JPH0156757B2 - - Google Patents
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- JPH0156757B2 JPH0156757B2 JP59019524A JP1952484A JPH0156757B2 JP H0156757 B2 JPH0156757 B2 JP H0156757B2 JP 59019524 A JP59019524 A JP 59019524A JP 1952484 A JP1952484 A JP 1952484A JP H0156757 B2 JPH0156757 B2 JP H0156757B2
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- hil2
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、ひとインターロイキン２様ポリペプ
チドを製造するためのDNA配列、組み換えDNA
分子および製造方法に関するものである。さらに
詳細には、本発明はDNA配列および適当な宿主
生物におけるその発現に関するものである。ここ
に記載する組み換えDNA分子は、ひとインター
ロイキン２の免疫学的もしくは生物学的活性を有
するポリペプチドを暗号化するDNA配列を特徴
とする。以下の開示から明らかとなるように、本
発明のDNA配列、組み換えDNA分子および方法
は、各種の医薬およびその他の有益な産業用途に
使用し得るポリペプチドの生産に使用することが
できる。 （従来の技術） インターロイキン２（「IL2」）はリンホカイン
である。リンホカインは、マイトジエンによる刺
激に際しリンパ球で合成される生産物である。こ
れらは可溶性の免疫反応調節因子である。多数の
リンホカインは、その医薬用途および実験室用途
に重要である。例えば、免疫インターフエロン
（IFN−γ）は抗ウイルス、抗癌および免疫調節
活性を有するリンホカインである〔例えば、アー
ル・デボス等、ヌクレイツク・アシツド・リサー
チ、第10巻、第2487−501頁（1982）〕。 インターロイキン２は、重要かつ有用な生物学
的性質を有するリンホカインである〔ギリス等、
イムノロジカル・レビユー、第63巻、第166−209
頁（1982）〕。例えば、IL2は、(a)in vitro（試験管
内）において抗原特異性の効果Ｔ−細胞の長期増
殖を刺激し、(b)胸腺細胞の有糸分裂を促進し、か
つ(c)細胞障害性Ｔ−細胞の反応性およびヌードマ
ウス脾細胞の培養物におけるプラーク形成反応を
誘発する〔ギリスおよびワトソン、ジヤーナル・
エキスペリメンタル・メデイスン、第152巻、第
1709〜19頁（1980）；ジエー・ジエー・フアラー
等、イムノロジカル・レビユー、第63巻、第129
〜65頁（1982）〕。 生物学的性質の結果、インターロイキン２を使
用して、免疫系が阻害された癌患者におけるひと
白血球抗原の制限された腫瘍特異性の細胞障害性
細胞の補給を、例えば胸腺刺激によつて刺激する
ことができる。従つて、IL2による治療は、各種
の細菌およびその他の感染に対しこれらの患者の
耐性を増大させる。しばしば、これらの感染は癌
治療、特に照射および薬剤治療を複雑化させる。 さらに、免疫系を刺激するIL2の能力は、免疫
系の機能障害に関連する病気、例えばエイズ
（AIDS）、狼瘡、多発性硬化症および関節リユー
マチ症の治療に有用である。公表された臨床学的
研究は、これらの病気とＴ−リンパ球における異
常性または異常抗体の生成との間の関係を示して
いる。例えば、in vitroの研究が示唆するところ
では、免疫系の少なくとも幾つかの機能は、IL2
の投与によつてエイズ患者を回復させることがで
きる。さらに、in vitroの研究が示すところで
は、低レベルIL2は、免疫のこれら病気の幾つか
に関連する異常抗体の生成に関係する。 さらに、公表された研究によれば、IL2は広範
囲の癌の治療に有用であると信じられる。さら
に、固体腫瘍、例えば肺癌、結腸−大腸癌および
乳癌を治療するための補助治療として特に有用で
ある。また、IL2は単独でまたは補助治療剤と共
に陰部疱疹およびその他のウイルス病を治療する
のにも有用である。 さらに、インターフエロンの抗癌活性がIL−
２により高められ、かつIL2を必要とさえするこ
とが示されている。何故なら、IL2はインターフ
エロンの抗癌活性における主原因であると考えら
れる「ナチユラルキラー」細胞の全活性を刺激す
るからである〔シー・エス・ヘニー、ネイチヤー
誌、第291巻、第335〜38頁（1981）〕。また、IL2
は幾種かの免疫病、例えば多発性硬化症の特徴で
あるサプレツサー細胞の欠乏を防止するにも有用
である。 最後に、IL2は診断および治療目的でＴ細胞の
培養物の確立および長期増殖についても使用され
る。例えば、同型細胞障害性Ｔ細胞の選択を可能
にするため、現在では癌細胞が使用されている。
これらのＴ細胞をin vitroで培養し、患者に注射
して腫瘍を後退させる。 生化学的レベルにおいて、IL2は約15000ダル
トンの分子量を有しかつグリコシル化されている
と信じられる。グリコシル化されていると仮定す
れば、これは100乃至130個のアミノ酸を有するは
ずである。IL2はカラム上で若干異質的に挙動す
る。SDSゲルにおいて、恐らくサブユニツトであ
る２つのバンド（12000および13000ダルトン）が
観察される〔ジエー・ダブリユー・マイケルおよ
びアール・シー・ガロ、プロシーデイング・ナシ
ヨナル・アカデミー・サイエンス、USA、第77
巻、第6134−38頁、（1980）〕。さらに、IL2は１
種より多い化合物である。これは白血球インター
フエロン（IFN−α）と同様に、種々なレベルの
免疫治療活性を示す１群の生産物である。また、
IL2は多形質でもある。例えば、特定個体の細胞
はより一般的なIL2分類内のIL2種類を生産する
ことができ、これら種類はそれが属する分類の原
型と生理学的に類似しているが、構造的に若干異
なつている。 リンホカインの１種であるIFN−γは、遺伝子
工学の応用によつて多量に生産されている〔アー
ル・デボス等、上記〕。IL2はこの方法では生産
されていない。 しかしながら、IL2の多くの重要な免疫治療活
性のため、並びに診断および治療目的に対するＴ
細胞の確立および長期増殖におけるその必要用途
のため、IL2の大規模生産に関し種々の方法およ
び手段が研究されているが、まだ成功を収めたも
のはない。 （発明の構成） 本発明は、IL2を暗号化するDNA配列を位置
決定しかつ同定し、これら配列によつて適当な宿
主を形質転換させ、それによりひとインターロイ
キン２の免疫学的もしくは生物学的活性を示すポ
リペプチドの生産に使用するDNA配列、組み換
えDNA分子およびその使用方法を提供しており、
そのことにより、上記問題を解決する。 本発明のDNA配列は、次式で示される：
ATGGCGCCTACTTCAAGTTCTACAAAGA
ＡＡＡＣＡＣＡＧＣＴＡＣＡＡＣＴＧＧＡＧＣＡＴＴＴ
ＡＣＴ
ＧＣＴＧＧＡＴＴＴＡＣＡＧＡＴＧＡＴＴＴＴＧＡＡＴ
ＧＧ
ＡＡＴＴＡＡＴＡＡＴＴＡＣＡＡＧＡＡＴＣＣＣＡＡＡ
ＣＴ
ＣＡＣＣＡＧＧＡＴＧＣＴＣＡＣＡＴＴＴＡＡＧＴＴＴ
ＴＡＣ
ＡＴＧＣＣＣＡＡＧＡＡＧＧＣＣＡＣＡＧＡＡＣＴＧＡ
ＡＡＣ
ＡＴＣＴＴＣＡＧＴＧＴＣＴＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＴ
ＣＡＡ
ＡＣＣＴＣＴＧＧＡＧＧＡＡＧＴＧＣＴＡＡＡＴＴＴＡ
ＧＣＴ
ＣＡＡＡＧＣＡＡＡＡＡＣＴＴＴＣＡＣＴＴＡＡＧＡＣ
ＣＣＡ
ＧＧＧＡＣＴＴＡＡＴＣＡＧＣＡＡＴＡＴＣＡＡＣＧＴ
ＡＡＴ
ＡＧＴＴＣＴＧＧＡＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＴＣＴＧＡＡ
ＡＣＡ
ＡＣＡＴＴＣＡＴＧＴＧＴＧＡＡＴＡＴＧＣＴＧＡＴＧ
ＡＧ
ＡＣＡＧＣＡＡＣＣＡＴＴＧＴＡＧＡＡＴＴＴＣＴＧＡ
ＡＣＡ
ＧＡＴＧＧＡＴＴＡＣＣＴＴＴＴＧＴＣＡＡＡＧＣＡＴ
ＣＡＴ
ＣＴＣＡＡＣＡＣＴＧＡＣＴ。 本発明の発現ベクターはTrpプロモーターの下
流に上記DNA配列が発現可能に結合している。 本発明の形質転換大腸菌は、上記発現ベクター
を含有する。 本発明によれば、免疫治療剤および方法並びに
Ｔ細胞の確立および長期増殖に使用するための、
IL2の免疫学的もしくは生物学的活性を示すポリ
ペプチドを得ることができる。本発明は、これら
ポリペプチドを従来不可能であつた量および方法
で製造し得る。 以下の開示から明らかなように、本発明の
DNA配列および組み換えDNA分子は、IL2の免
疫学的もしくは生物学的活性を示すポリペプチド
を、適当な宿主中で発現させることにより産生す
ることができる。さらに、適当な宿主におけるこ
れらDNA配列および組み換え、DNA分子の複組
は、これらポリペプチドを暗号化する遺伝子を多
量に製造することを可能にする。これらポリペプ
チドおよび遺伝子の分子構造および性質は、容易
に決定することができる。ポリペプチドおよび遺
伝子は、宿主中で生産されたままで或いは適当に
誘導または修飾した後に、これら生産物自身の生
成を検出しかつ改善するための組成物および方
法、免疫治療剤および方法に使用するための組成
物および方法、並びにＴ細胞の確立および長期増
殖ための組成物および方法に使用するのに有用で
ある。 上記から判るように、本発明の基本点は、
DNA組み換え技術を用いてIL2の免疫学的もし
くは生物学的活性を示すポリペプチドを暗号化す
ることを特徴とするDNA配列を提供することで
あり、あるいはDNA配列の集団からこの種の配
列を少なくとも選択し得ることであり、これら
DNA配列はDNA挿入物hIL2−０、hIL2−１、
前記DNA挿入物のいずれかにハイブリツト形成
しかつIL2を暗号化するDNA配列、および前記
DNA配列のいずれかにより暗号化されたポリペ
プチドを暗号化するDNA配列よりなる群から選
択される。本発明の配列はさらに、宿主において
IL2およびIL2様ポリペプチドの生産を可能にす
ることを特徴とする。 本発明を一層よく理解し得るよう以下詳細に説
明する。 以下の説明において次の用語を使用する： ヌクレオチド：糖成分（ペントース）とリン酸と
含窒素複素環塩基とよりなるDNAもしくは
RNAのモノマー単位。この塩基はグリコシド
炭素（ペントースの1′炭素）を介して糖成分に
結合される。塩基と糖との組合せをヌクレオシ
ドと呼ぶ。各ヌクレオチドは塩基により特徴づ
けられる。４種のDNA塩基はアデニン
（「Ａ」）、グアニン（「Ｇ」）、シトシン（「Ｃ」）
、
およびチミン（「Ｔ」）である。４種のRNA塩
基は、Ａ、Ｇ、Ｃおよびウラシル（「Ｕ」）であ
る。 DNA配列：リン酸ペントースと3′炭素と5′炭素
との間でホスホジエステル結合により互いに結
合されたヌクレオチドの線状列。 コドン：mRNAを介してアミノ酸、翻訳開始信
号または翻訳停止信号を暗号化する３個のヌク
レオチド（トリプレツト）のDNA配列。例え
ば、ヌクレオチドトリプレツトTTA、TTG、
CTT、CTC、CTAおよびCTGはアミノ酸ロ
イシン（「Leu」）を暗号化し、TAG、TAAお
よびTGAは翻訳停止信号であり、また、ATG
は翻訳開始信号である。 読枠：mRNAをアミノ酸配列まで翻訳する際の
コドンのグループ化。翻訳の際、適正な読枠を
維持しなければならない。例えば、配列
GCTGGTTGTAAGは３つの読枠もしくは相
で翻訳することができる。これら相のそれぞれ
は次の異なるアミノ酸配列を与える：GCT GGT TGT AAG−−Ala−Gly−
Cys−Lys Ｇ CTG GTT GTA AG−−Leu−Val
−Val GC TGG TTG TAA Ｇ−−Trp−Leu
−（停止） ポリペプチド：隣接アミノ酸のα−アミノ基とカ
ルボキシ基との間でペプチド結合により互いに
接続されたアミノ酸の線状列。 ゲノム：細胞またはウイルスの全DNA。これは
特に物質のポリペプチドを暗号化する構造遺伝
子、ならびにオペレーター、プロモーターおよ
びリボソームの結合および相互作用配列を包含
し、例えばシヤイン−ダルガルノ配列のような
配列をも含む。 遺伝子：鋳型またはメツセンジヤーRNA
（「mRNA」）を介して特定のポリペプチドに固
有のアミノ酸の配列を暗号化するDNA配列。 転写：遺伝子からmRNAを生産する過程。 翻訳：mRNAからポリペプチドを生産する過程。 発現：遺伝子もしくはDNA配列によりポリペプ
チドを生産するために受ける過程。これは転写
と翻訳との組合せである。 プラスミド：プラスミドが宿主細胞で複製される
ような完全「レプリコン」からなる非染色体性
二本鎖DNA配列。プラスミドを単細胞生物内
に挿入すると、この生物の特性はプラスミドの
DNAの結果として変化し、或いは形質転換す
ることができる。例えば、テトラサイクリン耐
性（TetR）に対する遺伝子を有するプラスミ
ドは、あらかじめテトラサイクリンに対し感受
性の細胞をテトラサイクリンに対し耐性の細胞
まで形質転換することができる。プラスミドに
より形質転換された細胞を「形質転換体」と呼
ぶ。 フアージまたはバクテリオフアージ：細菌性ウイ
ルスであつて、その多くは蛋白質エンベロープ
またはコート（「カプシド」）にカプセル化され
たDNA配列よりなつている。 クローン化ベヒクル：宿主細胞において複製しう
るプラスミド、フアージDNAまたはその他の
DNA配列であつて、これはDNAの本質的な生
物学的機能、たとえば複製、コート蛋白質の生
成の喪失を伴わずに、或いはプロモーターもし
くは結合部位の喪失を伴わずに決定可能に前詰
記DNA配列を切断することができる１個もし
くは少数のエンドヌクレアーゼ認識部位により
特徴づけられ、かつ形質転換細胞の同定に使用
するのに適する標識、たとえばテトラサイクリ
ン耐性またはアンピシリン耐性を有する。クロ
ーン化ベヒクルはしばしばベクターと呼ばれ
る。 クローン化：１種の生物もしくはDNA配列から
誘導される生物またはDNA配列の集落を無性
繁殖によつて得る過程。 組み換えDNA分子またはハイブリツドDNA：生
細胞の外部で端部結合された異なるゲノム由来
のDNA断片よりなり、かつ有る種の宿主細胞
に感染してそこに維持される能力を有する分
子。 発現制御配列：DNA配列もしくは遺伝子の発現
を、これら配列に作用可能に結合された際、制
御かつ調節するヌクレオチドの配列。これらは
1ac系、trp系、フアージλの主オペレーターお
よびプロモーター領域、fdコート蛋白質の制御
領域、ならびに原核もしくは真核細胞およびそ
のウイルスの遺伝子の発現を制御することが知
られたその他の配列またはそれらの組合せを包
含する。 IL2（様）：IL2の免疫学的もしくは生物学的活性
を示すポリペプチド。このポリペプチドは、原
IL2のアミノ酸の他にさらにアミノ酸を含み、
あるいは原IL2のアミノ酸の全部を含まないこ
ともできる。 インターロイキン２の生物学的分析 (a) 原理 インターロイキン２（IL2）またはＴ−細胞
増殖因子は可溶性化合物であつて、マイトジエ
ンまたは抗原刺激されたＴ細胞のクローン化誘
導体の長期培養を可能にする〔デイー・エー・
モルガン等、サイエンス誌、第193巻、第1007
−08頁（1976）〕。これら細胞の成長および増殖
は、投与量に応じて（dose−dependent）培地
中のIL2の存在に依存する。従つて、増殖量の
測定（すなわち、トリチウム標識チミジンの取
り込み量による）は、培地中のIL2の濃度を示
す。 (b) 目的細胞 「リンホプレプ」（フアルマシア社）により
ひとの末梢血液から単核細胞細を単離し、これ
ら細胞（中間層）を２回洗浄し、そしてこれら
を５×105細胞／mlの濃度にてRPMI1640培地
で培養し、この培地には１％Ｌ−グルタミンと
抗生物質（下記参照）と10％ウシ殆児血清とを
補充した。次いで、これら細胞10μｇ／mlまで
のフイトヘマグルチニン（PHA）（ウエルカム
社）により37℃で20時間刺激し、細胞を集めて
激しく洗浄し、そしてこれらをPHAを含まな
い培地中でさらに３日間培養した。４日目に、
これら細胞に対し、部分精製したひとIL2調製
物（PHA刺激した脾細胞の培地から得られた
50〜80％の（NH4）2SO4沈澱物を初期容量の1/
２０に再溶解し、かつリン酸緩衝生理食塩水に対
し徹底的に透析したもの〔モルガン等、上記〕）
の５％を補給した。次いで、これら細胞を３〜
４日毎に１：２の割合で分割した。 培養物を約２〜３週間置いた後、これらから
の生存細胞を洗浄し、かつこれら細胞を40％ウ
シ胎児血清と10％ジメチルスルホキシドとを含
有するIL2を含まない培地中で２×107細胞／ml
の最終濃度まで培養した。その直後に、細胞を
１mlのガラス瓶中で、速度調節フリーザー（ク
リオソン社）を用いて１℃／minの冷却速度で
−45℃まで凍結させ、次いで急速に−80℃まで
凍結させた。これら目的の細胞を液体窒素中で
保存した〔グラマツキ等、ジヤーナル・イムノ
ロジカル・メソツド、第53巻、第209〜20頁
（1982）〕〕。これら細胞を使用する直前に、これ
らを37℃にて迅速に解凍し、これらを培地と段
階的に混合し、そして洗浄した。調製した細胞
の生存度をチロール青排除によつて検査した。 (C) 微量分析 ギリス等、ジヤーナル・イムノロジー、第
120巻、第2027〜32頁（1978）により記載され
たのと実質的に同様にIL2微量分析を行つた。
先ず、100μのIL2試料を96穴のマイクロタイ
タープレート（フアルコン社）中へ段階的に
１：２希釈した（RPM1640、10％ウシ胎児血
清、１％Ｌ−グルタミンおよび抗生物質、下記
参照）。次いで、目的細胞を２×105細胞／mlの
濃度で懸濁し、100μの細胞を穴へ約２×104
細胞／穴の最終濃度まで加えた。これらマイク
ロタイタープレートを空気中５％CO2の加温雰
囲気において37℃で24時間培養し、0.5μCiの
3H−標識したチミジン（アメルシヤム社、20
〜30Ci／ｍmole）を各マイクロタイタープレ
ートの穴へ加え、そして細胞をさらに５時間培
養した。次いで、培養物をガラスフイルターの
上へ回収し（セル−ハーベスター、MASH
型を用いる）、かつ液体シンチレーシヨンカウ
ンターによつて 3H−チミジン取込み量を測定
した。 (d) 定量 ひとIL2標準試料を用いて、各試験試料の相
対活性を決定した。この標準（任意に選択した
ひとIL2含有の上澄液）は100単位／mlを含有
するものと規定した。これは 3H−チミジン吸
収により測定して、１：４〜１：８の希釈率ま
で最大の増殖を誘発する。一般に、標準曲線の
直線的下降部分の中央において、この試料の最
大活性の30％が観察された。 さらに、一連の希釈物において各試料を試験
し、それらの力価をグラフ分析によつて計算し
た。次いで、各試料の活性を式〔サタドラー
等、ジヤーナル・イムノロジー、第128巻、第
1620〜24頁（1982）〕： 試験試料の標準に対する最大cpmの30％
における逆タイター／標準の最大cpmの30％における逆
タイター＝単位×100 を用いて単位に変換した。 ひとインターロイキン2mRNA（hil−mRNA）を
含有するポリ(A)RNAの調製 本発明の方法に使用したRNAは、マイトジエ
ン刺激したひとの脾細胞から抽出した。提供され
た脾細胞は、単一供与体から多量の免疫系細胞を
供給するという利点を有し、さらにひと未梢血液
リンパ球により生成される量よりも多い量でイン
ターロイキン２を生成するという利点を有する
〔エー・モレツタ等、クリニカル・エキスペリメ
ンタル・イムノロジー、第44巻、第262〜269頁
（1981）〕。 (a) ひと脾細胞の単離 外科部門から得られたひと脾臓を無菌プラス
チツク袋中に入れて実験室まで選び、実験室内
において無菌ガラス皿に移した。無菌解剖鋏に
よつて脾臓の外膜を除去し、５cm3の脾臓組織を
切除した。その組織をプラスチツクペトリ皿
（直径15cm）に入れ、さらに小さい片（0.5cm3ま
で）に切断した。約10mlのRPMI1640培地（ギ
ブコ社）（２ｇ／のNaHCO3と20ｍＭの
HEPESとを補充したもの）を添加した後、２
mlプラスチツク注射器の吸子（plunger）の端
部で組織断片を静かに砕いて細胞の大部分をほ
ぐした。次いで、この懸濁物を約50mlの
RPMI11640培地で希釈し、そして得られた懸
濁物を充分に混合した。次いで、組織および細
胞懸濁物を無菌金属篩（８×0.3mm／cm）に移
して、液体を他のプラスチツクペトリ皿に排液
した。次いで、この篩上の組織を元のプラスチ
ツク皿に戻し、そして前記と同様に砕きかつ濾
過した。最後に、全細胞懸濁物を0.5のプラ
スチツク管へ注ぎ入れた。この手順を全脾臓が
調整されるまで新規な脾臓片につき反復した。 プラスチツク管の底部に凝集して濃厚沈澱物
を形成した死細胞の大部分を、再び金属篩によ
る懸濁物の濾過によつて除去した。次いで、細
胞懸濁物をシリコーン処理した100mlの無菌円
錐ガラス遠沈管に移し、この管の底部または懸
濁物の表面に存在する凝集物を除去した。 次いで、室温にて900×ｇで10分間遠心分離
することにより細胞を集め、これら細胞を10倍
容量の冷トリス−NH4Cl（0.83％NH419部とト
リス−HCl1部との混合物、20.6ｇ／、PH7.2）
溶液に静かに懸濁させて赤血球を溶血させた。
４℃にて10分間後、底部に凝集した全ての死細
胞を除去し、白色細胞を集め、そして
RPMI1640培地で少なくとも２回洗浄した。次
いで、細胞を完全培地（0.03％Ｌ−グルタミン
と100U／mlペニシリンと100μｇ／mlのストレ
プトマイシンと25μｇ／mlのネオマイシンと５
×10-5Mのβ−メルカプトエタノールと10％ウ
シ胎児血清とを補充したRPMI1640培地）へ移
して２〜４×106細胞／mlの濃度にした。 (b) マイトジエンによるひと脾細胞の刺激 上記細胞懸濁物（５、１×1010細胞）を遠
心分離フラスコに移し、フイトヘマグルチニン
（「PHA」）（ウエルカム社）を10μｇ／mlの濃度
まで加え、或いは0.08％PHA−Ｐ（デイフコ
社）および10nｇ／mlの12−０テトラデカノイ
ルホルボール−13−アセテート（「TPA」）（ピ
ー・エル・バイオケミカルス社）を加えた。培
養物上方の雰囲気を５％CO2の気体混合物で飽
和した後、懸濁物を37℃で20時間ゆつくり撹拌
した。 次いで、上記と同様にIL2依存性のひと末梢
血液リンパ球による 3H標識チミジンの吸収を
測定して、IL2活性につき懸濁物を分析した。 (c) ポリA+RNAの単離および翻訳 PHA／TPA誘発された脾細胞を遠心分離に
より集め、これらを冷PBSで洗浄した。これ
らの誘発脾細胞から全RNAを単離するため、
これら細胞を直ちにチオシアン酸グアニジウム
の溶液で溶解させた〔ジエー・エム・チヤーグ
ウイン等、「リボヌクレアーゼの豊富な原料か
ら生物学上活性なリボ核酸の単離」、バイオケ
ミストリー、第18巻、第5294−99頁（1979）〕。
脾臓１個当り平均して30mgの全RNAを得た。
次いで、このRNAをグアニジウム塩酸塩溶液
からの沈澱によりかつオリゴ（dT）セルロー
ス上でのクロマトグラフイーによつて精製した
〔ジエー・エム・チヤーグウイン等、上記〕。こ
の段階で、約１mgのRNA（その内60％以上が
rRNAである）が残留した。 得られたポリA+RNAを滅菌水に溶解させ、
混合物を68℃にて１分間加熱し、そしてこれを
10ｍＭトリス−HCl（PH7.5）と１ｍＭ EDTA
とにおける５〜20％蔗糖密度勾配において分画
し、その際密度勾配当り１〜２mgのRNAとベ
ツクマンSW41型Tiローターでの４℃で
40000rpmの16時間にわたる遠心分離とを用い
た。25個のフラクシヨン（それぞれ0.4ml）を
ISCO密度分画装置に集め、光学密度（254nｍ）
を連続的に測定した。 RNAを通過させた約300μｇのオリゴ（dT）
セルロースの並行密度勾配における遠心分離の
後に、5Sおよび18SのrRNAピーク
（28SrRNAはチユーブの底に存在した）の高
さを測定することにより単離RNAの品質を分
析した。 各フラクシヨン中のRNAを−20℃にて少な
くとも２時間沈澱させ、遠心分離（10000rpm、
30分、−20℃、HB4ソルバール型モーター）に
よつて集め、70％エタノールで洗浄した。この
RNAを乾燥させた後、これを25〜50μの滅
菌水中に溶解させた。 ポリA+RNA蔗糖密度勾配フラクシヨンのそ
れぞれを小麦胚芽抽出物（全容量10μ）にお
いて 35S−メチオニンの存在下で翻訳し〔ビ
ー・ロバーツおよびビー・エム・パターソン、
「市販の小麦胚芽からの無細胞系における
TMV RNAおよびうさぎグロビン5S RNAの
効率的翻訳」、プロシーデイング・ナシヨナ
ル・アカデミー・サイエンス・USA、第70巻、
第2330〜34頁（1973）〕、そして合成された蛋白
質を12.5％のSDS−ポリアクリルアミドゲル上
で分析した〔ユー・ケー・ラメリ、「バクテリ
オフアージT4の頭部を組込む際の構造蛋白質
の開裂」、ネイチヤー誌、第227巻、第680〜85
頁（1970）〕。この方式における大型ポリペプチ
ドの合成は、ここで調製されたRNAフラクシ
ヨンがin vitroでの翻訳の抑制因子を含まない
RNAを含有したことを示した。蔗断密度勾配
7S〜18Sで沈降したポリA+RNAフラクシヨン
を分析して、このmRNAにより暗号化された
