JPH0536414B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、ヒト免疫インターフエロン蛋白質含
有薬剤に関する。 背景技術 インターフエロン（以下IFNと略称することが
ある。）は、高等動物の細胞がウイルスや核酸な
どの刺激によつて誘発されて産生する蛋白質であ
り、抗ウイルス作用、抗腫瘍作用などを有する。 ヒトIFNには、現在α型、β型およびγ型の３
種の性状の異なるタイプが存在することが知られ
ており、α型およびβ型はウイルスや核酸で、γ
型はマイトージエンなどで誘発される。 α型IFN（以下IFN−αと略称する）、β型IFN
（以下IFN−βと略称する）に関する研究は比較
的すゝんでおり、その産生機構もかなり解明され
てきている。さらに遺伝子操作技術の進歩によつ
て、現在はIFN−αとIFN−β₁が大腸菌を培養す
ることにより、IFN−α₁が酵母を培養することに
より、それぞれ生物学的に活性な蛋白質として、
大量に得られるようになつた［ゴエデルら、ネイ
チヤー、287、411（1980）；イエルベルトンら、ヌ
クレイツク アシズ リサーチ、９、731
（1981）；ゴエデルら、同誌、８、4057（1980）；ヒ
ツツエマンら、ネイチヤー、293、717（1981）］。
さらに臨床へ応用するための大量生産が試みられ
るようになつてきた。 γ型IFN（以下IFN−γと略称することがあ
る。）はリンパ球の芽球化やリンホカイン産生が
起るような状況下で、免疫担当細胞から産生され
るため、免疫インターフエロン（以下Ｉ−IFNと
略称することがある）とも呼ばれている。Ｉ−
IFNはIFN−αやIFN−βと比較して、抗細胞増
殖活性や抗腫瘍活性が高いといわれており、臨床
的応用面からより期待されている。しかし、その
産生に新鮮なリンパ球が必要であることなどの制
約があるため、これまで効率のよい産生系は確立
されていない。また、異なる実験系では、異なる
細胞種が異なる分子種のＩ−IFNを産生する可能
性も示唆されており、その構造や性質に関しても
不明な点が多く残されている。 一方、IFNには高い種特異性があるため、ヒト
への応用にはヒト由来のIFNが使用されなければ
ならない。しかしながら、ヒト免疫インターフエ
ロンは量産が困難であるために、現時点では臨床
への応用が不可能であり、純度の高いヒトＩ−
IFNを容易により安価に大量生産できる技術の開
発が望まれている。 本発明者らは、遺伝子操作技術を利用してヒト
のＩ−IFN遺伝子をクローニングし、得られた組
み換えDNA分子を宿主に移入してヒトＩ−IFN
遺伝子を発現させ、目的とするＩ−IFN蛋白質を
得ることのできる技術の開発研究を行い、これに
基づいてさらに研究した結果、本発明を完成する
にいたつた。 発明の開示 本発明は、遺伝子組み換え技術により大腸菌形
質転換体から得られ、10⁷U／mg以上の比活性を
有し、Ｈ−Lys−Arg−Lys−Arg−Ser−Gln−
Met−Leu−Phe−Arg−Gly−Arg−Arg−Ala
−Ser−Gln−OHに対するモノクロナール抗体と
結合する、有効量のヒト免疫インターフエロン蛋
白質と製剤学的に許容される担体、賦形剤もしく
は希釈剤とを含有する抗ウイルス、抗腫瘍、細胞
増殖抑制または免疫増強剤を提供するものであ
る。 グレイらは、ヒトＩ−IFN遺伝子のひとつをク
ローニングしたと考え、それから推定されるポリ
ペプチドのアミノ酸配列を報告した［ネイチヤ
ー、295、503（1982）］。その後も、デボスら［ヌ
クレイツク アシズ リサーチ、10、2487
（1982）］およびデリンクら［同誌、10、3605
（1982）］により類似する発表が行われている。し
かし、これまでは抗ウイルス作用を有することに
よりIFN様物質の存在が推定されていたのみで、
現実に、実質的に純粋なヒト免疫インターフエロ
ン蛋白質を取得したとの報告はない。 本発明者らは、実質的に純粋な、遺伝子組み換
え技術によつて得られるヒト免疫インターフエロ
ン蛋白質含有薬剤を確立し本発明を完成した。 本発明で用いられるヒトＩ−IFNをコードする
DNAは、例えば一般式 【表】 DNA（）はプロモーターの下流に連結されて
いることが好ましく、これらプロモーターとして
トリプトフアン（trp）プロモーター、ラクトー
ス（lac）プロモーター、蛋白質鎖伸長因子Tu
（tufB）プロモーターが挙げられ、とりわけtrpプ
ロモーターが好適である。 一般式（）中、Ｘで示されるオリゴヌクレオ
チドのうちでもTAAが好ましい。 本明細書において、アミノ酸、ペプチド、保護
基、活性基、その他に関し略号で表示する場合、
それらはIUPAC−IUB（Commissin on
Biological Nomenclature）による略号あるいは
当該分野における慣用略号に基づくものであり、
その例を第１表に挙げる。また、アミノ酸などに
関し光学異性体がありうる場合は、特に明示しな
ければＬ体を示すものとする。 第１表 DNA：デオキシリボ核酸 Ａ：アデニン Ｔ：チミン Ｇ：グアニン Ｃ：シトシン RNA：リボ核酸 dATG：デオキシアデノシン三リン酸 dTTP：デオキシチミジン三リン酸 dGTP：デオキシグアノシン三リン酸 dCTP：デオキシシチジン三リン酸 ATP：アデノシン三リン酸 EDTA：エチレンジアミン四酢酸 SDS：ドデシル硫酸ナトリウム Gly：グリシン Ala：アラニン Val：バリン Leu：ロイシン Ile：イソロイシン Ser：セリン Thr：スレオニン Cys：システイン Met：メチオニン Glu：グルタミン酸 Asp：アスパラギン酸 Lys：リジン Arg：アルギニン His：ヒスチジン Phe：フエニールアラニン Tyr：チロシン Trp：トリプトフアン Pro：プロリン Asn：アスパラギン Gln：グルタミン Ｚ：カルボベンゾキシ Boc：ｔ−ブトキシカルボニル Mtr：４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベ
ンセンスルホニル Pme：ペンタメチルベンセンスルホニル OBu：ｔ−ブチルエステル ONB：Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，
３−ジカルボキシイミドエステル DCC：Ｎ，N′−ジシクロヘキシルカルボジイミ
ド DCU：Ｎ，N′−ジシクロヘキシルウレア HONB：Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−
２，３−ジカルボキシイミド HOBt：Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール CHA：シクロヘキシルアミン DCHA：ジシクロヘキシルアミン TEA：トリエチルアミン TFA：トリフルオロ酢酸 MSA：メタンスルホ酸 THF：テトラヒドロフラン DMP：ジメチルホルムアミド MeOH：メタノール AcOEt：酢酸エチル 本発明においては、例えばヒト末梢血リンパ球
などヒトＩ−IFNを分泌する細胞を培養し、培養
