JPS60172999A - 新規な塩基性ポリペプチドおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規な塩基性ポリペプチド、具体的Ｉこは新
規なヒトカンマ型インターフェロン様ポリペプチドおよ
びその製造法に関する。

ヒト、インターフェロンは、その生産細胞や生産のため
の誘導剤のちがいさらには物理化学並びに免疫学的性質
などからα型、β型、γ型の３種に分けられている。い
ずれの型のインターフェロンも強い抗ウィルス活性を有
するポリペプチドからなる物質（天然のβ型およびγ型
は糖鎖が付加されたポリペプチド即ち糖蛋白と言われて
いる）であるか、特にγ型インターフェロン（免疫イン
ターフェロンとも呼ばれる月ま、α型、β型インターフ
ェロンに比べ、細胞増殖抑制作用が強いことから抗ウィ
ルス剤の他１こ抗腫編剤や免疫調節剤としての利用が期
待される。

ヒト、γ型インターフェロン（以下１１．Ｉ　Ｆ　Ｎ−
γと略す）は、２０個のアミノ酸残基からなるシグナル
ペプチドを含む前駆体から適当１こプロセスされ生成す
る１　４６個のアミノ酸からなるポリペプチドであるこ
とが該遺伝子の構造解析から示されている（Ｄｅｖｏｓ
、　Ｒ，らＮｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ、　Ｒｅｓ、　１０：
２４８７、１９８２．およびＧｒａｙ＋　Ｐ、　Ｗ、ら
Ｎａｔｕｒｅ２９５：５０３，１９８２）。　さらに組
換えＤＮＡ技術を用いたプレｈＩＦＮ−γ　（シグナル
ペプチドを含むｈＩＦＮ−γ前駆体）並びにｈＩＦＮ−
γ（成熟型ｈＩＦＮ−γ）ポリペプチドの製造法に関す
る特許も公開されている（特開昭５８−９０５１４．同
５８−１７４３９６および同５８−１８９１９７）。

しかし、ヒトリンパ球もしくはヒト牌臓細胞から誘導生
成される天然のｈＩＦＮ−γ（糖蛋白質）を含め、γ型
インターフェロン（免疫インターフェロン）の物理化学
的性状には不明な点が多く、またα型、β型インターフ
ェロン（以下、各々ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βと略す）に
比べ物理化学的に不安定であるためその精製が困難と言
われている。

そこで本発明者らはこれらの問題点をクリアすべく、物
理化学的に安定で、高い生理活性を保持できしかも製造
φ精製が容易なりＩＦＮ−γアナログについて鋭意研究
を重ねた結果、特許請求の範囲第１項に示すような性質
を有する塩基性ペプチドまたは同第２項に示すような１
３１個乃至１３２個のアミノ酸残基からなる配列のポリ
ペプチドＣ以下ＧＩＦ１３１と略す）が、上記目的に合
致した物質であることを見出し、本発明を完成するに至
った。

本発明に示すポリペプチドのアミノ酸配列は、Ｄｅｖｏ
ｓら（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ、　Ｒｅｓ、　１０：２４
８７．１９８２ンおよびＧｒａｙら（Ｎａｔｕｒｅ　２
９５：５０３．１９８２）ｌこよって提示された１４６
個のアミノ酸残基からなる天然のｈＩＦＮ−γの構造中
に含まれてはいるが、本発明におけるポリペプチドの秀
れた物理化学的並びに生理学的性状（１、上記天然のｈ
ｌＦＮ−γ（以下Ｇ　Ｉ　Ｆ　ｌ　４６と略す）から容
易に類推できるものでは決してなく、本発明の物質は強
い免疫インターフェロン活性を有する明らか１こ新規な
ポリペプチドであると言える。

本発明ｆこおける純化されたポリペプチドは、１）ポリ
アクリルアミドゲル使用によるＳ、ＤＳ電気泳動法では
みかけの分子量約１６，０００（１６Ｋ）。

萬速液体フロマトグラフイーを用い１こ分子篩性ではみ
かけの分子量約１７．ｔ３ＵＩ［１７Ｋ）２）　クロマ
トフオーカシング法および平板法による等電点（ＰＩ値
）は各々約９．３．　９．８．’　３　）第１表１こ示
Ｔようなアミノ酸組成、４）　第２表に示すような元素
分析値、５）ｐ／２図のような紫外吸収曲線、６）　第
１３図のような円二色性曲線、７）　第を４図のような
核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル、および８’）　第１
ｓ図のような赤外吸収スペクトルを示す。また、アミノ
酸配列の解析ｌこおいては、詳細は後１こ述べるが、そ
の部分的配列を決定するとともにアミン基末端はＭｅｔ
又はＣｙｓで、カルボキシル基末端はＬｙｓであること
を確認した。そしてアミノ酸組説値、元素分析、その他
物理化学的解析の結果から、本発明の物質が１３１個乃
至１３２個のアミノ酸残基からなり、特許請求の範囲第
２項記載のようなアミノ酸配列を有するポリペプチドで
あることが示された。

さらに本発明のポリペプチド旧、実施例に示す如（、天
然のｂＩＦＮ−γ（ＧＩＦ１４６）とは異なる物理化学
的性質を有し、また強い免疫インターフェロン活性を有
する医薬用として有用な物質であることも示された。本
発明のポリペプチドは、水や通常用いられている緩衝溶
液に溶は易く、またＳＤＳや低いｐＨでの処理に対して
もその生理学的活性はＧＩＦ１４６１こ比べ比較的安定
に保たれることなどから、該ポリペプチドを生産する微
生物培養物からの抽出・精製が容易であるばかりでなく
、抗１匝瘍剤、抗がん剤、抗ウィルス剤、免疫調節剤な
ど医薬用としての製剤化も容易に行われるうることが期
待される。さらに、本発明のポリペプチドと、他の医薬
用物質たとえば他のタイプの種々なインターフェロンや
ＴＮＦ（ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｅｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏ
ｒ：腫瘍壊死因子）、ＩＬ２（ｉｎｔｅｒｌｅ　ｕ　ｋ
　ｉ　ｎ　２　：インターロイキノ２）、ＣＢＦ（ｃａ
ｎｃｅｒ　ｂｒｅａｋｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ：ガン破壊
因子）、ＭＩＦ（ｍａｃｒｏｐｂａｇｅ　１ｎｓ１ｉｌ
、１ｔｏｒｙ　ｆａｃｔｏｒ：マクロファージ遊走阻止
因子）、Ｃ３Ｆ（ｃｏ　ｌｏｎｙｓｔｉｍｕｌａｔｉｎ
ｇ　ｆａｃｔｏｒ：コロニー刺激因子）のようなリンフ
オカイ７などとの併用１こよる治療効果の増強も期待さ
れる。

本発明のポリペプチドは、特許請求の範囲第２項、第３
項または第２２項に記載のアミノ酸配列をコードするＤ
ＮＡ配列、例えば特許請求の範囲第１４項記載のような
化学的に合成されたＤＮＡ配列を組み込んだ該ＤＮＡ遺
伝子が発現可能な適当な発現ベクターによって形質転換
された微生物の培養物から得ることができる。また、驚
（べきことに特許請求の範囲第４項或いは第２０項に記
載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ、例えば特許請求の範囲第２２項記載のＤＮＡ配列
が組みこまれた適当な発現用ベクターＩコよって形質転
換された微生物、例えば特許請求の範囲第１６項もしく
は第１７項記載の大腸菌形質転換体（Ｗ３１１０／ｐｌ
Ｎ５ＧＩＦ５４．ＷＡ８０２／Ｉ）ＩＮ５ＧＩＦ５４．
Ｗ３１１０／ｐＹｔａｃＧＩＦもしくはＷＡ８＋Ｊ２／
ｐＹｔａｃＧＩＦ　）の培養物から抽出、精製すること
によっても得られることができた。特許請求の範囲第１
６項および同第１７項に記載の大腸菌形質転換体につい
ては各々特願昭５８−１３２５２４号および特願昭５８
−１６２３　：３７号明細書に開示されている。

本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ遺伝子は、特
願昭５７−８６１８０号明細書に記載されているよう］
こ、適当な長さのＤＮＡ断片をトリエステル法で化学的
■こ合成し、それらのＤＮＡ断片をライゲーション（Ｉ
ｉｇａｔｉｏｎ）して得ることもできるが、−万以下１
こ述べるように、特許請求の範囲第２２項１こ記載され
たＤＮＡ配列（ＧＩＦ１４Ｇをコードする化学的に合成
されたＤＮＡ遺伝子）から、所謂Ｍ１３ファージを用い
た１ｎｖｉｔｒｏまたは５ｉｔｅ　ｄｉｒｅｃｔｅｄ　
ｍｕｔａｔｉ。

ｎ法（Ｚｏｌ　ｌｅｒ　Ｍ、　Ｊ、　＆　Ｓｍ１ｔｈ、
　Ｍ、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ、Ｒｅｓ、１０：６４８
７．１９８２）を応用して得ることもできる。例えば、 １）ます、Ｍ１３ｍｐ９ファージ［市販品：Ｂｅｔｈｅ
ｓｄａ　Ｒｅ５ａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　
Ｉｎｃ。

Ｃ以下Ｂ　ＲＬ社と略）製］ｄｓＤＮＡ（二重鎖ＤＮＡ
）のＥ　ｃ　ｏ　ＲＩ　−Ｔ（ｉ　ｎ　ｃ　Ｈ断片にＧ
ＩＦ１４６コードする遺伝子（５′末にＥｃｏＲＩサイ
トをもち、３′末の５ａｌＩサイト７ｉ−Ｔ４ポリメラ
ーゼで（ｉｌｌ　ｉｎした）を挿入し、これをＥ、Ｃｏ
１１　Ｋ１２株由来のＪＭＩυ３（市販品：　ＢＲＬ社
製）Ｉこ形質転換する。

Ｘ−ｇａｌおよびＩ　ＰＴＧを含むＹＴ培地（０，８％
トリプトン、０５％酵母エキス、０．５％食塩、１５％
寒天〕上でｗｈｉＬｅ　ｐｌａｑｕｅ１１！：なるコロ
ニーを選んでファージＤ’ＮＡ（ＲＦＤＮＡと呼ぶ）を
抽出し、へそのＤＮＡの大きさ、制限酵素切断部位、塩
基配列等から形質転換体か否かをチェックする。

２）次に形質転換体の培養上清液より該ファージを分離
後、それよりファージＤＮＡ（−重ｇＤＮＡ：５ｓＤＮ
Ａ）を抽出し、これと下記のようなプライマーとしての
化学台［１ｉＩＥＤＮＡ断片とをアニーリングさせるっ
例えば、該化学台５ｉＤＮＡ断片は、特許請求の範囲第
５項または第２０項に記載のポリペプチドの１２８番目
から１３１番目のアミノ酸配列を・−ドするＤＮＡ配列
（５′八ＡＡＡＣＴＧＧＴＡＡＧ３′）のすぐ下流に翻
訳終止コドン（ＴＡＡ）と制限酵素５ａｌＩによる切断
認識配列（ＧＴＣＧＡＣ）、さらにその下流に特許請求
の範囲第４項または第２０項１こ記載のポリペプチドの
１３５番目から１３８番目までのアミノ酸配列をコード
するＤＮＡ５′ 配列（ＴＣＴＣＡＧＡＴＧＣＴＧ３’）が連らなってい
る一重鎖１）ＮＡ断片である。

３）上記のハイブリダイス′またはアニーリングされた
ＤＮＡ溶液に、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼ■
のｌａｒｇｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｋｌｅｎｏｗ　ｆｒ
ａｇｍわせしめ、１部（化学合成りＮＡ配列のうちＴＡ
ＡＧＴＣＧＡＣの部分、ファージＤＮＡ側では上記ポリ
ペプチドの１３２番目から１３４番目までのアミノ酸配
列をコードするＤＮＡＮＡ配列ＴＡＡＡＡＧＡの部分）
にｍｉｓｍａｔｃｈをもつｄｓＤＮＡを得る。

