JPH0141312B2 - - Google Patents

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JPH0141312B2
JPH0141312B2 JP58126808A JP12680883A JPH0141312B2 JP H0141312 B2 JPH0141312 B2 JP H0141312B2 JP 58126808 A JP58126808 A JP 58126808A JP 12680883 A JP12680883 A JP 12680883A JP H0141312 B2 JPH0141312 B2 JP H0141312B2
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lys
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ser
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phe
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JP58126808A
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Emu Kuroru Robaato
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F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
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Publication of JPH0141312B2 publication Critical patent/JPH0141312B2/ja
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    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
現在、形質転換微生物による、真核生物蛋白の
発現効率は、種々の要因によつて影響を受けるこ
とが知られている。蛋白発現を規定し、支配して
いる、最も重要な要因の中の２つとして、
mRNAに挿入された遺伝子を細菌細胞が転写す
る正確さ、と、細菌のリボゾームにより、この
mRNAが翻訳される効率を挙げることができる。
一般に発現という言葉で知られている、転写と翻
訳の効率は、ベクターDNA上の、クローン化さ
れた遺伝子の前に、定型的に位置する、ヌクレオ
チド配列に依存していると信じられている。これ
らの発現制御配列には、大部分、RNAポリメラ
ーゼと相互作用して、転写を開始するプロモータ
ー／オペレーター部位と、リボゾームが結合し、
mRNAと相互作用のもとに、蛋白への翻訳を開
始する、リボゾーム結合部位（RBS）とが含ま
れている。 プラズミド上に自然に存在するものとは異なつ
た、各種の発現制御配列を用いて、先行技術で真
核生物の蛋白及び細菌宿主中でのポリペプチド類
の発現の制御方法が改良されてきた。これらの例
としては、大腸菌の乳糖オペロンの、オペレータ
ー、プロモーター、リボゾーム結合並びに相互作
用配列の利用、大腸菌のトリプトフアン合成酵素
系の相当する配列及び、バクテリオ フアージ
λ（ラムダ）の主要オペレーター及びプロモータ
ー領域〔H.Bernard et al.，Gene ５，59−76
（1979）〕の利用を挙げることができる。 ラムダ フアージのプロモーターを、原核生物
中にクローン化した真核生物及び原核生物蛋白の
発現に利用してきた。PLのプロモーター活性が
温度感受性リプレツサーを規定する温度感受性遺
伝子の存在下で低温で抑制されるが、原核生物の
蛋白を発現する際には熱誘導で活性化できること
がわかつた。このプロモーター系を利用する、先
行技術の例は、1981年４月１日提出のヨーロツパ
特許出願81301413.1及び、Derynck等のNature
287，193−197（1980）の論文である。これらの
参考資料では、PLプロモーター系を、繊維芽細
胞インターフエロンの如き真核生物蛋白の発現
に、全細菌リボゾーム結合部位と共に利用した。
大腸菌で真核生物の遺伝子を発現するために、真
核細胞遺伝子上の適当な調節信号が欠除している
ことを克服する目的で、２つの研究方法が組み換
えDNA技術を利用して用いられてきた。即ち(1)
細菌遺伝子のコードしている部位、即ち、β−ラ
クタマーゼ遺伝子、内に、真核細胞遺伝子のコー
ドする配列を挿入し、大腸菌遺伝子の全RBSを
利用する方法、或いは、(2)Shine−Dalgarns
（SD）配列、SD配列に近接する（5′−方向に上
流側）配列およびAUG開始コドンと真核細胞
DNAに由来する残りのコード配列より成るいわ
ゆるハイブリドRBSを構築することである。SD
配列は塩基が、真核生物遺伝子のためのプロモー
ターと、翻訳開始信号の間に位置していて、16S
リボゾームRNAの3′−末端にある塩基に対し相
補的であるような、３から９塩基より成る配列の
ことである。初めの方法の主な欠点は、融合ポリ
ペプチドの生産を来たすこと、即ち、遺伝子生成
物の一部が、大腸菌DNAそして一部が真核生物
DNAによりコードされるということである。第
二の方法で、真正で成熟した（プリ配列の付加さ
れていない、完全で生物学的に活性な）、天然に
生産される、即ち、真核細胞で生産されるものと
同一の遺伝子生産物を作ることに成功した
〔Deron et al.，Gene 17，54−55（1982）；及び
Gheysen et al.，Gene 17，55−63（1982）〕。 現在まで、両方法を使つて、白血球、繊維芽細
胞、及び免疫、の如き種々のヒト インターフエ
ロン種の発現が試みられてきた。繊維芽細胞イン
ターフエロン（IFN−β）を発現させる研究で、
上述のGheysen等はPLプロモーター系と共に第一
の方法（全細胞RBS）を利用した。この文献に
は生物学的に活性で、非融合蛋白が得られたとあ
るが、そのIFN−β遺伝子が、適当な翻訳開始配
