ牛腸内ホスファターゼ
（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．２）および０．２
ｍＭ ＥＤＴＡにおける２０単位）によって３０分間に
わたり５′−脱燐酸した〔Ｊ．メッシング、メソッズ・
イン・エンチモロジー、第１０１巻、第２０−７８頁
（１９８３）〕。結合させるため２０ｎｇの線状化した
ベクターと０．１ｐモルのＤＮＡ断片とを１０μｌの結
合用緩衝液および４０単位のＴ４ＤＮＡポリメラーゼに
おいて１５℃にて２４時間用いた（図１）。
【００４６】断片Ａを平滑末端のＭ１３ｍｐ８ベクター
に結合させて、ＳＭＣ断片の末端にＢａｍＨＩ部位を再
生成し、かつさらにＮｃｏＩ部位（ＧＧＡＴＣＣＡＴＧ
Ｇ）が生成した組換ファージを得た（ｍｐ８ＳＭＣ
Ａ）（図１）。断片Ｂを二重平滑末端Ｍ１３ｍｐ８ベク
ターに結合させて、ＳＭＣ断片の末端にＢａｍＨＩおよ
びＨｉｎｄ III部位を再生成した組換ファージ（ｍｐ８
ＳＭＣ Ｂ）を得た（図１）。
【００４７】次いで、これら組換ファージのそれぞれに
よりイー・コリＪＭ１０１〔Ｊ．メッシングおよびＪ．
ビエイラ、ジィーン、第１９巻、第２６９−２７６頁
（１９８２）〕を形質転換させ、そして形質転換宿主を
５−ブロモ−４−クロル−３−インドリル−β−ガラク
トピラノシド（Ｘ−ＧＡＬ）を含有するＬ−ブロスプレ
ートに塗抹した。次いで、ｍｐ８ＳＭＣ Ａおよびｍｐ
８ＳＭＣ Ｂで形質転換されたイー・コリＪＭ１０１の
２４個の白色プラークからファージＤＮＡを精製し、ジ
デオキシ−連鎖末端によりＤＮＡを配列決定した〔Ａ．
Ｊ．Ｈ．スミス、メソッズ・イン・エンチモロジー、第
６５巻、第５６０−５８０頁（１９８０）〕。次いで、
ｍｐ８ＳＭＣ Ａおよびｍｐ８ＳＭＣ Ｂから細胞内Ｒ
Ｆ ＤＮＡを作成し、前者をＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩで、
後者をＢａｍＨＩ／Ｈｉｎｄ IIIでそれぞれ切断し、か
つゲル電気泳動によってＳＭＣ関連断片を単離した（図
１）。
【００４８】次いで、２種の断片（ＳＭＣ ＡおよびＳ
ＭＣ Ｂ）をバクテリオファージｍｕ（Ｂ．アレット氏
の寄贈物）のｎｅｒ遺伝子からの６７塩基対断片と混合
した〔Ｇ．クレー等、ジィーン、第３２巻、出版中〕。
この断片はヌクレオチド１０４３−９６で構成され
〔Ｈ．プリース等、モレキュラー・ゼネラル・ジェネテ
ィックス、第１８６巻、第３１５−３２１頁（１９８
２）、図４〕。その前にはＥｃｏＲＩエンドヌクレアー
ゼ制限部位が存在し、かつ後にはＮｃｏＩ部位（ＣＣＡ
ＴＧＧ）が存在し、ＮｃｏＩ部位の内部ＡＴＧは翻訳開
始コドンを形成する。さらに、この断片はほぼ最適なリ
ボソーム結合部位をも有する〔Ｊ．シャインおよびＬ．
ダルガルノ、ネイチャー、第２５４巻、第３４−３８頁
（１９７５）〕。この結合の結果として、ｍｕ遺伝子断
片とＳＭＣ ＡとＳＭＣ Ｂとからなる３０３塩基対の
ＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ III断片を単離した（図１）。結
合は、ｍｕ断片のＮｃｏＩ部位のＡＴＧ開始コドンが直
接融合しかつ正確な読み枠内でＳＭＣ Ａに融合された
ようなものである（図１および図２）。
【００４９】この断片を、予めＥｃｏＲＩおよびＨｉｎ
ｄ IIIで制限されたｐＬｃ２４に導入し〔Ｅ．レムート
等、ジィーン、第１５巻、第８１−９３頁（１９８
１）〕、プラスミドｐＬｃ２４ｍｕＳＭＣｏｒｉを生成