４）上記ｄｓＤＮＡをＪＭｌｌＪ３（既述）に形質導入
後、ＹＴ培地Ｉこ植菌し、得られるｗｌｌｉｔｅ　ｐｌ
ａｑｕｅを示すコロニーをＪＭＩυ３と混合塔−養後、
ＤＮＡ（ＲＦＤＮＡ）を抽出し、制限酵素による解析を
行い目的とするコロニーを得るっ次ｔこ該ファージを５
Ｍ１０３に感染させ、再びプラーグを形成させ、適当に
プラーグを選び、５Ｍ１０３と混合培養後ＤＮＡ（ＲＦ
ＤＮＡ）を抽出し、制限酵素による解析やＤＮＡ配列の
決定などを行い目的とするＤＮＡ配列即ち特許請求の範
囲第１４項記載のＤＮＡ配列を有するか否かをチェック
する。目的とするＤＮＡ配列を有する断片は、例えばｐ
ｌＮ５ＧＩＦ５４またはｐｔａｃＧＩＦ（各々特願昭５
８−１３２５２４号、向５８−１６２３３７号に記載）
プラスミドのＥｃ。

ＲＩ−５ａｌＩ切断点間１こ挿入されることにより、本
発明のポリペプチドを効率よく生産できるプラスミドベ
汐−を得ることができる。

以下、実施例において本発明１どおける新規な塩基性ポ
リペプチドおよびその製造法を述べるが、本発明は特許
請求の範囲においてこれらに限定されるものではない。

実施例 カザミノ酸（３％）を含む大腸菌用培地Ｍ９培地２１に
、大腸菌形質転換体Ｗ３１１０／ｐ　ｌＮ５ＧＩＦ５４
を接種しく種菌量、培地量の１％）、３０℃で２４時間
、通気攪拌培養を行ない、遠心分離（８，００Ｏｒｐｍ
、１０分）にて集菌した。２Ｉ！の培養から約４０ｇの
湿潤菌体を得ること−ができた。

３本の２１！の培養から得られる湿潤菌体約１３０ｇを
、５０　ｍＭ濃度のリン酸綬衡液ｐＨ０，０Ｃ以下ＫＰ
Ｂと略す）１１！に懸濁後遠心分離して集菌し、再度１
１のＫＰＢに懸濁した。この懸濁液を１０°Ｃ以下に冷
却後、マントンゴーリンホモゲナイザ−１５ＭＣＭａｎ
ｔｏｎ　Ｇａｕｌｉｎ社製）を用い、大腸菌細胞を破砕
した。

次に、遠心分Ｍ（７＋　ＯＵＯｒｐｍ、２０分）を行い
、沈澱区分と上澄区分に分けた。インターフェロン（Ｉ
ＦＮ）活性の大部分は上澄区分に見出され、その力価は
３．９　ｘ　ｌ　０５Ｕ／ｍｉ’であったＣ力価測方法
は後述する）。

次に、この上澄区分（約１１りのＩ）ＨをＩＮ水酸化す
）　ＩＪウムで７．０に調整後、冷却下Ｃ５℃〜１０℃
）にＩｌ！Ｉこ対し２４３ｇの硫酸アンモニウムを加え
３０分間から１時間放置した。続いて遠心分離（７，Ｕ
　＋ｌ　Ｏｒｐｍ、　２０分）し、沈澱区分と上澄区分
に分けた。ＩＦＮ活性の大部分は上澄区分に存在し１こ
。この上澄区分Ｃ約ｉｆ）に、冷却下（５℃〜１０℃）
に１４に対し２８５ｇの硫酸アンモニウムを加え３０分
間から１時間放置し１こ。

続いて、遠心分離（’７，０００　ｒｐｍ、２０分）し
、再び沈澱区分と上澄区分に分けた。ＩＦＮ　活性の大
部分は沈澱区分に存在していた。この沈澱区分を集め、
少量の氷冷した２０ｍＭ濃度のトリス塩酸緩衝溶液ｐＨ
７，５（以下ＴＨＢと略す）にて沈澱物を溶解した。尚
、ＴＨＢｆｆｉは硫酸アンモニウムによる塩析前の液量
の１０分の１にするのが好ましい。

この溶解液を透析チューブ（Ｕｎｉｏｎ　Ｃａｒｂｉｄ
ｅ社製）に入れ、約２０倍量の１０　ｍＭ　ＴＨＢ（、
ｐＨ７，５）に対し、冷室（約５°Ｃ）にて１回３時間
以上、２回透析外液を交換し透析を行った。透析後、上
記溶解液を冷却下］こ遠心分離（ｔｏ、ｔｌｏｏｒｐｍ
、２０分）にかけ沈澱物を除いた。ＩＦＮ活性の大部分
は上澄区分に存在し、その比活性（タンパク量に対する
ＩＦＮ活性）は約８ＸＩＯＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎで
あった。

２　゛イオン交換樹脂クロマトグラフィーによる精製 ａ、ＤＥＡＥセルローズグロマフロラフイ−ＤＥＡＥセ
ルローズＤＥ５２（ワンドマン社製）を蒸留水にてよ（
洗浄後、２０　ｍＭ　ＴＨＢ（ｐＨ７，５）に懸潤しＩ
Ｎ塩酸にてｐＨを７．５に調整、上記透析処理液に含ま
れる蛋白１１２０ｍｇ１こ対して、Ｌｍｌ］こなるよう
にカラムに充填した。このカラムに、上記透析済の試料
を、流坦約０．２　ｍｌ／　ａｍ２の速度で流下させ、
次１こ試料の約３倍里の２０　ｍＭ　ＴＨＢ（ｐＨ７，
５）　にてカラムを洗浄し１こ。流出液（試料通過区分
と洗浄液区分）は１０ｍ１　ずつ分画し、２８０　ｎｍ
の吸収（Ａ２８０）およびＦｏｌｉｎ　法による蛋白量
、およびＩＦＮ活性を測定した（第１図参照）。試料通
過区分（第１図ではｆｒａｃｆｉｏｎｎｏ、１０から３
０１こ相当）の比活性は約１×１０６Ｕ／ｍｇ　ｐｒｏ
ｔｅｉｎ　であった。

ｂＳＣＭセファデックスＣ−５０クロマトクラフイー ＣＭセファデックスＣ−５０（ファルマシア社製）を蒸
留水にてよく洗浄し充分膨潤させた後、２０　ｍＭ　Ｔ
ＨＢ（ｐＨ７，５）に懸濁し、ＤＥ５２カラム通過区分
に含まれる蛋白量５ｍｇ　に対して１ｍＡになるように
カラムに充填した。このカラムにＤＥ５２カラムの通過
区分溶液を流し目的ポリペプチドを吸着させた。該カラ
ム体積と同量の２０＋ｎＭＴＨＢＣｐＨ７，５）で洗浄
後、カラム体積の約５倍容量の５０　ｍＭ　Ｎａ　Ｃ１
から３００　ｍＭ　Ｎａ１ｌ！　の濃度勾配をつけたＮ
ａＣ１溶液を含む２０　ｍＭ　ＴＨＢ（ｐＨ７，５）に
て、目的ポリペプチドの溶出を行った。その溶出パター
ンを第２図に示した。ＩＦＮ活性区分はＮａＣ４濃度の
約１００　ｍＭ溶出区分に見出され、そのピークの比活
性は約５ＸＩＯＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎであった。

ｃ、ＣＭナセルース　クロマトグラフィーＣＭセルロー
スＣ−５２Ｃワツトマン？［）を蒸留水にてよく洗浄後
さらに５００ｍＭのギ酸アンモニウムで洗浄し緩衝化さ
せた。次に、１０ｍＭのギ酸アンモニウムで充分洗浄後
、蛋白量２ｍｇに対して１ｍＡ’になるようはカラムに
充填した。このカラムに、セファデックスＣ−５０クロ
マトグラフイーでのＩＦＳ活性溶出画分（第２図ではｆ
ｒａｃｔｉｏｎ　ｎｏ、２２から３０の両分に相当）を
５倍量の蒸留水で希釈した溶液を流し、目的ポリペプチ
ドを吸着せしめたつ続いて、カラム体積と同容量の１０
ｍＭギ酸アンモニウムで洗浄後、カラム体積の約５倍量
の１０ｍＭから２０　（ｌ　ｍＭの濃度勾配をつけたギ
酸アンモニウム溶液にて、目的ポリペプチドを溶出せし
めた。その溶出パターンを第３図に示した。主要なＩＦ
Ｎ活性を示す区分は、ｌ　ｌ　ＯｍＭから１３０　ｍＭ
のギ酸アンモニウム濃度のところ（第３図の■の区分）
に見出され、その比活性は１Ｘ１０　Ｕ／ｍｇ　ｐｒｏ
ｔｅｉｎであった。

尚、Ｃ−５２グロマトグラフイーにおいて、蛋白質の４
つのピークＣＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよび■）がみられたが
（第３図参照）、ＩＦＮ活性を示す目的とするポリペプ
チド（１３１個または１３２個のアミノ酸残基からなる
ポリペプチド）は、■のピーク（ｆｒａｃｔｉｏｎ　ｎ
ｏ、６５から７０　）　ｉコ相当するところに存在する
ことが、ポリアクリルアミドのＳＤＳ電気泳動法により
明らかとなった。

特許請求の範囲第２項記載のポリペプチドをコドするＤ
ＮＡ遺伝子を有するプラスミドによって形質転換された
大腸菌からの本発明のポリペプチド（ＧＩＦ１３１）の
製造例を以下に述べる。

Ｍ１３　ｍｐ　９　ＲＦ　ＤＮＡ（Ｂ　ＲＬ社）ｏ、５
μｇを３０μｌ　ＴＡ　ｂｕｆｆｅｒ（６６ｍＭ酢酸カ
リウム、１０ｍＭ酢酸マグネシウムおよびＱ、５ｍＭジ
チオスレイトルを含む３３　ｍＭ　）リス塩酸緩衝液、
ｐＨ７゜６）中で、ＥｃｏＲＩおよびＨｉ　ｎ　ｃ　１
］（各々１ユニ゛ント）を用いて３７℃、１時間加温す
ることにより分解後、１％アガロ−スゲｌし亀気泳動に
より一万■末端Ｃ平滑末端：　ｆｌｕｓｈｅｎｄ）をも
つ直鎖状ＤＮＡを分離した。

一万、ＧＩＦ１３１　をコードするＤＮＡ　は、以下に
述べるごとく、ＧＩＦ１４６をコードするＤＮＡをもつ
プラスミドＩ）ＩＮ５ＧＩＦ５４（特願昭５８−１３２
５２４号に記載）からｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｍｕｔａｔｉ
。

ｎによって得た。

ｐｌＮ５ＧＩＦ５４　ＤＮＡ　５μｇを５０ｐｌ　ＴＡ
　ｂｕｆｆｅｒに溶かし、５ａＪＩ（３０ｊ−１−ット
）を加え３７℃１時間加温した。次に、ｄＮＴＰ溶液（
ｄＡＴＰ、’　ｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを
各々２５ｍＭ含んだ浴液）１μＥと７４ＤＮＡポリメラ
ーゼ（１ユニツト）を加え３７℃で４５分間加温するこ
とにより、５ａｌＩ切断で生じた粘着末端部をｆｉｌｌ
ｉｎ　Ｌだ。次に６５°Ｃで３０分間加温することｌこ
より酵素反応をとめた後、ＥｃｏＲＩ（１０ユニツト）
を加え３７°Ｃ１時間反応させた。続いて１．５％アガ
ロースゲル電気泳動分離により得られる約４５（ｌ　ｂ
ｐ　ＤＮＡ断片に相当するゲルを切り出し、電気泳動法
（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｅｌｕｔｅ法）により該ＤＮＡ断片
を抽出・精製した。

