JPS61501430A - 修飾ガンマ・インタ−フェロン、そのｉｆｎをコ−ドするｄｎａ配列およびそのｉｆｎの生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 修飾ガンマ・インターフェロン、そのＩＦＮをコードするＤＮＡ配列およびその ＩＦＮの生産方法発明の技術的分野 本発明は、修飾ガンマ・インターフェロン、それをコードするＤＮＡ配列、およ び生産方法に関する。より詳細には、本発明は、より易溶性を有し、従ってより 精製しゃすく、極めて安定であり、かつ全長の完全ヒトガンマ・インターフェロ ンと同様のレベルの抗ウィルス−１および抗増殖−生物活性をもつアミノ−Δ３ −ガンマ・インターフェロンに関する。

また、本発明はアミノ−Δ３−ガンマ・インターフェロンをコードするＤＮＡ配 列およびアミノ−Δ３−ガンマ・インターフェロンを生産するために、そのＤＮ Ａ配列を発現させる方法に関する。加えて、本発明は、抗ウィルス、抗腫瘍、抗 ガン、もしくは免疫調節への応用および方法に、このアミノ−Δ３−ガンマ・イ ンターフェロンを用いた組成物および方法に関する。最後に、本発明は、ガンマ ・インターフェロンに限らず、選定タンパクおよびポリペプチドをコードするＤ ＮＡ配列の発現レベルを上昇させるための方法およびＤＮＡ配列に関する。

技術的背景 本出願においては、ネイチャー、第２８６巻、第１１０頁（４９８０年７月１０ 日）に掲載されたインターフェロン命名法を用いる。ｒ　Ｉ　ＦＮＪはインター フェロン、ｒｌＦＮ−αＪは白血球インターフェロン、ｒｌＦＮ−β」はｍ維芽 細胞インターフェロン、そして、ｒＩＦＮ−γ」は免疫もしくはガンマ・インタ ーフェロンを示す。アミン末端から３つのアミノ酸を除去した本発明のアミノ− Δ３−ガンマ・インターフェロンはアミノ−Δ３−ＩＦＮ−γとあらゎす。ここ では、便宜上、アミノ酸について、Ａ、レーニンジャー、「バイオケミストリー 」、第７３−７６頁（第２版　１９１５年）に定義されたように３字の略字を用 いる。

ＩＦＮは、広範囲のウィルスについて、ウィルス複製に対して起こる細胞質ＲＮ Ａとタンパク合成の誘導を通じて、抗ウィルス活性を示す細胞質タンパクである 。例えば、ヒトＩＦＮは以下のようなウィルス活性に対抗するために用いられて いる：呼吸感染［テキサス・レポート・オン・バイオロジー・アンド・メディス ン、第３５巻、第４８６−９６頁（１９７７）（これ以後「テキサス・レポート 」と呼ぶ）〕；単純ヘルベ　−ス角膜炎、［テキサス・レポート、第４９７−５ ００頁；Ｒ，サンドマッヒャー、「眼病における外生インターフェロン」、イン ターナショナル・パイロ占ジー■、ハーグ、アブストラクト・ｎ　ｒ　、　Ｗ２ ／１１、第９９頁（１９７ｇ＞　］　：急性出血結膜炎［テキサス・レポート、 第’５０１−５１０頁］：アデノウィルス性角膜−結膜炎［Ａ、ロマー）等、Ｉ ＳＭメモｌ−Ａ３１３１（１９７９年１０月）〕、水痘−帯状痘心〔テキサス・ レポート、第５１１−１５頁；サイトメガロウィルス感染［テキサス・レポート 、第５２３−２７頁］：およびＢ型肝炎［テキサス・レポート、第５１６−２２ 頁］。マたは、Ｗ、Ｅ、　スチュ’）−トＴｌ、インターフェロン・システム、 第３０７−２１頁、スブリンガー・ベルラーグ（第２版）　（１９８１）　（こ れ以後「インターフェロン・システムＪと呼ぶ）も参照しうる。

ＩＦＮは、抗ウィルス作用に加えて、他の作用をも有する。

例えば、ＩＦＮはコロニー刺激因子の力を弱め、造血性コロニー形成細胞の成長 を阻害し、顆粒白血球とマクロファージ前駆体の正常な分化を妨害する［テキサ ス・レポート、第３４３−４９頁］。また、ＤＭＳＯ処理したフレンドの白血病 細胞で、赤血球状体の分化を阻害する［テキサス・レポート、第　４２０−２８ 頁コ。

ＩＦＮは、また免疫応答の調節の役割も果す。例えば、抗原に関して、外用薬の 投与量と時間に依存して、ＩＦＮはインビボおよびインビトロで、免疫増強と免 疫抑制の両方に作用する［テキサス・レポート、第３５７−６９頁１゜加えて、 ＩＦＮは、キラーリンパ球および抗体依存性細胞媒介細胞障害の活性を増大させ ることも知られている［Ｒ，Ｒ，ハーバ−マン等、「ヒトナチュラル・インター フェロンおよび抗体依存性細胞媒介細胞障害による増強」、ネイチャー、第２２ ７巻、第２２１−２３頁（１９７９）　；　Ｐ’、ベバリー及びり、ナイト、「 キリング　カムス・ナチュラリー」、ネイチャー、第２７８巻、第１１９−２０ 頁（１９７９）　：テキサス・レポート、第３７５−８０頁：Ｊ、Ｒ，ツユ−ド ルストーン等、［インターフェロン治療法におけるヒトのナチュラル・キラー細 胞の誘導と反応速度論」、ネイチャー、第２８２巻、第４１７−１９頁（１９７ ９）　：Ｓ、アインホルン等、「インターフェロンおよびヒトで自然発生する細 胞障害、■、外生白血球インターフェロンを受容する患者の研究」、アクタ・メ ディスン・イン・スカンディナビア、第２０４巻、第４７８−８３頁（１９７ｇ ＞　］。

