JPS59186995A - ヒト免疫インターフェロン蛋白質およびその製造法 - Google Patents

Abstract

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め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、ヒト免疫インターフェロン蛋白質および遺伝
子工学手法によるそれの製造法に関する。

背景技術 インターフェロン（以下ＩＦ’と略称することがある。

）は、高等動物の細胞がウィルスや核酸などの刺激によ
って誘発されて産生ずる蛋白質であシ、抗ウィルス作用
、抗腫瘍作用などを有する。

ヒトの工Ｆには、現在α型、β型およびγ型の３種の性
状の異なるタイプが存在することが知られておシ、α型
およびβ型はウィルスや核酸で、γ型はマイト−ジエン
などで誘発される。

ａ型ＩＦ（以下ＩＰ−ａと略称する）、β型工Ｆ（以下
工Ｆ−βと略称する）に関する研究は比較的す−んでお
り、その産生機構もかなり解明されてきている。さらに
遺伝子操作技術の進歩によって、現在は工Ｆ−ａと工Ｆ
−β１が大腸菌を培養することによ）、工Ｆ−αｌが酵
母を培養することにより、それぞれ生物学的に活性な蛋
白質として、大量に得られるようになった〔ゴエデルら
、ネイチャー、？４７．４１１（１９８０）、イエμべ
μトンら、ヌクレイツク　アンス　リサーチ、９．７３
１（１９８１）、ゴエデμら、同誌、８，４０５７（１
９８０）　、ヒツツエマンら、ネイチャー、？−１３，
７１７（１９８１））。さらに臨床へ応用するだめの大
量生産が試みられるようになってきた。

γ型工Ｆ（以下ＩＦ’−γと略称することがある。

）はリンパ球の芽球化やリンホカイン産生が起るような
状況下で、免疫担当細胞から産生されるため、免疫イン
ターフェロン（以下■−工Ｆと略称することがある。）
とも呼ばれている。エーエＦはＩＦ’−αやＩＰ−βと
比較して、抗細胞増殖活性や抗腫瘍活性が高いといわれ
ておシ、臨床的応用面からよシ期待されている。しかし
、その産生に新鮮なリンパ球が必要であることなどの制
約があるため、これまで効率のよい産生糸は確立されて
いない。また、異なる実験系では、異なる細胞種が異な
る分子種のＩ−ＩＦを産生ずる可能性も示唆されてお９
、その構造や性質に関しても不明な点が多く残されてい
る。

一方、工Ｆには高い種特異性があるため、ヒトへの応用
にはヒト由来のＩＦが使用されなければならない。しか
しながら、ヒト免疫インターフェロンは量産が困難であ
るために、現時点では臨床への応用が不可能であシ、純
度の高いヒ）Ｉ−ＩＰを容易によシ安価に大量生産でき
る技術の開発が望まれている。、 本発明者らは、遺伝子操作技術を利用してヒトのニーＩ
Ｆ遺伝子をクローニングし、得られた組み換えＤＮＡ分
子を宿主に移入してヒ）Ｉ−４Ｆ遺伝子を発現させ、目
的とするＩ−ＩＦ蛋白質を得ることのできる技術の開発
研究を行った結果、本発明を完成するにいたった。

純粋なヒト免疫インターフェロン蛋白質、なラヒにヒト
免疫インターフェロンをフードする塩基配列を有するＤ
ＮＡを含有する形質転換体を培養し、得られるヒト免疫
インターフェロン蛋白質含有液をヒト免疫インターフェ
ロンに結合するモノクローナル抗体を用いて精製する当
該蛋白質の製造法を提供するものである。

Ｇｒａｙらは、ヒトのニーＩＦ’遺伝子のひとつをクロ
ーニングしたと考え、それから推定されるポリペプチド
のアミノ酸配列を報告した〔ネイチャ、２９５，５０３
（１９８２））。その後も、デボスら〔ヌクレイツク　
アンス　リサーチ、　１０　、２４８７（１９８２））
およびプリンクら〔同誌、ｉｏ、　　　　３６０５（１
９８２））によシ類似する発表が行なわ　；れている。

しかし、これまでは抗ウィルス作用を有することにより
ＩＦ様物質の存在が推定されていたのみで、現実に、実
質的に純粋なヒト免疫インターフェロン蛋白質を取得し
たとの報告はない。

本発明者らは、実質的に純粋なヒト免疫インターフェロ
ンおよびその製造法を確立し本発明を完成した。

本発明で用いられるとトエーエＦをコードするＤＮＡは
、例えば一般式 ％式％ （３） 〔式中、ＸはＴＡＡ　、ＴＧＡまたはＴＡＧを示す〕で
表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ（１）である。

上記ＤＮＡ（１）は、そのダ末端に ５’　　ＡＴＧ　　ＡＡＡ　ＴＡＴ　　ＡＣＡ　ＡＧＴ
　ＴＡＴ　　ＡＴＣＴＴＧＧＣＴ　　ＴＴＴ　　ＣＡＧ
　　ＣＴ（！　　ＴＧＣＡ’ｆ’ＣＧＴＴ　　ＴＴＧ　
　ＧＧＴＴＣＴ　ＣＴＴ　ＧＧＣ３’　　　（ＩＩ）ま
たはＡＴＧ（Ｉ［）を有していてもよい。

ＤＮＡ（Ｉ　）はプロモーターの下流に連結されている
ととが好ましく、これらプロモーターとしてトリプトフ
ァン（ｔｒｐ）　　プロモーター、ラクトース（ｌａｃ
）　　プロモーター、蛋白質鎖伸長因子角（ｔｕｒＢ）
プロモーターが挙げられ、とシわけｔｒｐプロモーター
が好適である。

一般式（１）中、Ｘで示されるオリゴヌクレオチドのう
ちでもＴＡＡが好ましい。

本明細書において、アミノ酸、ペプチド、保護基、活性
基、その他に関し略号で表示する場合、それらは工ＵＰ
ＡＣ−ＩＵＢ　（Ｃｏｍｍ１ｓｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏ
　−１ｏｇｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ　）に
よる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくも
のであシ、その例を第１表に挙げる。また、アミノ酸な
どに関し光学異性体があシうる場合は、特に明示しなけ
ればＬ体を示すものとする。

第１表 ＤＮＡ：　　デオキシリボ核酸 Ａ　：　アデニン Ｔ　：　チミン Ｇ　：　グアニン Ｃ：　シトシン ＲＮＡ　：　　リボ核酸 ｄＡＴＰ：　　デオキシアデノシン王リン酸ｄＴＴＰ：
　デオキシチすジン三リン酸ｄＧＴＰ：　デオキシグア
ノシン三リン酸ａｃｒｐ：　　デオキシシチジン三リン
酸ＡＴＰ　：　　アデノシン玉リン酸 ＥＤＴＡ：　　エチレンジアミン四西Ｆ酸ＳＤＳ：　　
ドデシｌｖ硫酸ナトリウムＧｌｙ：　　グリシン Ａｌａ　：　　アフニン Ｖａｌ：　　バリン Ｌｅｕ：　　ロイシン １１ｅ　：　　イソロイシン Ｓｅｔ：　　セリン Ｔｈｒ：　　スレオニン Ｃｙｓ　：　　システィン １Ｊｅｔ：　　メチオニン Ｇｌｕ　：　　グルタミン酸 Ａｓｐ：　　アスパラギン酸 ＴＪ　７　Ｂ　”、　　リジン Ａｒｇ：　　アルギニン Ｈ１Ｂ＝　ヒスチジン Ｐｈｅ：　　フェニールアラニン Ｔｙｒ　：　　チロシン Ｔｒｐ：　　）リプトファン Ｐｒｏ：　　プロリン Ａａｎ：　　アスパラギン Ｇｌｎ：　　グルタミン Ｚ　　：　カルボベンゾキシ Ｂｏａ：　　ｔ−ブトキシカルボニル Ｍｔｒ：　　４−メトキシ−２，３，６−）リメチルベ
ンゼンスルホニμ Ｐｉｅ　：　　ペンタメチルベンゼンスμホニルＯＢｕ
：　　ｔ−ブチルエステル ＯＮＢ：　　Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，
３−シカｐボキシイミドエステル ＤＣＣ：　　Ｎ、Ｎ’−ジシクロへキシルカルポジイミ
ド ＤＣＵ：　　Ｎ、Ｎ’−ジシクロヘキシルウレアＨＯＮ
Ｂ：　　Ｈ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−
ジカルボキシイミド ＨＯＢｔ：　　Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアシーμＣＨ
Ａ：　　シクロヘキシルアミン ＤＣＩＩＩＡ：　　ジシクロヘキシルアミンＴＥＡ：　
　）リエチルアミン ＴＦＡ：　　）リフルオロ酢酸 Ｍ８Ａ：　　メタンスルホン酸 ＴＨＦ’：　　テトラヒドロフラン ＤＭ）’　：　　ジメチμホμ″ムアミドＭｅＯＨ：　
　メタノール Ａｃ０Ｅｔ　：　　酢酸エチル 本発明においては、例えばヒト末梢血リンパ球などヒ）
Ｉ−ＩＰを分泌する細胞を培養し、培養液からヒトニー
ＩＰをコードする伝令（ｍ）ＲＮＡを分離し、たとえば
逆転写酵素を用いて単鎖の相補（ｃ）Ｄ、ＮＡを合成し
、二重鎖ＤＮＡに導き、プラスミドに導入して、例えば
大腸嬉を形質転換させ、これよすｃＤＮＡ含有プラスミ
ドを単離することによりヒト■−ＩＰをコードする二重
鎖ＤＮＡを製造することができる。

とこで用いられるヒト末梢血リンパ球は非感作澗胞、感
作細胞のいずれでもよい。

本発明に使用されるＩ−ＩＰ誘起剤は、ヒトリンパ球細
胞にｌ−１１ｉ”の産生を誘起させるものであればいか
なるものであってもよい。例えば、フィトヘマグμチニ
ン（ＰＩ（Ａ）、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、スタ
ヒロコツカル　エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）、ノイラ
ミニダーゼーガフクトース酸化酵素（ＮＡＧＯ）、１２
−０−テトラデカノイルホルボール− が挙げられ、これらを単独またはこれらを組合せて使用
することができる。

ニーＩＦ’の誘起は細胞をＲＰＭニー１６４０培地やＭ
ＥＭ培地などそれ自体公知の培地で培養して行うことが
できるが牛胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地が好
オしい。培養は、温度３５〜３９℃、望ましくは３６〜
３８℃で、培養時間は１２〜７２時間、望ましくは２２
〜２６時間行われる。細胞はそれ自体公知の方法で集め
、これにＲＮＩＬＩ１６　ｔｉｆｌ害剤としてグアニジ
ンチオシアナイド、ベントナイト、ヘパリン、ポリビニ
ル硫酸、オーリントリカルボン酸、バナジウム複合体、
ジエチμビロカμボネイト（ＤＰＣ）、ドデＳ／Ａ／硫
酸ナトリウム（　Ｓｎ２　）などを加えたのち、Ｎ−フ
ウリμザμコシン、ツイーン８０、ノニデットＰ−４０
などを加えて細胞を溶解させてＲＮＡを抽出する。必要
によシ、とのＲＮＡを含む抽出液にフェノール、フェノ
ール−クロロホルムｆｘＥを加えて抽出操作をくり返し
たのち、エタノ−μ沈殿でＲＮＡを集める。真核細胞の
細胞質に存在するｍＲＮＡの多くは、その了末端にポリ
Ａ配列をもっことが知られているので、つぎにオリゴ（
ｄＴ）セルロース、ぼり（Ｕ）セファロースなどを用い
てポ！Ｊ（Ａ＋）ＲＮＡを集め、これをショ糖密度勾配
遠心法で分画し、この画分の一部をアフリカツメガニ／
Ｌ／　（　Ｘｅｎｏｐａｓ　ｌａｅｖｉｓ　）の卵母細
胞に注入して翻訳させる〔ガードンら、ネイチャ，２３
３。

１７７（１９７１））。生じた蛋白質の抗ウィルス作用
を検定し、Ｉ−０’のｍＲＮＡを含む１２〜１６Ｓの画
分を得ることができる。ｍＲＮＡはホルムアミド−ポリ
アクリルアミトゲｌｖ電気泳動やグリオキサールを用い
たアガロ−スゲμ電気泳動を用いても精製することがで
きる。

得られたｍＲＮＡｆ．鋳型として、たとえば、逆転写酵
素を用い自体公知の方法で相補的ＤＮＡ（ｃＩ）ＮＡ）
鎖を合成し、ｃＤＮＡの二本鎖ＤＮＡへの変換ヲ行う〔
マニアチヌら，セＡ／，　８　、　１６３（１９７６）
〕。

このＤＮＡを例えばｄＧ−ｄＣあるいはｄＡ−ｄＴホモ
ポリマー結合法〔ネルソン，メソツズイン　エンヂモロ
ジー，６８，４１（１９７９）アカデミツク　プレス社
，ニューロ−り〕で、たとえばプラスミド　ｐＢＲ３２
２のＰｓｔ工あるいはｓｐｈ工制限エンドヌクレアーゼ
切断部位に組み込ませる。これを例えば大腸醒χ１７７
６株に導入して形質転換させ、テトラサイクリン耐性あ
るいはアンピシリン耐性でトランスホーマントを選ぶこ
とができる。別にエーエＦポリペプチドのアミノ酸配列
に対応すると考えられる塩基配列をもったオリゴヌクレ
オタイドを化学合成したのち、これを３２ｐでフベμし
てプローブとなし、たとえばそれ自体公知のコロニーハ
イブリダイゼーション法〔グμンヌテインとホグネス，
プロシーデイングオプ　ナショナル　アカデミ−サイエ
ンスＵＳＡ　、７２．３９６１（１９７５））によって
、すでに得たテトラサイクリン耐性あるいはアンピシリ
ン耐性のトランスホーマントの中から求めるクローンを
二次スクリーニングする。

このコロニーハイブリダイゼーションによって陽性を示
したクローンの塩基配列を、たとえばマキサム−ギルパ
ート法〔プロシーディング　オプナショナル　アカデミ
−　サイエンスＵＳＡ　。

７４−、５６０（１９７７））あるいはファージＭ１３
を用いたジヌクレオチド合成鎖停止の方法〔メシングら
、ヌクレイツク　アンズ　リサーチ、９゜３０９（１９
８１））の方法によって決定し、エーエＰ逝仏子の存在
を確認する。次に、得られたクローンからＩ−ＩＦ’遺
伝子の全部あるいは一部をきり出し、適当なプロモータ
ー、ＳＤ（シャインアンド　ダルガーノ）陀列の下流に
つないで、これを適当な宿主に導入するとともできる。

プロモーターとしては、前記のプロモーターが挙げられ
、宿主としては、大腸菌（２９４，Ｗ３１１０、Ｃ６０
０など）、とシわけ２９４が好ましい。

なお、２９４は公知の菌〔ベックマンら、プロシーディ
ング　オブ　ナショナル　アカデミ−サイエンス　ＵＳ
Ａ、７３．４１７４（１９７６）〕で財団法人［発酵研
究所（工ｎ５ｔｉ＋ｕｔｅ　Ｆ’ｏｒ　Ｆｅｒｍｅｎ−
ｔａｔｉｏｎ、　０ｓａｋａ　）ｌにＩＦ’０−１４１
７１として寄託もされている。

本発明のＤＮＡによる宿主の形質転換は、例えば公知の
方法〔コーエン、　Ｓ、Ｎ、ら、プロシーディング　オ
プ　ナショナル　アカデミ−サイエンス　ＵＳＡ、６９
．２１１０（１９７２））により行う。

このようにして得られた形質転換体をそれ自体公知の培
地で培養する。

培地としては、例えばグルコース、カザミノ酸を含むＭ
９培地〔ミラー、ジャーナル　オブ　エクヌペリメンツ
　イン　モレキュラー　ゼネテイクス４３１−４３３　
（コールド　スプリング　ハーバ−研、ニューヨーク　
１９７２））が挙げられる。

ここに、必要によジブロモ−ターを効率よく働かせるた
めに、たとえば３β−インドリルアクリル酸のような薬
剤を加えることができる。

培養は通常１５〜４３ｔｍで３〜２４時間行ない、必要
によシ、通気や攪拌を加えることもできる。

培養後、公知の方法で菌体を集め、例えば、緩衝液に懸
濁させた後、たとえば超音波処理、リゾチームおよび／
または凍結融解によって菌体を破壊し、遠心分離によシ
上澄みを得る。菌体の破壊に関しては、凍結融解後リゾ
チーム処理を行なうことが好ましい。

上記上澄み中のヒトｌ−４Ｆ’は、とトエーエＦに結合
するモノクローナμ抗体を用いることにより有利に精製
することができ、モノクローナル抗Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｌ
ｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｔｈ
ｒ（Ｃ） Ｇｌｙ　ＬｙａＡｒｇ　　で示されるペプチド鎖におい
てそのＣ末端から数えて１〜１６個のアミノ酸を有する
ペプチドもしくはアミノ酸残基を示し、Ｙ３は（Ｎ）　
　　　　　　　　　（Ｃ） ＡｒｇＡｒｇ　Ａｌａ　８ｅｒ　Ｇｌｎで示されるペプ
チド鎖においてそのＮ末端から数えて１〜５個のアミノ
酸を有するペプチドもしくはアミノ酸残基な示す〕で表
わされるポリペプチドに対するモノクローナμ抗体が挙
げられる。

なお、ポリペプチド（ＩＶ）は新規化合物である。

ポリペプチド（■）に関し、Ｙ、としてはＡｒｇＡｒｇ
ＪＨａ、　Ｓｅｒ　Ｇｌｎが好しく、Ｘ、としてはＬｙ
ａＡｒｇが好しい。さらに、ポリペプチド（ＩＶ）は、
１５〜２５個のアミノ酸残基からなるものが好しい。該
モノクローナμ抗体は、抗体カラムとして有利に使用で
きる。

抗体カラムの作製は、例えばハイグリドーマを接種した
腹水等から純すいに精製した上記モノクローナμ抗体を
適切な担体とカプリングさせることにより、以下の様な
方法でできる。

用いる担体は、カプリングの後にＩＦ’−γが特異的に
効率よく吸着され、その後適切な溶出が可能なものであ
ればどの様なものでもよいが、−例として蛋白の一部ア
ミンが結合し易い様に活性化されたアガロ−スゲ！ビー
ズ、例えばアフイゲμｍ１０（パイオーラド社製）など
が以下に述べる様表方法で好都合に用いられる。アフィ
ゲル−１０と抗体との反応は、０．００１〜ＩＭ、好ま
しくは０．１Ｍのパイカーボネート等の緩衝液中で反応
を行なう。反応条件は０〜２０℃、１０分〜　　“２４
時間、種々のｐＨが可能であるが、好ましくは、４℃、
４時間、ｐＨ３〜ｌＯの条件が用いられる。混合するア
フイゲ＃−１０と抗体の量比は、アフイゲｌｖｌ露ｔに
対し抗体量が約５０１１ｖ位迄は多ければ多い程多くの
抗体がつくので、この範囲内でいくらでもよいが、実用
上および結合効率を考慮して１９〜３０＆ｙの抗体が好
都合に用いられる。

この様にしてできた抗体−担体結金物は、反応に用いた
緩衝液でよく洗った後、数日放置するか、もしくは最終
濃度０．０５Ｍのエタノールアミン・塩酸を加え４℃で
１時間反応させる等の方法によシ、残存する未反応の活
性基をブロックした後、適切なカラムにつめることによ
り、抗体カラムとして使用できる。

上記した抗体カラムで精製するに際しては、たとえば、
上記の囲体破壊によシ得られる上澄み等のヒト免疫イン
ターフェロン蛋白質含有液を中性附近の緩衝液、たとえ
ばリン酸ｍＨＲ液やトリス・塩酸緩衝液に溶解して抗体
カラムに吸着させる。

次にカラムを同じ緩衝液で洗浄したのち、ＩＮ’−γを
溶出する。溶出液としては、弱酸性溶液たとえば酢酸溶
液、ポリエチレングリコールを含む溶液、資料にくらべ
抗体によシ結合し易いペプチドを含む溶液、高濃度塩溶
液などおよびこれらの組み合せた溶液などが用いられ、
ヒトニーＩＦ’の分解をあまり促進しないものが好まし
い。

カラム溶出液は、常法によシ緩衝液で中和する。

必要によシ再度上記の抗体カラムによる精ａＳ作を行な
うことができる。

ここで得られると）Ｉ−工Ｆ蛋白質溶液は透析に付し、
必要によりこれを凍結乾燥によシ粉末とすることができ
る。凍結乾燥に際しては、ソルビトール、マンニトール
、デキストロース、マルトース、グリセロールなどの安
定剤を加えることができる。

かくして得られるヒト免疫インターフェロン蛋白質はヒ
ト羊膜由来ＷＩＳＨ細胞に対する水泡性口内炎ウィルス
（ＶＳＶ）の細胞変性効果阻止試験によるウィルス活性
測定において１０７Ｕ／ｑ以上の比活性を示すものであ
る。

なおここでＩＰの活性としてのＵ　／　ｍｅ　（ユニッ
）　／　ｚｌ　）の出し方は以下の様に行った。ユニッ
トの確定した国際標準ＩＦ’−αと白血球由来の粗工Ｆ
−γをヒト羊膜由来ＦＬ細胞株に対するＶＳＶの細胞変
性効果阻止試験を用いて測定し、その力価の比較から白
血球由来粗ＩＦ−γの力価を決定しＩＦ’−γの標準品
とした。目的とする資料中のＩＦ’−γの力価算定のた
めには、常にこの標準工Ｆ−γを並べて前述のＷＩＳＨ
−ＶＳＶの系でアッセイを行い、その比率から力価を算
出した。

本発明のヒト免疫インターフェロン蛋白質は、好ましく
は一般式 ％式％ （） 〔式中、ＹはＭｅｔまたは結合手を示し、Ｚｌ、ｚ２は
それぞれＣｙｓまたは％Ｃｙａを示す〕のアミノ酸配列
からなるポリペプチドを含有するものである。

当該ポリペプチドを乾燥品基準で９０％以上とシわけ９
５９６以上含有するものが好ましい。

本発明によシ製造されるヒト免疫インターフェロン蛋白
質は下記の性状を有する。

１）ＳＤＳ−ポリアクリルアミトゲ／Ｌ／（１７５ｇ６
）電気泳動による分子量測定で１７Ｄｏｏ±１．０００
を示す。

２）アミノ末端アミノ酸としてシスティンもしくはハー
フシスチンまたはメチオニンを有する。

３）　　Ｈ−Ｌｙｅ−ｋｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−３ｅｒ
−Ｇｉｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅ　ｕ−Ｐｈｅ　−Ａｒ　ｇ−Ｇ
ｌ　ｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−３ｅ　ｒ−Ｇｌｎ−
ＯＨに対するモノクローナル抗体と結合する。

本発明により製造されるヒト免疫インターフェロン蛋白
質は従来の方法で得られるＩ−ＩＦと同様の目的に同様
の用法によシ使用できるが、従来品に比し、夾雑蛋白質
９発熱物質が少ないので、注射剤原体等としてよシ安全
に使用される。

本発明のヒトニーＩＦ蛋白質は抗ウィルス、抗腫瘍、細
胞増殖抑制および免疫増強作用を示す。

本発明のヒ）Ｉ−工Ｆ蛋白質は医薬として使用する場合
、それ自体あるいは滅菌水、ヒト血清アルブミン（Ｔ（
ＳＡ）、生理食塩水その他公知の生理学的に許容される
担体と混合して製剤学的に許容される組成物として使用
する仁とができ、非経口的に又は局所に投与することが
できる。例えば、成人１日当シｌＯ万〜１＠ユニット、
好ましくは５０００万〜６０００万ユニツトを静注又は
筋注などにより投与することができる。

本発明のヒトエーエＦ蛋白質を含有する製剤は、塩、希
釈剤、アジュバント、他の担体、バッファー、結合剤、
界面活性剤、保存剤のような生理的に許容される他の活
性成分も含有していてもよい。

非経口的投与用製剤は、滅菌水溶液又は生理学的に許容
される溶媒との懸局液アンプル、または生理学的に許容
される希釈液で用事希釈して使用しうる減菌粉末（通常
ニーＩＰ溶液を凍結乾燥して得られる）アンプルとして
提供される。

さらに本発明のヒト免疫インターフェロン蛋白質を含有
する製剤は、ＩＦ−αまたは１Ｆ−βまたはインターロ
イキン２などのリンホカインのような他の活性成分を本
発明物質に対し１〜９９９６含有していてもよい。