液からヒトＩ−IFNをコードする伝令(m)RNAを
分離し、たとえば逆転写酵素を用いて単鎖の相補
(c)DNAを合成し、二重鎖DNAに導き、プラスミ
ドに導入して、例えば大腸菌を形質転換させ、こ
れよりcDNA含有プラスミドを単離することによ
りヒトＩ−IFNをコードする二重鎖DNAを製造
することができる。 ここで用いられるヒト末梢血リンパ球は非感作
細胞、感作細胞のいずれでもよい。 ここでＩ−IFN誘起剤は、ヒトリンパ球細胞に
Ｉ−IFNの産生を誘起させるものであればいかな
るものであつてもよい。例えば、フイトヘマグル
チニン（PHA）、コンカナバリンＡ（Con Ａ）、
スタヒロコツカル エンテロトキシンＡ（SEA）、
ノイラミニダーゼ−ガラクトース酸化酵素
（NAGO）、12−Ｏ−テトラデカノイルホルボー
ル−13−アセテイト（TPA）などが挙げられ、
これらを単離またはこれらを組合せて使用するこ
とができる。 Ｉ−IFNの誘起は細胞をRPMI−1640培地や
MEM培地などそれ自体公知の培地で培養して行
うことができるが牛胎児血清を含むRPMI−1640
培地が好ましい。培養は、温度35〜39℃、望まし
くは36〜38℃で、培養時間は12〜72時間、望まし
くは22〜26時間行われる。細胞はそれ自体公知の
方法で集め、これにRNase阻害剤としてグアニ
ジンチオシアナイド、ベントナイト、ヘバリン、
ポリビニル硫酸、オーリントリカルボン酸、バナ
ジウム複合体、ジエチルピロカルボネイト
（DPC）、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）など
を加えたのち、Ｎ−ラウリルザルコシン、ツイー
ン80、ノニデツトＰ−40などを加えて細胞を溶解
させてRNAを抽出する。必要により、このRNA
を含む抽出液にフエノール、フエノール−クロロ
ホルムなどを加えて抽出操作をくり返したのち、
エタノール沈殿でRNAを集める。真核細胞の細
胞質に存在するmRNAの多くは、その3′末端に
ポリＡ配列をもつことが知られているので、つぎ
にオリゴ（dT）セルロース、ポリ(U)セフアロー
スなどを用いてポリ(A)RNAを集め、これをシヨ
糖密度勾配遠心法で分画し、この一部をアフリカ
ツメガエル（Xenopas laevis）の卵母細胞に注
入して翻訳させる［ガードンら、ネイチヤー、
233、177（1971）］。生じた蛋白質の抗ウイルス作
用を検定し、Ｉ−IFNのmRNAを含む12〜16Sの
画分を得ることができる。mRNAはホルムアミ
ドド−ポリアクリルアミドゲル電気泳動やグリオ
キサールを用いたアガロースゲル電気泳動を用い
ても精製することができる。 得られたmRNA鋳型として、たとえば、逆転
写酵素を用い自体公知の方法で相補的DNA
（cDNA）鎖を合成し、cDNAの二本鎖DAへの変
換を行う［マニアチスら、セル、８、163
（1986）］。 このDNAを例えばdG−dCあるいはdA−dTホ
モポリマー結合法［ネルソン、メソツズ イン
エンヂモロジー、68、41（1979）アカデミツク
プレス社、ニユーヨーク］で、たとえばプラスミ
ド pBR322のPstIあるいはSphI制限エンドヌク
レアーゼ切断部位に組み込ませる。これを例えば
大腸菌x1776株に導入して形質転換させ、テトラ
サイクリン耐性あるいはアンピシリン耐性でトラ
ンスホーマントを選ぶことができる。別にＩ−
IFNポリペプチドのアミノ酸配列に対応すると考
えられる塩基配列をもつたオリゴヌレオタイドを
化学合成したのち、これを32pでラベルしてプロ
ーブとなし、たとえばそれ自体公知のコロニーハ
イブリダイゼーシヨン法［グルンステインとホグ
ネス、プロシーデイング オブ ナシヨナル ア
カデミーサイエンスUSA、72、3961（1975）］に
よつて、すでに得たテトラサイクリン耐性あるい
はアンピシリン耐性のトランスホーマントの中か
ら求めるクローンを二次スクリーニングする。 このコロニーハイブリダイゼーシヨンによつて
陽性を示したクローンの塩基配列を、たとえばマ
キサム−ギルバート法［プロシーデイング オブ
ナシヨナル アカデミー サイエンスUSA、
74、560（1977）］あるいはフアージM13を用いた
デオキシヌクレオチド合成鎖停止［メシングら、
ヌクレイツク アシズ リサーチ、９、309、
（1981）］の方法によつて決定し、Ｉ−IFN遺伝子
の存在を確認する。次に、得られたクローンから
Ｉ−IFN遺伝子の全部あるいは一部をきり出し、
適当なプロモーター、SD（シヤイン アンド ダ
ルガーノ）配列の下流につないで、これを適当な
宿主に導入することもできる。 プロモーターとしては、前記のプロモーターが
挙げられ、宿主としては、大腸菌（エシエリヒア
コリ 294、W3110、C600など）、とりわけ294
が好ましい。 なお、294は公知の菌［バツクマンら、プロシ
ーデイング オブ ナシヨナル アカデミー サ
イエンス USA、73、4174（1976）］で財団法人
「発酵研究所（Institute For Fermentation、
Osaka）」にIFO−14171として寄託もされてい
る。 上記DNAによる宿主の形質転換は、例えば公
知の方法［コーエン、S.N.ら、プロシーデイン
グ オブ ナシヨナル アカデミー サイエンス
USA、69、2110（1972）］により行う。 このようにして得られた形質転換体をそれ自体
公知の培地で培養する。 培地としては、例えばグルコース、カザミノ酸
を含むM9培地［ミラー、ジヤーナル オブ エ
クスペリメンツ イン モレキユラー ゼネテイ
クス 431−433（コールド スプリング ハーバ
ー研、ニユーヨーク 1972）］が挙げられる。こ
こに、必要によりプロモーターを効率よく働かせ
るために、たとえば3β−インドリルアクリル酸
のような薬剤を加えることができる。 培養は通常15〜43℃で３〜24時間行い、必要に
より、通気や撹拌を加えることもできる。 培養後、公知の方法で菌体を集め、例えば、緩
衝液に懸濁させた後、たとえば超音波処理、リゾ
チームおよび／または凍結融解によつて菌体を破
壊し、遠心分離により上澄みを得る。菌体の破壊
に関しては、凍結融解後リゾチーム処理を行うこ
とが好ましい。 上記上澄み中のヒトＩ−IFNは、ヒトＩ−IFN
に結合するモノクローナル抗体を用いることによ
り有利に精製することができ、モノクローナル抗
体として、好ましくは式 Ｈ−X₁−^(N) _Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg
^(C) _Gly−Y₃−OH （） ［式中、X₁は結合手または^(N) _Lle Gln Val Met
Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly
Lys ^(C) _Argで示されるペプチド鎖においてそのＣ末
端から数えて１〜16個のアミノ酸を有するペプチ
ドもしくはアミノ酸残基を示し、Y₃は^(N) _Arg Arg
Ala Ser ^(C) _Gloで示されるペプチド鎖においてその
Ｎ末端から数えて１〜５個のアミノ酸を有するペ
