JP2566909B2 - 新規遺伝子配列、それによつてコ−ドされるｉ型インタ−フエロンペプチドおよびそのインタ−フエロンを産生する微生物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規なＩ型インターフエロンを製造する組
換えDNA法およびその方法に必要な生成物たとえば遺伝
子配列、組換えDNA分子、発現ビーグル、発現生物体に
関する。

より詳細には、本発明は、第３図および第４図に示さ
れる新規なＩ型ヒトインタフェロン蛋白質のコード配列
を含有する組換えDNAにおいて、 そのコード配列は、（ａ）大腸菌HB101中プラスミドE
76−E9（DSM番号3003でDSMに登録）もしくは（ｂ）大腸
菌HB101プラスミドP9A2（DSM番号3004でDSMに登録）のP
st−１切断サイトにおいて挿入された断片として、また
は同挿入断片の、１個または複数個のアミノ酸の付加、
挿入、欠失または置換体である、変異体であって、同挿
入断片と同じ機能を有する変異体として存在する組換え
DNA、該組換えDNAを含有する細菌中で複製可能なビーク
ルおよび該ビークル中の遺伝情報を含有する形質転換細
菌に関する。

インターフエロンは、一部は重複し一部は分岐した生
物学的活性によつて特徴づけられるヒト細胞における内
因性のいくつかの蛋白質につけられた造語である。これ
らの蛋白質は生体の免疫応答を修飾し、ウイルスにする
防御に寄与するものと考えられている。たとえば、イン
ターフエロンは大きく３種に、すなわちα，βおよびγ
−インターフエロンに分類されている。また、インター
フェロンは、２種の型、すなわちＩ型インターフエロン
およびII型インターフエロンにも分類される。Ｉ型イン
ターフエロンはさらに、α−インターフェロンおよびβ
−インターフェロンに分かれる。これらは、共通の先駆
蛋白質に由来するものと思われる。一方、II型インター
フエロンはγ−インターフェロンと命名され、Ｉ型イン
ターフエロンとは無関係である。

βおよびγ−インターフエロンはヒトではただひとつ
の亜種が知られている［たとえば、オーノほか（Ohno e
t al）：プロシーデイングス・オブ・ナシヨナル・アカ
デミー・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）、第78
巻、5305〜5309（1981）；グレーほか（Gray et al）：
ネイチヤー（Nature）、第295巻、503〜508（1982）；
タヤほか（Taya et al）：イーエムビーオー・ジヤーナ
ル（EMBO Journal）、1/8、953〜958（1982）参照］。
一方、α−インターフエロンについては数種の亜種が記
載されている［たとえば、フイロソフィカル・トランス
アクシヨンズ・オブ・ザ・ロイアル・ソサイアテイー・
オブ・ロンドン（phil.Trans.R.Soc.Lond.）、第299
巻、７〜28（1982）参照］。成熟α−インターフエロン
は各亜種間の最大分岐23％、アミノ酸長約166個である
ことが明らかにされている。異常に高い分子量［SDSポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により26,000:ゴーレン
（Goren,P.）ほか：バイロロジー（Virology）、第130
巻、273〜280（1983）］をもつα−インターフエロンも
報告されている。このインターフエロンはIFN−α26Kと
呼ばれていて、特異的な抗ウイルスおよび抗細胞活性は
これまで知られているもののうち最高である。

現在まで知られているインターフエロンは各種の疾患
に対して有効なこと考えられているが、多くの他疾患で
はほとんどあるいは全く効果がみられない［たとえばポ
ーレツジ（Powledge）：バイオテクノロジー（Bio/Tech
nology）、1984年３月、215〜228頁、インターフエロ
ン、・オン・トライアル（Interferon on Trial）参
照］。インターフエロンはまた、副作用に難点がある。
たとえば、第１相試験に基づいて安全性が確信されてい
た組換えα−インターフエロンの抗癌性に対する臨床試
験では、約5000万単位の用量で、たとえば、急性の錯乱
状態、手足が動かなくなる関節痛、ひどい疲労および食
欲不振、失見当識、けいれんおよび肝毒性の随伴が認め
られた。

1982年、フランス政府は、インターフエロン服薬中の
癌患者に致命的な心臓発作がみられたのち、臨験の中止
を指示した。最近の米国における臨床試験でも少なくと
も２例の心臓の副作用による死亡例が報告されている。
少なくとも一部の副作用、たとえば発熱、倦怠は、イン
ターフエロン分子自体に固有のもので、混入した不純物
によるものではないことが次第に明らかになつてきた。

インターフエロンに対する大きな期待と、副作用を減
弱させたさらに新しいインターフエロン様分子の発見に
対する願望から、本発明者らはそのような新規物質の探
索および製造に着手した。

本発明は、リーダーペプチドを含有してもよいある種
の新規Ｉ型インターフエロン、およびそのＮ−グリコシ
ル化誘導体（本明細書においてはω−インターフエロン
またはIFN−ωと呼ぶ）であつて、アミノ酸168〜174
個、好ましくは172個を含有し、これまで公知のα−イ
ンターフエロン亜種に比べて分岐30〜50％、好ましくは
40〜48％、β−インターフエロンに比べて分岐約70％で
あり、一方、α−インターフエロンと類似の有効性を示
すがこれらの分子の公知の治療上の多くの欠点を示さな
い新規インターフエロンに関するものである。

すなわち、本発明は、完全に精製されたグリコシル化
されていないまたはグリコシル化された新規インターフ
エロン、それをコードする遺伝子配列、ならびにその配
列を含有する組換え分子を提供する。本発明は、上述の
遺伝子配列を含有する発現ビークルたとえばプラスミ
ド、ならびに発酵または組織培養法によりこの新規イン
ターフエロンを産生できる各種宿主、とたえば微生物ま
たは組織培養宿主を提供する。

好ましい態様においては、本発明は、以下の式を有す
るω−インターフエロンおよび相当する遺伝子配列を提
供するものである。

111番目の配列GGG（Glyをコードする）はGAG（gluを
コードする）に置換することもできる。好ましい分子と
しては、78番目のアミノ酸がＮ−グルコシル化されてい
る誘導体も包含される。

上述の２種のω−インターフエロンは、たとえば式 で示されるリーダ−ペプチドを含有していてもよい。

本発明における新規なω−インターフエロンおよびそ
れをコードするDNA配列は以下の方法で得られる。

ヒトＢ細胞リンホイド系、たとえばナマルワ細胞［ク
ライン（Klein,G.）ほか：インターナシヨナル・ジヤー
ナル・オブ・キヤンサー（Int.J.Cancer）、第10巻、44
（1972）参照］はウイルス、たとえばセンダイウイルス
処置によつて刺激され、α−およびβ−インターフエロ
ンを同時に産生する。この過程で、生成したmRNAをナマ
ルワ細胞から単離すると、次にこれはcDNA合成の鋳型と
して使用できる。クローニング過程でのインターフエロ
ン特異的配列の収率を増大させるため、mRNAプレパレー
シヨンを庶糖濃度勾配により、各mRNA分子の長さに応じ
た領域に分離する。

12S付近（mRNAの塩基長約800〜1,000）の領域のmRNA
を集めるのが好ましい。α−インターフエロンおよびβ
−インターフエロンに特異的なmRNAはこの領域に集ま
る。この勾配領域からのmRNAを水で沈殿、溶解させ、濃
縮する。

cDNAライブラリーの調製には主として、文献公知の方
法を用いる［たとえば、ドウワーキン−ラツスル（Dwor
kin−Rastl,E）ほか：ジヤ−ナル・オブ・インターフエ
ロン・リサーチ（Journal of Interferon Research）、
2/4、575〜585（1982）参照］。mRNAにはオリゴ−dTを
加えてプライマーをつける。ついで４種のデオキシヌク
レオシドトリホスフエート （dATP,dGTP,dCTP,dTTP）および逆転写酵素を適当な緩
衝溶液を用いて加え、45℃で１時間、cDNAを合成させ
る。クロロホルム抽出およびゲルカラムたとえばセフア
デツクス50によるクロマトグラフィーで、cDNA/mRNAハ
イブリツドを精製する。アルカリ処理（0.3M NaOH,50
℃、１時間）でRNAを加水分解し、酢酸ナトリウム溶液
によつて中和したのちにエタノールでcDNAを沈殿させ
る。適当に緩衝した溶液中、４種のデオキシヌクレオシ
ドトリホスフエートおよび大腸菌DNA−ポリメラーゼＩ
を加えて二重鎖合成を実施する。この間、cDNAはその
３′末端におけるヘアピン構造の生成により、鋳造とし
てと同時にプライマーとしても使用する。（15℃、６時
間）［エフトラテイアデイス（Eftratiadis,A）ほか：
セル（Cell）、第７巻、279（1976）参照］。フエノー
ル抽出、セフアデツクスG50クロマトグラフィーおよび
エタノール沈殿後、適当な溶液中で、一重鎖に特異的な
エンドヌクレアーゼS1でDNAを処理する。ヘアピン構造
および二重鎖に変換されなかつたcDNAはすべて分解され
る。クロロホルム抽出およびエタノール沈殿後、二重鎖
DNA（dsDNA）を庶糖濃度勾配上、大きさによつて分離す
る。次のクローニング工程においては、新規インターフ
エロンをコードする完全は配列を含むクローンのみが得
られる確率を高めるために、600bp以上の大きさのdsDNA
のみを用いるのが好ましい。長さ600bp以上のdsDNAをエ
タノール沈殿および水への溶解により勾配から濃縮す
る。

得られたdsDNA分子の数を増加させるため、はじめdsD
NAを適当なベクター中に置き、ついでバクテリア、大腸
菌内に導入する。使用するベクターとしてはプラスミド
pBR322［ボリバー（Bolivar,F）ほか：ジーン（Gene）
第２巻、95（1977）］が好ましい。このプラスミドは主
として、レプリコンと２種の選択マーカーを含んでい
る。これは宿主に、抗生物質アンピシリンおよびテトラ
サイクリンに対する抵抗性 （Ap^r，Tc^r）を付与する。β−ラクタマーゼに対する遺
伝子（Ap^r）は制限酵素PstIに対する認識配列を含んで
いる。したがつて、pBR322はPstIで切断でききる。重複
３′末端は、適当に緩衝化した溶液中、あらかじめ混合
した量のdGTPとともに、末端デオキシヌクレオチドトラ
ンスフエラーゼ（TdT）により延長される。同時に、dsD
NAは、３′末端でdCTPを用い、酵素TdTにより同様に延
長される。プラスミドとdsDNAのホモポリマー末端は相
補性で、両者を適当な濃度比により、適当な塩、緩衝液
および温度条件下に混合すれば、ハイブリダイゼーシヨ
ンが起こる［ネルソン（Nelson,T）ほか：メソツズ・イ
ン・エンザイモロジー（Methods in Enzymorogy）、第6
8巻、41〜50（1980）］。

大腸菌HB101株［遺伝子型Ｆ−、hsds20（ｒ−B,m−
Ｂ）rec A13、ara−14、pro A2、lac Y1、gal K2、rps
L20（Smr）、xyl−５、mtl−１、sup E44、lambda−）
は、CaCl₂溶液での洗浄により、組換えベクター−dsDNA
分子での形質転換に備える。コンピーテントな大腸菌HB
101をDNAと混合し、０℃でインキユベーション後、かく
して得られたプラスミドDNAに42℃で２分間熱シヨツク
を与え、形質転換を行う［ダガート（Dagert,M.）ほ
か：ジーン（Gene）、第６巻、23〜28（1979）］。形質
転換されたバクテリアを次に、テトラサイクリン含有プ
レート上にひろげる（10μg/ml）。ベクターないしは組
換えキヤリアー分子（Tc^r）を受けた大腸菌HB101のみ
が、この寒天上で生育できる。β−ラクタマーゼ遺伝子
へのdsDNAの導入によりβ−ラクタマーゼに関する情報
は破壊されるので、組換えベクター−dsDNA分子は宿主
に、遺伝子型Ap^sTc^rを与える。クローンを次に50μg/ml
のアンピシリンを含む寒天板に移す。約３％のみが生育
し、これはクローンの97％にdsDNA分子が挿入されたこ
とを意味する。

0.5μｇのdsDNAに出発して30,000以上のクローンが得ら
れた。この28,600のクローンを別々に、栄養培地、10μ
g/mlのテトラサイクリンおよびグリセリンを含むマイク
ロタイター板のカツプに移した。クローンが生育したの
ち、プレートを−70℃に保持して貯蔵した（cDNAライブ
ラリー）。

新規なインターフエロン遺伝子含有クローンについて
cDNAライブラリーを検索するため、解凍したのちクロー
ンをニトロセルロースフイルタに移す。このフイルター
をテトラサイクリン含有栄養寒天培地上に置く。バクテ
リアのコロニーを生育させたのち、バクテリアのDNAを
フイルター上に固定した。

プローブとしては、IFN−α２−Argの遺伝子を含むク
ローンpER33のインサートを有利に使用できる［ラツス
ル（Rastl,E）ほか：ジーン（Gene）、第21巻、237〜24
8（1983）ヨーロツパ特許出願第0.115.613号参照］ニツ
クトランスレーシヨンにより、DNA−ポリメラーゼＩ、d
ATP、dGTP、dTTPおよびα−³²Ｐ−dCTPを用い、DNAのこ
の部分を放射能により標識する。ニトロセルロースフイ
ルターは最初、放射性サンプルを加えないで、緩和ハイ
ブリダイゼーシヨン条件下に前処理し、ついで放射性サ
ンプルを加えて16時間ハイブリダイズする。ついでフイ
ルターを同様に、緩和条件下に洗浄する。緊縮性の低い
ハイブリダイゼーションおよび洗浄により、インターフ
エロンα２−Argを含むクローンのみでなく、これまで
知られているα−インターフエロンとはかなり異なる配
列を有するインターフエロンを含む他のクローンも得ら
れる。乾燥後、フイルターをＸ線フイルムに暴露する。
背景レベルより明らかに高い黒化効果はインターフエロ
ン特異性配列をもつクローンの存在を示す。