キラーリンパ球と、抗体依存性細胞媒介細胞障害は、直接的あるいは間接的に、 腫瘍細胞への免疫攻撃に含まれうる。

従って、抗ウィルス剤としての使用に加えて、ＩＦＮは抗腫瘍および抗ガン治療 並びに免疫調節剤および方法への応用が可能である［インターフェロン・システ ム、第３１９−２１頁、第２５０−５６頁１゜現在、ＩＦＮが、多数の動物で、 多種の腫瘍の成長に影響することが知られている［インターフェロン・システム 、第２９２−３０４頁］。

インターフェロンは、他の抗腫瘍剤のように、小さなｌｆｆ１に直接作用するの が最も効果的であると思われる。動物ＩＦＮの抗腫瘍作用は投与量と時間に依存 するが、毒素レベル以下の濃度で作用する。従って、多くの研究と臨床試験が、 ヒトＩＦＮの抗腫瘍および抗ガン性につき行われ続けている。

これらには、骨肉腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫およびホジキン病のよう な、いくつかの悪性の病気が含まれる［テキサス・レポート、第４２９−３５頁 ］。これらの臨床試験の結果は励みになるとはいえ、ヒトＩＦＮの抗腫瘍、抗ガ ンおよび免疫調節への応用は、精ＩＩＦＮの充分な供給がなされないためにひど く妨げられてきた。

ウィルスと腫瘍またはガンに対するインターフェロン治療法は、いろいろな投与 口といくつかの投与形態でなされてきた［インターフェロン・システム第３０６ −２２頁］。例えば、インターフェロンは経口的に、または、接種により（静脈 内、筋肉内、鼻孔内、皮内、および皮下）、並びに目薬、軟膏、噴霧剤の形で効 果的に投与されてきた。通常、１０　〜１０　単位の投与口で１日に１〜３回投 薬される。

治療の程度と投与量とは、患者と治療の状態に依存する。

例えば、ウィルスの感染は、毎日もしくは毎日２回の割合で数日から２週間にわ たる投与がなされ、腫瘍およびガンは、通常、毎日または毎日複数回の割合で数 ケ月から数年にわたって投与される。勿論、投与された患者にとって最も効果的 な治療法は、病気の進行具合、以前に施された治療・投与法・投与】の選択にお ける患者のインターフェロンに対する応答などのような周知の因子について配慮 する主治医によって決定されるべきである。

インターフェロンは、１型ＩＦＮと■型ＩＦＮの２つのグループに分類される。

１型ＩＦＮはウィルスや合成ポリヌクレオチドによって誘導される「古典的な」 酸安定性ＩＦＮであり、一般的にＩＦＮ−αとＴＦＮ−βの２種より成る。■型 ＩＦＮは、ＩＦＮ−γと名付けられた１種のみである。

ｒＦＮ−γは免疫或いはガンマ・インターフェロンともよばれる。

ＩＦＮ−γは、特異的抗原や種々のミトーゲンによってリンパ球で誘導される糖 タンパクであり、抗原的にｆＦＮ−αおよびＩＦＮ−βと区別される［Ａ、ミッ ラヒ等、「インターフェロンのグリコジル化」、ジャーナル・オブ・バイオロイ ンターフェロン・システム、第１０７−０８頁：Ｐ、グレイ等、「ヒト免疫イン ターフェロンＣＤＮＡの大腸菌（Ｅ−ｃｏｌｉ）およびサル細胞における発現」 、ネイチャー、第２９５巻、第５０３−５０８頁（１９８２）　：Ｍ、　Ｐ、ラ ングフォード等、「ヒト免疫インターフェロンの大量生産と物理化学的特性Ｊ、 インフエクション・アンド・イムニティ、第２６巻、第３６−４１頁１゜このタ ンパクは、４０．０００〜４６．０００ダルトンの分子口をもち、恐らくグリコ ジル化された状態では、６５，０００〜７０．０００の分子量をもつと報告され ている。しかしながら、グリコジル化なしでもタンパクの生物活性にはほとんど 影響しない。ざらに、ＩＦＮ−γをグリコジル化したｒＤＮＡおよびグリコジル 化しないｒＤＮＡの両方についておこなった研究室の実験では、非グリコジル化 ＩＦＮ−γは、抗ガン剤として、グリコジル化されたＩＦＮ−γに比べ、僅かな がら毒性が低くがっ僅がながら活性が高かった。しかしながら、非グリコジル化 ＩＦＮ−γは抗ウィルス剤として僅かに活性が低い。

酸に不安定（ｐＨ２）であることに加えて、１ＦＮ−γは５６℃で一時間おくと 不活性化することが報告されている。

［Ｍ、プレイ等、「ミトーゲンによりヒト白血球で誘導されるインターフェロン ：生産、部分精製及び特性」、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー 、第１０巻、第８７７−８３頁（１９８０）　：Ｙ、　Ｋ、イエツブ等、「ヒト γ（免疫）インターフェロンの部分精製と特性」、プロシーディンゲス・オブ・ ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス　ＵＳＡ、第７８巻、第１６０１− ０５頁（１９８１）をも参照コ、ｒＦＮ−γ１．ｔ、ＩＦＮ−αやｒＦＮ−βよ りも他の異なった細胞リセブターを認識することが報告されている［Ａ、Ａ、ブ ランカ等、「Ｔ型及び■型インターフェロンは異なったりセブターを有する証拠 Ｊネイチャー、第２９４巻、第７６８−７０頁（１９８１）　］。

さらに、ＩＦＮ−γは、いろいろな研究官での研究で、ヘルペス・ジュニタリス のようなあるウィルスに対して効能をもつということが示されてきた。

抗ウィルス活性に加えて、ＩＦＮ−γは抗腫瘍もしくは抗ガン活性を示す。いろ いろな研究から、ＩＦＮ−γは直接的および間接的にある種の腫瘍細胞の成長を 阻害し或いは殺してしまうということが示されている。さらに、ＩＦＮ−αおよ びＩＦＮ−βと比較して、ＩＦＮ−γの抗腫瘍活性は少なくともマウスにおいて 腫瘍を抑制する。加えて、ＩＦＮ−７によるナチュラル・キラー細胞の活性化は 、ＩＦＮ−α及びＩＦＮ−βで観察されるようにプラトーには開運しない。また ＩＦＮ−γは、循環しているガングリオシドのレベルによって、ＩＦＮ−α及び ＩＦＮ−βよりも阻害が少ない［Ｈ。