IL2の活性を決定した。この分析のため、50μ
のポリA+RNA（１mg／ml）をそれぞれ15〜
20個のアフリカツメガエル（Xenopus laevis）
の卵細胞で微量注入し、この卵細胞をHEPES
緩衝された改変バース溶液（MBS−Ｈ）中で
３日間培養した。この緩衝溶液は0.1％のポリ
エチレングリコールと0.4％のアプロチニン原
源（シグマ社）とを含有した。 次いで、培地を抜き取り、分泌された翻訳生
成物をそのIL2活性につき上記のように分析し
た。第１図は典型的な分析実験の結果を示すグ
ラフである。これらの結果が示すように、ひと
IL2活性を暗号化するmRNA種類は、約10〜
11Sの蔗糖密度勾配で沈降した。 さらに、マイトジエン誘発脾細胞から単離し
た蔗糖密度勾配分画ポリA+RNAの微量注入の
後に、アフリカツメガエルの卵細胞によるひと
IL2の分泌の動力学を検査した。ここで、卵細
胞培養培地におけるIL2の蓄積は少なくとも72
時間持続することが観察された。 この点において認識すべきことは、蔗糖密度勾
配から得られるポリA+RNA生成物でさえ極めて
多数の異なるmRNAを含有することである。
hIL2に対し特異的なmRNAを除き、他のmRNA
は望ましくない汚染物である。残念ながら、これ
らの汚染物RNAは、本発明のクローン化工程の
残りの工程においてずつとhIL2mRNAと同様に
挙動する。したがつて、ポリ(A)RNAにおけるそ
の存在は、IL2以外のポリペプチドを暗号化する
遺伝子を含有する多数の望ましくない細菌クロー
ンを最終的に生成する。この汚染は、所望のIL2
ハイブリツドクローンを単離する際に複雑なスク
リーニング問題を提起する。IL2の場合、スクリ
ーニング問題は、所望クローンの同定に対する。
スクリーニングプローブとして役立つような充分
精製されたIL2mRNAもしくはDNAまたはその
部分の試料が無いためさらに悪化する。したがつ
て、IL2クローンのスクリーニング工程は極めて
時間のかかる困難なものである。さらに、極めて
少割合のIL2クローンしか生物学的もしくは免疫
学的な活性型でIL2を発現しないと予想されるの
で、活性クローンの単離は「藁の中から針を探
す」ようなスクリーニング工程となる。 有利なことに、本発明は組み換えDNA技術の
使用してIL2mRNAもしくはcDNAまたはその一
部の精製プローブを生成させることができる。次
いで、その精製されたmRNAもしくはcDNAを
使用して、極めて多数の細菌クローンを迅速にス
クリーニングし、かつそれによりIL2を活性型で
発現するクローンを単離することができる。 hIL2cDNAを含有する二本鎖 cDNAの合成 hIL2mRNAの豊富なポリ(A)RNAを鋳型として
使用して相補的DNA（「cDNA」）を調製した。こ
れはバクテリオフアージMS2RNAのDNAコピ
ーを含有するプラスミドの作成につきデボス等に
より実質的に記載されている〔「バクテリオフア
ージMS2RNAのほぼ完全寸法のDNAコピーを
含有するプラスミドの作成および特性化」、ジヤ
ーナル・モレキユラー、バイオロジー、第128巻、
第595〜619頁（1979）〕。 30μｇのポリA+RNA（蔗糖密度勾配からの３つ
のフラクシヨン）を50μの50ｍＭトリスHC1
（PH8.3）と30ｍＭのβ−メルカプトエタノールと
50ｍＭのKClと10ｍＭのMgCl2とそれぞれ0.5ｍ
Ｍの４つのdNTPと10μｇのpT12-18と100μCiのα
−32P dATPと100μCiのα−32P dCTP（それぞ
れ2500Ci／モル）と４ｍＭのNa2P2O7と100単位
のAMV逆転写酵素との混合物において43℃で30
分間培養した。EDTAにより反応を停止させか
つフエノール抽出した後、この混合物をセフアデ
ツクス−G75カラムにかけた。排除（ボイド）フ
ラクシヨンにおける核酸をエタノールで−20℃に
て１晩沈澱させ、そしてこれらを遠心分離により
集めた。ペレツトを70％エタノールで洗浄し、乾
燥させ、40μの水に溶解させた。 上記で合成したcDNA試料は、実際には濃厚化
したポリA+mRNAに存在する異なるmRNAから
生じた複雑なcDNAの混合物である。さらに、
AMV逆転写酵素による早期停止のため、cDNA
の多くはポリA+RNAにおける各種mRNAの不
完全コピーである。 CDNAを二本鎖にする前に、上記水混合物を
100℃にて30秒間加熱することによりこれを相補
的鋳型mRNAに対する結合から切り離し、次い
で直ちに０℃で冷却した。3μｇの膵臓リボヌク
レアーゼと３単位のT1−リボヌクレアーゼとを
加え、そして混合物を37℃で30分間培養した。 Ｋ−ホスフエート（PH6.9）（最終濃度100ｍＭ）
とジチオスレイトール（４ｍＭ）とMgCl2（10ｍ
Ｍ）と4dNTP（それぞれ250μM）と50μCiα−
32PdATPと50μCiα−32PdCTP（それぞれ
2500Ci／モル）との混合物を加えて混合物を
100μに調整し、イー・コリDNAポリメラーゼ
Ｉ（ビオラブ社、100単位）を加えかつ得られた混
合物を15℃にて３時間培養することにより、
cDNA鎖を二本鎖にした。反応をEDTAにより
停止させ、混合物をフエノール処理し、セフアデ
ツクス−G75カラムに通し、そして排除（ボイ
ド）フラクシヨンを前記と同様にエタノールによ
つて−20℃で一晩沈澱させた。 二本鎖cDNA構造に残存する一本鎖のヘアピン
ループを開裂させるため、遠心分離によりDNA
を除去し、ペレツトを乾燥し、そしてこれを再び
水に溶解し、混合物を0.2MのNaClと50ｍＭの
NaOAc（PH4.5）と１ｍＭのZnCl2と10単位のSIヌ
クレアーゼ（シグマ社）との100ml中で37℃にて
30分間培養した。混合物をフエノール／CHCl3／
イソアミルアルコールで抽出することにより反応
を停止させ、200μの2MのNH4OAcと10μｇの
イー・コリtRNAと１mlのエタノールとを加える
ことにより、−20℃で２時間および−70℃で10分
沈澱させた。遠心分離によりペレツトを取り出
し、そしてこれを乾燥した。二本鎖のcDNAのの
この混合物は、これを調製するための鋳型として
使用したポリA+RNAの不均一性の結果、並び
に、AMV逆転写結果によるcDNA転写の早期停
止により不均一となる。 上記の不均一性の影響を少なくするため、二本
鎖cDNA混合物のサイズを選別した。この際ペレ
ツトを10ｍＭトリス−HCl（PH7.5）と１ｍＭ
EDTAとの20μに溶解し、これを55℃にて５分
間培養し、ブロモフエノールブルー−キシレンシ
アノールFFと蔗糖とを加え、DNAを４％ポリア
クリルアミドゲル（トリス−硼酸塩、20cm×40×
0.3cm、200V−20ｍＡ）で一晩電気泳動した。こ
の際、フアージφX174のDNAの5′−32P−標識
Hae断片を並行路にマーカーとして電気泳動さ
せた。ゲルを放射線分析した後、このDNAをゲ
ル上の位置にしたがつてフラクシヨンM1（1000−
1300bp）、M2（750−1000bp）、M3（600−750bp）
およびM4（500−600bp）に分離した。各フラク
シヨンに対応するゲルスライスを切除し、これら
を２mlの0.5MのNH4OAcと10ｍＭのMgCl2と0.1
％SDSとで一晩溶出させ、そしてDNAを２容量
のエタノールで沈澱させた（−20℃）。遠心分離
した後、各ペレツトを100μの水に溶解し、そ
してこれを900μの10ｍＭ燐酸ナトリウム（PH
7.4）と100μ（充填容量）のヒドロキシアパタ
イト（バイオラツド社）との存在下で37℃にて10
分間培養した。次いでヒドロキシアパタイトをセ
フアデツクス−G75カラムに充填し、そしてこの
カラムを２ｍＭのリン酸ナトリウム（PH7.4）で
充分洗浄した後、DNAを0.45Mの燐酸ナトリウ
ム（PH7.4）で溶出させ、そして1/10容量の2Mの
NaOAc（PH５）と２容量のエタノールとで沈澱
させた。 ここでも認識されるように、cDNAフラクシヨ
ンのそれぞれには多数のcDNAが存在し、その極
く僅かのみがhIL2関連のcDNAである。 二本鎖のcDNAのクローン化 本発明により調製された二本鎖cDNAは、クロ
ーン化または発現させる際に、多くの種類の宿
主／クローン化ベヒクルの組み合わせを使用する
ことができる。例えば、有用なクローン化または
発現ベヒクルは染色体、非染色体および合成
DNA配列の断片、例えばSV40の各種の公知誘導
体および公知の細菌プラスミド、例えばcol E1、
pCR1、pBR322、pMB9およびその誘導体を含む
イー・コリからのプラスミド、広範囲の宿主プラ
スミド、例えばRP4、フアージDNA、例えばフ
アージλの多くの誘導体、例えばNM989および
その他のDNAフアージ、例えばM13および繊維
状一本鎖DNAフアージ並びにプラスミドとフア
ージDNAとの組み合わせから得られるベクター、
例えばフアージDNAまたはその他の発現制御配
列を使用するよう改変したプラスミドまたは酵母
プラスミド、例えば2μプラスミドもしくはその
誘導体よりなることができる。有用なクローン化
もしくは発現宿主は細菌宿主、例えばイー・コリ
HB101、イー・コリX1776、イー・コリX2282、
イー・コリMRCIおよびシユードモナス、枯草
菌、高熱細菌およびその他の細菌類、酵母および
その他の真菌類の菌株、動物もしくは植物宿主、
例えば培養物における動物（ひとを含む）もしく
は植物細胞またはその他の宿主を包含する。勿
論、必ずしも全ての宿主／ベクター組み合わせが
同等に有効であるとは限らない。宿主／クローン
化ベヒクル組み合わせの特定の選択は、ここに記
載した原理を考慮して本発明のポリペプチドを得
るべく、種々の組み合わせで当業者により行うこ
とができる。 さらに、それぞれ特異的クローン化もしくは発
現ベヒクルには、二本鎖DNAを挿入するための
各種の部位を選択することができる。これらの部
位は、一般にそこを切断する制限エンドヌクレア
ーゼにより命名される。これらの部位は当業者に
より充分知られている。勿論、本発明に有用なク
ローン化もしくは発現ベヒクルは、選択DNA断
片を挿入するための制限エンドヌクレアーゼ部位
を持つ必要がないことを予解すべきである。寧
ろ、ベヒクルは他の手段によつて断片に結合する
ことができる。 ベクターまたはクローン化もしくは発現ベヒク
ル、および特に選択DNA断片を付着させて組み
換えDNA分子を生成させるためにここに選択さ
れる部位は種々の因子、例えば特定の制限酵素の
作用を受ける部位の個数、発現すべき蛋白質の寸
法、宿主細胞酵素による蛋白分解に対する所望蛋
白質の感受性、精製の際除去することが困難な宿
主細胞蛋白質による発現される蛋白質の汚染また
は結合、例えばベクター配列に対する開始コドン
および停止コドンの位置のような発現特性、並び
に当業者に知られたその他の因子により決定され
る。特定遺伝子に対するベクターおよび挿入部位
の選択はこれら因子のバランスによつて決定さ
れ、必ずしも全ての選択が所定の場合に同等に有
効であるとは限らない。 外来DNAをクローン化ベヒクルまたは発現ベ
クター中に挿入して組み換えDNA分子を生成さ
せるには当業界で幾つかの方法が知られている
が、初期クローン化につき好適な方法はBam HI
によりpSV529DNA（後記）を切断し、Bam HI
部位を充填し、かつ末端トランスフエラーゼによ
つてdC末端を3′末端に付加することである。次
いで、二本鎖cDNAをこのpSV529DNAへ先ずこ
れをdG末端で処理した後に結合させる。次いで、
切断DNAと切断cDNAとを融合させて、DNAを
プラスミドの選択部位に挿入すると共にハイブリ
ツドDNAを再環化させることができ、dG−dC
末端の相補的性質はそれらの付着およびBam HI
部位の再構築を可能にする。かくして得られた組
み換えDNA分子は、クローン化ベクターにおけ
る選択位置に挿入遺伝子を有する（第２図）。 勿論、DNA配列をクローン化もしくは発現ベ
ヒクル中へ挿入して組み換えDNA分子を生成さ
せるその他の公知の方法も、同等に有用である。
例えば、これらはdA−dT未端処理、直接結合、
合成リンカー、エキソヌクレアーゼおよびポリメ
ラーゼ結合修復反応に続く結合、またはDNAポ
リメラーゼによるDNA鎖の延長および適当な一
本鎖鋳型の作成に続く結合を包含する。 勿論、クローン化ベヒクルの選択部位に挿入さ
れたヌクレオチド配列またはcDNA断片は、所望
のポリペプチドを暗号化する実際の遺伝子の一部
でないヌクレオチドを包含するか、あるいは所望
の蛋白質に対する完全遺伝子の断片のみを包含し
得ることを了解すべきである。DNAが最終的に
挿入された場合、形質転換された宿主がIL2の生
物学的もしくは免疫学的活性を有するポリペプチ
ドを生産すること、或いはDNA配列自身がIL2
の免疫学的もしくは生物学的活性を有するポリペ
プチドの生産に有用なDNA配列を含有するクロ
ーンを選択するためのハイブリダイゼーシヨンプ
ローブとして使用し得るものであることのみを必
要とする。 外来遺伝子を含有するクローン化ベヒクルまた
は発現ベクターを使用して宿主を形質転換させ、
この宿主が遺伝子の暗号化するIL2の免疫学的も
しくは生物学的活性を示すポリペプチドを発現す
るようにさせる。適当な宿主の選択は当業界で知
られた多くの因子により制限される。これらは、
例えば選択ベクターとの適合性、ハイブリツドプ
ラスミドにより暗号化される蛋白質の毒性、所望
蛋白質の回収の容易さ、発現特性、生物安全性お
よびコストなどを包含する。これら因子のバラン
スは、必ずしも全ての宿主が特定組み換えDNA
分子のクローン化または発現のいずれかに同等に
有効でないという理解と一致せねばならない。 本発明において、好適な初期クローン化ベヒク
ルはpSV529であり、かつ好適な初期制限エンド
ヌクレアーゼ部位はBam HIである。好適な初期
宿主はイー・コリHB101である。 １ Bam HI−開裂されたdC末端処理 pSV529DNAの調製 pSV529は、多量の後期領域が除去されてい
るキメラSV40プラスミド発現ベクターである
（第２図）。この構造はVP1遺伝子の大部分
（0.945〜0.145地図単位）を欠如するが転写の
複製、開始および停止、並びに16Sおよび19S
mRNAのスプライシングおよびポリアデニル
化に関与する全ての領域を保持する。pSV529
は、後期にSV40転写制御の下で遺伝子を発現
するよう設計される〔デイー・ゲイセンおよび
ダブリユー・フイエルス、ジヤーナル・モレキ
ユラー・アプライド・ジエネテイツクス、第１
巻、第385〜94頁（1982）〕。 pSV529の主たる特徴は次の通りである：(a)
SV40ゲノムの完全初期領域が存在しかつ小型
−ｔおよび大型−Ｔ抗原を暗号化し、さらに猿
の細胞における複製に必要な領域も存在し、こ
れらはoriの後期領域の方向に位置する「エン
ハンサー」配列である；(b)主たる構造蛋白質
VP1に対する遺伝子が削除されている（0.945
−0.145地図単位からのHind−Bam HI断
片）；(c)唯一のBam HI部位がキメラプラスミ
ドに存在し、そこに外来DNA配列を挿入して
SV40後期プロモーターの制御下で発現させる
ことができ、このBam HI部位は後期16S
mRNAアクセプタースプライス部位から39個
のヌクレオチドの後にかつVP1遺伝子の開始コ
ドン（既に除去されている）から12個のヌクレ
オチドの前に存在する；(d)主たる後期16Sメツ
セージに対するドナーおよびアクセプタースプ
ライス部位が存在する；(e)SV40後期領域から
のポリアデニル化部位が存在する（SV40地図
単位0.17）；(f)SV40DNAの2080bp断片（0.33
〜0.725の地図位置の間）の複製は猿細胞にお
ける同質の組み換えを可能にすると共に、プラ
スミド配列が既に除去されているウイルス構造
遺伝子VP1の代わり挿入遺伝子を含むSV40レ
プリコンを発生する。 50μｇのpSV529DNAを40単位のBam HI制
限酵素で37℃にて２時間にわたり60μの８ｍ
Ｍ MgCl2と40ｍＭ NaClと100ｍＭトリス−
HCL（PH7.4）において切断した。EDTAによ
りこの反応を停止させ、そして混合物をフエノ
ール処理し（３回）、エーテル抽出し（２回）、
１／１０容量の2M KOAc（PH５）と２容量のエタ
ノールとで沈澱させた。 沈澱しかつ線状化した（Bam HI）
pSV529DNAを次いで分離し、これを70％エタ
ノールで２回洗浄し、乾燥させ、水に溶解し、
そして50ｍＭトリス−HCl（PH8.3）と50ｍＭ
KClと10ｍＭ MgCl2と30ｍＭ β−メルカプ
トエタノールとそれぞれ250μMの4dNTPと50
単位のAMV逆転写酵素との混合物50μにお
いて37℃で30分間培養した。EDTAにより反
応を停止させ、この混合物をフエノール／
CHCl3／イソアミルアルコールで抽出した。緩
衝液および混合物をセフアデツクス−G75カラ
ム（20cm×0.5cm）に10ｍＭトリス−HCl（PH
7.5）と１ｍＭ EDTAとで充填し、排除（ボ
イド）フラクシヨンを2M KCAc（PH５）とエ
タノールとで−20℃にて１時間沈澱させた。 DNAを遠心分離により分離し、乾燥させ、
30μの10ｍＭトリス−HCl（PH7.5）と１ｍＭ
EDTAとに入れ、68℃にて30秒間加熱し、
そして氷上で冷却した。次いで、このDNAを
0.14M Ｋ−カコジル酸と30ｍＭトリス緩衝液
（PH6.8）と１ｍＭ CoSO4と１ｍＭジチオスレ
イトールと0.1ｍＭ dCTPと100μCiα−
32PdCTP（2500Ci／モル）と100単位の末端デ
オキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ（Ｐ
−Ｌバイオケミカルス社）との混合物200μ
中で37℃にて培養した。５分および10分後、
100μの量を抜き取つて、EDTAにより反応
を停止させた。 これらの分取部分をフエノール／CHCl3／イ
ソアミルアルコールで抽出し、DNAを上記の
ようにセフアデツクス−G75カラムを通してク
ロマトグラフイーにより精製した。排除（ボイ
ド）フラクシヨンにおけるDNAをエタノール
により沈澱させ、遠心分離し、乾燥しそして
30μの10ｍＭトリス−HCl（PH7.5）と１ｍＭ
のEDTAとに溶解した。平均して22個および
36個のdCMP残基が、それぞれ５分間および10
分間の培養の後に線状化pSV529DNAの3′末端
に付加されると計算された。さらに、Pvu
で切断したdC末端pSV529DNAのアガロース
ゲル電気泳動により示されるように、殆ど内部
切断（インターナルテイリング）が生じなかつ
た。 ２ 誘発脾細胞から得られるdG末端 cDNAの調製 上記の二本鎖cDNA（フラクシヨンM2および
M3）をゲルから溶出させ、ヒドロキシアパタ
イトで精製し、かつオリゴdGと共に煮沸し、
この場合慣用方法と末端デオキシヌクレオチジ
ルトランスフエラーゼとを使用した。 ３ dC延長pSV529とdG延長 cDNAとのアニーリング フラクシヨンM2およびM3のそれぞれからの
dG末端dsDNAを、Bam HIで線状化し充填さ
れかつdC末端処理したpSV529と混合し、標準
条件下で融合させた。 アニーリング後に得られるハイブリツド
DNAは、勿論、挿入DNA配列を含まない種々
の組み換えDNA分子と幾つかのクローン化ベ
ヒクルとの混合物である。しかしながら、各組
み換えDNA分子は、Bam HI部位にcDNA断
片を含有する。この種の各cDNA断片は遺伝子
またはその断片からなることもできる。極めて
少数のcDNA断片のみがIL2またはその部分を
暗号化する。大多数は、他の蛋白質またはその
部分（そのmRNAは本発明の方法に使用され
るポリ(A)RNAの一部である）を暗号化する。
さらに、上記で得られたクローンのいずれも
IL2の免疫学的もしくは生物学的活性を示すポ
リペプチドの発現を可能にしないことを了解す
べきである。寧ろ、これらはこの種のクローン
をスクリーニングしかつ同定する際にのみ有用
である。 ４ 融合ハイブリツドDNAによるイー・コリ HB101の形質転換 形質転換法および得られた形質転換体を処理
するその後の工程に対し、必要に応じ適当な封
じ込め施設を使用した。 融合DNAの混合物（フラクシヨンM2および
M3のそれぞれにつき）を、標準形質転換条件
を用いてコンピテント イー・コリHB101細
胞へ付加した。次いで、これら細胞100μ／
mlのカルベニシリンを含有するLB−寒天平板
に接種した。プラスミドpSV529はペニシリン
耐性の遺伝子を含むので、この遺伝子を有する
プラスミドで形質転換されたイー・コリ宿主
は、このように形質転換されない細菌を除き、
抗生物質を含有する培地中で増殖するであろ
う。したがつて、カルベニシリン含有培地にお
ける増殖は、組み換えDNA分子または再環化
ベクターにより形質転換され宿主の選択を可能
にする。 個々のコロニーを採取し、そしてこれらをマ
イクロタイタープレートにおける200μのLB
培地（カルベニシリンを含有する）において１
晩増殖させた。ジメチルスルホキシドを10％の
終濃度で加えた後、これらプレートを−20℃で
貯蔵した。M2およびM3 DNAフラクシヨンか
らそれぞれ約1300個および1000個のクローンを
得た。 各フラクシヨン（M2およびM3）カルベニシ
リン耐性のクローン化は、誘発脾細胞から得ら
れたポリA+RNAの混合物の寸法決定された完
全もしくは部分コピーを表現する各種の組み換
えDNA分子を含有する。これらクローン化の
大部分は、単一の組み換えDNA分子を含有す
るであろう。しかしながら、これら組み換え
DNA分子の極く少数のみがIL2に関連する。
したがつて、これらクローンは、IL2関連クロ
ーンを他のクローンから選択するよう選別せね
ばならない。 hIL2cDNAを含有する クローンのスクリーニング hIL2cDNAを含有する細菌クローンをスクリ
ーニングするには幾つかの方法がある。これら
は、例えばRNA選択ハイブリダイゼーシヨン
（アーウイン等、下記）、分別ハイブリダイゼーシ
ヨン〔テイー・ピー・セント・ジヨーンおよびア
ール・ダブリユー・デービス、「分別プラーク・
フイルターハイブリダイゼーシヨンによるサツカ
ロミセス・セレビシーからのガラクトース誘発性
DNA配列の単離」、セル誌、第16巻、第443〜452
頁（1979）〕、合成プローブによるハイブリダイゼ
ーシヨン〔ビー・ノイエス等、「オリゴデオキシ
ヌクレオチドプローブを用いるガストリン
mRNAの検出および部分配列分析」、プロシーデ
イング・ナシヨナル・アカデミー・サイエンス・
USA、第76巻、第1770〜74頁（1979）〕、または
所望蛋白質を生産するクローンの免疫学的分析
〔エル・ビラーコマロフ等、「プロインシユリンを
含成する細胞クローン」、プロシーデイング・ナ
シヨナル・アカデミー・サイセンス・USA、第
75巻、第3727〜31頁（1978）〕または生物学的分
析（エー・シー・ワイ・チヤング等、「ねずみジ
ヒドロホレート・レダクターゼを暗号化する
DNA配列のイー・コリにおける表現型発現」、ネ
イチヤー誌、第275巻、第617〜24頁（1978）〕に
よる選別を包含する。本発明においては、主たる
クローン選別に対する最も便利かつ有望な方法と
してRNA選択ハイブリダイゼーシヨンを選択し
た。 RNA選択ハイブリダイゼーシヨンにより同定
される組み換えDNA分子およびそれにより形質
転換された細菌培養物が完全IL2cDNA配列を含
有するという保証はなく、またDNA配列が実際
にIL2を暗号化しまたはIL2の免疫学的もしくは
生物学的活性を示すポリペプチドをクローンに発
現させ得るという保証さえない。しかしながら、
組み換えDNA分子は確かにIL2mRNA暗号化配
列に相補なヌクレオチド配列を含有する。したが
つて、組み換えDNA分子は、少なくとも他の組
み換えDNA分子およびそれにより形質転換され
たクローンを選別するためのプローブ源として使
用し、標準または完全IL2ヌクレオチド暗号化配
列を含有する他の種類のクローンを同定すること
もできる。次いで、これらクローンを、IL2の生
物学的もしくは免疫学的活性を示すポリペプチド
の可能な発現につき直接に分析することができ
る。さらに重要なことに、これらハイブリツドプ
ラスミドの挿入DNA断片およびそのアミノ酸翻
訳生産物のヌクレオチド配列は常套手段によつて
決定することができ、このDNA配列を使用して
適当な発現ベクターを作成し、これにより形質転
換された適当な秋宿主においてIL2の合成を行う
ことができる。 Ａ RNA選択ハイブリダイゼーシヨン分析 １ 選択ハイブリダイゼーシヨンの背景 蔗糖密度勾配からのポリA+RNAは約1μｇ
RNA／μｇを含有し、その内30nｇ（30n
）を各卵細胞へ微量注入する。IL2mRNA
が蔗糖密度勾配のピークフラクシヨンにおい
て全ポリA+RNAの0.3％を構成すると仮定
し、0.1ngのIL2mRNAを各卵細胞中に微量
注入する。この量の1/10、すなわち0.01nｇ
のIL2mRNAは卵細胞中への注入後に検出す
ることができる。上記の推定によれば、ピー
クフラクシヨンにはポリA+RNA1μｇ当り3n
ｇのIL2mRNAが存在する筈であり、またハ
イブリダイゼーシヨン溶出分析につき50μｇ
のポリA+RNAを使用すれば150nｇの
IL2mRNAが得られるであろう。 50個のクローンからなる各群は約10個の挿