放射能シグナルは質的に一定しないので、陽性のクロ
ーンまたは陽性結果が疑われるような反応を示すクロー
ンを小規模に培養する。プラスミドDNA分子を単離し、
制限エンドヌクレアーゼPstIで消化し、アガロースゲル
上電気泳動により大きさで分離する［バーンボイム（Bi
rnboim）ほか：ヌクレイツク・アシツズ・リサーチ（Nu
cl.Asid.Res.）、第７巻、1513（1979）］。アガロース
ゲル中のDNAを、サザーン法によつてニトロセルロース
フイルターに移す［サザーン（Southern,E.M.）：ジヤ
ーナル・オブ・モルキユラー・バイオロジー（J.Mol.Bi
ol.）、第98巻、503〜517（1975）］。このフイルター
中で、DNAを、放射性、IFN遺伝子含有、変性サンプルと
ハイブリダイズさせる。陽性コントロールとしては、イ
ンターフエロンα２−Argに対する遺伝子を含むプラス
ミド1F7（DSM番号2362でDSMに寄託）を用いる。オート
ラジオグラムから、２種のクローン、E76E9およびP9A2
が、非緊縮、緩和条件下にインターフエロンα2Argの遺
伝子とハイブリダイズした配列を含むこをが明らかであ
つた。クローンE76E9およびP9A2のdsDNAインサートにつ
いてさらに詳細を知るため、これらのクローンのプラス
ミドを大規模に製造した。DNAを種々の制限エンドヌク
レアーゼ、たとえばAluI、Sau3A、BglII、HinfI、PstI
およびHaeIIIで消化する。生成した断片をアガロースゲ
ル中で分離する。相当するサイズマーカー、たとえばpB
R322の制限エンドヌクレアーゼ、HinfIまたはHaeIIIに
よる消化で得られた断片との比較により、断片のサイズ
を決定できる。

スミスとバーンスタイルのマツピング法により、これ
らの断片の配列を決定できる［スミス（Simth,HO）ほ
か：ヌクレイツク・アシツズ・リサーチ（Nucl.Acid.Re
s）、第３巻、2387〜2398（1967）］。かくして得られ
た制限酵素地図（第１図および第２図）から、驚くべき
ことに、クローンE76E9およびP9A2のインサートはこれ
まで知られていないインターフエロン遺伝子、すなわち
ω−インターフエロン遺伝子を含むことが発見された。

ω−インターフエロンに関するこの情報は、cDNAイン
サートを適当な制限エンドヌクレアーゼで消化するため
に利用することができる。この断片をバクテリオフアー
ジM13mp9［メツシング（Messing,J）ほか：ジーン（Gen
e）、第19巻、269〜276（1982）］のdsDNA型（複製型）
にリゲートさせ、サンガーのジデオキシ法［サンガー
（Sanger,F）ほか：プロシーデイングス・オブ・ナシヨ
ナルアカデミー・サイエンシズ・オブ・ユナイテツド・
ステイツ・オブ・アメリカ（Proc.Natl.Acad.Sci USA）
第74巻、5463〜5467（1977）］を用いて配列を決定す
る。組換えフアージの一重鎖DNAを単離する。合成オリ
ゴマーの結合後、４種の別個のプレパレーシヨンについ
て、大腸菌からのDNA−ポリメラーゼの大断片（クレノ
ウ断片）を用いて第二鎖合成を行う。４個の部分反応の
それぞれに、４種のジデオキシヌクレオシドトリホスフ
エート（ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP）の１種を加え
る。これにより、特定のジデオキシヌクレオシドトリホ
スフエートに関して相補性の塩基が鋳型DNA中にたまた
ま生じた場所で、統計的に分布した鎖の切断が起こる。
放射標識dATPも使用する。合成反応を停止させたのち、
生成物を変性させ、単一鎖DNA断片を変性ポリアクリル
アミドゲル中、大きさにより分離する［サンガー（Sang
er,F）ほか：エフイービーエス・レターズ（FEBS Let
t.）、第87巻、107〜111（1978）］。ゲルを次にＸ線フ
イルムに暴露する。このオートラジオグラムから、組換
えM13フアージのDNA配列を読みとることができる。各種
組換えフアージのインサートの配列は適当なコンピユー
タプログラムによつて解析処理する［ステイドン（Stad
en,R）：ヌクレイツク・アシツズ・リサーチ（Nucl.Aci
d.Res.）、第10巻、4731〜4751（1982）］。

第１図および第２図には配列決定の方法を示す。第３
図はクローンP9A2のインサートのDNA配列を、第４図は
クローンE76E9のインサートのDNA配列を示す。非暗号DN
A鎖は５′→３′の方向にそれから誘導されるアミノ酸
配列とともに示す。

ω（Glu）−インターフエロンに関するクローンE76E9
の単離DNAは塩基対長858で３′非翻訳領域を有する。熟
成ω（Glu）−インターフエロンをコードする領域はヌ
クレオチド９からヌクレオチド524までである。ω（Gl
y）−インターフエロンに対するクローンP9A2の単離cDN
Aは塩基対長77、成熟ω（Glu）−インターフエロンをコ
ードする配列はヌクレオチド８からヌクレオチド523ま
でである。P9A2の場合、３′非翻訳領域はポリＡセグメ
ントまでである。

成熟ω（Glu）−インターフエロンをコードするDNA配
列はクローンE76E9およびP9A2中に完全に含有される。
成熟ω（Glu）−およびω（Gly）−インターフエロンの
Ｎ末端はいずれもアミノ酸、システイン−アスパラギン
酸−ロイシンで始まる。全く驚くべきことに、上述の２
種の成熟ω−インターフエロンはアミノ酸長172で、こ
れは他の公知のインターフエロンの長さ、すなわちα−
インターフエロンのアミノ酸長166（または165）と異な
つている。また驚くべきことに、２種のω−インターフ
エロンは78番目のアミノ酸（アスパラギン−メチオニン
−スレオニン）がＮ−グリコシル化されている。

クローンE76E9とP9A2のDNAを比較すると１個所だけ相
違がある。111番目のアミノ酸をコードするクローンE76
E9のトリプレツトはGAGでグルタミン酸をコードする。
このトリプレツトはクローンP9A2ではGGGでグリシンを
コードする。したがつて、２種のω−インターフエロン
蛋白質はアミノ酸１個がたがいに相違し、以下ω（Gl
u）−インターフエロン （76E9）およびω（Gly）−インターフエロン（P9A2）
と呼ぶ。

２種のω−インターフエロンを従来公知のヒトα−イ
ンターフエロン亜種と比較すると次のとおりである。

プラスミドE76E9をもつ大腸菌HB101およびプラスミド
P9A2をもつ大腸菌HB101ドイツ微生物寄託機関（German
Collection for Microorganisms,DSM,ゲツテインゲン）
にそれぞれDSM3003およびDSM3004の番号で1984年４月３
日寄託された。

新しく発見されたクローンがインターフエロン様の活
性を産生することを証明するため、クローンE76E9を培
養し、たとえばバクテリアの分解物を蓄積させ、ついで
プラーク減少試験を行う。期待どおり、バクテリアはイ
ンターフエロン様活性を産生した（例３参照）。

さらに、２種の新たに発見されたインターフエロンが
新しいインターフエロン族に属するものであることを証
明するため、ナマルワ細胞からすべてのDNAを単離し、
各種の制限エンドヌクレアーゼで消化させた。

この方法で、クローンP9A2および E76E9のcDNAでコードされる遺伝子の数を知ることがで
きる。この目的で、得られたDNA断片をアガロースゲル
上でサザーン法［サザーン（Southern）ほか：ジヤーナ
ル・オブ・モルキユラー・バイオロジー（J.Mol.Bio
l.）、第98巻、503〜517（1975）］を用いて分離し、ニ
トロセルロースフイルター上に置き、比較的ストリンジ
エントな条件下に、放射標識したクローンP9A2の特異的
DNAとハイブリダイズさせる。

プラスミドP9A2およびpER33からのDNAとのハイブリダ
イゼーシヨンで得られた結果を第5a図に示す。

各レーンには、消化した各種DNAサンプルを示す記号
を付してある（Ｅ＝EcoRI、Ｈ＝HindIII、Ｂ＝BamHI、
Ｓ＝SphI、Ｐ＝PstI、Ｃ＝ClaI）。フイルターの左側半
分はα−インターフエロン遺伝子プローブ（“A"）と、
右側半分はクローンP9A2のcDNAインサート（“O"）とハ
イブリダイズさせた。α−インターフエロン遺伝子プロ
ーブまたは新規インターフエロン遺伝子プローブとハイ
ブリダイズしたバンドのセツトは異つている。２種の異
なるプローブの交差ハイブリダイゼーションは相当する
レーンを調べても検出できなかつた。

第5b図にはクローンP9A2のcDNAとハイブリダイゼーシ
ョンに用いた断片とを例示する。一部の制限酵素の認識
部位を示してある（Ｐ＝PstI、Ｓ＝Sau3A、Ａ＝Alu
I）。プローブは３個の可能性あるPstI断片のうち２個
しか含んでいない。ハイブリダイゼーションパターン
は、約1300塩素体（bp）のただ１個のハイブリダイズ断
片しか示さず、これは相同性遺伝子に属する。120bpの
小断片はゲルの外側まで移動した。遺伝子の５′部に属
するバンドは、プローブがこの領域を含まないので発見
できない。少なくとも６個の異なるバンドがPstIのレー
ン中に発見できる。これは、新しい配列に関する他のい
くつかの遺伝子がヒトゲノム中に存在することを意味す
る。これらの遺伝子は１個もしくは２個以上のPstI認識
部位が存在するのであれば、少なくとも、もう３個の遺
伝子が単離できるものと期待される。

これらの遺伝子は、プラスミドベクター、フアージベ
クターまたはコスミドベクター中に含まれるヒト遺伝子
ライブラリーからのハイブリダイゼーシヨンによつて単
離するのが好ましいものと思われる（例4e参照）。

この点において、本発明によるω−インターフエロン
は特に記述する２種の成熟インターフエロンを包含する
のみでなく、INF−ω活性が影響されないで残つたこれ
らのポリペプチドの任意の修飾をも包含するということ
ができる。これらの修飾としては、活性に影響を与えな
いＮ末端またはＣ末端からの分子の短縮、アミノ酸残基
の他の残基との交換、不活性または活性の他の分子への
この分子の化学的または生化学的方法による結合があ
る。後者の例としては、１種もしくは２種以上のω−イ
ンターフエロンおよび／または公知のα−またはβ−イ
ンターフエロンから調整されるハイブリツド分子を挙げ
ることができる。

新規なインターフエロン、とくにω（Gly）−および
ω（Glu）−インターフエロンのアミノ酸およびヌクレ
オチド配列と、すでに報告されているα−インターフエ
ロンおよびβ−インターフエロンのアミノ酸およびヌク
レオチド配列［ワイスマン（Weissmann,C）ほか：フイ
ロソフイカル・トランスアクシヨンズ・オブ・ザ・ロイ
ヤル・ソサイアテイ・オブ・ロンドン（Phil.Trans.R.S
oc.Lond）、第299巻、７〜28（1982）；ウルリツチ（Ul
lrich,A）ほか：ジヤーナル・オブ・モルキユラー・バ
イオロジー（J.Mol.Biol.）、第156巻、467〜486（198
2）；タニグチ（Taniguchi,T）ほか：プロシーデイング
ス・オブ・ナシヨナル・アカデミー・サイエンシズ・オ
ブ・ザ・ユナイテツド・ステイツ・オブ・アメリカ（Pr
oc.Natl.Acad.Sci.）、第77巻、4003〜4006（1980）；
トコドロ（Tokodoro,k）ほか：イーエムビーオー・ジヤ
ーナル（EMBO J）、第３巻、669〜670（1984）］との差
を比較できるように、相当する配列が対になるように配
置し、各位置での差を数える。

第７図に示す結果は、クローンP9A2およびE76E9のDNA
配列はＩ型インターフエロン（たとえばαおよびβ−イ
ンターフエロン）の配列と関係があることを示してい
る。また、各α−インターフエロンと新規な配列との間
のアミノ酸配列の差は41.6％以上、47.0％以下であるこ
とも明らかである。新規な両配列および各α−インター
フエロンの配列と、β−インターフエロンの配列との間
の差は約70％のオーダーである。関係遺伝子の全セツト
の存在を示した例４の結果を考慮し、またインターフエ
ロンの命名法についての提案［ビルセツク（Vilceck
J）ほかジヤーナル・オブ・ゼネラル・バイロロジー
（J.Gen.Virol.）、第65巻、669〜670（1984）］を考慮
し、クローンP9A2およびE76E9のcDNAインサートが、イ
ンターフエロン−ωと呼ぶことにする新しいＩ型インタ
ーフエロン群をコードするものと考える。

また、ω−インターフエロン遺伝子の発現はＩ型イン
ターフエロンの場合と同様に起こることも明らかであ
る。α−およびω−インターフエロンの多重遺伝子族の
各メンバーのS1マツピング法［バーグ（Berk,AJ）ほ
か：セル（Cell）第12巻、721（1977）］に基づく転写
を検討し（例７参照）、ω−１−mRNA）の発現はウイル
ス誘発性であることが明らかである。この種の遺伝子族
の転写産物は約1.000個の塩基からわずか数個が異なる
のみであるから、各種IFNのmRNAを識別するためにはハ
イブリダイゼーシヨンだけでは充分に鋭敏な識別基準と
はいえない。

そのために、９種のα−インターフエロン、インター
フエロン−ω１およびβ−インターフエロンのmRMA配列
を一列に並べる。大文字はトツプ配列に特異的な塩基を
示す大文字を用いている。このような特異的サイトは単
純なコンピュータプログラムを用いて容易に発現でき
る。このような特異的サイトに始めるトツプ配列に相補
性のハイブリダイゼーシヨンプローブのみが選ばれたサ
ブタイプのmRNAと完全にハイブリダイズできる。このハ
イブリダイゼーションプローブがその特異的５′末端で
放射標識されていれば、一重鎖特異性ヌクレアーゼ（好
ましくはS1ヌクレアーゼ）での分解に対して保護されて
いる放射標識のみが、プローブが設計されたインターフ
エロンサブタイプmRNAとハイブリダイズしたものであ
る。

この原理はインターフエロンの場合に限らず、第８図
に記載の特異的サイトを有するいずれの群の公知配列に
も適用できる。

上述のサブタイプの特異的サイトは制限サイトではな
い。これは大部分の場合、制限エンドヌクレアーゼによ
るcDNAの切断ではサブタイプ特異的なハイブリダイゼー
シヨンプローブを生成できないことを意味する。したが
つて、この例で用いたプローブは、上記特異的サイトで
インターフエロン−ω１のmRNAと相補正の５′末端で放
射標識されたオリゴヌクレオチドを延長することによつ
て生成された。