プチドもしくはアミノ酸残基を示す］で表わされ
るポリペプチドに対するモノクローナル抗体が挙
げられる。 なお、ポリペプチド（）は新規化合物であ
る。 ポリペプチド（）に関し、Y₃としてはArg
Arg Ala Ser Glnが好ましく、ＸとしてはLys
Argが好ましい。さらに、ポリペプチド（）
は、15〜25個のアミノ酸残基からなるものが好ま
しい。該モノクローナル抗体は、抗体カラムとし
て有利に使用できる。 抗体カラムの作製は、例えばハイブリドーマを
接種した腹水等から純すいに精製した上記モノク
ローナル抗体を適切な担体とカプリングさせるこ
とにより、以下の様な方法でできる。 用いる担体は、カプリングの後にＩ−IFNが特
異的に効率よく吸着され、その後適切な溶出が可
能なものであればどの様なものでもよいが、一例
として蛋白の一級アミンが結合し易い様に活性化
されたアガロースゲルビーズ、例えばアフイゲル
−10（バイオ・ラド社製）などが以下に述べる様
な方法で好都合に用いられる。アフイゲル−10と
抗体との反応は、0.001〜1M、好ましくは0.1M
のバイカーボネート等の緩衝液中で反応を行う。
反応条件は０〜20℃、10分〜24時間、種々のPHが
可能であるが、好ましくは、４℃、４時間、PH３
〜10の条件が用いられる。混合するアフイゲル−
10と抗体の量比は、アフイゲル１mlに対し抗体量
が約50mg位迄は多ければ多い程多くの抗体がつく
ので、この範囲内でいくらでもよいが、実用上お
よび結合効率を考慮して１mg〜30mgの抗体が好都
合に用いられる。この様にしてできた抗体−担体
結合物は、反応に用いた緩衝液でよく洗つた後、
数日放置するか、もしくは最終濃度0.05Mのエタ
ノールアミン・塩酸を加え４℃で１時間反応させ
る等の方法により、残存する未反応の活性基をブ
ロツクした後、適切なカラムにつめることによ
り、抗体カラムとして使用できる。 上記した抗体カラムで精製するに際しては、た
とえば、上記の菌体破壊により得られる上澄み等
のヒト免疫インターフエロン蛋白質含有液を中性
付近の緩衝液、たとえばリン酸緩衝液やトリス・
塩酸緩衝液に溶解して抗体カラムに吸着させる。
次にカラムを同じ緩衝液で洗浄したのち、Ｉ−
IFNを溶出する。溶出液としては、弱酸性溶液た
とえば酢酸溶液、ポリエチレングリコールを含む
溶液、資料にくらべ抗体により結合し易いペプチ
ドを含む溶液、高濃度塩溶液などおよびこれらの
組み合せた溶液などが用いられ、ヒトＩ−IFNの
分解をあまり促進しないものが好ましい。 カラム溶出液は、常法により緩衝液で中和す
る。必要により再度上記の抗体カラムによる精製
操作を行うことができる。 ここで得られるヒトＩ−IFN蛋白質溶液は透析
に付し、必要によりこれを凍結乾燥により粉末と
することができる。凍結乾燥に際しては、ソルビ
トール、マンニトール、デキストロース、マルト
ース、グリセロールなどの安定剤を加えることが
できる。 本発明に用いられる実質的に純粋な、遺伝子組
み換え技術で得られるヒト免疫インターフエロン
蛋白質はヒト羊膜由来WISH細胞に対する水泡性
口内炎ウイルス（VSV）の細胞変性効果阻止試
験によるウイルス活性測定において10⁷U／mg以
上の比活性を示すものである。 なおここでＩ−IFNの活性としてのＵ／ml（ユ
ニツト／ml）の出し方は以下の様に行つた。ユニ
ツトの確定した国際標準IFN−αと白血球由来の
粗Ｉ−IFNをヒト羊膜由来FL細胞株に対する
VSVの細胞変性効果阻止試験を用いて測定し、
その力価の比較から白血球由来粗Ｉ−IFNの力価
を決定しＩ−IFNの標準品とした。目的とする資
料中のＩ−IFNの力価算定のためには、常にこの
標準Ｉ−IFNを並べて前述のWISH−VSVの系
でアツセイを行い、その比率から力価を算出し
た。 本発明の薬剤における10⁷U／mg以上の比活性
を有するヒト免疫インターフエロン蛋白質は、式 Ｈ−Lys−Arg−Lys−Arg−Ser−Gln −Met−Leu−Phe−Arg−Gly−Arg−Arg −Ala−Ser−Gln−OH で表わされるポリペプチドに対するモノクローナ
ル抗体と結合しうるすなわち当該モノクローナル
抗体を用いて精製されうるものであれば、前記し
たモノクローナル抗体を用いる精製法以外の精製
法により得られたものでもよい。 本発明に用いられるヒト免疫インターフエロン
蛋白質は、好ましくは一般式 【表】 ［式中、ＹはMetまたは結合手を示し、Z₁、Z₂は
それぞれCysまたは1/2Cysを示す］のアミノ酸配
列からなるポリペプチドを含有するものである。
当該ポリペプチドを乾燥品基準で90％以上とりわ
け95％以上含有するものが好ましい。 本発明に用いられる実質的に純粋な、遺伝子組
み換え技術によるヒト免疫インターフエロン蛋白
質は好ましくは下記の性状を有する。 (1) SDS−ポリアクリルアミドゲル（17.5％）電
気泳動による分子量測定で17000±1000を示す。 (2) アミノ末端アミノ酸としてシステインもしく
はハーフシスチンまたはメチオニンを有する。 (3) Ｈ−Lys−Arg−Lys−Arg−Ser−Gln−
Met−Leu−Phe−Arg−Gly−Arg−Arg−
Ala−Ser−Gln−OHに対するモノクローナル
抗体と結合する。 本発明のヒト免疫インターフエロン蛋白質含有
薬剤は従来の方法で得られるＩ−IFNと同様の目
的に同様の用法により使用できるが、従来品に比
し、夾雑蛋白質、発熱物質が少ないので、注射剤
原体等としてより安全に使用される。 本発明のヒトＩ−IFN蛋白質含有薬剤は抗ウイ
ルス、抗腫瘍、細胞増殖抑制および免疫増強作用
を示す。本発明のヒトＩ−IFN蛋白質含有薬剤は
医薬として使用する場合、当該ヒトＩ−IFN蛋白
質を滅菌水、ヒト血清アルブミン（HSA）、生理
食塩水その他公知の生理学的に許容される担体と
混合して製剤学的に許容される組成物として使用
することができ、非経口的に又は局所に投与する
ことができる。例えば、成人１日当り10万〜１億
ユニツト、好ましくは5000万〜6000万ユニツトを
静注又は筋注などにより投与することができる。 本発明のヒトＩ−IFN蛋白質含有薬剤は、塩、
希釈剤、アジユバント、他の担体、バツフアー、
結合剤、界面活性剤、保存剤のような生理的に許
容される他の活性成分も含有していてもよい。非
経口的投与用薬剤は、滅菌水溶液又は生理学的に
許容される溶媒との懸濁液アンプル、または生理
学的に許容される希釈液で用時希釈して使用しう
る滅菌粉末（通常Ｉ−IFN溶液を凍結乾燥して得
られる）アンプルとして提供される。 さらに本発明のヒト免疫インターフエロン蛋白
質含有薬剤は、IFN−αまたはIFN−βまたはイ
ンターロイキン２などのリンホカインのような他
の活性成分を当該ヒトＩ−IFN蛋白質に対し１〜
99％含有していてもよい。 以下参考例、実施例により本発明をさらに具体
的に説明するが、本発明はこれらに制限されるも
のでない。 下記参考例に開示しているマウスＢハイブリド
ーマγ2−11.1は、パスツール研究所［フランス国
パリ］のCNCMに寄託番号No.１−242として寄託
されている。 また実施例に開示している形質転換体E.