列を持つていない以上、融合IFN−β蛋白が、細
胞内で未知の非効率的機構による細胞の処理工程
の結果得られたものであることは明白である。更
にこの文献から明らかなことは、真核生物遺伝子
産物が、真核生物遺伝子の信号部分によりコード
されたアミノ酸配列を含んでいたことである。従
つて成熟形インターフエロンは発現されていな
い。 以下の文献、Gray et al.，Nature 295，503
−508（1982）、及びShepard et al.，DNA １，
125−131（1982）、では、第二の方法“ハイブリド
RBS”が用いられている。しかしながら、これ
らの文献からも解るように、発現は大腸菌のtrp
プロモーターの支配下にあり、ハイブリドRBS
は真核生物遺伝子のATGとSD及びtrpリーダー
のリンカー配列由来であつた。更に、この両文献
では、SD配列とSD配列に近接（5′−方位で上
流）の配列は、未変化のまゝ残つた。唯一の変化
は、リンカー領域にあつた。即ち、SD配列と
ATGコドン間のヌクレオチドの数と組成の変化
である。 先行技術では、クローン化した真核生物遺伝子
の発現を選択的に増加させるに必要な融通性のあ
るハイブリド リボゾーム結合部位をデザインし
組上げる方法が欠けていた。更に先行技術では、
温度感受性プロモーター系を使い、融合蛋白の独
立した細胞処理工程を使わずに、クローン化した
真核生物遺伝子蛋白を、成熟した形で発現される
制御法が欠けていた。 本発明は、前述のような従来技術の欠点を克服
するものであり、以下の(1)発現ベクターおよび(2)
この発現ベクターで形質転換したE.coli株に関す
る。 (1) バクテリオフアージλに由来するPLプロモ
ーターおよびOLオペレーター、ヒト成熟免疫
インタフエロンをコードするDNA配列および
前記プロモーターの下流域にあり、かつ前記イ
ンタフエロンをコードするDNA配列の上流域
に結合したハイブリツド リボゾーム結合部位
を含み、このハイブリツド リボゾーム結合部
位が次式、
TTAAAAATTAAGGAGGAATTCATG；
または
TTAAAAATTAAGGAGGAATTAATTCA
ＴＧ により示されるDNA配列を含有する、発現ベ
クター。 (2) バクテリオフアージλに由来するPLプロモ
ーターおよびOLオペレーター、ヒト成熟免疫
インタフエロンをコードするDNA配列および
前記プロモーターの下流域にあり、かつ前記イ
ンタフエロンをコードするDNA配列の上流域
に結合したハイブリツド リボゾーム結合部位
を含み、このハイブリツド リボゾーム結合部
位が次式、
TTAAAAATTAAGGAGGAATTCATG；
または
TTAAAAATTAAGGAGGAATTAATTCA
ＴＧ により示されるDNA配列を含有する発現ベク
ターで形質転換されたE.coli株。本発明のイン
タフエロン発現ベクターは以下の方法によるイ
ンタフエロン製造に有用である。 ａ 宿主生物を上記の発現ベクターで形質転換
し、λバクテリオフアージ由来の変異cIリプ
レツサー遺伝子は温度感受性リプレツサ蛋白
をコードするものであり、 ｂ ステツプａの発現ベクターによりコードさ
れているインターフエロンを生産するような
培地で形質転換生物を生育させ、 ｃ 生物を溶菌し、 ｄ 生成した溶菌物からインターフエロンを回
収することを含む方法である。 本発明の好ましい実施態様では、発現ベクター
か或いは、宿主が、染色体上に、λバクテリオフ
アージ由来の、変異cIリプレツサー遺伝子を含
み、その変異遺伝子は、温度感受性リプレツサー
蛋白をコードしている。また、上記で規定した如
きインターフエロンの生産工程では、宿主を、変
異リプレツサー遺伝子を発現させることができ、
又、ステツプ(a)の発現ベクターと充分に共存でき
る、別の複製可能なベクターで形質転換すること
により、該変異リプレツサー遺伝子をその宿主に
供給することができる。 上記操作のステツプ(b)の後、細胞を衆知の方法
で集め、緩衝液にけん濁した後溶菌する。こゝで
用いられる溶菌という言葉は、宿主の細胞壁を開
くための操作を示すもので、好ましくは酵素的に
行なわれるが超音波的、機械的或いは同業者に知
られ、又用いられている他のいかなる方法によつ
ても行われる。インターフエロンは、同業者によ
り知られるたん白精製の手法、例えば電気泳動或
いはクロマトグラフイー（たとえば抗体アフイニ
テイー クロマトグラフイー）、により溶菌液よ
り回収される。本発明で好ましい遺伝子はヒト免
疫インターフエロンの成熟型をコードし、即ちプ
レ配列を有していないものである。 本明細書および特許請求の範囲に用いられる略
語および用語は特に説明のない限り、同業者に一
般に用いられ、知られているものである。 本発明に係るヒト免疫インターフエロンは次の
DNA配列によりコードされる。 （5′） TGT TAT TGT CAG GAC CCA
TAT GTA AAA GAA GCA GAA AAC CTT AAG AAA TAT
TTT AAT GCA GGT CAT TCA GAT GTA GCG GAT AAT
GGA ACT CTT TTC TTA GGC ATT TTG AAG AAT TGG
AAA GAG GAG AGT GAC AGA AAA ATA ATG CAG AGC
CAA ATT GTC TCC TTT TAC TTC AAA CTT TTT AAA
AAC TTT AAA GAT GAC CAG AGC ATC CAA AAG AGT
GTG GAG ACC ATC AAG GAA GAC ATG AAT GTC AAG
TTT TTC AAT AGC AAC AAA AAG AAA CGA GAT GAC
TTC GAA AAG CTG ACT AAT TAT TCG GTA ACT GAC
TTG AAT GTC CAA CGC AAA GCA ATA CAT GAA CTC
ATC CAA GTG ATG GCT GAA CTG TCG CCA GCA GCT AAA
ACA GGG AAG CGA AAA AGG AGT CAG ATG CTG
TTT CGA GGT CGA AGA GCA TCC CAG −Ｘ （3′） （） 但し、ＸはTAA，TGA或いはTAGである。 上記DNA配列の5′末端には5′ATG AAA