させた。このプラスミドは、ＳＭＣ遺伝子とその開始Ａ
ＴＧコドンとをバクテリオファージλのＰ Ｌプロモータ
の制御下で有することを特徴とする（図１）。
【００５０】プラスミドｐＬｃ２４ｍｕＳＭＣｏｒｉを
用いるＳＭＣ様ポリペプチドの発現 ｐＬｃ２４ｍｕＳＭＣｏｒｉとｐｃＩ８５７、すなわち
Ｐ Ｌの温度感受性リプレッサをコードするｐＡＣＹＣ１
８４の誘導体〔Ｅ．レムート等、ジーン、第２２巻、第
１０３−１１３頁（１９８３）〕を用いてイー・コリＨ
Ｂ１０１を形質転換させた〔Ｔ．マニアチス等、モレキ
ュラー・クローニング（コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリー）（１９８２）〕。これら２種のプラ
スミドは異なる抗生物質耐性遺伝子、すなわちペニシリ
ナーゼ（ｐＬｃ２４ｍｕＳＭＣｏｒｉ）およびカナマイ
シン（ｐｃＩ８５７）を有するので、正確に形質転換さ
れた培養物は５０μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび４０
μｇ／ｍｌのカナマイシンで増殖させることにより選択
することができる。
【００５１】５０μｇ／ｍｌのアンピシリンと４０μｇ
／ｍｌのカナマイシンとを含有するＬ−ブロス中に、正
確に形質転換されたイー・コリＨＢ１０１（ｐＬｃ２４
ｍｕＳＭＣｏｒｉ）（ｐｃＩ８５７）を含有するプレー
トからの培養物５ｍｌを接種し、この培養物を２８℃に
て一晩増殖させた。次いで、２ｍｌの一晩培養物を４２
℃まで加温された１０ｍｌのＬ−ブロスに添加し、この
培養物を１００ｍｌの三角フラスコ中で４２℃にて２時
間にわたり激しく攪拌した。
【００５２】ＳＭＣ様ポリペプチドの産生につき分析す
るため、培養物１ｍｌ当りから細胞を遠心分離し（Ａ ５
５０＝２０）、かつこれらを５０μｌのＳＤＳ−β−メ
ルカプトエタノール溶解緩衝液〔Ｕ．Ｋ．レムリ、ネイ
チャー、第２２７巻、第６８０−６８５頁（１９７
０）〕において１０分間沸騰（１００℃）させることに
より溶解させた。次いで、市販の分析キット（ニコルス
・インスティチュート・ダイアグノスティックス社）を
用いる放射免疫分析により、全てのＳＭＣ活性を分析
し、その標準については精製ＩＧＦ−１（Ｒ．ハンブル
の寄贈物）を用いて予め証明した。分析用としてゲル電
気泳動用と同様に溶解物を含有するＳＭＣを作成し、こ
れを分析用緩衝液に少なくとも２０倍希釈し、かつ２反
復で分析した。標準溶解条件下で変性させたヒトＳＭＣ
はこのＲＩＡにおいて天然ホルモンと同様な反応性を有
することが観察された。
【００５３】この分析は、温度誘発に際しイー・コリＨ
Ｂ１０１（ｐＬｃ２４ｍｕＳＭＣｏｒｉ）（ｐｃＩ８５
７）が極めて少量のＳＭＣ活性（ＲＩＡにより１．４μ
ｇ／ｍｌ）を生成したことを示し、この量は蛋白ゲルに
おけるクーマシー青染色によって検出しえない量であ
る。従って、この形質転換宿主におけるＳＭＣ様ポリペ
プチド産生のレベルは細胞１個当り僅か数１００分子で
あると推定された。
【００５４】ＳＭＣ様ポリペプチドの産生を向上させる
試み ｐＬｃ２４ｍｕＳＭＣｏｒｉを用いるＳＭＣ様ポリペプ
チド産生のレベルが極めて低かったので、向上したレベ
ルの発現を有する他の各種のプラスミドを作成すべく試
みた。
【００５５】一つの方法において、他の蛋白をコードす
るＤＮＡ配列に融合されたＳＭＣをコードするＤＮＡ配
列を備えた発現ベクターを作成した。この方法におい
て、アミノ末端における非ＳＭＣ蛋白とカルボキシ末端