coli294／PHITtrp2101は、通商産業省工業技術院
微生物工業技術研究所（FRI）に受託番号FERM
Ｐ−7550として寄託されている。 発明を実施するための最良の形態 参考例 １ モノクローナル抗体の製造 (1) 免疫原の製造および免疫 以下の参考例１(1)Ａにおける薄層クロマトグ
ラフイーは、メルク社製シリカゲルプレート
60F₂₅₄又は、フナコシ薬品社製セルロースプレ
ート、アビセルSFを用い、下記の展開溶媒を
用いた。 Rf¹：クロロホルム：メタノール：酢酸＝
９：１：0.5 Rf²：酢酸エチル：ピリジン：酢酸：水＝
30：10：３：５ Rf³：クロロホルム：メタノール：水＝７：
３：0.5 Rf⁴：ｎ−ブタノール：ピリジン：酢酸：水
＝30：20：６：24 Rf⁵：酢酸エチル：ｎ−ブタノール：酢酸：
水＝１：１：１：１ (1)Ａ ヒト免疫インターフエロンのアミノ酸配
列No.131−146に対応するポリペプチドの製造 (1)Ａ(i) Ｚ−Ser−Gln−OBu^tの製造 Ｚ−Gln−OBu^t10.1ｇをメタノール500
mlに溶解し、パラジウム黒を触媒に水素気
流中で還元した。触媒をろ去し、溶媒を留
去した残留物をＺ−Ser−OH7.5ｇ、
HONB6.8ｇとともにDMF250mlに溶解し、
氷冷した。氷冷下にDCC7.15ｇを加え、０
℃で４時間室温で12時間撹拌した。析出し
たDCUをろ去し、溶媒を留去ののち残留
物をAcOEt300mlに抽出し、４％
NaHCO₃、水、0.2N塩酸、水で洗い、無
水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去
し、析出した結晶をエーテルでろ取し、乾
燥ののちCH₃CNより再結晶した。収量6.5
ｇ、収率51.2％、mp.97−100℃、［α］²⁵ _D−
24.1゜（ｃ＝0.40、メタノール）、Rf¹0.64 元素分析 C₂₀H₂₉O₇N₃として 計算値：C56.72；H6.90；N9.92 実験値：C56.21；H6.72；N9.76 (1)Ａ(ii) Ｚ−Ala−Ser−Gln−OBu^tの製造 Ｚ−Ser−Gln−OBu^t4.23ｇをメタノー
ル300mlに溶解し、パラジウム黒を触媒に
水素気流中で還元した。触媒をろ去し、溶
媒を留去した残留物をＺ−Ala−OH2.34
ｇ、HONB2.27ｇとともに、AcOEt200ml
とジオキサン200ml、DMF100mlの混合溶
媒に溶解し、氷冷した。冷却下にDCC2.38
ｇを加え０℃で４時間、室温で12時間撹拌
ののち、DCUをろ去し、溶媒を留去した。
残留物にCH₃CNとエーテルを加え結晶と
し、ろ取、乾燥ののちCH₃CNより再結晶
した。収量3.72ｇ、収率75.3％、mp.165−
170℃、［α］²⁵ _D−41.2゜（ｃ＝0.50、メタノー
ル）、Rf¹0.60 元素分析 C₂₃H₃₄O₈N₄として 計算値：C55.86；H6.93；N11.33 実験値：C55.58；H6.74；N11.12 (1)Ａ(iii) Ｚ−Arg（Pme）−Ala−Ser−Gln−
OBu^tの製造 Ｚ−Ala−Gln−OBu^t3.46ｇをメタノー
ル300mlに溶解し、パラジウム黒を触媒に
水素気流中で還元した。触媒をろ去し、溶
媒を留去した残留物を、Ｚ−Arg（Pme）−
OH・CHA4.54ｇから調製したＺ−Arg
（Pme）−OH、HOBt1.9ｇとともに
DMF150mlに溶解し氷冷した。冷却下に
DCC1.9ｇを加え、０℃で４時間、室温で
15時間撹拌した。DCUをろ去し、溶媒を
留去し残留物にAcOEtを加えゲル状の沈
澱を得、ろ取した。乾燥後、メタノールと
AcOEtより再沈澱した。収量4.55ｇ、収率
75.5％、mp.130−134℃、［α］²⁵ _D−24.1゜（ｃ
＝0.26、メタノール）、Rf¹0.57 元素分析 C₄₀H₆₀O₁₁N₈S・1/2H₂Oとして 計算値：C55.22；H7.07；N12.88 S3.69 実験値：C55.23；H6.93；N12.54 S3.48 (1)Ａ(iv) Ｚ−Arg（Pme）−Arg（Pme）−Ala
−Ser−Gln−OBu^tの製造 Ｚ−Arg（Pme）−Ala−Ser−Gln−
OBu^t4.3ｇをメタノール400mlに溶解し、
パラジウム黒を触媒に水素気流中で還元し
た。触媒をろ去し、溶媒を留去した残留物
を、Ｚ−Arg（Pme）−OH・CHA3.24ｇよ
り調製したＺ−Arg（Pme）−OH、
HOBt1.42ｇとともにDMF200mlに溶解し
氷冷した。冷却下にDCC1.41ｇを加え０℃
で４時間、室温で20時間撹拌した。DCU
をろ去し、溶媒を留去した残留物に
AcOEtを加え沈澱を得、ろ取した。乾燥
後、メタノールとAcOEtより、再沈澱し
た。収量4.4ｇ、収率71.7％、mp.125−130
℃、［α］²⁵ _D−18.0゜（ｃ＝0.40、メタノー
ル）、Rf¹0.63 元素分析 C₅₇H₈₆O₁₄N₁₂S₂・H₂Oとして 計算値：C54.96；H7.12；N13.50 S5.15 実験値：C54.66；H6.92；N13.32 S5.34 (1)Ａ(v) Ｚ−Arg（Pme）−Gly−OBu^tの製造 Ｚ−Gln−OBu^t13.0ｇをMeOH500mlに
とかし、Pd黒を触媒として、水素気流中、
接触還元した。触媒をろ去し、ろ液を減圧
濃縮し、残留物をDMF200mlにとかした。
これに、Ｚ−Arg（Pme）−OH・CHA20.0
ｇより調製したＺ−Arg（Pme）−OH、
HOBt5.4ｇを加えて氷冷し、DCC8.2ｇを
加えて48時間かき混ぜた。析出したDCU
をろ別し、濃縮後、AcOEt500mlにとかし
た。AcOEt層を４％NaHCO₃水、10％ク
エン酸水で洗浄後、Na₂SO₄で乾燥した。
濃縮後、石油ベンジンを加えて沈澱として
ろ取した。収量19.8ｇ（96.8％）。mp.71−
73℃、［α］²³ _D＋0.2゜（ｃ＝0.9、DMF）、
Rf¹0.62 元素分析 C₃₁H₄₅O₇N₅Sとして 計算値：C58.93；H7.18；N11.09 S5.08 実験値：C59.42；H7.58；N10.95 S4.84 (1)Ａ(vi) Ｚ−Phe−Arg（Pme）−Gly−OBu^t
の製造 Ｚ−Arg（Pme）−Gly−OBu^t10.0ｇを
MeOH500ml中、接触還元したのち、
DMF300mlに転溶した。これにＺ−Phe−
OH4.72ｇ、HOBt2.35ｇを加えて氷冷し、
DCC3.59ｇを加えて、15時間かきまぜた。