アンケル等、「マウス繊維芽細胞（１型）及び免疫（■型）インターフェロン： ガングリオシドとの親和性並びにマウス白血病Ｌ　−１２１ＯＲ細胞に対する抗 ウイルス性及び抗成長力における明白な相違Ｊ、プロシーディンゲス・オブ・ナ ショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス　ＵＳＡ、第７７巻、第２５２８−３ ２頁（１９８０）　］。従って、細胞もしくは腫瘍、特に固形腫瘍、例えば肺、 胸及び結腸−直腸ガンなどは、Ｉ　ＦＮ−（（もしくはｒＦＮ−βに対して、余 り応答を示さないが、ＩＦＮ−７で効果的に治療されうるし例えば、フレイネ等 、ジャーナル・オブ・ナショナル・キャンサー・インスティチュート、第６１巻 、第８９１頁（１９７８）　：バーン等、アブストラクト・オブ・Ｎ、Ｙ、アカ デミ−・オブ・サイエンス、第１１巻（４９７９年１０月２３−２６日）；ブラ ロツク等、セルラー・イムノロジー、第４９巻、第３９０−３９４頁（１９８０ ）　：Ｂ、　Ｙ、ルピン等、「抗ウィルス及び抗増殖剤としてのヒト工型及び■ 型インターフェロンの異なる効能」、プロシーディンゲス°オブ・ナショナル・ アカデミ−・オブ・サイエンス　ＵＳＡ。

第７７巻、第５９２８−３２頁（１９８０）　Ｊ。

ＩＦＮ−γは、その他に免疫調箇剤として利用されうる。

形質転換細胞に対するＩＦＮ−γの抗増殖効果は、Ｉ　ＦＮ−αもしくはＩＦＮ −βの１０〜１００倍大きいという報告がある［Ｐ、Ｗ、グレイ等、前出］。

ヒトＩＦＮ−γをコードするＤＮＡＩｅ列は、クローン化され、ＩＦＮ−γを産 生するようないろいろな宿主を形質転換するために利用されてきた［例えば、Ｗ 、フィアーズ等、「ヒト繊維芽細胞及びヒト免疫インターフェロン遺伝子、並び に相同及び異質細胞におけるそれらの遺伝子の発現」フィル・トランス・アール ・ソサエティ　ロンドン、Ｂ第２９９巻、第２９−３８頁（１９８２）　：　Ｐ 、　Ｗ、グレイ等、「ヒト免疫インターフェロンＣＤＮＡの大腸菌及びサル細胞 における発現」、ネイチャー、第２９５巻、第５０３−０８頁（１９８２）コ。

ＩＦＮ−γをコードする配列の構成として、ＴＦＮ−γを適切に形質転換した細 胞内で、高レベル（全タンパクの１０％以上）で産生させるような、いろいろな 発現制御配列が存在する。そのようなＩＦＮ−γのｒＤＮＡ産生は、抗ウィルス 、抗ガン及び免疫調節の方法及び薬剤の臨床研究のためのこのタンパクの以前の 深刻な不足を解決するために望まれていた。しかしながら、かなえられていなか った。

むしろ、形質転換された細胞は大量の外来性ＩＦＮ−γを蓄積するので、ＩＦＮ −１分子はお互いに相互作用して、正常細胞にはあまり見られない極めて溶解し にくい凝集体を形成する。その細胞は、それから、外来性タンパク凝集体が包み こまれた包合体を形成することによって、このタンパクの蓄積物に反応する。こ の難溶性と細胞内パフケージングによって、ＩＦＮ−γを含んだ凝集体は細胞か ら分離しうる。しかし、抽出と緩衝液への再懸濁をおこなったあとでも、ＩＦＮ −γが産生される細菌やいろいろな宿主の細胞抽出物から、ＩＦＮ−γを精製す ることは困難である。従って、これらのｌｉｄの問題は、抗ウィルス、抗ガン及 び免疫調節の方法及び組成物に利用するために必要な量のＩＦＮ−γを確保する ために欠点となった。

発明の開示 本発明は、［ＦＮ−γを、ＩＦＮ−γの全長からアミン末端の３個のアミノ酸残 基を欠失させて、より溶解しゃすく、従って精製しやすいアミノ−Δ３−ＩＦＮ −γを提供することにより、上記問題を解決するものである。この欠失は、タン パクの生物活性をほとんど変化させない。しかも、極めて安定であり、以前に作 られた組換えＩＦＮ−γに比べてより溶解しやすく、従って精製しゃすいＩＦＮ −γ様タンパクを提供する。

本発明のアミノ−Δ３−　Ｉ　ＦＮ−γは、医薬上有効ωのタンパクを含有する ような抗ウィルス、抗増殖もしくは免疫調節用組成物、またはそのような組成物 の医薬上有効団により医薬上許容しうる方法で細胞を処理することを特徴とする 抗ウィルス、抗増殖もしくは免疫調節方法に利用しうる。

本発明はまた、アミノ−Δ３−　Ｉ　ＦＮ−γをコードするＤＮＡ配列及びこれ らのＤＮＡ配列を用いてアミノ−Δ３−ＩＦＮ−γを生産する方法をも含んでい る。より好ましくは、本発明のＤＮＡ配列は、ＩＦＮ−γ遺伝子の非コード領域 のヌクレオチドの欠失によるが、少なくとも非コード領域のカルボキシ末端にポ リＧテールを残すことにより、さらに煤飾される。この欠失により、形質転換さ れたいろいろな宿主内での遺伝子の発現がさらに増強され、その結果アミノ−Δ ３−−ＩＦＮ−γの収量が増加する。また、他のＩＦＮ−γ様ポリペプチドの発 現レベルを上昇させるために単独で用いうる。