入物を含有する。３〜5μｇの挿入DNAを蔗
糖密度勾配遠心分離によつて精製し、ニトロ
セルロースフイルターに結合させた。かくし
て、0.3〜0.5μｇの個々の挿入DNA（個々の
クローンから得られたもの）がフイルターに
結合される。 10ngのIL2mRNA（150ngが利用可能であ
る）がフイルターに結合された300〜500nｇ
のIL2cDNA挿入物とハイブリツド形成し得
ると仮定し、かつこのRNAの30％が溶出後
に回収され得ると仮定して、3nｇの
IL2mRNAを2μの水に溶解し、その内30n
もしくは0.05nｇのIL2mRNAを卵細胞中
へ注入する。これは分析中に検出される筈で
ある。 それぞれ10個の挿入物（50個のクローンか
ら得られたもの）を含有する30個のフイルタ
ーを分析して、ハイブリツド形成すべき300
個の個々の挿入物を与えた。IL2mRNAがds
cDNA合成に使用したポリA+RNAの0.3％を
構成すると仮定して、平均で１個の
IL2cDNAクローンがフイルター中に存在す
る筈である。 ２ 分析の実施 工程Ａ：「挿入DNA」の精製およびこの「挿
入DNA」を含有するニトロセルロースフ
イルターの調製 上記で調製したライブラリー（M2および
M3）のそれぞれを50個のクローンからなる
群に分割し、50個の各群を単一の寒天平板上
で１晩増殖させた。次いで、これらクローン
から得られた細菌を10mlのLB培地に懸濁さ
せ、0.5の脳心臓潅流物（BHI−ジフコ）
にこの懸濁物を接種した。細菌懸濁物を１晩
増殖させた後（プラスミドの増加を伴わな
い）、SDS−アルカリ溶菌によつてこれら培
養物からDNAを単離した（デイー・イシユ
ーホロビツツおよびジエー・エフ・パーク、
ヌクレイツク・アシド・リサーチ、第９巻、
第2989〜2998頁（1981）〕。次いで、50個のク
ローンの各混合物（200μｇ）からのプラス
ミドDNAを20μの10ｍＭトリス−HCl（PH
7.5）と１ｍＭのEDTAにおいてBamHI制限
エンドヌクレアーゼにより切断して、「挿入
DNA」を切除した。反応が完結した後（４
％ポリアクリルアミドゲルにおいて5μを
電気泳動させて検査する）、DNA混合物を68
℃にて５分間加熱し、これを氷中で冷却し、
そして11μの５〜20％蔗糖密度勾配へ10ｍ
Ｍトリス−HCl（PH7.5）と１ｍＭのEDTAと
で充填した。各密度勾配をベツクマンSW41
型ローターにて40K（40000rpm）かつ４℃で
16時間遠心分離した。 次いで、各密度勾配を分画しかつ「挿入
DNA」の混合物（５〜10μｇ）を含有する
フラクシヨンを１：10容量の2M KOAc（PH
５）と２容量のエタノールとで−20℃にて少
なくとも３時間沈澱させた。 「挿入DNA」の沈澱混合物を遠心分離に
より集め、ペレツトを全部で20μの10ｍＭ
トリス−HCl（PH7.5）と１ｍＭ EDTAとに
入れ（2μを４％ポリアクリルアミドゲル
の電気泳動に使用した）、この混合物を100℃
にて１分間加熱し、氷中で冷却し、そして
10μの1.5N NaOHを加えた。混合物を室
温で10分間培養した後、30μの2M
NH4OAcを加え、これを前もつて1M
NH4OAcで湿らせておいたニトロセルロー
スフイルターにスポツトし（９mm2、シユライ
ヒヤーおよびシユエルBA85、0.45μｍ）、「挿
入DNA」をフイルター吸着させた。これら
フイルターを空気乾燥し、0.9M NaClと
0.09Mクエン酸ナトリウムとで洗浄し、乾燥
し、そして80℃にて減圧下に１晩焼成した。 工程Ｂ：「挿入DNA」とポリA+RNAとのハ
イブリダイゼーシヨン ハイブリダイゼーシヨン選択のため、30個
のニトロセルロースフイルターを、65％ホル
ムアミド（アンバーライトMB1、セルバ社、
により脱イオン化したもの）と0.2％SDSと
20ｍＭ HEPES（PH6.4）と0.4M NaClとの
混合物500μを含有する15mlのシリコン処
理した無菌コレツクスチユーブ中で50℃にて
２時間予備ハイブリツド形成させた。次い
で、溶液を、ポリA+RNAを含有する同一の
混合物（PHA／TPA誘発された脾細胞から
得られる５〜20％蔗糖密度勾配で上記のよう
に精製しかつ68℃にて１分間予備加熱したも
の50μｇ）で交換した。次いで、これらフイ
ルターおよび混合物を50℃にて５時間培養し
た。30個のニトロセルロースフイルターは、
上記のようにM2およびM3フラクシヨンの一
部からそれぞれ調製された50個のクローンよ
りなる30群を示した。 工程Ｃ：非ハイブリツド形成ポリA+RNAか
らのハイブリツド形成ポリA+RNA−挿入
DNAの分離 ハイブリツド形成ポリA+RNA−挿入
DNAを含有する30個のフイルターを50mlの
プラスチツクチユーブに移し、これらを50ml
の10ｍＭトリス−HCl（PH7.6）と0.15M
NaClと１ｍＭのEDTAと0.5％ SDSとの溶
液50mlで９回洗浄し、かつSDSを含まない上
記の緩衝液で65℃にて２回洗浄した。次い
で、それぞれ個々のフイルターを100μの
水と2μ（4μｇ）のポリA-RNAとを含有す
るシリコン処理したエツペンドルフ管へ移し
た（オリゴ（dT）セルロースカラムには脾
細胞からのRNAを通した）。これらチユーブ
を100℃にて１分間加熱し、そして直ちにこ
れらをCO2／エタノール浴中で凍結させた。
これらチユーブを室温で解凍した後、フイル
ターを各チユーブから取り出し、溶出した
RNAを−20℃にて15μの2M NaOAc（PH
５）と300μのエタノールとで１晩沈澱さ
せた。遠心分離によりRNAを集め、ペレツ
トを70％エタノールで２回洗浄しそして乾燥
させた。 工程Ｄ：IL2−mRNA活性の測定 30個のペレツトのIL2−mRNA活性を分析
するため、30個のフイルターに対応する、す
なわちM2およびM3フラクシヨンからの50個
のクローンよりなる初期の30群に対応するペ
レツトのそれぞれを2μの水に溶解し、こ
のRNA溶液を15〜20個のアフリカツメガル
の卵細胞へ上記と同様に注入した。23℃で３
日間後、卵細胞培地を除去し、IL2活性につ
き分析した（上記と同様）。 ３ RNA選択ハイブリダイゼーシヨン分析の
結果 50個のクローンよりなる30群〔cDNAフラ
クシヨンM2（750−1000bp）からの18群およ
びcDNAフラクシヨンM3（600−750bp）か
らの12群〕のうち２群、すなわち群M3−２
（フイルター20）と群M3−６（フイルター24）
とが、卵細胞注入分析で測定ししてIL2活性
を暗号化するmRNA（誘発脾細胞からのポリ
A+RNAから得られたもの）にハイブリツド
形成する挿入DNAを含有した。この分析の
結果を第１表に示す。 【表】 【表】 【表】 上記したように第２のハイブリダイゼーシヨン
と分析とを行つた後、群M3−２およびM3−６が
再び陽性を示した。群M3−２の50個のクローン
を14個のサブ群、すなわちサブ群Ａ〜Ｎにそれぞ
れ分割した（各群は７個のクローンを含有し、た
だしサブ群Ｎは８個のクローンを含有し、全群に
おける陽性クローンの存在は２つの陽性サブ群を
もたらす筈であり、すなわち「平方根法」を使用
する）。次いで、上記のハイブリダイゼーシヨン
および分析手順を、これら14個のサブ群からの挿
入DNAを含有するニトロセルロースフイルター
について反復し、サブ群M3−2D（クローンM3−
２−４、11、18、25、32、39および46を含有す
る）とサブ群M3−2L（クローンM3−２−29、
30、31、32、33、34および35を含有する）とが
IL2活性を示すことを突き止めた。したがつて、
個々のクローンM3−２−32がひとIL2−mRNA
に相対的な「挿入DNA」を有するプラスミドを
含有するクローンとして同定された。したがつ
て、クローンM3−２−32の挿入DNAを単離し、
精製し、そしてこれをニトロセルロースフイルタ
ーに結合させ、このRNAハイブリダイゼーシヨ
ン分析を上記と同様に反復した。この分析におい
て個々のクローンM3−２−32は約6800cpmIL2活
性を示した。 このクローンをイー・コリHB101（pSV529
（Bam HI）／hIL2−０）と命名し、その組み換
えDNA分子をpSV529（Bam HI）／hIL2−０
（「pSV−hIL2−０」）と命名し、かつそのDNA
挿入物をhIL2−０を命名した。この命名法は、
クローンおよび組み換えDNA分子がBam HI部
位にIL2−関連cDNAを含有するプラスミド
pSV529からなることを示し、特定クローンが最
初に示されている。 hIL2−０にクロスハイブリツド形成する 組み換えDNA分子を含有したクローンの同定 上記のように単離したpSV−hIL2−０を使用
して、群M2およびM3のcDNAから予め調製した
クローンのライブラリーをコロニーハイブリダイ
ゼーシヨンによつて選別した〔エム・グルンスタ
インおよびデイー・エス・ホグネス、「特定遺伝
子を含むクローン化RNAの単離法」、プロシーデ
イング・ナシヨナル・アカデミー・サイエンス・
USA、第72巻、第3961−65頁（1975）〕。この方
法は、pSV−hIL2−０から作成された放射性プ
ローブをニトロセルロースフイルターに固定され
た溶菌細菌コロニーのDNAに対しハイブリダイ
ゼーシヨンさせて関連コロニーを迅速に同定する
ことを可能にする。 上記のように、マイクロタイタープレートに集
めたクローンのライブラリーを同様な寸法のニト
ロセルロースシート（0.45μｍの孔直径、シユラ
イヒヤーおよびシユエルまたはミリポア社）で複
製したが、これらシートは界面活性剤を除去する
ため予め煮沸し、そしてこれらシートをカルベニ
シリン（100μｇ／ml）を含有するLB寒天平板の
上に置いた。細菌コロニーを37℃にて１晩増殖さ
せた。ニトロセルロースシート上の細菌の溶菌お
よび固定を、0.5N NaOH（約７分間２回）と1M
トリス−HCl（PH7.5）（約７分）と0.5Mトリス−
HCl（PH7.5）および1.5M NaCl（約７分）と、２
×SSC（0.15M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウ
ム（PH7.2）（約７分）とで順次に洗浄することに
より行つた。エタノールで充分洗浄しかつ風乾し
た後、これらシートを減圧下で80℃にて２時間焼
成し、室温で貯蔵した。 挿入DNA hIL2−０断片に特異的なHinf制限
断片を、コロニーハイブリダイゼーシヨンのプロ
ーブとして使用した。この断片（450塩基対）を、
pSV−hIL2−０のHinf切断生成物の４％ポリア
クリルアミドゲルにおける電気泳動で精製した。
DNAバンドを臭化エチジウムで染色した後、特
定断片を溶出させ、そして残留する臭化エチジウ
ムをイソアミルアルコール抽出によつて除去し
た。次いで、特定断片をエタノールでの沈澱によ
り濃縮し、「ニツク翻訳」により 32P−標識し
〔ピー・ダブリウ・ジエー・リグビー等、「DNA
ポリメラーゼＩでのニツク翻訳によるin vitroで
のデオキシリボ核酸の高比放射能ラベル」、ジヤ
ーナル・モレキユラー・バイオロジー、第113巻、
第237−251頁（1977）〕、この場合それぞれ
dCTP、dTTPおよびdGTPを400μMで2.5μ含
有し、かつ100p molesのα−ATP（アメルシヤ
ム社、2000Ci／ｍmole）と2.5単位のDNA−ポリ
メラーゼＩ（ベーリンガー社）とを含有する50μ
の50ｍＭトリス−HCl（PH7.4）と10ｍＭ
MgCl2と20ｍMβ−メルカプトエタノールにおい
て15℃にて45分間培養した。未反応のデオキシヌ
クレオシド三リン酸を、セフアデツクスG75カラ
ムにおけるTE緩衝液でのゲル濾過によつて除去
した。高度に 3P−標識されたDNAを0.1容量の
2M酢酸ナトリウム（PH5.1）と2.5容量のエタノ
ールとにより20℃にて沈澱させた。 フイルター含浸されたDNAに対する上記プロ
ーブのハイブリダイゼーシヨンを行つた（これは
デイー・ハナハンおよびエム・メセルソンによ
り、「高コロニー密度におけるプラスミドスクリ
ーニング」、ジーン誌、第10巻、第63−67頁
（1980）に実質的に記載されている）。上記したよ
うに調製したフイルターを0.1％フイコール、0.1
％ポリビニルピロリドン、0.1％牛血清アルブミ
ン、0.15M NaCl、0.03M トリス−HCl（PH８）、
１ｍＭ EDTAにおいて68℃にて２時間予備培
養し、次いで0.02％フイコール、0.02％ポリビニ
ルピロリドン、0.02％牛血清アルブミン、0.75M
NaCl、0.15Mトリス−HCl（PH８）、５ｍＭ
EDTAおよび0.5％SDSにて洗浄した。上記洗浄
溶液と同一の溶液でハイブリダイゼーシヨンを68
℃にて進行させ、この場合使用に先立ち100℃に
て５分間変性した 32P−標識プローブを使用し
た。ハイブリツド形成したフイルターを0.3M
NaCl、0.06Nトリス−HCl（PH８）、２ｍＭ
EDTAにて68℃で２時間２回洗浄した後、風乾
しかつ放射線分析した。 cDNAフラクシヨンM2から生じた約1300個の
クローンとcDNAフラクシヨンM3から生じた
1050個のクローンとを選別した。このコロニーハ
イブリダイゼーシヨンスクリーニングの結果、
IL2プローブに強力にハイブリツド形成したフラ
クシヨンM3 cDNAから生じる１個のコロニーを
同定した。フラクシヨンM3からのこのクローン
をpSV−hIL2−１と命名した。これはRNA選択
分析において予め陽性であつたM3−６群から生
じたものである。 DNA挿入物hIL2−１は約230bpを示した（そ
のＧ／Ｃ末端を含む）。この挿入物はhIL2−０の
内部Hinf断片とハイブリツド形成するので、こ
の挿入物は内部ニツクでdG末満処理されたds
cDNA分子を挿入することにより生じたものと思
われる。 勿論、上記のようにhIL2−０挿入DNAまたは
その挿入物を使用して同定されたクローンのその
他のDNA挿入物を用いるクローンスクリーニン
グのこの方法は組み換え、DNA技術、合成、天
然源またはその組合せから生ずるDNA配列を含
有するその他のクローン、あるいは単一もしくは
複数の塩基置換、挿入、逆転または削除を含む突
然変異による上記DNA配列のいずれかに関連し
たDNA配列を含むクローンについても同等に使
用することができる。従つて、この種のDNA配
列およびその同定も本発明の範囲内に入る。さら
に、上記DNA配列により送別されないが、ヌク
レオチド配列の結果として上記DNA配列により
暗号化されたポリペプチドを暗号化するような
DNA配列も本発明の範囲内に入ると了解すべき
である。 さらに、ひとインターロイキン２を暗号化する
DNA配列とねずみ、豚、にわとり、牛または犬
のようなひと以外の原料から得られるIL2を暗号
化するDNA配列との間には同質性が予想される
ので、本発明のDNA配列はこれらのひと以外の
インターロイキン２を暗号化するDNAの選択に
おいて、および免疫治療剤および方法に使用する
ためのひと以外のインターロイキンのクローン化
および発現において有用である。また、本発明の
DNA配列またはそれから調製かつ誘導されるオ
リゴヌクレオチドを使用して、インターロイキン
２ではないインターロイキン関連のポリペプチド
を暗号化するその他のDNA配列を選択すること
もできる。これらの配列およびポリペプチドも本
発明の１部である。 hIL2活性を示すポリペプチドの発現 hIL2−関連の挿入DNAを含有するプラスミド
で形質転換するためのアフリカ産緑猿（AP8）の
腎臓細胞を調製するため、これら細胞をデユルベ
ツコの改変イーグル最小培地（「DME」（ギブコ
社）に維持した。この培地は10％新生ウシ血清
（ギブコ社）と１ml当り100単位のペニシリンと１
ml当り100μｇのストレプトマイシンとを含有し
た。細胞培養物を、DEAE−デキストラン改変法
を用いてプラスミドDNAにより形質転換させた。
次の工程を行つた：細胞の単一層をトリプシン−
EDTAにより約１時間徹底的に処理し、次いで
10％の新生ウシ血清を含有するDMEにおいて17
mmのウエル（１板の板当り24穴、コスター社）に
分散させた。24時間後、これらの細胞をHEPES
緩衝最小必須培地で２回洗浄し、そしてプラスミ
ドDNA（12μのF11−HEPES緩衝液中に約１〜
10μｇ／μで溶解）を500μｇ／mlのDEAE−デ
キストラン（フアルマシア社）を含有する120μ
のDMEに加えた。この混合物を次いで細胞の
単一層へ約30〜60分間かけて加えた（ジエー・エ
ツチ・マツクチヤンおよびジエー・エス・バガ
ノ、「ジエチルアミノエチル−デキストランによ
る猿ウイルス40デオキシリボ核酸の感染性の促
進」、ジヤーナル・ナシヨナル・キヤンサー・イ
ンスチチユート、第41巻、第351−57頁（1978）；
ジー・チユーおよびピー・エー・シヤープ、「懸
濁物における細胞のSV40DNA形質転換：Ｔ−抗
原の転写および翻訳の効率分析」、ジーン誌、第
13巻、第197−202頁（1981））。これら細胞を
DMEで３回洗浄した後、新鮮な培地（DME＋10
％ウシ血清＋100μｇ／mlペニシリン、および
100μｇ／mlストレプトマイシン）を加えそして
細胞培養物をCO2培養器において37℃で72時間培
養した。 形質転換に使用したプラスミドDNAはリゾチ
ーム−界面活性剤の溶菌によりイー・コリ
HB101（pSV−hIL2−０）集落から調製し、臭化
エチジウムの存在下におけるCsCl勾配での同密
度遠心分離によつて精製した（エム・カーン等、
「プラスミドCol E1から誘導されたプラスミドク
ローン化ベヒクル」、メソツド・イン・エンザイ
モロジー、第68巻、組み換えDNA（アール・ウー
編）、第268−280頁（1979）に実質的に記載され
ている）。 72時間培養した後、上澄液（〜1/2ml）を形質
転換細胞から除去し、そしてこれを慣用のIL2分
析に使用して、上澄液における生物学的活性な
hIL2−関連ポリペプチドの存在を測定した（上
記）。 クローンpSV−hIL2−０からのIL2活性の発現
は何ら観察されなかつた。その後のDNA配列決
定（下記）が示すところでは、このクローンの
DNA挿入物hIL2−０はその5′末端において不完
全であり、開始信号を含まない。* ＊ hIL2−０の5′末端における喪失ヌクレオチド
の数を確定するため、短い（63bp）制限断片
を単離した。5′標識し、ストランド分離し、そ
して誘発脾細胞から得られたポリA+RNAへハ
イブリダイゼーシヨンした後に逆転写酵素によ
り延長化した。変性用ポリアクリルアミドゲル
上でのcDNA生成物の分析は約210ヌクレオチ
ドのバンドを示した。この分析から、hIL2−
０はIL2mRNAの全長よりも約110個のヌクレ
オチドだけ短いと確定された。 ここで使用した発現ベクターは開始信号を与え
ない。従つて、いかなるhIL2発現も、hIL2−０
のみを使用するこの発現系において期待すること
ができなかつた。しかしながら、DNA挿入物、
hIL2−０を使用して本発明で用いたクローンラ
イブラリーから、あるいはIL2の完全暗号化配列
を持つもしくはhIL2−０の配列と組み合わせて
配列の喪失部分を供給するような他のクローンま
たは染色体から、その他のクローンを選択し得る
こことを了解すべきである。この種の選択技術は
上記に記載され、これを以下に例示する。hIL2
に対する完全暗号化配列を有するクローンを同定
した後、この配列を使用して猿細胞を上記のよう
に形質転換させ、あるいはその他の適当な宿主を
形質転換させて、hIL2様ポリペプチドを生成さ
せることができる。さらに、このhIL2−０配列
を常法によりATG開始コドンと組み合わせて、
成熟hIL2を暗号化するそその配列またはその部
分を発現させることができる。 第５図は、hIL2−0DNA配列を使用してhIL2
を生成する幾つかの作成を示している。これらの
作成においては、先ずpSV−hIL2−０のBam
HI−Bam HI断片を単離した。これは第４図に
示したヌクレオチド配列を有する断片（hIL2−
０）である（ただし、下線を施した部分を除く）。
操作を単純化するため、先ずこの断片をpAT153
にサブクローン化し（第５図）、次いで得られた
hIL2−０暗号化配列を含有するプラスミド
pAT153をHgi A1によつて線状化させ、T4ポリ
メラーゼにより3′末端を除去し、次いでBam HI
により線状DNAを制限してhIL2含有の断片を単
離し、この断片の5′末端はCCT（第４図に示され
る第３のアミノ酸に対するコドン）で始まり、ま
たその3′末端はhIL2暗号化領域の末端を越える
（第４図）。この断片をhIL21と命名した。 DNA配列hIL21はPro（第４図に示したhIL2−
０配列の第３のアミノ酸）で始まる蛋白質を暗号
化するので、この配列の第２のアミノ酸（Ala）
をも暗号化するDNA配列を調製することに決定
した。* ＊ 成熟hIL2はこのアラニンで始まる。 この作成を行うため、先ずhIL21断片を
pAT153から調製した断片へ結合させ、その際こ
のプラスミドをNar Ｉ（GG↓CGCC）より線状
化し、末端をDNAポリメラーゼＩ（クレノー）
（Ban Ｉ部位をも形成する）で充填し、かつ線状
断片をBam HIで制限した。得られたプラスミ
ド、すなわち第５図においてpAS153（hIL2B）は
結合部に次の配列を有する： GGCGCCT…… Pro 次いで、このプラスミドをBan Ｉで線状化し、
5′末端をDNAポリメラーゼＩ（クレノー）で充填
し、そしてこの線状プラスミドをBam HIで制限
した。得られたhIL2含有の断片をhIL201と命名
した。その5′末端はGCGCCT（Ala−Proを暗号
化する）で始まりその3′末端はBam HI部位であ
つて、hIL2暗号化配列の末端を越える。次いで、
これら断片を、ATG開始コドンに隣接し、かつ
プロモーターおよびリボソーム結合部位の下流に
個々の発現ベクター中へ挿入した。この種の作成
によりアミノ末端としてそれぞれMet−Pro−
ThrまたはMet−Ala−Pro−Thrを有する本発明
のhIL2関連のポリペプチド生成物が得られた。 (a) フアージMuから得られるPLプロモーターお
よびリボソーム結合部位 上記のDNA配列を発現ベクターpPLcMu299
（ゲーリーブエルの寄贈による）中へ挿入した。
このベクターはフアージMu*から得られるPL
プロモーターとリボソーム結合部位とを含有す
る。これはさらに、Nco Ｉ部位（CCATGG）
の一部であるATG開始コドンと、さらに下流
の唯一のBam HI部位とを特徴とする。* ＊ このベクターはpPLc236から得られた（イ
ー・レモート等、「コリフアージλのPLプロモ
ーターにより制御される高効率発現のためのプ
ラスミドベクター」、ジーン誌、第81−93頁
（1981））。これら配列を含有する微生物および
プラスミドは、1982年８月16日付でATCC寄託
番号39173としてアメリカン・タイプ・カルチ
ヤー・コレクシヨンに寄託した。この培養物は
入手し得ると同時に、後記する培養物も入手す
ることができる。 従つて、pPLcMu299をNco Ｉにつつて線
状化し、5′末端をDNAポリメラーゼＩ（クレノ
ー断片）で全ての４つのdNTPの存存下に充填
し、かつさらに線状DNAをBam HIにより切
断した。アガロースゲル上で精製した後、線状
化したpPLcMu299を上記のhIL2含有断片と結
合させ、そして得られたプラスミドを挿入され
たhIL2含有断片に基づいてpPLcMu−hIL21お
よびpPLcMu−hIL201と命名した。構造
pPLcMu−hIL21の結合部におけるDNA配列
は次の通りである： TTAGGAGGGTTTTTACCATGCCT… S.D. MetPro… 構造pPLcMU−hIL201の結合部における
DNA配列は次の通りである： TTAGGAGGGTTTTTACCATGGCGCCT
… S.D. MetAlaPro… さらに、pPLcMu−hIL21の構造、フアージ
Muからのリボソーム結合部位およびPLプロモ
ーターを特徴とする第２のプラスミドを、
pPLcMu−hIL21の初期領域をpPLc28の領域
で交換することにより作成した（イー・レモー
ト等、上記）。このより小さいプラスミドを
pPLcMu−hIL22と命名した（第５図）。 次いで、イー・コリK12ΔHIΔtrpをこれら発
現ベクターのそれぞれ形質転換し、得られた培
養物を42℃で３時間誘発させた。次いで、煮沸
SDS中で細菌を破砕することにより細菌抽出物
を調製し、この抽出物をSDSポリアクリルアミ
ドで分析した（セルバブルーで染色）。３つの
抽出物のそれぞれにおいて、誘発後に約15Kの
新たな蛋白質バンドが存在した。しかし、この
バンドは28℃で生育させた形質転換細胞からの
抽出物には存在しなかつた。15Kの蛋白質は全
細胞蛋白質の約５〜10％であると推定された。 さらに上記した 3H−チミジン取込み分析に
より、これら形質転換宿主から作成された透明
な抽出物のhIL2生物学的活性を分析した。こ
の分析において、培養かつ誘発した細胞を界面
活性剤の不存在下で音波処理により開裂させ、
細胞残骸を30000ｇで遠心分離し、上澄液を
0.2μのミリポアフイルターを通して清澄させ
た。この分析の結果を下記第表に示す。 【表】 (b) Trpアテニュエイシヨン領域から得られる
Trpプロモーターおよびリボソーム結合部位 次いで、上記のhIL2配列を発現ベクター