上記の２種のＤＮＡ断片を２０μｌのライゲーション溶
液（１０ｍＨ塩化マグネシウム、’１ｍＭＡＴＰ、１０
ｍＭジチオスレイトルを含む２０ｍＭ）すス塩酸溶液、
ｐＨ７，５）中で、５ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼ（
ベーリンガーマンハイム社製）と１４°Ｃで１８時間反
応させた。この反応液３μｌ！を、常法通り塩化カルシ
ウム処理した大腸菌ＪＭ１０３（ＢＲＬ社より購入）５
０ｍＭ塩化カルシウム懸濁液に加え形質転換（ｔｒａｎ
ｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を行った。形質転ｍクローンの
選択は以下のように行った。

４５℃に保ったＸ−Ｇａ１およびＩＰＴＧを含むＹＴ軟
寒天培地（０，６％寒天、０．８％トリプトン、０５％
酵母エキス、０５％食塩の溶液３　ｍｌ　に、１００ｍ
Ｍ　ＩＰＴＧ　ｌ０１ｔｌ、２％Ｘ−Ｇａ１　５０ｐｌ
および対数増殖期のＪＭ１０３懸濁液０．２　ｍｌを加
えたもの）に、適当に希釈した上記の塩化カルシウム懸
濁液０．３　ｍｌ　を加え、ＹＴ寒天培地（１，５％、
寒天、０．８％トリプトン、０．５％酵母エキス、０゜
５％食塩）上にひろげて３７℃で１６時間培養した。生
じた白色のプラークより６クローンを選択し、２ＸＹＴ
液体培地（１，６％トリプトン、１％酵母エキス、］、
６６％食塩に植菌後３７℃で８時間培養した。次に該培
養液１ｍｌを１２，００　Ｏｒｐｍ１０分間遠心し、上
澄をファージ液として回収した。該ファージ液２５μｌ
に５μｌの１％ＳＤＳ、４０％グリセリン、０，２％ブ
ロムフェノールブルーからなる溶液を加え６５℃で１０
分間加温後、アガｖ　−スゲルにより目的とするＤＮＡ
（Ｍ１３ｍｐ９−ＧＩＦＬ４６ＲＰ：第４図）が得られ
ていることを確認するとともに該ファージＤＮＡ（−重
鎖ＤＮＡ：５ｓＤＮＡ）を以下番と述べるようにして分
離精製した。

上記ファージ液８００μｌに２．５　Ｍ食塩を含む２０
％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０υ０）２υ０μ
ｌを加え室温で１５分間放置後、１２，０００μｌｍ　
５分間の遠心分離によりファージを沈澱させた。このフ
ァージ沈澱をＴＩＥＳ　ｂｕｆｆｅｒ（１ｒｒＮＥＤＴ
Ａ　、１５０ｍＭ食塩を含む１０ｍＭ　トリス塩酸緩衝
液、ｐｌ（７，５）　１００μでに懸濁し、水飽和フェ
ノール５０μｌを加え５分間激しく混合後、１０．００
　Ｏｒｐｍ　５分間遠心分離を行った。水相より８０μ
ｌを分取し、これに３Ｍ酢酸ナトリウム３μｌおよびエ
タノール２００μｌ　を加えＤＮＡを沈澱させた。遠心
分離］こより回収された沈澱ＤＮＡをエタノールで１回
洗浄後ＴＥＳ　ｂｕｆｆｅｒ　５０μｌに溶解した。

次の配列：　５’　ＡＡＡＡＣＴＧＧ　ＴＡＡＧ　ＴＡ
ＡＧ　ＴＣＧ　ＡＣＴＣＴＣＡＧＡＴＧＣＴＧＴ３’か
らなるＤＮＡ断片を、同相法を用いたトリエステル法（
特開昭５８−２０１９９５号参照）で化学的１こ合成し
た。続いて、このＤＮＡ　４μｇをカイネージョンｂｕ
ｆｆ’ｅｒ（１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭＡＴＰ
を含む７０　ｍＭ　トリス塩酸緩衝液ｐＨ’７．５）２
０μｇに溶解し、これにポリヌクレオチドカイネース（
宝酒造社製）４ユニットヲ加え３７℃で４５分間反応さ
せることにより該化学合１１ｉ１ＥＤＮＡ断片の５′末
端をリン酸化した。

次に、この５′末端がリン酸化された化学合成りＮＡ　
断片０．５μｇを含む２．５μｌ　溶液に、上記（実施
例［−１−ａで得た）ファージＤＮＡ　溶液２、５　／
１１　およびＨｉｎ　ｂｕｆｆｅｒ（７０ｍＭ塩゛化マ
グネシウム、５ＵＯ，ｍＭＭ食塩含む７０ｍＭ）リス塩
酸緩衝液、ｐＨ７，５）１．５μｌを混合し、ガラスキ
ャピラリー（１００μｌマイクロピペツト使用）に封管
後、１υ０°Ｃ３分間加熱し次に４℃で２時間放置した
。次にこの混合液にＨｉｎ　ｂｕｆｆｅｒ２．５ｐｌ　
、５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴ
Ｐ各々２５μｌ、蒸留水１３．５μｌを加え、さらｌこ
ＤＮＡポリメラゼＩ　Ｋｌａ、ｎｏｗ　ｆｒａｇｍｅｎ
ｔ（ベーリンガーマンハイム社Ｗ）５ユニツトを加えて
室温で３０分間ＤＮＡ合成を行わせた。次に、１ｍＭに
なるようにＡＴＰを加えさらにＴ４ＤＮＡＵガーゼ（ベ
ーリンガーマンハイム社製）５ユニツトを加え１４°Ｃ
で１８時間反応させた。この反応液１０μｌを用い既述
の通り大腸菌ＪＭ　１１３３に形質転換せしめた。

前述（実施例■−１−ａｔこ記載）の如くして、育軟寒
天培地］こ生じたプラークより３６クローンを選択し、
２ＸＹＴ液体層地に植菌後３７°Ｃで８時間培養した。

培養液１ｍｅを１２．００Ｏｒｐｍ　１０分間遠心分離
し上澄をファージ液として回収した。

−万、沈澱物として得られ菌体をアルカリ抽出法（Ｂｒ
ｉｎｂｏｉｍ　、Ｈ，Ｃ，＆　Ｄｏｌｙ、Ｊ、＋　Ｎｕ
ｃｌ。

Ａｃ１ｄ、Ｒｅｓ、、７：　１５１３〜１５２３．　１
９７９）　ｌこ　よりＲＦＤＮＡ（二重鎖ＤＮＡ）を抽
出０分離し１こ。続いて、該ＲＦＤＮＡをＥ（１；ＯＲ
Ｉ　とＳａ／’■で二重消化した特約４００　ｂｐのＤ
ＮＡ断片が生じるようなりローンを選択した。さらに、
そのようなりローンからのＤＮＡを次にＢｇｌｎで消化
した時、ＧＩＦ遺伝子１こ相当するＤＮＡ領域（第６図
参照）がＢｇＪ■で切断されないようなりローンを選択
し、そのクローン（３６クローン中２クローン）から目
的とするＧＩＦ１３１をコードするＤＮＡを含有するも
のを得、各々をＭｌ　３ｍｐ９−ＧＩＦ　ｌ　３１−２
６および−３４と名ずけた。

次に各々を以下に述べる方法で純化した。Ｍ１３ｍｐ９
−ＧＩＦ１３１−２６および−３４１こ相当する先１こ
得たファージ液を用いてＪＭ１１Ｊ３に感染させ形質導
入後、前述と同様の方法でＲＦＤＮＡ（二重鎮ＤＮＡ）
を分離し、ＥｃｏＲＩとＳａｆ’Ｉの二重消化およびＢ
ｇＩ！Ｉｌ消化１こよる解析から目的とするクローンを
純化した。次ｔこ、２　Ｘ　ＹＴ液体培地８００ｍ１’
１こ、該クローンで感染させたＪＭＩ０３培養液０．８
ｍｅト非感染ＪＭＩ０３培養液８　ｍｅ　ｆ加え、３７
°Ｃで５時間培養後、遠心分離Ｉコより上澄からファー
ジ液を、沈澱からは感染菌を得た。感染菌から常法１こ
従いエチンウムブロマイドを含む塩化セシウム密度勾配
遠心１ｒよりＲＦＤＮＡを得た。−万、上澄のファージ
液からは、前述の方法でファージＤＮＡを得たのち、ｄ
ｉｄｅｏｘｙ　ｃｈａｉｎ　ｅｅｒｍｉｎａｔｉＯｎ法
ＣＭｏｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＥｎｚｙｍｏＪｏｇｙ　ｖｏ
ｌ。

ｆｉ５：５６υ−５８０，１９８０，Ａｃａｄｅｍｉｃ
　Ｐｒｅｓｓ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ参照）により塩基配列の決定を行つ１
こ。ソノ結果、調べたクローン（２つのクローン）共期
待通りの塩基配列、即ちＧＩＦ１３１　をコードするＤ
ＮＡの直後に終止コドン（ＴＡＡ）とＳａｇＩ切＠部位
を有した配列をもっていることが確認できた。

図参照）と形質転換 ｐｌＮ５ＧＩＦ５４　ＤＮＡ　２．５　μｇ　ｆ５（Ｊ
ｐｌ（ＤＴｋｂｕｆｆｅｒ　に溶解し、ＥｃｏＲＩ　と
　ＳａＡ’Ｉ　各々１０ユニツトを加え３７℃１時間加
温することにより完全にＥＣ０ＲＩ　と　５ａｆＩ　断
点を切断後、１％アガロースゲルを用いて大きい万のＤ
ＮＡ　断片を電気泳動法により分離した。

一方、先ｌこ得たＭ１３ｍｐ９−ＧＩＦ１３１−３４．
ＲＦＤＮＡ５μｇを５０　μｉのＴＡｂｕｆｆｅｒに溶
解し、Ｅ　ｃ　ｏ　Ｒ’Ｉ　と　５ａｌＩ　各々２０ユ
ニツトを加え３７°Ｃで１時間加温後、１．５％アガロ
ースゲルを用い約４０υｂｐのＤＮＡ断片（ＧＩＦ１３
１ＤＮＡ）を電気泳動法で分離し１こ。次に、このＤＮ
Ａ断片と先１こ得られたＤＮＡ断片をライゲーション溶
液２０μｌ！ｌこ溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１ユニッ
トを加え１４℃で１６時間反応させた。っこの反応液１
０μｊと塩化カルシウム処理した大腸菌Ｗ３１１０懸濁
液（Ｑ、　３　ｍｅの５０ｍＭ塩化カルシウム液）とを
混合し大腸菌Ｗ３１１０の形質転換を行った。続いて、
ｌ−当り４０μｇのアンピシリンを含むＮｕｔｒｉｅｎ
ｔａｇａｒ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）に適当蚤こ希釈した
上記混合液をひろげ一夜３７°Ｃで培養した。生じたコ
ロニーから適当］こ１２個のコロニーを選び、ｋｍｅ当
り４０μｇのアンピシリンを含むＬ−ｂ　ｒ　ｏ　ｔ　
ｈで３７°Ｃ１１８時間培養後、前記のアルカリ抽出法
によってプラスミドＤＮＡを分離・精製した。得られた
プラスミドＤＮＡが、ＥｃｏＲＩと５ａｌＩの２重分解
で約４００　ｂｐのＤＮＡ断片が生じ、ＢｇｌＨでは切
断されないことを確認した。適当１こ選択された１２個
の形質転換体はすべて目的とするプラスミドを有してい
１こ。このプラスミドをｐＩＮ５ＧＩＦ５４−１３１と
命名し、このプラスミドによって形質転換された大腸菌
Ｗ３１１（ｌをＷ３１１０／ｐ工Ｎ５ＧＩＦ５４−１３
１と命名しに０ 尚、大腸菌宿主株はＷ３１１０の代りにＷＡ８０２株を
用いて、上記と同様の方法でＧＩＦ１３１遺伝子を発現
する形質転換体ＷＡ８０２／ｐＩＮ５ＧＩＦ５４−１３
１を得ることができる。また、第６図■こおいてｐＩＮ
５ＧＩＦ５４プラスミドの代りにｐＹｔａｃＧＩＦ（特
願昭５８　１　（ｉ　２３３７号）を用い、上記と同様
な手法で、ＧＩＦ１３．１遺伝子発現ベクターｐＹｔａ
ｃＧＩＦ−１３１を造成し、そのプラスミドをＷＡ８０
２株もしくはＷ３１１０株に形質転換してＷＡ８０２／
ｐＹｔａｃＧＩＦ−１３１もしくはＷ３１１０／ｐＹｔ
ａｃＧＩＦ−１３１と称するＧＩＦ１３１生産形質転換
体を得ることもできる。