さらに、そのようなある選定タンパクもしくはポリペプチドをコードしかつ３′ ポリＧテールをもつ全ゆるＤＮＡ配列の非コード領域における３′側の非コード 領域の欠失は、形質転換された宿主細胞内におけるそのＤＮＡ配列の発現レベル を上昇させ、かつその細胞内での選定タンパク生産世のレベルを増進させる。

第１図は、クローン化されたＩＦＮ−γ遺伝子の非コード領域のヌクレオチド欠 失を含む組換えＤＮＡ分子を作成するための、本発明の方法の一実施例を示す略 図である。

第２図は、上記ヌクレオチド欠失とアミノ−Δ３−ＩＦＮ−γをコードするＤＮ Ａ配列とを含む組換えＤＮＡ分子を作成するための、本発明の方法の一実施例を 示す略図である。

第３図は、ｐｅｒ　ｏｒｉ　γプラスミドの重要な部位を示す略図である。

第４図は、合成ヌクレオチド配列と、その配列を利用してＩＦＮ−γをコードす る配列に９つのヌクレオチド欠失を生じさせ、アミノ−Δ３−　Ｉ　ＦＮ−ｒを コードするＣＩＮＡ配列を作成することに関する略図である。

第５図は、本発明の方法の出発物質として有用な組換えＤＮＡ分子のＩ　ＦＮ− ７を含む挿入物のＤＮＡ配列図である。

本発明の実施における居食方法 ここに開示する発明についてより充分に理解するため、以下詳細に説明する。

本発明には、以下の用語を用いた。

ＤＮＡ配列：となりあったペントースの３′位および５′位の炭素がホスホジエ ステル結合によって、次々に連結した直鎖状ヌクレオチド。

ポリペプチド：となりあったアミノ酸のα−アミノ基とカルボキシ基がペプチド 結合によって次々に連結した直鎖状アミノ酸。

ＩＦＮ−γ様ポリペプチド：完全ＩＦＮ−γと実質的に同発現：あるポリペプチ ドをコードするＤＮＡ配列が、そのＤＮＡ配列をもつ宿主内でそのポリペプチド を産生するという転写と翻訳の組合せ。

発現制御配列二ＤＮＡ配列に作用結合した際、そのＤＮＡ配列の発現を制御・調 節するヌクレオチド配列。発現ゐ１ｊ仰配列は、例えばｌａｃ系、ｔｒｐ系、λ ファージの主要オペレーター・プロモーター領域、ｆｄコートタンパクの制御領 域、ＴＡＣおよびＴＲＣ系、並びに前核もしくは真＠細胞およびそれらのウィル スのＤＮＡ配列で発現を制御していることが知られている他の配列、またはそれ らの組合せを含む。

クローニング・ビークル：宿主細胞内で複製が可能で１個もしくは少数のエンド ヌクレアーゼ認識部位によって特徴づけられ、その部位でＷＨ、コートタンパク の産生もしくはプロモーターや結合部位等のＤＮＡの本質的な生物別能の付随的 損失なしに決定できるように切断でき、かつテトラサイタリン耐性もしくはアン ピシリン耐性などの形質転換された細胞の同定に使用するのに適したマーカーを 含むプラスミド、ファージＤＮＡまたは他のＤＮＡ配列。クローニング・ビーク ルはベクターとも呼ばれる。

クローニング：無性的再生によって、生物もしくはＤＮＡ配列に由来するような 生物もしくはＤＮＡ配列を大口に得るための方法。

組換えＤＮＡ分子もしくはバイブリドＤＮＡ　：末端と末端を結合した異なるゲ ノムからのＤＮＡ断片を含む分子。

本発明は、完全ＩＦＮ−γの７ミノ末端にて３つのアミンフィルス（Ｂａｃｉｌ ｌｕｓ　ＳｔｅａｒＯｔｈｅｒｍＯＤｌｌｉｌＵＳ　＞および他の細菌等のよう な細菌宿主、酵母、他の真菌類、培養した動物（ヒトを含む）および植物細胞の ような動物および植物宿主、または他の宿主を含む。特別な宿主の選定によって 、アミノ−Δ３−ＩＦＮ−γがグリコジル化されるかどうかが決定されることを 了解すべきである。例えば、もしＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞で作られれば 、アミノ−Δ３　１ＦＮ−γはグリコジル化されるが、一方大腸菌で作られれば グリコジル化されないであろう。アミノ−Δ３−　Ｉ　ＦＮ−γの両形態とら本 発明に含まれる。

いろいろな発現制御配列が用いられうる。例えば、大腸菌のラクトース・オペロ ン（ｒｌａｃ系Ｊ）のオペレーター・プロモーターおよびリポソーム結合・相互 作用配列（シャインーダルガーノ配列のような配列を含む）、大腸菌のトリプト ファン合成系（「ｔｒｐ系」）のそれらに対応する配列、λファージの主要オペ レーター・プロモーター領域（ｏＬＰＬおよび０ＲＰＲ）、Ｈ＆雑状（ｆｉｌａ ｍｅｎｔｏｕｓ　）−重鎖ＤＮＡファージの制御領域、または前核・真核細胞お よびそれらのウィルスの組合せの遺伝子の発現を制御する他の配列などが含まれ る。

勿論、全てのベクター−発現制御配列−宿主の組合せが、等しい効率を持つわけ ではない。特異的な組合せの特定の選択は、本発明の範囲を逸脱することなく本 明細書の説明にしたがって当業者には可能である。

完全ＩＦＮ−γをコードする配列もアミノ−Δ３−Ｉ　ＦＮ−γをコードする配 列も、共にＡＴＧ開始コドンで始まらないので、発現させる前に翻訳開始シグナ ルをコード配列の前に挿入しなければならないことに注意しなければならない。