第10図は、期待されたように、 ω１−mRNAがナマルワ細胞およびNC37細胞中で誘発され
ることを示している。

したがつて、本発明は上述のω−インターフエロンを
特異的にコードする遺伝子配列のみでなく、突然変異、
欠失、転位または付加によつて容易かつ定常的に得られ
る修飾をも包含するものである。ヒトω−インターフエ
ロン（すなわち本明細書に示すような生物学的活性を有
するインターフエロン）をコードする任意の配列、およ
び実際に示した配列に縮退される任意の配列も包含され
る。本発明の技術分野における熟練者には、暗号領域の
縮退DNA配列の調製方法は自明であろう。また、本明細
書においてIFN−ωについて示した活性スペクトルを有
するポリペプチドをコードする任意の配列、および本明
細書に示した配列（またはその部分）とストリンジエン
トなハイブリダイゼーション条件（すなわち、約85％、
好ましくは約90％以上のホモロジーの選択）下にハイブ
リダイズするポリペプチドをコードする任意の配列もカ
バーする。

ハイブリダイゼーションは６×SSC/5×デンハード（D
enhardt）溶液/0.1％SDS中65℃で実施する。緊縮の程度
は洗浄工程で測定する。約85％またはそれ以上のホモロ
ジーをもつDNA配列の選択には0.2×SSC/0.01％SDS/65の
条件が適当であり、約90％またはそれ以上のホモロジー
をもつDNA配列の選択には0.1×SSC/0.01％SDS/65℃の条
件が適当である。

これらの条件（0.2×SSC）下部にコスミドライブラリ
ーをスクリーニングすると、IFN−ω１プローブとハイ
ブリダイズする多くのコスミドが発見される。それから
単離される制限酵素断片の配列解析から、真正のIFN−
ω遺伝子（第11図参照）、ならびにIFN−偽w2、IFN−偽
ω３およびIFN−偽ω４と呼んだ他の３種の関連遺伝子
（第12〜14図参照）が得られる。本発明はこれらの遺伝
子およびそれがコードするペプチドも包含する。これは
特許請求の範囲第43項から第52項までに請求されてい
る。

DNA比較の結果、偽遺伝子はIFN−ω遺伝子（インター
フエロン−ω１遺伝子）と約85％のホモロジーを示す。

さらにIFN−ω１遺伝子は、転写されると、mRNAが機
能インターフエロン蛋白質に対する情報、すなわち式 で示される23個のアミノ酸長のシグナルペプチドをコー
ドする情報を含み、次に成熟IF−ω１の172個のアミノ
酸が連なることを示している。

インターフエロン遺伝子は高収率を生じる条件下に任
意の生物体中に導入できる。適当な宿主およびベクター
は本技術分野の熟練者にはよく知られているとおりであ
るが、たとえばヨーロツパ特許出願A0.093.619号が参考
になる。

発現にはとくに原核生物が好ましい。たとえば、大腸
菌K12株294（ATCC番号31446）はとくに有用である。使
用できる他の微生物株としては大腸菌X1776（ATCC番号3
1.537）がある。上述の株、ならびに大腸菌W3110（F^-、
lambda^-、原栄養株、ATCC番号27325）枯草菌（Bacillus
subtilis）のようなバチルス、他の腸内バクテリアた
とえばサルモネラ（Salmonella typhimurim）またはセ
ラシア（Serratia marcesens）、各種シユードモナド種
が使用できる。

一般に、宿主細胞と適合性の種から誘導されるレプリ
コンおよびコントロール配列を含むプラスミドベクター
はこれらの宿主と組合せて使用される。このベクターは
はじめから、複製サイト、ならびに形質転換細胞中で表
現型による選択を可能にするマーカー配列を有する。た
とえば、大腸菌は、大腸菌の種から誘導されるプラスミ
ドpBR322を用いて典型的に形質転換される［ボリバー
（Bolivar）ほか：ジーン（Gene）、第２巻、95（197
7）］。pBR322はアンピシリンおよびテトラサイクリン
抵抗性の遺伝子を含有し、したがつて形質転換細胞を容
易に固定する手段がある。プラスミドpBR322または他の
プラスミドは、発現のために微生物によつて用いられる
プロモーターを含むかまたはそれを含むように修飾され
ねばならない。組換えDNAの構築にもつとも一般的に用
いられるプロモーターとしては、β−ラクタマーゼ（ペ
ニシリナーゼ）およびラクトースプモーターシステム
［チヤン（Chang）ほか：ネイチヤー（Nature）、第275
巻、615（1978）：イタラク（Itakura）ほかサイエンス
（Science）、第198巻、1056（1977）；ゲーデル（Goed
del）ほか：ネイチヤー（Nature）、第281巻、544（197
9）］およびトリプトフアン（trp）プロモーターシステ
ム［ゲーテル（Goeddel）ほか：ヌクレイツク・アシツ
ズ・リサーチ（Nucl.Acid.Res.）、第８巻、4057（198
0）；ヨーロツパ特許出願Ａ−0,036,766］がある。これ
らはもつとも一般的に用いられるものであるが、他の微
生物プロモーターも発見され、利用されている。たとえ
ば、IFN−ωに対する遺伝子配列はバクテリオフアージL
ambda（P_L）の左方プロモーターのコントロール下に置
くこともできる。このプロモーターはコントロール可能
な公知プロモーター中最も強力なもののひとつである。
コントロールはlambdaレプレツサーによつて生じ、隣接
制限サイトは公知である。

このレプレツサー遺伝子の熱感受性対立遺伝子は、完
全なIFN−ω配列を含みベクター上に置くことができ
る。温度を42℃に揚げるとレプレツサーが不活性化さ
れ、プロモーターはその最大レベルで発現する。このよ
うな条件下に産生されるmRNAの量は、P_Lプロモーターの
由来の新たに合成されたRNA約10％を含む細胞を生じる
のに十分である。この方法で、機能性IFN−ω配列がリ
ボソーム結合に隣接して存在し、lambdaP_Lプロモーター
の距離は様々のクローンのバンクを確立することができ
る。これらのクローンを次にスクリーニングに対し、最
高の収率を与えるクローンを選択する。

IFN−ω配列の発現および翻訳は、その非翻訳状態で
その生物体と相同性の他のレギユロンのコントロール下
に置かれる。たとえばラクトース依存性大腸菌染色体DN
Aは酵素β−ガラクトシダーゼを発現することによつて
ラクトース消化を起こさせるラクトースもしくはlacオ
ペロンからなる。

lacコントロール要素は、バクテリオフアージlambda
plac5から得られる。これは大腸菌に対して伝染性であ
る。フアージのlacオペロンは同じバクテリア種から形
質導入によつて誘導できる。本発明の方法への使用に適
したレギユロンはその微生物の天然プラスミドDNAから
誘導できる。lacプロモーター−オペレーターシステム
はIPTGによつて誘発できる。

他のプロモーター−オペレーターシステムまたはその
蛋白質も同様に使用できる。たとえばアラビノース−オ
ペレーター、コリシンE₁−オペレーター、ガラクトース
−オペレーター、アルカリホスフアターゼ−オペレータ
ー、trp−オペレーター、キシロースＡ−オペレータ
ー、tac−オペレーター等が使用できる。

原核生物のほか、真核生物の微生物、たとえば培養酵
母も使用できる。サツカロミセス（Saccharomyces cere
visiae）が真核生物微生物中では最も一般に使用されて
いるが、他の種の多くのものが同様に使用される。サツ
カロミセス中での発現では、たとえば、プラスミドYRp7
［ステインクカム（Stinchcomb）ほか：ネイチヤー（Na
ture）、第282巻、39（1979）；キングスマン（Kingsma
n）ほか：ジーン（Gene）、第７巻、141（1979）；トウ
シヤムパー（Tschumper）ほか：ジーン（Gene）、第10
巻、157（1980）］およびプラスミドYEp13［ブワツハ
（Bwach）ほか：ジーン（Gene）、第８巻、121〜131（1
979）］が一般的に用いられる。プラスミドYRp7はTRP1
遺伝子を含有し、これはトリプトフアン中でのー生育を
欠く酵母の突然変異株、たとえばATCC番号44076に対す
る選択マーカーを与える。

酵母宿主細胞ゲノムの特性としてTRP1損傷があれば、
トリプトフアンの非存在下における生育による形質転換
の検出のために効果的な環境を提供する。同様に、プラ
スミドYEp13は酵母LEU2遺伝子を含有し、これはLEU2−
突然変異株を補足するために使用できる。

酵母ベクター中の適当なプロモーター配列としては、
ADHIに対する遺伝子の５′−フランキング領域［アメラ
ー（Ammerer,G）：メソツズ・オブ・エンザイモノロジ
ー（Methods of Enzymology）、第101巻、192〜201（19
83）］３−ホスホグリセレートキナーゼ［ヒツツエマン
（Hitzeman）ほか：ジヤーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー（J.Biol.Chem.）、第255巻、2073（198
0）］または他の解糖酵素［カワサキほか（Kawasaki an
d Franker）：バイオケミカル・アンド・バイオフイジ
カル・リサーチ・コミユニケーシヨンズ（Biochem.Biop
hys.Res.Commun.）、第108巻、1107〜1112（1982）］、
たとえばエラノーゼ、グリセロアルデヒド−３−ホスフ
エートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベー
ト、デカルボキシレース、ホスホフラクトキナーゼ、グ
ルコース−６−ホスフエートイソメラーゼ、ホスホグル
コースイソメラーゼおよびグルコキナーゼを挙げること
ができる。適当な発現プラスミドを構築するには、これ
らの遺伝子に関連する終結配列にも、発現させる配列の
３′末端で発現ベクター中にリゲートし、mRNAのポリア
デニレーシヨンと集結を提供する。

生育条件によつてコントロールされる転写にさらに利
点を与える他のプロモータとしては、アルコールデヒド
ロゲナーゼ−２、イソチトクローム−Ｃ、酸ホスフアタ
ーゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、上述のグリセロア
ルデヒド−３−ホスフエートデヒドロゲナーゼ、マルト
ースおよびガラクトース利用に応答する酵素のプロモー
ター領域を挙げることができる。接合型酵母の遺伝子座
によつて調整されるプロモーター、たとえば遺伝子BAR
I、MFα１、STE2、STE3、STE5のプロモーターは、温度
依存性のsiv突然変位［ライン（Rhine）：博士論文、オ
レゴン大学、オレゴン（1979）；ヘルスコヴイツほか
（Herskowitz and Oshima）：酵母サツカロミセスの分
子生物学（The Molecular Biology of the Yeast Sacch
aromyces）、第１部、181〜209（1989）コールド・スプ
リング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor
Laboratory）］を用いた温度調整性システムに使用で
きる。これらの突然変異は、酵母のサイレントな接合型
カセツトの発現に直接影響し、したがつて間接的に接合
型依存性プロモーターに影響する。しかしながら、一般
に、酵母適合性プロモーター、複製開始および終結配列
を含む任意のプラスミドベクターが適当である。

微生物のほかに多細胞動物由来の培養細胞も宿主とし
て使用できる。原理的には、脊椎動物でも非脊椎動物で
も、任意の起源の培養細胞が利用可能である。しかしな
がら、脊椎動物細胞での研究に興味が集中されてきて、
最近では培養液中での脊椎動物細胞の増殖（組織培養）
は定常的な操作になつてきている［組織培養：アカデミ
ツク・プレス（Academic Press）クルーズおよびパター
ソン（Kruse and Patterson）編（1973）］。このよう
な有用な宿主細胞系の例としては、VEROおよびHeLa細
胞、チヤイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞系、W13
8、BHK、COS−７およびMDCK細胞系がある。このような
細胞に対する発現ベクターには通常（必要ならば）、オ
リジンの複製、発現する遺伝子の前方に位置するプロモ
ーターとともに、必要なリボソーム結合サイト、RNAス
プライスサイト、ポリアデニレーシヨンサイトおよび転
写終結配列が包合される。

哺乳類細胞中で用いるには、発現ベクターに対するコ
ントロール機能はウイルス性物質によつて与えられる場
合が多い。たとえば、一般に用いられるプロモーター
は、ポリオーマ、アデノウイルス２由来のものであり、
またシミアンウイルス40（SV40）由来のものが用いられ
ることがとくに多い。SV40の前期および後期エンドプロ
モーターは、ウイルスからSV40ウイルスオリジナルの複
製［フアイアース（Fiers）ほか：ネイチヤー（Natur
e）、第273巻、1123（1978）］をも含む断片としてウイ
ルスから容易に得られるので、とくに有用である。ウイ
ルスオリジンの複製中にHindIIIサイトからBglIサイト
の位置の方向に展開する約250bpの配列を包含する限
り、大または小SV40断片のいずれも使用できる。さら
に、所望の遺伝子配列と通常関連するプロモーターおよ
びコントロール配列を利用することは、このコントロー
ル配列が宿主細胞システムに適合する限り、可能であ
り、また望ましいことが多い。

複製のオリジンは、たとえばSV40または他のウイルス
（たとえば、ポリオーマー、アデノ、VSV、BPV等）源か
ら誘導される外因性オリジンを含むベクターの構築によ
つてもよいし、また宿主の細胞染色体複製機構によつて
提供されるものであつてもよい。ベクターが宿主細胞の
染色体中に統合化されているのであれば、後者で十分な
場合が多い。

しかしながら、遺伝子は発現プラスミドpER103［ラツ
スル−ドウワーキンほか（Rastle−Dowarkin,E）ほか：
ジーン（Gene）、第21巻、237〜248（1983）およびヨー
ロツパ特許出願Ａ−0,155,613;DSM番号2773で、1983年1
2月20日にDSMに寄託されている］。このベクターはすべ
てのレギユロンを含み、クローン化遺伝子の高発現率を
生じる。したがつて、本発明ではプラスミドpBR322に属
するEcoRI/BamHI短断片を、 式 で示されるDNA配列によつて置換した。

本発明の目的に到達するため、とたとえば第６図に従
つて、以下の操作を使用する。

I.必要な各DNA断片の調製 断片ａ 断片を生成させるためには、IFN−ωに対する遺伝子
を含むプラスミド、たとえばプラスミドP9A2を制限エン
ドヌクレアーゼAvaIIで消化する。生成したcDNAインサ
ートをクロマトグラフィーに付して精製したのち、これ
を制限エンドヌクレアーゼNcoIおよびAluIで２回再消化
し、ついでクロマトグラフイーおよび電気溶出によつて
単離する。この断片は相当するω−インターフエロン遺
伝子の大部分を含有する。たとえば、クローンP9A2のω
（Gly）−インターフエロン遺伝子断片は次の構造を有
する。

断片ｂ） 断片ｂ）を生成させるためには、プラスミドP9A2を制
限エンドヌクレアーゼIIで消化する。生成したcDNAイン
サートをクロマトグラフイーに付し、精製したのち、後
者を制限エンドヌクレアーゼSau3Aで再消化し、所望の
断片186bpをクロマトグラフイーおよび電気溶出で単離
する。これは以下の構造を有する。