以下実施例、参考例によシ本発明をさらに具体的に説明
するが、本発明はこれらに制限されるものでない。

発明を実施するだめの最良の形態 実施例１ （１）　　ヒトエーエＦをコードするｍＲＮＡの分離ヒ
ト末梢血よシ調製したリンパ球を１２−０−テトヲデカ
ノイルホルポールー１３−アセテート（ＴＰＡ）（ｉｓ
ｎｇ／＋＋／）とコンカナバリンＡ（４０μｂ全ｌ）を
含むＲＰＭＩ−１６４０培地（１０％の牛胎児血清を含
む）で３７℃培養し、エーエＦを誘導させた。２４時間
後、この誘導した１×１０１０個のヒトリンパ球をチオ
グアニジン変性溶液（５Ｍグアニジンチオシアネート、
５％メμカプトエタノール、５０　ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
Ｉ　ｐＨ７，６，１０ｍＭ　ＥＤＴＡ）中でテフロンホ
モゲナイザーによって破壊変性した後Ｎ−ヲウロイリμ
ザｐコシン酸ナトリウムを４９６になるように加え、均
質化した混合物を５．７Ｍ塩化セシウム溶液〔５，７Ｍ
塩化セシウム、０．１Ｍエチレンジアミン四酢酸（ＥＤ
ＴＡ））６ｇＺ上に重層し、ベツクマｙｓｗ２７のロー
ターを用いて１５Ｃで２４０００ｒｐｍ３０時間遠心処
理を行い、ＲＮＡ沈澱を得た。

このＲＮＡ沈澱を０．２５％Ｎ−ラウロイルザμコシン
酸ナトリウム溶液にとかした後、エタノールで沈澱させ
、＆３ｑのＲＮＡを得た。このＲ１１ｉＡを高塩溶液（
０，５Ｍ　ＮａＣ１，１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩｐＨ
７，６、１ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　０．３＊ＳＤＳ　）中
でオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに吸着させ、ポリ（
Ａ）を含むｍＲＮＡを低塩溶液（１０ｍＭＴｒｉｇ−７
ＴＣ１ｐＨ７，６，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、Ｑ、３＊ＳＤＳ
　）で溶出させることにより、ポリ（Ａ）を含むｍＲＮ
ｌ　７００μすを分取した。

とのｍＲＮＡを更にエタノールで沈澱させ、０．２１の
溶液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７，６、２ｍＭ　
ＥＤＴＡ、０．３％８Ｄ８　）に溶かし、６５℃で２分
間処理して１０〜ｂ （ペックマン５Ｗ２７のローターを用いて２０し、２５
００Ｏｒｐｍ　　で２１時間遠心分離）するととにより
分画化して２２分画を得た。この各分画につきＲＮＡの
一部ずつを、アフリカッメガエルの卵母細胞に注入し、
合成される蛋白質中のインターフェロン活性〔ヒト羊膜
由来Ｗ工ＳＨｉ胞に対する水泡性ロ内炎つィμス（ＶＳ
Ｖ）の細胞変性効果阻止試験を用いて測定した抗ウィル
ス活性〔ステワルト、ザ　インターフェロン　システム
。

スプリンガー社、ニューヨーク、１９７９年、１１頁〕
を測定し、分画１２（沈降定数Ｓ［は１２−１４８を示
した）に１９５ユニツト／μｆＲＮＡの活性を検出した
。このようにして得た分画１２のｍＲＮ　Ａは約２０μ
９であった。

（１１）単鎖ＤＮＡの合成 上記で得たｍＲＮＡおよび逆転写＃素を用い、１００／
ＺＪの反応液（ｓμｐのｍＲＮＡ、５０μリオリゴ（ｄ
Ｔ）、１００ユニツトの逆転写酵素、１ｍＭずつのｄＡ
ＴＰ、ｄｃＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、　８　ｍＭ
　ＭｇＧ１２．５０　ｍＭＫｃｌ、　１０　ｍＭ　ジチ
オスレイ）−／Ｌ’、５０　ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐ
Ｈｓ、　３　）中で４２℃、１時間インキュベートした
後に、フェノ−ρで除蛋白し、０．ＩＮのＮａ　ＯＴ（
で７（１，２０分処理してＲＮＡを分解除去した。

（Ｉｌｌ）　　二重鎖ＤＮＡの合成 ここで合成された単口の相補ＤＮＡを５０μノの反応液
（ｍＲＮＡとオリゴｄＴを含まない以外は上記と同じ反
応液）中で４２し２時間反応させることによシニ貢鎖Ｄ
ＮＡを合成した。

０ｖ）ｄＣテイルの付加 この二重ｇｌＤＮＡにヌクレアーゼＳ１を５０μｊの反
応液（二重鎖Ｄ　Ｎ　Ａ　０．１　Ｍ酢酸ナトリウムｐ
Ｈ４，５、０，２５Ｍ　ＮａＣ１，１，５ｍＭＺｎｓＯ
４，６０ユニツトの８１ヌクレアーゼ）中で室温３０分
間作用させ、フェノールで除蛋白し、エタノールでＤＮ
Ａを沈澱させた後、これにターミナルトランスフェラー
ゼを５０μｊの反応液（二重鎖ＤＮＡ　。

０．１４Ｍカコジル酸カリ、０．３ＭＴｒｉａ（塩基）
ｐＨ７，６，２ｍＭジチオｙ、ｖイトーｙ　、　１　！
ｌｌＭＣ□Ｃ１２−０，１５ｍＭ　ｄ　ＣＴＰ　、　　
３０ユニツトターミナμトランスフエヲーゼ）中で３分
間３７１Ｓで作用させ二重鎖ＤＮＡの１両端に約２０個
のデオキシシチジン鎖を伸長させた。これらの一連の反
応で約３００　ｎｇのデオキシシチジン鎖をもった二重
鎖ＤＮＡを得た。

（ｖ）大腸菌プラスミドの開裂ならびにｄＧテイルの付
加 一方、１０μ９の大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡ
に制限酵素ＰｓｔＩを５０μ！の反応液〔１０μｑＤ　
Ｎ　Ａ　、　５０　ｍＭＮａｃｌ、　６　ｍＭＴｒｉｓ
−ＥＣ１（ｐＨ７，４）、６ｍＭＭｇＧ１２．６ｍＭ　
　２−メルカプトエタノ−／ｌ／、Ｚｏｏμｇ７’ａＬ
　牛血清アルブミン、２０ユニツトのＰｓｔＩ）中で３
時間３７℃で作用させてｐＢＲ３２２ＤＮＡ中に１ケ所
存在するｐａｔｒｉ織部位を切断し、フェノールで除蛋
白した後、ターミナルトランスフェラーゼを５０μｍの
反応液（Ｄ　）Ｊ　ＡｌＯμＱ、０．１４１１カコジル
酸カリ、０．３　ＭＴｒｉｓ（塩基）ＰＨ７，６，２ｍ
１Ｊジチオスレイトール、１　ｍＭ　Ｃ□Ｃ１２，０，
１５ｍＭ　ｄＧＴＰ　、　　３０ユニツＦターミナμト
ランスフエラーゼ〕中で３分間３７℃で作用させ上記プ
ラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡの３′両端に約８個のデオ
キシグアニン鎖を延畏させた。

（Ｖｌ）ＣＤＮＡの会合ならびに大腸菌の形質変換この
ようにして得られた合成二重鎖Ｄ　Ｉｉ　Ａ　０．１μ
ｑと上記プラスミドｐＢＲ３２２０，５μ９を０．ＩＭ
ＮａＣｌ、　５０　ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　ｐＨ７，６
、１ｍｕ　ＢＤＴＡよりなる溶液中で６５℃２分間、４
５℃２時間加熱しその後除冷して会合させエネアらの方
法〔ジャーナル　オブ　モレキュラー　バイオロジー、
９６，４９５（１９７５））に従って大腸劇χ１７７６
を形質転換させた。

−　ヒＤＮＡ含有プラスミドの単離 こうして約８５００のテトラサイタリン耐性株が単離さ
れ、これら各々のＤＮＡをニトロセルロースフィルター
の上に固定した〔グルンステインとホグネス、プロＶ−
ディング　オプ　ナショナμ　アカデミ−サイエンスＵ
ＳＡ、７２．３９６１（１９７５））。

一方、ゴエデルらの報告〔ネイチャー、２９５゜５０３
（１９８２））のＩ−ＩＰのアミノ酸配列をもとにして
アミノ酸＆　１−５　（Ｃｙａ・Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌ
ｎ・Ａｓｐ　）及びアミノ酸７１１７７　８２　（Ｌｙ
ｓ−Ｇｌｎ・Ａａｐ−Ｍｅｔ−Ａｓ＋ｎ−Ｖａｌ　　）
よシ推測できる塩基配列（それぞれ５’　ＴＣＣＴＧＧ
ＣＡ合ＴＡΔＣ３′および５′ＡＣ２ＴＴＣＡＴ７ＴＣ
計Ｃ：ｇＴ”　）をトリエステμ法（Ｃｒｅａ−Ｒ。

ら、　Ｐｒｏｃ、　１１＆ｔ１．　Ａｃａｄ、　８ｃｉ
、　ＵＳＡ　、　７５　Ｉ　５７６５（１９７８））を
用いて化学合成した。このオリゴヌクレオチドに対して
Ｔ４ポリヌクレオチドカイネースを用いて５０μｊの反
応液（オリゴヌクレオチド０．２　ｌｉｇ　、　５０　
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ８，０、１０ｍＭＭｇＧ１
２．　１０　ｍＭメルカプトエタノール、５０μＣ１ｙ
−３２Ｐ　Ａ　Ｔ　Ｐ　、　３ユニットＴ４ポリヌクレ
オチドカイネース）中で１時間３７℃で反応させ、ダ末
端を３２ｐで標識した。この標識されたオリゴヌクレオ
チドをプローブとしてラウンらの方法〔ヌクレイツク　
アンス　リサーチ、９．６１０３（１９８１））Ｋ従っ
て上記のニトロセルロースフィルター上に固定したＤＮ
Ａに会合させ、オートラジオグラフィーによって上記二
種類のオリゴヌクレオチドプローブに反応する菌株を４
個単離した。とれらの菌株の各々の菌体からプラスミド
ＤＮＡをアルカリ法〔パーンボイムとドリー、ヌクレイ
ツク　アンス　リサーチ、７，１５１３（１９７９）〕
によって単藤した。次にプラスミドＤＮＡの挿入部を制
限酵素ＰａｔＩにより切シ出し、分離したプラスミドの
うちでその挿入部の長さの最も長い断片を含むものをえ
らび、このプラスミドをｐＨ１Ｔ３７０９　　と名ずけ
た。

このプラスミドの制限酵素地図を第１図に示す。

次にこのｐＨＩＴ３７０９プラスミドに挿入されたｃＤ
ＮＡ配列の一次構造（塩基配列）をジヌクレオチド合成
鎖停止法とマキサム−ギルバートの方法によって決定し
た。その−次構造は第２図の通シであった（特願昭５８
−４９６８１号明細１）参照：ｐＨ工Ｔ３７０９の工Ｆ
−γ暗号領域（コドン＆３１〜Ａ１４６）の塩基配列は
その後公表された文献〔ヌクレイツク　アシツズ　リサ
ーチ、１０゜２４８７（１９８２）中の第３図〕に記載
されたものと同一である） 実施例２ （１）発現プラスミドとして大腸隨のトリプトファン合
成のプロモータ一部分〔プロモーター、オペレーターを
含むＤＮＡ断片、２７６塩基対、ベネットら、リサーチ
〃　オプ　モレキュラー　バイオロジー、１２１，１１
３（１９７Ｂ））を含むプラスミドｐｔｒｐ６０１　（
ベクター１ｄｐＢＲ３２２）を構築した。

一方、プラスミドｐＢＲ３２２を制限酵素ＥｃｏＲＩお
よび制限酵素ＡｖａＩで切断し、得られたテトラサイク
リン耐性遺伝子を含むＥｃ　ｏＲＩ−ＡｖａＩ断片のの
シしろ部分をＤＮＡポリメラーゼ■ラージフラグメント
でうめた。この断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてｐｔ
ｒｐ６０１のＰｖｕＩ［の切断部位に結合させｐｔｒｐ
７０１を構築した（第３図）。

（１）　　次にｐｔｒｐ７θｌに２ケ所存在する制限酵
素Ｃ１ａＩ切断部位の一つを消去するため、ｐｔｒｐ７
０１をＣ１ａ工で部分分解して二つのＣ１ａＩ切断部位
のうち一方のみが切断されたものを得た。生じたのりし
ろ部分をＤＮＡポリメフーゼＩラージフフグメントでう
めたのち、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで再度結合させてｐｔｒ
ｐ７７１を得た（第３図）。

（ｌｉｔ）　　ｐＨ工Ｔ３７０９を制限酵素Ｐｓｔ工で
切断して■Ｆ−γの構造遺伝子を含むＰａｔｌ断片を得
た。この断片を制限酵素Ｂｓ　ｔＮＩで部分分解し、工
Ｆ　−γ構造遺伝子内にあるＢｓｔＮ１部位の切断され
たＢａｔＮＩ−ＰａｔＩ断片を得た。ＢａｔＮ工切断部
位ののリシろ部分をＩ）ＮＡポリメラーゼＩラージフラ
グメントでうめたのち、前述したトリエステμ法によっ
て化学合成した蛋白合成開始コドンＡＴＧを含むオリゴ
ヌクレオチドアダプター ＣＧＡＴＡＡＴＧ’ｌ’ＧＴＴＡＣ’ｒＧＣＣＴＡ’ｒ
ＴＡＣＡＣＡＡＴＧＡＣＧＧ をＴ４ＤＮＡリガーゼで結合させた。

一方、上記アダプターを結合させたＩＦ’−γ遺伝子を
ｐｔｒｐ７７１を制限酵素ＰｓｔＩと制限酵素Ｃ１ａＩ
で切断して得た断片のトリプトファンプロモーターの下
流に挿入してＴ４ＤＮＡ！ｊガーゼを用いて結合させ、
工Ｐ−γ発現プラスミドｐＨＩ’ｆ’ｔｒｐ１１０１を
構築した（第４図）。

Ｑｖ）　　ｐＨＩＴｔｒｐＨ０１をさらに改良して次の
通りｐＨ工Ｔｔｒｐ２１０１を構築した。

まずｐｔｒｐ６０１を制限酵素Ｃ１ａ工および制限酵素
Ｈｐａｌｒで処理してｔｒｐ　　プロモーターを含むＣ
１ａＩ　−ＨｐａＴ［断片０．３３　Ｋｂを得た。この
断片を、Ｃ１ａＩで切断しアルカリホスファターゼ処理
したｐＨＩＴｔｒｐＨｏ１にＴ４ＤＮＡ！Ｊガーゼを用
いて結合させｔｒｐ　　プロモーターが二つ直列に入っ
たｐＨＩＴｔｒｐ２１０１を得た（第５図）。

このプラスミドｐＨＩＴ−ｔｒｐ２１０１　を用いてＣ
ｏｈｅｎらの方法〔前出〕に従って、大腸菌２９４を形
質転換させ、このプラスミドを含む醒株ヒｃｏ１１２９
４／ｐＨＩＴ−ｔｒｐ２１０１を得た。

実施例３ Ｅ、　ｃｏ１１２９４／ｐＨＩＴｔｒｐ２１０１を８μ
（１／ｚｔのテトラサイクリン、０．４％カザミノ酸、
１％グルコースを含むＭ９培地２００ｇｔを分注した１
１マイヤー中で３７しで培養し、生育がＫＵ２２０に達
した時に３β−インドリ−μアクリ／Ｌ／酸（ＩＡＡ）
を３０μ’ＡＩになるように加えて更に４時間培養した
。

実施例４ 実施例３で得られた培養液１．２１を遠心分離して菌体
を集め、これを６０＊／の１０％シュクロースを含む０
．０５　Ｍ　Ｔｒｉｓ・ＨＣＩ　ｐＨ７，６にｌｉＨ，
１濁した。

このｍ体ｕｓｔ液に０．２Ｍフェニル−メチル−スルフ
；ｔ＝１７１オライＦ（ＰＭＳＦ）０．３ｇ／、５ｈ１
Ｍａｉｌ　２．４１！ｌ　、　０．２　Ｍエチレンジア
ミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）２．４ｍｌ、１Ｍス
ペルミジン２、４　ｍｌ　＋　５　’ｇ／　ｍｅリソｆ
−ム２．４ｔｓｌを加えｏｂで１時間放置したのち、３
７１Ｓで５分処理し、これを更にＡＲＴＬ：、に社（米
国）製超音波破砕器で０℃３０秒処理した。

この溶菌液を１０５，０００ｘｆ　　で１時間遠心分離
して上清６６ｇ／を集めた。

実施例５ 実施例４で得た上清６０ｔｔｔをｌ　ｍＭｌｆＤＴＡ、
　０．１５Ｍ　ＮａＣ１を含む２０　ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
ＣＩ　、　ｐＨ１６（ＴＥＮ）で１５０−に稀釈したの
ち、参考例１０の方法で調製した抗工Ｆ’−ｒ抗体力フ
ム（９ｔｅｌ　）にかけた。ＴＥＮで十分洗浄したのち
、さらに０．０１％ノニデットＰ　−４０（５ｈｅｌ１
社製）　Ｑ、　５　Ｍ　ＮａＣ１を含むＴＥＮで洗浄し
た。次に０．２５　Ｍ　ＮａＣ１を含む０．１Ｍ酢酸で
ＩＦ’−７を溶出し、溶出液はただちにＩＭ）リスＨＣ
ｌｐＨ７，６で中和した。得られた溶液を蒸留水に対し
４ｕ、１６時間透析し、これをアセトン−ドライアイヌ
で凍結後凍結乾燥に付し粉末とした。

結果は以下の通シであった。

蛋白質へ　全活性（Ｕ）　　比活性（ル４の　回収率（
（転）溶菌液上清　　　２５０．８　　４に１０８１．
６Ｘ１０６　　−抗体力ラム処理　　　　２．０　　１
．５×１０　　　７５に１０’　　　　３７．５ここで
得られた最終のヒト免疫インターフェロン蛋白質の比活
性（ＷＩＳＨ細胞に対するＶＳＶの細胞変性効果阻止試
験によるウィルス活性測定による（前出））は７．５　
Ｘ　１０７　Ｕ／ｒ４であった。

この蛋白質を以下の実験に供した。

実施例６　ヒト免疫インターフェロン蛋白質の性状 （１）　　分子量 実施例５で得られた蛋白質を２−メルカプトエタノ−μ
で処理して５ＤＳ−ポリアクリルアミトゲｙ（ｔｙ、ｓ
＊）電気泳動（１５ｍＶ、６時間）にかけ、クマジープ
ルーで染色したところ、蛋白質は単一のバンドとして確
認できた（第６図）。

なお同時に泳動させた分子量マーカーの泳動距離と蛋白
質の泳動距離との関係から蛋白質の分子量は１７，００
０±１．０００と推定された（第７図）。一方、２−メ
ルカプトエタノールで処理しなかった蛋白質は分子量３
３，０００±２，０００の位置にもう一本のバンドが検
出された。この値は工Ｆ−ｒの分子量１７．０００±ｉ
、ｏ　ｏ　ｏの約２倍に相当することから、このバンド
はＩＦ−γの二量体に由来すると考えられる。

（Ｉｆ）　　アミノ酸分析 実施例５で得られた蛋白質をガラス製加水分解用試験管
にとり、２００倍量（Ｖ／Ｗ）の４％チオグリコ−μ酸
を含む定沸未塩酸を加えて、減圧下に封管したのち、１
１（ｌで２４．４８．７２時間加水分解した。加水分解
後、開管し、塩酸を減圧下で除去し、残渣を０．０２Ｎ
塩酸に溶解して日立製８３５型高速アミノ酸分析計によ
りアミノ酸実施例 シスチンおよびシスティンは、ハースの方法〔メソツズ
　イン　エンチモロジー、１１，１９７（１９６７））
に従い、上記蛋白質を過ギ酸酸化したのち、上記と同様
に２４時間加水分解して、アミノ酸分析針によシシステ
ィン酸として定量した。

アミノ酸分析値は、２４．４８および７２時間の加水分
解で得られた値を平均して求めた。但し、セリン、スレ
オニン、チロシンおよびトリプトファンの値は加水分解
時間を０時間に外挿して求めた。その結果を第２表に示
す。

第２表 （１）　　アミノ末端アミノ酸分析 実施例５で得られた蛋白質をハースの方法〔メソッズ　
イン　エンチモロジー、１１−，１９７（１９６７））
に従って過ギ酸酸化したのち、エドマン分解法の岩永ら
による変法〔ヨーロピアンジャーナル　オプ　バイオケ
ミストリー、　８．１８９（１９６９））によシそのア
ミノ末端アミノ酸分析を実施した。生成したフ酸ニルチ
オヒダントイン−アミノ酸（ＰＴＨ−アミノ酸）はウル
トラヌフエアー〇Ｄ８カラム〔アルテックス社製（ロ、
ａ人）＋　４６　×２５０　ｍｍ　＋粒子径５４ｍ〕を
用い、７／ｌ／チヤーの方法〔アルテックス　クロマト
グラフ。

３　、ｓ　（１９８０））によシ、パリアン製高速液体
クロマトグラフ５０４０型（Ｕ、　ａ　Ａ、　）で同定
、定ｉｔした。その結果、ＰＴＨ−メチオニンスルホン
およびＰＴＨ−システィン酸が検出された。

上記実施例より明らかなように本発明によれば、７．５
　Ｘ　１０　Ｕ／ｑ以上の比活性を有する実質的に純粋
なヒト免疫インターフェロン蛋白質を製造することがで
きる。

実施例７　（注射用製剤） 本発明のヒトエーエＦ蛋白質（比活性：２Ｘ１０７Ｕ／
岬）５岬を１００ゴの５％ＵＳＡ水溶液１００ゴに溶解
し、メンブランフィルタ−（孔径０．２μｍ）を用いて
濾過後、無菌条件下１００バイアルに分配する。バイア
ル中の溶液を無菌的に凍結乾燥し、用倚調製用注射用製
剤を得る。

本製剤は用時１＊／の蒸留水に溶解する。

以下の参考例において、薄層クロマトグラフィーは、メ
ルク社製シリカゲルプレート６０　Ｆ２５４又ハ、フナ
コシ薬品社製セルロースプレート、アビ七／Ｌ’ＳＦを
用い、下記の展開溶媒を用いた。

Ｒｆｌ：クロロホルム：メタノー／Ｉ／：酢酸−９：ｌ
二０．５ Ｒｆ２：酢酸エチ／Ｉ／：ピリジン：酢酸：水＝３０：
１０　　：１５ Ｒｆ３：クロロホルム：メタノー／Ｌ／：水＝７：３：
０．５ Ｒｆ’：ｎ−ブタノ−ＪＬ／：ピリジン：酢酸：水モ３
０：２０：６：２４ Ｒｆ５：酢酸：Ｌ　ｆ　／Ｌ／　：　ｉ−ブタノ−１ｖ
：酸９＝水＝１：１：１：１ 参考例１ ヒト免役インターフェロンのアミノ酸配列應１３１−１
４６に対応するポリペプチドの合成（１）　　Ｚ−８ｅ
ｒ−Ｇｌｎ−ＯＢｕｔの製造Ｚ−Ｇｌｎ−ＯＢｕｔ１０
．１　ｆをメタノ−ＩＬ’５００ｔｘｅに溶解し、パラ
ジウム黒を触媒に水素気流中で還元した。触媒をろ去し
、溶媒を留去した残留物をＺ−８ｅｒ−ＯＨ７，５９、
ＨＯＮ　Ｂ　６．８９とともにＤＭｒ２５０ｓｇ／に溶
解し、氷冷した。氷冷下にＤＣＣ７，１５９を加え、０
℃で４時間室温で１２時間攪拌した。析出したＤＣＵを
ろ去し、溶媒を留去ののち残留物をＡｃ０Ｅｔ　　３０
０　Ｍｅに抽出し、４％ＮａＨＣＯ３水、０．２Ｎ塩酸
、水で洗い、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留
去し、析出した結晶をエーテルでろ取し、乾燥ののちＣ
Ｈ３ＣＡ１より再結晶した。収量６．５ｆ、収率５１．
２＊　、　ｍｐ、　９７−１００℃、　（ａ）Ｆ２４．
１°　（ｃ　−０，４０＊　メタノール）　、　Ｒｆｌ
　Ｏ，６４ 元素分析　Ｃ２０Ｈ２９０７”３として計算値：　Ｃ５
６−７２ｉ　Ｈ６，９０ｉ　Ｎ　９．９２実験値：　ｃ
　５６．２１；　Ｈ６，７２；　Ｎ　９．７６（１）　
　Ｚ−Ａｌａ−８ｅｒ−Ｇｌｎ−ＯＢｕｔの製造Ｚ−８
ｅｒ−Ｇ１ｎ−ＯＢｕｔ４．２３　ｔをメタノ−／Ｉ／
３００Ｍｔに溶解し、パラジウム黒を触媒に水素究流中
で還元した。触媒をろ去し、溶媒を留去した残留物をＺ
−Ａｌａ−０１２，３４９、ＨＯＮＢ　　２．２７９と
ともに、Ａｃ０Ｅｔ　　２００　ｔｘｌとジオキサン２
００ｇｖｌ。