ＡＴＧコード配列を組合せるというこのような構成は本発明の範囲内で当業者に よってなされうる。このような構成により、適切に形質転換された宿主内でｆ− ｍｅｔ−ＩＦＮ−γもしくはｆ−ｍｅｔ−アミノ−Δ３−ＩＦｘ−γの合成が可 能になる。しかしながら、アミノ末’Ｕ　Ｍ　ｅ　ｊが存在するがしないかによ って生じる異質性は、大腸菌などのいくつかの宿主が、ある程度まで７ミノ末端 のメチオニンを解離させることが知られているので、排除できない。

本発明およびそれを用いた方法を充分に理解するために、以下の実施例を示すが 、この実施例のみに限定されない。本発明の範囲からはずれることなしに、この アミノ−Δ３−ＩＦＮ−γの構成、生産および使用の為には他の手段および方法 も用いられうる。

実施例 第１図および第２図を参照して、本発明のより好ましいＤＮＡ配列を作成する為 の方法の一実施例の概略を示した。

この配列は、アミノ−Δ３−　Ｉ　ＦＮ−γをコードし、またＩＦＮ−γの３′ 側の非コード領域に４２２個のヌクレオチドの欠失がある。この実施例に従って 、最初にヌクレオチド消化により、３′側の非コード領域から４２２＠のヌクレ オチドを欠失させた。次いで、特定部位突然変異誘発（ｓｉｔｅ　５ｐｅｃｉｆ ｉｃ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）により、ＩＦＮ−γ遺伝子の５′端コード領域 （アミノ末端）にあるＡＴＧ開始コドンのあとの９個のヌクレオチドを欠失させ た。

ここに記載する本発明の実施例に用いた出発材料は、ｔｒｐ−由来発現制御配列 に作用結合させた（例えば第３図および第５図参照）完全ＩＦＮ−γをコードす るＤＮＡ配列を含むｐｅｒ　ｏｒｉ　７　（第１図（ａ））を持つ組換えＤＮＡ 分子である。この分子はまた、完全ＩＦＮ−γの最初のアミノ酸であるコード配 列（ＴＧＴ）に付けた翻訳開始シグナル（ＡＴＧ）を持ち、ｔｒｐ発現制御配° 列のシャインーダルガーノ配列と開始コドンとの間に１つのＣＩａＩ切断部位を 持っている（第３図および第５図）。第３図および第５図でより詳細に示される ように、この分子はまた３′側の非コード領域のカルボキシ末端の限界を示す３ ａｍＨＩ切断部位まで、ｒＦＮ−γ遺伝子の３′側の非コード（非翻訳）領域部 分を含んでいる。この非コード領域はまた、その配列内にＸｈｏ　［およびＲｓ ａ　Ｉ制限切断部位を含んでいる。残りの分子（ＢａｍＨＩ部位〜ｔｒｐ配列） は、プラスミドｐＢＲ３２２に含まれており、ＰｓｔＩ制限切断部位を持ってい る。

本発明のこの実施例ではこの組換え分子を出発材料として用いたが、他のどんな 由来の［ＦＮ−γのコードもしくは非コード領域でもこのアミノ−Δ３−ＩＦＮ −γを生産する為に同様に用いうろことを理解すべきである。

第１０の工程（ａ）に示したように、最初にｐｅｒ　ｏｒｉ　γをＲｓａＩで切 断し、ＩＦＮ−γ遺伝子の３′側の非コード領域に）（ｉｎｄｌｌ［制限切断部 位を作るために、ＨｉｎｄＩ［［リン切断し、直鎖状にしたＤＮＡを２つに分け た（第１図　工程断ＤＮＡの１つを、ＨｉｎｄＩＩＩ切断後の部位を平滑末端に するために８１ミクロコツカスヌクレアーゼで処理した。この処理ＤＮＡをアガ ロースゲルで精製し、ｐｓｊ工で切断し、生じた断片の大きい方（８ａｍＨＩ部 位を含む）を７ガロースゲルで精製した（第１図、工程（ｄ））。

前記のＨｉｎｄｌｌ［切断ＤＮＡのもう一方は、２重鎮ＤＮＡを消化する酵素で あるＢａ１３１ヌクレアーゼを用いて、直鎖状ＤＮＡの各末端から４２２ヌクレ オチドが取除かれるような条件下で消化した（第１図、工程（Ｃ））。アガロー スゲルで、この消化ＤＮＡを１１７したのち、このＤＮＡをＰｓｔＩで切断し、 生じた断片の小さい方（ｔｒｐ１ｉ＋１１１１配列、ＩＦＮ−γ遺伝子のコード 領域、およびＩＦＮ−γ遺伝子の非コード領域の始めの部分を含む）を精製した （第１図、工程（ｄ））。選択された断片上のＩＦＮ−γ遺伝子の非コード領域 は、Ｈｉｎｄｌ１１部位がらＩＦＮ−γ遺伝子のコード領域に向かって消化され 、その結果この領域の４２２個のヌクレオチドの欠失が生じた。この欠失を、第 ５図に角括弧で示す。

上記の２種のＤＮＡ断片を、次いでＩＦＮ−γ遺伝子の３′側の非コード領域に ４２２個のヌクレオチド欠失を生じたことを特徴とする再環状化ＤＮＡを作るた めに結合させた（第１図、工＆（ｅ））。この欠失により、このＤＮＡ分子で形 質転換した細胞内で、ＩＦＮ−γ遺伝子は高頻度で発現した。すなわち、全細胞 タンパクのおよそ２０〜３０％に及んだ。この欠失は、全ゆる＋ＦＮ−γコード 配列に有効である。従って、下記のように、アミノ−Δ３−　Ｉ　ＦＮ−γのコ ード配列と組合せることは必要でない。そのかわり、他の１ＦＮ−γやＩＦＮ− γ様ポリペプチドの生産において有効に用いうる。