断片ｃ） 断片ｃ）を生成させるには、プラスミドpER33［ラツ
スル−ドウワーキン（Rastl−Doworkin,E.）ほか：ジー
ン（Gene）、第21巻、237〜248（1983）およびヨーロツ
パ特許出願Ａ−0,115,613参照）を制限酵素 EcoRIおよびPvuIIで２回消化する。アガロースゲル分画
化および精製後に得られ、 Trpプロモーター、リボゾーム結合サイトおよび開始コ
ドンを含む386bpの断片を次に Sau3Aで消化する。所望の108bp断片は、アガロースゲル
電気泳動、電気溶出およびエルチツプカラム精製によつ
て得られる。以下の構造を有する。

断片ｂとｃのリゲーシヨン 断片ｂとｃをT₄リガーゼでリゲートし、酵素を破壊し
たのちHindIIIで切断する。リゲートされた断片は以下
の構造を有する。

また、プラスミドpRHW10の生成に必要なこのDNA断片
は合成的に製造したオリゴヌクレオチドを用いても製造
できる。

式 ５′−AGCTTAAAGATGTGT−３′ で示されるオリゴヌクレオチドの５′末端を脱ホスホリ
ル化の状態にしておく。

式 ５′−GATCACACATCTTTA−３′ で示されるオリゴヌクレオチドの５′末端を、T₄ポリヌ
クレオチドキナーゼとATPによりホスホリル化する。

２個のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせる
と、次のDNA短断片が得られる。

５′−AGCTTAAAGATGTGT ３′ ３′− ATTTCTACACACTAGp ５′ これは一端にHindIIIの典型的な５′オーバーラツプ
を、他端にSau3Aの典型的な５′オーバーラツプを生成
する。

断片はｂ）はウシ小腸ホスフアターゼを用いて脱ホス
ホリル化する。断片ｂ）と上述の断片を合し、T₄リガー
ゼを用いて結合させる。

リガーゼは少なくとも１個の５′−ホスフエート含有
末端を要求するので、DNAの合成ピースが断片ｂ）と結
合するかまたは２個の合成断片がそのSau3A末端で結合
するかである。生成するこの２種の断片は長さが異なる
ので、選択的イソプロパノールの沈殿で分離できる。か
くして精製された断片をT₄ポリヌクレオチドキナーゼと
ATPによりホスホリル化する。

II．発現プラスミドの製造 ａ）プラスミドpRHW10の製造 発現プラスミドpER103［ラツスル−ドウワーキン（Ra
stl−Dworkin,E）ほか：ジーン（Gene）、第21巻、237
〜284（1983）およびヨーロツパ特許出願 Ａ−O,115,613.DSM番号2773でDSMに寄託］をHindIIIで
線状とし、ついでウシ小腸ホスフアターゼで処理した。
かくして得られDNAを単離、精製したのち、脱ホスホリ
ル化し、ついで断片ｂとｃを結合された断片とリゲート
する（両者をHindIIIで消化したのち）。大腸菌HB101を
生成したリゲーション混合物で形質転換したのち、LBア
ガール＋50μg/mlアンピシリン上で培養する。所望の構
造を有するプラスミドをpRHW10と命名した（第６図参
照）。複製後、他のプラスミド製造のための中間体とし
て用いた。

ｂ）プラスミドpRHW12の製造 DNAポリメラーゼＩのクレノウ断片と４種のデオキシ
ヌクレオチドホスフエートを、BamHIで切断したプラス
ミドpRHW10に加える。インキユベーシヨン後、得られた
線状の、プラント末端を有するプラスミドを精製し、Nc
OIで切断する。アガロースゲル電気泳動、電気溶出およ
びエルチツプ精製［シユライヘル・アンド・シユネル社
のエルチツプ（Elutip ）カラムを用いて実施］を用い
て得られる大断片ａ）とリゲートする。大腸菌HB101を
このリゲーシヨン混合物で形質転換し、LBアガール＋50
μg/mlアンピシリン上で培養する。この構造を有するプ
ラスミドをpRHW12と命名した（第６図参照）。これは所
望のω（Gly）−インターフエロンを発現する。

たとえば、このようにして得られた細菌培養液（光学
密度:0.6/600nm）１は１×10⁶国際単位のインターフ
エロンを含有する。

ｃ）プラスミドpRHW11の製造 DNAポリメラリーゼＩのクレノウ断片と４種のデオキ
シヌクレオチドトリホスフエートを、BamHIで切断した
プラスミドpRHW10に加える。インキユベーシヨン後、得
られた線状の、プラント末端を有するプラスミドを精製
し、NcOIで切断する。アガロースゲル電気泳動、電気溶
出およびエルチツプ精製を用いて得られる大断片を、ア
ミノ酸（Gly）をコードするGGGゴトンがGAGAコトン（Gl
u）に置換されただけのプラスミドE76E9から同様にして
得られる断片ａとリゲートする。ついで、生成したリゲ
ーシヨン混合物を大腸菌HB101の形質転換に使用し、LB
アガール上で培養する。所望の構造を有するプラスミド
はpRHW11と命名した（同様に第６図参照）。これは所望
のω（Glu）−インターフエロンを発現する。

ベクターによる細胞の形質転換は多くの方法で実施で
きる。たとえば、カルシウムを用いて実施することがで
きる。これには、細胞をマグネシウム中で洗浄し、カル
シウム中に懸濁した細胞にDNAを加える方法と、細胞をD
NAとリン酸カルシウムの共沈殿物に暴露する方法とがあ
る。遺伝子発現後、細胞をトランスホーマント選択培地
上に置く。

宿主を適当に形質転換したのち、宿主内での遺伝子の
発現、IFN−ωを発現する条件下での発酵または細胞培
養し、生成物をよく知られたクロマトグラフイー分離操
作によつて抽出すると、リーデイング配列およびトレー
ニング配列をもつまたはもたないIFN−ωからなる物質
が得られる。IFN−ωはそのＮ末端にリーデイング配列
をもつた形で発現して（プレIFN−ωの生成）、一部の
宿主細胞中ではそれが除去される場合がある。除去され
ない場合はリーデイングポリペプチドを切断し、成熟IF
N−ωを生成させる必要がある。別法として、IFN−ωク
ローンを、微生物中でプレIFN−ωでなく直接、成熟蛋
白質を産生するように修飾することもできる。酵母接合
フエロモンのプレカーサー配列MF−α−１は融合蛋白の
正確な成熟に、また生成物の成育培地または細胞周辺腔
への分泌に使用することができる。機能性または成熟IF
N−ωに相当するDNA配列はMF−α−１に、開始コドンAT
Gから256番目のカテプシン様切断部位（lys−argの次）
で連結することができる［カージヤン（Karjan）ほか：
セル（Cell）、第30巻、933〜943（1982）］。

その生物学的活性に基づき、本発明の新規インターフ
エロンは、公知のインターフエロンが使用されてきた状
態の治療に適当である。たとえば、ヘルペス、ライノウ
イルス、エイズ感染、ある種の癌等の状態に使用でき
る。新規インターフエロンは単独で用いても、また他の
公知のインターフエロンもしくは他の生物学的活性物
質、たとえばINF−α、IL−２、他の免疫調節物質等と
組合せて使用することもできる。

IFN−ωは抗腫瘍またはこ抗ウイルス治療を要する対
象および免疫抑制状態を呈している対象に非経口的に投
与できる。投与量および投与回数はIFN−αの臨床試験
に最近用いられている用法用量とほぼ同様、たとえば約
（１〜10）×10⁶単位／日、純度が１％以上の物質の場
合にはたとえば約５×10⁷単位／日が投与される。

均一な細菌性IFN−ωの適当な剤型の例としては、3mg
のIFN−ωを5Nヒト血清アルブミン25mlに溶解し、この
溶液を細菌濾過器に通し、濾液を無菌的に100個のバイ
アルに分ける。純水なIFN−ω ６×10⁶単位を含有する
非経口投与用製剤が得られる。バイアルは使用まで冷所
（−20℃）に保存するのが好ましい。

本発明の化合物は、公知の方法に従い、医薬的に有用
な組成物を調製するために処方することができる。本発
明のポリペプチドは医薬的許容される担体ビーグルと合
し、混合物とすることができる。適当なビーグルおよび
その処方はマーチン（Martin,E.W.）編：レミントンの
製薬科学（Remington′s Pharmaceutical Sciences）の
記載が参考になる。IFN−ωは適当量のビーグルと混合
し、患者への有効な投与に適した医薬的に許容される組
成物を製造することができる。

次に本発明を実施例によつてさらに詳細に説明する
が、これは本発明を例示するものであつて限定するもの
ではない。

例１ IFN配列特異的クローンの発現 ａ）cDNAライブラリーの製造 文献［ドウワーキン−ラツスル（Dworkin−Rastl,E）
ほか：ジヤーナル・オブ・インターフエロン・リサーチ
（Journal of Interferon Research）2/4、575〜585（1
982）］で知られた方法に従い、cDNAライブラリーの確
立のために、出発原料としてセンダイ−ウイルス刺激細
胞からのmRNAを用いた。得られた30,000個のクローンを
マイクロタイター板のウエルにそれぞれ移した。生育に
は以下のメジウムを用い、コロニーを凍結した。

トリプトン 10g 酵母エキス 5 NaCl 5 クエン酸ナトリウム（2H₂O） 0.51 K₂HPO₄・2H₂O 7.5 KH₂PO₄ 1.8 MgSO₄・7H₂O 0.09 （NH₄)₂SO₄ 0.9 グリセリン 44 テトラサイクリン塩酸塩 0.01 水を加えて１とする 各クローンを加えたマイクロタイター板を一夜37℃で
インキユベートし、ついで−70℃に保存した。

ｂ）ハイブリダイゼーシヨン試験 ハイブリダイゼーシヨン試験のための出発原料として
は、組換えプラスミドpER33［ドウワーキング−ラツス
ル（Dworkin−Rastl,E）ほか：ジーン（Gene）、第21
巻、237〜248（1983）］を用いた。このプラスミドは成
熟インターフエロンIFN−α2argの暗号領域と３′非翻
訳領域190塩基を含んでいる。20μｇのpER33を反応溶液
［10ml Tris−HCl、pH7.5、10mM MgCl₂、1mMジチオスレ
イトール（DTT）、50mM NaCl］200μｌ中、HindIII制限
エンドヌクレアーゼ30単位と37℃で１時間インキユベー
トした。0.5Mエチレンジニトリル四酢酸（EDTA）1/25容
を加え、70℃に10分間加熱して反応を停止した。1/4容
の緩衝液［80％グリセリン、40mM Tris酢酸塩pH7.8、50
mM EDTA、0.05％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、0.1
％ブロモフエノールブルー］を５回加えたのち、生成し
た断片を１％アガロース中電気泳動に付し、サイズによ
って分離した［ゲルおよび電気泳動緩衝液（TBE）:10.8
g/lトリスヒドロキシメチルアミノメタン（Tris塩
基）、5.5g/lホウ酸、0.93g/l EDTA］。ゲルを0.5μg/m
lエチジウムブロミド溶液中インキユベーシヨンしたの
ち、DNAストリツプを紫外線で可視化し、IFN−遺伝子含
有DNAピース（約800bp）を含むゲル領域を切り取つた。
DNAを1/10×TBE緩衝液中に電気溶出した。DNA溶液をフ
エノールで１回、エーテルで４回抽出し、1/10容の3M酢
酸ナトリウム（NaAc）pH5.8および2.5容のエタノールを
加えて、−20℃で水からDNAを沈殿させた。遠心分離
後、DNAを70％エタノールで洗浄し、真空中で５分間乾
燥した。DNAを水50μｌに溶解した（約50μg/μｌ）。D
NAをニツクトランスレーシヨンを用いて放射標識した
［マニアテイス（Maniatis,I）ほか：モルキユラー・ク
ローニング（Molecular Cloning）の改良法］。また、5
0μｌインキユベーシヨン溶液は以下の組成とした。50m
M Tris pH7.8、5mMMgCl₂、10mMメルカプトエタノール、
pER33からのDNAインサート100ng、16pg DNaseI、25μM
dATP、25μgdGTP、25μM dTTP、20μCiα−³²Ｐ−dCTP
（＞3,000Ci/mMOl）ならびに３単位のDNAポリメラーゼ
Ｉ（大腸菌）。インキユベーシヨンは14℃で45分間行つ
た。１容の50mM EDTA、２％SDS、10mM Tris pH＝7.6の
溶液を加え、70℃に10分間加えて反応を集結させた。DN
AをセフアデツクスＧ−100を用いTE緩衝液（10mM Tri
s、pH＝8.0、1mM EDTA）へのクロマトグラフイーにより
放射標識されなかつた部分と分離した。放射標識サンプ
ルの比活性は約４×10⁷cpm/μｇであつた。

ｃ）IFN遺伝子含有インートのためのクローンのスクリ
ーニング マイクロタイター板のウエル中に凍結した細菌培養液
を解凍した（ａ）。相当する大きさのニトロセルロース
フイルター片［シユライヘル・アンド・シユール社、BA
85、孔径0.45μｍ）をLB−アガール（LB−アガール:10g
/lトリプトン、5g/l酵母エキス、5g/lNaCl、15g/lバク
トアガール、20mg/lテトラサイクリン塩酸塩）上に置
く。マイクロタイター板に適合したプランジヤーにより
各クローンをニトロセルロースフイルターに移した。バ
クテリアを一夜37℃で生育させ、径約5mmのコロニーを
形成させた。バクテリアを破壊し、DNAを変性するた
め、ニトロセルロースフイルターを、次の溶液：（１）
0.5M NaOHに８分、（２）1M Tris pH＝7.4に２分、
（３）1M Tris pH7.4に２分、（４）1.5M NaCl、0.5M T
ris pH＝7.4に４分、あらかじめ浸漬したウオツトマン
（Whatman）3MMろ紙のスタツク上に順次置いた。フィル
ターを風乾したのち、２時間80℃に保持した。フイルタ
ーを、６×SSC（１×SSCは0.15M NaCl、0.015Mクエン酸
三ナトリウム、pH＝7.0）、５×デンハルト溶液［１×
デンハルト溶液は0.02％PVP（ポリビニルピロリドン）
に相当］、0.02％フイコール（MG:40,000D）;0.02％BSM
（ウシ血清アルブミン）および0.1％SDS（ドデシル硫酸
ナトリウム）からなるハイブリダイゼーシヨン溶液中、
65℃で４時間前処理した。（ｂ）で製造したサンプル、
各フイルターあたり約１×10⁶cpmを煮沸して変性し、ハ
イブリダイゼーシヨン溶液に加えた。ハイブリダイゼー
ションは65℃で16時間実施した。フイルターを３×SSC/
0.1％SDSにより、65℃で１時間、４回洗浄した。フイル
ターを風乾し、サランラップ で覆い、コダツクＸ−Om
at S フイルムに暴露した。