ＤＭＦ１００Ｉ／の混合溶媒に溶解し、氷冷した。

冷却下にＤＣＣ２，３８ｇを加え０℃で４時間、室温で
１２時間攪拌ののち、ＤＣＵをろ去し、溶媒を留去した
。残留物にＣＨ３ＣＮ　　とエーテμを加え結晶とし、
ろ取、乾燥ののちＣＨ３０Ｎ　　よシ再結晶した。収量
３．７２ｆ、収率７５．３％、　ＨＰ、　　１６５−１
７０℃、〔α）９−４１．２°（ｃ−０，５０，メタノ
−／Ｌ’）　、　Ｒｆｌｏ、６０ 元素分析　Ｃ２３Ｔ３３４０８Ｎ４として計算値：　Ｃ
５５，８６ｉ　Ｈ６，９３ｉ　１１１１．３３実ｉ値：
　Ｃ５５，５８；　Ｉ（６，７４；　Ｎ　１１．１２（
ＩＮ）　　Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ａｌａ−３ｅｒ−Ｇ
ｉｎ−ＯＢｕｔの製造 Ｚ−Ａｌａ−３ｅｒ−Ｇｌｎ−ＯＢｕｔ３．４６　ｆを
メタノ−／Ｌ／３００Ｆｌ＋／に溶解し、パラジウム黒
を触媒に水素気流中で還元した。触媒をろ去し、溶媒を
留去した残留物を、Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍａ）−０Ｈ−ＣＨ
Ａ　４．５４９から調製したＺ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ｏ
Ｒ，’ＨＯＢｔ　　Ｌ９　ＱとともにＤＭＦ１５０ｍに
溶解し氷冷した。冷却下にＤＣ０１９ｇを加え、０℃で
４時間、室温で１５時間攪拌した。ＤＣＵをろ去し、溶
媒を留去し残留物にＡｃ０Ｅｔ　　を加えゲル状の沈澱
を得、ろ取した。乾燥後、メタノールとＡｃ０Ｅｔ　　
よシ再沈澱した。収１ｉ４．５５ｆ、収率７５，５％、
　ｍｐ、１３０−１３４　Ｃ、Ｃａ）響−２４，１°（
ｃ−０，２６，メタ／−／Ｌ’）　、　Ｒｆｌｏ、５７ 元素分析　Ｃ４０Ｈ６００１１”８”　２Ｈ２０として
計算値：　Ｃ５５，２２ｉ　Ｈ７，０７；　Ｎ　１２．
８８；８３．６９ 実験１ｉ！：　Ｃ５５，２３ｉ　Ｈ６，９３；　Ｎ　１
２．５４＋８３．４８ （ｔｖ）　　Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）
−Ａｌａ−８ｅｒ−Ｇｌｎ−ＯＢｕｔの製造 Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ａｌａ−８ｅｒ−Ｇｌｎ−ＯＢ
ｕｔ４．３９をメタノ−／Ｉ／４００１１１に溶解し、
パラジウム黒を触媒に水素気流中で還元した。触媒をろ
夫し、溶媒を留去した残留物を、Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）
−０Ｈ−ＣＨＡ３．２４ｆより調製したＺ−Ａｒｇ（Ｐ
ｍｅ）−ＯＲ，ＨＯＢｔｌ、４２１ＦとともにＤＭＦ’
２００ｇ？に溶解し氷冷した。冷却下にＤＣＣｌ、４１
ｆを加え０℃で４時間、室温で２０時間攪拌した。ＤＣ
Ｕをろ去し、溶媒を留去した残留物にＡｃ０Ｅｔ　を加
え沈澱を得、ろ取した。乾燥後、メタノールとＡｃ　Ｏ
Ｅ　ｔ　　よシ、再沈酸した。収量４．４ｆ、収率７１
．７９６　、　ｍｐ、１２５−１３（１，（α）’、’
−１８．０°（ｃ−０，４０，メタノール）、Ｒｆｌ　
　０．６３ 元素分析　Ｃ５７”８６”１４Ｎ１２Ｓ２°′Ｈ２０と
して計算値：　Ｃ５４，９６ｉ　Ｈ７，１２ｉ　Ｎ　１
３．５０ｉＳ５．１５ 実験値：　Ｃ５４，６６；　Ｈ６，９２；　Ｎ　１３．
３２；８５．３４ （Ｖ）　　Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ｇｌｙ−ＯＢｕｔの
製造Ｚ−Ｇｌｙ−ＯＢｕｔ１３゜ＯｇをＭｅＯＨ５００
ｍｌにとかし、Ｐｄ黒を触媒として、水素気流中、接触
還元した。触媒を戸別し、ろ液を減圧濃縮し、残留物を
ＤＭＦ２００ｇ／にとかした。これに、Ｚ−Ａｒｇ（Ｐ
ｍｅ）−（）Ｈ−ＣＨＡ　２０．０９よシ調製したＺ−
Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−ＯＨ，ＨＯＢｔ　５．４　ｆを加え
て氷冷し、ＤＣＣ８，２９を加えて４８時間かき混ぜた
。析出したＤＣＵを炉別し、濃縮後、Ａｃ０Ｉｔ　　５
００ｍｌにとかした。Ａｃ０Ｅｔ　層を４９６　ＮａＨ
ＣＯ３水、１０ｇ６クエン酸水で洗浄後、Ｎａ２ＳＯ４
で乾燥した。濃縮後、石油ベンジンを加えて沈澱として
恒数した。収量１９．８ｇ（９６，８％）。ｍｐ、７１
−７３℃、〔α〕菅十０．２°（ｃ−０，９、Ｄ　ｕｖ
　）　、　Ｒｆ’　０．６２元素分析　Ｃ３１Ｈ４５０
７Ｎ５Ｓとして計算値：　Ｃ５８，９３ｉ　Ｈ７，１８
ｉ　Ｎ　１１．０９ｉＳ５．０８ 実験値：　Ｃ５９，４２；　Ｈ７，５８ｉ　Ｎ　１０．
９５ｇ８４．８４ （ｖｌ）　　Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ｇｌｙ−
ＯＢｕｔの製造Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ｇｌｙ−ＯＢｕ
ｔｌ　０．０９をＭｅＯＨ５００ｍ？中、接触還元した
のち、ＤＭＰ″３００ＩＩＩｌに転溶した。これにＺ−
Ｐｈｅ−ＯＨ４，７２９、ＨＯＢｔ２．３５ｆを加えて
氷冷し、ＤＣＣ３，５９９を加えて、１５時間かきまぜ
た。析出したＤＣＵｔｐ別し、ｐ液を濃縮後、残留物を
Ａｃ０Ｅｔ　　４００　ｍｌにとかした。Ａｃ０Ｅｔ　
　５は、４９６　Ｈａ）ＴｅＯ２水、１０％クエン酸水
で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。濃縮後、エーテμ
を加えて結晶として戸数し、ＭｅＯＨ−エーテルより再
結晶した。収量１０．５９　（８５，３％）。ｍｐ、１
０１−１０３Ｃ１Ｃａ〕管−Ａ３゜（ｃ−０，９、ＤＭ
Ｆ　）　、　Ｒｆｌｏ、６４元素分析　Ｃ４０Ｈ５４０
８Ｎ６Ｓとして計算値：　Ｃ６１，６７逼Ｈ６，９９ｉ
　Ｎ　１０．７９ｉＳ４．１２ 実験値：　Ｃ６１，６６９Ｈ６，５６；Ｎ　１０．９３
ｉＳ４．１４ （ｖｌｌ）　　Ｚ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）
−Ｇｌｙ−○Ｂ１１ｔの製造 Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ｇｌｙ−（）Ｂｕｔ５
．５　ｑをＭｅＯＨ３００ゴ中、接触還元したのち、Ｄ
ＭＦ３００ｃｌに転溶した。これに、Ｚ−Ｌｅｕ−ＯＨ
ＤＣＨＡ　３．３１すよシ調製したＺ−Ｌｅｕ−ＯＨ，
ＨＯＮＢ　１．４７９を加えて氷冷し、ＤＣＣＩ、６８
９を加えて４８時間かきまぜた。析出したＤＣＵを炉別
し、濃縮後、Ａｃ０Ｅｔ　３００　ｍｌにとかした。Ａ
ｃ０Ｅｔ　層は、４％ＮａＨＣＯ３水、１０％クエン酸
水で洗浄し、Ｎ　ａ　２ＳＯ４で乾燥した。濃縮後、エ
ーテルを加えて粉末として戸数した。収量６．２ｇ（９
８，３％）ｍｐ。

１７　］　−１７３ｃ　、　Ｃｆｆ）ｙ−１５，５°（
ｃ−０，９゜ＤＭＦ　）、Ｒｆｌ　０．６４ 元素分析　Ｃ４６Ｈ６５０９Ｎ７Ｓ 計算値：　Ｃ６１，９３ｉ　Ｈ７，３４ｉ　Ｎ１０．９
９ｉｓ３．５９ 実験値：　Ｃ６２，０２；　ＥＩ　７．３７４Ｎ１１．
０８ｉＳ３．５９ （ｖｍ）　　Ｂｏｃ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ
（Ｐｍｅ）−Ｇｌｙ−〇Ｂｕｔの製造 Ｚ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ｇｌｙ−ＯＢ
ｕｔ６．０９をＭｅＯＨ２００１１１を中、接触還元し
たのち、ＤＭＦ１５０＋ｒ／に転溶した。これに、Ｂｏ
　ｃ−）Ｊｅｔ−ＯＨ−Ｄ（ｌＡ３．（ｌより調製した
Ｂｏ　ｃ−Ｍｅ　ｔ　−ＯＨ、ＨＯＮ　Ｂ１．３９ｇを
加えて氷冷し、ＤＣＣｌ、５９ｇを加えて１５時間かき
まぜた。析出したＤＣＵを戸別し、濃縮後、ｎ　−Ｂｕ
ＯＨ−ＡｃＯＥｔ　　にとかし、１０％クエン酸水で洗
浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。濃縮後、エーテルを加
えて結晶として炉取した。収量６．２９（９３，１４）
。ｍｐ、１９２−１９５℃、〔ａ〕管−１９，７°（ｃ
＝１．０　、ＤＭＦ’）、Ｒｆｌ　０．６４元素分析　
Ｃ４８Ｈ７６０１ＯＮ８Ｓ２として計算値：　０５８．
２７ｉ　ｎ　７．７４ｉ　Ｎ　１１．３３ｉＳ６．４８ 実験値：　Ｃ５８，４８；　Ｈ７，７９ｉ　Ｎ　１１．
３４；Ｓ５．９Ｂ （ｌｘ）　　Ｂｏａ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ
−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ｇｌｙ−ＯＨの製造 Ｂｏｃ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ　）
−Ｇｌｙ−ＯＢｕｔ５．５ｇにＴＦＡ５０茸／を加え、
室温で１ｏ分間振りまぜたのち濃縮し、エータμを加え
て戸数し乾燥した。これを、ＤＭ１５０Ｍｔにとかして
氷冷し、ＴＥＡｌ、８１／を加えた。これにＢｏｃ−Ｇ
ｌｎ−ＯＨ１，８５ｇ、ＨＯＮＢ　　１．４９ｆ、ＤＣ
Ｃｌ、９（ｌよシ調製したＢｏ　ｃ−Ｇｌｎ−ＯＲＢを
加え、１５時間がきまぜた。ｍ１ｉｓ後、ＡｃＯＨを加
え、Ａｃ０１ｉ：ｔ　　を加えて沈澱として炉取した。

収量５．３９（８９，８％）。

ｍｐ、１８１−１８３℃（分解）、〔α〕望−１９，６
゜（ｃ−１０、ＤＭＦ）　、Ｒｆ”　　０．３０元素分
析　Ｃ４９Ｈ７６０１２ＮＩＯ８２として計算値：　Ｃ
５５，４５ｉ　Ｈ７，２２ｉ　Ｎ　１３．２０ｉ８６．
０４ 実験値：　Ｃ５５，３９ｉ　ｌ’ｌ　７．１７；　Ｎ　
１３．３４；Ｓ６．２０ （ｘ）　　Ｚ−３ｅｒ−ＭＨＮＨ−Ｂｏａの製造Ｚ−８
ｅｒ−ＯＲ１０，Ｏｆ　、　ｔ−ブチ〃カルバゼー）６
．２９をＤＭＦ１５０厘ｌにとかして氷冷し、ＨＯＮＢ
　　８．０ワ、　Ｄ　ＣＣ９，３ｆを加えて１５時間か
きまぜた。析出したＤＣＵを炉別し、濃縮後、ＡＱＯＥ
ｔ　に転溶した。Ａｃ０Ｅｔ　　層は、４％ＮａＨＣＯ
３水、ｉｏ＊クエン酸水で洗浄し、ｔＪａ２ｓＯ４で乾
燥した。ｓｉａ後、エータμを加えて結晶として戸数し
た。収量７．３９（５０，４％）ｍｐ、９５−９　ｓ　
ｃ　、　Ｃａ）望−６，２°（ｃ−０，８、Ｄａｒ　）
　。

Ｒｆｌ　Ｏ，６２ 元素分析　Ｃ１６Ｈ２３０６Ｎ３として計算値：　ｅ　
５４．３８；　Ｈ６，５６；　Ｎ　１１．８９実瞼値：
　Ｃ５４，７７；　Ｈ６，８８漬Ｎ１２．２９（ｘｉ）
　　Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−８ｅｒ−ＮＨ？ＪＨ−ＢＯ
Ｑの製造Ｚ−３ｅｒ−ＮＴ’１ＮＨ−Ｂｏｏ　３．９　
ＱをＭｅＯＨ３００ｍｌｌ液接触還元たのち、Ｄ　Ｍ　
Ｆ’　５０　ｍｌに転溶した。これに、Ｚ−Ａｒｇ（Ｐ
ｍｅ）−０ＴＩ−ＣＨＡ　６．２　ｇよシ調製しだＺ−
Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−ＯＨ，ＨＯＢ　ｔ　１．５　ｆを加
えて氷冷し、ＤＣ，Ｃ２，３９を加えて１５時間かきま
ぜた。

析出したＤＣＵを炉別し、濃縮後、Ａｃ０Ｅｔにとかし
た。Ａｃ０Ｅｔ　Ｑは、４％ＮａＨＣＯ３水、１０％ク
エン酸水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。濃縮後エ
ーテルを加えて、沈澱として戸数する。収量ｙ、４５ｇ
（９３，７％）。！ｎＰ、１００−１０１℃。

〔α）２６−０．ｇ°　（ｃ−１，２，Ｄ？ＪＰ’）、
Ｒｆ１０．５１ 元素分析　Ｃ３３Ｈ４９０９１（７３として計算値：　
Ｃ５５，０６；　Ｈ６，８６；　Ｎ　１３．６２ｉＳ４
．４６ 実ｊ・贋値：　Ｃ５５，４９ｉ　Ｈ６，９４ｉ　Ｎ　１
３．１４；３３．８６ （Ｘｌｌ）　　Ｚ−Ｌｙｓ（Ｍｔｒ）−Ａｒｇ（Ｐｍｅ
）−８ｅｒ　−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃの製造 Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−８ｅｒ−ＮＨＮＨ−Ｂｏａ　３
．９ｇをＭｅｏＨ３００ｇ／にとかじ、接触還元したの
ち、ＤＭＦ　５０　ｔｘｔに転溶した。これに、Ｚ−Ｌ
ｙｓ（Ｍｔｒ）　−０Ｈ−ＤＣＨＡ　３．４　Ｑよりｍ
製したＺ−Ｌｙａ（Ｍｔ、ｒ）−ＯＨ，ＨＯＥｔ　　０
．８８ｆを加えて氷冷し、ＤＣＣｌ、３４９を加えて２
０時間かきまぜた。析出したＤＣＵを炉別し、濃縮後、
Ａｃ　ＯＥ　ｔ　を加えて扮末として戸数し、ＭｅＯＴ
！−ＡｃＯＥｔ　　より再結晶した。

収量５．１　ｙ　（９３゜４％）。ｍｐ、１０３−１０
５ｊ：、〔α〕２□６−７２°（Ｃ−０，８、ＤＭＦ　
）　、　Ｒｆｌｏ、５７ 元素分析　Ｃ４９”７３０１３”９Ｓ２とｌ−て計算値
：　Ｃ５５，５０；　Ｈ６，９４ｉ　Ｎ　１１．８９；
Ｓ６．０５ 実験値：　Ｃ５５，７０ｉ　Ｈ７，１５ｉ　Ｎ　１１．
６０ｉＳ５．６３ （ｘｍ）　Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ｌｙｅ（Ｍｔｒ）−
Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−８ｅｒ−ＷＨＩＲ−Ｂｏｃの製造 Ｚ−Ｌｙｓ（Ｍｔｒ）−Ａｒｇ（Ｐｍｅ　）−８ｅｒ−
ＮＨＮＨ−Ｂｏａ４．８ｇをＭｅＯＨ３００ｔｔｌにと
かし、接触還元したのち、ＤＭＦ’７０胃／に転溶した
。これに、Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−（）Ｈ−ＣＦ（Ａ　
２．８　ｇより調製したＺ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−ＯＨ、
ＨＯＢｔ　０．７４　ｇを加えて氷冷し、Ｔ）ＣＣ１、
１２ｇを加えて１５時間かきまぜた。析出したＤＣＵを
炉別し濃縮後、Ａｃ０Ｅｔ　　にとかし、Ａｃｏａｔ層
を４９５　ＮａＨＣＯ３水、１０％クエン酸水で洗浄し
、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。濃縮後、エーテルを加えて
沈澱として戸数し、Ｍｅ　ＯＥＩ−エーテルより再沈澱
した。収量５．Ｂｇ（８９，８％）。ｍｐ、１３６１３
７　′Ｃ９ＣＱ：ｌ望６，６°（ｃ−１，０、ＤＭｖ　
）　。

Ｒｆｌ　　Ｏ，５８ 元素分析　Ｃ６６Ｈ９９０□６Ｎ１３Ｓ３として計算値
：　Ｃ５５，５６７Ｈ６，９９；　Ｎ　１２．７６ｉＳ
６．７４ 実験値：　Ｃ５５，３４ｉ　Ｅ　７．０７７　Ｎ　１２
．５０ｉＳ６．５９ （ｘｌｖ）　　Ｚ−Ｌｙｓ（Ｍｔｒ）−Ａｒｇ（Ｐｍｅ
）−Ｌｙｓ（Ｍｔｒ）　−Ａｒｇ（Ｐｍｅ　）−８ｅｒ
−ＮＨＭＨ−Ｂｏａの製造Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ｌｙ
ｓ（Ｍｔｒ）−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−８ｅｒ−ＮＨＮＨ−
Ｂｏｃ　　３．　ＯｆをＭｅＯＨ１５０ｍｌにとかし、
接触還元したのち、Ｄ　Ｍ　Ｆ　６０　ｍｌに転溶した
。これに、Ｚ−Ｌｙｓ（Ｍｔｒ）−０Ｈ−ＤＣＪ（１１
，５４９より調製したＺ−Ｌｙｓ（Ｍｔｒ）−ＯＨ，Ｈ
ＯＢｔ　Ｏ，３１９を加えて氷冷し、ＤＣＣｏ、５７９
を加えて１５時間かきまぜた。析出したＤＣＵを炉別し
、ｔｍｍ後後ＬｃＯＥｔにとかし、Ａｃ０Ｅｔ）Ｎｌを
４　ｍ　ＮａＨＣＯ３水、１０％クエン酸水で洗浄し、
Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。濃縮後、エーテルを加えて結
晶として戸数し、Ａｃ０Ｅｔより再結晶した。収量２．
７（１（７２，８％）ｍｐ、１２３−１２５℃　（ａ）
Ｖ　　５．９°（ｃ−１，１、ＤＭＦ　）　、　Ｒｆｌ
　　ｎ、５７元素分析　Ｃ８２Ｈ１２３０２ＯＮ１５Ｓ
４として計算値：　Ｃ５５，７３ｉ　Ｈ７，０２ｉ　Ｎ
　１１．８９ｉ８７．２６ 実験値：　Ｃ５５，８９ｉ　Ｈ７，３０ｉ　Ｎ　１１．
７２；Ｓ７．０８ （ｘ１／）　Ｂｏａ−Ｇｉｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ
−Ａｒｇ（Ｐｉｅ）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ　）−Ａ
ｒｇ（Ｐｍｅ　）−Ａｌａ−８ｅｒ−Ｇｌｎ−（）Ｂｕ
ｔの製造 Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ａｒｇ（Ｐｍｅ　）−Ａｈａ−
８ｅｒ−Ｇｉｎ−ＯＢｕｔＬ　Ｏ’ＩをＭｅＯＨ１００
１１１にとかし、接触還元したのちＤＭＦ２０ｇ／に転
溶した。これに、Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐ
ｈｅ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ｇｌｙ−Ｏ１１０．８５　Ｑ
　、　ＨＯＢｔｌ　３５Ｔｑを加えて氷冷し、ＤＣＣ２
１（１’を加えて２０時間かきまぜた。析出したＤＣＵ
を炉別し、濃縮後、ＭｅＯＨを加えて沈毅として恒数し
た。収量１．５０９　（８７，４％）。

ｍｐ、２１６−２１７ｕ（分解）　、　Ｃａ〕’ｌ　−
１１，８゜（ｃ＝１．０　、ＤＭＦ’）　、Ｒｆｌ　Ｏ
，４３元素分析　Ｃ９８Ｈ１５４０２３Ｎ２２Ｓ４とし
て計算値：　Ｃ５５，０９ｉ　Ｈ７，２７ｉ　Ｎ　１４
．４２ｉＳ６．００ 実験値：　Ｃ５４，８１９Ｈ７，３３ｉ　Ｎ　１４．２
３；Ｓ５．７９ （ｘｖｌ）　　Ｈ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−
３ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ　−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−
Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−８ｅｔ−４１ｎ−Ｏ
Ｈの製造 Ｂｏａ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（Ｐ
ｍｅ）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）
−Ａｌａ−８ｅｒ−Ｇｌｎ−ＯＢｕｔｌ、ＯｇにＴＦＡ
ＩＯｇｔを加え、室温で５０分間振り混ぜたのち、濃縮
し、エーテルを加えて沈毅として戸数し、乾燥した。

一方、Ｚ−Ｌｙｓ（Ｍｔｒ）−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ｌｙ
ａ（Ｍｔｒ）−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）＝Ｓｅｒ−ＮＨＮＨ−
Ｂｏｃ　　Ｏ，８３９にＴＦＡ１０ｇｌ？を加えて室温
で１０分間振り混ぜたのち、濃縮し、エーテルを加えて
沈毅として恒数し乾燥した。これをＤＭＦｌｏｆｆｌに
とかし、ドライアイス−アセトンで冷却後、６．２　Ｎ
　ＨＣＩ／Ａｃ０Ｅｔ　０．２３ｍ１　、亜硝酸イソア
ミ／Ｌ／（０，０７５＋ｗｔ）を加え、−２５°〜−２
０℃で２０分間保った（ヒドラジンテヌト：陰性）。こ
れを再びドライアイス−アセトンで冷却し、Ｔ　Ｅｉ　
Ａ　０．２５　ｔｓｅを加えて中和した。