TAT ACA AGT TAT ATC TTG GCT
TTT CAG CTC TGC ATC GTT TTG
GGT TCT CTT GGC 3′ （）或いはメチオ
ニンをコードするATGトリプレツトが存在して
もよく、その場合もＮ末端にそれぞれMet−Lys
−Tyr−Thr−Ser−Tyr−Ile−Leu−Ala−Phe
−Gln−Leu−Cys−Ile−Val−Leu−Gly−Ser−
Leu−Glyのプレ配列或いはメチオニンが結合し
た免疫インターフエロンを発現する。発現ベクタ
ー上で免疫インターフエロンをコードするDNA
配列は適当なプロモーターオペレーター配列の下
流域にSD配列を介して結合している。 ATG開始シグナルを含む前述のDNA配列に
よりコードされるヒト免疫インターフエロンたん
白は次のアミノ酸配列を有する。 H2N−Met−Cys−Tyr−Cys−Gln−Asp−Pro
−Tyr−Val−Lys−Glu−Ala−Glu−Asn
−Leu−Lys−Lys−Tyr−Phe−Asη−
Ala−Gly−His−Ser−Asp−Val−Ala−
Asp−Asn−Gly−Thr−Leu−Phe−Leu
−Gly−Ile−Leu−Lys−Asn−Trp−Lys
−Glu−Glu−Ser−Asp−Arg−Lys−Ile
−Met−Gln−Ser−Gln−Ile−Val−Ser
−Phe−Tyr−Phe−Lys−Leu−Phe−
Lys−Asn−Phe−Lys−Asp−Asp−Gln
−Ser−Ile−Gln−Lys−Ser−Val−Glu−
Thr−Ile−Lys−Glu−Asp−Met−Asn−
Val−Lys−Phe−Phe−Asn−Ser−Asn
−Lys−Lys−Lys−Arg−Asp−Asp−
Phe−Glu−Lys−Leu−Thr−Asn−Tyr
−Ser−Val−Thr−Asp−Leu−Asn−
Val−Gln−Arg−Lys−Ala−Ile−His−
Glu−Leu−Ile−Gln−Val−Met−Ala−
Glu−Leu−Ser−Pro−Ala−Ala−Lys−
Thr−Cly−Lys−Arg−Lys−Arg−Ser−
Gln−Met−Leu−Phe−Arg−Gly−Arg
−Arg−Ala−Ser−Gln−OH （） 又、本発明の実施に於いてはATG開始シグナ
ルでコードされる第一のアミノ酸であるメチオニ
ンは発現した後微生物により切断されることも考
えられる。 ヒト インターフエロンβおよびインターフエ
ロンα（いろいろの種）を限定するアミノ酸配列
はそれらをコードする対応DNA配列と共に既に
報告されており、同業者によく知られている。 本発明によれば、インターフエロンをコードす
るDNA配列はプラズミド或いはクローニングベ
クターのDNAに挿入され、組み換えDNA配列を
形成し、それを用いて、通常の方法により宿主を
形質転換する。本発明によると、形質転換した宿
主は、好ましくは試験管内実験で、クローン化さ
れる。 本発明による発現ベクターはさらにハイブリツ
ドRBSをコードするDNA配列を含む。宿主細胞
において翻訳を開始するために必要なRBSは、
(1)アミノ酸メチオニンに対する翻訳開始コード
ATG（E.coliの遺伝子生成物で知られるものは全
て、アミノ酸メチオニンで始まり、これは後に切
断されることもされないこともある。）、(2)16Sリ
ボゾームRNAの3′末端に相補的な塩基で、SD配
列として知られる３個から９個の塩基の配列、お
よび(3)リンカー部位として知られるこれら２つの
間の塩基配列とから成る。 例えば、E.coliのlac Ｚ遺伝子の最初の配列は
ACAGGAAACAGCT〔ATG〕−。下線を引いた
配列がSD配列で、これはATGトリプレツトから
７塩基離れている。SD配列とATGトリプレツト
との間のリンカー部位の長さは遺伝子により５か
ら16塩基と異なり、この距離とたん白発現の程度
との間に相関関係があるようである。さらに、リ
ンカー部位の配列も又発現の程度に大きく影響す
ることが出来る。その上、SD配列自体の性質だ
けでなくそれに接するDNA配列およびATG開始
コードもmRNAの効率よい翻訳にとつて重要で
あることがわかつている。 本発明のハイブリツドRBSは天然に存在する
RBSとDNA配列の長さおよび／又は配列内の塩
基の順序の点で異なる。異なるのは、リンカー部
位、SD配列中、或いはSD配列に接する配列中
（5′−側に上流）である。以下に示すハイブリツ
ドRBSが特にすぐれた効果を示す。 TTAAAAATTAAGGAGGAATTCATG、
TTAAAAATTAAGGAGGAATTAATTCAT
Ｇ。 本発明の好ましい実施態様では形質転換の手法
で受容菌として用いられる微生物は英国特許No.
2055382Aに記載されているE.coli Ｋ−12 294株
である。本微生物は1978年10月28日にAmerican
Type Culture CollectionにATCC−31446とし
て寄託されており、入手可能である。さらに、
こゝに記載の全ての組み換えDNA実験は
National Institute of Health（NIH）の適用ガ
イドラインに従つて行なわれた。 最も好ましい実施態様として本発明はE.coli
Ｋ−12 294株に関して記載されているが、E.coli
RRI（ATCC 31344）のような公知のE.coli株或
いはAmerican Type Culture Collectionのよう
な公認の微生物寄託機関に寄託され、入手可能な
他の微生物菌株も本発明の実施に用いることが出
来る。 本発明の発現ベクターはプラズミドpBR322に
由来し（第２図、５図、６図および７図参照）、
バクテリオフアージ ラムダDNAから単離され
たPLプロモーターを含み、tetRおよびampR遺伝
子の間に両方向に向け挿入されている（即ち、転
写がampR遺伝子方向に又はtetR遺伝子方向に進
む。）。PLはλ cIリプレツサーにより効率よく又
便利に調節される非常に強いプロモーターである
ため好まれるプロモーターである。リプレツサー
をコードする遺伝子はcIts2又はcIts857の変異を
有し、これらはリプレツサーに温度感受性を与え
る。30℃に於いてはリプレツサーは正常に作用