pTrp321（ゲーリーブエルの寄贈）に挿入した。
このベクターはTrpアテニユエイシヨン領域か
ら得られる。Trpプロモーターとリボソーム結
合部位とを含有する。ベクター部分は実質的に
pBR322であり、開始ATGコドンはNco Ｉ部
位の部分であり、かつ唯一のBam HI部位が
存在する。従つて、上記(a)の項に記載したと同
じ作成技術に従つて、hIL2配列を含有するプ
ラスミドを作成した。これらのプラスミドを、
使用したhIL2含有断片に基づいて、pTrp−
hIL21およびpTrp−hIL201と命名した。構造
pTrp−hIL21の結合部におけるDNA配列は次
の通りである：AAAGGG TATCGATTCCATGCCT… S.D. MetPro… 構造pTrp−hIL201の結合部におけるDNA配
列は次の通りである：AAAGGG TATCGATTCCATGGCGCCT… S.D. MetAlaPro… 次いで、イー・コリK514λをpTrp−hIL21お
よびpTrp−hIL201で形質転換させ、そしてこ
れら形質転換宿主をトリプトフアン欠乏によつ
て37℃で誘発させた。誘発の後、再び誘発細胞
内に15Kの蛋白質バンドが観察された。予想通
り、このバンドは誘発しない細胞には存在しな
かつた。ここでも、ひとインターロイキン２の
活性の誘発合成のレベルは全細胞蛋白質の５〜
10％であつた。 さらに、界面活性剤の不存在下で音波処理に
より誘発培養物の細胞を開裂させ、細胞残骸を
30000ｇにて遠心分離し、かつ上澄液を0.2μの
ミリポアフイルターに通した後、生物学的活性
につき分析した。これら分析の結果を第表に
示す。 【表】 (c) 細菌抽出物からの生物学的活性の回収 １mlの培養物（pPLcMu−hIL21またはpTrp
−hIL21）から調製した細菌ペレツトを１％
SDS−１％β−メルカプトエタノールを含有す
るラメリの電気泳動用緩衝液（200μ）中に
懸濁させ、そしてこの懸濁物を37℃で１時間培
養し、次いで音波処理した。これら油出物
（40μ）を0.1％SDSを含有する15％PAGE（ラ
メリ）に通して電気泳動した後、このゲルを２
mmのスライスに切断し、各ゲルスライスをマイ
クロタイタープレートの穴に入れた。次いで、
ゲルスライスを10％ウシ胎児血清を含有する
RPMI1640培地（ストレプトマイシンとペニシ
リンとを補充）で２回洗浄し、これらゲルをガ
ラス棒で配砕し、そして200μの培地中へ拡
散させることにより37℃で１晩溶出した。プレ
ートを４℃で２時間培養した後、これを200ｇ
にて15分間遠心分離し、そして上澄液を前記と
同様にhIL2活性につき分析した。 この分析の結果、細菌抽出物（pPLcMu−
hIL21またはpTrp−hIL21）のhIL2生物学的活
性は、形質転換細胞の誘発の際現れる15K蛋白
質バンドと共に移動し、かつこの生物学的活性
はSDS−PAGEから回収され得ることが確認さ
れた。 hIL2関連挿入DNAの特性化 第４図を参照して、挿入DNA hIL2−０の物
理地図を、供給業者により特定された条件下にお
ける種々の制限酵素（ニユー・イングランド・バ
イオラブ社またはベーリンガー社）での切断によ
つて作成した。切断生成物を、2.2％アガロース
ゲルまたは６％ポリアクリルアミドゲルにおいて
40ｍＭトリス−HOAc（PH7.8）と20ｍＭ EDTA
で電気泳動させた。これらを臭化エチジウムで染
色して肉眼化した後、または制限断片を 32P−ホ
スフエート（下記）で末端標識する放射線分析の
後に分析し、pBR322の詳細な物理的地図と比較
した〔ジエー・ジー・サツトクリフ、「大腸菌プ
ラスミドpBR322の完全ヌクレオチド配列」、コ
ールド・スプリング・ハーバー・シンポジウム、
第43巻、第１号、第77−90頁（1978）〕。制限地図
を、これら切断パターンに基づいて作成した。こ
れらをDNA挿入物の配列決定により規定した
〔エー・エム・マキサムおよびダブリユウ・ギル
バート、「DNAの新規な配列決定方法」、プロー
シーデイング・ナシヨナル・アカデミー・サイエ
ンス・USA、第74巻、第560−64頁（1977）の方
法による〕。hIL2−０の配列は、下記するゲノム
hIL2クローンからの配列情報によつて補充した。
ゲノム情報を第４図に示す。 プラスミドDNAをイシユーホロビツツおよび
バーク（上記）の方法によつてpSV−hIL2−０
から作成し、この方法はスクリーニングとして一
群のクローンからDNAを単離するために上記で
使用した。挿入DNAをpSV−hIL2−０のBam
HI制限によつて得、これを前記と同様に中性蔗
糖密度勾配遠心分離によつて精製した（約
740bp）。次いで、製造業者（ニユー・イングラ
ンド・バイオラブ社）により推奨されるように、
種々の制限酵素で制限した。 制限した、DNAを、４単位の細菌由来のアル
カリホスフアターゼと0.1％のSDSとの存在下に
65℃にて30分間脱リン酸した。２回フエノール抽
出しかつエタノール沈澱した後、DNAをγ−
32P−ATP（〜3000Ci／ｍmole）とポリヌクレオ
チドキナーゼ（Ｐ−Ｌ−バイオケミカルス社）と
で5′未端標識した。或いは、制限断片を、α−標
識した 32P−ヌクレオシドトリホスフエート（〜
1000Cu／ｍmole）の存在下でDNAポリメラーゼ
反応（クレノー断片、ベーリンガー社）により
3′末端標識した。 配列決定のため、標識した断片を２つの方法で
処理した。すなわち、あるものは第２の制限酵素
で開裂する前にポリアクリルアミドゲルで精製し
た。他のものは第２の制限酵素で直ちに開裂し
た。両者の場合、所望の断片をポリアクリルアミ
ドゲル上でトリス硼酸塩−EDTA緩衝液にて分
離した。第３図は種々の制限断片（円および正方
形はそれぞれ3′または5′標識を示し、矢印は配列
決定の方向を示す）および使用した配列決定法を
示している。酵素Acc Ｉ、Apa、Ava Ｉ、
Bg1 II、Bst EI、Dde Ｉ、Eco RI、Eco
RV、Fnn4HI、Hae II、Hinc II、Hpa Ｉ、
Hph Ｉ、Kpn Ｉ、Msp Ｉ、Nae Ｉ、Nru
Ｉ、Pvu Ｉ、Pvu II、Sac Ｉ、Sma Ｉ、
Sph ＩおよびTaqについては制限部位が見られ
なかつた。 これら断片をエー・エム・マキサムおよびダブ
リユー・ギルバート（上記）の方法に従つて分解
した。生成物を、種々の濃度および長さのポリア
クリルアミドゲルで50ｍＭトリス硼酸塩とImM
EDTA（PH8.3）にて900V〜2000Vを用いて分画し
た。このようにして得られた複合ヌクレオチド配
列およびその対応アミノ酸配列を第４図に示す。 hIL2−０に関し第４図に示したDNA配列は、
GC末端から−９〜−14の位置にポリアデニル化
信号AATAAAを有する。これは停止信号で終端
する133個のアミノ酸を暗号化するオープン読み
枠を有する。hIL2の分子量に基づきかつ天然
hIL2がグリコシル化されていると仮定して、成
熟hIL2は100〜130個のアミノ酸を有するであろ
うと予想した。従つて、挿入hIL2−０は成熟
hIL2に対する完全暗号化配列を含むと信じられ
るが、プレhIL2の推定シグナル配列およびこの
シグナル配列のATG開始信号のアミノ酸に対す
る暗号化領域の少なくとも１部を喪失していると
思われる。*ここでも、これらの喪失アミノ酸を暗
号化するクローンを前記と同様に選択し、或いは
作成することができる。例えば、第４図におい
て、この部分はゲノムクローン（下線）からの配
列情報によつて供給される。しかしながら、この
配列は、これにより形質転換された宿主における
hIL2様ポリペプチドの合成を可能にする。 ＊ 推定信号ペプチドは第４図における矢印で示
されるようにSerとAlaとの間で成熟hIL2から
開裂されると思われる。 この配列は、塩基置換、欠損、挿入または逆転
を含む、単数もしくは複数の突然変異のような遺
伝子に対する改変がまだこの遺伝子に生じていな
いか、或いはこのような改変によつてさらにこの
遺伝子の性質またはこの遺伝子から発現されるポ
リペプチドの性質を改変させ得ないという可能性
を排除するものではない。さらに、生理学的に同
じであるが、構造的には第４図に示したものと若
干異なる遺伝子またはポリペプチドをもたらすよ
うな任意の多形性を排除するものでもない。 もちろん、常法によりポリA+RNAから得られ
たクローン化cDNA（上記）は5′末端ヌクレオチ
ドを欠如していても、また人工的配列を含んでい
てもよいことを了解すべきである〔アール・ア
イ・リチヤード等、「鶏の成体のβ−グロビン
cDNAの分子クローン化および配列分析」、ヌク
レイツク・アシツド・リサーチ、第７巻、第1137
−46頁（1979）〕。 さらに、真核生物mRNAにおいて、5′末端か
ら最初のAUGトリプレツトは、一般に蛋白質合
成のための開始部位である〔エム・コザツク、
「メツセンジヤーRNAにおける開始領域を真核細
胞リボソームはどのように選択するか」、セル誌、
第15巻、第1109−25頁（1978）〕。 もちろん、第４図に示したポリペプチドの構造
は、生体内における酵素との相互作用、たとえば
グリコシル化によつてもたらされるポリペプチド
に対する何らの改変をも考慮に入れていない。従
つて、第４図に示したアミノ酸配列は、生体内で
生成されるIL2とは同一でないこともあると理解
せねばならない。 IL2を暗号化する染色体遺伝子の同定 HaeおよびAlu Ｉで部分開裂により生成さ
れかつEco RIリンカーによつてλシヤロン4A
アームに結合された胎児ひと染色体DNAの断片
から得られるハイブリツドフアージは、アール・
エム・ローン等によつて作成された〔セル誌、第
15巻、第1157−74頁（1978）〕。同様に、Mbo
Ｉでの部分開裂により生成されるひと染色体
DNA断片を、λ47のBamH Ｉ部位にクローン
化させた〔ダブリユー・エー・エム・レーネンお
よびダブリユー・ジエー・ブランマー、ジーン
誌、第20巻、第249−59頁（1980）；ジエー・デラ
マータ、私的通信〕。両遺伝子は前記のように
pSV−hIL2−０の 32P−標識Hinf Ｉ断片をプ
ローブとして使用する（インサイチユ（in
situ））方法によつて選別した〔タブリユー・デ
ー・ベントンおよびアール・ダブリユー・デビ
ス、サイエンス誌、第196巻、第180−82頁
（1977）；テイー・マニアチス等、セル誌、第15
巻、第687−701頁（1978）〕。 ローン遺伝子の1300000個のプラークから２個
およびレーネン遺伝子の700000個のプラークから
３個のハイブリダイゼーシヨン陽性フアージクロ
ーンを単離した。これらプラークを繰返し精製し
て、これらをそれぞれλCH4A−ghIL2−１、
λCH4A−ghIL2−２並びにλL47−ghIL2−１、
λL47−ghIL2−２およびλL47−ghIL2−３と命名
した。 第６図は、全hIL2遺伝子を有するプラーク
λCH4A−ghIL2−１の部分制限地図を示してい
る。さらに、この遺伝子をpUR250において、そ
れぞれ2.7kbおよび3.8kbの２つのEco RI断片と
してサブクローン化した〔ユー・ルター、「pUR
は挿入物DNAストランドの迅速な化学的開裂決
定を可能にする」、ヌクレイツク・アシツド・リ
サーチ、第10巻、第5765−72頁（1981）〕。制限分
析およびハイブリダイゼーシヨンのデータに基づ
き、pUR−ghIL2−１／2700bp RI−RIはhIL2の
信号配列とプロモーター領域とを含有することが
確認された。このプラスミドおよびpUR−ghIL2
−１／3800bp RI−RIの制限分析はさらに、
hIL2暗号化領域には４個のエクソンと３個のイ
ントロンとが存在することを示唆した。 IL2活性を暗号化する染色体遺伝子は細菌宿主
において発現できないこともあることを了解すべ
きである。何故なら、これらの介入配列はこの種
の宿主によつて正確に処理されないことがあるか
らである。染色体遺伝子は真核細胞宿主における
IL2の生産において極めて有用であると思われ、
この場合ひと非暗号化領域イントロンおよび暗号
化領域は、高レベルの現および生物学的活性な
IL2への生産物の正確な処理に対し極めて重要で
ある。 本発明により生産されるIL2活性を示すポリペプ
チドの収率および活性の向上 蛋白質の生産レベルは３つの主要な因子により
支配される：すなわち、細胞内の遺伝子のコピー
数、これら遺伝子コピーが転写される効率および
これらが翻訳される効率である。転写および翻訳
（これらは一緒になつて発現を構成する）の効率
はヌクレオチド配列、一般には所望の暗号化配列
の前方に位置する配列に依存する。これらのヌク
レオチド配列または発現制御配列は、特に、
RNAポリメラーゼが反応して転写を開始する位
置（プロモーター配列）と、リボソームが
mRNA（転写の生成物）と結合かつ反応して翻訳
を開始する位置とを規定する。必ずしも全てのこ
の種の発現制御配列が同等な効率を有するとは限
らない。従つて、所望の蛋白質に対する特定暗号
化配列を隣接するヌクレオチド配列から分離し
て、これらを他の公知の発現制御配列へ融合さ
せ、より高レベルの発現を得ることが有利であ
る。これが達成された後、新たに作成された
DNA断片をより多数のコピープラスミド中へ、
またはバクテリオフアージ誘導体中へ挿入して、
細胞内の遺伝子コピー数を増加させ、かつそれに
より発現蛋白質の収率をさらに向上させることが
できる。 上記のように数種の発現制御配列を使用するこ
とができる。これらはイー・コリの乳糖オペロン
（「lac系」）のオペレーター、プロモーターおよび
リボソーム結合および相互反応配列（例えばシヤ
イン−ダルガルノ配列のような配列を含む）、イ
ー・コリのトリプトフアンシンセターゼ系（「trp
系」）の対応する配列、フアージλの主オペレー
ターおよびプロモーター領域（上記したような
ULPLおよびURPR）、繊維状の一本鎖DNAフアー
ジの制御領域、または真核もしくは原核細胞およ
びそのウイルスの遺伝子の発現を制御するその他
の配列、またはそれらの組合せを包含する。従つ
て、適当な宿主における特定ポリペプチドの生産
を向上させるには、このポリペプチドを暗号化す
る遺伝子を上記のように作成し、かつこれをその
発現制御配列に近接して、または上記の改善発現
制御配列の１種の制御下で組み換えDNA分子中
に挿入する。この種の方法は当業界で公知であ
る。 翻訳の効率を向上させる他の方法は、化学的ま
たは酵素的に調製したオリゴヌクレオチドを開始
コドンの前方に挿入することを含む。この方法に
より、一層最適なメツセンジヤーRNAの１次お
よび２次構造を得ることができる。さらに詳細に
は、開始AUGコドンが容易に認識され得る位置
（すなわち２次構造により遮蔽されていない）に
おいてヘアピンの頂部に生ずるか、または他の一
本鎖領域に生ずるように配列を設計することがで
きる。さらに、上記シヤイン−ダルガルノ断片の
位置および配列も同様に最適化することができ
る。メツセンジヤーRNAの一般的構造（折畳み）
の重要性が示されている〔デイー・イセレンタン
トおよびダブリユー・フアイエルス、「mRNAの
２次構造および翻訳開始の効率」、ジーン誌、第
９巻、第１〜12頁（1980）〕。 所望生産物の細胞収率の増加は、細胞内で利用
し得る遺伝子数の増加に依存する。これは、IL2
遺伝子をその転写および翻訳制御要素を用いて、
または用いずに高コピー数プラスミドへ、または
温度制御されたコピー数プラスミド（すなわち、
プラスミドのコピー数が温度の上昇変化の後に増
大する〔ビー・ウーリン等、「クローン遺伝子お
よびその生産物の増大に対する温度依存性コピー
数を有するプラスミド」、ジーン誌、第６巻、第
91−106頁（1979）〕ように突然変異したプラスミ
ド）へ挿入することにより達成される。 或いは、遺伝子量の増加は、たとえば上記のよ
うに作成された組み換えDNA分子を特に簡単に
は制限酵素でのプラスミドの切断によつて溶原性
バクテリオフアージλ中へ挿入して線状分子を生
成させ、次いでこれを制御フアージλクローン化
ベヒクルと混合することにより達成され〔例え
ば、エヌ・イー・ムレー等、「in vitro組み換え
体の回収を簡単にするフアージλ」、モレキユラ
ー・ゼネラル・ジエネテイツクス、第150巻、第
53−61頁（1977）およびエヌ・イー・ムレー等、
「バクテリオフアージT4からのDNAリガーゼ遺
伝子の分子クローン化」、ジヤーナル・モレキユ
ラー・バイオロジー、第132巻、第493−505頁
（1979）〕、そして組み換えDNA分子をDNAリガ
ーゼと共に培養して生成させる。次いで、所望の
組み換えフアージを前記と同様に選択し、かつこ
れを使用してイー・コリの宿主菌株を溶原化させ
る。 従つて、本発明に用いられる挿入DNAは
SV529プラスミドから取り出して、これを前記と
同様に他の発現ベクター中へ挿入し、これらベク
ターを種々の宿主で前記と同様に使用してILを
暗号化する遺伝子の発現を向上させ得ることを了
解すべきである。 本発明により生成されるIL2様ポリペプチドの
生物学的活性はさらに、本発明のDNA配列を哺
乳動物の細胞系に適用して形質転換させ、遺伝子
をこれらの系で発現させることにより改善され得
る。この種の哺乳動物系は公知である〔例えば、
ピー・ジエー・サウザーンおよびピー・ベルク、
ジヤーナル、モレキユラー・アプライド、ジエネ
テイツクス、第１巻、第327−41（1982）；エス・
サブラマニ等、モレキユラー・セル・バイオロジ
ー、第１巻、第854−64頁（1981）；アール・ジエ
ー・カウフマンおよびピー・エー・シヤープ、モ
レキユラー・セル・バイオロジー、（出版中）〕。
好適な系は、遺伝子発現をメトトレキセート
（MTX）により増大させ得るCHO（チヤイニー
ズ・ハムスター・オバリー）（DHFR-）細胞系
である。これらの発現系は、グリコシル化蛋白質
の生成を可能にする。 IL2活性を示すポリペプチド（本発明により作
成）は、融合蛋白質（例えば分泌を行う原核もし
くは真核Ｎ−末端断片へ結合したもの）の形態、
プロインターロイキン２（例えば分泌の際、開裂
し得るインターロイキン２の配列の全部または１
部で出発する）の形態、または成熟インターロイ
キン２（発現および分泌の際の初期メチオニンを
含む異質アミノ酸の開裂による）として、または
ｆ−met−IL2として調製され得る。本発明にお
いて特に有用なポリペプチドは、アミノ末端に結
合した容易に開裂し得るアミノ酸もしくは一連の
アミノ酸が付加された成熟インターロイキン２で
ある。この構造は、成熟インターロイキン２に存
在しない開始信号を必要とするような宿主におけ
る蛋白質の合成を可能にし、次いで余分のアミノ
酸を開裂して成熟インターロイキン２を生産する
ことを可能にする。 これら種々異なる形態のポリペプチドの収率
は、上記方法のいずれかまたは組み合わせによつ
て改善することができる。さらに、本発明の
DNA配列に使用したコドン１群または全部に対
し、種々異なるコドンを置換することもできる。
これらの置換コドンは、交換されたコドンにより
暗号化されるものと同一のアミノ酸を暗号化する
ことができ、しかもポリペプチドの高収率をもた
らす。或いは、アミノ酸置換、またはより長いも
しくはより短いIL2関連ポリペプチドをもたらす
コドンの１つの置換または組み合わせも、一般に
その性質を変化させる（例えば、安定性を増大さ
せ、溶解度を増大させ、免疫治療活性を増大さ
せ、長期のＴ細胞の増殖活性を増大させる）。 最後に本発明の組み換えDNA分子を用いて生
産されたポリペプチドの活性は、周知手段により
本発明の範囲を逸脱することなく、本発明の
DNA配列もしくはポリペプチドを断片化し、改
変し、または誘導化することにより改善すること
もできる。例えば、他のインターフエロンとのハ
イブリツドを遺伝子レベルで作成して適当な宿主
で発現させることもでき、或いは化学合成法で蛋
白質レベルで作成することもできる。 ここに記載した方法で調製された微生物および
組み換えDNA分子は、1983年２月８日付けで西
ドイツ国、ゲツチンゲン在、ドイツチエ・ザンム
ルング・フオン・ミクロオルガニズムの培養物コ
レクシヨンに寄託した培養物で例示される： hIL2−Ａ：E.coli HB101 （pSV−hIL2−０） hIL2−Ｂ：E.coli HB101 （pSV−hIL2−１） これら培養物は、それぞれ寄託番号DSM2595
および2596が付与されている。 さらに、ここに記載した方法で作成された微生
物および組み換えDNA分子を、1983年４月18日
付けでメリーランド州、ロツクビル在のアメリカ
ン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨンの培養物
コレクシヨンに寄託した： hIL2−Ｃ：E.coli k514λ （pTrp−hIL201） hIL2−Ｄ：E.coli K12RRIΔM15 （λCH4A−ghIL2−１／2700bp RI−RI） hIL2−Ｅ：E.coli K12RRIΔM15 （λCH4A−ghIL2−１／3800bp RI−RI） これら培養物には、それぞれATCC39338、
39339および39340の寄託番号が付与された。 以上、本発明に関連する多数の実施態様につき
説明したが、この基本構成を改変した方法および
構成を利用する他の実施態様を与えることもでき
る。したがつて、本発明の範囲は上記の実施態様
のみに限定されない。 本発明のDNA配列は、5′未端付近にATGGCG
…の塩基配列を有する。このように、Ｎ末端から
２番目のAlaに対するコドンがGCGであるDNA
配列を利用すると、高効率でヒトインターロイキ
ン２（ヒトIL2）が生産され得る。これに対して、
本発明と同一のアミノ酸をコードするDNA配列
であつても塩基の種類が異なる場合には、このよ
うな効果が得られないことがある。例えば、上記
ATGGCＧ…の配列を有する本発明のDNA配列
［Ala2（GCG）型DNAとする］を有する発現ベク
ターと、２番目のAlaに対する塩基が１ケ所にお
いて異なる、ATGGCＡ…の配列を有するDNA
配列［Ala2（GCA）DNAとする］を有する発現
ベクターとを用いてヒトIL2の産生量を比較し
た。これらの発現ベクターで、大腸菌（E.coli）
Ｋ−12株由来のC600株を形質転換後、これらの
株のヒトIL2の産生量を比較したところ、第表
に示す結果が得られた。第表において、発現率
は生産された総タンパクあたりのヒトIL2の割合
を、そして生産量は、培溶液１あたりのヒト
IL2の重量（ｇ）を示す。 【表】 【表】 率 生産量
菌 株 OD６５０ pH (％) (g／L)
チドを製造するためのDNA配列、組み換えDNA
分子および製造方法に関するものである。さらに
詳細には、本発明はDNA配列および適当な宿主
生物におけるその発現に関するものである。ここ
に記載する組み換えDNA分子は、ひとインター
ロイキン２の免疫学的もしくは生物学的活性を有
するポリペプチドを暗号化するDNA配列を特徴
とする。以下の開示から明らかとなるように、本
発明のDNA配列、組み換えDNA分子および方法
は、各種の医薬およびその他の有益な産業用途に
使用し得るポリペプチドの生産に使用することが
できる。 （従来の技術） インターロイキン２（「IL2」）はリンホカイン
である。リンホカインは、マイトジエンによる刺
激に際しリンパ球で合成される生産物である。こ
れらは可溶性の免疫反応調節因子である。多数の
リンホカインは、その医薬用途および実験室用途
に重要である。例えば、免疫インターフエロン
（IFN−γ）は抗ウイルス、抗癌および免疫調節
活性を有するリンホカインである〔例えば、アー
ル・デボス等、ヌクレイツク・アシツド・リサー
チ、第10巻、第2487−501頁（1982）〕。 インターロイキン２は、重要かつ有用な生物学
的性質を有するリンホカインである〔ギリス等、
イムノロジカル・レビユー、第63巻、第166−209
頁（1982）〕。例えば、IL2は、(a)in vitro（試験管
内）において抗原特異性の効果Ｔ−細胞の長期増
殖を刺激し、(b)胸腺細胞の有糸分裂を促進し、か
つ(c)細胞障害性Ｔ−細胞の反応性およびヌードマ
ウス脾細胞の培養物におけるプラーク形成反応を
誘発する〔ギリスおよびワトソン、ジヤーナル・
エキスペリメンタル・メデイスン、第152巻、第
1709〜19頁（1980）；ジエー・ジエー・フアラー
等、イムノロジカル・レビユー、第63巻、第129
〜65頁（1982）〕。 生物学的性質の結果、インターロイキン２を使
用して、免疫系が阻害された癌患者におけるひと
白血球抗原の制限された腫瘍特異性の細胞障害性
細胞の補給を、例えば胸腺刺激によつて刺激する
ことができる。従つて、IL2による治療は、各種
の細菌およびその他の感染に対しこれらの患者の
耐性を増大させる。しばしば、これらの感染は癌
治療、特に照射および薬剤治療を複雑化させる。 さらに、免疫系を刺激するIL2の能力は、免疫
系の機能障害に関連する病気、例えばエイズ
（AIDS）、狼瘡、多発性硬化症および関節リユー
マチ症の治療に有用である。公表された臨床学的
研究は、これらの病気とＴ−リンパ球における異
常性または異常抗体の生成との間の関係を示して
いる。例えば、in vitroの研究が示唆するところ
では、免疫系の少なくとも幾つかの機能は、IL2
の投与によつてエイズ患者を回復させることがで
きる。さらに、in vitroの研究が示すところで