アミン成分をＤＭＦ’４０πｌにとかし、氷冷しＴＥＡ
ｏ、１６＊／を加えたのち、先に調製したアジド溶液を
加えて、４℃で７２時間かきまぜた。反応液を、希酢酸
水にそそぎ、析出したゲμを恒数し、含水ＣＨ３ＣＮ　
で洗浄した。収量１．４（１（８１，５＊）、　Ｒｔ’
　　０．０９゜このうち４００岬を０．１５Ｍ　　Ｍｓ
Ａｆｉ−含むＴＦＡ−チオアニソ−ルーメチルスルフィ
ト（８：１：１）６０ｄにとかし、室温で２時間振シま
ぜたのち、Ａｃ０ＮＨ４４００呼を加えて濃縮し、エー
テルを加えて沈澱として恒数し、乾燥した。これを少量
のＩ　ＨＡｃＯＨにとかしセファデックスＧ−２５のカ
ラム（２，２Ｘ１２０Ｃ礒）に付した。Ｉ　Ｎ　ＡｃＯ
Ｈで溶出し１６０訂ｌ−２６０ｍｌの分画を集めて凍結
乾燥し、ついでアンバーライトＩＲＡ−４１０（酢酸型
）のカラムを通し、凍結乾燥した。これをさらにＴ８に
−ＬＳ−４１０のカラム（２，１４Ｘ７．５ｃａ＋−１
−２，１４ｘ３０　Ｃ１１）を用いるＨＰＬＣでＭ製し
、目的物を得た。収量４５Ｈｆ。Ｃａ）”７−４５．９
°　（ｃ　＝　０．７　ｍｏ、　Ｉ　Ｎ　ＡｃＯＨ）　
、　Ｒｆ’（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）　０．２０アミノ酸
分析：　Ｌｙｓ　１．７１．　Ａｒｇ　４．７１゜Ｓｅ
ｒ　１．６９．　Ｇｌｕ　２．１２．　Ｇｌｙ　１．０
０．　Ａｌａｌ、　０３．　Ｍｅｔ　０．３２．　Ｌｅ
ｕ　１．３０．　Ｐｈｅ　１．０８（平均回収率７７％
） 参考例２ キャリヤー蛋白とポリペプチド複合体の合成参考例１　
（ＸＶＩ）　　で得たポリペプチドとサイログロブリン
（以下ＴＧ）との結合を、グツトフレンドらの方法に準
じて行なった〔サイエンス、１４４．１３３４頁（１９
６４））。即ち、当該ポリペプチド２．５ｑをＴＧ３．
７５ｑと混合し、２ｅｒの５０ｍＭのフォスフェートバ
ッファーを加え、氷水中でよく攪拌した。これに力μポ
ジイミド塩酸ｔ＝　３０．４りを蒸留水２００　ｕＪに
溶かしたものを１滴ずつゆっくりと加えた後、３時間氷
水中で攪拌しながら反応させた。反応後、蒸留水で透析
を充分に行ない、凍結乾燥を行なって蛋白複合体４．７
りを得た。

参考例３ 抗体検出のためのＫＩＡ用抗原の調製 ＥＩＡ用抗原の調製は北用らの方法〔ジャーナル　オプ
　バイオケミストリー、υ、２３３（１９７６））の方
法に準じて行った。

（１）　　ポリペプチドへのマレイミド基の導人参考例
１　（ｘｖｌ）で得たポリペプチド（３５０ｎｍｏｌｅ
ｓ）を１１１Ｉ１０１００　ｍＭフォスフェートバッフ
ァーｐＨ６，８に溶解し、Ｎ−（４−カルポキンシクロ
ヘキＶルメチ／！／）マレイミドのＮ−ヒドロキシサク
シニミドエステ）Ｌ’５８５μｆ（ｘ、７＊μｍｏｌｅ
ｓ）と７０μ！のＮ、Ｎ−ジメチルクロマミド溶液に加
え混合し、３０ｔで３０分攪拌して反応後、セファデッ
クスＧ−２５カラムで分画を行ないマレイミド基の導入
されたポリペプチド分画１８５　ｎｍｏｌｅａを得た。

（Ｉｔ）　　マレイミド基導入ポリペプチドとβ−Ｄ−
ガラクトシダーゼとの結合 参考例３（１）で得たマレイミド基導入ポリペプチド１
６．５　ｎ１ｌｌｏ１ｅ８とβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ
３、３　ｎｍｏｌｅａを混合し、４℃で１８時間反応後
、４１２、５　ｎｍｏｌｅｓのβ−メμカブＦエタノー
ルで反応を停止させた。β−Ｄ−ガラクトシダーゼと結
合したポリペプチドは、セファロース６Ｂカラムで分画
を行ない、以下の実験に使用した。

参考例４ ＥＩＡ法 参考例２で得た蛋白複合体で免疫したマウス血清あるい
はハイブリドーマ上清中の抗体活性の検出はＥＩＡ法を
用いて行なった〔イムノファーマコロジー、１．３　（
１９７８））。すなわち、血清あるいはハイプリドーマ
上清をバッファーＡ　（２０ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４、１
００ｍＭ　ＮａＣ１、０，１９６ＮａＮ３　。

ｌ　ｍＭ　ＭｇＣｌ２．　ｐＨ７，０）で希釈し、この
１００μｋをとり、寿謬例３で得たポリペプチド誘導体
１００μｍとよく混合し、２４ｔＣで２４時間反応させ
た。反応後、ウサギ抗マウスエｇＧ　　を結合した３％
七μロース１００μｍを加えて２４υ、４時間反応させ
た。反応後、セルロースを０．５９６ツイーン２０を含
んだバッファーＡでよく洗浄し、４−メチレンペリフェ
リルーβ−Ｄ−ガラクトシド２０μ９／ｗｌを５００μ
！加え、３７℃で２時間反応後、１００ｍＭカーボネー
トバッファー（ｐＨ１０，５）を３ｍｌ加えて反応を停
止し、上清中の螢光強度を螢光計で測定した（エキサイ
チージョン３６５ｎｍｌエミッション４５０ｎｍ）。

参考例５ 免疫 ７〜８週令のＢＡＬＢ／ｃ雌マウス６匹各々に抗原とし
て参考例２で得た蛋白複合体の、タンパク量として、４
０ｐｆをフロインドコンデリートアジュバントとよく混
合し、皮下に接種した（初回免疫）。初回免役の２週後
、同量の抗原をフロイントインコンプリート　アジュバ
ントとよく混合し、皮下に接種した（二次免疫）。さら
に、その２週後、二次免疫と同様の方法で三次免疫を行
なった。三次免疫の６日後、マウスから血液を部分採取
し、血清中の抗体価を参考例４記載のＥＩＡ法で測定し
た。乙のうち、高い抗体価を示したγ−２マウスに対し
て１２０μｑの抗原を０，５ｗｌの食塩水に溶解させた
ものを静脈内に接種することにより最終免疫を行なった
。各マウスの抗体価は第３表に示した。

第３表 １）血清の希釈は１／１０００ ２）血清の希釈は１／６３００ ３）血清の希釈は１／７８００ ４）−：　　検出不可能 ５）ＮＤ：　　検索せず Ｂ／Ｔ　：　（結合した酵素活性／加えた全酵素活性）
Ｘ１００ 参考例６ 細胞融合 参考例５記載の方法で免役を行ない、最終免疫の３日後
のγ−２マウスから牌臓を摘出し、ステンレスメツシュ
で圧迫、濾過Ｌ、イーグルズ・ミニマム・エッセンシャ
ルメテイウム（ＭＥＭ）Ｋ浮遊させ、碑臓細胞浮遊液を
得た。細胞融合に用いる細胞として、ＢＡＬＢ１０マウ
ス由来ミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ６３．Ａｇ８．Ｕｌ（Ｐ
３Ｕ１）を用いた〔カレント　トピックス　イン　マイ
クロバイオロジー　アンド　イムノロジー、８１．１（
１９７８））。細胞融合は、原注（ネイチャー。

２５６巻、４９５頁、　１９７．５年）に準じて行なつ
た。即ち、牌臓細胞およびＰ３Ｕｌをそれぞれ血清を含
有し外いＩＩＴＭで３度洗浄し、＊臓細胞とＰ２Ｈ４数
の比率を５：１になるよう混合して、８００回転で１５
分間遠心を行なって細胞を沈殿させた。上清を充分に除
去した後、沈殿を軽くほぐし、４５％ポリエチレングリ
コ−／Ｌ／（ＰＥＧ）６０００（フッホライト社！３り
を０．３ｄ加え、３７Ｃ温水槽中で７分間静置して融合
を行なった。融合後細胞に毎分２ｄの割合でＭＥＭを添
加し、合計１２ｗ１のＭＥＭを加えた後６００回転１５
分間遠心して上清を除去した。この細胞沈酸物を１０％
牛脂児血清を含有するＲＰＭ工１６４０メディウム（Ｒ
ＰＭ工１工種６４００ＦＣ３）にＰ２Ｈ４がＩＭｌ当！
Ｄ　２　Ｘ　１０５個になるよう浮遊し、２４穴マμチ
デイシユ（リンプロ社製）に１ウエ／Ｉ／ｌｄずつ１４
４ウニμに播種した。播種後、細胞を３７℃で５％戻酸
ガスフラン器中培養した。２４時間後、ＨＡＴ（ヒボキ
サンチンｌＸ１０’Ｍ。

アミノプテリン４Ｘ１０　　Ｍ、チミジン１．６×１０
”−５Ｍ　”）を含んだＰＲＭ工１６４０−１０ＦＣ８
培地（ＨＡＴ培地）を１ウエル当Ｄ　Ｉ　ＩＦ／ずつ添
加することにより、ＨＡＴ選択培養を開始した。

ＨＡＴ選択培養は、培養開始３，５．７日後に旧液をＩ
ｇ／捨てたあと、１ｍ／のＨＡＴ培地を添加することに
よシ継続した。ハイプリドーマの増殖は、細胞融合後１
０〜１４日で認められ、培養液が黄変したとき（約Ｉ　
Ｘ　１０６／ｌｔｌ　）　、上清を採取し、ＥＩＡ法で
、抗体の有無を検索した。このようにして、ハイプリド
ーマの増殖が認められた１４１ウエルの上清を調べたと
ころ、２ウニ／Ｌ／（γ２−１１　、ｒ２−１ｏｏ）に
強い抗体活性、２ウエル（γ２−６２．γ２−７０）に
弱い活性を認めた。

参考例７ クローニング 抗体活性が陽性を示した３ウニｌＶ（γ２−１１．６２
．１００）の各ハイプリドーマを、限界希釈法によって
クローニングを行なった。即ちハイプリドーマが２個／
　ｍｌになるようＲＰＭ工１工種６４００Ｆ’Ｃ８に浮
遊させ、９６穴マイクロプレート（ヌンク社製）に１ウ
ェル当、９０．１　ｇ／ずつ分注した。分注する際、フ
ィーダー細胞としてＢＡＬＢ／ｃマウスの胸腺細胞をウ
ニμ当ｆｉ５に１０５個になるよう加えた。このように
して、約２週間後には細胞の増殖が認められるようにな
り、上溝を採取して、抗体の有無を参考例４記載のＥＩ
Ａ法で調べた。その結果、γ２−１１では１９クローン
中８クローン、γ２−６２では５４クローン中３クロー
ン、γ２−１００では４７クローン中５クローンに抗体
活性を認めた。

参考例８ モノクローナル抗体産生ハイプリドーマの腹水化 ＩＦＮ−７に対して結合能を示す抗体を産生ずるγ２−
１１　、１クローン細胞（マウスＢハイプリドーマ　γ
２−１１．１） １　Ｋ　１０６個を、あら かじめ０．５　ｍｌのミネヲμオイルを腹腔内に投与し
ておいたＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスの腹腔内に接種
することによシ腹水化を行った。ハイプリドーマを腹腔
に投与して１０日後、腹水を採取して抗体価をＥＩＡ法
で測定したところ、１０　倍希釈まで抗体活性を示した
。なお、当該クローン細胞の培養上清中の抗体活性は、
１０　倍希釈まで認められているが、腹水化するととに
よシ約１０００倍程度抗体活性が上昇した。

参考例９ モノクローナμ抗体の精製 参考例８で得られた腹水４ｔｓｌを出発材料として、ス
テーリンラ（ジャーナル　オプ　バイオロジカルケミス
トリー、２５６巻、９７５０頁、１９８１年）の方法に
準じてモノクローナμ抗体を精製した。

まず腹水からフィブリン様物質を除去するため１０７１
００回転１５分間遠心した後、リン酸緩衝液−食塩水（
Ｐ　Ｂ　Ｓ　：　８．１　ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４，１，
５ｍＭＫＨ２ＰＯ４，２，７ｍＭ　ＫＣＩ　、　１３７
　ｍｕ　ＮａＣ１，ｐＨ７２）で２８０　ｎｍの紫外部
吸収（Ａ２８０）が１２〜１４の値を示す濃度に希釈し
た。希釈後サンプルに飽和硫酸アンモニウム溶液を４７
％の濃度になるように加え、４℃で攪拌しながら６０分
間塩析を行ない、その後遠心（１ｏ、ｏｏｏ回転、１５
分間）を行なって沈澱物を得た。沈澱物を５０　ｍＭ？
ＪａＣ１含有２０ｍＭ）リス緩衝溶液（ｐＨ７，９）に
清遊し、同溶液２！に対して透析を行なった。

２時間後、２Ｅの新しい同じ透析液に換え、さらに１５
時間透析を行なった。透析後、沈澱を除去するため１０
，０００回転１５分間遠心を行ない、上清をＡ２８０の
値が２０〜３０の濃度になるように調整した。このサン
プルを充分量の５０ｍＭ　−ＮａＣ１含有トリス緩衝溶
液で順化したＢＰＩｔのＤＥＡＥセルロースカヲム（ワ
ットマンＤＥ、５２）にかけ、５０　ｍＭ　ＮａＣ１含
有トリス緩衝溶液を用いて１．５ｍ１１分の流出速度で
分画な行なった。との条件下では、抗体活性は主として
素通り分画に認められた。

参考例１０ 参考例９の要領で精製された素通り分画のモノクローナ
ル抗体２５ｍ／（６５，３ｆｌｆ）をＱ、　ｌ　Ｍ　Ｎ
ａａｃｏ３．　ｐＩ（８，３溶液に対して一晩透析を行
った。

一方、アフイゲｔｖ　−１０（バイオ・ラド社）２５ば
をグラスフィルターを用いて充分水洗を行った後、０．
　Ｉ　Ｍ　ＮａＨＣＯ３ｐＨ８，３溶液に浮遊させ前記
抗体とを混合し、４℃で４時間、ゆつ＜シ攪拌しながら
反応させた。その後、４℃で一晩放置した後、グラスフ
ィルターを用いて０．　Ｉ　Ｍ　ＮａＨＣＯ３ｐ’Ｈ８
，３溶液でよく洗浄した。反応させたゲルに０．１Ｍ−
１−タノールアミン、０．１５ＭＮａＣ１を含む溶液（
ｐＨ８，０）を２５ｇ／加え、４℃、１時間後とうし、
残存するかも知れない未反応の活性基をブロックした。