し、約37℃から約42℃では不活化される。従つて
PLプロモーターは30℃で抑制され（スイツチ
オフされ）、42℃で抑制解除（スイツチ オン）
される。この特徴は興味ある遺伝子生成物が細胞
に毒性を有する場合、或いは多量に存在すると細
胞生育に有害である場合に望ましい。PLプロモ
ーターを調節できるということは菌を約30℃から
約36℃の間で遺伝子生成物を発現することなく生
育させることが出来、適当な時期に望む遺伝子生
成物を生産させるために温度を約37℃から約42℃
に上昇させることが出来る。 本開示発明のベクターは全てまたEcoRI切断部
位をSD配列の3′方向（末端）に０，１或いは４
塩基の距離に含有し、このため異なるハイブリツ
ドRBSを構成する手段を提供する。EcoRI部位
を用いてハイブリツドRBSを構成してPL−SD配
列とインターフエロンをコードする遺伝子の
ATGコード配列と結合すると、さらにEcoRI制
限切断し、末端をクレナウ ポリメラーゼをつ
なげ、得られる２つの末端をT4DNAリガーゼで
平滑末端結合することで修飾することが出来る。 本発明をさらに以下の実施例１および５〜８お
よび参考例２〜４により具体的に説明する。 実施例 １ ラムダのPLプロモーターOLオペレーターを含
む350塩基対（bp）断片を単離するために250μｇ
のλcI857Sam7DNA（マイルズラボラトリーズ）
を制限エンドヌクレアーゼBamHIおよびBgl
で消化し、アガロースゲルの電気泳動で生成物を
分離した。PLプロモーターOLオペレーターを含
む1200bp断片をゲルから単離した（第１図参
照）。 この1200bp断片をHpaで完全に消化し、
450bp断片を得、これを再びHinfIで部分消化す
る。５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（PAGE）により、PLプロモーターおよびOLオペ
レーター部位（OL1，OL2，OL3）を含み、これに
λcIリプレツサーが結合している350bp断片を単
離した。ラムダＮ遺伝子のSD配列とＮ遺伝子の
開始コドンの間にHinfI部位があるため（第１図
および第２図参照）、外来遺伝子をE.coli中で発
現する目的でハイブリツド リボゾーム−結合部
位の構成が可能である。このHinfI部位はEcoRI
部位にも変えられ得る。 350bpのBgl −HinfI断片を前もつてEcoRI
とBglで消化したプラズミドpRClにクローニン
グした。pRClはEcoRI部位に隣接してBgl部位を
有するpBR 322（ATCC 31344）の誘導体である
（第２図参照）。第２図はまた、結合末端の配列を
示し、ベクターのEcoRI末端が断片のHinfI末端
にどのように結合でき、EcoRI部位を再構成する
かを示している。（第２図の丸印をしたＡは細胞
のin vivo機構により修復された。）得られた組換
えプラズミドはpRC14と名づけた。 PLプロモーターを用いて数多くの他の発現ベ
クターも構成された（第４図、５図、６図および
７図）。pRC15は上述の350bpのBgl−HinfI断
片に加えて、λint遺伝子のSD配列を含む55bp断
片（HinfI−MboI）を含有している（第４図お
よび５図参照）。pRC21およびpRC22はそれぞれ
pRC14およびpRC15に同類のものである。これら
のプラズミドの主要な違いはPL含有断片の挿入
の方向であり、従つて転写の方向の違いである
（第５図参照）。pRC23は“consensus”リボゾー
ム結合部位〔Scherer et al，Nucleic Acids
Research ８巻3895頁：1980年〕を含む合成オリ
ゴヌクレオチドをPLプロモーターを含む250bpの
Bgl−Hae断片に結合し、生成物を第７図に
示すようにpRC2に挿入することにより構成され
た。 参考例 ２ 白血球インターフエロンＡ（以後LeIF−Ａ又は
LIFAとも呼ばれる）の遺伝子は以下の方法に従
つていろいろのプラズミドに挿入され、宿主中で
発現する。LeIF遺伝子の出所として、pLeIFA25
〔Goeddelら、Nature287巻411頁（1980年）〕か
らのPstI−EcoRI断片を単離し、pRC14から単離
されたEcoRI−PstIの大きい断片と結合する。結
合部位の配列を第３図に示す。SD配列はATG開
始コドンから５塩基の距離にある。この距離を９
塩基とするためにpRC14／LIFAをEcoRIで消化
し、付着末端をポリメラーゼのクレナウ断片
（＋dTTP，dATP）でうめ、平滑末端を再び結
合する。このようにして得られる結合部分の配列
を第３図に示す（pRC1410／LIFA）。本実施例
で利用される新規ハイブリツド リボゾーム結合
部位の配列は、pRC14／LIFAで
AATTC、pRC1410／LIFAで
AATTAATTCである（いずれも第３図に
示してある）。 前述のPL発現プラスミドを、2400bp Bgl挿
入物上の温度感受性cIリプレツサー遺伝子を含有
する低コピー数プラスミドpRK 248 cIts（ATCC
33766）を有するE.coliの菌株（菌株294）中に移
入する。即ち、リプレツサーは約30℃から約36℃
で作用し、約37℃から約42℃で失活する。この特
質はPLプロモーターの調節に便利な機構を提供
する。この場合、細胞はM9−グルコース培地中、
30℃で１ml当り２−３×108細胞となるまで生育
され、それから42℃に上げて２時間おく。培養液
中の細胞は次に7Mグアニジン塩酸で溶菌し、溶
菌液を測定する。pRC1410／LIFAを用いてこの
方法を行なうと菌抽出液或いは溶菌液中に１リツ
トル当り107〜108ユニツトの収率のインターフエ
ロン活性が検出される。pRC14／LIFAの発現の
程度はpRC1410／LIFAで得られるもののおよそ
10％である。pRC15／LIFAはpRC1410／LIFA
と匹敵するLIFAの発現の程度が得られる。 参考例 ３ 人繊維芽細胞インターフエロン遺伝子（FIF）
を以下の如く（第８図）ベクターpRC21及び
pRC22に挿入した。別の反応で、pRC21及び
pRC22をEcoRIで消化し、末端をクレナウ ポリ
メラーゼで充てんし、BamHIで消化し、大き