析出したDCUをろ別し、ろ液を濃縮後、
残留物をAcOEt400mlにとかした。AcOEt
層は、４％NaHCO₃水、10％クエン酸水
で洗浄し、Na₂SO₄で乾燥した。濃縮後、
エーテルを加えて結晶としてろ取し、
MeOH−エーテルより再結晶した。収量
10.5ｇ（85.3％）。mp.101−103℃、［α］²⁶ _D
−8.3゜（ｃ＝0.9、DMF）、Rf¹0.64 元素分析 C₄₀H₅₄O₈N₆Sとして 計算値：C61.67；H6.99；N10.79 S4.12 実験値：C61.66；H6.56；N10.93 S4.14 (1)Ａ(vii) Ｚ−Leu−Phe−Arg（Pme）−Gly−
OBu^tの製造 Ｚ−Phe−Arg（Pme）−Gly−OBu^t5.5ｇ
をMeOH300ml中、接触還元したのち、
DMF300mlに転溶した。これに、Ｚ−Leu
−OH DCHA3.13ｇより調製したＺ−Leu
−OH、HONB1.47ｇを加えて氷冷し、
DCC1.68ｇを加えて48時間かきまぜた。析
出したDCUをろ別し、濃縮後、AcOEt300
mlにとかした。AcOEt層は４％NaHCO₃
水、10％クエン酸水で洗浄し、Na₂SO₄で
乾燥した。濃縮後、エーテルを加えて粉末
としてろ取した。収量6.2ｇ（98.3％）。
mp.171−173℃、［α］²⁶ _D−15.5゜（ｃ＝0.9、
DMF）、Rf¹0.64 元素分析 C₄₆H₆₅O₉N₇Sとして 計算値：C61.93；H7.34；N10.99 S3.59 実験値：C62.02；H7.37；N11.08 S3.59 (1)Ａ(viii) Boc−Met−Leu−Phe−Arg
（Pme）−Gly−OBu^tの製造 Ｚ−Leu−Phe−Arg（Pme）−Gly−
OBu^t6.0ｇをMeOH200ml中、接触還元し
たのち、DMF150mlに転溶した。これに、
Boc−Met−OH・DCHA3.0ｇより調製し
たBoc−Met−OH、HONB1.39ｇを加え
て氷冷し、DCC1.59ｇを加えて15時間かき
まぜた。析出したDCUをろ別し、濃縮後、
ｎ−BuOH−AcOEtにとかし、10％クエ
ン酸水で洗浄し、Na₂SO₄で乾燥した。濃
縮後、エーテルを加えて結晶としてろ取し
た。収量6.2ｇ（93.1％）。mp.192−195℃、
［α］²⁶ _D−19.7゜（ｃ＝1.0、DMF）、Rf¹0.64 元素分析 C₄₈H₇₆O₁₀N₈Sとして 計算値：C58.27；H7.74；N11.33 S6.48 実験値：C58.48；H7.79；N11.34 S5.98 (1)Ａ(ix) Boc−Gln−Met−Leu−Phe−Arg
（Pme）−Gly−OHの製造 Boc−Met−Leu−Phe−Arg（Pme）−
Gly−OBu^t5.5ｇにTFA50mlを加え、室温
で10分間振りまぜたのち濃縮し、エーテル
を加えてろ取し乾燥した。これを、
DMF50mlにとかして氷冷し、TFA1.8ml
を加えた。これにBoc−Gln−OH1.85ｇ、
HONB1.49ｇ、DCC1.90ｇより調製した
Boc−Gln−ONBを加え、15時間かきまぜ
た。濃縮後、AcOHを加え、AcOEtを加
えて沈澱としてろ取した。収量5.3ｇ
（89.8％）。mp.181−183℃（分解）、［α］²⁶ _D
−19.6゜（ｃ＝1.0、DMF）、Rf¹0.30 元素分析 C₄₉H₇₆O₁₂N₁₀S₂として 計算値：C55.45；H7.22；N13.20 S6.04 実験値：C55.39；H7.17；N13.34 S6.20 (1)Ａ(x) Ｚ−Ser−NHNH−Bocの製造 Ｚ−Ser−OH10.0ｇ、ｔ−ブチルカルバ
ゼート6.2ｇをDMF150mlにとかして氷冷
し、HONB8.0ｇ、DCC9.3ｇを加えて15時
間かきまぜた。析出したDCUをろ別し、
濃縮後、AcOEtに転溶した。AcOEt層は、
４％NaHCO₃水、10％クエン酸水で洗浄
し、Na₂SO₄で乾燥した。濃縮後、エーテ
ルを加えて結晶としてろ取した。収量7.3
ｇ（50.6％）。mp.95−98℃、［α］²⁶ _D−6.2゜
（ｃ＝0.8、DMF）、Rf¹0.62 元素分析 C₁₆H₂₃O₆N₃として 計算値：C54.38；H6.56；N11.89 実験値：C54.77；H6.88；N12.29 (1)Ａ(xi) Ｚ−Arg（Pme）−Ser−NHNH−
Bocの製造 Ｚ−Ser−NHNH−Boc3.9ｇを
MeOH300ml中接触還元したのち、
DMF50mlに転溶した。これに、Ｚ−Arg
（Pme）−OH・CHA6.2ｇより調製したＺ
−Arg（Pme）−OH、HOBt1.5ｇを加えて
氷冷し、DCC2.3ｇを加えて15時間かきま
ぜた。析出したDCUをろ別し、濃縮後、
AcOEtにとかした。AcOEt層は、４％
NaHCO₃水、10％クエン酸水で洗浄し、
Na₂SO₄で乾燥した。濃縮後エーテルを加
えて、沈澱としてろ取した。収量7.45ｇ
（93.7％）。mp.100−101℃、［α］²⁶ _D−0.9゜
（ｃ＝1.2、DMF）、Rf¹0.51 元素分析 C₃₃H₄₉O₉N₇Sとして 計算値：C55.06；H6.86；N13.62 S4.46 実験値：C55.49；H6.94；N13.14 S3.86 (1)Ａ(xii) Ｚ−Lys（Mtr）−Arg（Pme）−Ser
−NHNH−Bocの製造 Ｚ−Arg（Pme）−Ser−NHNH−
Boc3.9ｇをMeOH300mlにとかし、接触還
元したのち、DMF50mlに転溶した。これ
に、Ｚ−Lys（Mtr）−OH・DCHA3.4ｇよ
り調製したＺ−Lys（Mtr）−OH、
HOBt0.88ｇを加えて氷冷し、DCC1.34ｇ
を加えて20時間かきまぜた。析出した
DCUをろ別し、濃縮後、AcOEtを加えて
粉末としてろ取し、MeOH−AcOEtより
再結晶した。収量5.1ｇ（93.4％）。mp.103
−105℃、［α］²⁶ _D−7.2゜（ｃ＝0.8、DMF）、
Rf¹0.57 元素分析 C₄₉H₇₃O₁₃N₉S₂として 計算値：C55.50；H6.94；N11.89 S6.05 実験値：C55.70；H7.15；N11.60 S5.63 (1)Ａ() Ｚ−Arg（Pme）−Lys（Mtr）−
Arg（Pme）−Ser−NHNH−Bocの製造 Ｚ−Lys（Mtr）−Arg（Pme）−Ser−
NHNH−Boc4.8ｇをMeOH300mlにとか
し、接触還元したのち、DMF70mlに転溶
した。これに、Ｚ−Arg（Pme）−OH・