例２ IFN−遺伝子含有組換えプラスミド確認のためのサザー
ントランスフアー 陽性反応を示すコロニーまたは陽性反応が疑われるコ
ロニーの培養液5mlをＬ−培地（10g/lトリプトン、5g/l
酵母エキス、5g/lNaCl、20mg/lテトラサイクリン塩酸
塩）中、37℃で一夜生育させた。プラスミドDNAはバー
ンボイムとドリー（Birnboim and Doly）の方法［ヌク
レイツク・アシツズ・リサーチ（Nucl.Acid.Res.）、第
７巻、1513（1979）］の改良プロトコールを用いて単離
した。1.5ml懸濁液中の細胞を遠心分離し、50mMグルコ
ース、10mM EDTA、25mM Tris−HCl pH＝8.0および4mg/m
lのリゾチームからなるリゾチーム溶液100μｌ中０℃に
再懸濁した。室温で５分間インキユベートしたのち、２
容の氷冷0.2M NaOH、１％SDS溶液を加え、さらに５分間
インキユベーシヨンを続けた。次に氷冷酢酸ナトリウム
溶液（pH4.8）150μｌを加え、５分間インキユベートし
た。沈殿した細胞成分を遠心分離した。

DNA溶液を１容のフエノール／クロロホルム（1:1）で抽
出し、２容のエタノールを加えてDNAを沈殿させた。遠
心分離後、ペレツトを70％エタノールで１回洗浄し、真
空中で５分間乾燥した。DNAを50μｌの（TE）−緩衝液
に溶解した。この10μｌを反応液（10mM Tris−HCl pH
＝7.5、10mM MgCl₂、50mM NaCl、1mM DTT）50μｌ中、P
stI制限エンドヌクレアーゼ10単位により、37℃で１時
間消化した。

1/25容の0.5M EDTAならびに1/4容５×緩衝液（例1b参
照）を加えたのち、10分間加熱し、ついでDNAを１％ア
ガロースゲル（TBE−緩衝液）中電気泳動によつて分離
した。アガロースゲル中のDNAをサザーン法［サザーン
（Southern,EM）：ジヤーナル・オブ・モンキユラー・
バイオロジー（J.Mol.Biol）、第98巻、503〜517（197
5）］に従つてニトロセルロースフィルターに移した。
ゲルを、1.5M NaCl/0.5M NaOH溶液中で１時間インキユ
ベートして、ゲル中のDNAを変性した。次に、1M Tris×
HCl pH＝8/1.5M NaCl溶液で１時間中性化した。DNAを10
×SSC（1.5M NaCl、0.15Mクエン酸ナトリウムpH＝7.0）
でニトロセルロースフイルターに移した。トランスフア
ー完了後（約16時間）、フイルターを６×SSC緩衝液中
で短時間すすぎ、風乾し、最後に80℃に２時間加熱し
た。フイルターを６×SSC/5×デンハント溶液/0.1％SDS
（例1c参照）により65°で４時間前処置した。約２×10
⁶cpmのハイブリダイゼーシヨンサンプル（例1b参照）を
100℃に加熱して変性し、ついでハイブリダイゼーシヨ
ン溶液に加えた。ハイブリダイゼーシヨンは65℃で16時
間実施した。次にフイルターを３×SSC/0.1％SDS溶液に
より５℃で１時間、４回洗浄した。風乾後、フイルター
をサランラツプ で覆い、コダツクＸ−Omat S フイル
ム上に暴露した。

例３ クローンE76E9中インターフエロン活性の検出 クローンE76E9中の培養液100mlをＬ−培地（10g/lトリ
プトン、5g/l酵母エキス、5g/l NaCl、5g/lグルコー
ス、20mg/lテトラサイクリン塩酸塩）中37℃で、光学密
度A₆₀₀＝0.8になるまで培養した。バクテリアを7,000rp
mで10分間遠心分離し、40mM Tris×HCl pH＝8.0、30mM
NaCl溶液で１回洗浄し、ついで洗浄液1.5mlに再懸濁し
た。1mg/mlのリゾチームと０℃で30分間インキユベート
したのち、バクテリア懸濁液の凍結／解凍を５回くり返
した。細胞を4,000rpmで１時間遠心分離してペレツト化
した。上澄液を滅菌ろ過し、インターフエロン活性につ
いて試験した。使用した試験法はV3細胞および水泡性口
内炎ウイルスを用いたプラーク減少試験であつた［アド
ルフ（Adolf,GR）ほか：アーカイブス・オブ・バイロロ
ジー（Arch.Virol.）第72巻、169〜178（1982）］。驚
くべきことに、このクローンは初期培養液１に対し、
9,000単位までのインターフエロンを産生した。

例４ 新規配列に関連する遺伝子数を決定するためのゲノムの
サザーンブロット ａ）ナマルワ細胞からのDNAの単離 ナマルワ細胞培養液400mlをJA21遠心分離機により1,0
00rpmで遠心分離し、細胞をペレツト化する。生成した
ペレットをNP40緩衝液（NP40緩衝液:140mM NaCl、1.5mM
MgCl₂、10mM Tris−HCl pH＝7.4）に再懸濁して注意深
く洗浄し、再び1,000rpmでペレツト化する。得られたペ
レツトを20mlのNP40緩衝液20mlに再び懸濁し、1mlのNP4
0溶液と混合して細胞壁を破壊する。５分間水浴中に放
置したのち、無傷の細胞核を1,000rpmで遠心分離してペ
レツト化し、上澄液を捨てる。細胞核を50mM Tris/Cl p
H＝8.0、10mM EDTAおよび200mM NaClからなる溶液10ml
に再懸濁し、次いで20％SDS1mlを加えて蛋白質を除去す
る。生成する粘稠な溶液を同量のフエノール（10mM Tri
s/Cl pH＝8.0で飽和）により２回、クロロホルムによ
り２回抽出する。エタノールを加え、遠心分離に付して
DNAを沈殿させる。次に、生成したDNAペレツトを70％エ
タノールで１回洗浄し、真空中で５分間乾燥し、TE緩衝
液（TE緩衝液:10mM Tris/Cl pH＝8.0、1mM EDTA）6mlに
溶解する。DNAの濃度は0.8mg/mlである。

ｂ）ナマルワ細胞からのDNAの制限エンドヌクレアーゼ
消化 制限エンドヌクレアーゼ消化は、製造業者［ニユー・
イングランド・バイオラブズ（New England Biolab
s）］の特定した条件に従って実施した。DNA 1μｇを容
量10μｌ中、37℃において、２時間またはそれ以上、適
当な制限エンドヌクレアーゼ２単位で消化する。制限エ
ンドヌクレアーゼとしては、EcoRI、HindIII、BamHI、S
phI、PstIおよびClaIを使用した。各消化実験にDNA2μ
ｇを使用する。消化の完結をモニターするために、10μ
ｌ（一部）を反応開始時にとり、0.4μｇのlambdaフア
ージ−DNAと混合する。２時間インキユベーシヨンした
のち、これらの部分サンプルをアガロースゲル電気泳動
に対し、染色lambdaフアージDNA断片のサンプルと比較
して消化の完結を調べる。このようなチエツクを実施し
たのち、EDTAを最終濃度20mMになるように加え、溶液を
70℃に10分間加熱して反応を停止させる。0.3M NaAC、p
H＝5.6および2.5容のエタノールを加えてDNAを沈殿させ
る。−70℃で30分間インキユベートしたのち、DNAをエ
ツペンドルフ（Eppenforf）遠心分離機でペレツト化
し、70％エタノールで１回洗浄し、乾燥する。生成した
DNAをTE緩衝液30μｌにとる。

ｃ）ゲル電気泳動およびサザントランスフアー消化した
DNAサンプルをTE緩衝液 （10.8g/l Tris塩基、5.5g/lホウ酸、0.93g/l EDTA）中
0.8アガロースゲルにより、大きさに応じて分画化す
る。この目的には、DNAサンプル15μｌを４μｇの負荷
緩衝液（0.02％SDS、５×TE緩衝液、5mM EDTA、50％グ
リセリン、0.1％ブロモフエノールブルー）と混合し、
短時間70℃に加熱し、ゲル中に設けたトローフにロード
する。EcoRIおよびHindIIIで切断したLambda−DNAを別
個にロードし、DNAのサイズのマーカーとして用いる。
ゲル電気泳動は、約1V/cmで24時間行う。ついでDNAを、
サザーン法を用いて、10×SSC（１×SSC:150mMクエン酸
三ナトリウム、15ml Nacl、pH＝7.0）で、ニトロセルロ
ースフイルター［シユライヘル・アンド・シユール（Sc
hleicher add Schuell）社、BA85］に移す。フイルター
を室温で乾燥したのち、80℃に２時間加熱してDNAをフ
イルターに結合させる。

ｄ）ハイブリダイゼーシヨンプローブ 20μｇのプラスミドP9A2をAvaIIで切断すると、全cDN
Aインートを含有する約1100bpの断片が生成する。このD
NA断片をSau3AおよびAluIで再び切断し、アガロースゲ
ル電気泳動（第5b図参照）後に、電気溶出およびエルチ
ツプカラムクロマトグラフイーによつてDNA大断片を単
離する。生成したDNA（1.5μｇ）を水15μｇに溶解す
る。

20μｇのプラスミドpER33をHindIIIで切断し、このIF
N−α２−Argに対する発現プラスミド［ラツスル−ドウ
ワ−キン（Rastl−Dworkin,E）ほか：ジーン（Gene）、
第21巻、237〜248（1983）］を２回切断する。インター
フエロン−α２−Argに対する遺伝子を含有するDNA小断
片をプラスミドP9A2の場合と同様にして単離する。

両DNAをリグビー（Rigby,PWJ）ほか［ジヤーナル・オ
ブ・モルキユラー・バイオロジー（J.Mol.Biol.）、第1
13巻、237〜251（1977）］の提案した方法を用いてニツ
クトランスレーシヨンに付す。ニツクトランスレーシヨ
ンは１×ニツク緩衝液（１×ニツク緩衝液:50mM Tris/C
l pH＝7.2、10mM MgSO₄、0.1mM DTT、50μg/mlBSA）dAT
P、dGTPおよびdTTPそれぞれ100μmol、150μCi α−³²
Ｐ−dCTP［アマーシヤン（Amersham、3000CimMOl］なら
びにDNAポリメラーゼＩ［ベーリンガー・マンハイム（B
oehringer−Mannheim）］５単位を含有する溶液50μｌ
中DNA0.2gを用いて実施する。14℃で２時間反応させた
のち、同量のEDTA溶液（40mMOl）を加えて反応を停止さ
せ、TE緩衝液中G50カラムクロマトグラフイーに付して
未反応放射性物質を分離する。残つた比放射能は約100
×10₆cpm/μg DNAである。

ｅ）ハイブリダイゼーシヨンおよびオートラジオグラフ
イー ニトロセルロースフイルターを半分に切る。いずれの
半分も、同一セツトのトレースと例4aに述べた制限酵素
であらかじめ処置したナマルワDNAを含有する。このフ
イルターを６×SSC、５×デンハルト［ｌ×デンハルト:
0.02％ウシ血清アルブミン（BSA）、0.02％ポリビニル
ピロリドン（PVP）、0.02％フイコール400］、0.5％SD
S、0.1mg/ml変性ウシ胸線DNAおよびEDTAを含む溶液中、
65℃で２時間、プレハイブリダイズする。ハイブリダイ
ゼーシヨンは６×SSC、５×デンハルト、10mM EDTA、0.
5％SDSおよび約10×10⁶cpmのニツクトランスレートした
DNA中、65℃で16時間実施する。フイルターの半分はイ
ンターフエロン−α２−Arg−DNAと、他の半分はプラス
ミドP9A2から単離したインターフエロン−DNAとハイブ
リダイズする。ハイブリダイゼーシヨン後、両フイルタ
ーを２×SSCおよび0.1％SDSからなる溶液により室温で
４回、0.2×SSCおよび0.01％SDSからなる溶液により65
℃で45分間２回洗浄する。ついでフイルターを乾燥し、
コダツクＸ−Omat Sフイルムに暴露する。

例５ 発現プラスミドpRHW12およびpRHW11の製造 予備的説明：発現プラスミドの製造は第６図に例示が
ある。制限酵素による消化はすべて酵素の製造業者の指
示に従って実施する。

ａ）プラスミドpRHW10の製造 100μｇのプラスミドP9A2を制限エンドヌクレアーゼA
vaII（ニユー・イングランド・バイオライズ）100単位
で消化する。消化後、70℃に加熱して酵素を不活化し、
得られた断片を1.4％アガロースゲル上、TBE緩衝液（TB
E緩衝液:10.8g/l Tris塩基、5.5g/lホウ酸、0.93g/lEDT
A）により、サイズに応じて分画化する。全cDNAインサ
ートを含有するバンドを電気溶出し、エルチツプカラム
（シユライヘル・アンド・シユール）を用いて精製す
る。得られた20μｇのうちの６μｇを制限エンドヌクレ
アーゼSau3a（溶液計100μｌ中20単位）でさらに消化す
る。断片をTBE緩衝液中２％アガロースゲルを用いて分
離する。エチジウムブロミド（EtBr）で染色後、189bp
のDNA断片を電気溶出し、上述したと同様に精製する
（＝第６図の断片ｂ）。

インターフエロン遺伝子にプロモーター、リボゾーム
結合サイトおよび開始コドンを結合するため、相当する
DNA断片を発現プラスミドpER33［ラツスル−ドウワーキ
ン（Rastl−Dworkin,E）ほか：ジーン（Gene）、第21
巻、237〜248（1983）］から単離する。この目的のた
め、50μｇのpER33を制限酵素EcoRIおよびPvuIIで２回
消化し、生成した断片をTBE緩衝液中アガロースゲル上
に、その大きさにより分画化する。長さ389bpで、Trpプ
ロモーター、リボソーム結合サイトおよび開始コドンを
含むDNA断片を電気溶出し、エルチツプカラムを用いて
精製する。かくして得られた断片を、次にSau3Aで消化
し、アガロースゲル電気泳動、電気溶出およびエルチツ
プカラム精製に付すと、所望の断片108bpが約100μｇの
収量で得られる（＝第６図の断片ｃ）。

20ngの断片ｂを20ngの断片ｃと、50mM Tris/Cl pH＝
7.5、10mM CaCl₂、1mM DTTおよび1mM ATPを含む溶液
中、容量40μlde、T₄リガーゼ10単位を用い、14℃で18
時間、リゲートさせる。次に70℃に加熱して酵素を破壊
し、生成したDNAを総容量50μｇ中、HindHIIIで切断す
る。