な断片を分離した（4.3kb）。 FIF遺伝子の供給源である、pFIF trp69
〔Goeddel et al.，Nucleic Acids Res.８，4057
（1980）〕をXbaIで消化し、末端をクレナウ ポ
リメラーゼで充てんして平滑末端に変え、
BamHIで消化し、FIF遺伝子を含む、小断片
（850bp）を分離した。FIF850bp断片を4.3kbPL含
有断片に結合し、生成する構造を、制限解析で確
認した。 PL−FIFプラスミドのFIF発現能力を検討する
ために、pRC21／FIF及びpRC22／FIFで形質転
換した大腸菌をM9−グルコース培地で30℃下、
菌濃度、２〜３×108菌数／mlになるまで生育さ
せ、42℃で誘導し、１mlのサンプルを取り、遠心
で集菌し、溶菌させる目的で、7Mグアニジン−
HCl（５×109菌数／ml）中に再懸濁した。菌体残
渣を遠沈で除去し、抗ウイルス活性検定に先立つ
て、上澄を50倍に稀釈した。結果を第２表に示
す。
【表】
【表】 参考例 ４ FIF発現に関して、新規ハイブリツド リボゾ
ーム結合部位の効果を決めるために、pRC21／
FIFとpRC22／FIFの誘導体を作成した。
pRC21／FIF及びpRC22／FIFのリンカー域中の
２つの制限部位を組合わせると、ハイブリド
RBS中に幾つかの修飾を施こす方法が生まれた。
EcoRI又はXbaIをリンカー域内での切断に用い、
クレナウ ポリメラーゼを生ずる末端の充てん
に用い、平滑末端は再結合し、かくて、第３表に
示す如き各種の配列を生成した。これら構成物
が、形質転換大腸菌株RRI（pRK248clts）中で
FIFを発現するか否かをテストした。これらPL−
FIFプラスミドのFIF発現能をテストするために、
pRC21／FIF，pRC22／FIF，pRC211／FIF，
pRC221／FIF，pRC212／FIF、及びpRC222／
FIFより撰んだ単一のプラスミド変種で形質転換
した菌の各培養を以下の操作を行なつた。菌体を
30℃下、M9−グルコース培地で菌濃度が２〜３
×108菌数／mlになるまで生育させ、42℃で約120
分間誘導し、１mlサンプルを採り、遠沈により集
菌し、溶菌するために7Mグアニジン−HCl（５×
109菌株／ml）に再懸濁した。菌体残渣を遠心で
除去し上澄を抗−ウイルス活性の検定に先立つて
50倍に稀釈した。結果を第３表に示す。
【表】 実施例 ５ ヒト免疫インターフエロン（IFI）遺伝子を含
む、PL−発現ベクターも作成した。IFI遺伝子の
供給源はPst1部位に挿入した、IFI，mRNAの
1100bp cDNAコピーを有するpBR322の誘導体
の、pHIT3709であつた。該挿入物上に存在する
IFIをコードする配列は式により表わされる。
IFI遺伝子を含むプラスミドpHIT3709を、以下
の方法により作成した。 (i) IFIをコードするmRNAの分離 ヒト末梢血より調製したリンパ球を、IFI誘導
のため、15ng／mlの12−ｏ−テトラデカノイル
−フオルボル−13−酢酸（TPA）と、40μｇ／ml
のコンカナバリンＡを含むRPM1−1640培地（10
％牛胎児血清含有）中で37℃で培養した。培養24
時間後、この様にして誘導したヒト リンパ球
（１×1010細胞）をテフロン ホモゲナイザー中
の、チオグアニジン溶液（5Mグアニジン チオ
シアン酸、５％メルカプトエタノール、50mMト
リス−HCl（PH7.6）、10mMEDTA）中で破壊し、
変性させた。次いでナトリウム Ｎ−ラウロイル
サルコシネートを４％濃度になるように加え、
均質化後の混合液を６mlの塩化セシウム溶液
（5.7M塩化セシウム、0.1M EDTA）上に層状に
のせ、ベツクマンSW27ローターを用いて
24000rpmで30時間15℃で遠心して、RNA沈澱物
を得た。 このRNA沈澱物を0.25％Ｎ−ラウロイル サ
ルコシネートに溶解し、次いでエタノールで沈澱
して8.3mgのRNAを得た。このRNAを高塩濃度
の溶液中（0.5M NaCl、10mMトリス−HCl（PH
7.6）、1mM EDTA、0.3％SDS）でオリゴ（dT）
セルロース カラムに吸着させ、低塩濃度溶液
（10mMトリス−HCl（PH7.6），1mM EDTA，0.3
％SDS）を用いてポリ(A)含有mRNAを溶出した。
700μｇのmRNAを集めた。 該mRNAをエタノールで再沈澱し、次いで
10mMトリス−HCl（PH7.6）、2mM EDTA及び
0.3％SDSを含む溶液0.2mlに溶解し、65℃で２分
間処理し、ベツクマンSW27ローターを用い、20
℃で25000rpm，21時間、10−35％蔗糖密度勾配
遠心により、22部分に分画した。各画分の一部づ
つをXenopus laevis（南アフリカ産有爪雌蛙）の
卵母細胞に注射し、合成された蛋白のインターフ
エロン活性を検定した。このような方法により、
画分12（沈降恒数が12−14S）が、mRNA1ミクロ
グラム当たり、195国際インターフエロン単位の
活性を示すことを認めた。このようにして取得し
た画分12中のmRNAは約20μｇであつた。 (ii) 一重鎖DNAの合成 上記mRNA5μｇ、オリゴ（dT）50μｇ、リバ
ース トランスクリプターゼ（逆転写酵素）100
単位、各dATP，dCTP，dGTP及びdTTPを
1mMづつ、MgCl28mM，KCl50mM、ジチオス
レイトール10mM及びトリス−HCl（PH8.3）
50mMを含む、100μの反応混合液を42℃で１時
間インキユベートし、次いで、フエノールで除蛋
白し、RNAの変性を目的として、0.1N NaOH
で70℃、20分間処理した。 (iii) 二重鎖DNAの合成 このようにして合成した単鎖相補DNAを、逆
転写酵素100単位、各dATP，dCTP，dGTP及び
dTTPを1mMづつ、MgCl28mM，KCl50mM、
シチオスレイトール10mM及びトリス−HCl（PH
8.3）50mMを含む、50μの反応混合液中で、42
℃、２時間反応させて二重鎖（dS）DNAを合成
した。 (iv) dCテイルの付加 上記二重鎖DNAを0.1M酢酸ナトリウム（PH
4.5），0.25M NaCl，1.5mM ZnSO4を含む、50μ
の反応混合液中、60ユニツトのヌクレアーゼＳ
−１で室温下、30分間処理した。反応混液をフエ