CHA2.8ｇより調製したＺ−Arg（Pme）−
OH、HOBt0.74ｇを加えて氷冷し、
DCC1.12ｇを加えて15時間かきまぜた。析
出したDCUをろ別し濃縮後、AcOEtにと
かし、AcOEt層を４％NaHCO₃水、10％
クエン酸水で洗浄し、Na₂SO₄で乾燥し
た。濃縮後、エーテルを加えて沈澱として
ろ取し、MeOH−エーテルより再沈澱し
た。収量5.8ｇ（89.8％）。mp.136−137℃、
［α］²⁶ _D−6.6゜（ｃ＝1.0、DMF）、Rf¹0.58 元素分析 C₆₆H₉₉O₁₆N₁₃S₃として 計算値：C55.56；H6.99；N12.76 S6.74 実験値：C55.34；H7.07；N12.50 S6.59 (1)Ａ() Ｚ−Lys（Mtr）−Arg（Pme）−
Lys（Mtr）−Arg（Pme）−Ser−NHNH−
Bocの製造 Ｚ−Arg（Pme）−Lys（Mtr）−Arg
（Pme）−Ser−NHNH−Boc3.0ｇを
MeOH150mlにとかし、接触還元したの
ち、DMF60mlに転溶した。これに、Ｚ−
Lys（Mtr）−OH・DCHA1.54ｇより調製
したＺ−Lys（Mtr）−OH、HOBt0.31ｇを
加えて氷冷し、DCC0.57ｇを加えて15時間
かきまぜた。析出したDCUをろ別し、濃
縮後、AcOEtにとかし、AcOEt層を４％
NaHCO₃水、10％クエン酸水で洗浄し、
Na₂SO₄で乾燥した。濃縮後、エーテルを
加えて結晶としてろ取し、AcOEtより再
結晶した。収量2.70ｇ（72.8％）。mp.123
−125℃、［α］²⁶ _D−5.9゜（ｃ＝1.1、DMF）、
Rf¹0.57 元素分析 C₈₂H₁₂₃O₂₀N₁₅S₄として 計算値：C55.73；H7.02；N11.89 S7.26 実験値：C55.89；H7.30；N11.72 S7.08 (1)Ａ() Boc−Gln−Met−Leu−Phe−
Arg（Pme）−Gly−Arg（Pme）−Arg
（Pme）−Ala−Ser−Gln−OBu^tの製造 Ｚ−Arg（Pme）−Arg（Pme）−Ala−
Ser−Gln−OBu^t1.0ｇをMeOH100mlにと
かし、接触還元したのちDMF20mlに転溶
した。これに、Boc−Gln−Met−Leu−
Phe−Arg（Pme）−Gly−OH0.85ｇ、
HOBt135mg加えて氷冷し、DCC210mgを加
えて20時間かきまぜた。析出したDCUを
ろ別し、濃縮後、MeOHを加えて沈澱と
してろ取した。収量1.50ｇ（87.4％）。
mp.216−217℃（分解）、［α］²⁶ _D−11.8゜（ｃ
＝1.0、DMF）、Rf¹0.43 元素分析 C₉₈H₁₅₄O₂₃N₂₂S₄として 計算値：C55.09；H7.27；N14.42 S6.00 実験値：C54.81；H7.33；N14.23 S5.79 (1)Ａ() Ｈ−Lys−Arg−Lys−Arg−
Ser−Gln−Met−Leu−Phe−Arg−Gly
−Arg−Arg−Ala−Ser−Gln−OH製造 Boc−Gln−Met−Leu−Phe−Arg
（Pme）−Gly−Arg（Pme）−Arg（Pme）−
Ala−Ser−Gln−OBu^t1.0ｇにTFA10mlを
加え、室温で50分間振り混ぜたのち、濃縮
し、エーテルを加えて沈澱としてろ取し、
乾燥した。 一方、Ｚ−Lys（Mtr）−Arg（Pme）−
Lys（Mtr）−Arg（Pme）−Ser−NHNH−
Boc0.83ｇにTFA10mlを加えて室温で10分
間振り混ぜたのち、濃縮し、エーテルを加
えて沈澱としてろ取し乾燥した。これを
DMF10mlにとかし、ドライアイス−アセ
トンで冷却後、6.2N HCl−AcOEt0.23ml、
亜硝酸イソアミル（0.075ml）を加え、−25
〜−20℃で20分間保つた（ヒドラジンテス
ト：陰性）。これを再びドライアイス−ア
セトンで冷却し、TEA0.25mlを加えて中
和した。アミン成分DMF40mlにとかし、
氷冷し、TEA0.16mlを加えたのち、先に
調製したアジド溶液を加えて、４℃で72時
間かきまぜた。反応液を、希酢酸水にそそ
ぎ、析出したゲルをろ取し、含水CH₃CN
で洗浄した。収量1.40ｇ（81.5％）、
Rf¹0.09。このうち400mgを0.15M MSAを
含むTFA−チオアニソール−メチルスル
フイド（８：１：１）60mlにとかし、室温
で２時間振りまぜたのち、AcONH₄400mg
を加えて濃縮し、エーテルを加えて沈澱と
してろ取し、乾燥した。これを少量の1N
AcOHにとかしセフアデツクスＧ−25のカ
ラム（2.2×120cm）に付した。1N AcOH
で溶出し160ml−260mlの分画を集めて凍結
乾燥し、ついでアンバーライトIRA−410
（酢酸型）のカラムを通し、凍結乾燥した。
これをさらにTSK−LS−410のカラム
（2.14×7.5cm＋2.14×30cm）を用いる
HPLCで精製し、目的物を得た。収量45
mg。［α］²⁴ _D−45.9゜（ｃ＝0.7、0.1N
AcOH）、Rf（cellulose）0.20 アミノ酸分析：Lys1.71、Arg4.71、 Ser1.69、Glu2.12、
Gly1.00、Ala1.03、Met0.32、Leu1.30、
Phe1.08（平均回収率77％） (1)Ｂ キヤリヤー蛋白とポリペプチド複合体の
合成 上記(1)Ａ（）で得たポリペプチドとサ
イログロブリン（以下TG）との結合を、グ
ツトフレンドらの方法に準じて行つた［サイ
エンス、144、1334頁（1964）］。即ち、当該
ポリペプチド2.5mgをTG3.75mgと混合し、２
mlの50ｍＭのフオスフエートバツフアーを加
え、氷水中でよく撹拌した。これにカルボジ
イミド塩酸塩30.4mgを蒸留水200μに溶かし
たものを１滴ずつゆつくりと加えた後、３時
間氷水中で撹拌しながら反応させた。反応
後、蒸留水で透析を充分に行い、凍結乾燥を
行なつて蛋白複合体4.7mgを得た。 (1)Ｃ 抗体検出のためのEIA用抗体の調製 EIA用抗原の調製は北川らの方法［ジヤー
ナル オブ バイオケミストリー、79、233
（1976）］の方法に準じて行つた。 (1)Ｃ(i) ポリペプチドへのマレイミド基の導
入 前記(1)Ａ（）で得たポリペプチド
（350nmoles）を１mlの100ｍＭフオスフエ
ートバツフアーPH6.8に溶解し、Ｎ−（４−
カルボキシシクロヘキシルメチル）マレイ
ミドのＮ−ヒドロキシサクシニミドエステ
ル585μｇ（1.75μmoles）と70μのＮ，Ｎ