前記の様に８ａ１３１ヌクレアーゼを用いて、より長時間消化しかつＸｂａ　Ｉ リンカ−を用いることによって、ＩＦＮ−Ｔ遺伝子の３′側の非コード領域に４ ８４ｇＪＡのヌクレオチド欠失を生じたことを特徴とするＤＮＡを作成した。こ の欠失ではＩＦＮ−γの収缶は４２２個のヌクレオチド欠失と同等か、もしくは 幾分多かった。従って、本発明の方法を用いて、ＩＦＮ−７１伝子の３′側の非 コード領域の全ゆる長さの欠失をｒＦＮ−γの収□□□を増加させるために作成 しうる。

ＩＦＮ−７遺伝子へ前述の欠失を組込んだあと、アミノ−へ３−ＩＦＮ−γのコ ード配列を作るために、ＩＦＮ−γの５′コード領域に９個のヌクレオチド欠失 を導入した。出発材料となった組換えＤＮＡ分子ｐｅｒ　ｏｒｉ　γについて、 非コード領域に４２２個のヌクレオチド欠失を導入するための最初の処理をして いる間、アミノ末端の先頭に９ヌクレオチドの欠失の導入も行うこともでき、或 いはこの欠失と４２２個の非コード領域の欠失を組合せなくてもよいことを了解 すべきである。けれども、高レベルの発現が得られるので、この発現ご一クルは 両方の欠失をもっている方が望ましい。

第２図に示したように、再環状化したＤＮＡ分子を２つの方法で処理した。１つ は、Ｃｌａ工とＢａｍＨＩを、これらの制限酵素の製造元の提示した条件下で用 いて、このＤＮＡを切断し、アガロースゲルで、大きい方のＣ１ａニ−ＢａｍＨ Ｉ断片を単離・緒製した（第２図、工程（ａ））。

この断片は、ｔｒｐ制園配列の一部、ＰｓｔＩ切断部位およびＩＦＮ−γ遺伝子 の３′側非コード領域の一部分を含んでいる（第２図）。次いで、この断片（２ 本鎖）を１本鎖Ｃ１ａＩ−ＢａｍＨよりＮＡ断片にするために、０．１ＮＮａＯ Ｈ中で至温で１０分間変性させたく第２図、工程（ｂ））。

再環状化した分子のうち、もう１つは直鎖状化するためＰｓｔｌで切断し、アガ ロースゲルでこの直鎖状ＤＮＡを精製した（第２図、工程（ａ））。次いで、こ の直鎖状２本鎖ＤＮＡを、１本鎖ＤＮＡにするために、０．ｌＮＮａＯＨ中でＶ 温で１０分間変性させたく第２図、工程（ｂ））。

次に、上記の２つの制限切断によって生じた１本鎖ＤＮＡ断片を、６０℃でトリ ス−ＨＣｌ　（ｐＨ８）−ＥＤＴＡ−ＮａＣｌ　（ｒＴＥＮＪ　）ハイブリダイ ゼーション緩衝液中で２〜３時間混合したく第２図、工程（Ｃ））。一方のＤＮ Ａ鎖のＣｌ　ａＩ−ＢａｍＨＩ切断部位の間にギャップのある復元化２本鎖のプ ラスミドを作成するために、２つのＤＮＡ断片を巻きもどしさせた。それからこ の復元ＤＮＡをエタンール沈澱によって精製し、この精ｌＤＮＡをリガーゼ／ポ リメラーゼ緩衝液に再溶解させた。

次に、ＣＧＡＴＡＣＴＡＴＧＣＡＧＧＡＣＣＣという配列をもつ合成オリゴヌク レオチドブライマーを調製した。第４図に示したように、このプライマーは、ｔ ｒｃ＋ｔｄ］ｌ配列の領域とＩＦＮ−γのコード領域のｐｅｒ　ｏｒｉ　１分子 のＤＮＡ配列に相補的である。しかしながら、このプライマーはｐｅｒ　ｏｒｉ γのＤＮＡ配列と比較して、９個のヌクレオチドの欠失がある。この欠失配列、 ＴＧＴＴＡＣＴＧＣは、ＩＦＮ−γのアミノ末端の最初の３つのアミノ酸である システィン−チロシン−システィンのコード配列に対応する。従って、このプラ イマーはｐｅｒ　ｏｒｉ　γの一方のＤＮＡ鎖にバイブリド化したあと、それら の９個のヌクレオチドの欠落したＤＮＡ配列の合成を可能にする。

前述のように、上記のプライマーを復元ＤＮＡの一本鎖ＤＮＡ部分にバイブリド 化した（第２図、工程（ｄ））。このハイブリダイゼーションは、９ヌクレオチ ドの欠失がバイブリド形成を妨げないように、リガーゼ／ポリメラーゼ緩衝液中 で１７℃にて行った。次に、４つのデオキシリボヌクレオチド三リン酸、Ｄ　Ｎ 、Ａポリメラーゼエ（フレノウ断片）およびリガーゼを用いて、−重鎖のＤＮＡ のギャップを埋めた（第２図、工程（ｅ））。この操作によって、一方の鎖にｒ ＦＮ−γの完全なコード配列を有しかつ他方の鎖にＩＦＮ−γの７ミノ末端の最 初の３つのアミノ酸をコードする９個のヌクレオチドを欠いたＤＮＡ配列を有す る、二本鎖ＤＮＡを作成した（第４図）。

次いで、この埋め尽くした二本鎖ＤＮＡで大腸菌に１２株細胞を形質転換し、片 方の鎖に９ヌクレオチドの欠失のあるＤＮＡ配列で形質転換された宿主を選択し た（第２図、工程（ｆ））。選択の為に、グルンシュタインーホッグネス・ハイ ブリダイゼーション・スクリーニングにおいて、４２℃で、先の合成プライマー 配列をプローブとして用いた［Ｈ。

グルンシュタイン及びＯ，Ｓ、ホッグネス、「コロニーハイブリダイゼーション ：特定の遺伝子を含むクローン化ＤＮＡの単離の為の方法」、プロシーディンゲ ス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス　ＵＳＡ、第７２巻、第 ３９６１−６５頁（１９７５）　］。ハイブリダイゼーションによる選択を通じ て、弱いシグナル（間違って起こったもの）と強いシグナル（間違いないもの） とを区別した。