10μｇの発現プラスミドpER103［ラツスル−ドウワー
キン（Rastl−Dworkin,E）ほか：ジーン（Gene）、第21
巻、237〜248（1983）］を総容量100μｌ中HindHIIIで
線状になる。37℃で２時間処理したのち、１容の２×ホ
スフアターゼ緩衝液（20mM Tris/Cl pH＝9.2、0.2mM ED
TA）とウシ小腸ホスフアターゼ（CIP）１単位を加え
る。45℃で30分間反応させたのち、さらに１単位のCIP
を加え、さらに30分インキユベーシヨンを続ける。かく
して得られたDNAをフエノールで２回、クロロホルムで
１回抽出し、0.3M酢酸ナトリウム（pH＝5.5）と2.5容の
エタノールを加えて沈殿する。次のリゲーシヨン工程で
ベクターの再リゲーシヨンを防止するため、脱ホスホス
ホリン化する。

100ngの直線化pER103とリゲートした断片ｂとｃ（Hin
dIII消化後）をリガーゼ緩衝液を含む100μｌの溶液に
加え、T₄−DNAリガーゼを用いて14℃で18時間リゲート
する。

コンピーテント大腸菌HB101［ドウワーキン（Dworki
n,E）ほか：デベロプメンタル・バイオロジー（Dew.Bio
l.）、第76巻、453〜448（1980）］200μｌをリゲーシ
ョン混合物20μｌと混合し、氷上で45分間インキユベー
トする。ついで、40℃での２分間の熱シヨツクにより、
DNAの取り込みを起こさせる。細胞懸濁液を氷上でさら
に10分間インキユベートし、最後に50mg/lのアンピシリ
ンを含むLBアガール（10g/lトリプトン、5g/l酵母エキ
ス、5g/l NaCl、1.5％アガール）に適用する。得られた
24個のコロニーからのプラスミドをバーンボイムとドリ
ー（Birnboim and Doly）の方法［ヌクレイツク・アシ
ツズ・リサーチ（Nucl.Acid.Res.）、第７巻、1513〜15
23（1979）］を用いて単離する。各種の制限酵素で消化
したのち、１個のプラスミドが所望の構造を示した。こ
れをpRHW10と命名した（第６図参照）。

ｂ）プラスミドpRHW12の製造 約10μｇのプラスミドpRHW10をBamHIで切断する。つ
いでDNAポリメラーゼＩのクレノウ断片および４種のデ
オキシヌクレオシドトリホスフエートを加え、20分間室
温でインキユベートする。得られた線状の、ブンラント
末端のプラスミドをフエノール抽出、沈殿で精製し、容
量100μｇ中制限エンドヌクレアーゼNcoIで切断する。
アガロースゲル電気泳動、電気溶出およびエルチツプ精
製により大断片が得られる。断片ａ）（第６図参照）
は、P9A2−cDNAインサート（上述）を含むAvaII断片４
μｇをNcoIおよびAluIで消化すると得られる。断片ａ）
の収量は約２μｇである。

最終リゲーシヨン工程では、断片ａ）を、BamHI/NcoI
であらかじめ消化したpRHW10と、容量10μｌ中、各DNA1
0ngを用いてリゲートする。BamHIサイトにAluIで切断し
たDNAをリゲートすることにより、BamHI認識サイトが保
持される。

生成したリゲーシヨン混合物で、上述のようにして、
コンピーテント大腸菌HB101を形質転換する。得られた4
0個のコロニーのうち１個が選択される。これがpRHW12
である。

プラスミドを単離し、サンガー法［サンガー（Sange
r,F）ほか：プロシーデイングス・オブ・ザ・ナシヨナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Aca
d.Sci.）第74巻、5463〜5467（1979）］を用いてEcoRI/
BamHIインサートの配列を決定する。これは期待の構造
を有する。

ｃ）プラスミドpRHW11の製造 これは例5bと同様に行う。１μｇのプラスミドpRHW10
をBamHIで消化する。生成したDNAの粘着末端を、DNAポ
リメラーゼＩのクレノウ断片と４種のデオキシヌクレオ
シドトリホスフエートを用いてブラント末端に変換し、
ついで線状化DNAをNcoIで切断する。アガロースゲル電
気泳動、電気溶出およびエルチツプカラムクロマトグラ
フイーにより、大断片が得られる。

NcoI−AluI断片はクローンE76E9から例5bと同様に単
離する。次に、10ngのベクター部分を10ngのcDNA部分
と、容量10μｌ中適当な条件下に、T₄リガーゼ１単位を
用いてリゲートする。生成したDNA混合物で大腸菌HB101
を形質転換し、得られた45個のコロニーをアンピシリン
含有LB板上で選択し、１個のコロニーを選ぶ。これをpR
HW11と命名する。相当する。相当するクローンを培養し
たのち、プラスミドDNAを単離する。その構造は数種の
特異的制限エンドヌクレアーゼ（AluI、EcoRI、HindII
I、NcoI、PstI）切断サイトの存在により証明される。

ｄ）プラスミドpRHW12含有大腸菌HB101によるインター
フエロン活性の発現 バクテリア培養液100mlを、トリプトフアンを除く全
アミノ酸（各アミノ酸20μg/ml）、チアミン１μg/ml、
0.2％グルコースおよび20μg/mlのインドール−（３）
−アクリル酸（IAA）、トリプトフアンオペロンのイン
デユーサーを含むM9最小培地中、600nmでの光学密度が
0.6になるまでインキユベートする。ついでバクテリア
を遠心分離（7,000rpmで10分）してペレツト化し、50mM
Tris/Cl pH＝８、30mM NaClで１回洗浄し、最後に同一
の緩衝液1.5mlに懸濁する。氷上、1mg/mlのリゾチーム
と30分間インキユベートしたのち、バクテリアの凍結、
解凍を５回くり返す。40,000rpmで１時間遠心分離して
細胞屑を除く。上澄液を滅菌ろ過し、ヒトA549細胞およ
び脳心筋炎ウイルスを用いたプラーク減少定量法によ
り、インターフエロン活性を試験する。

結果：生成したバクテリア培養液１は１×10⁶国際
単位のインターフエロンを含有する［ビリオー（Billia
u,A）：アンチバイラル・リサーチ（Antiviral Re
s.）、第４巻、75〜98（1984）］。

例６ Ｉ型インターフエロンのアミノ酸およびヌクレオチド配
列間の相違の要約 成熟インターフエロンの最初のシステイン残基を、プ
ラスミドP9A2およびE76E9のcDNAインサートをコードす
るアミノ酸配列の最初のシステイン残基と一列に並べ
て、アミノ酸配列をたがいに比較する。P9A2またはE76E
9クローンの特異的配列の間には差がみられなかつたの
で、この２つの配列は第７図ではIFN−ωとして示して
ある。補正したのはインターフエロン−αＡの45位にお
けるギヤツプの挿入のみで、これは差として計算した。
ω−インターフエロンの配列と比較する場合は、通常の
166個のアミノ酸について考慮した。この値は第７図
に、クローンP9A2およびE76E9によつてコードされるさ
らに６個のアミノ酸の数とともに示した。差の百分率は
差を1.66で割つて得られた値である。したがつて１個の
アミノ酸の差は0.6％になる。IFN−ωのさらに６個のア
ミノ酸については3.6％の差があることになるが、これ
はすでに百分率の値に含まれている。

β−インターフエロンとの比較は、成熟β−インター
フエロンの３番目のアミノ酸を、成熟α−インターフエ
ロンの最初のアミノ酸またはプラスミドP9A2およびE76E
9によつてコードされる最初のシステインと一列に並べ
た。したがつて、α−インターフエロンとβ−インター
フエロンを比較した場合、対応した最長の構造はアミノ
酸162個である。α−インターフエロンにもβ−インタ
ーフエロンにも各２個の比較されないアミノ酸がある。
これらは差として計算し、第７図では別に示したが、百
分率の計算には包含させてある。β−インターフエロン
とクローンP9A2またはE76E9のアミノ酸配列の照合も同
様に実施したが、この場合には対応のないアミノ酸が計
10個である。

ｂ）ヌクレオチド配列の比較 比較される配列を例6bと同様にリストする。成熟α−
インターフエロンのDNAの最初のヌクレオチドはシステ
インをコードする成熟α−インターフエロンのトリプレ
ツトの最初のヌクレオチドである。プラスミドP9A2また
はE76E9のDNAからの最初のヌクレオチドもシフテイン−
１に対するコドンの最初のヌクレオチドである。β−イ
ンターフエロンのDNAからの最初のヌクレオチドは第３
番目のトリプレツトの最初のヌクレオチドである。α−
インターフエロンの各DNAをβ−インターフエロンのDNA
と比較する場合には計498個のヌクレオチドについて比
較し、各α−インターフエロンまたはβ−インターフエ
ロンのDNA配列をプラスミドP9A2およびE76E9のDNA配列
と比較する場合には516個のヌクレオチドについて比較
した。ギヤツプの絶対数を第７図におけるテーブルの左
側に示し、相当する百分率はカツコ内に示す。

例７ ウイルス誘発性のω−１−mRNAの発現およびNC37細胞 ａ）ω−インターフエロン特異性ハイブリダイゼーシヨ
ンプロープの合成 オリゴヌクレオチドｄ（TGCAGGGCTGCTAA）10pMolをγ
−³²P−ATP（比活性：＞5000Ci/mMOl）およびポリヌク
レオチドキナーゼ10単位と、総容量10μｌ（70mM Tris/
Cl pH＝7.6、10mM MgCl₂、50mM DTT）中に混合し、37℃
に１時間放置する。ついで、70℃に10分間加熱して反応
を停止させる。生成した放射能標識オリゴヌクレオチド
を5mMolのM13pRHW12ssDNA（第９図参照）により、総容
量35μｌ（100mM NaCl）中、50℃に１時間放置してハイ
ブリダイズする。

室温に冷却したのち、ニツクトランスレーシヨン緩衝
液、４種のデオキシヌクレオシドトリホスフエートおよ
び10単位のクレノウポリメラーゼを加えて総容量50μｌ
（50mM Tris/Cl pH＝7.2、10mM MgCl₂、50μg/mlBSA、
ヌクレオチド1mM）とする。ポリメリゼーションは室温
で１時間行い、70℃に５分間加熱して反応を停止させ
る。

反応中、部分的に二重鎖の環状DNAが得られる。これ
を、製造業者の指示した緩衝液を用いAvaII25単位によ
り、総容量500μｌ中で切断する。二重鎖領域は均一の
大きさに切断される。70℃に５分間加熱して反応を停止
させる。

ｂ）ウイルス感染細胞からのRNAの製造 100×10⁶個の細胞（0.5×10⁶/ml）を100μMolのデキ
サメサゾンで48〜72時間処理する。対照にはデキサメサ
ゾンを加えない。インターフエロンを誘導するため、血
清を含まないメジウムに細胞を濃度５×10⁶/mlになるよ
うに懸濁し、2₁₀単位/mlのセンダイウイルスを感染させ
る。細胞培養液の上清の一部をとり、プラーク減少定量
法（例5b）によりIFN活性を試験する。ウイルス感染６
時間後に細胞を遠心分離（1,000g,10分）によつて収穫
し、50mlのNP40緩衝液で洗浄し（例4a）、氷冷したNP40
緩衝液9.5mlに再懸濁し、10％NP40緩衝液0.5mlを加えて
氷冷下に５分間おき分解する。核を遠心分離（1,000x
g、10分）によつて除去したのち、上澄液に50mM Tris/C
l、0.5％ザルコシンおよび5mM EDTAを加えてpH＝８に調
整し、−20℃に保存する。上澄液から総RNAを単離する
ため、フエノールで１回、フエノール／クロロホルム／
イソアミルアルコールで１回、クロロホルム／アミルア
ルコールで１回抽出する。水相を5.7モルCsClパツド4ml
の上に層にし、SW40ロータで遠心分離し（35krpm、20時
間）、抽出液からDNAおよび残つた蛋白質を除去する。
生成したRNAペレツトを2mlのTE、pH＝8.0に再懸濁し、
エタノールで沈殿させる。沈殿したRNAを5mg/mlの濃度
で水に溶解させる。

ｃ）インターフエロン−ω mRNAの検出 例7a）で製造したハイブリダイゼーシヨンプロープ0.
2μｌを、例7b）に従って製造したRNA20〜50μｇととも
に、エタノールを添加して沈殿させる。対照としては、
プラスミドpRHW12（例５）で形質転換した大腸菌起源の
トランスフアーRNA（tRNA）またはRNAを細胞性RNAの代
わりに加える。生成したペレツトを70％で洗浄して塩を
除き、乾燥し、80％ホルムアミド（100mM PIPES pH＝6.
8、400mM NaCl、10mME EDTA）25μｌに溶解する。次に
サンプルを100℃に５分間加熱してハイブリダイゼーシ
ヨンサンプルを変性させ、そのまま温度を52℃に調整
し、この温度で24時間インキユベートする。ハイブリダ
イゼーシヨン後、サンプルを氷上に置き、S1反応混合物
（4mM Zn(Ac)₂、30mM NaAC、250mM Nacl、５％グリセリ
ン、20μgSSウシ胸線DNA、S1ヌクレアーゼ100単位］475
μｌを加える。37℃で１時間消化したのち、エタノール
で沈殿させて反応を停止させる。

ペレツトを６μｌのホルムアミド緩衝液に溶解し、8M
尿素を含有する６％アクリルアミドゲル上DNA配列決定
反応からのサンプルの場合とはほぼ同様に分離する［サ
ンガー（Sanger,F）ほか：プロシーデイングス・オブ・
ザ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Pr
oc.Natl.Acad.Sci.）、第74巻、5463〜5467（197
9）］。

オートラジオグラフィーのためには、乾燥したゲル
を、−70℃で、コダツクレーンのレギユラー強化スクリ
ーンを用いてデユポンクロネツクスＸ線フィルムに暴露
する。

第10図の説明 レーンＡ〜C:対照 レーンA:20μgtRNA レーンB:pER33からのRNA10μｇ（大腸菌−インターフエ
ロン−α２−Argの発現株） レーンC:pRHW12からのRNA1ng（大腸菌−インターフエロ
ン−ω１の発現株） レーンD:非処理ナマルワ細胞からのRNA50μｇ レーンE:ウイルス感染ナマルワ細胞からのRNA50μｇ レーンF:デキサメサゾンで前処置し、ウイルスで感染さ
せたナワルワ細胞からのRNA50μｇ レーンG:非処理NC37細胞からのRNA20μｇ レーンH:ウイルス感染NC37細胞からのRNA20μｇ レーンI:デキサメサゾンで前処理し、ウイルスで感染さ
せたNC37細胞からのRNA20μｇ レーンM:サイズマーカー（HinfIで切断したpBR322） レーンＢおよびＣは、特異的RNAがRNA分子中にある場合
にのみ期待されるシグナルが検出できることを示してい
る。また、大過剰の異なるDNAがあつてもバツクグラン
ドシグナルは生じないことも明らかである（レーンＢ参
照）。さらに、ハイブリダイゼーシヨンの相手として用
いたtRNAもシグナルを生じない（レーンＡ参照）。