におけるＳＭＣ様ポリペプチドとよりなる融合蛋白を作
成した。この融合蛋白は前記ベクターから高収率で産生
されうるが、これらは動物およびヒト治療においてｆ−
ｍｅｔ−ＳＭＣまたはＳＭＣ自身程好適でない。その結
果、最も有利な使用には、この融合蛋白は非−ＳＭＣ蛋
白をこれらから除去する追加処理を必要とする。この種
の方法は公知であるが（たとえば米国特許第４４２５４
３７号、第４３３８３９７号および第４３６６２４６号
参照）、これらは直接的分泌および成熟の場合を除いて
所望のＳＭＣ様ポリペプチドの直接的発現ほど好適でな
い。
【００５６】従って、ＳＭＣ様ポリペプチドの産生を向
上させる第２の試みにおいて、牛成長ホルモンおよび豚
成長ホルモンの発現レベルを向上させるのに有用である
ことが証明されている削除技術を採用した〔たとえば、
ヨーロッパ特許出願第１０３３９５号および第１０４９
２０号参照〕。これらの方法を用いてＳＭＣ様ポリペプ
チドを産生し、アミノ端末の欠失を特徴とする各種の改
変ＳＭＣコード配列を作成した。たとえば、ｆ−Ｍｅｔ
−Δ３−ＳＭＣおよびｆ−Ｍｅｔ−Δ６−ＳＭＣを産生
する発現ベクターを作成した。これら改変ＳＭＣの産生
レベルはベクターｐＬｃ２４ｍｕＳＭＣｏｒｉからのｆ
−Ｍｅｔ−ＳＭＣの産生レベルより若干高いものであっ
たが、この発現レベルはまだ極めて低いものである。
【００５７】最後に、第３の方法としてプロモータとリ
ボソーム結合部位との各種組合せを用いて、ＳＭＣコー
ド配列の発現を制御した。しかしながら、何れにせよ、
これらの改変はＳＭＣ産生の点でｐＬｃ２４ｍｕＳＭＣ
ｏｒｉよりも貧弱であった。
【００５８】ＳＭＣ様ポリペプチドの産生をコード化す
る最適ＤＮＡ配列の選択 上記２種の方法は何れも成功せずあるいは多くの場合Ｓ
ＭＣ様ポリペプチドの大して好適でない産生をもたらし
たので、任意の蛋白の産生をコードする最適配列、より
詳細にはＳＭＣ様ポリペプチドの産生をコードする最適
ＤＮＡ配列を選択しうるような方法を設計することに決
定した。
【００５９】この方法は、遺伝子のＮ−末端部分をコー
ドするＤＮＡ配列およびこの実施例に記載した特定具体
例においては、ｆ−Ｍｅｔ−ＳＭＣをコードする遺伝子
における暗黙の突然変異が改良されたＲＮＡ二次構造を
与え、従って選択宿主においてより高レベルの発現をも
たらしうるという本発明の仮説に基づいている。しかし
ながら、最適コード配列を選択するには発現に際し存在
するどの作用を決定するかにつき分析せねばならない多
くの可能な暗黙突然変異が存在するため、これら配列に
対する迅速かつ簡単なスクリーニング法を設計する必要
がある。このような方法がなければ、クローンのスクリ
ーニングは全く不可能でないとしても面倒であり、その
方法は失格である。
【００６０】ｌａｃＺとの遺伝子融合体を予め使用し
て、それら遺伝子生産物を分析せずに蛋白の産生を監視
した〔Ｌ．グアレンテ等、セル、第２０巻、第５４３−
５５３頁（１９８０）；Ｂ．Ａ．カスチルホ等、Ｊ．バ
クテリオロジー、第１５８巻、第４８８−４９５頁（１
９８４）〕。さらに、β−ガラクトシダーゼ産生は、比
色プレート分析によって容易に監視することができる。
従って、このスクリーニング法を用いて本発明による最
適ＤＮＡコード化配列を選択することに決定した。勿
論、好適ではないにせよ、他のスクリーニング法も本発
明の最適ＤＮＡ配列を選択する際に用いうることを了解
すべきである。
【００６１】本発明による方法のこの実施例にてＳＭＣ