要求する９個のヌクレオチドの欠失をもつＤＮＡ配列を一方の鎖に有するとして 選択された宿主（強いシグナル、プローブの誤認ではない）をとり、栄養分を多 く含んだ培地で成育させ、溶菌すると、１つは全長のＩＦＮ−γに対応し、もう １つはアミノ−Δ３−ＩＦＮ−７に対応する２本のタンパクのバンドが観察され る。２本のバンドが観察されたのは、培養した細胞の複製が進行し、２つの型の 分子を含むようになったという理由による。（第２図、工程（ｆ））。一方は全 長のＩＦＮ−γコード配列をもつＤＮＡ鎖から複製されたものであり、もう一方 はＩＦＮ−γ遺伝子の開始コドンに続く９個のヌクレオチドの欠失をもつＤＮＡ 鎖から複製されたものである。そこで、陽性宿主細胞から少量のプラスミドを取 出して、前述のように４２℃で、合成プローブを用いて、グルンシュタインーホ ッグネス・ハイブリダイゼーション法で、強いシグナルを示すプラスミドを選ぶ ことによって、プラスミドを２つの型に分けた（第２図、工程（ｇ））。

次いで、Ｉ　ＦＮ−７コ一ド配列の５′末端に９つの欠失をもった配列のみを含 むように選んだこれらのプラスミドで、大腸菌に１２ｖＡ胞を形質転換した（第 ５図に枠で囲んだヌクレオチド配列参照）。これらのＴａ　％を培養すると、ア ミノ−Δ３−　Ｉ　ＦＮ−γを示す一本のタンパクのバンドが観察された。全長 ＩＦＮ−γにあたるバンドは検出されなかった。

ＩＦＮ−γの５′末端に９つのヌクレオチドの欠失と３′側の非コード領域に４ ２２個のヌクレオチド欠失をもつＤＮＡ配列をもつプラスミドを、ｐｔｒｐ−ア ミノ−Δ３−ＩＦＮ−γ−Δ４２２と名付けた。

次いで、上記のように作成されたアミノ−Δ３−　Ｉ　ＦＮ−γを、ｐｅｒ　ｏ ｒｉ　γで形質転換された大腸菌宿主から調製された全長のＩＦＮ−γと、抗ウ ィルス活性および抗増殖活性について比較した。この比較により、アミノ−Δ３ −ＩＦＮ−γは、ｐｅｒ　ｏｒｉ　γから得られた組換えｒＦＮ−γと少なくと も同程度の抗ウィルス活性および抗増殖活性をもつことが示された。更に、アミ ノ−Δ３−ＩＦＮ−γは、極めて溶解しやすく、従って精製しやすかった。また 、溶液中で極めて安定であった。

勿論ここでは、アミノ−Δ３−ＩＦＮ−γを作るために１つの方法な示しただけ であり、この修飾ｆＦＮ−γをコードする配列を作成する為には種々の方法があ るということはいうまでもない。例えば、ＤＮＡレベルでは、アミノ−Δ３−Ｉ ＦＮ−γをコードする配列を作成する為に他の方法を用いつる。これには、合成 方法、他の突然変異誘発および欠失方法が含まれる。タンパクレベルでも、アミ ノ−Δ３−　Ｉ　ＦＮ−γを生産する為にいろいろな技術が存在する。

上記の例は、ＩＦＮ−γ遺伝子の非コード領域にさらに４２２個もしくは４８４ 個のヌクレオチド欠失をともにもつＤＮＡ配列によってコードされたアミノ−Δ ３−　Ｉ　ＦＮ−γを示しであるが、本発明はそれには限定されないことを了解 すべきである。むしろ、３′側の非コード領域におけるいろいろな長さのヌクレ オチドの欠失をもつＤＮＡ配列を含んでおり、この欠失はＲｓａＩエンドヌクレ アーゼ認識部位から開始され、ＩＦＮ−γ遺伝子のコード領域に向かって続いて いる方が好ましい。加えて、本発明は、遺伝子のコード領域のアミノ末端に９つ のヌクレオチド欠失のみをもつアミノ−へ３−ＩＦＮ−γをコードするＤＮＡ配 列を含む。その様な例では、例えば、第２図の方式のみが用いられ、ＢａｍＨＩ 切断のかわりにＸｈｏ■切断によるのが好ましい。

更に、本発明は全ゆるタンパクもしくはポリペプチドをコードし、３′側にポリ Ｇテールを有するＤＮＡ配列にまで及び、そのＤＮＡ配列は遺伝子の３′側の非 コード領域にヌクレオチド欠失があるが、少なくとも非コード領域のカルボキシ 末端のポリＧテールは残存するものである。この欠失は、マ哨、２４２ 国際調査報告 一一ψ中−ｈａｍｇｍｍｍ　１１＆ＰＣＴ／ＥＰ　ｆ１５１００１０９入ＮＮＥ Ｘ　Ｔｏ　ＴＯｆＮＴＥＲＮ八τ工０ＮへＬ　ＳＥ入ＲＣＨＲＥＰＯＲＴ　ＯＮ 頁の続き ：１ｎｔ、ＣＩ、４　識別記号　庁内整理番号