その後ゲμをＰＢＳでよく洗浄し、Ｑ、　ｌ　９６　Ｎ
ａＮ３を含むＰＢＳ２５ｔ／に懸濁し、４Ｃで保存した
。加えた抗体量と回収されたか液中の抗体量から、ゲ／
Ｌ’　１　ｇ／当り２．３５ｒＩｙの抗体が結合してい
ることが判明した。この様にして得た反応物をカラムに
充め、抗体カラムとして使用した。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１　（ｖｌ）で得られたプラスミドｐＨ
ＩＴ３７０９の制限酵素地図を表わし、１部分はシグナ
ルペプチドと考えられるペプチドをコードする部分を示
し、簡司はＩ−ＩＦポリペプチドをコードする部分を示
す。第２図は実施例１（Ｖｌｌ）で得られたｐ）ＴＩＴ
３７０９プラスミドの一次構造（塩基配列）を、第３図
は実施例２（１）（Ｉｔ）のｐｔｒｐ７０１およびｐｔ
ｒｐ７７１、第４図は実施例２（１）のｐＨ工Ｔｔｒｐ
ＨＯ１、第５図は実施例２０Ｖ）のｐＨ工Ｔｔｒｐ２１
０１の構築図をそれぞれ表わす。第６図は実施例６（１
）の電気泳動の結果を、第７図は実施例６（１）におけ
る分子量測定の結果を示す。 上記参考例に開示しているマウスＢハイブリドーマγ２
−１１．１ｔＬバスツーμ研究所〔フランヌ国パリ〕の
ＣＮＣＭに寄託番号煮ｌ−２４２として寄託されている
。 ＄１　口 ０　　　　　　２００　　　　　４００　　　　　６０
０　　　　　８００　　　　１０００　１１０１　　ｂ
ｐ茅３１ ＄１図 竿乙図 １　へ糧マーカー ２　４令￥（２−メンレヵフａ￥てクノール引９ねと下
）３　　蚤令￥（２−メルジシ７・ト：【＝−タノーＪ
レフ！ミ２１５−イＭ１−−ン＄７図 相対移動夜 Ｃ未弛永素酵凛　　　　　　（３〕、／ρＩ）Ｏトソ７
°シ〉インしヒ・ター　（入豆）　　（２／、りρｌ）
Ｅ　　ソン゛デーＡ　　　　　　　　　　　　　（／ゲ
・りｌρ）吹田市千里山西４丁目３９番Ａ− ２０４号 ０発　明　者　黒用勉 川西市水明白１丁目１番地の５０ 手　続　補　正　書（自発） 昭和５９年３　月２７日 特許庁長官　　殿 １、事件の表示 昭和５８　年特許願第１７６０９０　　号２、発明の名
称 ヒト免疫インターフェロン蛋白質およびその製造法３、
補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 住　　所　　大阪市東区道修町２丁目２７番地名　称（
２９３）武田薬品工業株式会社代表者　　　倉　　林　
　育　　四　　部４、代理人 住　　所　　大阪市淀用区十三本町２丁目１７番８５号
明細書の発明の名称、特許請求の範囲１発明の詳細な説
明１図面の簡単な説明の欄及び図面６、補正の内容 別紙のとおシ フ、添付書類の目録 （１）　　別紙１．　　　　　　　訂正明細書　１通（
２）　　別紙２．　　　　　　　図　　　面　１通Ｃ３
）　　さチリ、６帖し３　　　　　　　　Ａプづ；生コ
１δ（ン１さ６丁ξａヨｌ−１〜ントミ　Ｉと保と 訂正明細書 １、発明の名称 蟲インターフェロン蛋白質およびその製造法２、特許請
求の範囲 （１）遺伝子組み換え技術で得られる実質的に側枠なヒ
ト免疫インターフェロン蛋白質。 （２）　　１０７１Ｔ／ｑ以上の比活性を有する特許請
求の範囲第１項記載の蛋白質。 （３）　　ヒト免役インターフェロン蛋白質が、式％式
％ Ｇｌｎ　　Ａｒ（＜　　１７日　Ａｌａ　　Ｉｌｅ　　
Ｈｉｓ　　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　　工ｌｅ　ＧｌｎＶａｌ　
Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　　
Ａｌａ　Ａｌａ　ＬｙｅＴｈｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｒ
ｇ　Ｌｙｓ　　Ａｒｇ　８ｅｒ　Ｇｌｎ　Ｍｅｔ　Ｌｅ
ｕＰｈｅ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｌａ　
８ｅｒ　Ｇｌｎ−０Ｈ（Ｃ）〔式中、ＹはＭｅｔ　　ま
たは結合手を示し、Ｚｌ　。 Ｚ２はそれぞれＣｙｓまたは’Ａ　Ｃ’ｆＢ　ｋ示す〕
のアミノ酸配列で示される特許請求の範囲第１項記載の
蛋白質。 （４）凍結乾燥品である特許請求の範囲第１項、第２項
または第３項記載の蛋白質。 （５）　　ヒト免疫インターフェロンをコードする塩基
配列を含有するＤＮＡを有する形質転換体を増殖させ、
形質転換体内にヒト免疫インターフェロン會生成、＠槓
せしめ、溶菌し、得られたヒト免疫インターフェロン含
有液を、ヒト免疫インターフェロンに結合するモノクロ
ーナル抗体を用いて精製することを特徴とする遺伝子組
み換え技術で得られる実質的に純粋なヒト免疫インター
フェロン蛋白質の製造法。 （６）遺伝子組み換え技術で得られるヒト免疫インター
フェロンがＩＯＵ／Ｍｇ以上の比活性を有する特許請求
の範囲第５項記載の製造法。 （７）　　ヒト免役インターフェロンをコードする塩基
配列が式 ％式％ （３） 〔式中、ＸはＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを示す〕であ
る特許請求の範囲第５項記載の製造法。 （８）モノクローナル抗体が式 ％式％ （］ （９） 〔式中、Ｘｌは結合手または工１ｅ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　
ＭｅｔＡｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｌ
ａ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　ＴｈｒＧ１ｙｃｌ Ｌｙｓ　Ａｒｇ　　で示されるペプチド鎖においてその
Ｃ末端から数えて１〜１６個のアミノ酸を有するべ依〕 プチドもしくはアミノ酸残基を示し、Ｙ３はＡｒｇ（Ｃ
） Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎで示されるペプチド鎖
においてそのＮ末端から数えて１〜５個のアミノ酸を有
するペプチドもしくはアミノ酸残基を示す〕で表わされ
るポリペプチドに対するモノクローナル抗体である特許
請求の範囲第５項記載の製造法。 （９）Ｙ３がＡｒｇ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ
である特許請求の範囲第８項記載の製造法。 ａｃｔ　　ｘ工がＬｙｓ　Ａｒｇである特許請求の範囲
第８項または第９項記載の製造法。 αυ　遺伝子組み換え技術で得られる有効量の実質的に
純粋なヒト免疫インターフェロン蛋白質と製剤学的に許
容される担体、賦形剤もしくは希釈剤とを含有する製剤
学的組成物。 （２）遺伝子組み換え技術で得られるヒト免疫インター
フェロン蛋白質が１０７　ＴＩ／ｓｇ以上の比活性を有
する特許請求の範囲第１１項記載の組成物。 α葎　注射用製剤である特許請求の範囲第１１項記載の
組成物。 ａ→　遺伝子組み換え技術で得られる実質的に純粋なヒ
ト免疫インターフェロン蛋白質と製剤学的に許容される
担体、賦形剤もしくは希釈剤とを混合することを特徴と
する有効量の該ヒト免疫インターフェロン蛋白質を含有
する製剤学的組成物の製造法。 ００　　遺伝子組み換え技術で得られるヒト免疫インタ
ーフェロン蛋白質がＩＯＵ／Ｗ以上の比活性を有する特
許請求の範囲第１４項記載の製造法。 Ｑ・　組成物が注射用製剤である特許請求の範囲第１４
項記載の製造法。 ３、発明の詳細な説明 技術分野 本発明は、ヒト免役インターフェロン蛋白質および遺伝
子工学手法によるそれの製造法に関する。 背景技術 インターフェロン（以下工ＦＮと略称することがある。 ）は、高等動物の細胞がウィルスや核酸などの刺激によ
って誘発されて産生ずる蛋白質であり、抗ウイμス作用
、抗睡瘍作用などを有する。 ヒトの１ＦＮには、現在α型、β型およびγ型の３種の
性状の異なるタイプが存在することが知られておシ、α
型およびβルはウィルスや核酸で、γ型はマイト−ジエ
ンなどで誘発される。 α型工ＦＮ（以下工ＦＮ−αと略称する）、β型工ＦＮ
（以下工ＦＮ−βと略称する）に関する研究は比較的す
−んでおり、その産生機構もかなシ解明されてきている
。さらに遺伝子操作技術の進歩によって、現在はＩＦＮ
−αと工ＦＮ−βｌが大腸菌を培養することにより、■
ＦＭ−α、が酵母を培養することにより、それぞれ生物
学的に活性な蛋白質として、大量に得られるようになっ
た〔ゴエデルら、ネイチャー、　２８７　、４１１（１
９８０）；イエ〃ペルトンら、ヌクレイックアンズ　リ
サーチ、９，７３１（１９８１）；ゴエデルら、同誌、
８．４０５７（１９８０）ｉヒツツエマンラ、ネイチャ
ー、２９３．７１７（１９８１））。さらに臨床へ応用
するための大量生産が試みられるようになってきた。 γ型工ＦＮ（以下工ＦＮ−γと略称することがある。）
はリンパ球の芽球化やリンホカイン産生が起るような状
況下で、免疫担当細胞から産生されるため、免疫インタ
ーフェロン（以下エーエＦＮと略称することがある）と
も呼ばれている。■−エＦＮは工ＦＩＪ−αや工ＦＮ−
βと比較して、抗細胞増殖活性や抗腫瘍活性が高いとい
われており、臨床的応用面からより期待されている。し
かし、その産生に新鮮なリンパ球が必要であることなど
の制約があるため、これまで効率のよい産生糸は確立さ
れていない。また、異なる実験糸では、異なる細胞種が
異なる分子種のエーエＦＨｆ産生する可能性も示唆され
ており、その構造や性質に関しても不明な点が多く残さ
れている。 一方、１１Ｍには高い種特異性があるため、ヒトへの応
用にはヒト由来の工ＹＨが使用されなければならない。 しかしながら、ヒト免疫インターフェロンは量産が困難
であるために、現時点では臨床への応用が不可能であシ
、純度の高いヒトエーエＦＮを容易により安価に大量生
産できる技術の開発が望まれている。 本発明者らは、遺伝子操作技術を利用してヒトのエーエ
ＦＮ遺伝子をクローニングし、得られた組み換えＤＮＡ
分子を宿主に移入してヒトエーエＦＮ遺伝子を発現させ
、目的とするエーエＦＮ蛋白質を得ることのできる技術
の開発研究を行った結果、本発明を完成するにいたった
。 発明の開示 本発明は、遺伝子組み換え技術で得られる実質的に純粋
なヒト免疫インターフェロン蛋白質、ならびにヒト免疫
インターフェロンをコードする塩基配列を有するＤＮＡ
を含有する形質転換体を培養し、得られるヒト免役イン
ターフェロン蛋白質含有液をヒト免疫インターフェロン
に結合するモノクローナル抗体を用いて精製する当該蛋
白質の製造法を提供するものである。 グレイらは、ヒトのＩ−工ＦＮ遺伝子のひとつをクロー
ニングしたと考え、それから推定されるポリペプチドの
アミノ酸配列を報告した〔ネイチャ、２９５．５０３（
１９８２））。その後も、デボスら〔ヌクレイツク　ア
ンズ　リサーチ。 １０．２４８７（１９８２））およびプリンクら〔同誌
、１０．３６０５（１９８２））によ）類似する発表が
行われている。しかし、これまでは抗つイμス作用を有
することによりＩＦＮ様物質の存在が推定されていたの
みで、現実に、実質的に純粋なヒト免役インターフェロ
ン蛋白質を取得したとの報告はない。 本発明者らは、実質的に純粋な、遺伝子組み換え技術に
よって得られるヒト免役インターフェロン蛋白質および
その製造法を確立し本発明全完成した。 本発明で用いられるヒトエーエＦＮをコードするＤＮＡ
は、例えば一般式 ％式％ （３） 〔式中、Ｘは’ｌ’ＡＡ、ＴＧＡ　ｔたはＴＡＧを示す
〕で表わされる塩基配列を含有するＤＨＡＣＩ）である
。 上記ＤＮＡ　（１）は、その５′末端に５　　　ＡＴＧ
　　ＡＡＡ　　ＴＡＴ　　ＡＣＡ　　ＡＧＴ　　ＴＡＴ
　　Ａ’［’ＣＴＴＧＧＣＴ　　ＴＴＴ　　ＣＡＧ　　
Ｃ’Ｉ’ＣＴＧＣＡＴＣＧＴＴ　　ＴＴＧ　　ＧＧＴ　
　ＴＣＴＣ’Ｉ’Ｔ　ＧＧＣ３（Ｉ［） またはＡＴＧ（Ｎ）ｔ”有していてもよい。 ＤＮＡ（Ｉ）はプロモーターの下流に連結されているこ
とが好ましく、これらプロモーターとしてトリプトファ
ン（ｔｒｐ）プロモーター、ラクトースＣ１ａｃ）プロ
モーター、蛋白質鎖伸長因子Ｔｕ（ｔｕｆＢ）プロモー
ターが挙げられ、とシわけｔｒｐ　　プロモーターが好
適である。 一般式（１）中、Ｘで示されるオリゴヌクレオチドのう
ちでもＴＡＡが好ましい。 本明細書において、アミノ酸、ペプチド、保護基、活性
基、その他に関し略号で表示する場合、それらは工［Ｉ
ＰＡＣ−工ＵＢ（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ　　ｏｎＢｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌ　　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）による
略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくもので
あシ、その例を第１表に挙げる。また、アミノ酸などに
関し光学異性体がありうる場合は、特に明示しなければ
Ｌ体を示すものとする。 第１表 ＤＮＡ　：　　デオキシリボ核酸 Ａ　：　アデニン Ｔ　：　チミン Ｇ　：　グアニン Ｃ：　シトシン　。 ＲＮＡ：　　リポ核酸 ｄＡＴＰ：　　デオキシアデノシン三リン酸ｄＴ’［’
Ｐ　、　　デオキシチミジン三リン酸ｄＧＴＰ：　　デ
オキシグアノシン三リン酸ｄＣＴＰ：　デオキシンチジ
ン三リン酸Ａ’Ｌ’Ｐ、　　アデノンン三リン酸 ＥＤＴＡ、　　エチレンジアミン四酢酸８Ｄ８　、　　
ドデＶｌｖ硫酸ナトリウムＧｌｙ：　　グリシン ＡｌａＨアラニン Ｖａｌ：　　バリン Ｌｅｕ：　　ロイシン エｌｅ、　　イソロイシン ８ｅｒ：　　セリン Ｔｈｒ　：　　スレオニン Ｃｙｓ　：　　　システィン Ｍｅｔ：　　メチオニン Ｇｌｕ：　　グルタミン酸 Ａｓｐ：　　アスパラギン酸 Ｌｙｓ：　　リジン Ａｒｇ　：　　アルギニン Ｈ１日：　ヒスチジン Ｐｈｅ：　　フヱニールアラニン Ｔｙｒ　：　　チロシン Ｔｒｐ：　　）リプトファン Ｐｒｏ　：　　プロリン Ａ８ｎ　：　　アスパラギン Ｇ　１　ｎ−Ｈグルタミン ２　：　カルボベンゾキシ Ｂｏａ：　　ｉ、−ブトキシカ〃ボニルＭｔｒ：　　４
−メトキシ−２，３，６−）リメチルベンゼンス〃ホニ
ル Ｐｍｅ　ＨペンタメチμベンゼンスルホニｐＯＢｕ：　
　　ｔ−ブチルエステル ＯＲＢ：　　Ｎ−ヒドロキＶ−５−ノｐボルネン−２，
３−シカμポキシイミドエステル ＤＣＣ：　　Ｎ、Ｎ’−ジシクロヘキシルカルポジイミ
ド ＤＣＵ：　　Ｎ、Ｎ’−シンクロへキシルウレアＨＯＮ
Ｂ：　　Ｎ−ヒドロキシ−５−ノμボｐネン−２，３−
シカμポキシイミド ＨＯＢｔ：　　Ｍ−ヒドロキシベンゾトリアシーμＣＨ
Ａ　：　　シクロヘキシルアミン ＤＣＨＡ　：　　ジＶクロヘキＶｌｖアミンＴＥＡ：　
　　）リエチルアミン ＴＦＡ：　　）リフルオロ酢酸 Ｍ８Ａ：　　メタンスルホン酸 ＴＨ１ｉ’　：　　テトラヒドロンランＤＭＦ　：　　
ジメチｐホμムアミド ＭｅＯＨ：　　メタノール Ａｃ０Ｅｔ　：　　酢酸エチル 本発明においては、例えばヒト末梢血リンパ球などヒト
ｌ−１ＦＮを分泌する細胞を培養し、培養液からヒトニ
ーＩＦＮ’ｉコードする伝令（ｍ）ＲＨＡｋ分離し、た
とえば逆転写酵素を用いて単鎖の相補（ｃ　）ＤＮＡ″
ｆｒ合成し、二重鎖ＤＮＡに導き、プラスミドに導入し
て、例えば大腸菌全形質転換させ、これよりｃＤＮＡ含
有プラスミドを単離することによりヒトニー工ＦＮをコ
ードする二重鎖ＤＮＡを製造することができる。 ここで用いられるヒト末梢血リンパ球は非感作細胞、感
作細胞のいずれでもよい。 本発明に使用される■−１ＦＮ誘起剤は、ヒトリンパ球
細胞にＩ−工ＦＨの産生を誘起させるものであればいか
なるものであってもよい。例えば、フィトヘマグμチニ
ン（ＰＨＡ）、コンカナバリンＡ（Ｃｃ＋ｎＡ）ｓスタ
ヒロコツ力ル　エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）、ノイラ
ミニダーゼ−ガラクトース酸化酵素（ＮＡＧＯ）、１２
−ｏ−テトラデカノイルホルボーｖ−１３−アセチイト
（ＴＰＡ）などが挙げられ、これらを単独またはこれら
を組合せて使用することができる。 ■−工ＦＮの誘起は細胞をＲＰＭニー１６４０培地やＭ
ＫＭ培地などそれ自体公知の培地で培養して行うことが
できるが牛胎児血清を含むＲＰＭニー１６４０培地が好
ましい。培養は、温度３５〜３９°Ｃ１望ましくは３６
〜３８°Ｃで、培養時間は１２〜７２時間、望ましくは
２２〜２６時間行われる。細胞はそれ自体公知の方法で
集め、これにＲＮａｓｅｌｉＥＬ害剤としてグアニジン
チオンアナイド。 ベントナイト、ヘパリン、ポリビニ／Ｌ／硫酸、オーリ
ントリカルボン酸、バナジウム複合体、ジエチμピロカ
ルボネイト（ＤＰＣ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
８）などを加えたのち、Ｎ−ラウリルザルコシン、ツイ
ーン８０．ノニデットＰ−４０などを加えて細胞を溶解
させてＲＮＡ’ｅ抽出する。必要によシ、このＲＮＡ１
ｆｉむ抽出液にフェノール、フェノ−〃−クロロホルム
などを加工て抽出操作ヲ＜シ返したのち、エタノール沈
殿でＲＮＡを集める。真核細胞の細胞質に存在するｍＲ
ＮＡの多くは、その３′末端にポリＡ配列をもっことが
知られているので、つぎにオリゴ（ｄＴ）セルロース、
ポリ（Ｕ）セフ１０−スなどｆ用いてボＵ　（Ａ　）　
ＲＨ）、を集め、これ’ｆｒＶＢ糖密度勾自己遠心法で
分１ガ一部をアフリカッメガエル（Ｘｅｎｏｐａｓ　　
１ａｅｖｉｓ　）の卵母細胞に注入して鼾訳させる〔ガ
ードンら、ネイチャ、２３３．１７７（１９７１））。 生じた魚白質の抗ウイルス作用全検定し、■−エＦＮの
ｍＲＮＡ　ｌ：含む＋２−１６８の両分を得ることがで
きる。ｍＲＮＡはホルムアミド−ポリアクリルアミトゲ
／ｌ／電気泳動やグリオキサールを用いたアガロ−スゲ
／Ｉ／電気泳動會用いても精製することができる。 得られたｍＲＮＡを両型として、たとえば、逆転写酵素
を用い自体公知の方法で相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）ｉｉ
合成し、ｃＤＮＡの二本鎖ＤＮＡへの変換を行う〔マニ
アチスら、セル、８，１６３（１９７６））。 と１７）ＤＮＡｔ例えばｄＧ−ｄＣあるいはｄＡ−ｄＴ
ホモポリマー結合法〔ネルソン、メソッズイン　エンヂ
モロジー、６８．４１（１９７９）アカデミツク　プレ
ス社、ニューヨーク〕で、たとえばプラスミド　ｐＢＲ
３２２のＰｓｔ工あるいは５ｐｈＩ制限工ンドヌクレア
ーゼ切断部位に組み込ませる。これを例えば大腸菌Ｘ１
７７６株に導入して形質転換させ、テトラサイクリン耐
性あるいはアンピシリン耐性でトランスホーマントを選
ぶことができる。別にＩ−ＩＦＮポリペプチドのアミノ
酸配列に対応すると考えられる塩基配列をもったオリゴ
ヌクレオタイドを化学合成したのち、これＴｈ３２ｐで
ラベルしてプローブとなし、たとえばそれ自体公知のコ
ロニーハイブリダイゼーション法（グルンステインとホ
グネス、プロシーディング　オブ　ナショナル　アカデ
ミーサイエンヌＵＳＡ、７２．３９６１（１９７５））
によって、すでに得たテトラサイクリン耐性あるいはア
ンピシリン耐性のトランスホーマントの中から求めるク
ローン全二次スクリーニングする。 このコロニーハイブリダイゼーションによって画性を示
したクローンの塩基配列を、たとえばマキサム−ギルバ
ート法〔プロシーディング　オブナショナル　アカデミ
−サイエンスＵＳＡ。 ７４．５６０（１９７７））あるいはファージＭ１３を
用いたデオキシヌクレオチド合成鎖停止〔メシングら、
ヌクレイツク　アンズ　リサーチ。 ９．３０９（１９８１））の方法によって決定し、エー
エＦＮ遺伝子の存在全確認する。次に、得られたクロー
ンからエーエＦＮ遺伝子の全部あるいは一部をきり出し
、適当なプロモーター、８Ｄ（シャイン　アンド　ダル
ガーノ）配列の下流につないで、これ’ｔａ当な宿主に
導入することもできる。 プロモーターとしては、前記のプロモーターが挙げられ
、宿主としては、大腸菌（エシェリヒアコリ　２９４　
、ｗ３１１０　、ｃ６００など）、とりわけ２９４が好
ましい。 なお、２９４は公知の菌（バックマンら、プロシーディ
ング　オプ　ナシ、ナル　アカデミ−サイエンス　ＵＳ
Ａ、７３．４１７４（１９７６））で財団法人「発酵研
究所（工ｎｅｔｉｔｕｔｅ　　ＦｏｒＦ’ｅｒｍｅｎｔ
ａｔｉｏｎ＋　０ｓａｋａ　）　Ｊに工Ｆ　Ｏ−１４１
７１として寄託もされている。 本発明のＤＮＡによる宿主の形質転換は、例えば公知の
方法〔ニーエン、　Ｓ、Ｎ、ら、プロシーディング　オ
プ　ナショナル　アカデミ−サイエンス　ＵＳＡ、６９
．２１１０（１９７２））により行う。 このようにして得られた形質転換体をそれ自体公知の培
地で培養する。 培地としては、例えばグルコース、カザミノ酸を含むＭ
９培地〔ミラー、ジャーナル　オプ　エクヌベリメンツ
　イン　モレキュラー　ゼネティクス　４３１−４３３
（コーμド　スプリングハーバ−研、ニューヨーク　１
９７２））が挙げられる。ここに、必要によりプロモー
ターを効率よく働かせるために、たとえば３β−インド
リルアクリ／ｌ’酸のような薬剤を加えることができる
。 培養は通常１５〜４３℃で３〜２４時間行い、必要によ
シ、通気や攪拌を加えることもできる。 培養後、公知の方法で菌体を集め、例えば、緩衝液に懸
濁させた後、たとえば超音波処理、リゾチームおよび／
または凍結融解によって菌体を破壊し、遠心分離により
上澄みを得る。菌体の破壊に関しては、凍結融解後リゾ
チーム処理を行うことが好ましい。 上記上澄み中のヒトエーエＦｌｉは、ヒトニーＩＦＨに
結合するモノクローナル抗体を用いることにより有利に
精製することができ、モノクローナル抗体として、好ま
しくは式 （ ％式％ （ ） （ 〔式中、ｘｌは結合手または工１ｅ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　
ＭｅｔＡｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　８ｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｌ
ａ　Ａｌａ　Ｌｙｅ　’Ｉ’ｈｒ　Ｇｌｙ（Ｃ） Ｌｙｅ　Ａｒｇ　　で示されるペプチド鎖においてその
Ｃ末端から数えて１〜１６個のアミノ酸を有するべ（Ｎ
） プチドもしくはアミノ酸残基を示し、Ｙ３　はＡｒｇ（