−ジメチルホルマミド溶液に加え混合し、
30℃で30分撹拌して反応後、セフアデツク
スＧ−25カラムで分画を行いマレイミド基
の導入されたポリペプチド分画185nmoles
を得た。 (1)Ｃ(ii) マレイミド基導入ポリペプチドとβ
−Ｄ−ガラクトシダーゼとの結合 上記(1)Ｃ(i)で得たマレイミド基導入ポリ
ペプチド16.5nmolesとβ−Ｄ−ガラクト
シダーゼ3.3nmolesを混合し、４℃で18時
間反応後、412.5nmolesのβ−メルカプト
エタノールで反応を停止させた。β−Ｄ−
ガラクトシダーゼと結合したポリペプチド
は、セフアロース6Bカラムで分画を行い、
以下の実験に使用した。 (1)Ｄ EIA法 前記(1)Ｂで得た蛋白複合体で免疫したマウ
ス血清あるいはハイブリドーマ上清中の抗体
活性の検出はEIA法を用いて行つた［イムノ
フアーマコロジー、１、３（1978）］。すなわ
ち、血清あるいはハイブリドーマ上清をバツ
フアーＡ（20ｍＭ Na₂HPO₄、100ｍＭ
NaCl、0.1％NaN₃、１ｍＭ MgCl₂、PH
7.0）で希釈し、この100μをとり、参考例
１(1)Ｃで得たポリペプチド誘導体100μと
よく混合し、24℃で24時間反応させた。反応
後、ウサギ抗マウスIgGを結合した３％セル
ロース100μを加えて24℃、４時間反応さ
せた。反応後、セルロースを0.5％ツイーン
20を含んだバツフアーＡでよく洗浄し、４−
メチルウンベリフエリル−β−Ｄ−ガラクト
シド20μｇ／mlを500μ加え、37℃で２時間
反応後、100ｍＭカーボネートバツフアー
（PH10.5）を３ml加えて反応を停止し、上清
中の蛍光強度を蛍光計で測定した（エキサイ
テーシヨン365nｍ、エミツシヨン450nｍ）。 (1)Ｅ 免疫 ７〜８週令のBALB／ｃ雌マウス６匹
各々に抗原として前記(1)Ｂで得た蛋白複合体
の、タンパク量として、40μｇをフロインド
コンプリート、アジユバントとよく混合し、
皮下に接種した（初回免疫）。初回免疫の２
週後、同量の抗原をフロインドコンプリート
アジユバントとよく混合し、皮下に接種し
た（二次免疫）。さらに、その２週後、二次
免疫と同様の方法で三次免疫を行つた。三次
免疫の６日後、マウスから血液を部分採取
し、血清中の抗体価を前記(1)Ｄ記載のEIA法
で測定した。このうち、高い抗体価を示した
γ−２マウスに対して120μｇの抗原を0.5ml
の食塩水に溶解させたものを静脈内に接種す
ることにより最終免疫を行つた。各マウスの
抗体価は第２表に示した。 【表】 (2) モノクローナル抗体γ2−11.1の製造 (2)Ａ 細胞融合 上記(1)Ｅ記載の方法で免疫を行い、最終免
疫の３日後のγ−２マウスから脾臓を摘出
し、ステンレスメツシユで圧迫、ろ過し、イ
ーグルズ・ミニマム・エツセンシヤルメデイ
ウム（MEM）に浮遊させ、脾臓細胞浮遊液
を得た。細胞融合に用いる細胞として、
BALB／ｃマウス由来ミエローマ細胞P3−
×63.Ag8.U1（P3U1）を用いた［カレント
トピツクス イン マイクロバイオロジー
アンド イムノロジー、81、１（1978）］。細
胞融合は、原法（ネイチヤー、256巻、495
頁、1975年）に準じて行つた。即ち、脾臓細
胞およびP3U1をそれぞれ血清を含有しない
MEMで３度洗浄し、脾臓細胞とP3U1数の
比率を５：１になるよう混合して、800回転
で15分間遠心を行つて細胞を沈澱させた。上
清を充分に除去した後、沈澱を軽くほぐし、
45％ポリエチレングリコール（PEG）6000
（コツホライト社製）を0.3ml加え、37℃温水
槽中で７分間静置して融合を行つた。融合後
細胞に毎分２mlの割合でMEMを添加し、合
計12mlのMEMを加えた後600回転15分間遠
心して上清を除去した。この細胞沈澱物を10
％牛胎児血清を含有するRPMI1640メデイウ
ム（RPMI1640−10FCS）にP3U1が１ml当
り２×10⁵個になるよう浮遊し、24穴マルチ
デイシユ（リンプロ社製）に１ウエル１mlず
つ144ウエルに播種後、細胞を37℃で５％炭
酸ガスフラン器中培養した。24時間後、
HAT（ヒポキサンチン１×10^-4M、アミノプ
テリン４×10^-7M、チミジン1.6×10^-5M）
を含んだPRMI1640−10FCS培地（HAT培
地）を１ウエル当り１mlずつ添加することに
より、HAT選択培養を開始した。HAT選
択培養は培養開始３、５、７日後に旧液を１
ml捨てたあと、１mlのHAT培地を添加する
ことにより継続した。ハイブリドーマの増殖
は、細胞融合後10〜14日で認められ、培養液
が黄変したとき（約１×10⁶／ml）、上清を採
取し、EIA法で、抗体の有無を検索した。こ
のようにして、ハイブリドーマの増殖が認め
られた141ウエルの上清を調べたところ、２
ウエル（γ2−11、γ2−100）に強い抗体活
性、２ウエル（γ2−62、γ2−70）に弱い活
性を認めた。 (2)Ｂ クローニング 抗体活性が陽性を示した３ウエル（γ2−
11、62、100）の各ハイブリドーマを、限界
希釈法によつてクローニングを行つた。即ち
ハイブリドーマが２個／mlになるよう
RPMI1640−20FCSに浮遊させ、96穴マイク
ロプレート（ヌンク社製）に１ウエル当り
0.1mlずつ分注した。分注する際、フイーダ
ー細胞としてBALB／ｃマウスの胸腺細胞
をウエル当り５×10⁵個になるよう加えた。
このようにして、約２週間後には細胞の増殖
が認められるようになり、上清を採取して抗
体の有無を前記(1)Ｄ記載のEIA法で調べた。
その結果、γ2−11では19クローン中８クロ
ーン、γ2−62では54クローン中３クローン、
γ2−100では47クローン中５クローンに抗体
活性を認めた。 (2)Ｃ モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ
の腹水化 IFN−γに対して結合能を示す抗体を産生
するγ2−11、１クローン細胞（マウスＢハ
イブリドーマ γ2−11.1）１×10⁶個を、あ
らかじめ0.5mlのミネラルオイルを腹腔内に
接種することにより腹水化を行つた。ハイブ
リドーマを腹腔に投与して10日後、腹水を採
取して抗体価をEIA法で測定したところ、
10⁷倍希釈まで抗体活性を示した。なお、当
該クローン細胞の培養上清中の抗体活性は、
10⁴倍希釈まで認められているが、腹水化す
ることにより約1000倍程度抗体活性が上昇し
た。 (2)Ｄ モノクローナル抗体の精製 上記(2)Ｃで得られた腹水４mlを出発材料と