コード化配列の二次構造を変化させるため、ＳＭＣのア
ミノ酸２−６をコードする２５６種の可能なＤＮＡ配列
からなる一連の合成リンカを作成した。ＳＭＣのアミノ
酸２−６は２５６種の異なる配列によってコードされう
るが、フェニルアラニンをコードするＴＴＹを含め全て
の可能なロイシンコドン（ＳＭＣ位置５）を可能にする
５１２倍の縮退リンカを使用した（図３）。勿論、本発
明の方法にはそれより長いまたは短いオリゴヌクレオチ
ドも使用しうることを了解すべきである。たとえば、Ｓ
ＭＣアミノ酸２０までをコードするような長い合成リン
カを、ＳＭＣの発現に際しこれらの長い配列の作用を決
定するために有利に使用することができる。これら一連
の５１２−リンカの余分なＤＮＡ配列を図３に示す。
【００６２】図３を参照して、ここにはＳＭＣ産生にお
けるこれら余分なＤＮＡ配列を用いる方法の一具体例が
図示されている。図３に示したように、先ず最初にｐＬ
ｃ２４ｍｕＳＭＣｏｒｉの１６５塩基対のＥｃｏＲＩ−
ＢａｍＨＩ断片をＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ切断されたｐ
ＵＣ８にサブクローン化して、ｌａｃＺとＳＭＣとの間
のＢａｍＨＩ部位における相内融合を生ぜしめた。この
ベクターをｐＵＣｍｕＳＭＣ Ａｏｒｉと呼ぶ（図
３）。ｐＵＣ８を選択した理由は、その小さい寸法およ
びｌａｃＺを中断するその独特な制限部位ならびにそれ
がｌａｃＩ ‐宿主に使用され得るからである。しかしな
がら、ｌａｃＺ遺伝子を有する他のプラスミドもこのス
クリーニング法に用いうることを了解すべきである。
【００６３】ＳＭＣコード配列をｌａｃＺ遺伝子のプロ
モータ近接領域に挿入して融合体を作成したので、この
ハイブリッド遺伝子の発現はｐＵＣ８のｌａｃプロモー
タの制御下にある。
【００６４】リボソームは、ｌａｃリボソーム結合部位
において、ｐＵＣｍｕＳＭＣ Ａｏｒｉでの翻訳を開始
することができる。しかしながら、この種の翻訳はｐＬ
ｃ２４ｍｕＳＭＣｏｒｉから誘導されたｍｕ断片の枠内
停止コドンにて急速に停止する。あるいはこれらリボソ
ームはｍｕリボソーム結合部位で翻訳を開始して、ＳＭ
Ｃからのアミノ末端部分とｌａｃＺからのカルボキシ末
端部分とよりなる融合蛋白を生成することもできる。ｐ
ＵＣｍｕＳＭＣｏｒｉにおけるＳＭＣ−β−ガラクトシ
ダーゼ融合体は、Ｎ−末端にＳＭＣの３５個のアミノ酸
を含有した。
【００６５】ｐＵＣｍｕＳＭＣ Ａｏｒｉにおける融合
遺伝子は相内にあるが、イー・コリＪＭ８３〔Ｊ．ビエ
イラおよびＪ．メッシェング、ジィーン、第１９巻、第
２５９−２６８頁（１９８２）〕をプラスミドでトラン
スフェクトしかつ形質転換宿主を５−ブロモ−４−クロ
ル−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ
−ＧＡＬ）を含有するＬＢ−寒天板で培養した際、３７
℃にて１６時間後に白色コロニーのみが観察された。こ
れらのコロニーは４０時間後に最終的に極めて淡い青色
となったが、１６時間後におけるその白色はこれらが極
めて少量のＳＭＣ−β−ｇａｌ融合蛋白しか産生しなか
ったことを示している。勿論、この結果はｐＬｃ２４ｍ
ｕＳＭＣｏｒｉにおける低発現レベルという本発明者等
の従前の観察と一致する。
【００６６】次いで、プラスミドｐＵＣｍｕＳＭＣ Ａ
ｏｒｉ中へ、ＳＭＣのアミノ酸２−６をコードする５１
２倍縮退合成ＤＮＡリンカ（ＡｖａＩＩ−ＨａｅＩＩ断