Ｃ） Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎで示されるペプチド鎖
においてそのＮ末端から数えて１〜５個のアミノ酸を有
するペプチドもしくはアミノ酸残基を示す〕で表わされ
るポリペプチドに対するモノクローナル抗体が挙げられ
る。 なお、ポリペプチド（１％’）は新規化合物である。 ポリペプチド（ＩＶ）に関し、Ｙ３　　としてはＡｒｇ
ＡｒｇＡｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎが好ましく、Ｘ　として
はＬｙｓ　Ａｒｇが好ましい。さらに、ポリペプチド（
ＩＶ）は、１５〜２５個のアミノ酸残基からなるものが
好ましい。該モノクローナル抗体は、抗体カラムとして
有利に使用できる。 抗体カラムの作製は、例えばハイプリドーマを接種した
腹水等から純すいに精製した上記モノクローナル抗体を
適切な担体とカプリングさせることにより、以下の様な
方法でできる。 用いる担体は、カプリングの後に■−工ＦＮが特異的に
効率よく吸着され、その後適切な溶出が可能なものであ
ればどの様なものでもよいが、−例として蛋白の一部ア
ミンが結合し易い様に活性化されたアガロ−スゲμビー
ズ、例えばアフイゲ／ｌ／−１０（バイオ・−ラド社製
）などが以下に述べる様な方法で好都合に用いられる。 アフィゲル−１０と抗体との反応は、０．００１〜１Ｍ
、好ましくは０．１Ｍのパイカーボネート等の緩衝液中
で反応を行う。反応条件は０〜２０°Ｃ１１０分〜２４
時間、種々のｐＨが可能であるが、好ましくは、４℃、
４時間、ｐＨ３〜１０の条件が用いられる。混合するア
フイゲ／Ｌ’−１０と抗体の量比は、アフイゲｌ　１　
ｗｌに対し抗体量が約５０１’）位迄は多ければ多い程
多くの抗体がつくので、この範囲内でいくらでもよいが
、実用上および結合効率を考慮して１倉ｌ〜３０ｇ！ｖ
の抗体が好都合に用いられる。 この様にしてできた抗体−担体結合物は、反応に用いた
緩衝液でよく洗った後、数日放置するか、モジ〈はｊ＆
終濃度０　、０５　Ｍのエタノールアミン・塩酸を加え
４°Ｃで１時間反応させる等の方法により、残存する未
反応の活性基をブロックした後、適切なカラムにつめる
ことにより、抗体カラムとして使用できる。 上記した抗体カラムで精製するに際しては、たとえば、
上記の菌体破壊によシ得られる上澄み等のヒト免役イン
ターフェロン蛋白質含有液を中性附近の緩衝液、たとえ
ばリン酸緩衝液やトリ７・塩酸緩衝液に溶解して抗体カ
ラムに吸着させる。 次にカラムを同じ緩衝液で洗浄したのち、■−エＦＨｆ
溶出する。溶出液としては、弱酸性溶液たとえば酢酸溶
液、ポリエチＶングリコ−Ｉｖ’ｌ含む溶液、資料にく
らべ抗体により結合し易いペプチドを含む溶液、高濃度
塩溶液などおよびこれらの組み合せた溶液などが用いら
れ、ヒトニー■ＦＭの分解をあまり促進しないものが好
ましい。 カラム溶出液は、常法により緩衝液で中和する。 必要により再度上記の抗体カラムによる精製操作を行う
ことができる。 ここで得られるヒトエーエＦＮ蛋白質溶液は透析に付し
、必要によシこれを凍結乾燥により粉末とすることがで
きる。凍結乾燥に際しては、ソｐピトー／Ｉ／、マンニ
ドーμ、デキヌトロース、マμドース、グリセロールな
どの安定剤を加えることができる。 本発明の突質的に純粋な、遺伝子組み換え技術で得られ
るヒト免役インターフェロン蛋白質はヒト羊膜由来ｗｉ
ｓｕ細胞に対する水泡性口内炎ウイルヌ（ＶＳＶ）の細
胞変性効果阻止試験によるウイ／ｌ’ス活性測足におい
てＩＯＵ／＃以上の比活性を示すものである。 なおここでエーエＦＨの活性としてのＴＪ／ｖｔｌ（ユ
ニット／コ）の出し方は以下の様に行。た。 ユニットの確定した国際標準ＩＦＮ−αと白血球由来の
粗エーエＦ　Ｎ　ｉヒト羊膜由来Ｐ　Ｌ細胞株に対する
ｖ’ｓｖの細胞変性効果阻止試験を用いて測定し、その
力価の比較から白血球由来粗エーエＦＮの力価を決定し
エーエＦ　ｌＴの標準品とした。目的とする資料中のエ
ーエＰＨの力価算定のためには、常にこの標準エーエＦ
Ｎを並べて前述のＷ工５ａ−ｖｓｖの系でアッセイを行
い、その比率から力価を算出した。 本発明のヒト免疫インターフェロン蛋白質は、好ましく
は一般式 ％式％ エｌｅ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　
Ｔｈｒ　　工ｌｅ　Ｌｙｓ　ＧｌｕＡｓｐ　　Ｍｅｔ　
　Ａｓｎ　　Ｖａｌ　　Ｌｙｓ　　Ｐｈｅ　　Ｐｈｅ　
　Ａｓｎ　　Ｓｅｒ　　ＡｓｎＬｙｅ　Ｌｙｓ’Ｌｙｓ
　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｌｙｅ　
ＬｅｕＴｈｒ　　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｔ
ｈｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　ＶａｌＧｌｎ　Ａｒｇ
　Ｌｙｓ　　Ａｌａ　’Ｉｌｅ　Ｈｉｓ　　Ｇｌｕ　Ｌ
ｅｕ　　工ｌｅ　　ＧｌｎＶａｓｔ　　Ｍｅｔ　　Ａｌ
ａ　　Ｇｌｕ　　Ｉ、ｅｕ　　Ｓｅｒ　　Ｐｒｏ　　Ａ
ｌａ　　Ａｌａ　　ＬｙｓＴｈｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　　
Ａｒｇ　Ｌｙｅ　　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｍｅｔ　
ＬｅｕＰｈｅ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　ＡｒｇＡｒｇ　Ａｌａ
　８ｅｒ　Ｇｌｎ−０Ｈ（Ｃ）（Ｖ）〔式中、ＹはＭｅ
ｔ　または結合手を示し、Ｚ　１　＋　Ｚｚはそれぞれ
Ｃｙｓ　またはＶ２Ｃｙｓ　’ｅ示す〕のアミノ酸配列
からなるポリペプチドを含有するものである。当該ポリ
ペプチドを乾燥品基準で９０％以上とＱわけ９５％以上
含有するものが好ましい。 本発明により製造される実質的に純粋な遺伝子組み換え
技術によるヒト免疫インターフェロン蛋白質は下記の性
状を有する。 １）ＳＤ８−ポリアクリルアミドゲル（１７，５％）電
気泳動による分子量測定で１７．０００±１．０００を
示す。 ２）アミノ末端アミノ酸としてシスティンもしくハハー
フシスチンまたはメチオニンｖ有する。 ３）　Ｈ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｅ−Ａｒｇ−８ｅｒ−
Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ　−Ｐｈｅ　−Ａｒｇ−Ｇｌｙ
−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−８ｅｒ−Ｇｌｎ−ＯＨに対
するモノクローナμ抗体と結合する。 本発明によシ製造されるヒト免疫インターフェロン蛋白
質は従来の方法で得られるニーＩＦＮと同様の目的に同
様の用法により使用できるが、従来品に比し、夾雑蛋白
質１発熱物質が少ないので、注射剤原体等としてより安
全に使用される。 本発明のと）Ｉ−工１４蛋白質は抗ウィルス。 抗腫瘍、細胞増殖抑制および免疫増強作用を示す。 本発明のヒ）Ｉ−工ＦＮ蛋白質は医薬として使用する場
合、それ自体あるいは滅菌水、ヒト血清アμグミン（Ｕ
ＳＡ）、生地食塩水その他公知の生理学的に許容される
担体と混合して製剤学的に許容される組成物として使用
することができ、非経口的に又は局所に投与することが
できる。例えば、成人１日当り１０万〜１億ユニツト、
好ましくは５０００万〜６０００万ユニツ）１−静注又
は筋注などにより投与することができる。 本発明のヒトエーエＦＮ蛋白質を含有する製剤は、塩、
希釈剤、アジュバント、他の担体、バッファー、結合剤
、界面活性剤、保存剤のような生理的に許容される他の
活性成分も含有していてもよい。非経口的投与用製剤は
、滅菌水浴液又は生理学的に許容される溶媒との懸濁液
アンプル、または生理学的に許容される希釈液で用事希
釈して使用しうる滅菌粉末（通常ニー■１Ｎ溶液を凍結
乾燥して得られる）アンプルとして提供される。 さらに本発明のヒト免疫インターフェロン蛋白質を含有
する製剤は、工ＦＮ−αまたは工ＦＮ−βまたはインタ
ーロイキン２などのリンホカインのような他の活性成分
を本発明物質に対し１〜９９％含有していてもよい。 以下膠考例、実施例によシ本発明をさらに具体的に説明
するが、本発明はこれらに制限されるものでなり０ 下記参考例に開示しているマウスＢハイブリドーマγ２
−１１．１は、パスツーμ研究所〔フランス国パリ〕の
ＣＮＣＭに寄託番号風ニー２４２として寄託されている
。 また実施例に開示している形質転換体Ｅ、　ｃｏｌｉ２
９４／ｐＨ工Ｔｔｒｐ２１０１は、通商産業省工業技術
院微生物工業技術研究所（ＦＲ工）に受託番号ＦＥＢＭ
　　Ｐ−７ム焔　　として寄託されている。 発明を実施するための最良の形態 ↓ 以下の参考例（１）Ａにおよる薄層クロマトグラフィー
は、メルク社製シリカゲルプレート６０　Ｆ’２５４又
は、フナコシ薬品社製セルロースプレート、アビセ／Ｌ
’８Ｆを用い、下記の展開溶媒を用いた。 Ｒｆｌ：クロロホルム：メタノー７’：酢酸−９：１：
０．５ Ｒｆ２：ＩＦ酸ｍｆ−／Ｌ／：　Ｉｌｌ’！ｌ　ｓ／ン
：酢酸：　水＝　３０　。 １０：３：５ Ｒｆ３．クロロホルム：メタノ−／Ｌ／：水＝７：３：
０．５ Ｒｆ’：ｎ−ブタノ−１ｖ：ピリジン：酢酸：水＝３０
：２０：６：２４ Ｒｆ５：酢酸エチμ：ｎ−ブタノール：＃酸：水に１：
ｌ：１：１ （１）Ａ、ヒト免疫インターフェロンのアミノ酸配列凪
１３１−１４６に対応するポリペプチドの製造 （１ンＡ　（１）、Ｚ−８ｅｒ−Ｇｌｎ−ＯＢｕｔの製
造Ｚ−Ｇｌｎ−ＯＢｕ　　１０　、　ｉ　ｆ全メタノ−
／Ｉ１５００ｍｌに溶解し、パラジウム黒を触媒に水素
気流中で還元した。触媒をろ去し、溶ＩＧＩＩ留去した
残留物をＺ−３ｅｒ−０）Ｉ　７　、５　ｆ　、　ＨＯ
ＮＢ　　６　、８　ｆとともにＤＭ　Ｆ　２５０　ｗｅ
に溶解し、氷冷した。氷冷下にＤＣＣ７，１５ｆを加え
、０℃で４時間室温で１２時間攪拌した。析出したＤＣ
Ｕをろ去し、溶媒を留去ののち残留物ｆ　　Ａｃ０Ｅｔ
　　３００＠ｅに抽出し、４％ＮａＨＣＯ３１水、０　
、２Ｎ塩酸、水で洗込、無水硫酸ナトリウムで乾燥した
。溶媒を留去し、析出した結晶全エーテルでろ取し、乾
燥ののちＣＨ３Ｃｌより再結晶した。収量６．５ｆ、収
率５１．２％１ｍｐ−９７−１００℃、〔α９名５−２
４．１’（ｃ＝０．４０．メタノール）、Ｒｆｌ　０．
６４元素分析　Ｃ２０Ｈ２９０７Ｎ３として計算値：　
ｃ　５６．７２；　Ｈ６，９０；　ｙ　９．９２突験値
：　ｃ　５６．２１；　Ｈ６，７２；　Ｎ　９．７６（
１）Ａ　（ｉｉ　）、Ｚ−Ａｌａ−８ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｏ
Ｂｕｔの製造Ｚ−Ｂｅｒ−Ｇｌｎ−ＯＢｕ　　４．２３
１　ｋメタノ−／Ｉ／３００ｗｅに溶解し、パラジウム
黒を触媒に水素気流中で還元した。触媒をろ去し、溶媒
を留去した残留物’１Ｚ−Ａｌａ−ＯＨ２，３４ｆ、Ｈ
ＯＮＢ　　２．２７９ととモニ、Ａｃ０Ｅｔ　　２００
　ｍｌとジオキサン２００＠ｅ。 ＤＭＦ１００１ｔ／の混合溶媒に溶解し、氷冷した。 冷却下にＤｅｃ２．３８ｆ’に加えＯ’ＣＴ４時間、室
温で１２時間攪拌ののち、ＤＣＵをろ去し、溶媒を留去
した。残留物にＣＨ３ＣＮとエーテルを加え結晶とし、
ろ取、乾燥ののちＣＨ３０Ｍより再結晶した。収量３．
７２ｇ、収率７５．３％１ｌｎｐ。 １６５−１７０℃、〔α子−４１，２°（ｃ＝０．５０
．メタノ−／Ｌ／）　、ｕｆｌ　　Ｏ，６０元素分析　
Ｃ２３■３４ｏＢ　Ｎ４として計算値：　ｃ　５５．８
８；　Ｈ６，９３；　ｙ　ＩＬ３３実除値：　ｃ　５５
．５８；　Ｈ６，７４；　Ｎ　１１．１２（１）Ａ　（
Ｉｌｌ　）、Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）　−Ａｌａ　＝Ｓｅ
ｒ−Ｇｌｎ−ＯＢｕｔの製造 Ｚ−Ａｌａ−８ｅｒ−Ｇｌｎ−ＯＢｕｔ３　、４６　ｆ
　ｋメタノール３００１１Ｉｔに溶解し、パラジウム黒
を触媒に水素気流中で還元した。触媒をろ去し、溶媒を
留去した残留物を、Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−０Ｈ・ＣＨ
Ａ　４　、５４　ｆから調製したＺ−Ａｔ−ｇ（Ｐｍｅ
）−０Ｈ，１（ＯＢｔ　　ｌ　、９ｆとともにｎＭＦ１
５０／に溶解し氷冷した。冷却下にＤＣＣｌ、９ｆｔ”
加え、０℃で４時間、室温で１５時間攪拌した。ＤＣＵ
’ｉろ去し、溶媒全留去し残留物にＡｃ０Ｅｔ’に加え
ゲル状の沈＃を得、ろ取した。 乾燥後、メタノ−μとＡｃ０Ｅｔ　　よシ再沈澱した。 収ｉ４．５５Ｎ、収率７５．５％、ｍｐ、１３０−１３
４℃、〔α〕乙５−２４．１９　（ｃ＝０．２６゜メタ
ノ−／ｌ／）、Ｒｆｌｏ、５７ 元素分析　Ｃ４ｏＨ６ｏＯ□、Ｎ８Ｓ−すＨ２Ｏとして
計算値：　ｃ　５５．２２；　Ｈ７，０７；　Ｎ　１２
．８８；８　３．６９ 実験１Ｍ　：　ｃ　５５．２３ｉ　Ｈ６，９３；　ｙ　
１２．５４；８　　３．４８ （１）Ａ　（ＩＶ　）、Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ａｒ（
７（Ｐｍｅ）−Ａｌａ−８ｅｒＧｌｎ−ＯＢｕ　　の製
造 Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ａｌａ−８ｅｒ−Ｇｌｎ−ＯＢ
ｕｔ　　４．３　ｆｋメタ／−／Ｌ’４００ｇ／に溶解
し、パラジウム黒を触媒に水素気流中で還元した。触媒
をろ去し、溶媒を留去した残留物を、Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍ
ｅ）−０Ｈ−ＣＥＩＡ３．２４ｆより調製したＺ−Ａｒ
ｇ（Ｐｍｅ）−ＯＨ，ＨＯＢｔｌ、４２９とともにｎｕ
Ｆ２００ａ＋ｌに溶解し氷冷した。冷却下にＤｅｃｌ、
４１ｆを加え０°Ｃで４時間、室温で２０時間撹拌した
。ＤＣＵをろ去し、溶Ｋを留去した残留物にＡｃ０Ｅｔ
　會加え沈鍬を得、ろ取し友。乾燥後、メタノ−μとＡ
ｃ０Ｅｔ　　より、再沈酸した。収量４．４ｆ、収率７
１．７％。 −０，４０，メタノ−／Ｌ／）、Ｒｆｌ　０．６３元素
分析　Ｃ５７■８６０□４Ｎ工、Ｓ２・Ｎ２０として計
算値：　ｃ　５４．９６；　Ｈ７，１２＋　Ｎ　１３．
５０；８　５．１５ 実験値：　ｃ　５４．６６；　Ｈ６，９２；　Ｎ　１３
．３２ｓ８　５．３４ （１）Ａ　（Ｖ　）、Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）Ｇｌｙ−Ｏ
Ｂｕｔの製造Ｚ−Ｇｌｙ　　０Ｂｕｔ　１　３　　、Ｏ
ｆをＭｅＯＨ５００１１にとかし、Ｐｄ黒を触媒として
、水素気流中、接触還元した。触媒を戸別し、ろ液を減
圧濃縮し、残留物ｖｉ−ＤＭＦ２００１ｆｆにとかした
。これに、Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−０Ｈ・ＣＴＩＡ　２
０　、　Ｏｆより調製したＺ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−０Ｈ
，ＨＯＢｔ　５−４　ｇｋ加えて氷冷し、ＤＣＣＢ、２
９に加えて４８時間かき混ぜた。析出したＤｃｔｒ＠−
ｇ＝別し、濃縮後、Ａｃ０Ｅｔ’　　５００ｍｌにとか
した。Ａｃ０Ｅｔ　　層ｔ−４％ＨａＨＣＯ３水、１０
％クエン酸水で洗浄後、Ｎａ　２　Ｓ　Ｏ４で乾燥した
。濃縮後、石油ベンジンを加えて沈澱として炉取した。 収量１９．８ｇ（９６，８％）。ｍｐ、７１−７３°Ｃ
９〔α〕６３＋０．２°　ＣＱ＝０．９．ＤＭＩｆ’）
。 Ｒｆｌ　０．６２ 元素分析　Ｃ３１Ｈ４５Ｃ７Ｈ５８として計算値：　ｃ
　５８．９３；　Ｈ７，１８；　Ｎ　１１．０９；８　
５．０８ 実験値：　ｃ　５９．４２；　Ｈ７，５８；　Ｎ　１０
．９５＋８　４．８４ （１）Ａ　（ｖｌ　）、Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）
−Ｇｌｙ−ＯＢｕｔの製造Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）　−Ｇ
ｌｙ−ＯＢｕｔｌｏ、ＯｆＴｈＭｅＯＨ５００ｇ＋ｊ中
、接触還元したのち、ＤＭＦ３００ｇ／に転溶した。こ
れにＺ−Ｐｈｅ−ＯＨ４、７２ｆ　、ＨＯＢｔ２．３５
ｆを加えて氷冷し、ＤＣＣＢ、５９１を加えて、１５時
間かきまぜた。析出したＩＩＣＵｉｆ別し、炉液を濃縮
後、残留物をＡｃ０Ｅｔ　　４００ｍｌにとかした。Ａ
ｃ０Ｉｔ　　層は、４％ＮａＨＣＯ３水。 １０％クエン酸水で洗浄し、１ｉａ２８０４　で乾燥し
た。 濃縮後、エーテ／Ｌ／を加えて結晶として戸数し、Ｍｅ
ＯＨ−エーテルよシ再結晶した。収量１０．５Ｆ（８５
，３％）。ｍｐ、１０１−１０３℃。 〔α）２６−８　、３°　（ｃ＝０．９．ＤＭＦ）。 Ｒｆｌｏ、６４ 元素分析　Ｃ４０Ｈ５４０８Ｈ６Ｓ　　として計算値：
　ｃ　６１．６７＋　Ｈ６，９９＋　Ｎ　１０．７９；
８　４．１２ 実験値：　ｃ　６１．６６；　ｎ　６．５６；　ｘ　１
０．９３＋８　４．１４ （１）　Ａ　（ｖｌｌ　）、　Ｚ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａ
ｒｇ（Ｐｍｅ）−Ｇｌｙ−ＯＢｕｔの卵造 Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ｇｌｙ−ＯＢｕｔ５　
、５　ｆ　ｅＭｅＯＨ３００ｄ中、接触還元したのち、
ｎａｒ３００ｇ？に転溶した。これに、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｏ
ＨＤＣＨＡ　３　、３１　ｆよシ調製したＺ−Ｌｅｕ−
ＯＨ，ＨＯＮＢ　ｌ　、　４７Ｆを加えて氷冷し、ｎｃ
ｃｌ、６８ｆｆ：加えて４８時間かきまぜた。析出した
ＤＣＵを炉別し、濃縮後、Ａｃ０Ｅｔ　３００　ｍ１ｌ
ｌｃとかした。ＡｃｏＥｔ層は、４％ＮａＨＣ０３水、
１０％クエン酸水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。 濃縮後、エーテ／１／ヲ加えて粉末として戸数した。収
量６．２ｆ（９８，３％）ｍｐ。 １７＋−１７３°Ｃ，（α）Ｈ６−１５，５０（ｃ＝０
．９　、ＤＭＦ）、Ｒｆ’　　０．６４元素分析　ｃ４
６Ｈ６５ｏ９　Ｈ７ｓ 計算値：　ｃ　ｓｔ、９３．　Ｈ７，３４；Ｈ１０，９
９；８　３．５９ Ｗｅ値：　ｃ　６２．０２；　Ｈ７，３７；　Ｍ　１１
．０８；３　３．５９ （１）　Ａ　（！／Ｉｌｌ　）、　Ｂｏｃ−Ｍｅｔ−Ｌ
ｅｕ　−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）　−Ｇｌｙ−ＯＢｕ
　　の製造 Ｚ−Ｌｓｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）　−Ｇｌｙ−Ｏ
Ｂｕｔ　６　、　ＯｆをＭｅＯＨ２００ｇｌ中、接触還
元したのち、ＤＭＦ１５０ｇｔに転溶した。これに、Ｂ
ｏＣ−Ｍｅｔ　−ＯＨ・ＤＣＨＡ３．（ｌより調製した
Ｂｏｃ−Ｍｅｔ　−ＯＨｓ■ｏｕＢ　１．３９ｆｔ−加
えて氷冷し、Ｄ　ＣＣＩ　、５９ｇを加えて１５時間か
きまぜた。析出したＤＣＵｔｐ別し、濃縮後、ｎ−Ｂｕ
ＯＨ−ＡｃＯＥｔにとかし、１０％クエン酸水で洗浄し
、Ｎａ２８０４で乾燥した。 濃縮後、エーテμを加えて結晶として戸数した。 収量６．２Ｆ（９３，１％）。ｍｐ、　１９２−１９５
℃、（ａ）ｊ６−１９．７°（ｃ−１，０，ＤＭＦ）。 Ｒｆｌｏ、６４ 元素分析　０４ＢＨ７６０１ＯＮ８８２として計算値：
　ｃ　５８．２７；　Ｈ７，７４；　Ｎ　１１．３３；
８　６．４８ 実験値：　ｃ　５８．４８＋　Ｈ７，７９；　Ｎ　１１
．３４；８　５．９８ （１）　Ａ　（ｌｘ　）、Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｌ
ｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ｇｌｙ−ＯＨの製造 Ｂｏｃ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（Ｐ、ｍｅ　
）　−Ｇｌｙ−ＯＢｕｔ５．．５ｆＫＴＦＡ５０ｇｊを
加え、室温で１０分間振りまぜたのち濃猫し、エーテ／
ｌ／に加えて戸数し乾燥した。これを、ＤＭＦ、５０ｍ
１にとかして氷冷し、ＴＥＡｌ、８ｇ？を加えた。これ
にＢｏａ　−Ｇｌｎ　−ＯＨｌ　、８５ｆ　、ＨｏＭＢ
　１．４９ｆ　、ＤＣＣｌ、９０ｇよシー製したＢｏｃ
　−Ｇｌｎ−ＯＨＢを加え、１５時間かきまぜた。濃縮
後、ＡｃＯＨを加え、Ａｃ０Ｅｔを加えて沈澱として戸
数した。、収量５．３ｊＦ（８９，８％）。ｍｐ、１８
１−１８３°Ｃ（分解）。 （ａ）、１６−１９．６°（ｃ−１，０，ＤＭＥ’）。 Ｒｆｌ　　Ｏ、３，０ 元素分析　Ｃ４９■７６０□２Ｎ工。Ｓ２として計算値
：　ｃ　５５．４５；　Ｈ７，２２；　Ｎ　１３．２０
；８　６．０４ 実験値：　ｃ　５５．３９；　Ｈ７，１７；　Ｎ　１３
．３４；８　６．２０ （１）Ａ　（Ｘ　）、Ｚ−８ｅｒ−ＨＴｉＨＨ−ＢｏＣ
の製造Ｚ−８ｅｒ−ＯＨｌ　Ｏ、Ｏｆ　、　ｔ−ブチル
力ｐバゼー）６．２ｆをＤＭＦ１５（Ｉｇｌにとかして
氷冷し、ＨＯＮＢ　　Ｂ、Ｏｆ、ＤＣＣ９，３ｆｋ加え
て１５時間かきまぜた。析出したＤＣＵを炉別し、濃縮
後、Ａｃ０Ｅｔに転溶した。ＡｃｏＥｔ層は、４％Ｎ　
ａ　ＨＣ０３水、１０ｇ６クエン酸水で洗浄し、Ｎａ　
２　ＳＯ４で乾燥した。濃顧後、エーテルを加えて紡孔
としてか取した。収量７．３１＜５０．４％）ｍｐ、９
５−６ ９８°Ｃ，（α〕Ｄ−６．２　（Ｃ−０，８，ＤＭＦ）
、Ｒｆ　　Ｏ，６２ 元素分析　Ｃ１６Ｈ２３０６Ｎ３として計算値：　Ｃ５
４，３８ｉ　Ｈ６，５６ｉ　Ｎ　１１．８９実験値：　
Ｃ５４，７７＋　Ｈ６，８８ｉ　Ｎ　１２．２９（１）
Ａ　（ｘｉ　）−ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−８ｅｒ−ＮＨ
ＮＨ−ＢｏＣの製造Ｚ−８ｅｒ−ＮＨＮｉ−Ｂｏｃ　３
　、９１７　ｋ　ＭｅＯＨ３００ｓ／Ｉ中接触還元した
のち、ＤＭＦ５０ａ？に転溶した。これに、Ｚ−Ａｒｇ
（Ｐｍｅ）−ＯＨ−ＣＨＡ　６　、２　ｆｉよシ調製し
たＺ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−ＯＨ，ＨＯＢｔ　１　、５　
ＩＩを加えて氷冷し、Ｄｃｃ２．３１に加えて１５時曲
かきまぜた。析出したＤＣＵをｐ別し、濃縮後、Ａｃ０