は、低レベルIL2は、免疫のこれら病気の幾つか
に関連する異常抗体の生成に関係する。 さらに、公表された研究によれば、IL2は広範
囲の癌の治療に有用であると信じられる。さら
に、固体腫瘍、例えば肺癌、結腸−大腸癌および
乳癌を治療するための補助治療として特に有用で
ある。また、IL2は単独でまたは補助治療剤と共
に陰部疱疹およびその他のウイルス病を治療する
のにも有用である。 さらに、インターフエロンの抗癌活性がIL−
２により高められ、かつIL2を必要とさえするこ
とが示されている。何故なら、IL2はインターフ
エロンの抗癌活性における主原因であると考えら
れる「ナチユラルキラー」細胞の全活性を刺激す
るからである〔シー・エス・ヘニー、ネイチヤー
誌、第291巻、第335〜38頁（1981）〕。また、IL2
は幾種かの免疫病、例えば多発性硬化症の特徴で
あるサプレツサー細胞の欠乏を防止するにも有用
である。 最後に、IL2は診断および治療目的でＴ細胞の
培養物の確立および長期増殖についても使用され
る。例えば、同型細胞障害性Ｔ細胞の選択を可能
にするため、現在では癌細胞が使用されている。
これらのＴ細胞をin vitroで培養し、患者に注射
して腫瘍を後退させる。 生化学的レベルにおいて、IL2は約15000ダル
トンの分子量を有しかつグリコシル化されている
と信じられる。グリコシル化されていると仮定す
れば、これは100乃至130個のアミノ酸を有するは
ずである。IL2はカラム上で若干異質的に挙動す
る。SDSゲルにおいて、恐らくサブユニツトであ
る２つのバンド（12000および13000ダルトン）が
観察される〔ジエー・ダブリユー・マイケルおよ
びアール・シー・ガロ、プロシーデイング・ナシ
ヨナル・アカデミー・サイエンス、USA、第77
巻、第6134−38頁、（1980）〕。さらに、IL2は１
種より多い化合物である。これは白血球インター
フエロン（IFN−α）と同様に、種々なレベルの
免疫治療活性を示す１群の生産物である。また、
IL2は多形質でもある。例えば、特定個体の細胞
はより一般的なIL2分類内のIL2種類を生産する
ことができ、これら種類はそれが属する分類の原
型と生理学的に類似しているが、構造的に若干異
なつている。 リンホカインの１種であるIFN−γは、遺伝子
工学の応用によつて多量に生産されている〔アー
ル・デボス等、上記〕。IL2はこの方法では生産
されていない。 しかしながら、IL2の多くの重要な免疫治療活
性のため、並びに診断および治療目的に対するＴ
細胞の確立および長期増殖におけるその必要用途
のため、IL2の大規模生産に関し種々の方法およ
び手段が研究されているが、まだ成功を収めたも
のはない。 （発明の構成） 本発明は、IL2を暗号化するDNA配列を位置
決定しかつ同定し、これら配列によつて適当な宿
主を形質転換させ、それによりひとインターロイ
キン２の免疫学的もしくは生物学的活性を示すポ
リペプチドの生産に使用するDNA配列、組み換
えDNA分子およびその使用方法を提供しており、
そのことにより、上記問題を解決する。 本発明のDNA配列は、次式で示される：
ATGGCGCCTACTTCAAGTTCTACAAAGA
ＡＡＡＣＡＣＡＧＣＴＡＣＡＡＣＴＧＧＡＧＣＡＴＴＴ
ＡＣＴ
ＧＣＴＧＧＡＴＴＴＡＣＡＧＡＴＧＡＴＴＴＴＧＡＡＴ
ＧＧ
ＡＡＴＴＡＡＴＡＡＴＴＡＣＡＡＧＡＡＴＣＣＣＡＡＡ
ＣＴ
ＣＡＣＣＡＧＧＡＴＧＣＴＣＡＣＡＴＴＴＡＡＧＴＴＴ
ＴＡＣ
ＡＴＧＣＣＣＡＡＧＡＡＧＧＣＣＡＣＡＧＡＡＣＴＧＡ
ＡＡＣ
ＡＴＣＴＴＣＡＧＴＧＴＣＴＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＴ
ＣＡＡ
ＡＣＣＴＣＴＧＧＡＧＧＡＡＧＴＧＣＴＡＡＡＴＴＴＡ
ＧＣＴ
ＣＡＡＡＧＣＡＡＡＡＡＣＴＴＴＣＡＣＴＴＡＡＧＡＣ
ＣＣＡ
ＧＧＧＡＣＴＴＡＡＴＣＡＧＣＡＡＴＡＴＣＡＡＣＧＴ
ＡＡＴ
ＡＧＴＴＣＴＧＧＡＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＴＣＴＧＡＡ
ＡＣＡ
ＡＣＡＴＴＣＡＴＧＴＧＴＧＡＡＴＡＴＧＣＴＧＡＴＧ
ＡＧ
ＡＣＡＧＣＡＡＣＣＡＴＴＧＴＡＧＡＡＴＴＴＣＴＧＡ
ＡＣＡ
ＧＡＴＧＧＡＴＴＡＣＣＴＴＴＴＧＴＣＡＡＡＧＣＡＴ
ＣＡＴ
ＣＴＣＡＡＣＡＣＴＧＡＣＴ。 本発明の発現ベクターはTrpプロモーターの下
流に上記DNA配列が発現可能に結合している。 本発明の形質転換大腸菌は、上記発現ベクター
を含有する。 本発明によれば、免疫治療剤および方法並びに
Ｔ細胞の確立および長期増殖に使用するための、
IL2の免疫学的もしくは生物学的活性を示すポリ
ペプチドを得ることができる。本発明は、これら
ポリペプチドを従来不可能であつた量および方法
で製造し得る。 以下の開示から明らかなように、本発明の
DNA配列および組み換えDNA分子は、IL2の免
疫学的もしくは生物学的活性を示すポリペプチド
を、適当な宿主中で発現させることにより産生す
ることができる。さらに、適当な宿主におけるこ
れらDNA配列および組み換え、DNA分子の複組
は、これらポリペプチドを暗号化する遺伝子を多
量に製造することを可能にする。これらポリペプ
チドおよび遺伝子の分子構造および性質は、容易
に決定することができる。ポリペプチドおよび遺
伝子は、宿主中で生産されたままで或いは適当に
誘導または修飾した後に、これら生産物自身の生
成を検出しかつ改善するための組成物および方
法、免疫治療剤および方法に使用するための組成
物および方法、並びにＴ細胞の確立および長期増
殖ための組成物および方法に使用するのに有用で
ある。 上記から判るように、本発明の基本点は、
DNA組み換え技術を用いてIL2の免疫学的もし
くは生物学的活性を示すポリペプチドを暗号化す
ることを特徴とするDNA配列を提供することで
あり、あるいはDNA配列の集団からこの種の配
列を少なくとも選択し得ることであり、これら
DNA配列はDNA挿入物hIL2−０、hIL2−１、
前記DNA挿入物のいずれかにハイブリツト形成
しかつIL2を暗号化するDNA配列、および前記
DNA配列のいずれかにより暗号化されたポリペ
プチドを暗号化するDNA配列よりなる群から選
択される。本発明の配列はさらに、宿主において
IL2およびIL2様ポリペプチドの生産を可能にす
ることを特徴とする。 本発明を一層よく理解し得るよう以下詳細に説
明する。 以下の説明において次の用語を使用する： ヌクレオチド：糖成分（ペントース）とリン酸と
含窒素複素環塩基とよりなるDNAもしくは
RNAのモノマー単位。この塩基はグリコシド
炭素（ペントースの1′炭素）を介して糖成分に
結合される。塩基と糖との組合せをヌクレオシ
ドと呼ぶ。各ヌクレオチドは塩基により特徴づ
けられる。４種のDNA塩基はアデニン
（「Ａ」）、グアニン（「Ｇ」）、シトシン（「Ｃ」）
、
およびチミン（「Ｔ」）である。４種のRNA塩
基は、Ａ、Ｇ、Ｃおよびウラシル（「Ｕ」）であ
る。 DNA配列：リン酸ペントースと3′炭素と5′炭素
との間でホスホジエステル結合により互いに結
合されたヌクレオチドの線状列。 コドン：mRNAを介してアミノ酸、翻訳開始信
号または翻訳停止信号を暗号化する３個のヌク
レオチド（トリプレツト）のDNA配列。例え
ば、ヌクレオチドトリプレツトTTA、TTG、
CTT、CTC、CTAおよびCTGはアミノ酸ロ
イシン（「Leu」）を暗号化し、TAG、TAAお
よびTGAは翻訳停止信号であり、また、ATG
は翻訳開始信号である。 読枠：mRNAをアミノ酸配列まで翻訳する際の
コドンのグループ化。翻訳の際、適正な読枠を
維持しなければならない。例えば、配列
GCTGGTTGTAAGは３つの読枠もしくは相
で翻訳することができる。これら相のそれぞれ
は次の異なるアミノ酸配列を与える：GCT GGT TGT AAG−−Ala−Gly−
Cys−Lys Ｇ CTG GTT GTA AG−−Leu−Val
−Val GC TGG TTG TAA Ｇ−−Trp−Leu
−（停止） ポリペプチド：隣接アミノ酸のα−アミノ基とカ
ルボキシ基との間でペプチド結合により互いに
接続されたアミノ酸の線状列。 ゲノム：細胞またはウイルスの全DNA。これは
特に物質のポリペプチドを暗号化する構造遺伝
子、ならびにオペレーター、プロモーターおよ
びリボソームの結合および相互作用配列を包含
し、例えばシヤイン−ダルガルノ配列のような
配列をも含む。 遺伝子：鋳型またはメツセンジヤーRNA
（「mRNA」）を介して特定のポリペプチドに固
有のアミノ酸の配列を暗号化するDNA配列。 転写：遺伝子からmRNAを生産する過程。 翻訳：mRNAからポリペプチドを生産する過程。 発現：遺伝子もしくはDNA配列によりポリペプ
チドを生産するために受ける過程。これは転写
と翻訳との組合せである。 プラスミド：プラスミドが宿主細胞で複製される
ような完全「レプリコン」からなる非染色体性
二本鎖DNA配列。プラスミドを単細胞生物内
に挿入すると、この生物の特性はプラスミドの
DNAの結果として変化し、或いは形質転換す
ることができる。例えば、テトラサイクリン耐
性（TetR）に対する遺伝子を有するプラスミ
ドは、あらかじめテトラサイクリンに対し感受
性の細胞をテトラサイクリンに対し耐性の細胞
まで形質転換することができる。プラスミドに
より形質転換された細胞を「形質転換体」と呼
ぶ。 フアージまたはバクテリオフアージ：細菌性ウイ
ルスであつて、その多くは蛋白質エンベロープ
またはコート（「カプシド」）にカプセル化され
たDNA配列よりなつている。 クローン化ベヒクル：宿主細胞において複製しう
るプラスミド、フアージDNAまたはその他の
DNA配列であつて、これはDNAの本質的な生
物学的機能、たとえば複製、コート蛋白質の生
成の喪失を伴わずに、或いはプロモーターもし
くは結合部位の喪失を伴わずに決定可能に前詰
記DNA配列を切断することができる１個もし
くは少数のエンドヌクレアーゼ認識部位により
特徴づけられ、かつ形質転換細胞の同定に使用
するのに適する標識、たとえばテトラサイクリ
ン耐性またはアンピシリン耐性を有する。クロ
ーン化ベヒクルはしばしばベクターと呼ばれ
る。 クローン化：１種の生物もしくはDNA配列から
誘導される生物またはDNA配列の集落を無性
繁殖によつて得る過程。 組み換えDNA分子またはハイブリツドDNA：生
細胞の外部で端部結合された異なるゲノム由来
のDNA断片よりなり、かつ有る種の宿主細胞
に感染してそこに維持される能力を有する分
子。 発現制御配列：DNA配列もしくは遺伝子の発現
を、これら配列に作用可能に結合された際、制
御かつ調節するヌクレオチドの配列。これらは
1ac系、trp系、フアージλの主オペレーターお
よびプロモーター領域、fdコート蛋白質の制御
領域、ならびに原核もしくは真核細胞およびそ
のウイルスの遺伝子の発現を制御することが知
られたその他の配列またはそれらの組合せを包
含する。 IL2（様）：IL2の免疫学的もしくは生物学的活性
を示すポリペプチド。このポリペプチドは、原
IL2のアミノ酸の他にさらにアミノ酸を含み、
あるいは原IL2のアミノ酸の全部を含まないこ
ともできる。 インターロイキン２の生物学的分析 (a) 原理 インターロイキン２（IL2）またはＴ−細胞
増殖因子は可溶性化合物であつて、マイトジエ
ンまたは抗原刺激されたＴ細胞のクローン化誘
導体の長期培養を可能にする〔デイー・エー・
モルガン等、サイエンス誌、第193巻、第1007
−08頁（1976）〕。これら細胞の成長および増殖
は、投与量に応じて（dose−dependent）培地
中のIL2の存在に依存する。従つて、増殖量の
測定（すなわち、トリチウム標識チミジンの取
り込み量による）は、培地中のIL2の濃度を示
す。 (b) 目的細胞 「リンホプレプ」（フアルマシア社）により
ひとの末梢血液から単核細胞細を単離し、これ
ら細胞（中間層）を２回洗浄し、そしてこれら
を５×105細胞／mlの濃度にてRPMI1640培地
で培養し、この培地には１％Ｌ−グルタミンと
抗生物質（下記参照）と10％ウシ殆児血清とを
補充した。次いで、これら細胞10μｇ／mlまで
のフイトヘマグルチニン（PHA）（ウエルカム
社）により37℃で20時間刺激し、細胞を集めて
激しく洗浄し、そしてこれらをPHAを含まな
い培地中でさらに３日間培養した。４日目に、
これら細胞に対し、部分精製したひとIL2調製
物（PHA刺激した脾細胞の培地から得られた
50〜80％の（NH4）2SO4沈澱物を初期容量の1/
２０に再溶解し、かつリン酸緩衝生理食塩水に対
し徹底的に透析したもの〔モルガン等、上記〕）
の５％を補給した。次いで、これら細胞を３〜
４日毎に１：２の割合で分割した。 培養物を約２〜３週間置いた後、これらから
の生存細胞を洗浄し、かつこれら細胞を40％ウ
シ胎児血清と10％ジメチルスルホキシドとを含
有するIL2を含まない培地中で２×107細胞／ml
の最終濃度まで培養した。その直後に、細胞を
１mlのガラス瓶中で、速度調節フリーザー（ク
リオソン社）を用いて１℃／minの冷却速度で
−45℃まで凍結させ、次いで急速に−80℃まで
凍結させた。これら目的の細胞を液体窒素中で
保存した〔グラマツキ等、ジヤーナル・イムノ
ロジカル・メソツド、第53巻、第209〜20頁
（1982）〕〕。これら細胞を使用する直前に、これ
らを37℃にて迅速に解凍し、これらを培地と段
階的に混合し、そして洗浄した。調製した細胞
の生存度をチロール青排除によつて検査した。 (C) 微量分析 ギリス等、ジヤーナル・イムノロジー、第
120巻、第2027〜32頁（1978）により記載され
たのと実質的に同様にIL2微量分析を行つた。
先ず、100μのIL2試料を96穴のマイクロタイ
タープレート（フアルコン社）中へ段階的に
１：２希釈した（RPM1640、10％ウシ胎児血
清、１％Ｌ−グルタミンおよび抗生物質、下記
参照）。次いで、目的細胞を２×105細胞／mlの
濃度で懸濁し、100μの細胞を穴へ約２×104
細胞／穴の最終濃度まで加えた。これらマイク
ロタイタープレートを空気中５％CO2の加温雰
囲気において37℃で24時間培養し、0.5μCiの
3H−標識したチミジン（アメルシヤム社、20
〜30Ci／ｍmole）を各マイクロタイタープレ
ートの穴へ加え、そして細胞をさらに５時間培
養した。次いで、培養物をガラスフイルターの
上へ回収し（セル−ハーベスター、MASH
型を用いる）、かつ液体シンチレーシヨンカウ
ンターによつて 3H−チミジン取込み量を測定
した。 (d) 定量 ひとIL2標準試料を用いて、各試験試料の相
対活性を決定した。この標準（任意に選択した
ひとIL2含有の上澄液）は100単位／mlを含有
するものと規定した。これは 3H−チミジン吸
収により測定して、１：４〜１：８の希釈率ま
で最大の増殖を誘発する。一般に、標準曲線の
直線的下降部分の中央において、この試料の最
大活性の30％が観察された。 さらに、一連の希釈物において各試料を試験
し、それらの力価をグラフ分析によつて計算し
た。次いで、各試料の活性を式〔サタドラー
等、ジヤーナル・イムノロジー、第128巻、第
1620〜24頁（1982）〕： 試験試料の標準に対する最大cpmの30％
における逆タイター／標準の最大cpmの30％における逆
タイター＝単位×100 を用いて単位に変換した。 ひとインターロイキン2mRNA（hil−mRNA）を
含有するポリ(A)RNAの調製 本発明の方法に使用したRNAは、マイトジエ
ン刺激したひとの脾細胞から抽出した。提供され
た脾細胞は、単一供与体から多量の免疫系細胞を
供給するという利点を有し、さらにひと未梢血液
リンパ球により生成される量よりも多い量でイン
ターロイキン２を生成するという利点を有する
〔エー・モレツタ等、クリニカル・エキスペリメ
ンタル・イムノロジー、第44巻、第262〜269頁
（1981）〕。 (a) ひと脾細胞の単離 外科部門から得られたひと脾臓を無菌プラス
チツク袋中に入れて実験室まで選び、実験室内
において無菌ガラス皿に移した。無菌解剖鋏に
よつて脾臓の外膜を除去し、５cm3の脾臓組織を
切除した。その組織をプラスチツクペトリ皿
（直径15cm）に入れ、さらに小さい片（0.5cm3ま
で）に切断した。約10mlのRPMI1640培地（ギ
ブコ社）（２ｇ／のNaHCO3と20ｍＭの
HEPESとを補充したもの）を添加した後、２
mlプラスチツク注射器の吸子（plunger）の端
部で組織断片を静かに砕いて細胞の大部分をほ
ぐした。次いで、この懸濁物を約50mlの
RPMI11640培地で希釈し、そして得られた懸
濁物を充分に混合した。次いで、組織および細
胞懸濁物を無菌金属篩（８×0.3mm／cm）に移
して、液体を他のプラスチツクペトリ皿に排液
した。次いで、この篩上の組織を元のプラスチ
ツク皿に戻し、そして前記と同様に砕きかつ濾
過した。最後に、全細胞懸濁物を0.5のプラ
スチツク管へ注ぎ入れた。この手順を全脾臓が
調整されるまで新規な脾臓片につき反復した。 プラスチツク管の底部に凝集して濃厚沈澱物
を形成した死細胞の大部分を、再び金属篩によ
る懸濁物の濾過によつて除去した。次いで、細
胞懸濁物をシリコーン処理した100mlの無菌円
錐ガラス遠沈管に移し、この管の底部または懸
濁物の表面に存在する凝集物を除去した。 次いで、室温にて900×ｇで10分間遠心分離
することにより細胞を集め、これら細胞を10倍
容量の冷トリス−NH4Cl（0.83％NH419部とト
リス−HCl1部との混合物、20.6ｇ／、PH7.2）
溶液に静かに懸濁させて赤血球を溶血させた。
４℃にて10分間後、底部に凝集した全ての死細
胞を除去し、白色細胞を集め、そして
RPMI1640培地で少なくとも２回洗浄した。次
いで、細胞を完全培地（0.03％Ｌ−グルタミン
と100U／mlペニシリンと100μｇ／mlのストレ
プトマイシンと25μｇ／mlのネオマイシンと５
×10-5Mのβ−メルカプトエタノールと10％ウ
シ胎児血清とを補充したRPMI1640培地）へ移
して２〜４×106細胞／mlの濃度にした。 (b) マイトジエンによるひと脾細胞の刺激 上記細胞懸濁物（５、１×1010細胞）を遠
心分離フラスコに移し、フイトヘマグルチニン
（「PHA」）（ウエルカム社）を10μｇ／mlの濃度
まで加え、或いは0.08％PHA−Ｐ（デイフコ
社）および10nｇ／mlの12−０テトラデカノイ
ルホルボール−13−アセテート（「TPA」）（ピ
ー・エル・バイオケミカルス社）を加えた。培
養物上方の雰囲気を５％CO2の気体混合物で飽
和した後、懸濁物を37℃で20時間ゆつくり撹拌
した。 次いで、上記と同様にIL2依存性のひと末梢
血液リンパ球による 3H標識チミジンの吸収を
測定して、IL2活性につき懸濁物を分析した。 (c) ポリA+RNAの単離および翻訳 PHA／TPA誘発された脾細胞を遠心分離に
より集め、これらを冷PBSで洗浄した。これ
らの誘発脾細胞から全RNAを単離するため、
これら細胞を直ちにチオシアン酸グアニジウム
の溶液で溶解させた〔ジエー・エム・チヤーグ
ウイン等、「リボヌクレアーゼの豊富な原料か
ら生物学上活性なリボ核酸の単離」、バイオケ
ミストリー、第18巻、第5294−99頁（1979）〕。
脾臓１個当り平均して30mgの全RNAを得た。
次いで、このRNAをグアニジウム塩酸塩溶液
からの沈澱によりかつオリゴ（dT）セルロー
ス上でのクロマトグラフイーによつて精製した
〔ジエー・エム・チヤーグウイン等、上記〕。こ
の段階で、約１mgのRNA（その内60％以上が
rRNAである）が残留した。 得られたポリA+RNAを滅菌水に溶解させ、
混合物を68℃にて１分間加熱し、そしてこれを
10ｍＭトリス−HCl（PH7.5）と１ｍＭ EDTA
とにおける５〜20％蔗糖密度勾配において分画
し、その際密度勾配当り１〜２mgのRNAとベ
ツクマンSW41型Tiローターでの４℃で
40000rpmの16時間にわたる遠心分離とを用い
た。25個のフラクシヨン（それぞれ0.4ml）を
ISCO密度分画装置に集め、光学密度（254nｍ）
を連続的に測定した。 RNAを通過させた約300μｇのオリゴ（dT）
セルロースの並行密度勾配における遠心分離の
後に、5Sおよび18SのrRNAピーク
（28SrRNAはチユーブの底に存在した）の高
さを測定することにより単離RNAの品質を分
析した。 各フラクシヨン中のRNAを−20℃にて少な
くとも２時間沈澱させ、遠心分離（10000rpm、
30分、−20℃、HB4ソルバール型モーター）に
よつて集め、70％エタノールで洗浄した。この
RNAを乾燥させた後、これを25〜50μの滅
菌水中に溶解させた。 ポリA+RNA蔗糖密度勾配フラクシヨンのそ
れぞれを小麦胚芽抽出物（全容量10μ）にお
いて 35S−メチオニンの存在下で翻訳し〔ビ
ー・ロバーツおよびビー・エム・パターソン、
「市販の小麦胚芽からの無細胞系における
TMV RNAおよびうさぎグロビン5S RNAの
効率的翻訳」、プロシーデイング・ナシヨナ
ル・アカデミー・サイエンス・USA、第70巻、
第2330〜34頁（1973）〕、そして合成された蛋白
質を12.5％のSDS−ポリアクリルアミドゲル上
で分析した〔ユー・ケー・ラメリ、「バクテリ
オフアージT4の頭部を組込む際の構造蛋白質
の開裂」、ネイチヤー誌、第227巻、第680〜85
頁（1970）〕。この方式における大型ポリペプチ
ドの合成は、ここで調製されたRNAフラクシ
ヨンがin vitroでの翻訳の抑制因子を含まない
RNAを含有したことを示した。蔗断密度勾配
7S〜18Sで沈降したポリA+RNAフラクシヨン
を分析して、このmRNAにより暗号化された
IL2の活性を決定した。この分析のため、50μ
のポリA+RNA（１mg／ml）をそれぞれ15〜
20個のアフリカツメガエル（Xenopus laevis）
の卵細胞で微量注入し、この卵細胞をHEPES
緩衝された改変バース溶液（MBS−Ｈ）中で
３日間培養した。この緩衝溶液は0.1％のポリ
エチレングリコールと0.4％のアプロチニン原
源（シグマ社）とを含有した。 次いで、培地を抜き取り、分泌された翻訳生
成物をそのIL2活性につき上記のように分析し
た。第１図は典型的な分析実験の結果を示すグ
ラフである。これらの結果が示すように、ひと
IL2活性を暗号化するmRNA種類は、約10〜
11Sの蔗糖密度勾配で沈降した。 さらに、マイトジエン誘発脾細胞から単離し
た蔗糖密度勾配分画ポリA+RNAの微量注入の
後に、アフリカツメガエルの卵細胞によるひと
IL2の分泌の動力学を検査した。ここで、卵細
胞培養培地におけるIL2の蓄積は少なくとも72
時間持続することが観察された。 この点において認識すべきことは、蔗糖密度勾
配から得られるポリA+RNA生成物でさえ極めて
多数の異なるmRNAを含有することである。
hIL2に対し特異的なmRNAを除き、他のmRNA
は望ましくない汚染物である。残念ながら、これ
らの汚染物RNAは、本発明のクローン化工程の
残りの工程においてずつとhIL2mRNAと同様に
挙動する。したがつて、ポリ(A)RNAにおけるそ
の存在は、IL2以外のポリペプチドを暗号化する
遺伝子を含有する多数の望ましくない細菌クロー
ンを最終的に生成する。この汚染は、所望のIL2
ハイブリツドクローンを単離する際に複雑なスク
リーニング問題を提起する。IL2の場合、スクリ
ーニング問題は、所望クローンの同定に対する。
スクリーニングプローブとして役立つような充分
精製されたIL2mRNAもしくはDNAまたはその
部分の試料が無いためさらに悪化する。したがつ
て、IL2クローンのスクリーニング工程は極めて
時間のかかる困難なものである。さらに、極めて
少割合のIL2クローンしか生物学的もしくは免疫
学的な活性型でIL2を発現しないと予想されるの
で、活性クローンの単離は「藁の中から針を探
す」ようなスクリーニング工程となる。 有利なことに、本発明は組み換えDNA技術の
使用してIL2mRNAもしくはcDNAまたはその一
部の精製プローブを生成させることができる。次
いで、その精製されたmRNAもしくはcDNAを
使用して、極めて多数の細菌クローンを迅速にス
クリーニングし、かつそれによりIL2を活性型で
発現するクローンを単離することができる。 hIL2cDNAを含有する二本鎖 cDNAの合成 hIL2mRNAの豊富なポリ(A)RNAを鋳型として
使用して相補的DNA（「cDNA」）を調製した。こ
れはバクテリオフアージMS2RNAのDNAコピ
ーを含有するプラスミドの作成につきデボス等に
より実質的に記載されている〔「バクテリオフア
ージMS2RNAのほぼ完全寸法のDNAコピーを
含有するプラスミドの作成および特性化」、ジヤ
ーナル・モレキユラー、バイオロジー、第128巻、
第595〜619頁（1979）〕。 30μｇのポリA+RNA（蔗糖密度勾配からの３つ
のフラクシヨン）を50μの50ｍＭトリスHC1
（PH8.3）と30ｍＭのβ−メルカプトエタノールと
50ｍＭのKClと10ｍＭのMgCl2とそれぞれ0.5ｍ
Ｍの４つのdNTPと10μｇのpT12-18と100μCiのα
−32P dATPと100μCiのα−32P dCTP（それぞ
れ2500Ci／モル）と４ｍＭのNa2P2O7と100単位
のAMV逆転写酵素との混合物において43℃で30
分間培養した。EDTAにより反応を停止させか
つフエノール抽出した後、この混合物をセフアデ
ツクス−G75カラムにかけた。排除（ボイド）フ