ノールで除蛋白し、DNAをエタノールで沈澱さ
せ、0.14Mカコジル酸カリウム、0.3Mトリス
（PH7.6），2mMジチオスレイトール、1mM
CoCl2，0.15mM dCTP及び末端トランスフエラ
ーゼ30単位を含む混合液中で、37℃、３分間、
dS DNAの3′末端に約20のデオキシシチジン残基
を付加するため、末端トランスフエラーゼ反応に
供した。 この一連の反応で二重鎖デオキシシチジン鎖含
有DNAを約300ng取得した。 (v) 大腸菌プラスミドpBR322の分割と、dGテイ
ルの付加 別に、10μｇの大腸菌プラスミドpBR322DNA
を50mM NaCl、6mMトリス−HCl（PH7.4）、
6mM MgCl2、6mM2−メルカプトエタノール及
び100μｇ／mlの牛血清アルブミンを含む、50μ
の反応混液中で、制限酵素PstI20単位で37℃、３
時間処理した。反応混液を次いでフエノールで除
蛋白し、DNAを、さらに、0.14Mカコデイル酸
カリウム、0.3Mトリス（PH7.6）2mMジチオスレ
イトール、1mM CoCl2及び0.15mM dGTPを含
む反応混液50μ中で、30単位の末端トランスフ
エラーゼで、プラスミドpBR322DNAの3′−末端
に約８デオキシグアニジン残基を付加するため
に、37℃で３分間処理した。 (vi) cDNAのアニーリング及び大腸菌の形質転換 このようにして取得したdc−テール付き合成
dSDNA0.1μｇと上記dG−テール付きプラスミド
pBR322DNA0.5μｇを0.1M NaCl，50mMトリス
−HCl（PH7.6）及び1mM EDTA含有液中で、65
℃２分間、次いで45℃で２時間加熱してアニーリ
ングを行い、次第に冷却した。大腸菌×1776の形
質転換は、Enea等の方法〔J.Mol.Biol.96，495
（1975）〕によつて行つた。 (vii) プラスミド含有cDNAの分離 このようにして、約8500のテトラサイクリン耐
性コロニーを分離し、各コロニーのDNAを、ニ
トロセルロース フイルターに固定した〔M.
Grunsteun and D.S.Hogness，Proc.Natl.Acad.
Sci.USA，72，3961（1975）〕。 別にGray等により〔Nature 295，503
（1982）〕報告されている如く、IFIのアミノ酸配
列に基づき、アミノ酸配列Cys−Tyr−Cys−Gln
−Asp（１−５）及びLys−Gln−Asp−Met−
Asn−Val（77−82）に相当する二つの塩基配列
5′TCCTGGCAA GTAA GＣ 3′及び5′ACG ATTCATG A
TCT CTCT CT3′をトリエステル法〔R.Crea等．，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，5765（1978）〕に
より、化学的に合成した。0.2μｇのこれらオリゴ
ヌクレチオドを、50mMトリス−HCl（PH8.0）、
10mM MgCl2，10mMメルカプトエタノール及
び50μCiγ−32P−ATPを含む反応混液50μ中で
３単位のT4ポリヌクレチオド キナーゼで37℃
１時間処理した。5′−末端に32Pで標識した、こ
れらオリゴヌクレチオドをプローブとして利用
し、上述のニトロセルロースフイルター上の
DNAとLaun等の方法〔NnCleic Acids Res..９，
6103（1981）〕でアニールした。オート ラジオ
グラフイーで、上記二つのオリゴヌクレチオド
プローブと反応する４つのコロニーを同定した。 これら、それぞれのコロニーの細菌細胞中より
Birn boim and Doly〔Nucleic Acids Res.１，
1513（1979）〕の方法に従つて、プラスミドDNA
を分離した。プラスミドDNA中の挿入部をPstl
制限酵素で切り出した。分離したプラスミドよ
り、最長のcDNA挿入部を含むものを選び、
pHIT3709と命名した。第９図に、該プラスミド
の制限酵素地図を示す。 pHIT3709プラスミドに挿入されたmRNA配列
の一次構造（塩基配列）を、次いで、Sanger等
〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74，5463（1977）〕の
方法及びMaxam−Gilbertの方法により決定し
た。第１０図に該一次構造を示した。 該一次構造は、140位のアミノ酸がCAA（Gln）
の代りにCGA（Arg）でコードされている事を除
き、Gray等の報告したIFI cDNAの一次構造と
一致している。 一次構造より、このプラスミドはIFI蛋白の全
コード域を含んでいることは明白である。この事
実は、該プラスミドに挿入されたDNAを他の発
現プラスミドに移すことにより、例えば大腸菌の
如き宿主に免疫インターフエロンを生産させる可
能性を示している。 実施例 ６ pHIT3709よりIFIをコードする配列の430bpお
よび470bpの3′側非コード領域を含む900bpの
BstNI断片を単離した。（制限酵素BstNIはNew
England Biolabs.社、Beverly.Massachusettsか
ら市販されており、その酵素により認識される塩
基配列は本願出願前公知であつた。）本断片上に
存在しないのはIFIのシグナルの部分および成熟
たん白の最初の３個のアミノ酸のコドンである。
欠けている３個のコドンを回復し、開始のメチオ
ニン コドンを供給するため合成オリゴヌクレチ
オドを調製し、900bp断片に結合した（第１１図
参照）。合成断片は両側のBst NI末端をEco RI
末端に変えた。得られた断片を、EcoRIで制限切
断したpRC22ベクター中にクローン化した。挿入
部分の方向性は3′側の非コード領域中を切断する
Bglでの制限切断分析により決定した。 全ての結合操作が期待通りに行なわれた事を確
認するためにIFI遺伝子を含有するpRC22ベクタ
ー（pRC22／IFI−900と命名）をプロモーターと
遺伝子の結合部位の周辺を配列決定した（第１１
図参照）。 IFI遺伝子の発現を試験するためにE.coli RRI
株（pRK248cl ts，pRC22／IFI−900）をM9−
グルコース培地中、30℃にて１ml当り３−４×