Ｅｔにとかした。ＡｃｏＥｔ層は、４％Ｎａ　ＨＣＯ３
水、１０％クエン酸水で洗浄し、Ｈａ、８０４で乾燥し
た。濃縮後エーテルを加えて、沈澱として沖取゛μ−己
。収量７．４５１＜９３．７９６）。ｍｐ、　１０　［
１−１０１℃。 〔α）２６−０．９°　（ｃ＝１．２．ＤＭＦ）。 Ｒｆ’　０．５１ 元素分析　Ｃ３３Ｈ４９ｏ、”７８　　として計算値、
　Ｃ５５，０６ｉ　Ｈ５，８６ｉ　Ｎ　１３．６２；８
　４．４６ 実験値：　ｃ　５５．４９；　Ｈ６，９４；　ｙ　１３
．１４；８　３．８６ （１）Ａ　　（ＸＩ　　）、Ｚ−Ｌｙｓ（Ｍｔｒ）−Ａ
ｒｇ（Ｐｕｒｅ）−８ｅｒ　−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃの製造 Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）　−８ｅｒ−ＨＨＨＨ−Ｂｏｃ　
３　、９　ｆ　’ｒ：　ＭｅＯＨ３００Ｍｌにとかし、
接触還元したのち、ＤＭＥ’５０ｇ／に転溶した。これ
に、Ｚ−Ｌｙｓ（Ｍｔｒ）　−０Ｈ−ＤＣＨＡ　３　、
４　ｆよＨＭ製したＺ−Ｌｙｓ　（Ｍｔｒ　）　−ＯＨ
。 ＨＯＢｔＯ，８８ｇを加えて氷冷し、Ｄ　ＣＣ１，３４
ｆを加えて２０時間かきまぜた。析出したＤＣＵを炉別
し、濃縮後、Ａｃ０Ｅｔを加えて粉末として戸数し、Ｍ
ｅＯＨ−ＡｃＯＥｔ　Ｊ：　、り再結晶した。収量５．
１ｇ（９３，４％）。ｍｐ、１０３−１０５°Ｃ９〔α
）２６−７　、２°　（ｃ−０，８，ＤＭＦ）。 Ｒｆｌ　０．５７ 元素分析　０４９Ｈ７３０１３Ｎ９８２として計算値：
　Ｃ５５，５０ｉ　Ｈ６，９匂Ｎ　１１．８９；８　６
．０５ 実験値：　ｃ　５５．７０；　Ｈ７，１５；　Ｎ　１１
．６０；８　５．６３ （１）Ａ　（ｘｌｌｌ　）、Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）　−
Ｌｙｓ（Ｍｔｒ）−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−８ｅｒ−ＮＨＮ
Ｈ−Ｂｏｃの製造 Ｚ−Ｌｙｓ（Ｍｔｒ）＝Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−８ｅｒ−Ｈ
ＨＨＨ−ＢｏＣ４、８１ｉＭｅＯＨ３００ｙｘｌにとか
し、接触還元したのち、ＩＩＭＦ７０ｆｆＪＫ転溶した
。これに、２−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−ＯＨ−ＣＨＡ　２　
、８　Ｆより調製したＺ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−ＯＨ，Ｈ
ＯＢｔ　　Ｏ、７４ｇ全加えて氷冷し、ＤＣＣｌ、１２
１に加えて１５時間かきまぜた。析出したＤＣＵ’ｉ枦
別し濃炉別、Ａｃ０Ｅｔ　　にとかし、ＡｃｏＥｔ層を
４％Ｎａ　ＨＣＯ３水、１０％クエン酸水で洗浄し、ａ
ａ　２８　ｏ　４で乾燥した。濃縮後、エーテ／Ｌ／ｌ
−加えて沈澱として戸数し、ＭｅＯＨ−エーテルよ勺再
沈澱した。収量５．８ｆ（８９，８％）。 ｍｐ、１３６１３７“ｃ、ｃ・）２６−６．６°（・Ｄ ＝１　．０　　、ＤＭＦ）、Ｒｆｌ　０．５８元素分析
　Ｃ６６Ｈ０，０□６Ｎよ、Ｓ３として計算値：　ｃ　
５５．５６；　Ｈ６，９９；　Ｎ　１２．７６；８　６
．７４ 夾酔値：　ｃ　５５．３４；　Ｈ７，０７；　Ｎ　１２
．５（１；８　６．５９ （１）　Ａ、　（ｘｌｖ　）、ｚ−Ｌｙｓ（Ｍｔｒ）−
Ａｒｇ（Ｐｍｅ　）−Ｌｙｓ（’Ｍｔｒ）−Ａｒｇ（Ｐ
ｒｎｅ　）　−８’ｅｒ　−ｎＨＮＴＪ−Ｂｏｃの製造
Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ｌｙｓ（Ｍｔｒ）’Ａｒｇ（Ｐ
ｍｅ）−８ｅｒ−ＭＨＨＨ−Ｂｏａ　　３　’、　Ｏｆ
　ｋ　Ｍｅｏ）Ｉ　１５０　ａｔにとかし、接触還元し
たのち、：ｏｙＦ６０ｓ＋ｌＫ絵溶した。これに、Ｚ−
Ｌｙｅ（Ｍｔｒ）−０Ｈ−ＤＣＨＡ　１　、５−４’ｆ
　ｊ　、！７ＨＩＤしたＺ−Ｌｙｅ（ｌｌｌｔｒ＞−Ｏ
Ｈ，ＨＯＢｔ　Ｏ、３１’ｆを加えて水冷し、ＤＣＣｏ
、５７ｆを加えて１５時間かきまぜた。析出したＤＣＵ
を炉別し、濃縮後、Ａｃ０Ｅｔにとかし、Ａｃ０Ｅｔ　
）ｍ　ｋ　４％ＮａＨＣＯ水、１１クエン酸水で洗浄し
、Ｎ江、ＳＯ２で乾燥した。濃縮後、エーテ／ｌ／會加
えて結晶として戸数し、ＡｃＯｇｔより再結晶した。収
量２．’７０ｆ＜７２．８％）ｍｐ、１２３−１２５℃
、（ａ）、Ｆ６−５．９°（Ｃ＝ｌ　　、ｌ　　、ＤＭ
Ｆ）、Ｒｆｌ　０．５７元素分析　Ｃ８２’Ｈ１’２３
０２ＯＮ１５　ｓ４として計算値：　ｃ　５５．７３；
　Ｈ７，０２；　Ｎ　１１．８９；Ｓ　７．２６ 実験値：　ｃ　５５．８９；　Ｈ７，３０；　Ｎ　１１
．７２；８　７．０８ （１）Ａ　（ＸＶ）、Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ
−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ｇｌ：１１’−Ａｒｇ（
Ｐｍｅ）−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ａｌａ−８ｅｒ−Ｇｌｎ
−ＯＢｕｔの製造 Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）　−Ａｌａ−
８ｅｒ−Ｇｌｎ−ＯＢｕｔｌ　、　Ｑ　ｆ　ｔＭｅＯＨ
１００ａｔにとかし、接触還元しためちＤＭＦ２０ｉｇ
ｌに転溶した。これに、ＢｏＣ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅ
ｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（Ｐｎｉｅ）　−Ｇｌｙ−ＯＨＯ、
８５ｆ　、ｍｏＢｔ　　’１３５ｑを加えて水冷し、Ｄ
ＣＣ２１０ｔｖを加えて２０時間かきまぜた。析出した
ＤｃＵｔＦ別し、＃縮後、ＭｅＯＨを加えて沈澱として
戸数した。収量１．５ｏｆ（ｓｒ、＋９６）。 ｍｐ、２１６−２１７−０　（分解）　、　（ｒｘ　）
ｊ６−１１．８゜（ｃ＝１．０．ＤＭＦ）、’Ｒｆ１０
．４３４２− 元素分析　Ｃ９８Ｈ１５４０２３Ｍ２２８４として計算
値：　ｃ　５５．０９；　Ｈ７，２７；　Ｎ　１４．４
２；８　６．００ 実験値：　ｃ　５４．８１；　Ｈ７，３３；　Ｎ　１４
．２３；８　５．７９ （１）　Ａ　（ｘｖｌ　）、　Ｈ−１，ｙｓ　−Ａｒｇ
−Ｌ１２−Ａｒｇ−８ｅ’ｒ−Ｇｌｎ　−Ｍｅｔ−Ｌｅ
ｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ
−８ｅｒ−Ｇｌｎ−ＯＴＩの製造Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−Ｍｅ
ｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ｇｌｙ−Ａｒ
ｇ（Ｐｍｅ）−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）　−Ａｌａ　−８ｅｒ
−Ｇ１ｎ＝ＯＢｕｊ　　１　、　ＯｆにＴｒＡ１０＋ｆ
ｆを加え、室温で５０分間振）混ぜたのち、濃縮し、エ
ーテ／Ｉ／’ｉ加えて沈澱として炉取し、乾燥した。　
　　　□ 一方、Ｚ−：ｒ、ｙｓ（Ｍｔｒ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃｉ）
−Ｌｙａ（Ｍｔｒ）−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−８ｅｒ−ＨＨ
ＭＨ−Ｂｏｃ　　Ｏ、８３ｆ　Ｋ　Ｔ　Ｆ　Ａ１０ｇ／
を加えて室温で１０分間振り混ぜたのち、濃縮し、エー
テルを加えて沈澱として炉取し乾燥した。これをＤＭＦ
　１０−にとかし、ドライアイスーアセトシで冷却後、
’　６　、２Ｎ　ＨＣｊ−／Ａｃ０Ｅｔσ、２３ｔｔｔ
１．亜楢酸イソアミＡｚ（０，０７５ｇ／）４３− を加え、−２５〜−２０℃で２０分間保った（ヒドラジ
ンテスト：陰性）。これを再びドライアイス−アセトン
で冷却し、ＴＥＡｏ、２５１ＩＩｌを加えて中和した。 アミン成分ｉＤＭＦ４０ｇ／にとかじ、氷冷しＴＥＡｏ
、１６ｇｇ？？加えたのち、先に調製したアジド溶液を
加えて、４℃で７２時間がきまぜた。反応液を、希酢酸
水にそそぎ、析出したゲｌｖを炉取し、含水ＣＨ３ＣＮ
で洗浄した。収量１．４０ｆＩ（８１，５９１６）、Ｒ
ｆｌ　０．０９゜このうち４００Ｗを０．１５Ｍ　　Ｍ
８Ａを含む’［’ＦＡ−チオアニソー！−メチルスルフ
ィド（８：１：１）６０ゴにとかし、室温で２時間振り
まぜたのち、Ａｃ０ＮＨ４４００’％’を加えて濃縮し
、エーテ／Ｌ／を加えて沈澱と′して戸数し、乾燥した
。これを少盆の１！１ＡｃＯＨにとかしセフ１デックス
Ｇ−２５のカラム（２，２Ｘ１２０自）に付した。１Ｎ
ＡｃＯＨで溶出し１６０ａｔ　−２６０ａｔの分画を集
めて凍結乾燥し、ついでアンバーライトｆｐＡ＝４１０
（酢酸型）のカラムを通し、凍結乾燥した。これをさら
に′ｆ′５Ｋ−Ｌｓ−＋　１ｏのカラム（２，’１４Ｘ
７．５ｃｌＩ＋２．１４Ｘ３０ｃ１１）を用いるＨＰＬ
Ｃで精製し、目的物を得た。収量４５１１４゜〔α〕抵
４−４５．９°　（ｃ＝０．７．ｏ、ｌＮＡｃ０Ｈ）。 Ｒｆ　　（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）０　．２０アミノ酸分
析：　Ｌｙｓ　１．７Ｌ　Ａｒｐ；　４．７Ｌ　５ｅｒ
１．６９．Ｇｌｕ　２．１２．Ｇｌｙ　１．００．Ａｌ
ａ　　１．０３゜Ｍｅｔ　Ｏ，３２，Ｌｅｕ　１．３０
．　Ｐｈｅ　１．０Ｂ　（平均回収率７７％） （１）　Ｂ、キャリヤー蛋白とポリペプチド複合体の合
成 上記（υＡ（ＸＶＮで得たポリペプチドとサイログロブ
リン（以下ＴＧ）との結合を、グツトフレンドらの方法
に準じて行った〔サイエンス、１４４゜１３３４頁（１
９６４））。即ち、当該ポリペプチド２．５呼をＴｅ３
．７５岬と混合し、２ｍＭの５０ｍＭのフォスフェート
バッファーに加え、氷水中でよく摘拌した。これにカル
ボジイミド塩酸塩３０　、４Ｗｔ−蒸留水２００μｌに
溶かしたものを１滴ずつゆっくりと加えた後、３時間氷
水中で攪拌しながら反応させた。反応後、蒸留水で透析
を充分に行す、凍結乾燥を行なって蛋白複合体４．７岬
を得た。 （１）Ｃ０抗体検出のためのＥＩＡ用抗原の調製ＥＩＡ
用抗原の自製は北用らの方法〔ジャーナ〃　オプ　バイ
オケミストリー、７９．２３３（１９７６））の方法に
準じて行った。 （１）Ｃ（１）、ポリペプチドへのマレイミド基の導入
前記（１）　Ａ　（ＸＶＩ　）で得たポリペプチド（３
５０ｎｍｏｌｓｓ　）　ｋ　１　ｗｌの１００　ｍＭフ
ォスフェートバッファー１）Ｈ６，８にｆ４ＭＬ、Ｎ−
（４−カルボキシシクロヘキシルメチ／ｌ／）マレイミ
ドのＮ−ヒドロキシサクシニミドエステル５８５μｇ（
１，７５μｍｏｌｅｓ　）と７０μｌのＨ，Ｈ−ジメチ
ｌｖ木、＋レマミド溶液に加え混合し、３０°Ｃで３０
分攪拌して反応後、セファデックスＧ−２５カラムで分
画を行いマレイミド基の導入されたポリペプチド分画ｉ
　１３５　ｎｍｏｌｅｓを得た。 （１）Ｃ（ｉｉ　）、マレイミド基導入ポリペプチドと
β−Ｄ−ガフクトシダーゼとの結合 上記（１）Ｃ（１）で得たマレイミド基導入ポリペプチ
ド１６　、５　ｎｍｏｌｅｓ　　とβ−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼ３　、３　ｎｍｏｌ’ｅｓを混合し、４℃で１８
時間反応後、４１２　、５　ｎｍｏｌｅａのρ−メルカ
プトエタノールで反応を停止させた。β−Ｄ−ガラクト
シダーゼと結合したポリペプチドは、セファロース６Ｂ
カラムで分画を行い、以下の実験に使用した。 （１）Ｄ、　Ｅ　Ｉ　Ａ法 前記（１）　Ｂで得た蛋白複合体で免疫したマウス血清
あるいはハイブリドーマ上溝中の抗体活性の検出はＥＩ
Ａ法を用いて行った〔イムノファーマコロジー、１．３
（１９７８））。すなわち、血清あるいはハイプリドー
マ上清をバッフ、−Ａ（２０ｍＭ　Ｈａ２ＨＰＯ４ｔ　
　１００ｍＭ　ＮａＣ１，０，１４Ｎａｌｉ３　＋　１
　ｍＭ　ＭｇＣｌ２−　ｐＨ７−０）で希釈し、この１
００μｌをとシ、参考例１　（１）　Ｃで得たポリペプ
チド誘導体音００μｌとよく混合し、２４℃で２４時間
反応させた。反応後、ウサギ抗マウスエｇＧを結合した
３９６七μロース１００μｌを加えて２４°０，４時間
反応させた。反応後、七ルロースを０．５％ツイーン２
０ｔｌ−含んだバッファーＡでよく洗浄し、４−メチル
ゞシベリフェリルーβ−Ｄ−ガラクトシド２０μｇ／　
ＩＩ／を５００μｌ加え、３７℃で２時間反応後、１０
０　ｍＭカーボネートバッファーｃｐｕ１０．５）を３
　ｇｇ加えて反応を停止し、上溝中の螢光強度を蛍光計
で測定した（エキサイチーＶ！！ン３６５ｎｍ、エミッ
ション４５０　ｎｍ）。 （υＥ、免疫 ７〜８週令のＢＡＬＢ／ｃ雌マウス６匹各々に抗原とし
て前記（１）　Ｂで得た蛋白複合体の、タンパク量とし
て、４０μｇｔ−フロインドコンデリートアジュバント
とよく混合し、皮下に接種した（初回免疫）。初回免疫
の２週後、同量の抗原をフロイントインコンプリート　
アジュバントとよく混合し、皮下に接種した（二次免疫
）。さらに、その２週後、二次免疫と同様の方法で三次
免疫を行った。三次免疫の６日後、マウスから血液を部
分採取し、血清中の抗体価を前記（１）Ｄ記載のＥＩＡ
法で測定した。このうち、高い抗体価を示したγ＝２マ
ウスに苅して１２０μｇの抗原を０．５ｇ？の食塩水に
溶解させたものを静脈内に接種することにより最終免疫
を行った。各マウスの抗体価は第２表に示した。 第２表 １）血清の希釈は１／１０００ ２）血清の希釈は１／６３００ ３）血清の希釈はｌ／７８００ ４）−二　検出不可能 ５）ＮＤ：　　検淵せず Ｂ／Ｔ：（結合した酵素活性／加えた全酵素活性）Ｘ１
００ （２）モノクローナル抗体γ２−１１゜１の製造（２）
Ａ、細胞融合 上記（１）Ｅ記載の方法で免疫を行い、最終免疫の３日
後のγ−２マウスからｗＩＩ臓を摘出し、ステンレスメ
ツシュで圧迫、沖過し、イーグルズ・ミニマム・エッセ
ンシャρメディウム（ＭＥＭ）に浮遊させ、屏臓細胞浮
遊液を得た。細胞融合に用いる細胞として、ｐＡＬＢ／
ｃマウヌ由来ミエローマ細胞Ｐ　３−　Ｘ　６３．　　
Ａｇ　８．　Ｕｌ（Ｐ２Ｈ４）を用いた〔カレント　ト
ピックス　イン　マイクロバイオロジー　アンド　イム
ノロジー、８１．１（１９７Ｂ））。細胞融合は、原注
（ネイチャー。 ２５６巻、４９５頁、１９７５年）に準じて行った。即
ち、Ｎ１１ｔｉ胞およびＰ３Ｕｌｔ−それぞれ血清を含
有しないＭＥＭで３度洗浄し、製減細胞とｐ３ｔｒ１　
数の比率を５：１になるよう混合して、８００回転で１
５分間遠心を行って細胞を沈殿させた。上清を充分に除
去し之後、沈殿を軽くほぐし、４５％ポリエチレングリ
コ−ｆｉ／（ＰＥＧ）６０００（コツホライト社製）を
０．３ｔｘｌ加え、３７℃温水槽中で７分間静置して融
合を行った。 融合後細胞に毎分２ｗｅの割合でＭＥＭを添加し、合計
１２ｒｌのＭＥＭ會加えた後６００回転１５分間遠心し
て上清を除去した。この細胞沈澱物を１０９６牛脂児血
清を含有するＲＰＭ工１６４０メディウム（ＲＰＭ工１
６４０−１０ＦＣ８）にＰ３Ｕｌが１ｗｔ１当シ２×１
０　個になるよう浮遊し、２４穴マルチデイシユ（リン
プロ社製）に１ウニ／Ｌ／Ｉ　Ｍｌずつ１４４ウニμに
播種した。播種後、細胞を３７℃で５９６次酸ガスフフ
ン器中培養した。 ２４時間後、ＨＡＴ（ヒポキサンチンＩ　Ｘ　１０−’
７ Ｍ、アミノプテリン４Ｘ１０　　Ｍ、チミジン１．６Ｘ
ＩＯＭ）を含んだＰＲＭ工１６４０−１０ＦＣ８培地（
ＨＡＴ培地）を１ウエル当＃）１ｍｌずつ添加すること
により、ＨＡＴ選択培簑を開始した。 ＨＡ’Ｉ’選択培養は、培養開始３，５．７日後に旧液
に１ｘｌ捨てたあと、１　ｍｌのＨＡＴ培地を添加する
ことにより継続した。ハイブリドーマの増殖は、細胞融
合後１０〜１４日で認められ、培養液が黄変したとき（
約ｌＸｌ０　　／ｍｌ）、上清を採取し、ＥＩＡ法で、
抗体の有無を検宗した。このようにして、ハイブリドー
マの増殖が認められた１４１ウエルの上清を峙ぺたとこ
ろ、２ウニｆｉ／（γ２−１１、γ２−１００）に強い
抗体活性、２ウエ〃（γ２−６２．１２−７０）に弱い
活性を認めた。 （２３Ｂ、クローニング 抗体活性が陽性を示した３ウエ／Ｌ／（γ２−１１゜６
２．１００）の各ハイブリドーマを、限界希釈法によっ
てクローニングを行った。即ちハイブリドーマが２個／
　ｍｌになるようＲＰＭ工１６４０−２０ＦＣＢに浮遊
させ、９６穴マイクロプレート（ヌンク社１１りに１ウ
ェル当り０．１＋ｌずっ分注した。分注する際、フィー
ダー細胞としてＢＡＬＢ　／　ｃマウスの胸腺細胞をウ
ニμ当り５　Ｘ　１０５個になるよう加えた。このよう
にして、約２週間後には細胞の増殖が認められるように
なシ、上清を採取して、抗体の有無を前記（１）　Ｄ記
載のＥＩＡ法で刺べた。その結果、γ２−１１では１９
クローン中８クローン、γ２−６２では５４クローン中
３クローン、γ２−１００では４７クローン中５クロー
ンに抗体活性ヲ認めた。 （２）Ｃ，モノクローナル抗体産生ハイプリドーマの腹
水化 工ＦＮ−γに対して結合能を示す抗体を産生ずるγ２−
１１．１クローン細胞（マウスＢハイプリドーマ　γ２
−１１．１）Ｉ×１０　個を、あらかじめ０．５ｍｇの
ミネラルオイ／Ｉ／ヲ腹腔内に接種することにより腹水
化を行った。ハイブリドーマを腹腔に投与して１０日後
、腹水を採取して抗体価１ＥＩＡ法で測定したところ、
１０７倍希釈まで抗体活性を示した。なお、当該クロー
ン細胞の培養土溝中の抗体活性は、１０　倍希釈まで認
められているが、腹水化することにより約１０００倍程
度抗体活性が上昇した。 （２１Ｄ、モノクローナル抗体のＭ製 上記（２１Ｃで得られた腹水４ゴを出発材料として、ス
テーリンら（ジャーナル　オプ　バイオロジカルケミス
トリー、２５６巻、９７５０頁、１９８１年）の方法に
準じてモノクローナル抗体をＭ製した。まず腹水からフ
ィブリン様物質を除去するため１０．０００回転１５分
間遠心した後、リン酸緩衝液−食塩水ＣＰＢＳ：８．１
ｍＭＮ５、Ｈ２ＰＯ４゜１．５　ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４，
２，７ｍＭ　ＫＣＩ、１３７　　ｍＭＭａｉｌ、　ｐＨ
７’、２）　”ｔ’２８０　ｎ　ｍの紫外部吸収（Ａ２
８０）が１２〜１４の値を示す濃度に希釈した。希釈後
サンプルに飽和硫酸アンモニウム溶液ｆｆ１４７４の濃
度になるように加え、４℃で攪拌しながら６０分間塩析
を行い、その後遠心（１０，０００回転。 １５分間）を行って沈澱物を得た。沈澱物を５０ｍＭ　
ＮａＣ１含有２０ｍＭ）リス緩ＩＡ溶液（ｐＨ７，９）
に清遊し、同溶液２１に対して透析を行った。２時間後
、２１の新しい同じ透析液に換え、さらに１５時間透析
を行った。透析後、洗眼を除去するため１０，０００回
転１５分間遠心を行い、上清をＡ２８ｏの値が２０〜３
０の濃度になるように調整した。このサンプ／Ｉ／を充
分量の５０ｍＭ　−１ＪａＣ１含有トリスＭ！前溶液で
順化した８　ｗｌのＤＥＡＩセルロースカラム（ワット
マンＤＥ５２）にかけ、５０　ｍＭ　ＮａＣ１含有トリ
ス緩砺溶液を用いて１．５ｍ＋／／分の流出速度で分画
を行った。この条件下では、抗体活性は主として素通）
分画に認められた。 参考例２　抗体カラムの製造 上記参考例ｉ　（２）　Ｄ記載の方法で精製された素通
り分画のモノクローナル抗体（γ２−１１．１モノクロ
ーナμ抗体）　２５ｍｇ（６５、３ｍｇ）　ｅＯ，ＩＭ
　ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８、３溶液に対して一晩透析を行
った。一方、アフイゲｌｖ−１０（バイオ・ラド社）２
５譚ｌをグラスフィルターを用いて充分水洗を行った後
、０　、１１１ＮａＨｃＯ３ｐＨ８，３溶液に浮遊させ
前記抗体とを混合し、４℃で４＃間、ゆっくシ攪拌しな
がら反応させた。その後、４°Ｃで一晩放置した後、グ
ラスフィルターを用いて０．１ＭＮａＨＣＯ３ｐ　Ｈ８
、３溶液でよく洗浄した。反応させたゲμに０．１Ｍエ
タノールアミン、０．１５Ｍ　ＮａＣ１’ｆｔ：含む溶
液（ｐＨ８、０）Ｊｒ２５ｍｇ加え、４℃、１時間振と
うし、残存するかも知れない未反応の活性基をブロック
した。その後ゲ／ｌ／’１ＰＢＳでよく洗浄し、０．１
％ＮａＮ３　ｋ含むＰＢ８２５ｍ／に懸濁し、４℃で保
存した。加えた抗体量と回収されたろ液中の抗体量から
、ゲｌ　１　ｗｌ当り２．３５Ｗの抗体が結合している
ことが判明した。 この様にして得た反応物をカラムに充め、抗体カラムと
して使用した。 実施例１　ヒト免疫インターフェロン蛋白質の製造 （１）形質転換体の製造 （１）Ａ、■−エＩＩＮ遺伝子含有プラスミドｐＨ工Ｔ
３７０９の製造 （１）Ａ（＋）、ヒトニー工ＦＮｉコードするｍＲＮＡ
の分離 ヒト末梢血よシ調製したリンパ球を１２−０−テトヲデ
カノイルホルポー／Ｉ／−１３−アセテート（’ｒｐ＊
　）（１５ｎｇ　／ａｔ）とコンカナバリンＡ（４０μ
ｇ、　／　ｗｌ　）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（１
０９６の牛胎児血清を含む゛）で３γ°Ｃ培養し、■−
■ＦＭを誘導させた。２４時間後、この誘導した１×１
０　個のヒトリンパＭ’にチオグアニジン変性溶液（５
Ｍグアニジンチオシア＊−）、５９６メルカプトエタノ
ーＩＶ　、　５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７，
６，１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ）　　中でテフロンホモゲナ
イザーによって破壊変性した後Ｎ−ラウロイリ／Ｌ／ｌ
″ルコシン酸ナトリウムを４９６になるように加え、均
質化した混合物を５．７Ｍ塩化セシウム溶液（５，７１
１化セシウム、０．１Ｍエチレンジアミン四酢酸（ＥＤ
ＴＡ））６Ｉｌ上に重層し、ベックマン５ｗ２７のロー
ターを用いて１５℃で２４０００　ｒｐｍ　　３０時間
遠心処理を行い、ＲＮＡ沈澱を得た。 とのＲＮＡ沈澱を０．２５＊Ｎ−ラウロイルザルコシン
酸ナトリウム溶液にとかした後、エタノールで沈澱させ
、８．３Ｆ＃のＲＮＡを得た。このＲＮＡを萬塩溶液（
０、５Ｍ　ｆｆａｃＬ　１０ｍＭ　’Ｉｌ’ｒｉｓ−Ｈ
ｃ：Ｌ　ｐＩ（７，６，１ｍＭ　　ＥＤＴＡ、０．３９