ラクシヨンにおける核酸をエタノールで−20℃に
て１晩沈澱させ、そしてこれらを遠心分離により
集めた。ペレツトを70％エタノールで洗浄し、乾
燥させ、40μの水に溶解させた。 上記で合成したcDNA試料は、実際には濃厚化
したポリA+mRNAに存在する異なるmRNAから
生じた複雑なcDNAの混合物である。さらに、
AMV逆転写酵素による早期停止のため、cDNA
の多くはポリA+RNAにおける各種mRNAの不
完全コピーである。 CDNAを二本鎖にする前に、上記水混合物を
100℃にて30秒間加熱することによりこれを相補
的鋳型mRNAに対する結合から切り離し、次い
で直ちに０℃で冷却した。3μｇの膵臓リボヌク
レアーゼと３単位のT1−リボヌクレアーゼとを
加え、そして混合物を37℃で30分間培養した。 Ｋ−ホスフエート（PH6.9）（最終濃度100ｍＭ）
とジチオスレイトール（４ｍＭ）とMgCl2（10ｍ
Ｍ）と4dNTP（それぞれ250μM）と50μCiα−
32PdATPと50μCiα−32PdCTP（それぞれ
2500Ci／モル）との混合物を加えて混合物を
100μに調整し、イー・コリDNAポリメラーゼ
Ｉ（ビオラブ社、100単位）を加えかつ得られた混
合物を15℃にて３時間培養することにより、
cDNA鎖を二本鎖にした。反応をEDTAにより
停止させ、混合物をフエノール処理し、セフアデ
ツクス−G75カラムに通し、そして排除（ボイ
ド）フラクシヨンを前記と同様にエタノールによ
つて−20℃で一晩沈澱させた。 二本鎖cDNA構造に残存する一本鎖のヘアピン
ループを開裂させるため、遠心分離によりDNA
を除去し、ペレツトを乾燥し、そしてこれを再び
水に溶解し、混合物を0.2MのNaClと50ｍＭの
NaOAc（PH4.5）と１ｍＭのZnCl2と10単位のSIヌ
クレアーゼ（シグマ社）との100ml中で37℃にて
30分間培養した。混合物をフエノール／CHCl3／
イソアミルアルコールで抽出することにより反応
を停止させ、200μの2MのNH4OAcと10μｇの
イー・コリtRNAと１mlのエタノールとを加える
ことにより、−20℃で２時間および−70℃で10分
沈澱させた。遠心分離によりペレツトを取り出
し、そしてこれを乾燥した。二本鎖のcDNAのの
この混合物は、これを調製するための鋳型として
使用したポリA+RNAの不均一性の結果、並び
に、AMV逆転写結果によるcDNA転写の早期停
止により不均一となる。 上記の不均一性の影響を少なくするため、二本
鎖cDNA混合物のサイズを選別した。この際ペレ
ツトを10ｍＭトリス−HCl（PH7.5）と１ｍＭ
EDTAとの20μに溶解し、これを55℃にて５分
間培養し、ブロモフエノールブルー−キシレンシ
アノールFFと蔗糖とを加え、DNAを４％ポリア
クリルアミドゲル（トリス−硼酸塩、20cm×40×
0.3cm、200V−20ｍＡ）で一晩電気泳動した。こ
の際、フアージφX174のDNAの5′−32P−標識
Hae断片を並行路にマーカーとして電気泳動さ
せた。ゲルを放射線分析した後、このDNAをゲ
ル上の位置にしたがつてフラクシヨンM1（1000−
1300bp）、M2（750−1000bp）、M3（600−750bp）
およびM4（500−600bp）に分離した。各フラク
シヨンに対応するゲルスライスを切除し、これら
を２mlの0.5MのNH4OAcと10ｍＭのMgCl2と0.1
％SDSとで一晩溶出させ、そしてDNAを２容量
のエタノールで沈澱させた（−20℃）。遠心分離
した後、各ペレツトを100μの水に溶解し、そ
してこれを900μの10ｍＭ燐酸ナトリウム（PH
7.4）と100μ（充填容量）のヒドロキシアパタ
イト（バイオラツド社）との存在下で37℃にて10
分間培養した。次いでヒドロキシアパタイトをセ
フアデツクス−G75カラムに充填し、そしてこの
カラムを２ｍＭのリン酸ナトリウム（PH7.4）で
充分洗浄した後、DNAを0.45Mの燐酸ナトリウ
ム（PH7.4）で溶出させ、そして1/10容量の2Mの
NaOAc（PH５）と２容量のエタノールとで沈澱
させた。 ここでも認識されるように、cDNAフラクシヨ
ンのそれぞれには多数のcDNAが存在し、その極
く僅かのみがhIL2関連のcDNAである。 二本鎖のcDNAのクローン化 本発明により調製された二本鎖cDNAは、クロ
ーン化または発現させる際に、多くの種類の宿
主／クローン化ベヒクルの組み合わせを使用する
ことができる。例えば、有用なクローン化または
発現ベヒクルは染色体、非染色体および合成
DNA配列の断片、例えばSV40の各種の公知誘導
体および公知の細菌プラスミド、例えばcol E1、
pCR1、pBR322、pMB9およびその誘導体を含む
イー・コリからのプラスミド、広範囲の宿主プラ
スミド、例えばRP4、フアージDNA、例えばフ
アージλの多くの誘導体、例えばNM989および
その他のDNAフアージ、例えばM13および繊維
状一本鎖DNAフアージ並びにプラスミドとフア
ージDNAとの組み合わせから得られるベクター、
例えばフアージDNAまたはその他の発現制御配
列を使用するよう改変したプラスミドまたは酵母
プラスミド、例えば2μプラスミドもしくはその
誘導体よりなることができる。有用なクローン化
もしくは発現宿主は細菌宿主、例えばイー・コリ
HB101、イー・コリX1776、イー・コリX2282、
イー・コリMRCIおよびシユードモナス、枯草
菌、高熱細菌およびその他の細菌類、酵母および
その他の真菌類の菌株、動物もしくは植物宿主、
例えば培養物における動物（ひとを含む）もしく
は植物細胞またはその他の宿主を包含する。勿
論、必ずしも全ての宿主／ベクター組み合わせが
同等に有効であるとは限らない。宿主／クローン
化ベヒクル組み合わせの特定の選択は、ここに記
載した原理を考慮して本発明のポリペプチドを得
るべく、種々の組み合わせで当業者により行うこ
とができる。 さらに、それぞれ特異的クローン化もしくは発
現ベヒクルには、二本鎖DNAを挿入するための
各種の部位を選択することができる。これらの部
位は、一般にそこを切断する制限エンドヌクレア
ーゼにより命名される。これらの部位は当業者に
より充分知られている。勿論、本発明に有用なク
ローン化もしくは発現ベヒクルは、選択DNA断
片を挿入するための制限エンドヌクレアーゼ部位
を持つ必要がないことを予解すべきである。寧
ろ、ベヒクルは他の手段によつて断片に結合する
ことができる。 ベクターまたはクローン化もしくは発現ベヒク
ル、および特に選択DNA断片を付着させて組み
換えDNA分子を生成させるためにここに選択さ
れる部位は種々の因子、例えば特定の制限酵素の
作用を受ける部位の個数、発現すべき蛋白質の寸
法、宿主細胞酵素による蛋白分解に対する所望蛋
白質の感受性、精製の際除去することが困難な宿
主細胞蛋白質による発現される蛋白質の汚染また
は結合、例えばベクター配列に対する開始コドン
および停止コドンの位置のような発現特性、並び
に当業者に知られたその他の因子により決定され
る。特定遺伝子に対するベクターおよび挿入部位
の選択はこれら因子のバランスによつて決定さ
れ、必ずしも全ての選択が所定の場合に同等に有
効であるとは限らない。 外来DNAをクローン化ベヒクルまたは発現ベ
クター中に挿入して組み換えDNA分子を生成さ
せるには当業界で幾つかの方法が知られている
が、初期クローン化につき好適な方法はBam HI
によりpSV529DNA（後記）を切断し、Bam HI
部位を充填し、かつ末端トランスフエラーゼによ
つてdC末端を3′末端に付加することである。次
いで、二本鎖cDNAをこのpSV529DNAへ先ずこ
れをdG末端で処理した後に結合させる。次いで、
切断DNAと切断cDNAとを融合させて、DNAを
プラスミドの選択部位に挿入すると共にハイブリ
ツドDNAを再環化させることができ、dG−dC
末端の相補的性質はそれらの付着およびBam HI
部位の再構築を可能にする。かくして得られた組
み換えDNA分子は、クローン化ベクターにおけ
る選択位置に挿入遺伝子を有する（第２図）。 勿論、DNA配列をクローン化もしくは発現ベ
ヒクル中へ挿入して組み換えDNA分子を生成さ
せるその他の公知の方法も、同等に有用である。
例えば、これらはdA−dT未端処理、直接結合、
合成リンカー、エキソヌクレアーゼおよびポリメ
ラーゼ結合修復反応に続く結合、またはDNAポ
リメラーゼによるDNA鎖の延長および適当な一
本鎖鋳型の作成に続く結合を包含する。 勿論、クローン化ベヒクルの選択部位に挿入さ
れたヌクレオチド配列またはcDNA断片は、所望
のポリペプチドを暗号化する実際の遺伝子の一部
でないヌクレオチドを包含するか、あるいは所望
の蛋白質に対する完全遺伝子の断片のみを包含し
得ることを了解すべきである。DNAが最終的に
挿入された場合、形質転換された宿主がIL2の生
物学的もしくは免疫学的活性を有するポリペプチ
ドを生産すること、或いはDNA配列自身がIL2
の免疫学的もしくは生物学的活性を有するポリペ
プチドの生産に有用なDNA配列を含有するクロ
ーンを選択するためのハイブリダイゼーシヨンプ
ローブとして使用し得るものであることのみを必
要とする。 外来遺伝子を含有するクローン化ベヒクルまた
は発現ベクターを使用して宿主を形質転換させ、
この宿主が遺伝子の暗号化するIL2の免疫学的も
しくは生物学的活性を示すポリペプチドを発現す
るようにさせる。適当な宿主の選択は当業界で知
られた多くの因子により制限される。これらは、
例えば選択ベクターとの適合性、ハイブリツドプ
ラスミドにより暗号化される蛋白質の毒性、所望
蛋白質の回収の容易さ、発現特性、生物安全性お
よびコストなどを包含する。これら因子のバラン
スは、必ずしも全ての宿主が特定組み換えDNA
分子のクローン化または発現のいずれかに同等に
有効でないという理解と一致せねばならない。 本発明において、好適な初期クローン化ベヒク
ルはpSV529であり、かつ好適な初期制限エンド
ヌクレアーゼ部位はBam HIである。好適な初期
宿主はイー・コリHB101である。 １ Bam HI−開裂されたdC末端処理 pSV529DNAの調製 pSV529は、多量の後期領域が除去されてい
るキメラSV40プラスミド発現ベクターである
（第２図）。この構造はVP1遺伝子の大部分
（0.945〜0.145地図単位）を欠如するが転写の
複製、開始および停止、並びに16Sおよび19S
mRNAのスプライシングおよびポリアデニル
化に関与する全ての領域を保持する。pSV529
は、後期にSV40転写制御の下で遺伝子を発現
するよう設計される〔デイー・ゲイセンおよび
ダブリユー・フイエルス、ジヤーナル・モレキ
ユラー・アプライド・ジエネテイツクス、第１
巻、第385〜94頁（1982）〕。 pSV529の主たる特徴は次の通りである：(a)
SV40ゲノムの完全初期領域が存在しかつ小型
−ｔおよび大型−Ｔ抗原を暗号化し、さらに猿
の細胞における複製に必要な領域も存在し、こ
れらはoriの後期領域の方向に位置する「エン
ハンサー」配列である；(b)主たる構造蛋白質
VP1に対する遺伝子が削除されている（0.945
−0.145地図単位からのHind−Bam HI断
片）；(c)唯一のBam HI部位がキメラプラスミ
ドに存在し、そこに外来DNA配列を挿入して
SV40後期プロモーターの制御下で発現させる
ことができ、このBam HI部位は後期16S
mRNAアクセプタースプライス部位から39個
のヌクレオチドの後にかつVP1遺伝子の開始コ
ドン（既に除去されている）から12個のヌクレ
オチドの前に存在する；(d)主たる後期16Sメツ
セージに対するドナーおよびアクセプタースプ
ライス部位が存在する；(e)SV40後期領域から
のポリアデニル化部位が存在する（SV40地図
単位0.17）；(f)SV40DNAの2080bp断片（0.33
〜0.725の地図位置の間）の複製は猿細胞にお
ける同質の組み換えを可能にすると共に、プラ
スミド配列が既に除去されているウイルス構造
遺伝子VP1の代わり挿入遺伝子を含むSV40レ
プリコンを発生する。 50μｇのpSV529DNAを40単位のBam HI制
限酵素で37℃にて２時間にわたり60μの８ｍ
Ｍ MgCl2と40ｍＭ NaClと100ｍＭトリス−
HCL（PH7.4）において切断した。EDTAによ
りこの反応を停止させ、そして混合物をフエノ
ール処理し（３回）、エーテル抽出し（２回）、
１／１０容量の2M KOAc（PH５）と２容量のエタ
ノールとで沈澱させた。 沈澱しかつ線状化した（Bam HI）
pSV529DNAを次いで分離し、これを70％エタ
ノールで２回洗浄し、乾燥させ、水に溶解し、
そして50ｍＭトリス−HCl（PH8.3）と50ｍＭ
KClと10ｍＭ MgCl2と30ｍＭ β−メルカプ
トエタノールとそれぞれ250μMの4dNTPと50
単位のAMV逆転写酵素との混合物50μにお
いて37℃で30分間培養した。EDTAにより反
応を停止させ、この混合物をフエノール／
CHCl3／イソアミルアルコールで抽出した。緩
衝液および混合物をセフアデツクス−G75カラ
ム（20cm×0.5cm）に10ｍＭトリス−HCl（PH
7.5）と１ｍＭ EDTAとで充填し、排除（ボ
イド）フラクシヨンを2M KCAc（PH５）とエ
タノールとで−20℃にて１時間沈澱させた。 DNAを遠心分離により分離し、乾燥させ、
30μの10ｍＭトリス−HCl（PH7.5）と１ｍＭ
EDTAとに入れ、68℃にて30秒間加熱し、
そして氷上で冷却した。次いで、このDNAを
0.14M Ｋ−カコジル酸と30ｍＭトリス緩衝液
（PH6.8）と１ｍＭ CoSO4と１ｍＭジチオスレ
イトールと0.1ｍＭ dCTPと100μCiα−
32PdCTP（2500Ci／モル）と100単位の末端デ
オキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ（Ｐ
−Ｌバイオケミカルス社）との混合物200μ
中で37℃にて培養した。５分および10分後、
100μの量を抜き取つて、EDTAにより反応
を停止させた。 これらの分取部分をフエノール／CHCl3／イ
ソアミルアルコールで抽出し、DNAを上記の
ようにセフアデツクス−G75カラムを通してク
ロマトグラフイーにより精製した。排除（ボイ
ド）フラクシヨンにおけるDNAをエタノール
により沈澱させ、遠心分離し、乾燥しそして
30μの10ｍＭトリス−HCl（PH7.5）と１ｍＭ
のEDTAとに溶解した。平均して22個および
36個のdCMP残基が、それぞれ５分間および10
分間の培養の後に線状化pSV529DNAの3′末端
に付加されると計算された。さらに、Pvu
で切断したdC末端pSV529DNAのアガロース
ゲル電気泳動により示されるように、殆ど内部
切断（インターナルテイリング）が生じなかつ
た。 ２ 誘発脾細胞から得られるdG末端 cDNAの調製 上記の二本鎖cDNA（フラクシヨンM2および
M3）をゲルから溶出させ、ヒドロキシアパタ
イトで精製し、かつオリゴdGと共に煮沸し、
この場合慣用方法と末端デオキシヌクレオチジ
ルトランスフエラーゼとを使用した。 ３ dC延長pSV529とdG延長 cDNAとのアニーリング フラクシヨンM2およびM3のそれぞれからの
dG末端dsDNAを、Bam HIで線状化し充填さ
れかつdC末端処理したpSV529と混合し、標準
条件下で融合させた。 アニーリング後に得られるハイブリツド
DNAは、勿論、挿入DNA配列を含まない種々
の組み換えDNA分子と幾つかのクローン化ベ
ヒクルとの混合物である。しかしながら、各組
み換えDNA分子は、Bam HI部位にcDNA断
片を含有する。この種の各cDNA断片は遺伝子
またはその断片からなることもできる。極めて
少数のcDNA断片のみがIL2またはその部分を
暗号化する。大多数は、他の蛋白質またはその
部分（そのmRNAは本発明の方法に使用され
るポリ(A)RNAの一部である）を暗号化する。
さらに、上記で得られたクローンのいずれも
IL2の免疫学的もしくは生物学的活性を示すポ
リペプチドの発現を可能にしないことを了解す
べきである。寧ろ、これらはこの種のクローン
をスクリーニングしかつ同定する際にのみ有用
である。 ４ 融合ハイブリツドDNAによるイー・コリ HB101の形質転換 形質転換法および得られた形質転換体を処理
するその後の工程に対し、必要に応じ適当な封
じ込め施設を使用した。 融合DNAの混合物（フラクシヨンM2および
M3のそれぞれにつき）を、標準形質転換条件
を用いてコンピテント イー・コリHB101細
胞へ付加した。次いで、これら細胞100μ／
mlのカルベニシリンを含有するLB−寒天平板
に接種した。プラスミドpSV529はペニシリン
耐性の遺伝子を含むので、この遺伝子を有する
プラスミドで形質転換されたイー・コリ宿主
は、このように形質転換されない細菌を除き、
抗生物質を含有する培地中で増殖するであろ
う。したがつて、カルベニシリン含有培地にお
ける増殖は、組み換えDNA分子または再環化
ベクターにより形質転換され宿主の選択を可能
にする。 個々のコロニーを採取し、そしてこれらをマ
イクロタイタープレートにおける200μのLB
培地（カルベニシリンを含有する）において１
晩増殖させた。ジメチルスルホキシドを10％の
終濃度で加えた後、これらプレートを−20℃で
貯蔵した。M2およびM3 DNAフラクシヨンか
らそれぞれ約1300個および1000個のクローンを
得た。 各フラクシヨン（M2およびM3）カルベニシ
リン耐性のクローン化は、誘発脾細胞から得ら
れたポリA+RNAの混合物の寸法決定された完
全もしくは部分コピーを表現する各種の組み換
えDNA分子を含有する。これらクローン化の
大部分は、単一の組み換えDNA分子を含有す
るであろう。しかしながら、これら組み換え
DNA分子の極く少数のみがIL2に関連する。
したがつて、これらクローンは、IL2関連クロ
ーンを他のクローンから選択するよう選別せね
ばならない。 hIL2cDNAを含有する クローンのスクリーニング hIL2cDNAを含有する細菌クローンをスクリ
ーニングするには幾つかの方法がある。これら
は、例えばRNA選択ハイブリダイゼーシヨン
（アーウイン等、下記）、分別ハイブリダイゼーシ
ヨン〔テイー・ピー・セント・ジヨーンおよびア
ール・ダブリユー・デービス、「分別プラーク・
フイルターハイブリダイゼーシヨンによるサツカ
ロミセス・セレビシーからのガラクトース誘発性
DNA配列の単離」、セル誌、第16巻、第443〜452
頁（1979）〕、合成プローブによるハイブリダイゼ
ーシヨン〔ビー・ノイエス等、「オリゴデオキシ
ヌクレオチドプローブを用いるガストリン
mRNAの検出および部分配列分析」、プロシーデ
イング・ナシヨナル・アカデミー・サイエンス・
USA、第76巻、第1770〜74頁（1979）〕、または
所望蛋白質を生産するクローンの免疫学的分析
〔エル・ビラーコマロフ等、「プロインシユリンを
含成する細胞クローン」、プロシーデイング・ナ
シヨナル・アカデミー・サイセンス・USA、第
75巻、第3727〜31頁（1978）〕または生物学的分
析（エー・シー・ワイ・チヤング等、「ねずみジ
ヒドロホレート・レダクターゼを暗号化する
DNA配列のイー・コリにおける表現型発現」、ネ
イチヤー誌、第275巻、第617〜24頁（1978）〕に
よる選別を包含する。本発明においては、主たる
クローン選別に対する最も便利かつ有望な方法と
してRNA選択ハイブリダイゼーシヨンを選択し
た。 RNA選択ハイブリダイゼーシヨンにより同定
される組み換えDNA分子およびそれにより形質
転換された細菌培養物が完全IL2cDNA配列を含
有するという保証はなく、またDNA配列が実際
にIL2を暗号化しまたはIL2の免疫学的もしくは
生物学的活性を示すポリペプチドをクローンに発
現させ得るという保証さえない。しかしながら、
組み換えDNA分子は確かにIL2mRNA暗号化配
列に相補なヌクレオチド配列を含有する。したが
つて、組み換えDNA分子は、少なくとも他の組
み換えDNA分子およびそれにより形質転換され
たクローンを選別するためのプローブ源として使
用し、標準または完全IL2ヌクレオチド暗号化配
列を含有する他の種類のクローンを同定すること
もできる。次いで、これらクローンを、IL2の生
物学的もしくは免疫学的活性を示すポリペプチド
の可能な発現につき直接に分析することができ
る。さらに重要なことに、これらハイブリツドプ
ラスミドの挿入DNA断片およびそのアミノ酸翻
訳生産物のヌクレオチド配列は常套手段によつて
決定することができ、このDNA配列を使用して
適当な発現ベクターを作成し、これにより形質転
換された適当な秋宿主においてIL2の合成を行う
ことができる。 Ａ RNA選択ハイブリダイゼーシヨン分析 １ 選択ハイブリダイゼーシヨンの背景 蔗糖密度勾配からのポリA+RNAは約1μｇ
RNA／μｇを含有し、その内30nｇ（30n
）を各卵細胞へ微量注入する。IL2mRNA
が蔗糖密度勾配のピークフラクシヨンにおい
て全ポリA+RNAの0.3％を構成すると仮定
し、0.1ngのIL2mRNAを各卵細胞中に微量
注入する。この量の1/10、すなわち0.01nｇ
のIL2mRNAは卵細胞中への注入後に検出す
ることができる。上記の推定によれば、ピー
クフラクシヨンにはポリA+RNA1μｇ当り3n
ｇのIL2mRNAが存在する筈であり、またハ
イブリダイゼーシヨン溶出分析につき50μｇ
のポリA+RNAを使用すれば150nｇの
IL2mRNAが得られるであろう。 50個のクローンからなる各群は約10個の挿
入物を含有する。３〜5μｇの挿入DNAを蔗
糖密度勾配遠心分離によつて精製し、ニトロ
セルロースフイルターに結合させた。かくし
て、0.3〜0.5μｇの個々の挿入DNA（個々の
クローンから得られたもの）がフイルターに
結合される。 10ngのIL2mRNA（150ngが利用可能であ
る）がフイルターに結合された300〜500nｇ
のIL2cDNA挿入物とハイブリツド形成し得
ると仮定し、かつこのRNAの30％が溶出後
に回収され得ると仮定して、3nｇの
IL2mRNAを2μの水に溶解し、その内30n
もしくは0.05nｇのIL2mRNAを卵細胞中
へ注入する。これは分析中に検出される筈で
ある。 それぞれ10個の挿入物（50個のクローンか
ら得られたもの）を含有する30個のフイルタ
ーを分析して、ハイブリツド形成すべき300
個の個々の挿入物を与えた。IL2mRNAがds
cDNA合成に使用したポリA+RNAの0.3％を
構成すると仮定して、平均で１個の
IL2cDNAクローンがフイルター中に存在す
る筈である。 ２ 分析の実施 工程Ａ：「挿入DNA」の精製およびこの「挿
入DNA」を含有するニトロセルロースフ
イルターの調製 上記で調製したライブラリー（M2および
M3）のそれぞれを50個のクローンからなる
群に分割し、50個の各群を単一の寒天平板上
で１晩増殖させた。次いで、これらクローン
から得られた細菌を10mlのLB培地に懸濁さ
せ、0.5の脳心臓潅流物（BHI−ジフコ）
にこの懸濁物を接種した。細菌懸濁物を１晩
増殖させた後（プラスミドの増加を伴わな
い）、SDS−アルカリ溶菌によつてこれら培
養物からDNAを単離した（デイー・イシユ
ーホロビツツおよびジエー・エフ・パーク、
ヌクレイツク・アシド・リサーチ、第９巻、
第2989〜2998頁（1981）〕。次いで、50個のク
ローンの各混合物（200μｇ）からのプラス
ミドDNAを20μの10ｍＭトリス−HCl（PH
7.5）と１ｍＭのEDTAにおいてBamHI制限
エンドヌクレアーゼにより切断して、「挿入
DNA」を切除した。反応が完結した後（４
％ポリアクリルアミドゲルにおいて5μを
電気泳動させて検査する）、DNA混合物を68
℃にて５分間加熱し、これを氷中で冷却し、
そして11μの５〜20％蔗糖密度勾配へ10ｍ
Ｍトリス−HCl（PH7.5）と１ｍＭのEDTAと
で充填した。各密度勾配をベツクマンSW41
型ローターにて40K（40000rpm）かつ４℃で
16時間遠心分離した。 次いで、各密度勾配を分画しかつ「挿入
DNA」の混合物（５〜10μｇ）を含有する
フラクシヨンを１：10容量の2M KOAc（PH
５）と２容量のエタノールとで−20℃にて少
なくとも３時間沈澱させた。 「挿入DNA」の沈澱混合物を遠心分離に
より集め、ペレツトを全部で20μの10ｍＭ
トリス−HCl（PH7.5）と１ｍＭ EDTAとに
入れ（2μを４％ポリアクリルアミドゲル
の電気泳動に使用した）、この混合物を100℃
にて１分間加熱し、氷中で冷却し、そして
10μの1.5N NaOHを加えた。混合物を室
温で10分間培養した後、30μの2M
NH4OAcを加え、これを前もつて1M
NH4OAcで湿らせておいたニトロセルロー
スフイルターにスポツトし（９mm2、シユライ
ヒヤーおよびシユエルBA85、0.45μｍ）、「挿
入DNA」をフイルター吸着させた。これら
フイルターを空気乾燥し、0.9M NaClと
0.09Mクエン酸ナトリウムとで洗浄し、乾燥
し、そして80℃にて減圧下に１晩焼成した。 工程Ｂ：「挿入DNA」とポリA+RNAとのハ
イブリダイゼーシヨン ハイブリダイゼーシヨン選択のため、30個
のニトロセルロースフイルターを、65％ホル
ムアミド（アンバーライトMB1、セルバ社、
により脱イオン化したもの）と0.2％SDSと
20ｍＭ HEPES（PH6.4）と0.4M NaClとの