レーンＧ〜Ｉは、ウイルス感染NC37細胞におけるω１
特異的RNAの誘導を示している。

レーンＤ〜Ｆは、ナマルワ細胞でもNC37細胞の場合と
基本的に同じ結果が得られることを示している。この結
果は、相当する細胞上清について測定したインターフエ
ロン力価と平行している。

インターフエロン−ω１遺伝子発現におけるこの挙動
は、インターフエロンＩ型遺伝子から期待されたものと
同じである。

例８ IFN−ω１をコードする遺伝子またはその関連遺伝子の
単離 ａ）コスミドスクリーニング ヒトコスミドバンク［コスミドベクターpcos2 EMBLに
クローニングしたヒトDNA（男性）；ポントカ（Ponstk
a,A）ほか；プロシーデイングス・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミー・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad,Sc
i.）、第81巻、4129〜4133（1984）；コンプレキシテ
イ:2×10⁶）について、IFN−ωまたは関連遺伝子をスク
リーニングした。宿主としては、大腸菌DH1（r_k ^-、
m_k ⁺、rec.A;gyrA96、Sup.E）を用いた。まずMg 細胞
（平板バクテリア）を調製した。大腸菌DH1を0.2％マル
トース補充Ｌ−培地（10g/lトリプトン、5g/l酵母エキ
ス、5g/l NaCl）中一夜生育させる。遠心分離してバク
テリアを除き、10mM MgSO₄溶液にとると、光学密度600
＝２を示す。この細胞懸濁液5mlを12.5×10⁶コロニー形
成単位のパツクされたコスミドとともに37℃で20分間イ
ンキユベートする。次に10容のLBを加え、コスミドにコ
ードされているカナマイシン抵抗性の発現のために懸濁
液を37℃に１時間保持する。バクテリアを遠心分離して
除き、LB50mlに再懸濁し、その200μｌをとつてニトロ
セルロースフイルター（シユライヘル・アンド・シユー
ル、BA85、径132mm）上に広げ、これをLBアガール（Ｌ
培地中1.5％アガール）プラスカナマイシン上に置く。
各フイルターに約10,000〜20,000のコロニーが成育す
る。コロニーを４℃に保つたニトロセルロースフイルタ
ー上でさらにレプリカ培養する。

コロニーフイルターのセツトを例1c）に記載したと同
様に処理する。すなわち、バクテリアを変性させ、単一
鎖DNAをニトロセルロース上に固定する。フイルター
を、500mM Tris/HCl pH＝8.0、1M NaCl、1mM EDTA、0.1
％SDS溶液中、65℃で４時間洗浄する。フイルターを次
に、５メデンハルト（例1c参照）、６×SSC、0.1％SDS
溶液中、65℃で２時間インキユベートし、同一溶液中
で、ニツクトランスレーシヨンした変性IFN−ω1 DNA
（クローンpRHW12のHindIII−BamHIインサート、第６図
参照）約50×10⁶cpmと65℃で24時間ハイブリダイズす
る。ハイブリダイゼーション後、フイルターを、まず、
２×SSC、0.01％SDS溶液中、室温で３×10分間、次に0.
2×SSC、0.01％溶液中で３×45分間洗浄する。フイルタ
ーを乾燥し、−70℃で増感フイルムを用し、コダツクＸ
−Omat Sフィルムに暴露する。レプリカフィルター上の
陽性反応コロニーをかき落とし、Ｌ培地＋カナマイシン
（30μg/ml）に再懸濁する。この懸濁液から数μｌをと
り、LBアガール＋30μg/mlカナマイシン上にひろげる。
得られたコロニーをニトロセルロースフイルター上でレ
プリカ培養に付す。これらのフイルターを前述のよう
に、³²P標識IFN−ω１−DNAとハイブリダイズする。ハ
イブリダイズした各コロニーから、バーンボイムとドリ
ー（Birnbiom＆Doly）の方法［ヌクレイツク・アシツズ
・リサーチ（Nucl.Acid.Res.）、第７巻、1513（197
9）］を用いてコスミドを単離する。このコスミドDNAプ
レパレーシヨンで大腸菌DH1を形質転換し、トランスホ
ーマントをLBアガール＋30μg/mlカナマイシン上で選択
する。トランスホーマントを再び、陽性反応クローンに
ついて³²P放射能標識IFN−ω1DNAで試験した。単離され
たオリジナル材料に出発する各場合１個のクローンを選
択し、そのコスミドを大規模に産生させる［クレウエル
（Clewell,DB）ほか：バイオケミストリー（Biochemist
ry）、第９巻、4428（1970）］。単離された３個のコス
ミドをcos9,cos10およびcosBと命名した。

ｂ）ハイブリダイズした断片のPUC8中サブクローニング コスミド、cos9、cos10およびcosB 1μｇをHindIIIよ
り製造業者（ユニー・イングランド・バイオラブズ）推
薦の条件下に切断した。切断をTBE緩衝液中１％アガロ
ースゲ上、電気泳動で分離し、サザーン法（例4c）によ
ってニトロセルロースフイルターに移す。２個のフイル
ターをニツクトランスレーシヨンに付したω１−DNAで
例4dに記載したと同様にしてハイブリダイズし、洗浄
し、暴露する。各コスミド約20μｇをHindIIIで切断
し、生成した断片をゲル電気泳動で分離する。予備試験
でω１−DNAとハイブリダイズした断面を電気溶出し、
エルチツプカラム（シユライヘル・アンド・シユール）
で精製する。これらの断片をHindIII状化脱ホスホリル
化PUC8とリゲートし［メツシング（Messing,J）ほか：
ジーン（Gene）、第19巻、269〜276（1982）］、大腸菌
JM101（supE、thi、（lac−proAB）、［Ｆ′、traD36,p
roAB、lac q z M15］（たとえば、ピー・エル・バイオ
ケミカルズ）をリガーゼ反応溶液で形質転換する。バク
テリアを50μg/mlのアンピシリン、250μg/mlの５−ブ
ロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシド（BCIG、ジグマ）および250μg/mlのイソプ
ロピル−β−Ｄ−チオガラクト−ピラノシド（IPTG、シ
グマ）を含むLBアガール上にひろげる。生成したコロニ
ーの青色はPUC8中インサートの非存在を示す。一部の白
色コロニーから小規模にプラスミドDNAを単離し、つい
でHindIIIで切断し、１％アガロースゲル上で分離す
る。DNA断片をニトロセルロースフイルター上に移し、
前述したと同様にして³²P−ω１−DNAとハイブリダイズ
する。cos9およびcos10から出発し、各場合とも１個の
サブクローンを選択し、pRHW22またはpRH57と命名し
た。cosBからはω−１プローブとよくハイブリダイズす
る２個のDNA断片をサブクローン化し、pRH512およびpRH
52と命名した。

ｃ）配列解析 PUC8中に挿入されたDNAはそのベクター部分から、Hin
dIII切断断、ついでゲル電気泳動によつて分離する。こ
のDNA約10μｇを、反応溶液50μｌ中t₄DNAリガーゼを用
いてリゲートし、容量をニツクトランスレーシヨン緩衝
液（例4d）によつて350μｌに調整し、ついで超音波を
用いて分解する。この間氷冷しておく（MSE100ワツト超
音波デイスインテグレーター、20kHzにおける最大出
力、30秒５回）。次に断片の末端を、1/100容の0.5mMdA
TP、dGTP、dCTPおよびdTTPならびに10単位のDNAポリメ
ラーゼＩのクレノウ断片を加えて、14℃で２時間修復す
る。ブラント末端をもつ生成したDNA断片をアガロース
ゲル上その大きさによつて分離する。500〜1000pbの大
きさの断片を単離し、SmaIで切断した脱ホスホリル化フ
アージベクターM13中にサブクローニングする。組換え
フアージの単一鎖DNAを単離し、サンガー（Sanger）に
よつて開発された方法［サンガー（Sanger,F）ほか：プ
ロシーデイングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）、第74
巻、5463〜5467（1976）］を用いて配列を決定する。各
配列をコンピュータを用いてつなげると総配列が得られ
る［ステードン（Staden,R.）：ヌクレイツク・アシツ
ズ・リサーチ（Nucl.Acid.Res.）、第10巻、4731〜4751
（1982）］。

ｄ）サブクローンpRH57の配列（IFN−ω１） この配列は第11図に示す。1933bpのこの断片は、イン
ターフエロン−ω１の遺伝子を含有する。蛋白質をコー
ドする領域はヌクレオチド576〜1163である。配列は全
体としてcDNAクローンP9A2と同一である。ヌクレオチド
576〜674の部分は23個のアミノ酸からなるシグナルペプ
チドである。TATAボツクスは、開始コドンATGの前方、
Ｉ型インターフエロン遺伝子に特徴的な距離にある（47
6〜482の位置）。この遺伝子は、転写時のポリアデニレ
ーシヨンのためのシグナル配列を多く含んでいて（ATTA
AA:1497〜1502、または1764〜1799;AATAAA:1729〜1734
または1798〜1803）、その最初のものはクローンP9A2で
使用された。

ｅ）サブクローンpRHW22の配列（IFN−偽ω２） 第12図には、ω１−DNAサンプルとハイブリダイズす
る、コスミドcos9からのHindIII断片、2132pbの配列を
示す。読み取り枠は905〜1366のヌクレオチドにある。
それから誘導されるアミノ酸配列を示す。最初の23個の
アミノ酸は典型的なＩ型インターフエロンのシグナルペ
プチドのアミノ酸に類似する。以下の131個のアミノ酸
にはアミノ酸65までω１−インターフエロンに類似して
いる。ただし、成熟蛋白質の最初のアミノ酸はチロシン
である。

位置66のアミノ酸からはＮ−グリコシル化可能部位の
配列である（Asn−Phe−Ser）。この点から前方へのア
ミノ酸配列はＩ型インターフエロンの配列とは異なつて
いる。しかしながら、適当な挿入とそれによる蛋白質読
み取り枠の移動によりIFN−ω１に対する類似性を成立
させることができる。（例９参照）。したがつて、Ｉ型
インターフエロンからみて、単離された遺伝子は偽遺伝
子（IFN−偽ω２）である。

ｆ）サブクローンpRH51の配列（IFN−偽ω３） cosBに由来し、bp約3500、ω１−プロープとハイブリ
ダイズするHindIII断片について部分的配列決定を行う
（第13図）。読み取り枠はヌクレオチド92〜394から得
られる。最初の23個のアミノ酸はシグナルペプチドの特
徴を示す。以下のトリプトフアンに始まる配列は、アミ
ノ酸42までIFN−ω１に類似する。その後の誘導された
配列はIFN−ω１とは異なりアミノ酸78の後で終わる。
この配列は挿入によつて、IFN−ω１と著しく相同性に
変化する（例９）。この遺伝子はIFN−偽ω３と命名す
る。

ｇ）pRH52のインサートの配列（IFN−ω偽４） 長さ3659pb、コスミドＢから単離され、ω１−DNAと
ハイブリダイズするHindIII断片の配列を第14図に示
す。翻訳生成物が部分的にIFN−ω１と相同性を示す読
み取り枠はヌクレオチド2951〜3250に存在する。23個の
アミノ酸からなるシグナルペプチドに続いて、以後のア
ミノ酸配列はフエニルアラニンに始まる。IFN−１に対
する相同性はわずかに16番目のアミノ酸の後で中断し、
22番目のアミノ酸から続いて41番目のアミノ酸で終わ
る。翻訳は77番目のアミノ酸まで可能である。例8f）お
よび8g）の場合と同様に、インサーシヨンの導入によ
り、IFN−ω１との良好なホモロジーが成立する。ここ
に単離された偽遺伝子はIFN−偽ω４と命名する。

例９ IFN−ω族の４種のメンバーに対する遺伝子の評価 第15図にはIFN−ω１からIFN−偽ω４までの遺伝子
を、アミノ酸翻訳とともに示す。類似性を高めるため、
各遺伝子にギヤツプを挿入しこれを点線で示す。除去し
た塩基はない。塩基の番号にはギヤツプが含まれてい
る。IFN−ω１のアミノ酸翻訳はすべてそのままである
（たとえば位置352〜355:Hisをコードする“C.AC"）。
偽遺伝子の場合、アミノ酸への翻訳は、これが疑いの余
地なく可能な場合のみとする。この図は、４個の単離さ
れた遺伝子が相互に関係するものであることを直接示し
ている。たとえば、Ｎ−グリコシル可能な位置（ヌクレ
オチド位置301〜309）は４個の遺伝子すべてにみられ
る。

同様に、IFN−偽ω４の場合を除いて、ヌクレオチド6
11〜614に停止コドンを示すトリプレツトがあり、これ
はIFN−ω１の場合、アミノ酸長172の成熟蛋白質を終結
させる。この配列では、IFN−偽ω２の停止コドンはヌ
クレオチド497〜499に、IFN−偽ω４の停止コドンはヌ
クレオチド512〜514に存在する。

遺伝子またはアミノ酸翻訳の間の相関の程度は、第15
図に示した配列から計算できる。第16図にはIFN−ω族
のメンバーの間のDNAホモロジーを示す。２個ずつの比
較では、２個のパートナーの一方または両方がギヤツプ
をもつ位置は計算に入れていない。この比較で、IFN−
ω１−DNAとその偽遺伝子の間には約85％のホモロジー
が認められ。IFN−偽ω２−DNAはIFN−偽ω３およびIFN
−偽ω４のDNAに対して約82％のホモロジーを示す。第1
7図にはシグナル配列の比較結果を、第18図には成熟蛋
白質の比較結果を示す。後者は72〜83％の間を変動す
る。しかしながら、このホモロジーは、IFN−ω１とIFN
−α、IFN−βの間のホモロジー（例６）より大であ
る。IFN−ω族の各メンバーが、IFN−αの族のメンバー
の場合よりも、たがいに大きな相違を示すことは、単離
されたIFN−ω遺伝子４個中の３個が偽遺伝子であり、
機能性遺伝子として同一の選択操作に付されたものでな
いことによつて説明できるものと思われる。