108細胞となるまで生育し、その後42℃で１時間
誘発する。誘発の前にさらにグルコースおよびカ
ザミノ酸をそれぞれ1.0％，0.5％となるよう添加
した。10mlのサンプルを取り、遠心分離により集
菌し、0.1mlの50mMトリス（PH7.4），10％蔗糖中
にけん濁し、けん濁液をドライアイス／エタノー
ル中で急凍結した。細胞を20℃で融解し、氷槽に
入れた。NaClを100mM、EDTA10mMスペルミ
ジン20mMとなるよう、又リゾチームを１ml当り
200μｇ添加した。混合物を氷槽中45分間放置し
た後37℃で２分間置いた。細胞残渣を遠心分離に
より除去し、上澄液のWISH細胞を用いたIFI抗
ウイルス活性を測定した。この最初の実験で１ml
の細胞抽出液当り1280ユニツトのIFI活性が得ら
れた。 誘発のキネテイツクスを決定するために上記操
作をくり返えした。対照として１検体を30℃で保
存し、他の検体を42℃での誘発後30分、60分、90
分、120および180分で取つた。サンプルは上述の
とおり処理した。第４表に示す結果によると、30
℃では活性は見られず、42℃で誘発後検出される
活性は約90分後で最大となり、その後次第に低下
することを示している。
【表】 実施例 ７ pRC22／IFI−900DNAをさらにEcoRIで制限
切断し、IFIを含む900bp断片を単離し、前もつ
てEcoRIで制限切断してあるpRC23に挿入した
（第１２図参照）。得られる構造、pRC23／IFI−
900、はpRC22／IFI中と有意に異なるRBSを含
んでいる（第１１図と第１２図を比較のこと）。
IFI遺伝子の発現を試験するためにRRI
（pRK248cIts，pRC23／IFI−900）株をM9−グ
ルコース培地中30℃で１ml当り３−４×108細胞
となるまで生育し、42℃で１時間誘発をした。誘
発の前にさらにグルコースおよびカザミノ酸をそ
れぞれ1.0および0.5％となるよう添加した。10ml
のサンプルをとり、遠心分離により集菌し、0.1
mlの50mMトリス（PH7.4）、蔗糖10％中にけん濁
し、けん濁液をドライアイス／エタノール中で急
凍結した。細胞を20℃で融解し、氷槽中に置く。
NaClを100mMに、EDTA10mM、スペルミジン
20mMとなるよう、又リゾチーム１ml当り200μｇ
を添加し、この混合物を氷槽中で45分間、次いで
37℃で２分間放置した。遠心分離により細胞残渣
を除去し、上澄液につき、IFI抗ウエルス活性を
WISH細胞上で測定した。第５表に示すように、
【表】 pRC23／IFIをE.coli RRI株の形質転換に用いる
と、pRC22／IFIより約４倍高いIFI活性を生産し
た。 実施例 ８ pRC23／IFIをさらにEcoRIで２個の切断部位
の片方のみが切断されるような条件下で制限切断
する。得られる分子をクレナウ ポリメラーゼ
で処理してEcoRI末端を充填した。平滑末端を
T4DNAリガーゼで結合し、そのDNAでRRI
（pRK248cIts）を形質転換した。IFI遺伝子の最
初のEcoRI部位を欠損した形質転換株を検索し、
２株が得られた。 pRC231／IFI−900と命名されたその１つを用
い、IFIを発現するためE.coli RRI株を形質転換
した。IFI遺伝子の発現を試験するためこのRRI
（pRK248cIts，pRC231／IFI−900）株をM9−グ
ルコース培地中30℃で１ml当り３−４×108細胞
となるまで培養し、その後42℃で１時間誘発し
た。誘発の前にさらにグルコースおよびカザミノ
酸をそれぞれ1.0および0.5％となるよう添加し
た。10mlのサンプルを取り、遠心分離により集菌
し、0.1mlの50mMトリス（PH7.4），10％蔗糖にけ
ん濁し、けん濁液をドライアイス／エタノール中
で急凍結した。細胞を20℃で融解し氷槽中に置い
た。NaClを100mM，EDTA10mMスペルミジン
20mMとなるように、又リゾチームを１ml当り
200μｇ添加した。混合物を氷の中で45分放置し
た後、37℃で２分置いた。遠心分離により細胞残
渣を除去し、上澄液につきIFI抗ウイルス活性を
WISH細胞で測定した。その結果は第５表に示
す。 記載のpRC23／IFIの修飾はリンカー部位を
6bpから10bpに伸ばすために計画した。このよう
な修飾でLeIF−Ａ発現ベクターでは発現が10〜
20倍増加した。IFIの場合にはその発現に10bpよ
り6bpの距離の方がよいようである。 要 約 以下の方法より成るインターフエロンの生産方
法。 (a) 宿主微生物を、インターフエロンを発現する
ことが出来、バクテリオフアージ ラムダに由
来するプロモーターおよびオペレーターDNA
配列、ハイブリツド リボゾーム結合部をコー
ドする配列およびインターフエロンをコードす
るDNA配列を含む発現ベクターで形質転換し、 (b) 形質転換した微生物を培地中で生育させ、そ
れによつて上記発現ベクターのインターフエロ
ン遺伝子によりコードされるインターフエロン
を生産させ、 (c) 形質転換微生物を溶菌し、そして (d) 得られる溶菌液からインターフエロンを回収
する。
【図面の簡単な説明】
第１図はPLプロモーターを含む1200bpのBgl
−BamHI断片の部分制限切断図を示す。第２図
は、350bp挿入部分にラムダPLプロモーターを含
む発現ベクターpRC14の構成につき説明してい
る。第３図は、発現ベクターpRC14に挿入した、
白血球インターフエロン遺伝子を説明している。
第４図は、発現ベクターpRC15の組立用のバクテ
リオフアージ ラムダのint遺伝子のためのSD配
列を含む82bp断片を分離するために用いた概要
を説明したものである。第５図は発現ベクター
pRC15の構造につき説明。第６図は、それぞれ、
プラスミドpRC14及びpRC15由来の発現ベクター
pRC21及びpRC22の構造につき説明。第７図は、
PLプロモーターおよび合成RBSを用いるpRC2プ
ラスミドからの発現ベクターpRC23の構成を示
す。第８図は、繊維芽細胞インターフエロンをコ
ードしている遺伝子を、プラスミドpRC21及び
pRC22に挿入するため用いた方法の概要と、得ら
れたプロモーターと遺伝子の接合点の配列を示し