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. １．全ＩＦＮ−γのアミノ末端から、システイン、チロシン、システインのアミ ノ酸配列が欠失したアミノーΔ３−ＩＦＮ−γを発現に際しコードするＤＮＡ配 列。
2. ２．ＡＴＧ開始コドンが、完全ＩＦＮ−γのアミノ末端の第４番目のアミノ酸を コードするコドンに直接に接合している請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列。
3. ３．インターフエロン様タンパクを発現の際にコードし、ＩＦＮ遺伝子の３′側 非コード領域と３′ポリＧテールとを含み、かつ３′側非コード領域の少なくと も一部分のヌクレオチドを欠失しているが、ＩＦＮ遺伝子の非コード領域のカル ボキシ末端にポリＧテールを保持しているＤＮＡ配列。
4. ４．ＩＦＮ遺伝子の３′側非コード領域に４２２個のヌクレオチドの欠失をもち 、その欠失がＲｓａＩ制限酵素認識部位で開始しかつＩＦＮ遺伝子のコード領域 に向かつて続いている請求の範囲第３項記載のＤＮＡ配列。
5. ５．ＩＦＮ遺伝子の３′側非コード領域に４８４個のヌクレオチドの欠失をもち 、その欠失がＲｓａＩ制限酵素認識部位で開始しかつＩＦＮ遺伝子のコード領域 に向かつて続いている請求の範囲第３項記載のＤＮＡ配列。
6. ６．完全ＩＦＮ−γのアミノ末端から、システイン、チロシン、システインのア ミノ酸配列が欠失しているアミノーΔ３−ＩＦＮ−γを発現の際にコードし、か つＩＦＮ−γ遺伝子の３′側非コード領域と３′ポリＧテールとを含み、３′側 非コード領域の少なくとも一部分のヌクレオチドを欠失しているが、この遺伝子 の３′非コード領域のカルボキシ末端のポリＧテールを保持しているＤＮＡ配列 。
7. ７．ＩＦＮ遺伝子の３′側非コード領域に４２２個のヌクレオチドの欠失をもち 、その欠失がＲｓａＩ制限酵素認識部位で開始しかつＩＦＮ遺伝子のコード領域 に向かつて続いている請求の範囲第６項記載のＤＮＡ配列。
8. ８．ＩＦＮ遺伝子の３′側非コード領域に４８４個のヌクレオチドの欠失をもち 、その欠失がＲｓａＩ制限酵素認識部位で開始しかつＩＦＮ遺伝子のコード領域 に向かつて続いている請求の範囲第６項記載のＤＮＡ配列。
9. ９．ＡＴＧ開始コドンが、完全ＩＦＮ−γのアミノ末端の第４番目のアミノ酸を コードするコドンに直接に接合している請求の範囲第６項記載のＤＮＡ配列。
10. １０．請求の範囲第１項、第２項、第６項、第７項、第８項または第９項記載の ＤＮＡ配列より成る群から選択し、前記ＤＮＡ配列が組換えＤＮＡ分子内の発現 制御配列に作用結合したＤＮＡ配列を特徴とする組換えＤＮＡ分子。
11. １１．請求の範囲第３項、第４項または第５項記載のＤＮＡ配列からなり、この ＤＮＡ配列が組換えＤＮＡ分子内の発現制御配列に作用結合していることを特徴 とする組換えＤＮＡ分子。
12. １２．請求の範囲第１０項または第１１項記載の組換えＤＮＡ分子の少なくとも 一つで形質転換された宿主。
13. １３．アミノーΔ３−ＩＦＮ−γ、ｆ−ｍｅｔ−アミノーΔ３−ＩＦＮ−γおよ びその混合物より成る群から選択されるポリペプチド。
14. １４．グリコシル化ポリペプチドおよび非グリコシル化ポリペプチドより成る群 から選択される請求の範囲第１３項記載のポリペプチド。
15. １５．請求の範囲第１０項または第１１項記載の組換えＤＮＡ分子によつて形質 転換された宿主の酸酵によつて生産されるポリペプチド。
16. １６．請求の範囲第１０項記載の組換えＤＮＡ分子で形質転換した宿主を培養し 、かつポリペプチドを回収することを特徴とするアミノーΔ３−ＩＦＮ−γの生 産方法。
17. １７．請求の範囲第１１項記載の組換えＤＮＡ分子で形質転換した宿主を培養し 、ポリペプチドを回収することを特徴とするＩＦＮ−γ様ポリペプチドの生産方 法。
18. １８．請求の範囲第１３項乃至第１５項のいずれかに記載のポリペプチドより成 る群から選択される少なくとも１種のポリペプチドを医薬上有効量含有する抗ウ イルス組成物。
19. １９．請求の範囲第１３項乃至第１５項のいずれかに記載のポリペプチドより成 る群から選択される少なくとも１種のポリペプチドを医薬上有効量含有する抗増 殖組成物。
20. ２０．請求の範囲第１３項乃至第１５項のいずれかに記載のポリペプチドより成 る群から選択される少なくとも１種のポリペプチドを医薬上有効量含有する免疫 調節用組成物。
21. ２１．請求の範囲第１３項乃至第１５項のいずれかに記載のポリペプチドより成 る群から選択される少なくとも１種のポリペプチドを医薬上有効量含有する抗ガ ン組成物。
22. ２２．請求の範囲第１３項乃至第１５項のいずれかに記載のポリペプチドより成 る群から選択される少なくとも１種のポリペプチドを含む組成物の医薬上有効量 により、医薬上許容しうる方法で細胞を処理することを特徴とする抗ウイルス、 抗増殖、抗ガンもしくは免疫調節方法。
23. ２３．選定したタンパクもしくはポリペプチドを発現に際しコードするＤＮＡ配 列の３′側の非コード領域の少なくとも一部分を欠失させるが、３′ポリＧテー ルを保持させ、上記ＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子で形質転換した宿主を培 養し、かつ前記タンパクもしくはポリペプチドを回収することを特徴とする、前 記選定タンパクもしくはポリペプチドをコードしかつ３′ポリＧテールをもつＤ ＮＡ配列の宿主内での発現のレベルを上昇させる方法。
24. ２４．タンパクもしくはポリペプチドを発現の際にコードし、そのタンパクもし くはポリペプチド遺伝子の３′側の非コード領域および３′ポリＧテールを含み 、かつ３′側の非コード領域の少なくとも一部分のヌクレオチドを欠失している が、この非コード領域のカルボキシ末端のポリＧテールを保持しているＤＮＡ配 列。
25. ２５．請求の範囲第２４項記載のＤＮＡ配列からなり、このＤＮＡ配列が組換え ＤＮＡ分子内の発現制御配列に作用結合していることを特徴とする組換えＤＮＡ 分子。
26. ２６．請求の範囲第２５項記載の組換えＤＮＡ分子の少なくとも一つで形質転換 した宿主。