片）よりなる各保存物を、原プラスミドにおけるこれら
アミノ酸のコード配列に対する置換体として導入した。
リンカ結合体を回避するため、結合前にこれらリンカを
燐酸化しなかった。これらの配列をプラスミドｐＵＣｍ
ｕＳＭＣ Ａｏｒｉ中に導入し、その際各配列をｍｕリ
ボソーム結合部位とＳＭＣアミノ酸１（ｐＵＣｍｕＳＭ
Ｃ Ａｏｒｉの７０ｂｐ ＥｃｏＲＩ−ＡｖａＩＩ断
片）とをコードする断片およびＳＭＣのアミノ酸７−３
２をコードする断片（ｐＵＣｍｕＳＭＣＡｏｒｉの７１
ｂｐ ＨａｅＩＩ−ＢａｍＨＩ断片）と結合させ、次い
で得られたＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ組合せ断片をＥｃｏ
ＲＩ−ＢａｍＨＩ制限ｐＵＣｍｕＳＭＣ Ａｏｒｉに導
入した（図３参照）。
【００６７】上記プラスミドの混合体で形質転換させた
イー・コリＪＭ８３の５０００個のコロニーをＸ−ＧＡ
Ｌを含有するＬ−ブロス板に塗抹した。得られたコロニ
ーの約１０％は、３７℃にて４０時間後にｐＵＣ８ｍｕ
ＳＭＣ Ａｏｒｉよりも暗青色であった。次いで、５０
００個のコロニーのうち１４個（青色および白色の両
者）（イー・コリＪＭ８３（ｐＵＣｍｕＳＭＣ Ａ１−
１４））を各種の方法で分析した。すなわち、縮退領域
のＤＮＡ配列決定、β−ガラクトシダーゼの酵素活性、
およびイー・コリＣ６００におけるＳＭＣ発現〔Ｔ．マ
ニアチス等、モレキュラー・クローニング（コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー）（１９８
２）〕。これらの分析は各ｐＵＣｍｕＳＭＣ Ａ１−１
８の１６５ｂｐＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＬｃ２
４ｍｕＳＭＣｏｒｉ中に置換した後に行った。これら後
者のプラスミドを、図３においてｐＬｃ２４ｍｕＳＭＣ
１−１８と呼ぶ。分析用に選択した１４個のコロニーの
うち、１０個は青色であり、４個はＸ−ＧＡＬ板上で白
色であった。表１はこれら各種の分析の結果を示してい
る。
【００６８】
【表１】
【００６９】＊ β−ガラクトシダーゼ活性について
は、Ｊ．Ｈ．ミラーによりエキスペリメンツ・イン・モ
レキュラー・ジェネティックス（コールド・スプリング
・ハーバー・ラボラトリース出版）（１９７２）に実質
的に記載されたようにＯ−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガ
ラクトシド（ＯＮＰＧ）を用いて分析した。
【００７０】表１に示したように、ｐＵＣ８ｍｕＳＭＣ
Ａ１−１０を含有する青色コロニーは、イー・コリＪ
Ｍ８３（ｐＵＣ８ｍｕＳＭＣ Ａｏｒｉ）よりも２．５
〜８倍多いβ−ガラクトシダーゼ単位を生成した。これ
に対し、ｐＵＣｍｕＳＭＣＡ１１−１４を含有する白色
コロニーは、検出しうるβ−ガラクトシダーゼを生成し
なかった。驚くことにｐＵＣ８ｍｕＳＭＣ Ａ１−１０
のβ−ガラクトシダーゼ生成は原プラスミドのそれより
も２．５〜８倍高かったが、これらプラスミドからのＥ
ｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＬｃ２４ｍｕＳＭＣｏｒ
ｉに挿入した際、これらプラスミドはイー・コリＨＢ１
０１において原プラスミドにおけるよりも２３〜４６倍
多いＳＭＣ活性を与えた。さらに、所定の融合体に対す
るβ−ガラクトシダーゼ単位とＰ Ｌ制御下における対応