尚、本実施例で用いた制限酵素はすべて宝酒造社より購
入した。

ｓ、ｗ３ｘｔｏ／ｐＩＮ５Ｇｉｐｓ４−１３１１こよる
ＧＩＦ１３１の製造 カザミノ酸（３％）を含む大腸菌用Ｍ９培地２ｔ！］こ
、大腸菌形質転換体Ｗ３１１０／Ｉ）ＩＮ５ＧＩＦ５４
−１３１を接種し３０°Ｃで２４時間通気培養を行なっ
た。培養後遠心分離により約６０ｇの湿潤菌体を得た。

続いて、５０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ６゜０で洗浄後再
度同じ緩衝液に懸濁し、冷却下（１０℃以下）マントン
ゴーリン　ホモゲナイザー（既述）を用い細胞の破砕を
行った。次に、遠心針＊Ｃ７，ＯＵ　Ｕ　ｒｐｍ、２０
分）により沈澱区分と上澄区分に分け、上澄区分につい
て抗ウィルス活性（ＩＦＮ活性）を測定した（ＩＦＮ活
性活性測定法クコては後述する）。その結果、活性は５
　Ｘ　ｌ　ＯＵ／ｍｅであつ１こ。

次１こ、上記の上澄画分と各種標準蛋白質（ファルマシ
ア社製電気泳動標準蛋白キット、ロット番号２００７　
）とを１３％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた
ところ、約１６，０００の分子量に相当する位置に明ら
か１こ濃い蛋白のバンドが認められた。このバンドが、
コントロール（ｐｌＮ５ＧＩＦ５４−１３１プラスミド
を有していない大腸菌）では見出されなかったこと、お
よびその位置（泳動距離）が実施例■−１−ａで示すバ
ンドの位置（第９図ンと一致Ｌｒ、Ｉとから、Ｗ３１１
０／ｐＩＮ５ＧＩＦ５４−１３１　が明らか１こＧＩＦ
１３１ポリペプチドを生産しているが確認できた。尚、
本実施例で得られた上澄液からのＧＩＦ１３１の精製は
、実施例Ｉ−２に示した方法により行うことができるこ
とは明らかである。

ＩＩＩ　精製ポリペプチドの純度の検定ＣＭセルロース
Ｃ−５２グロマトグラフィーにより精製されたＩＦＮ活
性を有するポリペプチド区分の純度を以下のようにチェ
ックした。

１．３Ｄｓ電気泳動法 該精製ポリペプチド画分を、１３％アクリル゛アミドの
濃度て常法１こより５ＤＳｌｉ気泳動を行ツタところ、
分子量が約１６，０００（１６Ｋ）（７）ところに単一
のバンドがみられ、高純度に精製されていることがわか
った。

また、銀染色法Ｃ蛋白質、酵素基礎実験法堀雄。

山下編、　ｐ、４　Ｊ　９，１９８１：　南江堂）を行
ったが、該両分にはほとんど不純物が含まれていないこ
とも確認された。

２、　高速液体フロマトグラフィー法 該両分をウォーターズ社製マイクロボンダパックＣ１８
のカラムを使用し、高速液体クロマト（ウォーターズ社
製使用）グラフィーを行った。

目的ポリペプチドの溶出は、トリフロロ酢酸１こてｐＨ
２，０としたアセトニトリル溶液を用い、アセトニトリ
ルの濃度を２３％がら６９％１こ上昇さぜるどとにより
行った（第７図）。その結果、約５３％のアセトニトリ
ル濃度のところに単一のピークがみられた。尚、ポリペ
プチドは２１４　ｎｍの吸収（Ａ２１４）によって検出
した。

■　精製ポリペプチドの物理化学的性状以下の如く本発
明のポリペプチドの物理化学的性状１こついて検討した
。

■１分分子 量製ポリペプチドの分子量は、ポリアクリルアミドＳＤ
Ｓ電気泳動法（ＳＤＳ　ＰＡＧＥ）　および高速液体ク
ロマトグラフィーによる分子篩法により測定した。

ａ、ＳＤＳ　ＩＰＧＡＥ 各種標準蛋白質（ファルマシア社製電気泳動標準蛋白キ
ット、ロフト番号２υυ７）、ＧＩＦＩ４６ポリペプチ
ドおよび本発明の精製ポリペプチドとを１３％アクリル
アミドＳＤＳ電気泳動１こかけ分子量を推定した（第８
図参照）。第８図−ａはその電気泳動結果を示し、Ａは
ＧＩＦ１４６　ポリペプチド、Ｂ、Ｄ、Ｆは標準蛋白質
（９４に：フオスフオリラーゼＢ　、ｆｉ　７　Ｋ　：
ウシ血清アルブミン、４３に：卵白アルブミノ、３０に
：カルボニツクアンハイドラーゼ、２０に＝大豆ドリブ
ンツインヒビター、１４．４に：α−ラグトアルブミン
〕、Ｃ，Ｅは本発明における精製ポリペプチド、ＧはＧ
ＩＦ１４６ポリヘプチドと本発明のポリペプチドとの混
合物の電気泳動パターンを各々示す。第８図−ｂは、各
々の蛋白質もしくはポリペプチドの電気泳動距離をグラ
フに表わしたもので、このグラフから本発明のポリペプ
チドの分子量は約１６゜０００’（１６にンと推定され
たつ ｂ　高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）ＧＰＣカ
ラ、！−５Ｗ−３０００Ｃ東洋ンータ゛社製〕を用いた
高速液体クロマトグラフィ＝（溶媒として０．２ＭＮａ
Ｃ１！を含む０．１　Ｍリン酸カリを用い、流癒０．７
ｍｅ１分）Ｉこよる標準蛋白質（オリエンタル酵母社製
キット使用）と本発明におけるポリペプチドの溶出パタ
ーンのグラフ（第９図）がらは、本発明のポリペプチド
のみかけの分子量は約１７゜０００（１７Ｋ）と推定さ
れた。

２　等電点 本発明のポリペプチドの等重点（ＰＩ値）をアイソエレ
クトロフオーカンフグ法および平板法を用い測定した（
Ｖｅｓｔｅｒｂｅｒｇ＋　Ｏ，，８５ｖｅｎｓｓｏｎ　
Ｈ，、Ａｃｔａ　Ｃｈｅｍ、５ｃａｎｄ、２Ｌｌ：８２
０＋１９６６参照）。

フロマトフオーカンング法は、アンホラインｐＨ９〜１
１のものを使用し、カラム１１０型（いずれもスエーデ
ンＬＫＢ社製）を用い、松属ら（蛋白質、核酸、酵素Ｖ
ｏ１．１２；　Ｎｏ、　９．　ｐ、　７３７、１９６７
、共立出版）の方法１こ準じて行った（第１０図参照）
。その結果、第７図に示された如く、ｐＨがおよそ９．
２から９．４の両分に該ポリペプチドのＩＦＮ活性がみ
られ、平均の等電点（ＰＩ値）は約９．３と推定された
。

平板法は、ＬＫＢ社製マルチフオ屯気泳動装置を用イ、
ｐＨ７，８カラｌ　、ｏ、　ｏのアンホラインアクリｌ
レアミドゲル上で行った。その結果、本発明のポリペプ
チドの主たる等電点（ＰＩ値）は約９．８となった。尚
、およそのｐＩ値が９．３および１００のところにも少
里のバンドがみられたが、これらはこのポリペプチドの
重合性によるものではないかと思われる。

３、アミノ酸組成 本発明の精製ポリペプチド３９μｇを脱塩後、アミノ酸
分析用塩酸に溶解させ６ＮＨＣＪ’　溶液とした。これ
を真空中で封管し、１００°Ｃの電気炉で２４時間、４
８時間、７２時間加水分解した。

次に、減圧下で塩酸を除き、アミノ酸分折機日立８３５
−’５　Ｕ型Ｉこてアミノ酸分析を行った。Ｌｅｕ（ロ
イシン）の含有量を基準にとり５０分子量１６゜０００
として算出したアミノ酸組成を第１表に示した。理論値
は、特許請求の範囲第２項記載の１３１個のアミノ酸残
基からなるポリペプチド（Ｘは水素原子）からの値であ
る。

ＣｙＳｐ３Ｈ１，８５２ Ａｓｐ　１９．７０　２０ ＴｈｒｂＩｏ’ｏ、　’５ Ｓｅｒｂ８．９０　９ Ｇｌｘ　１５．５６　１６ Ｐｒｏ　２．２７　２ Ｇｌｙ　、　４．ｌＵ　４ Ａｌａ　７．０９　７ Ｃｙｓ　−− ＶａｌＣ７，９９８ Ｍｅｔｂ２．８９　３ １１ｅＣ６，８７７ Ｌｅｕ　９．００’　９ Ｔｙｒ　４８５　５ Ｐｈｅ　８．８５　９ Ｌｙｓ　１８．４７　１９ Ｈｉｓ　２．０６　２ Ａｒｇ　３．４０　３ ｒ　ｐｄ −１ ※　Ｌ６ｕを標準とした。

１ｋ・シ　２４時間、７２時間加水分解から計算。

ａ、ギ酸による酸化機分析 ｂ　Ｏタイムに外挿して計算した。

Ｃ４７２時間加水分解の値。

ｄ１本実験条件では測定できない。

４、　アミン基末端の解析 該精製ポリペプチドを塩酸性のメタノールに溶解させ、
フォルミル型のＭｅｔ（メチオニンンを全てフリーのＭ
ｅ　ｔｌこ変換した後、アミノ基末端を５％塩酸を含む
メタールで切断し、遊離されるアミノ酸を上記アミノ酸
分析機にて解析した結果、アミノ基末端のアミノ酸の約
３０％はＭｅｔ（フォルミル化Ｍｅｔ含む）であること
が推察された。

５、　アミノ酸配列（−次構造）とカルボキシル基末端
の解析 該精製ポリペプチド１ツ・を１．８ｒｎｌ・臭化シアン
（ＢｒＣＮ）を含むＱ、　１　ｍｅの７０％ギ酸に溶解
後、室温にて２４時間反応することにより、該ポリペプ
チドに含まれるＭｅｔ　を選択的に切断した。次］こ減
圧下にギ酸および臭化シアンを除去後、残査をｐＨ２，
０のトリフロロ酢酸含有１０％アセトニトリル水溶液に
溶解させた。これをμｍボンタ゛パツクＣｌ８（ウォー
ターズ社製）カラムを用い、高速液体クロマトグラフィ
ーＣウォーターズ社製）にて、アセトニトリルの濃度を
７５％まで上昇させることにより各成分を分別した。３
ケの溶出画分（Ｉ　：ＢｒＣＮ（４９〜８０）、Ｕ：Ｂ
ｒＣＮ（８１〜Ｌ　２０　）、およびＩＩＩ　：　Ｂｒ
ＣＮ（１２１〜ｌ　３１．））およびＢｒＣＮ分解なし
のポリペプチドについて、アミノ酸シークエンスアナラ
イザー（アプライドパイオンステムモデル４７０Ａ）を
用い、エドマン法によりアミノ酸列を解析した。

その結果を第１１図に示す。同図において矢印を示した
ところが、本実験Ｉこおいてアミノ酸配列が明らかとさ
れ１こものである。矢印のない部分のアミノ酸配例は、
特許請求の範囲第２項に記載の配列を記している。