例10 発酵 ａ）菌株の保存 LB−アガール（25mg/lアンピシリン）上の菌株HB101/
pRHW12の単一コロニーを、25mg/lアンピシリン含有トリ
プトン−大豆−培地−（OXOID CM129）に接種し、37
℃、250rpmで振盪しながら、光学密度（546nm）が約５
に達するまで（対数期）インキユベートする。培養液に
10％（w/v）滅菌グリセリンを加え、滅菌アンプル中に
1.5mlずつ充填し、−70℃で凍結する。

ｂ）接種ステージ メジウムは15g/l Na₂HPO₄・12H₂O、0.5g/l Nacl、1.0
g/l NH₄Cl、3.0g/l KH₂PO₄、0.25g/l MgSO₄・7H₂O、0.0
11g/l CaCl₂、5g/lカサミノ酸（メルク2238）、6.6g/l
グルコース−一水和物、0.1g/lアンピシリン、20mg/lシ
ステインおよび1mg/lチアミン塩酸塩を含有する。この
メジウム200mlをとつた1000mlエルレンマイヤーフラス
コ４個それぞれに、HB101/pRHW14で解凍培養液1mlを接
種し、250rpmで振盪しながら37℃で、16〜18時間インキ
ユベートする。

ｃ）製造ステージ メジウムは10g/l(NH₄)₂HPO₄、4.6g/l K₂HPO₄・3H₂O、
0.5g/l NaCl、0.25g/lMgSO₄・7H₂O、0.011g/l CaCl₂、1
1g/lグルコース−一水和物、21g/lカサミノ酸（メルク2
238）、20mg/lシステイン、1mg/lチアミン塩酸塩および
20mg/l3−β−インドールアクリル酸を含有する。14lの
フアーメンター（高さ対直径＝3:1）中に滅菌メジウム8
lをとり、上記培養液800mlを接種する。発酵は、28℃、
1000rpmで攪拌、通気速度1vvm（容量／容量／分）、初
期pH6.9で行う。発酵中にはpHは6.0に低下する。以後、
3N NaOHを自動的に加えて、pHをこのレベルに調節す
る。光学密度（546nm）が18〜20に達したのち（通常8.5
〜9.5時間を要す）、培養液を通気、攪拌下に20℃に冷
却し、通気を止めて6N H₂SO₄を加え、pHを2.2にする。8
00rpm、20℃で１時間攪拌したのち、不活性化した培養
液をCEPAラボラトリーGLE型遠心分離機により、30,000r
pmで遠心分離する。細胞ペーストを凍結し、−20℃で保
存する。

例11 インターフエロン−ω−Glyの精製 ａ）部分精製 すべての工程は４℃で実施する。

培養混合物（発現プラスミドで形質転換された大腸菌
HB101）140gをあらかじめ冷却した１％酢酸1150mlに再
懸濁し、30分間攪拌する。懸濁液のpHを5M NaOH添加に
より10.0とする。この懸濁液をさらに２時間攪拌する。
次に5M塩酸を用いてpHを7.5に再調整し、攪拌をさらに1
5分続ける。懸濁液を10,000rpm（J21遠心分離機、ベツ
クマン、JA10−ローター）、４℃で１時間遠心分離す
る。

澄明な上清を150mlのCPG（制御細孔ガラス）カラム
（CPG10−350、平均サイズ120/200）に、流速50ml/時で
適用する。１の25mM Tris pH＝7.5/1M NaClでカラム
を洗浄し、結合して物質を、25mM Tris pH7.5/1M KCNS/
50％エチレングリコール含有溶液により、流速50ml/時
で溶出する。

インターフエロンの活性を含む分画を集め、0.1Mリン
酸ナトリウム/10％ポリエチレングリコール40,000約100
容量に対して一夜、透析する。生成した沈殿を10,000rp
m（J21遠心分離機、JA20ローター）、４℃で１時間遠心
分離する（第１表参照）。

例12 HuIFN−ω１の特性 ａ）ヒト細胞に対する抗ウイルス活性 定量細胞系：ヒト肺癌細胞A54（ATCCDDL185） チヤレンジウイルス：ネズミ脳心筋炎ウイルス（EMCV） 定量法：細胞変性作用の阻止 蛋白質含量9.4mg/mlの部分精製HuIFN−ω１を細胞培
養メジウムで希釈し、定量板に適用した。こノプレパレ
ーシヨンは対照標準プレパーシヨンGo−23−901−527
（ナシヨナル・インステイチユート・オブ・ヘルス・ベ
セダ、米国）に対し比活性8300IE/mgの抗ウイルス活性
を示した。

ｂ）サル細胞に対する抗ウイルス活性 定量細胞系:GL−V3ベルベツトサル腎臓細胞［クリス
トフイニス（Christofinis,GJ）：ジヤーナル・オブ・
メデイカル・マイクロバイオロジー（J.Med.Microbio
l.）、第３巻、251〜258（1970）］ チヤレンジウイルス：小水泡口内炎ウイルス（VSV） 定量法：プラーク減少 部分精製HuIFN−ω１プレパレーシヨン（例12a）参
照）を培養メジウムに希釈し、定量細胞に適用した。こ
のプレパレーシヨンは比活性580単位/mgを示した。

ｃ）ヒトバーキツトリンパ種細胞（細胞系Daud1）に対
する抗増殖作用 ヒトバーキツトリンパ種細胞系Daud1を各種濃度のHuI
FN−ω（例12a）参照）の存在下に成育させた。培養は
細胞100,000個/mlで開始し、2,4および６日後の培養液
（37℃）中の細胞密度を測定した。非処理培養液を対照
とした。培養はすべて３個ずつ行つた。第19図に実験結
果を示す。細胞増殖は10単位/mlで部分的または一時的
に、100単位/mlで強力に阻止された。

ｄ）ヒト子宮頸癌細胞（細胞頸HeLa）に対する抗増殖活
性 ヒト子宮頸癌細胞系HeLaを以下の蛋白質または蛋白質
混合物の存在下に生育させた。

HuIFN−ω１（例12a参照） 100単位/ml HuIFN−γ（例12a参照） 100単位/ml ヒト腫瘍壊死因子（HuTNF）、純度98％以上、ジーン
テク・インコーポレーション（Genetech Ins.,サンフラ
ンシスコ、米国）製［ペニカ（Pennica,D）ほか：ネイ
チャー（Nature）、第312巻、724〜729（1984）参照］1
00ng/ml これらの蛋白質の２種の組合せはすべて、上述したと
同じ濃度に調整する。

いずれの実験についても２個の培養を行い、初期細胞
濃度50,000個/3cmペトリ皿、37℃で６日間インキユベー
トし、ついで細胞密度を測定した。

HuIFN−ω１およびHuTNFは、細胞の生育に弱い影響を
与えたのみであつたが、HuIFN−γは明らかな細胞変性
作用を示した。INF−γとIFN−ω１の組合せには相剰的
な細胞増殖阻止および細胞毒作作用が見がみられる。結
果は第20図に示す。

ｅ）低pHにおける安定性 HuIFN−ω１のプレパレーシヨン（例12a参照）を細胞
培養メジウム（RPM11640メジウム、10％ウシ胎仔血清含
有）で希釈し、塩酸でpHを２に調整した。４℃で24時間
インキユベートしたのち、プレパレーシヨンを水酸化ナ
トリウムを用いて中和し、その抗ウイルス活性を例12a
と同様にして滴定した。このプレパレーシヨンは中和pH
でインキユベートした対照の75％の活性を示した。した
がつて、HuIFN−ω１は低pHにおいて安定とみなすこと
ができる。

ｆ）血清学的特性 HuIFN−ω１とHuIFN−α２の血清学的性質を比較する
ため、両蛋白質のサンプル（例12a参照）を100単位/ml
に希釈し、各種抗血清またはモノクローナル抗体の溶液
等容量と混合し、37℃で90分間インキユベートした。こ
れらのサンプルの抗ウイルス活性を非処理対照の場合と
比較した。結果は第２表に示す。HuIFN−ω１の抗ウイ
ルス活性はヒトリンパ球由来IFNに対する抗体血清によ
り、かなり高濃度で中和されたが、HuIFN−α２を中和
するHuIFN−β、HuIFNーα_２に対するポリクロナール抗
血清または各種モノクローナル抗体によつては中和され
なかつた。したがつて、HuIFN−ω１は血清学的にHuIFN
−α２ならびにHuIFN−βとは無関係であるといえる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、クローンE76E9の制限酵素地図である。第２
図はクローンP9A2の制限酵素地図である。第３図はクロ
ーンP9A2のDNA配列である。第４図はクローンE76E9のDN
A配列である。第５図はプローブとしてクローンP9A2のD
NAを用いたゲノムのサザーンブロツト解析を示す図であ
る。第６図は発現クローンpRHW12の構築を示す図示であ
る。第７図は、Ｉ型インターフエロン間のアミノ酸およ
びヌクレオチドの差を示す図である。第8a図はIFN−α
Ａ遺伝子の特異なヌクレオチド位置を、第8b図はIFN−
ω１遺伝子の特異なヌクレオチド位置を、第8c図はIFN
−αＤ遺伝子の特異なヌクレオチド位置を示す図であ
る。第９図は特定サンプルからのインターフエロンサブ
タイプの合成を模式的に示した図である。第10図はイン
ターフエロンサブタイプの特異的mRNAからの検出を示す
オートラジオグラムである。第11図、第12図、第13図、
第14図はそれぞれ、IFN−ω１、IFN−偽ω２、IFN−偽
ω３およびIFN−偽ω４の遺伝子のDNA配列である。第15
図はIFN−ω遺伝子の補正リストである。第16図はシグ
ナル配列のホモロジー、第17図は成熟蛋白質配列のホモ
ロジーを示す図である。第18図は４種のDNA配列の相互
のホモロジーを示す図である。第19図はヒトバーキツト
リンパ腫細胞に対するHuIFN−ω１の抗増殖作用を示
し、濃度は、○：対照、●:1IE/ml、□:100IE/ml、▼:1
00IE/ml（＝国際単位/ml）である。第20図はヒト子宮頸
癌細胞（細胞系HeLa）に対する抗増殖作用を示す図であ
り、記号は、C:非処置対照、T:HuTNF、O:HuIFN−ω１、
G:HuIFN−γを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/66 ＡＤＹ Ｇ０１Ｎ 33/50 ＡＤＵ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 エバ ラストル‐ドウオーキン アメリカ合衆国ニユーヨーク州ニユーヨ ーク，アブト．６‐ジエイ．モーニング サイド ドライブ 90 (72)発明者 ギユンター アドルフ オーストリア国ウイーン，ヨハンナガツ セ 20―７ (72)発明者 ピーター スウエツトリイ オーストリア国ウイーン，ヒエトジンガ ー ハウプトストラーセ 40 ビ‐９ (72)発明者 クリスチヤン ピーラー オーストリア国ウイーン，シユワルズス パニエルストラーセ ９―11 (72)発明者 ノルベルト ハウエル ドイツ連邦共和国ビベラツハ １，ハン デルストラーセ 12

Claims (13)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】式 または で示される、新規なＩ型ヒトインタフェロン蛋白質のコ
   ード配列を含有する組換えDNAにおいて、そのコード配
   列は、（ａ）大腸菌HB101中プラスミドE76−E9（DSM番
   号3003でDSMに登録）もしくは（ｂ）大腸菌HB101中プラ
   スミドP9A2（DSM番号3004でDSMに登録）のPst−１切断
   サイトにおいて挿入された断片として、または同挿入断
   片の、１個または複数個のアミノ酸の付加、挿入、欠失
   または置換体である、変異体であって、同挿入断片と同
   じ機能を有する変異体として存在する組換えDNA。
2. 【請求項２】コード配列が式 （式中、ＹはヌクレオチドＡまたはＧである） を示す特許請求の範囲第１項の組換えDNA。
3. 【請求項３】式 で示されるDNA配列をさらに含有する特許請求の範囲第
   ２項の組換えDNA。
4. 【請求項４】式 （式中、ＹはヌクレオチドＡまたはＧである）で表わさ
   れるインタフェロン−ω１遺伝子である特許請求の範囲
   第１項の組換えDNA。
5. 【請求項５】式 または で示される、新規なＩ型ヒトインタフェロン蛋白質のコ
   ード配列を含有する組換えDNAにおいて、そのコード配
   列は、（ａ）大腸菌HB101中プラスミドE76−E9（DSM番
   号3003でDSMに登録）もしくは（ｂ）大腸菌HB101中プラ
   スミドP9A2（DSM番号3004でDSMに登録）のPst−１切断
   サイトにおいて挿入された断片として、または同挿入断
   片の、１個または複数個のアミノ酸の付加、挿入、欠失
   または置換体である、変異体であって、同挿入断片と同
   じ機能を有する変異体として存在する組換え DNAを含有する細菌中で複製可能なビークル。
6. 【請求項６】発現のために必要なレプリコンおよびコン
   トロール配列をさらに含有する特許請求の範囲第５項記
   載のビークル。
7. 【請求項７】発現のために必要なプラスミドpER103（DS
   M2773）のレプリコンおよびコントロール配列を含有す
   る特許請求の範囲第６項記載のビークル。
8. 【請求項８】ビークルがプラスミドpBR322の誘導体であ
   って、このプラスミドに固有の短い方のEcoRI/BamHI断
   片の代りにプラスミドpBR322は式 で示されるDNA配列を含有する特許請求の範囲第７項の
   ビークル。
9. 【請求項９】インタフェロン−ω１遺伝子が式 で示されるDNA配列を含有する発現プラスミドpRHW12で
   ある特許請求の範囲第８項のビークル。
10. 【請求項１０】インタフェロン−ω１遺伝子が式 で示されるDNA配列を含有する発現プラスミドpRHW11で
    ある特許請求の範囲第８項のビークル。
11. 【請求項１１】式 または で示される、新規なＩ型ヒトインタフェロン蛋白質のコ
    ード配列を含有する組換えDNAにおいて、そのコード配
    列は、（ａ）大腸菌HB101中プラスミドE76−E9（DSM番
    号3003でDSMに登録）もしくは（ｂ）大腸菌HB101中プラ
    スミドP9A2（DSM番号3004でDSMに登録）のPst−１切断
    サイトにおいて挿入された断片として、または同挿入断
    片の、１個または複数個のアミノ酸の付加、挿入、欠失
    または置換体である、変異体であって、同挿入断片と同
    じ機能を有する変異体として存在する組換えDNAを含有
    する細菌中で複製可能なビークル中の遺伝情報を含有す
    る形質転換細菌。
12. 【請求項１２】プラスミドpRHW11またはpRHW12により形
    質転換された大腸菌（E.coli）である、特許請求の範囲
    第11項に記載の形質転換細菌。
13. 【請求項１３】DSM番号3003の大腸菌またはDSM番号3004
    の大腸菌である特許請求の範囲第11項に記載の形質転換
    細菌。