混合物500μを含有する15mlのシリコン処
理した無菌コレツクスチユーブ中で50℃にて
２時間予備ハイブリツド形成させた。次い
で、溶液を、ポリA+RNAを含有する同一の
混合物（PHA／TPA誘発された脾細胞から
得られる５〜20％蔗糖密度勾配で上記のよう
に精製しかつ68℃にて１分間予備加熱したも
の50μｇ）で交換した。次いで、これらフイ
ルターおよび混合物を50℃にて５時間培養し
た。30個のニトロセルロースフイルターは、
上記のようにM2およびM3フラクシヨンの一
部からそれぞれ調製された50個のクローンよ
りなる30群を示した。 工程Ｃ：非ハイブリツド形成ポリA+RNAか
らのハイブリツド形成ポリA+RNA−挿入
DNAの分離 ハイブリツド形成ポリA+RNA−挿入
DNAを含有する30個のフイルターを50mlの
プラスチツクチユーブに移し、これらを50ml
の10ｍＭトリス−HCl（PH7.6）と0.15M
NaClと１ｍＭのEDTAと0.5％ SDSとの溶
液50mlで９回洗浄し、かつSDSを含まない上
記の緩衝液で65℃にて２回洗浄した。次い
で、それぞれ個々のフイルターを100μの
水と2μ（4μｇ）のポリA-RNAとを含有す
るシリコン処理したエツペンドルフ管へ移し
た（オリゴ（dT）セルロースカラムには脾
細胞からのRNAを通した）。これらチユーブ
を100℃にて１分間加熱し、そして直ちにこ
れらをCO2／エタノール浴中で凍結させた。
これらチユーブを室温で解凍した後、フイル
ターを各チユーブから取り出し、溶出した
RNAを−20℃にて15μの2M NaOAc（PH
５）と300μのエタノールとで１晩沈澱さ
せた。遠心分離によりRNAを集め、ペレツ
トを70％エタノールで２回洗浄しそして乾燥
させた。 工程Ｄ：IL2−mRNA活性の測定 30個のペレツトのIL2−mRNA活性を分析
するため、30個のフイルターに対応する、す
なわちM2およびM3フラクシヨンからの50個
のクローンよりなる初期の30群に対応するペ
レツトのそれぞれを2μの水に溶解し、こ
のRNA溶液を15〜20個のアフリカツメガル
の卵細胞へ上記と同様に注入した。23℃で３
日間後、卵細胞培地を除去し、IL2活性につ
き分析した（上記と同様）。 ３ RNA選択ハイブリダイゼーシヨン分析の
結果 50個のクローンよりなる30群〔cDNAフラ
クシヨンM2（750−1000bp）からの18群およ
びcDNAフラクシヨンM3（600−750bp）か
らの12群〕のうち２群、すなわち群M3−２
（フイルター20）と群M3−６（フイルター24）
とが、卵細胞注入分析で測定ししてIL2活性
を暗号化するmRNA（誘発脾細胞からのポリ
A+RNAから得られたもの）にハイブリツド
形成する挿入DNAを含有した。この分析の
結果を第１表に示す。 【表】 【表】 【表】 上記したように第２のハイブリダイゼーシヨン
と分析とを行つた後、群M3−２およびM3−６が
再び陽性を示した。群M3−２の50個のクローン
を14個のサブ群、すなわちサブ群Ａ〜Ｎにそれぞ
れ分割した（各群は７個のクローンを含有し、た
だしサブ群Ｎは８個のクローンを含有し、全群に
おける陽性クローンの存在は２つの陽性サブ群を
もたらす筈であり、すなわち「平方根法」を使用
する）。次いで、上記のハイブリダイゼーシヨン
および分析手順を、これら14個のサブ群からの挿
入DNAを含有するニトロセルロースフイルター
について反復し、サブ群M3−2D（クローンM3−
２−４、11、18、25、32、39および46を含有す
る）とサブ群M3−2L（クローンM3−２−29、
30、31、32、33、34および35を含有する）とが
IL2活性を示すことを突き止めた。したがつて、
個々のクローンM3−２−32がひとIL2−mRNA
に相対的な「挿入DNA」を有するプラスミドを
含有するクローンとして同定された。したがつ
て、クローンM3−２−32の挿入DNAを単離し、
精製し、そしてこれをニトロセルロースフイルタ
ーに結合させ、このRNAハイブリダイゼーシヨ
ン分析を上記と同様に反復した。この分析におい
て個々のクローンM3−２−32は約6800cpmIL2活
性を示した。 このクローンをイー・コリHB101（pSV529
（Bam HI）／hIL2−０）と命名し、その組み換
えDNA分子をpSV529（Bam HI）／hIL2−０
（「pSV−hIL2−０」）と命名し、かつそのDNA
挿入物をhIL2−０を命名した。この命名法は、
クローンおよび組み換えDNA分子がBam HI部
位にIL2−関連cDNAを含有するプラスミド
pSV529からなることを示し、特定クローンが最
初に示されている。 hIL2−０にクロスハイブリツド形成する 組み換えDNA分子を含有したクローンの同定 上記のように単離したpSV−hIL2−０を使用
して、群M2およびM3のcDNAから予め調製した
クローンのライブラリーをコロニーハイブリダイ
ゼーシヨンによつて選別した〔エム・グルンスタ
インおよびデイー・エス・ホグネス、「特定遺伝
子を含むクローン化RNAの単離法」、プロシーデ
イング・ナシヨナル・アカデミー・サイエンス・
USA、第72巻、第3961−65頁（1975）〕。この方
法は、pSV−hIL2−０から作成された放射性プ
ローブをニトロセルロースフイルターに固定され
た溶菌細菌コロニーのDNAに対しハイブリダイ
ゼーシヨンさせて関連コロニーを迅速に同定する
ことを可能にする。 上記のように、マイクロタイタープレートに集
めたクローンのライブラリーを同様な寸法のニト
ロセルロースシート（0.45μｍの孔直径、シユラ
イヒヤーおよびシユエルまたはミリポア社）で複
製したが、これらシートは界面活性剤を除去する
ため予め煮沸し、そしてこれらシートをカルベニ
シリン（100μｇ／ml）を含有するLB寒天平板の
上に置いた。細菌コロニーを37℃にて１晩増殖さ
せた。ニトロセルロースシート上の細菌の溶菌お
よび固定を、0.5N NaOH（約７分間２回）と1M
トリス−HCl（PH7.5）（約７分）と0.5Mトリス−
HCl（PH7.5）および1.5M NaCl（約７分）と、２
×SSC（0.15M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウ
ム（PH7.2）（約７分）とで順次に洗浄することに
より行つた。エタノールで充分洗浄しかつ風乾し
た後、これらシートを減圧下で80℃にて２時間焼
成し、室温で貯蔵した。 挿入DNA hIL2−０断片に特異的なHinf制限
断片を、コロニーハイブリダイゼーシヨンのプロ
ーブとして使用した。この断片（450塩基対）を、
pSV−hIL2−０のHinf切断生成物の４％ポリア
クリルアミドゲルにおける電気泳動で精製した。
DNAバンドを臭化エチジウムで染色した後、特
定断片を溶出させ、そして残留する臭化エチジウ
ムをイソアミルアルコール抽出によつて除去し
た。次いで、特定断片をエタノールでの沈澱によ
り濃縮し、「ニツク翻訳」により 32P−標識し
〔ピー・ダブリウ・ジエー・リグビー等、「DNA
ポリメラーゼＩでのニツク翻訳によるin vitroで
のデオキシリボ核酸の高比放射能ラベル」、ジヤ
ーナル・モレキユラー・バイオロジー、第113巻、
第237−251頁（1977）〕、この場合それぞれ
dCTP、dTTPおよびdGTPを400μMで2.5μ含
有し、かつ100p molesのα−ATP（アメルシヤ
ム社、2000Ci／ｍmole）と2.5単位のDNA−ポリ
メラーゼＩ（ベーリンガー社）とを含有する50μ
の50ｍＭトリス−HCl（PH7.4）と10ｍＭ
MgCl2と20ｍMβ−メルカプトエタノールにおい
て15℃にて45分間培養した。未反応のデオキシヌ
クレオシド三リン酸を、セフアデツクスG75カラ
ムにおけるTE緩衝液でのゲル濾過によつて除去
した。高度に 3P−標識されたDNAを0.1容量の
2M酢酸ナトリウム（PH5.1）と2.5容量のエタノ
ールとにより20℃にて沈澱させた。 フイルター含浸されたDNAに対する上記プロ
ーブのハイブリダイゼーシヨンを行つた（これは
デイー・ハナハンおよびエム・メセルソンによ
り、「高コロニー密度におけるプラスミドスクリ
ーニング」、ジーン誌、第10巻、第63−67頁
（1980）に実質的に記載されている）。上記したよ
うに調製したフイルターを0.1％フイコール、0.1
％ポリビニルピロリドン、0.1％牛血清アルブミ
ン、0.15M NaCl、0.03M トリス−HCl（PH８）、
１ｍＭ EDTAにおいて68℃にて２時間予備培
養し、次いで0.02％フイコール、0.02％ポリビニ
ルピロリドン、0.02％牛血清アルブミン、0.75M
NaCl、0.15Mトリス−HCl（PH８）、５ｍＭ
EDTAおよび0.5％SDSにて洗浄した。上記洗浄
溶液と同一の溶液でハイブリダイゼーシヨンを68
℃にて進行させ、この場合使用に先立ち100℃に
て５分間変性した 32P−標識プローブを使用し
た。ハイブリツド形成したフイルターを0.3M
NaCl、0.06Nトリス−HCl（PH８）、２ｍＭ
EDTAにて68℃で２時間２回洗浄した後、風乾
しかつ放射線分析した。 cDNAフラクシヨンM2から生じた約1300個の
クローンとcDNAフラクシヨンM3から生じた
1050個のクローンとを選別した。このコロニーハ
イブリダイゼーシヨンスクリーニングの結果、
IL2プローブに強力にハイブリツド形成したフラ
クシヨンM3 cDNAから生じる１個のコロニーを
同定した。フラクシヨンM3からのこのクローン
をpSV−hIL2−１と命名した。これはRNA選択
分析において予め陽性であつたM3−６群から生
じたものである。 DNA挿入物hIL2−１は約230bpを示した（そ
のＧ／Ｃ末端を含む）。この挿入物はhIL2−０の
内部Hinf断片とハイブリツド形成するので、こ
の挿入物は内部ニツクでdG末満処理されたds
cDNA分子を挿入することにより生じたものと思
われる。 勿論、上記のようにhIL2−０挿入DNAまたは
その挿入物を使用して同定されたクローンのその
他のDNA挿入物を用いるクローンスクリーニン
グのこの方法は組み換え、DNA技術、合成、天
然源またはその組合せから生ずるDNA配列を含
有するその他のクローン、あるいは単一もしくは
複数の塩基置換、挿入、逆転または削除を含む突
然変異による上記DNA配列のいずれかに関連し
たDNA配列を含むクローンについても同等に使
用することができる。従つて、この種のDNA配
列およびその同定も本発明の範囲内に入る。さら
に、上記DNA配列により送別されないが、ヌク
レオチド配列の結果として上記DNA配列により
暗号化されたポリペプチドを暗号化するような
DNA配列も本発明の範囲内に入ると了解すべき
である。 さらに、ひとインターロイキン２を暗号化する
DNA配列とねずみ、豚、にわとり、牛または犬
のようなひと以外の原料から得られるIL2を暗号
化するDNA配列との間には同質性が予想される
ので、本発明のDNA配列はこれらのひと以外の
インターロイキン２を暗号化するDNAの選択に
おいて、および免疫治療剤および方法に使用する
ためのひと以外のインターロイキンのクローン化
および発現において有用である。また、本発明の
DNA配列またはそれから調製かつ誘導されるオ
リゴヌクレオチドを使用して、インターロイキン
２ではないインターロイキン関連のポリペプチド
を暗号化するその他のDNA配列を選択すること
もできる。これらの配列およびポリペプチドも本
発明の１部である。 hIL2活性を示すポリペプチドの発現 hIL2−関連の挿入DNAを含有するプラスミド
で形質転換するためのアフリカ産緑猿（AP8）の
腎臓細胞を調製するため、これら細胞をデユルベ
ツコの改変イーグル最小培地（「DME」（ギブコ
社）に維持した。この培地は10％新生ウシ血清
（ギブコ社）と１ml当り100単位のペニシリンと１
ml当り100μｇのストレプトマイシンとを含有し
た。細胞培養物を、DEAE−デキストラン改変法
を用いてプラスミドDNAにより形質転換させた。
次の工程を行つた：細胞の単一層をトリプシン−
EDTAにより約１時間徹底的に処理し、次いで
10％の新生ウシ血清を含有するDMEにおいて17
mmのウエル（１板の板当り24穴、コスター社）に
分散させた。24時間後、これらの細胞をHEPES
緩衝最小必須培地で２回洗浄し、そしてプラスミ
ドDNA（12μのF11−HEPES緩衝液中に約１〜
10μｇ／μで溶解）を500μｇ／mlのDEAE−デ
キストラン（フアルマシア社）を含有する120μ
のDMEに加えた。この混合物を次いで細胞の
単一層へ約30〜60分間かけて加えた（ジエー・エ
ツチ・マツクチヤンおよびジエー・エス・バガ
ノ、「ジエチルアミノエチル−デキストランによ
る猿ウイルス40デオキシリボ核酸の感染性の促
進」、ジヤーナル・ナシヨナル・キヤンサー・イ
ンスチチユート、第41巻、第351−57頁（1978）；
ジー・チユーおよびピー・エー・シヤープ、「懸
濁物における細胞のSV40DNA形質転換：Ｔ−抗
原の転写および翻訳の効率分析」、ジーン誌、第
13巻、第197−202頁（1981））。これら細胞を
DMEで３回洗浄した後、新鮮な培地（DME＋10
％ウシ血清＋100μｇ／mlペニシリン、および
100μｇ／mlストレプトマイシン）を加えそして
細胞培養物をCO2培養器において37℃で72時間培
養した。 形質転換に使用したプラスミドDNAはリゾチ
ーム−界面活性剤の溶菌によりイー・コリ
HB101（pSV−hIL2−０）集落から調製し、臭化
エチジウムの存在下におけるCsCl勾配での同密
度遠心分離によつて精製した（エム・カーン等、
「プラスミドCol E1から誘導されたプラスミドク
ローン化ベヒクル」、メソツド・イン・エンザイ
モロジー、第68巻、組み換えDNA（アール・ウー
編）、第268−280頁（1979）に実質的に記載され
ている）。 72時間培養した後、上澄液（〜1/2ml）を形質
転換細胞から除去し、そしてこれを慣用のIL2分
析に使用して、上澄液における生物学的活性な
hIL2−関連ポリペプチドの存在を測定した（上
記）。 クローンpSV−hIL2−０からのIL2活性の発現
は何ら観察されなかつた。その後のDNA配列決
定（下記）が示すところでは、このクローンの
DNA挿入物hIL2−０はその5′末端において不完
全であり、開始信号を含まない。* ＊ hIL2−０の5′末端における喪失ヌクレオチド
の数を確定するため、短い（63bp）制限断片
を単離した。5′標識し、ストランド分離し、そ
して誘発脾細胞から得られたポリA+RNAへハ
イブリダイゼーシヨンした後に逆転写酵素によ
り延長化した。変性用ポリアクリルアミドゲル
上でのcDNA生成物の分析は約210ヌクレオチ
ドのバンドを示した。この分析から、hIL2−
０はIL2mRNAの全長よりも約110個のヌクレ
オチドだけ短いと確定された。 ここで使用した発現ベクターは開始信号を与え
ない。従つて、いかなるhIL2発現も、hIL2−０
のみを使用するこの発現系において期待すること
ができなかつた。しかしながら、DNA挿入物、
hIL2−０を使用して本発明で用いたクローンラ
イブラリーから、あるいはIL2の完全暗号化配列
を持つもしくはhIL2−０の配列と組み合わせて
配列の喪失部分を供給するような他のクローンま
たは染色体から、その他のクローンを選択し得る
こことを了解すべきである。この種の選択技術は
上記に記載され、これを以下に例示する。hIL2
に対する完全暗号化配列を有するクローンを同定
した後、この配列を使用して猿細胞を上記のよう
に形質転換させ、あるいはその他の適当な宿主を
形質転換させて、hIL2様ポリペプチドを生成さ
せることができる。さらに、このhIL2−０配列
を常法によりATG開始コドンと組み合わせて、
成熟hIL2を暗号化するそその配列またはその部
分を発現させることができる。 第５図は、hIL2−0DNA配列を使用してhIL2
を生成する幾つかの作成を示している。これらの
作成においては、先ずpSV−hIL2−０のBam
HI−Bam HI断片を単離した。これは第４図に
示したヌクレオチド配列を有する断片（hIL2−
０）である（ただし、下線を施した部分を除く）。
操作を単純化するため、先ずこの断片をpAT153
にサブクローン化し（第５図）、次いで得られた
hIL2−０暗号化配列を含有するプラスミド
pAT153をHgi A1によつて線状化させ、T4ポリ
メラーゼにより3′末端を除去し、次いでBam HI
により線状DNAを制限してhIL2含有の断片を単
離し、この断片の5′末端はCCT（第４図に示され
る第３のアミノ酸に対するコドン）で始まり、ま
たその3′末端はhIL2暗号化領域の末端を越える
（第４図）。この断片をhIL21と命名した。 DNA配列hIL21はPro（第４図に示したhIL2−
０配列の第３のアミノ酸）で始まる蛋白質を暗号
化するので、この配列の第２のアミノ酸（Ala）
をも暗号化するDNA配列を調製することに決定
した。* ＊ 成熟hIL2はこのアラニンで始まる。 この作成を行うため、先ずhIL21断片を
pAT153から調製した断片へ結合させ、その際こ
のプラスミドをNar Ｉ（GG↓CGCC）より線状
化し、末端をDNAポリメラーゼＩ（クレノー）
（Ban Ｉ部位をも形成する）で充填し、かつ線状
断片をBam HIで制限した。得られたプラスミ
ド、すなわち第５図においてpAS153（hIL2B）は
結合部に次の配列を有する： GGCGCCT…… Pro 次いで、このプラスミドをBan Ｉで線状化し、
5′末端をDNAポリメラーゼＩ（クレノー）で充填
し、そしてこの線状プラスミドをBam HIで制限
した。得られたhIL2含有の断片をhIL201と命名
した。その5′末端はGCGCCT（Ala−Proを暗号
化する）で始まりその3′末端はBam HI部位であ
つて、hIL2暗号化配列の末端を越える。次いで、
これら断片を、ATG開始コドンに隣接し、かつ
プロモーターおよびリボソーム結合部位の下流に
個々の発現ベクター中へ挿入した。この種の作成
によりアミノ末端としてそれぞれMet−Pro−
ThrまたはMet−Ala−Pro−Thrを有する本発明
のhIL2関連のポリペプチド生成物が得られた。 (a) フアージMuから得られるPLプロモーターお
よびリボソーム結合部位 上記のDNA配列を発現ベクターpPLcMu299
（ゲーリーブエルの寄贈による）中へ挿入した。
このベクターはフアージMu*から得られるPL
プロモーターとリボソーム結合部位とを含有す
る。これはさらに、Nco Ｉ部位（CCATGG）
の一部であるATG開始コドンと、さらに下流
の唯一のBam HI部位とを特徴とする。* ＊ このベクターはpPLc236から得られた（イ
ー・レモート等、「コリフアージλのPLプロモ
ーターにより制御される高効率発現のためのプ
ラスミドベクター」、ジーン誌、第81−93頁
（1981））。これら配列を含有する微生物および
プラスミドは、1982年８月16日付でATCC寄託
番号39173としてアメリカン・タイプ・カルチ
ヤー・コレクシヨンに寄託した。この培養物は
入手し得ると同時に、後記する培養物も入手す
ることができる。 従つて、pPLcMu299をNco Ｉにつつて線
状化し、5′末端をDNAポリメラーゼＩ（クレノ
ー断片）で全ての４つのdNTPの存存下に充填
し、かつさらに線状DNAをBam HIにより切
断した。アガロースゲル上で精製した後、線状
化したpPLcMu299を上記のhIL2含有断片と結
合させ、そして得られたプラスミドを挿入され
たhIL2含有断片に基づいてpPLcMu−hIL21お
よびpPLcMu−hIL201と命名した。構造
pPLcMu−hIL21の結合部におけるDNA配列
は次の通りである： TTAGGAGGGTTTTTACCATGCCT… S.D. MetPro… 構造pPLcMU−hIL201の結合部における
DNA配列は次の通りである： TTAGGAGGGTTTTTACCATGGCGCCT
… S.D. MetAlaPro… さらに、pPLcMu−hIL21の構造、フアージ
Muからのリボソーム結合部位およびPLプロモ
ーターを特徴とする第２のプラスミドを、
pPLcMu−hIL21の初期領域をpPLc28の領域
で交換することにより作成した（イー・レモー
ト等、上記）。このより小さいプラスミドを
pPLcMu−hIL22と命名した（第５図）。 次いで、イー・コリK12ΔHIΔtrpをこれら発
現ベクターのそれぞれ形質転換し、得られた培
養物を42℃で３時間誘発させた。次いで、煮沸
SDS中で細菌を破砕することにより細菌抽出物
を調製し、この抽出物をSDSポリアクリルアミ
ドで分析した（セルバブルーで染色）。３つの
抽出物のそれぞれにおいて、誘発後に約15Kの
新たな蛋白質バンドが存在した。しかし、この
バンドは28℃で生育させた形質転換細胞からの
抽出物には存在しなかつた。15Kの蛋白質は全
細胞蛋白質の約５〜10％であると推定された。 さらに上記した 3H−チミジン取込み分析に
より、これら形質転換宿主から作成された透明
な抽出物のhIL2生物学的活性を分析した。こ
の分析において、培養かつ誘発した細胞を界面
活性剤の不存在下で音波処理により開裂させ、
細胞残骸を30000ｇで遠心分離し、上澄液を
0.2μのミリポアフイルターを通して清澄させ
た。この分析の結果を下記第表に示す。 【表】 (b) Trpアテニュエイシヨン領域から得られる
Trpプロモーターおよびリボソーム結合部位 次いで、上記のhIL2配列を発現ベクター
pTrp321（ゲーリーブエルの寄贈）に挿入した。
このベクターはTrpアテニユエイシヨン領域か
ら得られる。Trpプロモーターとリボソーム結
合部位とを含有する。ベクター部分は実質的に
pBR322であり、開始ATGコドンはNco Ｉ部
位の部分であり、かつ唯一のBam HI部位が
存在する。従つて、上記(a)の項に記載したと同
じ作成技術に従つて、hIL2配列を含有するプ
ラスミドを作成した。これらのプラスミドを、
使用したhIL2含有断片に基づいて、pTrp−
hIL21およびpTrp−hIL201と命名した。構造
pTrp−hIL21の結合部におけるDNA配列は次
の通りである：AAAGGG TATCGATTCCATGCCT… S.D. MetPro… 構造pTrp−hIL201の結合部におけるDNA配
列は次の通りである：AAAGGG TATCGATTCCATGGCGCCT… S.D. MetAlaPro… 次いで、イー・コリK514λをpTrp−hIL21お
よびpTrp−hIL201で形質転換させ、そしてこ
れら形質転換宿主をトリプトフアン欠乏によつ
て37℃で誘発させた。誘発の後、再び誘発細胞
内に15Kの蛋白質バンドが観察された。予想通
り、このバンドは誘発しない細胞には存在しな
かつた。ここでも、ひとインターロイキン２の
活性の誘発合成のレベルは全細胞蛋白質の５〜
10％であつた。 さらに、界面活性剤の不存在下で音波処理に
より誘発培養物の細胞を開裂させ、細胞残骸を
30000ｇにて遠心分離し、かつ上澄液を0.2μの
ミリポアフイルターに通した後、生物学的活性
につき分析した。これら分析の結果を第表に
示す。 【表】 (c) 細菌抽出物からの生物学的活性の回収 １mlの培養物（pPLcMu−hIL21またはpTrp
−hIL21）から調製した細菌ペレツトを１％
SDS−１％β−メルカプトエタノールを含有す
るラメリの電気泳動用緩衝液（200μ）中に
懸濁させ、そしてこの懸濁物を37℃で１時間培
養し、次いで音波処理した。これら油出物
（40μ）を0.1％SDSを含有する15％PAGE（ラ
メリ）に通して電気泳動した後、このゲルを２
mmのスライスに切断し、各ゲルスライスをマイ
クロタイタープレートの穴に入れた。次いで、
ゲルスライスを10％ウシ胎児血清を含有する
RPMI1640培地（ストレプトマイシンとペニシ
リンとを補充）で２回洗浄し、これらゲルをガ
ラス棒で配砕し、そして200μの培地中へ拡
散させることにより37℃で１晩溶出した。プレ
ートを４℃で２時間培養した後、これを200ｇ
にて15分間遠心分離し、そして上澄液を前記と
同様にhIL2活性につき分析した。 この分析の結果、細菌抽出物（pPLcMu−
hIL21またはpTrp−hIL21）のhIL2生物学的活
性は、形質転換細胞の誘発の際現れる15K蛋白
質バンドと共に移動し、かつこの生物学的活性
はSDS−PAGEから回収され得ることが確認さ
れた。 hIL2関連挿入DNAの特性化 第４図を参照して、挿入DNA hIL2−０の物
理地図を、供給業者により特定された条件下にお
ける種々の制限酵素（ニユー・イングランド・バ
イオラブ社またはベーリンガー社）での切断によ
つて作成した。切断生成物を、2.2％アガロース
ゲルまたは６％ポリアクリルアミドゲルにおいて
40ｍＭトリス−HOAc（PH7.8）と20ｍＭ EDTA
で電気泳動させた。これらを臭化エチジウムで染
色して肉眼化した後、または制限断片を 32P−ホ
スフエート（下記）で末端標識する放射線分析の
後に分析し、pBR322の詳細な物理的地図と比較
した〔ジエー・ジー・サツトクリフ、「大腸菌プ
ラスミドpBR322の完全ヌクレオチド配列」、コ
ールド・スプリング・ハーバー・シンポジウム、
第43巻、第１号、第77−90頁（1978）〕。制限地図
を、これら切断パターンに基づいて作成した。こ