カルボキシル基末端のアミノ酸は、カルボキシペプチダ
ーゼ法により該精製ポリペプチドを分解し生成するアミ
ノ酸を解析したところ、Ｌｙｓ（リジン）であることが
判明した。

以上の実験の結果（特に実施例ｌ１ｌ−３，、ｌｌｌ−
４゜１１１−５）および本物質の製造法からみて、本発
明におけるポリペプチドは、特許請求の範囲第２項に示
す１３１個もしくは１３２個のアミノ酸残基からなるポ
リペプチド（ＧＩＦ１３１と略す）であることを強く示
唆しているものである。

６、元素分析 該精製ポリペプチド２ツを蒸留水に対し透析・脱塩後凍
結乾燥し、その１．２０４ｙｙをパーキンエルマー２４
０Ｂ型元素分析機を用いＣ，Ｎ、　Ｈの元素分析を行な
った。その結果を第２表に示したＯ 第２表 測定値　理論値８ Ｃ４８，９８％　５３．７４％ Ｈ６，６７％　７．０６％ ※　特許請求の範囲第２項に記載の１３１個のアミノ酸
残基ア）らなるポリペプチドから計算っ即ち、Ｃｆ１８
４．Ｈ１ｆｉ７１，０２０６．Ｎ１８Ｌ　Ｓ５として計
算。

−尚、第２表において、測定値か理論値１こ比して若干
低い値を示しているが、Ｃ，Ｈ，Ｎの比を計算すると理
論比Ｃ：Ｈ：Ｎ−１：０．１３１：０゜３０９に対し測
定比Ｃ：　Ｈ：　Ｎ　−１：　０．１　：３６：０、３
　（１７となり良く一致している。

一般１こ、高分子のペプチドや蛋白質の凍結乾燥品には
、水分や精製時に用いた緩衝液成分等を含む可能性があ
り、この元素分析基こおける測定値と理論値との差は、
それに起因しているのではないかと推測される。

７、紫外吸収曲線 該精製ポリペプチドを０．２３　ｍｙ／　ｍｅの濃度１
こなるよう蚤こ１５ｍＭギ酸アンモニウムに溶Ｈし、３
４υｎｍから１９０　ｎｍにかけて吸収スペクトルを測
定した（島津ＵＶ２４０分光光度計使用）。

その結果を第１２図１こ示した。

該精製ポリペプチドを０．１　ｍｆ／　ｍｅの濃度にな
るように０．１５　Ｍギ酸アンモニウムに溶解し、０１
σのセルを用いグレード２で円二色性を測定したＣ日本
分光工業Ｊ−２１ＪＣ使用）。その結果を第１３因に示
した。

９、核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル 該精製ポリペプチド１９を脱塩後凍結乾燥し、０、７　
ｍｅ　（７）　Ｄ　２　ｏニ溶解ＬＮＭＲＮＴ３６０　
ＮＩＣ０ＬＥＴ製を用い周波数３ＦｉＯＭＨ（メガヘル
ン）にてＮＭＲスペクトルを測定した。その結果を第１
１図に示した。

１０、赤外吸収スペクトル 該精製ポリペプチド０．３　ｍｇを脱塩後凍結乾燥し、
ＫＢｒ錠剤法に従って赤外吸収スペクトルを測定した。

ＮＩＣＬ、ＥＴ５−ＤＸ　ＦＴ−ＩＲ機種を使用し、波
長は４６００　ｎｍから４０　Ｕ　ｎｍ　にかけて測定
した。その結果を第１２図に示した。

本発明のポリペプチドは既に記したようｆこ強いインタ
ーフェロン活性を有する。該ポリペプチドのインターフ
ェロン活性は以下に述べるように抗ウィルス活性によっ
て測定した。

抗ウィルス活性の測定はＦＬ羊膜とンンドウイルスを用
いたＣＰＥ５０法（細胞障害法：Ｔｌ１ｅＣ１ｉｎｉｃ
ａＪ　ＰｏｔｅｎｔｉａＩ！　ｏｆ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒ
ｏｎｐ、２９！Ｊ−３０９１９８０Ｔｏｋｙｏ　Ｕｎｉ
ｖｅ、ｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ）に従って行った。

検定用標準抗ウイルス活性物質としては、ヒト白血球１
こ５ＥＳ（スフフィロコツ力スエ／トドキシンＢ）を加
えて誘導生成され１こ粗インターフェロン溶液（はとん
どがカンマ型インターフェロン〕および精製アルファ型
インターフェロンを用いた。

尚、本発明１こおけるポリペプチドの抗ウィルス活性は
、ヒトα型およびβ型インターフェロン抗体との中和反
応で失活せず、ヒトγ型インターフェロン抗体で不活性
化されることま１こアガロース薄層ゲルによる免疫電気
泳動法（免疫化学同定法１”、２５〜２８．１９７３．
佐々木・村地編、東大出版会）Ｉこおいて抗ヒトγ型イ
ンターフェロン血清とのみに沈降線が認められることか
ら本発明におけるポリペプチド（ＧＩＦ１３１）はヒト
カンマ型インターフェロン様物質である言える。

２、生物学的活性の安定性 一般ｆこ、γ型インターフェロン活性は低いｐＨやＳＤ
Ｓ処理で容易に失活すると言われている。そこで本発明
１こおける精製ポリペプチドの生物学的活性の耐酸拳耐
アルカリ性、耐熱性、ＳＤＳ感受性等について調べた。

ａ、耐酸・耐アルカリ性 本発明の精製ポリペプチドを種々のｐＨの緩衝溶液１こ
ｌ　Ｏｔｔｇ　／ｍｅ　＋こなるよう溶解し、４°Ｃで
υ〜１４日間放置後、ｐＨ７，０の０．１　Ｍ　Ｕン酸
緩衡溶液にて希釈してｐＨを中性に調整したのち残留抗
ウィルス活性を測定した。その結果を第３表に示した。

５．５　１００　３２　３２　１６ ＳＰＢｂ）６．０　１００　６３　３２　３２６．５　
１００　６３　６３　６３ ７．０　１００　ｆｉ３　６３　６３ ＴＨＢｃ）７．５　１０ＬＩ　６３　６３　６３８．０
　５８　３２　３２　３２ ８．５　５８　３２　３２　１６ コントロール７．２　１００　６３　６３　６３※　コ
ントロールの残存活性を１００として算出した。

※※コントロールの絃衡液は０．１５ＭＮａｃＩ！　を
含むリン酸緩衡液 ａ　）ｓｏｄｉｕｍ　ａｃｅｔａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｂ
）ｓｏｄｉｕｍ　ｐｂｏｓｐｂａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｃ
）Ｔｒｉｓ−Ｈｙｄｒｏｃｂｌｏｒｉｄｅ　ｂｕｆｆｅ
ｒ第４表 残存抗ウィルス活性に） ｐＨ ＯＵ′ａ　２１１＠Ｊｌ　１２１ｍ ２．０　１０ＬＩ　３０　２０ ７．２（コントロール）　１００　１００　１００※　
コントロール（ｐＨ７，２）の残存活性７ｉ−１０ｆＪ
として算出した。

生物学的安定性を調べるため、該ポリペプチド１０μｇ
を蒸留水に溶かしＩＮ塩酸でｐＨを２０とした１ｍｌ’
の溶液をつくり、４°Ｃで０−１２時間放置後、ＩＮ　
ＮａＯＨで中和して残留抗ウィルス活性を測定し１こ。

その結果は第４表］こ示す如く、１２時間処理後も約２
０％の抗ウィルス活性が残存しており、天然のＩＦＮ−
γＣＧＩＦ１４６）　に比べ耐酸性があることが推察さ
れた。

ｂ、５ＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）感受！ 該精製ポリペプチドを１０μｇ／ｍｅになるように０，
１％ＳＤＳ水溶液に溶解し、４℃にて０〜１２時間放置
後、適当に蒸留水Ｉこて希釈し残存する抗ウィルス活性
を測定した。その結果は第５表に示す如く、２時間後で
約２０％、１２時間後でも約１０％の抗ウィルス活性が
残存しており、天然のＩＦＮ−γ（ＧＩＦ１４６ンＩこ
比べＳＤＳに対して耐性があることがう少がわれた。　
。