ている。第９図は、実施例５(vii)で得られたプラス
ミドpHIT3709の制限酵素切断地図を示し、〓部
分はシグナルペプチドとなるべきペプチドをコー
ドする配列を示し、〓部分は、IFIポリペプチド
をコードする配列を示す。第１０図は、実施例５
(vii)で得られたプラスミドpHIT3709の塩基配列を
示す。第１１図は、免疫インターフエロンをコー
ドしている遺伝子を、発現ベクターpRC22に挿入
するため用いた方法の概要と、プロモーターと遺
伝子の接合点の配列を示している。第１２図は、
免疫インターフエロン遺伝子を発現ベクター
pRC23に挿入する方法と、プロモーターと遺伝子
間の接合点の配列並びにその修飾を示している。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ バクテリオフアージλに由来するPLプロモ
    ーターおよびOLオペレーター、ヒト成熟免疫イ
    ンタフエロンをコードするDNA配列および前記
    プロモーターの下流域にあり、かつ前記インタフ
    エロンをコードするDNA配列の上流域に結合し
    たハイブリツド リボゾーム結合部位を含み、こ
    のバイブリツド リボゾーム結合部位が次式 TTAAAAATTAAGGAGGAATTCATG；
    または
    TTAAAAATTAAGGAGGAATTAATTCAT
    Ｇ により示されるDNA配列を含有する、発現ベク
    ター。 ２ ヒト成熟免疫インタフエロンをコードする
    DNA配列が下記一般式で示される特許請求の範
    囲第１項記載の発現ベクター： （5′） TGT TAT TGT CAG GAC CCA
    TAT GTA AAA GAA GCA GAA AAC CTT AAG AAA TAT
    TTT AAT GCA GGT CAT TCA GAT GTA GCG GAT AAT
    GGA ACT CTT TTC TTA GGC ATT TTG AAG AAT TGG
    AAA GAG GAG AGT GAC AGA AAA ATA ATG CAG AGC
    CAA ATT GTC TCC TTT TAC TTC AAA CTT TTT AAA
    AAC TTT AAA GAT GAC CAG AGC ATC CAA AAG AGT
    GTG GAG ACC ATC AAG GAA GAC ATG AAT GTC AAG
    TTT TTC AAT AGC AAC AAA AAG AAA CGA GAT GAC
    TTC GAA AAG CTG ACT AAT TAT TCG GTA ACT GAC
    TTG AAT GTC CAA CGC AAA GCA ATA CAT GAA CTC
    ATC CAA GTG ATG GCT GAA CTG TCG CCA GCA GCT AAA
    ACA GGG AAG CGA AAA AGG AGT CAG ATG CTG
    TTT CGA GGT CGA AGA GCA TCC CAG −Ｘ （3′） （） （式中、ＸはTAA，TGA又はTAGであ
    る）。 ３ ヒト成熟免疫インタフエロンをコードする
    DNA配列が次の式で示されるポリペプチドをコ
    ードする特許請求の範囲１項記載の発現ベクタ
    ー： H2N−Cys−Tyr−Cys−Gln−Asp−Pro−Tyr
    −Val−Lys−Glu−Ala−Glu−Asn−Leu
    −Lys−Lys−Tyr−Phe−Asn−Ala−
    Gly−His−Ser−Asp−Val−Ala−Asp−
    Asn−Gly−Thr−Lei−Phe−Leu−Gly−
    Ile−Leu−Lys−Asn−Trp−Lys−Glu−
    Glu−Ser−Asp−Arg−Lys−Ile−Met−
    Gln−Ser−Gln−Ile−Val−Ser−Phe−
    Tyr−Phe−Lys−Leu−Phe−Lys−Asn
    −Phe−Lys−Asp−Asp−Gln−Ser−Ile
    −Gln−Lys−Ser−Val−Glu−Thr−Ile
    −Lys−Glu−Asp−Met−Asn−Val−
    Lys−Phe−Phe−Asn−Ser−Asn−Lys
    −Lys−Lys−Arg−Asp−Asp−Phe−
    Glu−Lys−Leu−Thr−Asn−Tyr−Ser
    −Val−Thr−Asp−Lei−Asn−Val−Gln
    −Arg−Lys−Ala−Ile−His−Glu−Leu
    −Ile−Gln−Val−Met−Ala−Glu−Leu
    −Ser−Pro−Ala−Ala−Lys−Thr−Cly
    −Lys−Arg−Lys−Arg−Ser−Gln−
    Met−Leu−Phe−Arg−Gly−Arg−Arg
    −Ala−Ser−Gln−OH. ４ ハイブリツド リボゾーム結合部位をコード
    するDNA配列が式 TTAAAAATTAAGGAGGAATTCATGで示
    される特許請求の範囲２項または第３項のいづれ
    か一つに記載の発現ベクター。 ５ ハイブリツド リボゾーム結合部位をコード
    するDNA配列が式 TTAAAAATTAAGGAGGAATTAATTCAT
    Ｇで示される特許請求の範囲第２項または第３項
    のいづれか一つに記載の発現ベクター。 ６ バクテリオフアージλに由来するPLプロモ
    ーターおよびOLオペレータ、ヒト成熟免疫イン
    タフエロンをコードするDNA配列および前記プ
    ロモーターの下流域にあり、かつ前記インタフエ
    ロンをコードするDNA配列の上流域に結合した
    ハイブリツド リボゾーム結合部位を含み、この
    ハイブリツド リボゾーム結合部位が次式、 TTAAAAATTAAGGAGGAATTCATG；ま
    たは TTAAAAATTAAGGAGGAATTAATTCAT
    Ｇ により示されるDNA配列を含有する発現ベクタ
    ーで形質転換されたE.coli株。
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