の発現に対するＳＭＣのマイクログラムとの間には明ら
かな特異的相関関係が存在しなかった。しかしながら、
Ｘ−ＧＡＬ板におけるこれらコロニーの青色／白色の差
は、ＳＭＣの高度発現をコードするＤＮＡ配列の選択を
簡単に可能にした。したがって、この方法を一般的に使
用して、任意所望の真核もしくは原核ポリペプチドの産
生につき最適なＤＮＡ配列を選択することができる。
【００７１】特定理論に拘束されるものでないが、本発
明による縮退ＤＮＡ配列により示される発現レベルの差
はＳＭＣのＮ−末端アミノ酸をコードするヌクレオチド
のＲＮＡ二次構造に関連すると思われる。たとえば、本
発明による結果は、スレオニン−ロイシンに対するコド
ン（ＡＣＮ−ＣＴＮ）により形成される可能なＣＣＣ
（ＳＭＣ位置４および５）がＳＭＣ合成に対し特に悪影
響があることを示している。ここで分析した白色コロニ
ーおよびｐＵＣｍｕＳＭＣｏｒｉは全てｐＬｃ２４ｍｕ
ＳＭＣにおけるリボソーム結合部位に対し水素結合を形
成しうるこの配列を特徴とする。
【００７２】上記本発明の実施例においては、Ｎ−末端
にＳＭＣの３５個のアミノ酸を有する融合蛋白を産生す
るような所望の蛋白−ｌａｃＺ融合体をコードするＤＮ
Ａ配列を使用したが、融合蛋白における２つの部分の相
対的長さはこの方法における最も有効なスクリーニング
につき実験的に決定せねばならない。この実験結果は、
この選択を可能にすると考えられるいくつかのファクタ
を確認した。たとえば、リボソーム結合部位の強度が重
要である。ｍｕからのものでなくｔｒｐリボソーム結合
部位を使用すると、ＳＭＣの３５個のアミノ酸を含有す
る融合体は青色コロニーを生成しなかった。融合蛋白に
おけるβ−ガラクトシダーゼと選択蛋白との相対的割合
も重要である。たとえば、Ｎ−末端に１４個のみのＳＭ
Ｃアミノ酸を有する融合蛋白を生成した遺伝子融合体
は、青色／白色の選択を可能にしなかった。この場合、
融合蛋白のβ−ガラクトシダーゼ活性が高過ぎて、最適
Ｎ−末端コード配列の検出を可能にしなかったことが明
らかである。最後に、検出系の感度も重要である。この
スクリーニング法で有用なβ−ガラクトシダーゼ活性範
囲は、原ｐＵＣ８により生成されるβ−ガラクトシダー
ゼレベルの１〜８％であることを確認した。これらファ
クタならびに上記のように同様に決定しうるファクタを
相応に考慮して、当業者は適当な融合蛋白ならびにここ
に説明した方法によるスクリーニング分析を本発明の範
囲を逸脱することなく選択することができる。
【００７３】上記実施例で産生された特定のＳＭＣ様ポ
リペプチドはｆ−Ｍｅｔ−ＳＭＣであるが、各種の可能
な手段によってこのＳＭＣからｆ−Ｍｅｔを除去しうる
ことも了解すべきである。
【００７４】本発明の方法により産生されるＳＭＣ様ポ
リペプチドは、常法を用いて医薬上有用な組成物に配合
することができる。これらの組成物は、所望の組織成長
刺戟を行うのに医薬上有効量のＳＭＣ様ポリペプチド
と、好ましくは医薬上許容しうるキャリヤとからなって
いる。適するキャリヤは周知されている。上記したよう
に、これら組成物は組織成長を刺戟する方法、ならびに
矮小発育症、筋肉アトロピー、骨折、外傷あるいは組織
に対するその他の傷を治療するのに有用である。
【００７５】ここに説明した方法で作成された微生物お
よび組換ＤＮＡ分子は、１９８５年３月２３日付けで西
ドイツ、ゲッチンゲン在、ドイッチェ・ザンムルンク・
フォン・ミクロオルガニスメンの培養物寄託機関に寄託
して、ＳＭＣ−１およびＳＭＣ−２として同定された培