６ＳＤｓ〕中でオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに吸着
させ、ポリ（Ａ）　ｉ含むｍＲＮＡを低塩溶液（１０ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ・ＨＣＩ　ｐＨ７，６，１ｍＭ　ＦＤ’［
’Ａ、０．３４８ＤＳ）で溶出させることによシ、ポリ
伍）を含むｍＲＮＡ７００μｇを分取した。 このｍＲＮＡ１−更にエタノールで沈澱させ、０．２ｍ
ｌの溶液（１０ｍＭＴｒｉｓ・Ｈｃｌ　ｐＨ７，６，２
ｍＭＥＤＴＡ　、０．３９６８Ｄ８　）に溶かし、６５
°Ｃで２分間処理して１０〜３５４庶糖密度勾配遠心処
理（ベックマン５ｗ２７のローターを用いて２０’ＣＣ
１２５０００ｒｐで２１時間遠心分ｔｓ）することによ
り分画化して２２分画を得た。この各分画につ＠ＲＮＡ
の一部スつを、アフリカッメガエルの卵母細胞に注入し
、合成される蛋白質中のインターフェロン活性〔ヒト羊
膜由来Ｗ工ＳＨ細胞に対する水泡性口内炎ウィルス（Ｖ
ＳＶ）の細胞変性効果阻止試験を用いて測定した抗ウィ
ルス活性〔ステワルト、ザ　インターフェロン　システ
ム。 スプリンガー社、ニューヨーク、１９７９年。 １１頁）〕を測定し、分画１２（沈降定数Ｓ値は１２−
１４ｓを示した）に１９５ユニット／μｇＲＮＡの活性
を検出した。このようにして得た分画１２のｍＲＮＡは
約２０μｇであった。 ５８− （１）Ａ　（ｒｒ　）単鎖ＤＮＡの合成上記で得たｍＲ
ＮＡおよび逆転写酵素を用い、１００μｌの反応液（５
μｇのｍＲＮＡ　、　５０　＃ｇ、ｔ！Ｊ：Ｉ’（ｃｌ
’ｌ’）＄１００ユニットの逆転写酵素。 ｉ　ｍＭずつのｄＡＴＰ、ｄｃ’［’Ｐ、ｄＧ’Ｌ’Ｐ
およびｄＴＴＰ、　　８ｍＭＭｇＣ１２，５０ｍＭ　Ｋ
Ｃｌ、　１０ｍＭ　ジチオスレイト−ｌ　、　５０　ｍ
ＭＴｒｉａ・Ｈｃｌ　ｐＨ８，３）中で４２℃、１時間
インキュベートした後に、フェノールテ除蛋白し、０　
、１　Ｎ（１りＮａＯＨＴ７０　℃。 ２０分処理してＲＮＡｆｒ、分解除去した。 （１）　Ａ　（０１）、二重鎖ＤＮＡの合成ここで合成
された単鎖の相補ＤＮＡを５０μｌの反応液（ｍＲＮＡ
とオリゴｄＴを含まない以外は上記と同じ反応液）中で
４２℃２時間反応させることによシニ重鎖ＤＮＡを合成
した。 （１）Ａ　（ＩＶ　）、ｄ　Ｃ７−イルの付加この二重
鎖ＤＮＡにヌクレアーゼ８１Ｔｈ５０Ｉｌ／の反応液（
二重鎖ＤＮＡ、０．１Ｍ酢酸す）ＩＪウムｐＨ４、５、
０、２５ＭＮａＣ１，１，５ｍＭＺｎＳＯ４゜６０ユニ
ツトの８１ヌクレアーゼ）中で室温３゜５９− 分間作用させ、フェノールで除蛋白し、エタノールでＤ
ＨＡｆ沈澱させた後、これにターミナルトランスフェラ
ーゼを５０μｌの反応液（二重鎖ＤＭＡ　、　０　、１
４Ｍカコジル酸カリ、　Ｑ　、　３ＭＴｒｉｓ（塩基）
　ｐＨ７、６、２ｍＭ　　ジチオスレイトール。 ｌ　ｍＭ　ＣｏＣｌ２．０．１５ｍＭｄＣＴＰ、３　Ｑ
ユニットターミナルトランスフェラーゼ）中で３分間３
７°Ｃで作用させ二重鎖ＤＮＡの３両端に約２０個のデ
オキシシチジン鎖を伸長させた。これらの一連の反応で
約３００　ｎｇのデオキシシチジンａｔ−４った二重鎖
ＤＮＡを得た。 （１）　Ａ　（Ｖ入大腸菌プフヌミドの開裂ならびにｄ
Ｇテイルの付加 一方、１０μｇの大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡ
に制限酵素Ｐｅｔ工を５ｏμｌの反応液（１０／７ｇＤ
　ＨＡ　、　５０　ｍＭ　ＮａＣ１＋　６ｍＭＴｒｉ８
−ＨＣＩ（ｐＨ７−４）　、６　ｍＭ　Ｍｇ　Ｃ１２，
６ｍ　Ｍ　　２−メルカプトエタノール、１００μｇ／
ｇ？牛血清アルプミ７゜２０ユニツトのＰａｔ工〕中で
３時間３７℃で作用させてｐＢＲ３２２ＤＮＡ　中に１
ケ所存在するＰｓｔ工認識部位を切断し、フェノールで
除蛋白した後、ターミナルトランスフェラーゼを５０μ
ｌの反応液（ＤＮＡ　１０μｇ、０．１４Ｍカコジμ酸
カリ。 ０．３ＭＴｒｉｓ（ｍ基）　ｐＨ７，６５２ｍＭジチオ
スレイトール、　１　ｍＭ　ＣｏＣｌ２．０．１５ｍＭ
　ｄＧ’ｌｌ’Ｐ。 ３０ユニツトターミナルトヲンスフエラーゼ〕中で３分
間３７℃で作用させ上記プラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡ
の３′両端に約８個のデオキシグアニン鎖を延長させた
。 （１）Ａ　（ｖｌ　）、ｃＤＮＡの会合な勢に大腸菌の
形質変換 このようＫして得られた合成二重鎖ＤＮＡ０．１μｇと
上記プラスミドｐＢＲ３２２０，５μｇを０．１Ｍ　１
ｆａｃ１．５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ　ｐＨ７，６，
１ｍＭ　ＥＤＴＡよシなる溶液中で６５℃２分間、４５
℃２時間加熱しその後徐冷して会合させエネアらの方法
〔ジャーナル　オプ　モレキュラー　バイオロジー　、
９６．４９５　（１９７５））に従って大腸菌ＸＩＴ７
６を形質転換させた。 （１）Ａ　（ｖｌｌ　）、ｃＤＮＡ含有プラスミドの単
離こうして約８５００のテトラサイクリン耐性株が単離
され、これら各々のＤＮＡ’）ニトロセルロースフィル
ターの上に固定した〔グルンステインとホグネス、プロ
シーディング　オプ　ナショナル　アカデミ−サイエン
スＵＳＡ、７２．３９６１（１９７５））。 一方、ゴエデルらの報告〔ネイチャー、２９５゜５０３
（１９８２）、ｌのｌ−１１ｉ’ｌｌＴのアミノ酸配列
をもとにしてアミノ酸Ｎｌ　１−５　（Ｃｙｓ・Ｔｙｒ
・Ｃｙｅ　・Ｇｌｎ−Ａｓｐ）及びアミノ酸陽７７−８
２　（Ｌｙｓ・Ｇ１ｎ４ｅｐ−ＭｅｔＡｓｎ−Ｖａｌ）
より推測できる塩基配ＡＣＡＴＴＣＡ’ｆ？ＴＣＨＴＣ
：ｉＴ”’　）　ｆｒ　）　リニア　Ｔ　／Ｌ法Ｃり１
／アら、プロシーディング　オプ　ナショナル　アカデ
ミ−サイエフＸ　　ＵＳＡ　、　　７５　！　　５７６
５（１９７８）ｉ用いて化学合成しｆｃ。　このオリゴ
ヌクレオチドに対してＴ４ポリヌクレオチドカイネース
を用いて５０μｌの反応液（オリゴヌクレオチド０．２
μｇ　、５０ｍＭ　Ｔｒｉｏ・ＨＣＩ　ｐＨ８，０，１
０ｍＭ　ＭｇＣｌ２，１０　ｍＭメルカプトエタ−６と ノール、５０μＣｉγ−”２ＰＡ’［’Ｐ、３ユニット
Ｔ４ポリヌクレオチドカイネース）中で１時間３７”Ｃ
で反応させ、５′末端を３２　ｐで標識した。この標識
されたオリゴヌクレオチドをプローブとしてラウンらの
方法〔ヌクレイツク　アンス　リサーチ、亀。 ６１０３（１９８１））に従って上記のニトロセルロー
スフィルター上に固定したＤＮＡに会合させ、オートラ
ジオグラフィーによって上記二種類のオリゴヌクレオチ
ドプローブに反応する菌株を４個単離した。これらの菌
株の各々の菌体からプラスミドＤＮＡをアルカリ法〔バ
ーンボイムとドリー、ヌクレイツク　アンス　リサーチ
、工。 １５１３（１９７９））によって単離した。次にプラス
ミドＤＮＡの挿入部を制限酵素Ｐｓｔ工によ〕切）出し
、分離したプラスミドのうちでその挿入部の長さの最も
長め断片を含むもの倉見らび、このプラスミドをｐＨ工
’Ｉ’３７０９　と名ずけた。 このプラスミドの制限酵素地図を第１図に示す。 次にこのｐＨ工Ｔ３７０９プラスミドに挿入されたｃＤ
ＮＡ配列の一次構造（塩基配列）をジヌクレオ６３− チド合成頒停止法とマキサム−ギルパートの方法によっ
て決定した。その−次構造は第２図の通りであった（特
願昭５８−４９６８１号明細書参照：　ｐＨＩＴ３７０
９のニー１１ｉ’Ｎ暗号領域（コドン凪Ｓ１〜Ｎａ１４
６）の塩基配列はその後公表された文献〔ヌクレイツク
　アシツメ　リサーチ、１０゜２４８７（１９８２）中
の第３図〕に記載されたものと同一である。 （１）　Ｂ　、発現用プラスミドならびに発現用形質転
換体の製造 （１）Ｂ　（１）、ｐｔｒｐ　６０１およびｐｔｒｐ７
０１の構築発現プラスミドとして大腸菌のトリプトファ
ン合成のプロモータ一部分〔プロモーター、オペレータ
ーを含むＤＮＡ断片、２７６樵基対、ベネットら、リサ
ーチμ　オブ　モレキュラー　バイオロジー、１２１．
＋１３（１９７８））を含むプラスミドｐｔｒｐ　６０
１（ベクターはｐＢＲ３２２）を構築した。 一方、プラスミドｐＢＲ３２２ｋ制限酵素Ｅｃ　ｏＲＩ
および制限酵素ＡｖａＩ　で切断し、得られたテトラサ
イクリン耐性遺伝子を含むＥｃ　ｏＲＩ　−ＡｖａＩ断
片ののりしろ部分ｖｉ−ＤＮＡポリメヲーゼエヲージフ
ラグメントでうめた。この断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを
用いてｐｔｒＴｙ６０１のＰｖｕ　ＩＦの切断部位に結
合させｐｔｒｐ７０１を構築した（第３図）。 （１）Ｂ　（ｉｉ　）、ｐｔｒｐ　７７１の構築次にｐ
ｔｒｐ　７０１に２ケ所存在する制限酵素Ｃ１ａ　Ｉ切
断部位の一つを消去するため、ｐｔｒｐ７０１　’ｋｃ
１ａ工で部分分解して二つのＣ１ａＩ切断部位のうち一
方のみが切断されたものを得た。生じたのシしろ部分１
ｋＤＭＡポリメラーゼＩラージフラグメントでうめたの
ち、Ｔ４ＤＮ／Ｉ＋ガーゼで再度結合させてｐｔｒｐ７
７１を得た（第３図）。 （υ１３　（ＩＩＩ　）、ｐＨ工Ｔｔｒｐ　　１１０１
の構築ｐＨ工Ｔ３７０９を制限酵素ＰｓｔＩで切断して
エーエＦＨの構造遺伝子を含むＰ８ｔＩ断片を得た。こ
の断片を制限酵素ＢｓｔＮ工で部分分解し、　■−■Ｆ
Ｍ構造遺伝子内にあるＢｓｔＮ工部位の切断されたＢｓ
ｔＮニーＰｓｔ工断片全断片。ＢｓｔＮ工　切断部位の
のシしろ部分をＤＮＡポリメラーゼエラージフラグメン
トでうめたのち、前述したトリエステル法によって化学
合成した蛋白合成開始コドンＡＴＧｔｌ−含むオリゴヌ
クレオチドアダプターＣＧＡＴＡＡＴＧＴＧＴＴＡＣＴ
ＧＣＣＴＡＴＴＡＣＡＣＡＡＴＧＡＣＧＧ ｋＴ　４　Ｉ）Ｎ　Ａリガーゼで結合させた。 一方、上記アダプターを結合させたエーエＦＮ遺伝子１
ｋｐｔｒｐ７７１を制限酵素Ｐｓｔ工と制限酵素Ｃ１ａ
　Ｉで切断して得た断片のトリプトファンプロモーター
の下流に挿入してＴ４ＤＮＡ！Ｊガーゼを用いて結合さ
せ、■−ｒＦＭ発現プラスミドｐＨＩＴ　ｔｒｐ　１１
０１　　を構築した（第４図）。 （１）Ｂ　（Ｉｖ　）、ｐＨ工Ｔｔｒｐ２１０１　　の
構築および発現用形質転換体の製造 ｐＨ工’ｌ’ｔｒｐ　１１０１　　ｅさらに改良して次
の通シｐＨ工Ｔｔｒｐ２１０１　を構築した。 まずｐｔｒｐ６０１　ｋ制限酵素Ｃ１ａ工および制限酵
素ＨｐａＩ［で処理してｔｒｐ　プロモーターを含むＣ
１ａニ−ＨｐａＩＩ断片０−３３Ｋｂを得た。この断片
ｋ、Ｃ１ａ工で切断しアルカリホスファターゼ処理した
ｐＨ工Ｔｔｒｐ　１１０１にＴ４ＤＮＡリガーゼを用い
て結合させｔｒｐプロモーターが二つ直列に入ったｐａ
工Ｔｔｒｐ　２１０１を得た（第５図）。 このプラスミドｐＨ工Ｔｔｒｐ２１０１　ｋ用いてコー
エンらの方法〔前出〕に従って、大腸菌２９４を形質転
換させ、このプラスミドを含む菌株エシェリヒア　コリ
（Ｅ、ｃｏｌｉ）２９４／ｐＨ工Ｔｔｒｐ２１０１を得
た。 （′２Ｊ発現用形質転換体の培養 Ｅ、ｃｏｌｉ　２９４／ｐＨＩＴｔｒｐ　２１旧を８μ
ｇ／ｇ／のテトフサイクリン、０．４４カザミノ酸、１
％グルコースを含むＭ９培地２００ｍ１＆分注した１１
マイヤー中で３７’Ｃ！で培賛し、生育がＫ　ｒｓ　２
２０に達した時に３β−インドリ−μアクリル酸（工Ａ
Ａ）ｅ３０μｇ／ａｔｅになるように加えて更に４時間
培養した。 （３）ヒト免疫インターフェロン蛋白質の精製（３）Ａ
、ヒトエーエＦＮ含有上清の製造上記（２）で得られた
培養液１．２１を遠心分離して菌体を集め、これを６０
ｖｔｌの１０９６シユクロースを含む０　、０５ＭＴｒ
ｉｓ・ＨＣＩ　ｐＨ７，６に懸濁した。この菌体懸濁液
に０．２Ｍフェニルーメチルースμフォニルフルオライ
ド（ＰＭＳＦ　）０．３μｇ１．５ＭＨａｃ１２．４ａ
工ＩＯ−２Ｍエチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤ
ＴＡ）２．４Ｍｉ　ＩＭスベμミジン２　、４ａ工　、
　５ｑ／ｍｅリゾチーム２．４ｙｘｌを加え０°Ｃで１
時間放置したのち、３７℃で５分処理し、これを更にＡ
ＲＴＥＫ社（米国）製超音波破砕器で０℃３０秒処理し
た。 この溶菌液Ｔｈ１０５．０００Ｘｆで１時間遠心分離し
て上清６６ａＪを集めた。 （３）Ｂ、抗体カラムを用いるヒトエーエＩＩＮの精製
上記（３）Ａで得た上清６０　ｍｌｋ　１　ｍＭ　ＥＤ
ＴＡ　。 ０．１５ＭＮａＣ１を含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ
、ｐＨ７，６（ＴＥＮ）で１５０Ｍ１に稀釈したのち、
参考例２の方法でＭＷした抗ニー１１ｉ’Ｎ抗体力フム
（９ａ工）にかけた。’Ｉ’ＥＮで十分洗浄したのち、
さらに０．０１％ノニデッ）Ｐ−４０（シェル社１ｉＭ
）　０．５ＭＮａＣ１を含む’［’ＥＮで洗浄した。次
に０　、２５　Ｍ　ＮａＣ１を含む０．１Ｍ酢ｍでｘ−
ｘＦＮを溶出し、溶出液はただちにＩＭ）リスＨＣｌｐ
Ｈ７，６で中和した。得られた溶液を蒸留水に対し４°
Ｃ５１６時間透析し、これをアセトン−ドライアイスで
凍結乾燥に付し粉末とした。 結果は以下の通りであった。 蛋白質−全活性（均圧活性（ＴＪ／ｋｆｌ）回収率（４
）８　　　　　　　　６ 溶菌液上清　２５０．８　　４ＸＩ０　　１．６Ｘ１０
　　　−抗体カラム列理　　２．０　　１．５Ｘ１０　
　　７．５ＸＩＱ　　　　　３７．５ここで得られた最
終のヒト免疫インターフェロン蛋白質の比活性（Ｗ工Ｓ
Ｈ＃Ｉ胞に列するＶＳＶの細胞変性効果阻止試験による
ウィルス活性測定による（前出））は７．５Ｘ１０　　
Ｕ／ｑであった。この蛋白質を以下の実験に供した。 （３）　Ｃ、ヒト免疫インターフェロン蛋白質の性状上
記（３）Ｂで得られたヒ１−Ｉ−ＩＦＮ蛋白質の性状は
下記のとおシであった。 ｆ：（）ｃ（Ｉ入分子址 上記（３）Ｂで得られた蛋白資金２−メルカプトエタノ
ールで処理して５ＤＳ−ポリアクリルアミトゲ／Ｉ／（
１７，５％）′［を気泳動（１５ｍＡ、６時間）にかけ
、クマジープルーで染色したところ、蛋白質は単一のバ
ンドとして確認できた（第６図）。 なお同時に泳動させた分子量マーカーの泳動距離と蛋白
質の泳動距離との関係から蛋白質の分子片は１７．００
０±１．０００と推定された（第７図）。 一方、２−メμカプトエタノールで処理しなかった蛋白
質は分子片３３．０００±２，０００の位置にもう一本
のバンドが検出された。この値はエーエＦ１ｇの分子量
１７．０００±１．０００の約２借に相当することから
、このバンドはＩ−工ＦＨの二量体に由来すると考えら
れる。 （３）Ｃ（ｉ　）、アミノ酸分析 前記（３）Ｂで得られた蛋白質をガラス製加水分解用試
験管にとり、２００倍値（Ｖ／Ｗ）の４％チオグリコ−
１ｖ酸會含む定沸点塩酸を加えて、減圧下に封管したの
ち、１１０℃で２４．４８．７２時間加水分解した。加
水分解後、開管し、塩酸を減圧下で除去し、残渣を０．
０２Ｎ塩酸に溶解して日立製８３５型高速アミノ酸分析
計によりアミノ酸分析全実施した。 シスチンおよびシヌテインは、ハースの方法〔メソッズ
　イン　エンチモロジー、　１１．１９７（１９６７）
）に従い、上記蛋白質を過ギ酸酸化したのち、上記と同
様に２４時間加水分解して、アミノ酸分析計によりシス
ティン酸として定量した。アミノ酸分析値は、２４．４
８および７２時間の加水分解で得られた値を平均して求
めた。但シ、セリン、スレオニン、チロシンおよヒドリ
ブトファンの値は加水分解時間を０時間に外挿して求め
た。その結果を第３表に示す。 第３表 （３）　Ｃ（ＩＩ＋　’）アミノ末端アミノ酸分析前記
（３）Ｂで得られた蛋白質をハースの方法〔メソッズ　
イン　エンチモロジー、１１，１９７（１９６７））に
従って過ギ酸酸化したのち、エドマン分解法の岩永らに
よる変法〔ヨーロピアンジャーナル　オブ　バイオケミ
ストリー、８゜１８９（１９６９））によりそのアミノ
末端アミノ酸分析を実施した。生成したフエ二μチオヒ
ダントインーアミノ酸（ＰＴＨ−アミノ酸）はウルトラ
スフェア−０ＤＳカラム〔アルテックス社製（Ｕ、８．
Ａ、）、４．６Ｘ２５０闘９粒子径５μｍ〕を用い、ア
ルチャーの方法〔アルテックス　クロマトグラム、旦、
８（１９８０））により、パリアン製高速液体クロマト
グラフ５０４０型（Ｕ。 ８、Ａ、）で同定、定量した。その結果、ＰＴＨ−メチ
オニンヌルホンおよびＰＴＨ−システィン酸が検出され
た。 上記から明らかなように本発明によれば、７．５ＸＩＯ
Ｕ／Ｗ以上の比活性を有する実質的に純粋な、遺伝子組
み換え技術によるヒト免反インク−フェロン蛋白質全製
造することができる。 ｔｒｐ　２１０１を実施何例と同一の条件で培養し、実
施例＋　（３）　Ａに記載と同一の条件で菌体を破壊し
上清６４ｍ１を集めた。 上記上清６０ゴを実施例１（３）Ｂに記載の条件で、参
考例２に記載の条件で調製した抗Ｉ−工ＦＮ抗体カラム
を用いて稍製し、凍結乾燥粉末としてヒトエーエＦＮｉ
白質（比活性：１．４ｘ１０７ｔｒ／ダ）１．８ｔＪｆ
を得た。 上記蛋白質５０μｇと２５　ｍＭ酢酸アンモニウム−水
酸化ナトリウム（ｐＨ８、０）中でＴＰＣＫ−トリプシ
ン〔ワーシントン社製（米国）〕と３７℃で１８時間反
応させて消化し、２−メルカプトエタノールを添加して
３７°Ｃでさらに２時間保温したのち、１９６のトリフ
ルオロ酢酸を加えて反応を停止した。このようにして得
られた消化物’に０．０２％）リフルオロ酢酸−５９６
７七トニトリルで平衡化したウルトラスフェア−オクチ
ルカラム〔５μｍ１４．６×２５０ＩＩＮ、アルテック
ス社製（米国）〕にかけ、アセトニトリルの直線濃度勾
配法（５−７０９６）によって温度３０’Ｃ，流Ｍ１．
（ｌｒｌ／分で溶出した。モニターはフルオレスカミン
を用いる螢光法によって行った。ここで得られたトリプ
シン消化ペプチドマツプの結果は第８図に示すとおシで
あった。 実施例３　注射用製剤 本発明のとトエーｊＦＮ蛋白質（比活性：２×１０７Ｕ
／Ｗ）　５ｗｆｔ　１００ｍ１ｆ３５９６Ｈ８Ａ水溶液
１００ｇ？に溶解し、メンブランフィルタ−１孔径０．
２μｍ）を用いて濾過後、無菌条件下１００バイアμに
分配する。バイ゛アル中の溶液を無菌的に凍結乾燥し、
用時調製用注射用製剤を得る。 本製剤は用時１　ｍｌの蒸留水に溶解する。 ４、図面の簡単な説明 第１図は実施例１（１）Ａ　（ｖｌ　）で得られたプラ
スミドｐＨ工Ｔ３７０９の制限酵素地図を表わし、１部
分はシグナルペプチドと考えられるペプチドを−７＋ コードする部分を示し、へ　はエーエＦＮポリペプチド
をコードする部分を示す。第２図は実施例１（１）Ａ　
（Ｖｌｌ　）　”？’得られたｐＨＩＴ３７０９デヲス
ミドの一次構造（塩基配列）を、第３図は実施例１（１
）Ｂ（＋）および（ｉｉ　）のｐｔｒｐ７０１およびｐ
ｔｒｐ７７１、第４図は実施例＋　（１）Ｂ　（Ｉｌ＋
　）のｐＥＩ工Ｔ　ｔｒｐｌｌｏｌ、第５図は実施例１
　（１）Ｂ　（Ｉｖ　）　＋７）ｐＨＩＴｔｒｐ　２１
０１の構築図をそれぞれ表わす。第６図は実施例１で得
たとトγエーエＦ蛋白質の電気泳動の結果を、第７図は
同蛋白質の分子量測定の結果を示す。第８図は実施例２
で得たトリプシン消化ペプチドマツプを示す。 ７５− 第３図 第≠図 第５図 ｐＨＩＴｌｒｐ　＋１０１　　　　　　　　　　　　　
　ｐｌｒｐ’６０１第６図 ０．２　　　　　　０．４　　　　　　０．６　　　　
　　０．８　　　　　　１．０相対捗動炙 Ｏトソ７°シ＞イ＞ｂヒ？−（入正）　　（２／、ｔρ
ρ）ε　　シン゛デー、ム、　　　　　　　　　　　　
（／ゲ、りｌρ）＄　８　目 祿杵跨聞　（奈）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　　遺伝子組み換え機作′技術で得られる実質的
   に純粋なヒト免疫インターフェロン蛋白質。 （２）　　１０　　Ｕ／Ｑ以上の比活性を有する特許請
   求の範囲第１項記載の蛋白質。 （３）　　ヒト免疫インターフェロン蛋白質が、式％式
   ％ （） 〔式中、ＹはＭａｔまたは結合手を示し、２１．２２は
   それぞれＣｙｓまたは％Ｃｙｓを示す〕のアミノ酸配列
   で示される特許請求の範囲第１項記載の蛋白質。 （４）凍結乾燥品である特許請求の範囲第１項、第２項
   または第３項記載の蛋白質。 （５）　　ヒト免疫インターフェロンをコードする塩基
   配列を含有するＤＮＡを有する形質転換体を増殖させ、
   形質転換体内にヒト免疫インターフェロンを生成、蓄積
   せしめ、溶菌し、得られたヒト免疫インターフェロン含
   有液を、ヒト免疫インターフェロンに結合枠なヒト免疫
   インターフェロン蛋白質の製造法。 （６）　　遺伝子操作技術で得られるヒト免疫インター
   フェリンが１０７Ｕ／ｌ１ｒｆ以上の比活性を有する特
   許請求の範囲第５項記載の製造法。 （７ン　　ヒト免疫インターフェロンをコードする塩基
   配列が式 ％式％ （３） 〔式中、ＸはＴＡＡ　、ＴＧＡまたはＴＡＧを示す〕で
   ある特許請求の範囲第２項記載の製造法。 （？）モノクローナル抗体が式 ％式％ （） Ｇｌｙ　Ｌｙ８Ａｒｇ　　で示されるペプチド鎖におい
   てそのＣ末端から数えて１〜１６個のアミノ酸を有にお
   いてそのＮ末端から数えて１〜５個のアミノ酸を有する
   ペプチドもＬ＜はアミノ酸残基を示す〕で表わされるポ
   リペプチドに対するモノクローナル抗体である特許請求
   の範囲第５項記載の製造法。 （ｆ）　　Ｙ３がＡｒｇ　ＡｒｇＡｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌ
   ｎである特許請求の範囲第２項記載の製造法。 Ｑｏ）　　ｘ、がＬｙｓ　Ａｒｇである特許請求の範囲
   第３項純粋なヒト免疫インターフェロン蛋白質と製剤学
   的に許容される担体、賦形剤もしくは希釈剤とを含有す
   る製剤学的組成物。 ｌ１２）　　遺伝子操作技術で得られるヒト免疫インタ
   ーフェロン蛋白質がＩＯＵ／ｑ以上の比活性を有する特
   許請求の範囲第１１＋項記載の組成物。 ―　注射用製剤である特許請求の範囲第１１）項記ト免
   疫インターフェロン蛋白質と製剤学的に許容される担体
   、賦形剤もしくは希釈剤とを混合することを特徴とする
   有効量の該ヒト免疫インターフェロン蛋白質を含有する
   製剤学的組成物の製造法。 ６向　　遺伝子操作技術で得られるヒト免疫インターフ
   ェロン蛋白質が１０７Ｕ／４以上の比活性を有する特許
   請求の範囲第１＋項記載の製造法。 −組成物が注射用製剤である特許請求の範囲第１今項記
   載の製造法。