第５表 ※ ゆヤ　′存抗″″“活性り ※　コントロール（蒸留水）の残存活性を１００として
計算した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、抽出物のＤＥＡＥでルローズＤＥ５２クロマ
トグラフィー、第２図は、ＤＥ５２クロマトグラフィー
でＩＦＮ活性を有した両分のＣＭセファデックスＣ−５
０クロマトグラフイー、第３図は、Ｃ−５０クロマトグ
ラフイーでＩＦＮ活性を有した両分（ｆｒａｃｆｉｏｎ
　ｎｏ。２ｏから３０の両分）のＣＭセルロースＣ−５
２クロマトグラフイーを示す。第４図は、ＧＩＦ１４６
遺伝子断片のＭ１３ｍｐ９ＲＦＤＮＡへのクローニング
の概略を、第５図は、】ｎｖｉｔｒｏ　ｍｕｔａｔｉｏ
ｎにょるＧＩＦ１３１遺伝子をもつＲＦＤＮＡの調製法
の概略を、第６図は、ＧＩＦ１３１遺伝子発現ベクター
ＰＩＮ５ＧＩＦ５４−１３１の造成の概略を示す。第７
図は、本発明における精製ポリペプチドの高速液体クロ
マトグラフィーによる溶出バク−／を示す。第８図−ａ
は、本発明におけるポリペプチドおよびＧＩＦ１４６ポ
リペプアクリルアミ チドならびに標準蛋白質のポリへ茹卆ドＳＤＳ電気泳動
のパターンを示す。ＡはＧＩＦ１４６ポリペプチド、Ｂ
、Ｄ、Ｆは標準蛋白質、Ｃ，Ｅは本発明のポリペプチド
、ＧはＧＩＦ１４６と本発明のポリペプチドとの混合物
のパターンを示す。第８図−すは、各々のポリペプチド
および標準蛋白質の電気泳動距離をグラフに示したもの
である。第９図は、高速液体クロマトグラフィーを用い
た分子叶による本発明のポリペプチドと標準蛋白質の溶
出パターンをグラフに表わしたものである。第１０図は
、アイソエレクトロフオーカッシング法による本発明の
ポリペプチドの等定点ＣＰＩ値）測定のためのクロマト
グラフィーを示す。第１１図は、本発明における１３１
個のアミノ酸残基からなるポリペプチドのアミノ酸配列
およびその一次１１４造の肪″析（矢印）を示す。第１
２図から第１５図までは、各々本発明のポリペプチドの
ＵＶ吸収曲線、円二色性、ＮＭＲスペクトルおよび描外
吸収スペクトＪしを示す。 出願人　サン）　ＩＪ−株式会社 第６図 第７図 ５水ｖ＋　１　廣＆（ｃｍ） 第９図 ４才１０吋間（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎｔｉｍｅ）第１２図 第１３図 （す ３ト 手続補正書（酸） 昭和６０年１　月Ｊｏ日 １、　事件の表示 昭和５８年特許願第２４１４５７号 ３、　補正をする者 事件との関係　特許出願人 住　所　大阪府大阪市北区堂島浜２丁目１番４０号名　
称　サントリー株式会社 代表者佐治敬三 ４、代理人 “１６３の日付　昭和　年　月　日 ５・　拒絶理由通知 （発送日、昭和　年　月　日付） ６、　補正により増加する発明の数　０第６図 手続補正書（吐） 昭和６０年１　月３０日 特許庁長官殿 ２・　発明０名称　新規。塩基性ｉ＋＞−ニーｙ−ｙ−
ｖおよヶヤ。製ｊ、法３、　補正をする者 事件との関係　特許出願人 住　所　大阪府大阪市北区堂島浜２丁目１番４０号特許
請求の範囲 １．ＳＤＳ電気泳動法による みかけの分子量が約１６，０００．高速液体クロマトグ
ラフィーを用いた分子篩法によるみかけの分子量が約１
７．００’Ｏ１等電点（ＰＩ値）が９．２〜１０．０の
範囲、アミ７基末端がシスティンもしくはメチオニン、
カルボキシル基末端がリジン、アミノ酸組成がＡｓｘ　
２０．　Ｔｈｒ　５．　Ｓｅｒ　９．　Ｇｌｘ１６、Ｐ
ｒｏ　２．ＧＩＹ　４．Ａｌａ　７．Ｃｙｓ　２．Ｖａ
ｌ　８゜Ｍｅｔ３乃至４．　Ｉｌｅ　７．Ｌｅｕ　９．
Ｔｙｒ　５．、Ｐｂｅ９、Ｌｙｓ　１９．Ｈｉｓ　２．
Ａｒｇ　３．Ｔｒｐ　Ｉ　であることを特徴とする１３
１個もしくは１３２個のアミノ、酸残基からなる免疫イ
ンターフェロン様活性を有する新規な塩基性ポリペプチ
ド。（ただし、ＡｓｘはＡＳｐｆ！：Ａｓｎを含み、Ｇ
ｌｘは（、ｌｕとＧｌｎを含も。） ２、塩基性ポリペプチドが次のアミノ酸配列＝Ｘ　Ｃｙ
ｓ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ
　Ｖａｌ　Ｌｙｓ０ Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｌｙａ　Ｌ
ｙｓ　Ｔｙｒ　ＰｈｅＡｓｎ　Ａｈａ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ
　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｓｐ０ Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇ
ｌｙ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ０ Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｓ
ｅｒ　Ａｓｐ　Ａｒｇ０ Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｍｅｔ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　ａｌｎ　ｌ
ｉｅ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ０ ｐｈｅ　Ｔｙｒ　ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌ
ｙｓ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ０ Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｇ
ｉｎ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ０ Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａ
ｓｐ　Ｍｅｔ　Ａｓｎ０ Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ａ
ｓｎ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓで表わされることを特徴とする特
許請求の範囲第１項記載のポリペプチド。 （但シ、Ｘは水素原子又はメチオニル基を表わす。 ） ３、次のアミノ酸配列： Ｍｅｔ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｐ
ｒｏ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　ＬｙｓＧｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ
　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ０ Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｖ
ａｌ　Ａｌａ　Ａｓｐ０ Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇ
ｌｙ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ０ Ｌｙｓ　Ａｓｙ＋　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　
５ｅｒ　Ａｓｐ　Ａｒｇ’０ Ｌｙｓ　ｌｉｅ　Ｍｅｔ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｉ
ｌｅ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ０ Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　ｐｈｅ　Ｌｙｒ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌ
ｙｓ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ０ Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　ｌｌｅ　Ｇ
ｌｎ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ０ Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｉｃｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａ
ｓｐ　Ｍｅｔ　Ａｓｎ０ Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ａ
ｓｎ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　。 をコードする化学的に合成されたＤＮＡ配列を含有する
プラスミドによって形質転換された微生物の培養物から
得られることを特徴とする特許請求の範囲第１項または
第２項記載のポリペプチド。 、ｔａｃＧＩＦ１３１　で表わされる特許請求の範囲＄
３項記載のポリペプチド。 ５、　次のアミノ酸配列： Ｍｅｔ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｐ
ｒｏ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ０ Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｌ
ｙｒ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ０ 、Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　
Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｓｐ０ Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇ
ｌｙ　ｌｉｅ　Ｌｅｕ０ Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　にＩｕ　Ｇｌｕ　Ｓ
ｅｒ　Ａｓｐ　Ａｒｇ０ Ｌｙｓ　ＩＪｅ　Ｍｅｔ　にＩｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｚ
ｌｅ　Ｖａｌ　５ｅｒ０ Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｂｅ　Ｌ
ｙｓ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ０ Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　１１ｅ　Ｇ
ｌｎ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ０ Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａ
ｓｐ　Ｍｅｔ　Ａｓｎ０ Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｐ）ｉｅ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　
Ａｓｎ　Ｌｙｓ　ＬｙｓＧｌｎ　Ｍｅｔ　Ｌｅｔｓ　Ｐ
ｈｅ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｌａをフー
ドする化学的に合成されたＤＮＡ配列を含有するプラス
ミドによって形質転換された微生物の培養物から得られ
ることを特徴とする特許請求の範囲第１項または第２項
記載のポリペプチド。 ６　プラスミドがｐｌＮ５ＧＩＦ５４　もしくはｐＹｔ
ａｃＧＩＦで表わされる特許請求の範囲第５項記載のポ
リペプチド。 ７、形質転換された微生物か大腸菌である特許請求の範
囲第３項または第５項記載のポリペプチド。 ８、形質転換された大腸菌がＷ３１１０／ｐｌＮ５ＧＩ
Ｆ５４もＬ〈はＷＡ８０２／ｐｌＮ５ＧＩＦ５４で表わ
される特許請求の範囲第７項記載のポリペプチド。 ９、形質転換された大腸菌がＷＡ　８０２　／　ｐ　Ｙ
　ｔ　ａ　ｃＧＩＦ　もしくはＷ３１１０／ｐＹｔａｃ
ＧＩＦで表わされる特許請求の範囲第７項記載のポリペ
プチド。 １０　形質転換された大腸菌がＷ３１１０／ｐ　Ｉ　Ｎ
５ＧＩＦ５４−１３１もしくはＷＡ８０２／Ｉ）ＩＮ５
ＧＩＦ５４−１３１　で表わされる特許請求の範囲第７
項記載のポリペプチド。 １１、形質転換された大腸菌がＷ３１１０／ｐＹｔａｃ
ＧＩＦ１３］　もしくはＷＡ８０２／ｐＹｔａｃＧＩＦ
１３］で表わされる特許請求の範囲第７項記載のポリペ
プチド。 １２、次のアミノ酸配列： Ｍｅｔ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｐ
ｒｏ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ０ Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｌ
ｙｓ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ０ Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｖ
ａｌ　Ａｌａ　Ａｓｐ０ Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇ
ｌｙ　ｌｉｅ　Ｌｅｕ０ Ｌｙｓ、Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｓ
＋４　Ａｓｐ　Ａｒｇ０ Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｍｅｔ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　ｌ
ｉｅ　ＶａＪ　Ｓｅｒ０ ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌ
ｙｓ　Ａｓ’ｎ　Ｐｂｅ０ Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｇ
ｉｎ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ０ Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　ｌｉｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａ
ｓｐ　Ｍｅｔ　Ａｓｎ０ Ｖａｌ　Ｌｙｓ　ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ａ
ｓｎ、　Ｌｙｓ　ＬｙｓＡｓｎ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｖ’
ａｌ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　ＶａｌＡｌａ
　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓをコードする化学的
ｌこ合成されたＤＮＡ配列を含有するプラスミドによっ
て形質転換された微生物を培養し、その培養物から抽出
、精製するこ七を特徴とする特許請求の範囲第１項また
は第２項記載のポリペプチドを製造する方法。 １３、プラスミドがｐｌＮ５ＧＩＦ５４−１３１　もＬ
〈はｐＹｔａｃＧＩＰ１３１で表ゎされる特許請求の範
囲第１２項記載の方法。 １４、化学的に合成されたＤＮＡが次のＤＮＡ配列： ＡＡＣＴＧＧ　ＡＡＡ　ＧＡＡ　ＧＡＡ　ＴＣＴ　ＧＡ
ＣＣＧＴ　ＡＡＡ　ＡＴＣＴＴＧ　ＡＣＣＴＴＴ　ｃｒ
ｒ　ＣＴＴ　ＡＧＡ　ＣＴＧ　ＧＣＡ　ＴＴＴ　ＴＡＧ
ＡＴＧ　ＣＡＧ　ＴＣＴ　ＣＡＧ　ＡＴＣＧＴＴ　ＴＣ
Ｔ　ＴＴＣＴＡＣＴＴＣＴＡＣＧＴＣＡＧＡ　ＧＴＣＴ
ＡＧ　ＣＡＡ　ＡＧＡ　ＡＡＧ　ＡＴＧ　ＡＡＧＡＡＧ
　ＣＴＧ　ＴＴＣＡＡＡ　ＡＡＣＴＴＣＡＡＧ　ＧＡＣ
ＧＡＣＣＡＧＴＴＣＧＡＣＡＡＧ　ＴＴＴ　ＴＴＧ　Ａ
ＡＧ　ＴＴＣＣＴＧ　ＣＴＧ　ＧＴｃＴＣＴ　ＡＴＣＣ
ＡＧ　ＡＡＡ　ＴＣＴ　ＧＴＴ　ＧＡＡ　ＡＣＴ　ＡＴ
ＣＡＡＧＡＧＡ　ＴＡＧ　ＧＴＣＴＴＴ　ＡＧＡ　ＣＡ
Ａ　ＣＴｒ　ＴＧＡ　ＴＡＧ　ＴＴＣＧＡＡ　ＧＡＣＡ
ＴＧ　ＡＡＣＧＴＴ　ＡＡＧ　ＴＴＣＴＴＣＡＡＣＴＣ
ＴＣＴＴ　ＣＴＧ　ＴＡＣＴＴＧ　ＣＡＡ　ＴＴＣＡＡ
Ｇ　ＡＡＧ　ＴＴＧ　ＡＧＡＡＡＣＡＡＧ　ＡＡＡ　Ａ
ＡＧ　ＣＧＴ　ＧＡＣＧＡＣＴＴＣＧＡＡ　ＡＡＧＴＴ
Ｇ　ＴＴＣＴＴＴ　ＴＴＣＧＣＡ　ＣＴＧ　ＣＴＧ　Ａ
ＡＧ　ＣＴＴ　ＴＴＣＣＴＴ　ＡＣＴ　ＡＡＣＴＡＣＴ
ＣＴ　ＧＴＴＡＣＴ　ＧＡＣＣＴＴ　ＡＡＴＣ，ＡＡ　
ＴＧＡ　ＴＴＧ　ＡＴＧ　ＡＧＡ　ＣＡＡ　ＴＧＡ　Ｃ
ＴＧ　ＧＡＡ　ＴＴＡＧＴＡ　ＣＡＧ　ＣＧＴ　ＡＡＡ
　ＧＣＴ　ＡＴＣＣＡＴ　ＧＡＡ　ＣＴＧ　ＡＴＣＣＡ
Ｔ　ＧＴＣＧＣＡ　Ｔ’ｌＴ　ＣＧＡ　ＴＡＧ　ＧＴＡ
　ＣＴＴ　ＧＡＣＴＡＧＣＡＧ　ＧＴＴ　ＡＴＧ　ＧＣ
Ｔ　ＧＡＡ　ＣＴＧ　ＴＣＣＣＣＧ　ＧＣＴＧＣＴＧＴ
ＣＣＡＡ’ＴＡＣＣＧＡ　ｃＴＴ　ＧＡＣＡＧＧ　ＧＧ
ＣＣＧＡ　ＣＧＡＡＡＡ　ＡＣＴ　ＧＧＴ　ＡＡＧ　Ｔ
ＡＡ　Ｇ　３’ＴＴＴ　ＴＧＡ　ＣＣＡ　ＴＴＣＡＴＴ
　ＣＡＧＣＴ　ｓを有する特許請求の範囲第１２項記載
の製造法。 ） １５、形質転換された微生物が大腸菌である特許請求の
範囲第１２項または第１４項記載の方法。 １６、　形質転換された大腸菌がＷ３１１０／ｐＩＮ５
ＧＩＦ５４もしくはＷ８０２／ｐｌＮ５ＧＩＦ５４　で
表ゎされる特許請求の範囲第１５項記載の方法。 １７、形質転換きれた大腸菌かＷ３１１０　／　ｐＹｔ
　ａＣＧＩＦもしくはＷＡ８０２／ｐＹｔａｃＧＩＦで
表わされる特許請求の範囲第１５項記載の方法。 １８　形質転換はれた大腸菌がＷ３１１０／ｐｌＮ５Ｇ
ＩＦ５４−１３１　’Ｌしく　はＷＡ８０２／ｐＩＮ５
ＧＩＦ５４−１３１で表わされる特許請求の範囲第１５
項記載の方法。 １９、形質転換された大腸菌かＷ３１１０／ｐＹｔａｃ
ＧＩＦ１３１　もしくはＷＡ８０２／ｐＹｔａｃＧＩＦ
１３１で表わされる特許請求の範囲第１５項記載の方法
。 ２０　次のアミノ酸配列。 Ｍｅｔ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｐ
ｒｏ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ０ Ｇｌｕ　Ａｈａ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｌ
ｙｓ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ０ Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｖ
ａｌ　Ａｌａ　Ａｓｐ０ Ａｓｎ　Ｇａｙ　Ｔｈｒ　１−ｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　
Ｇｌｙ　ｌｉｅ　Ｌｅｕ０ Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｓ
ｅｒ　Ａｓｐ　ＡｒｇＬｙｓ　ｌｉｅ　Ｍｅｔ　Ｇｌｎ
　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ０ Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌ
ｙｓ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ０ Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　ｌｉｅ　Ｇ
ｉｎ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ０ Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　ｌｉｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａ
ｓｐ　Ｍｅｔ　Ａｓｎ０ Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ａ
ｓｎ　Ｌｙｓ　ＬｙｓＳｅｒ　（、Ｉｎ をコードする化学的に合成されたＤＮＡ配列を含有する
プラスミドによって形質転換された微生物を培養し、そ
の培養物から抽出、精製することを特徴とする特許請求
の範囲第１項または第２項記載のポリペプチドを製造す
る方法。 ２１、プラスミドかｐＩＮ５ＧＩＦ５４　もしくはｐＹ
ｔａｃＧＩＦで表わされる特許請求の範囲第２０項記載
の方法。 ２２、化学的に合成されたＤＮＡが次のＤＮＡ配列゛ ＧＡＡ　ＴＧＡ　ＴＴＧ　ＡＴＧ　ＡＧＡ　ＣＡＡ　Ｔ
ＧＡ　ＣＴＧ　ＧＡＡ　ＴＴΔＧＴＡ　ＣＡＧ　ＣＧＴ
　ＡＡＡ　ＧＣＴ　ＡＴＣＣＡＴ　ＧＡＡ　ＣＴＧ　Ａ
ＴＣＣＡＴ　ＧＴＣＧＣＡ　ＴＴＴ　ＣＧＡ　ＴＡＧ　
ＧＴＡ　ＣＴＴ　ＧＡＣＴＡＧＣＡＧ　ＧＴＴ　ＡＴＧ
　ＧＣＴ　ＧＡＡ　ＣＴＧ　ＴＣＣＣＣＧ　ＧＣＴ　Ｇ
ＣＴＧＴＣＣＡＡ　ＴＡＣＣＧＡ　ＣＴＴ　ＧＡＣＡＧ
Ｇ　ＧＧＣＣＧＡ　ＣＧＡＡＡＡ　ＡＣＴ　ＧＧＴ　Ａ
ＡＧ　ＣＧＴ　ＡＡＡ　ＡＧＡ　ＴＣＴ　ＣＡＧ　ＡＴ
ＧＴｒＴ　ＴＧＡ　ＣＣＡ　ＴＴＣ；　ＧＣＡ　ＴＴＴ
　ＴＣＴ　ＡＧＡ　ＧＴＣＴＡＣＣＴＧ　ＴＴＣＣＧＴ
　ＧＧＴ　ＣＧＴ　ＣＧＴ　ＧＣＴ　ＴＣＴ　ＣＡＧ　
ＴＡＡＧＡＣＡＡＧ　ＧＣＡ　ＣＣＡ　ＧＣＡ　ＧＣＡ
　ＣＧＡ　ＡＧＡ　ＧＴＣＡＴＴ３ ＣＡＧＣＴ　５ を有する特許請求の範囲第２０項記載の方法。（） ２３、形質転換された微生物が大腸菌である特許請求の
範囲第２０項または第２２項記載の方法。 ２４、形質転換された大腸菌がＷ３１１０／ｐＩＮ５Ｇ
ＩＦ５４もしくはＷＡ　８０２　／　ｐ　Ｉ　Ｎ　５　
Ｇ　ＩＦ　５４　で表わ享れる特許請求の範囲第２３項
記載の方法。 ２５　形質転換された大腸菌かＷ３１］０／ｐＹｔａＣ
ＧＩＦもしくはＷＡ　８０２　／　ｐ　Ｙ　ｔ　ａ　ｃ
　Ｇ　Ｉ　Ｆ　で表わされる特許請求の範囲第２３項記
載の方法。 ２６、形質転換された大腸菌がＷ３］１０／ｐｌＮ５Ｇ
ＩＦ５４−１３１もしくはＷＡ８０２／ｐＩＮ５ＧＩＦ
５４−１３１で表わされる特許請求の範囲第２３項記載
の方法。 ２７　形質転換された大腸菌かＷ３１　］　０／　ｐＹ
ｔ　ａ　ｃＧＩＦ１３１　もしくはＷＡ８０２／Ｔ）Ｙ
ｔａｃＧＩＦＩ３１で表わされる特許請求の範囲第２３
項記載の方法。 手続補正前 特許庁長官殿　Ｏｎ和６０年３月　７日およびその製造
法 ３、補正をＪる右 事件との関係　１シｔＦｆ出願人 住所　大阪府大阪市北区営島浜 ２丁目１番４０号 名称　ザントリー株式会礼 代表者　佐治　敬三 ４、代理人 住所　大阪市東区北浜４の４６　万成ピル５、補正命令
の日イ」　昭和６０年２月２２日（発送日、昭和６（）
年３月　５目付）６、補正の対象　昭和６０年１月３０
日（ｆｌ提出の手続補正１！１（自発） 特「［庁長官殿　昭和６０年１月３０日１、事件の表示
　昭和５８年特〃［願第２４１４５７＠２、発明の名称
　新規なＪｌｕ基性本性ポリペプチドびその製造法 ３、補正をする者 事件との関係　特γ［出願人 住所　大阪府大阪市北区営島浜 ２丁目１番４０号 名称　ザン１〜り一株式会社 代表者　佐治　敬三 ４、代理人 ６、−７＋ｌｉ正の対象　明細辺の発明の詳細な説明の
欄および図面 ７、補正の内容　明ｍ古を次表のとおり補正し、図面の
第２図、第３図、 第６図を別紙の通り訂正Ｊる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ｓＤｓ電気泳動法による みかけの分子量が約１　（’ｒ、０　（１０，高速液体
   クロマトグラフィーを用いた分子篩性によるみかけの分
   子量か約１７，０００、等電点（ＰＩ値）か９．２〜１
   ０．０の範囲、アミノ基末端がシスティンもしくはメチ
   オニン、カルボキシル基末端がリジン、アミノ酸組成が
   Ａｓｘ　２０　、　Ｔ１１ｒ　５　、　Ｓｅｒ　９　、
   　ＧｌｘｌＪＰｒｏ　２．Ｇｌｙ　４．Ａｌａ　７．Ｃ
   ｙｓ　２．Ｖａｌ　８゜Ｍｅｔ３乃至４．　ＩＪｅ　７
   　、　Ｌｅｕ　９　、　Ｔｙｒ　５　、　Ｐｈｅ９、Ｌ
   ｙｓ　１９．Ｈｉｓ　２．Ａｒｇ　３１Ｔｒｐ１　であ
   ることを特徴とする１３１個もしくは１３２個のアミ　
   ′ノ酸残甚からなる免疫インターフェロン様活性ヲ有す
   る新規な塩基性ポリペプチド。（ただし、ＡｓｘはＡｓ
   ｐ　Ｌ　Ａｓｎを含み、ＧｌｘはＧｌｕとＧｉｎを含む
   。） ２　塩基性ポリペプチドが次のアミノ酸配列：Ｘ　Ｃｙ
   ｓ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ
   　Ｖａｌ　Ｌｙｓ０ Ｇｌｕ゛Ａ１ａ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｌ
   ｙｓ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ０ Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｖ
   ａｌ　Ａｈａ　Ａｓｐ０ Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇ
   ｌｙ　Ｉｃｅ　Ｌｅｕ０ Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｓ
   ｅｒ　Ａｓｐ　Ａｒｇ５υ Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｍｅｔ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｉ
   ｌｅ　Ｖａｔ　Ｓｅｒ０ Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌ
   ｙｓ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ０ Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　ｌｉｅ　Ｇ
   ｌｎ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ０ Ｖａｌ　Ｇ、Ｉｕ　Ｔｈｒ　ｌｉｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　
   Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ａｓｎ０ Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ａ
   ｓｎ　Ｌｙｓ　ＬｙｓＡｓｎ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ
   　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｖａｌυυ Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｔｈｅ　’Ｇｌｙ　Ｌｙｓで表わされ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のポリペ
   プチドっ 〔但し、Ｘは水素原子又はメチオニル基を表わす６つ　
   〕３　次のアミノ酸配列： Ｍｅｔ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｐ
   ｒｏ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　ＬｙｓＧｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ
   　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　ＰｈｅＡ
   ｓｎ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｖａ
   ｌ　Ａｌａ　Ａｓｐ０ Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｐｂｅ　Ｌｅｕ　Ｇ
   ｌｙ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ０ Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｓ
   ｅｒ　Ａｓｐ　Ａｒｇ０ Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｍｅｔ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｉ
   ｌｅ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ０ Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｂｅ　Ｌ
   ｙｓ　八ｓｎ　Ｉ’ｂｅ０ Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｉｊｅ　Ｇ
   ｌｎ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ０ Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａ
   ｓｐ　Ｍｅｔ　Ａｓｎ０ Ｖａｌ　Ｌｙｓ　円】ｅ　Ｐｌｌｅ　Ａｓｎ　Ｓｅ’ｒ
   　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　ＬｙｓＡｌａ　Ｌｙｓ　Ｔ１１ｒ　
   Ｇｌｙ　Ｌｙｓをコードする化学的に合成され１こＤＮ
   Ａ配列を含有するプラスミド１こよって形質転換された
   微生物の培養物から得られることを特徴とする特許請求
   の範囲第１項または第２項記載のポリペプチド。 ４１．　プラスミドがｐＩＮ５ＧＩＦ５４．１３１もし
   くはｐＹｔａｃＧＩＦ１３Ｌで表わされる特許請求の範
   囲第３項記載のポリペプチド。 ５、　次のアミノ酸配列： ２υ Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ａ
   ｌａ　Ａｓｐ　Ａｓｎ０ Ｇｌｙ　Ｔｂｉ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｉ
   ｃｅ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ４υ Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ａ
   ｓｐ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ０ １１ｅ　Ｍｅｔ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｉｌｅ　Ｖ
   ａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｂｅ０ Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｉｌｅ　Ｌｙｓ　
   Ａｓｎ　円】ｅｌ、、ｙＳ０ Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｇｌｎ　Ｌ
   ｙｓ　Ｓｅｒ　Ｖａ１０ Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｍ
   ｅｔＡｓｎ　Ｖａ１０ Ｇｉｎ をフードする化学的に合成されたＤＮＡ配列を含有する
   プラスミドにまって形質転換された微生物の培養物から
   得られることを特徴とする特許請求の範囲第１項または
   第２項記載のポリペプチド。 ６、　プラスミドがｐＩＮ５ＧＩＦ５４もしくはｐＹｊ
   ａｃＧＩＦで表わされる特許請求の範囲第５項記載のポ
   リペプチド。 ７、形質転換された微生物が大腸菌である特許請求の範
   囲第３項または第５項記載のポリペプチド。 ８、形質転換された大腸菌がＷ３１ＬＤ／ｐＩＮ５ＧＩ
   Ｆ５４もしくはＷＡ８　（１２名）ｌＮ５ＧＩＦ５４　
   で表わされる特許請求の範囲第７項記載のポリペプチド
   。 ９、形質転換された大腸菌かＷＡ８（１２／ｐＹｔａｃ
   ＧＩＦ　もしくはＷ３１１０／ｐＹｔａｃＧＩＦ　で表
   わされる特許請求の範囲第７項記載のポリペプチド。 １０、形質転換され１こ大腸菌がＷ３１１０／ｐ　ｌＮ
   ５ＧＩＦ５４−１３１もしくはＷＡ８Ｌ１２／ｐｌＮ５
   ＧＩＦ５４−１３１で表わされる特許請求の範囲第７項
   記載のポリペプチド。 １１、形質転換された大腸菌かＷ３１１Ｌｌ／ｐＹｔａ
   ＣＧＩＦ１３１もしくはＷＡ８ＬＩ２／ｐＹＬａｃＧＩ
   ＦＬ３１で表わされる特許請求の範囲第７項記載のポリ
   ペプチド。 １２、次のアミノ酸配列： Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｌ
   ｙｓ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅｌ０ Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｖ
   ａｌ　Ａｌａ　Ａｓｐ０ Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇ
   ｌｙ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ０ Ｌｙｓ　Ａｓｎ’Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｓ
   ｅｒ　Ａｓｐ　Ａｒｇ０ Ｌｙｓ　Ｉｃｅ　Ｍｅｔ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｉ
   ｌｅ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ０ Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌ
   ｙｓ　Ａｓｎ　Ｐｈｅｌ０ Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｇ
   ｌｎ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ０ Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａ
   ｓｐ　Ｍｅｔ　Ａｓｎ０ Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｉ”ｈｅ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　
   Ａｓｎ　Ｌｙｓ　ＬｙｓＬｙｓ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ａｓ
   ｐ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ１υ０ をコードする化学的ｆこ合成されたＤＮＡ配列を含有す
   るプラスミド１こよって形質転換された微生物を培養し
   、その培養物から抽出、精製することを特徴とする特許
   請求の範囲第１項または第２項記載のポリペプチドを製
   造する方法。 １３、プラスミドか１）ｌＮ５ＧＩＦ５４−１３１　も
   しくはｐＹｔａｃＧＩＦ１３１で表わされる特許請求の
   範囲第１２項記載の方法。 １４・　化学的に合成されｆニー　Ｄ　Ｎ　Ａか次のＤ
   ＮＡ配列： ＴＴＣＧＡＣＡＡＧ　’ｌ−１’ｌ’　１丁Ｇ　ＡＡＧ
   　１ＴＣＣＴＧ　ＣＴＧ　ＧＴＣＴＣＴ　ＡＴＣＣＡＧ
   　ＡＡＡ　ＴｃＴ　ＧＴＴ　ＧＡＡ　ＡＣＴ　ＡＴＣＡ
   ＡＧＡＧＡ　ＴＡＧ　ＧＴＣＴＴＴ　ＡＧＡ　ＣＡＡ　
   ＣＴＴ、ＴＧＡ　ＴＡＧ　ＴＴＣを有する特許請求の範
   囲第１２項記載の製造法。 １５、形質転換された微物が大腸菌である特許請求の範
   囲第１２項または第１４項記載の方法。 １６、形質転換された大腸菌がＷ３１　ｉ　ｏ／ｐ　ｌ
   Ｎ５ＧＩＦ５４もしくはＷ８０２／ｐＩＮ５ＧＩＦ５４
   で表わされる特許請求の範囲第１５項記載の方法。 １７、形質転換された大腸菌がＷ３１１　ｏ／ｐＹｔ　
   ａｃＧＩＦもしくはＷＡ８０２／ｐＹｔａｃＧＩＦで表
   わされる特許請求の範囲第１５項記載の方法。 １８　形質転換され１こ大腸菌がＷ３１１０／ｐＩＮ５
   ＧＩＦ５４−１３１　もＬ＜　はＷＡ８０２／ｐＩＮ５
   ＧＩＦ５４−１３１で表わされる特許請求の範囲第１５
   項記載の方法。 １９　形質転換された大腸菌がＷ３１１　ｏ／ｐＹ　ｔ
   　ａｃＧＩＦ１３１もしくはＷＡ８（１２，／ｐＹｔａ
   ｃＧＩＦ１３１で表わされる特許請求の範囲第１５項記
   載の方法。 ２０、次のアミノ酸配列： Ｍｅｔ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｐ
   ｒｏ　Ｔｙｒ　Ｖａｔ　Ｌｙｓ０ ＧＩＩＪ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　
   Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ０ Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　ｌ４ｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　
   Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｓｐ０ Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇ
   ｌｙ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ０ Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｓ
   ｅｒ　Ａｓｐ　Ａｒｇ０ Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｍｅｔ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｉ
   ｌｅ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ０ ｐ）１ｅ　Ｔｙｒ　円〕ｅ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　
   Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｐｂｅ０ Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｇ
   ｉｎ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ０ Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｂｒ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａ
   ｓｐ　Ｍｅｔ　Ａｓｎ０ Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｐｂｅ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ａ
   ｓｎ　Ｌｙｓ　ＬｙｓＬｙｓ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ａｓｐ
   　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ００ Ａｒｇ　ＧＩｙ’Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇ
   ｉｎをコードする化学的に合成され７：　Ｄ　Ｎ　Ａ配
   列を含・有するプラスミドによって形質転換された微生
   物を培養し、その培養物から抽出、精製することを特徴
   とする特許請求の範囲第１項または第２項記載のポリペ
   プチドを製造する方法。 ２１、プラスミドがｐＩＮ５ＧＩＦ５４　もしく　１′
   ！ｐＹｔａｃＧＩＦで表わされる特許請求の範囲第２１
   項記載の方法。 ２２　化学的に合成されたＩ）　Ｎ　Ａが次のＤＮＡ配
   列： ＡＡＧ　Ｔｆ’Ｇ　ＣＧＡ　ＣＣＡ　ＧＴＡ　ＡＧＡ　
   ＣＴＧ　ＣＡＡ　ＣＧＡ　ＣＴＧＡＡＣＧＧＴ　ＡＣＴ
   　ＣＴＧ　ＴＴＣＣＴＧ　ＧＧＴ　ＡＴＣＣＴＧ　ＡＡ
   八へＴＧ　ＣＣＡ　ＴＧＡ　ＧＡＣＡＡＧ　ＧＡＣＣＣ
   Ａ　ＴＡＧ　ＧＡＣＴＴ’ｒＡＡＣＴＧＧ　ＡＡＡ　Ｇ
   ＡＡ　ＧＡＡ　ＴＣＴ　ＧＡＣＣＧＴ　ＡＡＡ　ＡＴＣ
   ＴｒＧ　ＡＣＣＴＴＴ　ＣＴＴ　ＣＴＴ　ＡＧＡ　ＣＴ
   Ｇ　ＧＣＡ　ＴＴｒ　ＴＡＧＡＩ’Ｇ　ＣＡＧ　ＴＣＴ
   　ＣＡＧ　ＡＴＣＧＴＴ　ＴＣＴ　ＴｒＣＴＡＣＴＴＣ
   ＴＡＣＧＴＣＡＧＡ　ＧＴＣＴＡＧ　ＣＡＡ　ＡＧＡ　
   ＭＧ　ＡＴＧ　ＡＡＧＡＡＧ　ＣＴＧ　ＴＴＣＡＡＡ　
   ＡＡＣＴＴＣＡＡＧ　ＧＡＣＧＡＣＣＡＧＴｒＣＧＡＣ
   ＡＡＧ　ＴＴＴ　ＴｒＧ　ＡＡＧ　ＴＴＣＣＴＧ　ＣＴ
   Ｇ　ＧＴＣＴＣＴ　ＡＴＣＣＡＧ　ＡＡＡ　ＴＣＴ　Ｇ
   ＴＴ　ＧＡＡ　ＡＣＴ　ＡＴＣＡＡＧＡＧＡ　ＴＡＧ　
   ＧＴＣＴＴＴ　ＡＧＡ　ＣＡＡ　ＣＴＴ　ＴＧＡ　ＴＡ
   Ｇ　ＴｒＣＧＡＡ　ＧＡＣＡＴＧ　ＡＡＣＧＴＴ　ＡＡ
   Ｇ　ＴＴＣＴＴＣＡＡＣＴＣＴＣＴｒ　ＣＴＧ　ＴＡＣ
   ＴＴＧ　ＣＡＡ　ＴＴＣＡＡＧ　ＡＡＧ　ＴＴＧ　ＡＧ
   ＡＡＡＣＡＡＧ　ＡＡＡ　ＡＡＧ　ＣＧＴ　ＧＡＣＧＡ
   ＣＴＴＣＧＡＡ　ＡＡＧＴＴＧ　ＴＴＣＴＴｒ　ＴｒＣ
   ＧＣＡ　ＣＴＧ　ＣＴＧ　ＡＡＧ　Ｃ’ｌＴ　ＴＴＣＣ
   ゛「丁　ＡＣＴ　ＡＡＣＴＡＣＴＣＴ　ＧＴＴ　ＡＣＴ
   　ＧＡＣＣＴＣ’　ＡＡＴＧＡＡ　ＴＧＡ　ＴＴＧ　Ａ
   ＴＧ　ＡＧＡ　ＣＡＡ　ＴＧＡ　ＣＴＧ　ＧＡＡ　ＴＴ
   ＡＧＴＡ　ＣＡＧ　ＣＧＴ　ＡＡＡ　ＧＣＴ　ＡＴＣＣ
   ＡＴ　ＧＡＡ　ＣＴＧ　ＡＴＣＣＡＴ　ＧＴＣＧＣＡ　
   ＴＴＴ　ＣＧＡ　ＴＡＧ　ＧＴＡ　ＣＴＴ　ＧＡＣＴＡ
   ＧＣＡＧ　ＧＴＴ　ＡＴＧ　ＧＣＴ　ＧＡＡ　ＣＴＧ　
   ＴＣＣＣＣＧ　ＧＣＴ　ＧＣＴＧＴＣＣＡＡ　ＴＡＣＣ
   ＧＡ　ＣＩＴ　ＧＡＣＡＧＧ　ＧＧＣＣＧＡ　ＣＧＡＡ
   ＡＡ　ＡＣＴ　ＧＧＴ　ＡＡＧ　ＣＧＴ　ＡＡＡ　ＡＧ
   Ａ　ＴＣＴ　ＣＡＧ　ＡＴＧ丁汀ＴＧＡ　ＣＣＡ　ＴＴ
   ＣＧＣＡ　ＴＩＴ　ＴＣＴ　ＡＧＡ　ＧＴＣＴＡＣＣＴ
   Ｇ　ＴＴＣＣＧＴ　ＧＧＴ　ＣＧＴ　ＣＧＴ　ＧＣＴ　
   ＴＣＴ　ＣＡＧ　ＴＡＡＧＡＣＡＡＧ　ＧＣＡ　ＣＣＡ
   　ＧＣＡ　ＧＣＡ　ＣＧＡ　ＡＧＡ　ＧＴＣＡＴＴＧ３
   ′ ＣＡＧＣＴ　５’ を有する特許請求の範囲第２０項記載の方法。（但し、
   口で囲んだ配列はＴＧＴであってもよい。〕ＣＡ ２３、形質転換されＴこ微生物が大腸菌である特許請求
   の範囲第２０項または第２２項記載の方法。 ２４　形質転換された大腸菌がＷ３１１０／ｐｌＮ５Ｇ
   ＩＦ５４もしくはＷＡ８０２／１）ＩＮ５ＧＩＦ５４て
   表わされる特許請求の範囲第２３項記載の方法。 ２５、形質転換された大腸菌がＷ３１１０／ｐＹｔａｃ
   ＧＩＦもしくはＷＡ８Ｕ２／ｐＹｔａｃＧＩＦで表わさ
   れる特許請求の範囲第２３項記載の方法。 ２６　形質転換された大腸菌かＷ３１１０／ｐＩＮ５Ｇ
   ＩＦ５４−１３１　もしくはＷＡ８０２／Ｉ）ＩＮ５Ｇ
   ＩＦ５４−１３１で表わされる特許請求の範囲第２３項
   記載の方法。 ２７、形質転換された大腸菌がＷＢ２１　ｏ／ｐＹ　ｔ
   　ａｃＧＩＦ１３１もしくはＷＡ８０２／ｐＹｔａｃＧ
   ＩＦ１３１で表わされる特許請求の範囲第２３項記載の
   方法。