れらをDNA挿入物の配列決定により規定した
〔エー・エム・マキサムおよびダブリユウ・ギル
バート、「DNAの新規な配列決定方法」、プロー
シーデイング・ナシヨナル・アカデミー・サイエ
ンス・USA、第74巻、第560−64頁（1977）の方
法による〕。hIL2−０の配列は、下記するゲノム
hIL2クローンからの配列情報によつて補充した。
ゲノム情報を第４図に示す。 プラスミドDNAをイシユーホロビツツおよび
バーク（上記）の方法によつてpSV−hIL2−０
から作成し、この方法はスクリーニングとして一
群のクローンからDNAを単離するために上記で
使用した。挿入DNAをpSV−hIL2−０のBam
HI制限によつて得、これを前記と同様に中性蔗
糖密度勾配遠心分離によつて精製した（約
740bp）。次いで、製造業者（ニユー・イングラ
ンド・バイオラブ社）により推奨されるように、
種々の制限酵素で制限した。 制限した、DNAを、４単位の細菌由来のアル
カリホスフアターゼと0.1％のSDSとの存在下に
65℃にて30分間脱リン酸した。２回フエノール抽
出しかつエタノール沈澱した後、DNAをγ−
32P−ATP（〜3000Ci／ｍmole）とポリヌクレオ
チドキナーゼ（Ｐ−Ｌ−バイオケミカルス社）と
で5′未端標識した。或いは、制限断片を、α−標
識した 32P−ヌクレオシドトリホスフエート（〜
1000Cu／ｍmole）の存在下でDNAポリメラーゼ
反応（クレノー断片、ベーリンガー社）により
3′末端標識した。 配列決定のため、標識した断片を２つの方法で
処理した。すなわち、あるものは第２の制限酵素
で開裂する前にポリアクリルアミドゲルで精製し
た。他のものは第２の制限酵素で直ちに開裂し
た。両者の場合、所望の断片をポリアクリルアミ
ドゲル上でトリス硼酸塩−EDTA緩衝液にて分
離した。第３図は種々の制限断片（円および正方
形はそれぞれ3′または5′標識を示し、矢印は配列
決定の方向を示す）および使用した配列決定法を
示している。酵素Acc Ｉ、Apa、Ava Ｉ、
Bg1 II、Bst EI、Dde Ｉ、Eco RI、Eco
RV、Fnn4HI、Hae II、Hinc II、Hpa Ｉ、
Hph Ｉ、Kpn Ｉ、Msp Ｉ、Nae Ｉ、Nru
Ｉ、Pvu Ｉ、Pvu II、Sac Ｉ、Sma Ｉ、
Sph ＩおよびTaqについては制限部位が見られ
なかつた。 これら断片をエー・エム・マキサムおよびダブ
リユー・ギルバート（上記）の方法に従つて分解
した。生成物を、種々の濃度および長さのポリア
クリルアミドゲルで50ｍＭトリス硼酸塩とImM
EDTA（PH8.3）にて900V〜2000Vを用いて分画し
た。このようにして得られた複合ヌクレオチド配
列およびその対応アミノ酸配列を第４図に示す。 hIL2−０に関し第４図に示したDNA配列は、
GC末端から−９〜−14の位置にポリアデニル化
信号AATAAAを有する。これは停止信号で終端
する133個のアミノ酸を暗号化するオープン読み
枠を有する。hIL2の分子量に基づきかつ天然
hIL2がグリコシル化されていると仮定して、成
熟hIL2は100〜130個のアミノ酸を有するであろ
うと予想した。従つて、挿入hIL2−０は成熟
hIL2に対する完全暗号化配列を含むと信じられ
るが、プレhIL2の推定シグナル配列およびこの
シグナル配列のATG開始信号のアミノ酸に対す
る暗号化領域の少なくとも１部を喪失していると
思われる。*ここでも、これらの喪失アミノ酸を暗
号化するクローンを前記と同様に選択し、或いは
作成することができる。例えば、第４図におい
て、この部分はゲノムクローン（下線）からの配
列情報によつて供給される。しかしながら、この
配列は、これにより形質転換された宿主における
hIL2様ポリペプチドの合成を可能にする。 ＊ 推定信号ペプチドは第４図における矢印で示
されるようにSerとAlaとの間で成熟hIL2から
開裂されると思われる。 この配列は、塩基置換、欠損、挿入または逆転
を含む、単数もしくは複数の突然変異のような遺
伝子に対する改変がまだこの遺伝子に生じていな
いか、或いはこのような改変によつてさらにこの
遺伝子の性質またはこの遺伝子から発現されるポ
リペプチドの性質を改変させ得ないという可能性
を排除するものではない。さらに、生理学的に同
じであるが、構造的には第４図に示したものと若
干異なる遺伝子またはポリペプチドをもたらすよ
うな任意の多形性を排除するものでもない。 もちろん、常法によりポリA+RNAから得られ
たクローン化cDNA（上記）は5′末端ヌクレオチ
ドを欠如していても、また人工的配列を含んでい
てもよいことを了解すべきである〔アール・ア
イ・リチヤード等、「鶏の成体のβ−グロビン
cDNAの分子クローン化および配列分析」、ヌク
レイツク・アシツド・リサーチ、第７巻、第1137
−46頁（1979）〕。 さらに、真核生物mRNAにおいて、5′末端か
ら最初のAUGトリプレツトは、一般に蛋白質合
成のための開始部位である〔エム・コザツク、
「メツセンジヤーRNAにおける開始領域を真核細
胞リボソームはどのように選択するか」、セル誌、
第15巻、第1109−25頁（1978）〕。 もちろん、第４図に示したポリペプチドの構造
は、生体内における酵素との相互作用、たとえば
グリコシル化によつてもたらされるポリペプチド
に対する何らの改変をも考慮に入れていない。従
つて、第４図に示したアミノ酸配列は、生体内で
生成されるIL2とは同一でないこともあると理解
せねばならない。 IL2を暗号化する染色体遺伝子の同定 HaeおよびAlu Ｉで部分開裂により生成さ
れかつEco RIリンカーによつてλシヤロン4A
アームに結合された胎児ひと染色体DNAの断片
から得られるハイブリツドフアージは、アール・
エム・ローン等によつて作成された〔セル誌、第
15巻、第1157−74頁（1978）〕。同様に、Mbo
Ｉでの部分開裂により生成されるひと染色体
DNA断片を、λ47のBamH Ｉ部位にクローン
化させた〔ダブリユー・エー・エム・レーネンお
よびダブリユー・ジエー・ブランマー、ジーン
誌、第20巻、第249−59頁（1980）；ジエー・デラ
マータ、私的通信〕。両遺伝子は前記のように
pSV−hIL2−０の 32P−標識Hinf Ｉ断片をプ
ローブとして使用する（インサイチユ（in
situ））方法によつて選別した〔タブリユー・デ
ー・ベントンおよびアール・ダブリユー・デビ
ス、サイエンス誌、第196巻、第180−82頁
（1977）；テイー・マニアチス等、セル誌、第15
巻、第687−701頁（1978）〕。 ローン遺伝子の1300000個のプラークから２個
およびレーネン遺伝子の700000個のプラークから
３個のハイブリダイゼーシヨン陽性フアージクロ
ーンを単離した。これらプラークを繰返し精製し
て、これらをそれぞれλCH4A−ghIL2−１、
λCH4A−ghIL2−２並びにλL47−ghIL2−１、
λL47−ghIL2−２およびλL47−ghIL2−３と命名
した。 第６図は、全hIL2遺伝子を有するプラーク
λCH4A−ghIL2−１の部分制限地図を示してい
る。さらに、この遺伝子をpUR250において、そ
れぞれ2.7kbおよび3.8kbの２つのEco RI断片と
してサブクローン化した〔ユー・ルター、「pUR
は挿入物DNAストランドの迅速な化学的開裂決
定を可能にする」、ヌクレイツク・アシツド・リ
サーチ、第10巻、第5765−72頁（1981）〕。制限分
析およびハイブリダイゼーシヨンのデータに基づ
き、pUR−ghIL2−１／2700bp RI−RIはhIL2の
信号配列とプロモーター領域とを含有することが
確認された。このプラスミドおよびpUR−ghIL2
−１／3800bp RI−RIの制限分析はさらに、
hIL2暗号化領域には４個のエクソンと３個のイ
ントロンとが存在することを示唆した。 IL2活性を暗号化する染色体遺伝子は細菌宿主
において発現できないこともあることを了解すべ
きである。何故なら、これらの介入配列はこの種
の宿主によつて正確に処理されないことがあるか
らである。染色体遺伝子は真核細胞宿主における
IL2の生産において極めて有用であると思われ、
この場合ひと非暗号化領域イントロンおよび暗号
化領域は、高レベルの現および生物学的活性な
IL2への生産物の正確な処理に対し極めて重要で
ある。 本発明により生産されるIL2活性を示すポリペプ
チドの収率および活性の向上 蛋白質の生産レベルは３つの主要な因子により
支配される：すなわち、細胞内の遺伝子のコピー
数、これら遺伝子コピーが転写される効率および
これらが翻訳される効率である。転写および翻訳
（これらは一緒になつて発現を構成する）の効率
はヌクレオチド配列、一般には所望の暗号化配列
の前方に位置する配列に依存する。これらのヌク
レオチド配列または発現制御配列は、特に、
RNAポリメラーゼが反応して転写を開始する位
置（プロモーター配列）と、リボソームが
mRNA（転写の生成物）と結合かつ反応して翻訳
を開始する位置とを規定する。必ずしも全てのこ
の種の発現制御配列が同等な効率を有するとは限
らない。従つて、所望の蛋白質に対する特定暗号
化配列を隣接するヌクレオチド配列から分離し
て、これらを他の公知の発現制御配列へ融合さ
せ、より高レベルの発現を得ることが有利であ
る。これが達成された後、新たに作成された
DNA断片をより多数のコピープラスミド中へ、
またはバクテリオフアージ誘導体中へ挿入して、
細胞内の遺伝子コピー数を増加させ、かつそれに
より発現蛋白質の収率をさらに向上させることが
できる。 上記のように数種の発現制御配列を使用するこ
とができる。これらはイー・コリの乳糖オペロン
（「lac系」）のオペレーター、プロモーターおよび
リボソーム結合および相互反応配列（例えばシヤ
イン−ダルガルノ配列のような配列を含む）、イ
ー・コリのトリプトフアンシンセターゼ系（「trp
系」）の対応する配列、フアージλの主オペレー
ターおよびプロモーター領域（上記したような
ULPLおよびURPR）、繊維状の一本鎖DNAフアー
ジの制御領域、または真核もしくは原核細胞およ
びそのウイルスの遺伝子の発現を制御するその他
の配列、またはそれらの組合せを包含する。従つ
て、適当な宿主における特定ポリペプチドの生産
を向上させるには、このポリペプチドを暗号化す
る遺伝子を上記のように作成し、かつこれをその
発現制御配列に近接して、または上記の改善発現
制御配列の１種の制御下で組み換えDNA分子中
に挿入する。この種の方法は当業界で公知であ
る。 翻訳の効率を向上させる他の方法は、化学的ま
たは酵素的に調製したオリゴヌクレオチドを開始
コドンの前方に挿入することを含む。この方法に
より、一層最適なメツセンジヤーRNAの１次お
よび２次構造を得ることができる。さらに詳細に
は、開始AUGコドンが容易に認識され得る位置
（すなわち２次構造により遮蔽されていない）に
おいてヘアピンの頂部に生ずるか、または他の一
本鎖領域に生ずるように配列を設計することがで
きる。さらに、上記シヤイン−ダルガルノ断片の
位置および配列も同様に最適化することができ
る。メツセンジヤーRNAの一般的構造（折畳み）
の重要性が示されている〔デイー・イセレンタン
トおよびダブリユー・フアイエルス、「mRNAの
２次構造および翻訳開始の効率」、ジーン誌、第
９巻、第１〜12頁（1980）〕。 所望生産物の細胞収率の増加は、細胞内で利用
し得る遺伝子数の増加に依存する。これは、IL2
遺伝子をその転写および翻訳制御要素を用いて、
または用いずに高コピー数プラスミドへ、または
温度制御されたコピー数プラスミド（すなわち、
プラスミドのコピー数が温度の上昇変化の後に増
大する〔ビー・ウーリン等、「クローン遺伝子お
よびその生産物の増大に対する温度依存性コピー
数を有するプラスミド」、ジーン誌、第６巻、第
91−106頁（1979）〕ように突然変異したプラスミ
ド）へ挿入することにより達成される。 或いは、遺伝子量の増加は、たとえば上記のよ
うに作成された組み換えDNA分子を特に簡単に
は制限酵素でのプラスミドの切断によつて溶原性
バクテリオフアージλ中へ挿入して線状分子を生
成させ、次いでこれを制御フアージλクローン化
ベヒクルと混合することにより達成され〔例え
ば、エヌ・イー・ムレー等、「in vitro組み換え
体の回収を簡単にするフアージλ」、モレキユラ
ー・ゼネラル・ジエネテイツクス、第150巻、第
53−61頁（1977）およびエヌ・イー・ムレー等、
「バクテリオフアージT4からのDNAリガーゼ遺
伝子の分子クローン化」、ジヤーナル・モレキユ
ラー・バイオロジー、第132巻、第493−505頁
（1979）〕、そして組み換えDNA分子をDNAリガ
ーゼと共に培養して生成させる。次いで、所望の
組み換えフアージを前記と同様に選択し、かつこ
れを使用してイー・コリの宿主菌株を溶原化させ
る。 従つて、本発明に用いられる挿入DNAは
SV529プラスミドから取り出して、これを前記と
同様に他の発現ベクター中へ挿入し、これらベク
ターを種々の宿主で前記と同様に使用してILを
暗号化する遺伝子の発現を向上させ得ることを了
解すべきである。 本発明により生成されるIL2様ポリペプチドの
生物学的活性はさらに、本発明のDNA配列を哺
乳動物の細胞系に適用して形質転換させ、遺伝子
をこれらの系で発現させることにより改善され得
る。この種の哺乳動物系は公知である〔例えば、
ピー・ジエー・サウザーンおよびピー・ベルク、
ジヤーナル、モレキユラー・アプライド、ジエネ
テイツクス、第１巻、第327−41（1982）；エス・
サブラマニ等、モレキユラー・セル・バイオロジ
ー、第１巻、第854−64頁（1981）；アール・ジエ
ー・カウフマンおよびピー・エー・シヤープ、モ
レキユラー・セル・バイオロジー、（出版中）〕。
好適な系は、遺伝子発現をメトトレキセート
（MTX）により増大させ得るCHO（チヤイニー
ズ・ハムスター・オバリー）（DHFR-）細胞系
である。これらの発現系は、グリコシル化蛋白質
の生成を可能にする。 IL2活性を示すポリペプチド（本発明により作
成）は、融合蛋白質（例えば分泌を行う原核もし
くは真核Ｎ−末端断片へ結合したもの）の形態、
プロインターロイキン２（例えば分泌の際、開裂
し得るインターロイキン２の配列の全部または１
部で出発する）の形態、または成熟インターロイ
キン２（発現および分泌の際の初期メチオニンを
含む異質アミノ酸の開裂による）として、または
ｆ−met−IL2として調製され得る。本発明にお
いて特に有用なポリペプチドは、アミノ末端に結
合した容易に開裂し得るアミノ酸もしくは一連の
アミノ酸が付加された成熟インターロイキン２で
ある。この構造は、成熟インターロイキン２に存
在しない開始信号を必要とするような宿主におけ
る蛋白質の合成を可能にし、次いで余分のアミノ
酸を開裂して成熟インターロイキン２を生産する
ことを可能にする。 これら種々異なる形態のポリペプチドの収率
は、上記方法のいずれかまたは組み合わせによつ
て改善することができる。さらに、本発明の
DNA配列に使用したコドン１群または全部に対
し、種々異なるコドンを置換することもできる。
これらの置換コドンは、交換されたコドンにより
暗号化されるものと同一のアミノ酸を暗号化する
ことができ、しかもポリペプチドの高収率をもた
らす。或いは、アミノ酸置換、またはより長いも
しくはより短いIL2関連ポリペプチドをもたらす
コドンの１つの置換または組み合わせも、一般に
その性質を変化させる（例えば、安定性を増大さ
せ、溶解度を増大させ、免疫治療活性を増大さ
せ、長期のＴ細胞の増殖活性を増大させる）。 最後に本発明の組み換えDNA分子を用いて生
産されたポリペプチドの活性は、周知手段により
本発明の範囲を逸脱することなく、本発明の
DNA配列もしくはポリペプチドを断片化し、改
変し、または誘導化することにより改善すること
もできる。例えば、他のインターフエロンとのハ
イブリツドを遺伝子レベルで作成して適当な宿主
で発現させることもでき、或いは化学合成法で蛋
白質レベルで作成することもできる。 ここに記載した方法で調製された微生物および
組み換えDNA分子は、1983年２月８日付けで西
ドイツ国、ゲツチンゲン在、ドイツチエ・ザンム
ルング・フオン・ミクロオルガニズムの培養物コ
レクシヨンに寄託した培養物で例示される： hIL2−Ａ：E.coli HB101 （pSV−hIL2−０） hIL2−Ｂ：E.coli HB101 （pSV−hIL2−１） これら培養物は、それぞれ寄託番号DSM2595
および2596が付与されている。 さらに、ここに記載した方法で作成された微生
物および組み換えDNA分子を、1983年４月18日
付けでメリーランド州、ロツクビル在のアメリカ
ン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨンの培養物
コレクシヨンに寄託した： hIL2−Ｃ：E.coli k514λ （pTrp−hIL201） hIL2−Ｄ：E.coli K12RRIΔM15 （λCH4A−ghIL2−１／2700bp RI−RI） hIL2−Ｅ：E.coli K12RRIΔM15 （λCH4A−ghIL2−１／3800bp RI−RI） これら培養物には、それぞれATCC39338、
39339および39340の寄託番号が付与された。 以上、本発明に関連する多数の実施態様につき
説明したが、この基本構成を改変した方法および
構成を利用する他の実施態様を与えることもでき
る。したがつて、本発明の範囲は上記の実施態様
のみに限定されない。 本発明のDNA配列は、5′未端付近にATGGCG
…の塩基配列を有する。このように、Ｎ末端から
２番目のAlaに対するコドンがGCGであるDNA
配列を利用すると、高効率でヒトインターロイキ
ン２（ヒトIL2）が生産され得る。これに対して、
本発明と同一のアミノ酸をコードするDNA配列
であつても塩基の種類が異なる場合には、このよ
うな効果が得られないことがある。例えば、上記
ATGGCＧ…の配列を有する本発明のDNA配列
［Ala2（GCG）型DNAとする］を有する発現ベク
ターと、２番目のAlaに対する塩基が１ケ所にお
いて異なる、ATGGCＡ…の配列を有するDNA
配列［Ala2（GCA）DNAとする］を有する発現
ベクターとを用いてヒトIL2の産生量を比較し
た。これらの発現ベクターで、大腸菌（E.coli）
Ｋ−12株由来のC600株を形質転換後、これらの
株のヒトIL2の産生量を比較したところ、第表
に示す結果が得られた。第表において、発現率
は生産された総タンパクあたりのヒトIL2の割合
を、そして生産量は、培溶液１あたりのヒト
IL2の重量（ｇ）を示す。 【表】 【表】 率 生産量
菌 株 OD６５０ pH (％) (g／L)
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 次式で示されるDNA配列：
ATGGCGCCTACTTCAAGTTCTACAAAGA
ＡＡＡＣＡＣＡＧＣＴＡＣＡＡＣＴＧＧＡＧＣＡＴＴＴ
ＡＣＴ
ＧＣＴＧＧＡＴＴＴＡＣＡＧＡＴＧＡＴＴＴＴＧＡＡＴ
ＧＧ
ＡＡＴＴＡＡＴＡＡＴＴＡＣＡＡＧＡＡＴＣＣＣＡＡＡ
ＣＴ
ＣＡＣＣＡＧＧＡＴＧＣＴＣＡＣＡＴＴＴＡＡＧＴＴＴ
ＴＡＣ
ＡＴＧＣＣＣＡＡＧＡＡＧＧＣＣＡＣＡＧＡＡＣＴＧＡ
ＡＡＣ
ＡＴＣＴＴＣＡＧＴＧＴＣＴＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＴ
ＣＡＡ
ＡＣＣＴＣＴＧＧＡＧＧＡＡＧＴＧＣＴＡＡＡＴＴＴＡ
ＧＣＴ
ＣＡＡＡＧＣＡＡＡＡＡＣＴＴＴＣＡＣＴＴＡＡＧＡＣ
ＣＣＡ
ＧＧＧＡＣＴＴＡＡＴＣＡＧＣＡＡＴＡＴＣＡＡＣＧＴ
ＡＡＴ
ＡＧＴＴＣＴＧＧＡＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＴＣＴＧＡＡ
ＡＣＡ
ＡＣＡＴＴＣＡＴＧＴＧＴＧＡＡＴＡＴＧＣＴＧＡＴＧ
ＡＧ
ＡＣＡＧＣＡＡＣＣＡＴＴＧＴＡＧＡＡＴＴＴＣＴＧＡ
ＡＣＡ
ＧＡＴＧＧＡＴＴＡＣＣＴＴＴＴＧＴＣＡＡＡＧＣＡＴ
ＣＡＴ
ＣＴＣＡＡＣＡＣＴＧＡＣＴ。 ２ Trpプロモーターの下流に次式で示される
DNA配列が発現可能に結合した発現ベクター：
ATGGCGCCTACTTCAAGTTCTACAAAGA
ＡＡＡＣＡＣＡＧＣＴＡＣＡＡＣＴＧＧＡＧＣＡＴＴＴ
ＡＣＴ
ＧＣＴＧＧＡＴＴＴＡＣＡＧＡＴＧＡＴＴＴＴＧＡＡＴ
ＧＧ
ＡＡＴＴＡＡＴＡＡＴＴＡＣＡＡＧＡＡＴＣＣＣＡＡＡ
ＣＴ
ＣＡＣＣＡＧＧＡＴＧＣＴＣＡＣＡＴＴＴＡＡＧＴＴＴ
ＴＡＣ
ＡＴＧＣＣＣＡＡＧＡＡＧＧＣＣＡＣＡＧＡＡＣＴＧＡ
ＡＡＣ
ＡＴＣＴＴＣＡＧＴＧＴＣＴＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＴ
ＣＡＡ
ＡＣＣＴＣＴＧＧＡＧＧＡＡＧＴＧＣＴＡＡＡＴＴＴＡ
ＧＣＴ
ＣＡＡＡＧＣＡＡＡＡＡＣＴＴＴＣＡＣＴＴＡＡＧＡＣ
ＣＣＡ
ＧＧＧＡＣＴＴＡＡＴＣＡＧＣＡＡＴＡＴＣＡＡＣＧＴ
ＡＡＴ
ＡＧＴＴＣＴＧＧＡＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＴＣＴＧＡＡ
ＡＣＡ
ＡＣＡＴＴＣＡＴＧＴＧＴＧＡＡＴＡＴＧＣＴＧＡＴＧ
ＡＧ
ＡＣＡＧＣＡＡＣＣＡＴＴＧＴＡＧＡＡＴＴＴＣＴＧＡ
ＡＣＡ
ＧＡＴＧＧＡＴＴＡＣＣＴＴＴＴＧＴＣＡＡＡＧＣＡＴ
ＣＡＴ
ＣＴＣＡＡＣＡＣＴＧＡＣＴ。 ３ 前記DNA配列が、pTrp321に発現可能に結
合している特許請求の範囲第２項に記載の発現ベ
クター。 ４ pTrp−hIL201である特許請求の範囲第３項
に記載の発現ベクター。 ５ Trpプロモーターの下流に次式で示される
DNA配列が発現可能に結合した発現ベクターを
有する大腸菌：
ATGGCGCCTACTTCAAGTTCTACAAAGA
ＡＡＡＣＡＣＡＧＣＴＡＣＡＡＣＴＧＧＡＧＣＡＴＴＴ
ＡＣＴ
ＧＣＴＧＧＡＴＴＴＡＣＡＧＡＴＧＡＴＴＴＴＧＡＡＴ
ＧＧ
ＡＡＴＴＡＡＴＡＡＴＴＡＣＡＡＧＡＡＴＣＣＣＡＡＡ
ＣＴ
ＣＡＣＣＡＧＧＡＴＧＣＴＣＡＣＡＴＴＴＡＡＧＴＴＴ
ＴＡＣ
ＡＴＧＣＣＣＡＡＧＡＡＧＧＣＣＡＣＡＧＡＡＣＴＧＡ
ＡＡＣ
ＡＴＣＴＴＣＡＧＴＧＴＣＴＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＴ
ＣＡＡ
ＡＣＣＴＣＴＧＧＡＧＧＡＡＧＴＧＣＴＡＡＡＴＴＴＡ
ＧＣＴ
ＣＡＡＡＧＣＡＡＡＡＡＣＴＴＴＣＡＣＴＴＡＡＧＡＣ
ＣＣＡ
ＧＧＧＡＣＴＴＡＡＴＣＡＧＣＡＡＴＡＴＣＡＡＣＧＴ
ＡＡＴ
ＡＧＴＴＣＴＧＧＡＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＴＣＴＧＡＡ
ＡＣＡ
ＡＣＡＴＴＣＡＴＧＴＧＴＧＡＡＴＡＴＧＣＴＧＡＴＧ
ＡＧ
ＡＣＡＧＣＡＡＣＣＡＴＴＧＴＡＧＡＡＴＴＴＣＴＧＡ
ＡＣＡ
ＧＡＴＧＧＡＴＴＡＣＣＴＴＴＴＧＴＣＡＡＡＧＣＡＴ
ＣＡＴ
ＣＴＣＡＡＣＡＣＴＧＡＣＴ。 ６ 前記DNA配列が、pTrp321に発現可能に結
合している特許請求の範囲第５項に記載の大腸
菌。 ７ 前記発現ベクターがpTrp−hIL201である特
許請求の範囲第５項に記載の大腸菌。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB838303383A GB8303383D0 (en) | 1983-02-08 | 1983-02-08 | Sequences recombinant dna molecules |
| GB8303383 | 1983-02-08 | ||
| GB8315981 | 1983-06-10 |
Publications (2)
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ID=10537631
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|---|---|---|---|
| JP59019524A Granted JPS59220189A (ja) | 1983-02-08 | 1984-02-07 | ひとインターロイキン２様ポリペプチドをコードするｄｎａ配列、該ｄｎａ配列を有する発現ベクターおよび該発現ベクターを有する大腸菌 |
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|---|---|
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| GB (2) | GB8303383D0 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| WO1986006405A1 (fr) * | 1985-05-02 | 1986-11-06 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Nouveau transformateur et son utilisation |
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Family Cites Families (5)
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Also Published As
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