養物により例示される。
【００７６】 ＳＭＣ−１：イー・コリＨＢ１０１（ｐｃＩ８５７） （ｐＬｃ２４ｍｕＳＭＣｏｒｉ） ＳＭＣ−２：イー・コリＨＢ１０１（ｐｃＩ８５７） （ｐＬｃ２４ｍｕＳＭＣ８） これらの培養物はそれぞれＤＳＭ３２７６および３２７
７の受託番号が付与された。
【００７７】以上、本発明を多くの実施例につき説明し
たが、この基本構成を改変して本発明の方法および構成
を利用する他の実施例を提供しうることが了解されよ
う。従って、本発明の範囲は、例示した上記特定実施例
のみに限定されないことが了解されよう。
【図面の簡単な説明】
【図１】概要においてｆ−Ｍｅｔ−ＳＭＣをコードする
合成ＤＮＡ配列ならびにｍｕおよびＰ Ｌプロモータから
誘導される配列の下流に前記ＤＮＡ配列を有するプラス
ミドｐＬｃ２４ｍｕＳＭＣｏｒｉの一つの製造方法を示
す概要図である。
【図２】ｆ−Ｍｅｔ−ＳＭＣをコードする合成ＤＮＡ配
列を製造するための本発明による方法の１実施例に使用
する２種の断片〔ＳＭＣ Ａ（断片Ａ）およびＳＭＣＢ
（断片Ｂ）〕の合成ヌクレオチド配列（両者ともストラ
ンド）を示し、さらにこの図２はこれら断片を製造する
ために使用する断片ＳＭＣ ＡおよびＳＭＣＢならびに
各種のオリゴヌクレオチド配列１−１１、Ｘ、Ｙおよび
Ｚのアミノ酸配列をも示す配列図である。
【図３】概要においてプラスミドｐＵＣｍｕＳＭＣ Ａ
ｏｒｉ、ｐＵＣｍｕＳＭＣ Ａ１−１８およびｐＬｃ２
４ｍｕＳＭＣ１−１８の一製造方法を示し、図３の中央
に図示された５１２倍縮退した合成リンカの配列におい
て「Ｎ」は４種の全ての塩基の可能性を示し、「Ｐ」は
プリンを示しかつ「Ｙ」はピリミジンを示す概要図であ
る。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 発現のためにＤＮＡ配列によりコードさ
    れたＳＭＣ様ポリペプチドにおいて、前記ＤＮＡ配列
    が、ｐＬＣ２４ｍｕＳＭＣ１〜ｐＬＣ２４ｍｕＳＭＣ１
    ０のＤＮＡ挿入物から選択されることを特徴とするＳＭ
    Ｃ様ポリペプチド。
  2. 【請求項２】 組換ＤＮＡ分子により形質転換された単
    細胞宿主を培養する工程を特徴とするＳＭＣ様ポリペプ
    チドの産生方法において、前記組換ＤＮＡ分子が、ｐＬ
    Ｃ２４ｍｕＳＭＣ１〜ｐＬＣ２４ｍｕＳＭＣ１０よりな
    る群から選択されることを特徴とするＳＭＣ様ポリペプ
    チドの産生方法。
  3. 【請求項３】 前記単細胞宿主が、イー・コリ、シュー
    ドモナス、バチルス、ストレプトミセス、酵母、その他
    の真菌類の菌株、動物細胞及び植物細胞よりなる群から
    選択されることを特徴とする請求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】 形質転換された単細胞宿主が、イー・コ
    リＨＢ１０１（ｐｃＩ８５７）（ｐＬＣ２４ｍｕＳＭＣ
    ８）であることを特徴とする請求項３記載の方法。
  5. 【請求項５】 請求項２記載の方法により産生されたＳ
    ＭＣ様ポリペプチド。
  6. 【請求項６】 組織成長刺戟剤として有効量の請求項５
    記載の方法により産生されたＳＭＣ様ポリペプチドと、
    医薬上許容し得るキャリヤとからなることを特徴とする
    医薬組成物。
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