して、ステーリンら（ジヤーナル オブ バ
イオロジカルケミストリー、256巻、9750頁、
1981年）の方法に準じてモノクローナル抗体
を精製した。まず腹水からフイブリン様物質
を除去するため10000回転15分間遠心した後、
リン酸緩衝液−食塩水（PBS：8.1ｍＭ
NaH₂PO₄、1.5ｍＭ KH₂PO₄、2.7ｍＭ
KCl、137ｍＭ NaCl、PH7.2）で280nｍの
紫外部吸収（A₂₈₀）が12〜14の値を示す濃度
に希釈した。希釈後サンプルに飽和硫酸アン
モニウム溶液を47％の濃度になるように加
え、４℃で撹拌しながら60分間塩析を行い、
その後遠心（10000回転、15分間）を行つて
沈澱物を得た。沈澱物を50ｍＭ NaCl含有
22ｍＭトリス緩衝溶液（PH7.9）に溶解し、
同溶液２に対して透析を行つた。２時間
後、２新しい同じ透析液に換え、さらに15
時間透析を行つた。透析後、沈澱を除去する
ため10000回転15分間遠心を行い、上清を
A₂₈₀の値が20〜30の濃度になるように調整し
た。このサンプルを充分量の50ｍＭ NaCl
含有トリス緩衝溶液で順化した８mlのDEAE
セルロースカラム（ワツトマンDE₅₂）にか
け、50ｍＭ NaCl含有トリス緩衝溶液を用
いて1.5ml／分の流出速度で分画を行つた。
この条件下では、抗体活性は主として素通り
分画に認められた。 参考例 ２ 抗体カラムの製造 上記参考例１(2)Ｄ記載の方法で精製された素通
り分画のモノクローナル抗体（γ2−11.1モノクロ
ーナル抗体）25ml（65.3mg）を0.1M NaHCO₃、
PH8.3溶液に対して一晩透析を行つた。一方、ア
フイゲル−10（バイオ・ラド社）25mlをグラスフ
イルターを用いて充分水洗を行つた後、0.1M
NaHCO₃、PH8.3溶液に浮遊させ前記抗体とを混
合し、４℃で４時間、ゆつくり撹拌しながら反応
させた。その後、４℃で一晩放置した後、グラス
フイルターを用いて0.1M NaHCO₃、PH8.3溶液
でよく洗浄した。反応させたゲルに0.1Mエタノ
ールアミン、0.15M NaClを含む溶液（PH8.0）を
25ml加え、４℃、１時間振とうし、残存するかも
知れない未反応の活性基をブロツクした。その後
ゲルをPBSでよく洗浄し、0.1％NaN₃を含む
PBS25mlに懸濁し、４℃で保存した。加えた抗
体量と回収されたろ液中の抗体量から、ゲル１ml
当り2.35mgの抗体が結合していることが判明し
た。この様にして得た反応物をカラムに充め、抗
体カラムとして使用した。 実施例 １ ヒト免疫インターフエロン蛋白質の製造 (1) 形質転換体の製造 (1)Ａ Ｉ−IFN遺伝子含有プラスミドPH
IT3709の製造 (1)Ａ(i) ヒトＩ−IFNをコードするmRNA
の分離 ヒト抹梢血より調製したリンパ球を12−
Ｏ−テトラデカノイルホルボール−13−ア
セテート（TPA）（15nｇ／ml）とコンカ
ナバリンＡ（40μｇ／ml）を含むRPMI−
1640培地（10％の牛胎児血清を含む）で37
℃培養し、Ｉ−IFNを誘導させた。24時間
後、この誘導した１×10¹⁰個のヒトリンパ
球をチオグアニジン変性溶液（5Mグアニ
ジンチオシアネート、５％メルカプトエタ
ノール、50ｍＭ Tris・HCl PH7.6、10
ｍＭ EDTA）中でテフロンホモゲナイ
ザーによつて破壊変性した後Ｎ−ラウロイ
ルザルコシン酸ナトリウムを４％になるよ
うに加え、均質化した混合物を5.7M塩化
セシウム溶液［5.7M塩化セシウム、0.1M
エチレンジアミン四酢酸（EDTA）］６ml
上に重層し、ベツクマンSW27のローター
を用いて15℃で24000rpm30時間遠心処理
を行い、RNA沈澱を得た。 このRNA沈澱を0.25％Ｎ−ラウロイル
ザルコシン酸ナトリウム溶液にとかした
後、エタノールで沈澱させ、8.3mgのRNA
を得た。このRNAを高塩溶液［0.5M
NaCl、10ｍＭ Tris・HCl PH7.6、１ｍ
Ｍ EDTA、0.3％SDS］中でオリゴ
（dT）セルロースカラムに吸着させ、ポリ
(A)を含むmRNAを低塩溶液（10ｍＭ
Tris・HCl PH7.6、１ｍＭ EDTA、0.3
％SDS）で溶出させることにより、ポリ(A)
を含むmRNA700μｇを分取した。 このmRNAを更にエタノールで沈澱さ
せ、0.2mlの溶液（10ｍＭ Tris・HCl
PH7.6、２ｍＭ EDTA、0.3％SDS）に溶
かし、65℃で２分間処理して10〜35％庶糖
密度勾配遠心処理（ベツクマンSW27のロ
ーターを用いて20℃、25000rpmで21時間
遠心分離）することにより分画化して22分
画を得た。この各分画につきRNAの一部
ずつを、アフリカツメガエルの卵母細胞に
注入し、合成される蛋白質中のインターフ
エロン活性［ヒト羊膜由来WISH細胞に対
する水泡性口内炎ウイルス（VSV）の細
胞変性効果阻止試験を用いて測定した抗ウ
イルス活性［ステワルト、ザ インターフ
エロン システム、スプリンガー社、ニユ
ーヨーク、1979年、11頁）］を測定し、分
画12（沈降定数Ｓ値は12−14Sを示した）
に195ユニツト／μｇRNAの活性を検出し
た。このようにして得た分画12のmRNA
は約20μｇであつた。 (1)Ａ(ii) 単鎖DNAの合成 上記で得たmRNAおよび逆転写酵素を
用い、100μの反応液（5μｇのmRNA、
50μｇオリゴ（dT）、100ユニツトの逆転写
酵素、１ｍＭずつのdATP、dCTP、
dGTPおよびdTTP、８ｍＭ MgCl₂、50
ｍＭ KCL、10ｍＭ ジチオスレイトー
ル、50ｍＭ Tris・HCl PH8.3）中で42
℃、１時間インキユベートした後に、フエ
ノールで除蛋白し、0.1NのNaOHで70℃、
20分処理してRNAを分解除去した。 (1)Ａ(iii) 二重鎖DNAの合成 ここで合成された単鎖の相補DNAを
50μの反応液（mRNAとオリゴdTを含
まない以外は上記と同じ反応液）中で42℃
２時間反応させることにより二重鎖DNA
を合成した。 (1)Ａ(iv) dCテイルの付加 この二重鎖DNAにヌクレアーゼS1を
50μの反応液（二重鎖DNA、0.1M酢酸
ナトリウム PH4.5、0.25M NaCl、1.5ｍ
Ｍ ZnSO₄、60ユニツトのS1ヌクレアー
ゼ）中で室温30分間作用させ、フエノール
で除蛋白し、エタノールでDNAを沈澱さ
せた後、これにターミナルトランスフエラ
ーゼを50μの反応液（二重鎖DNA、
0.14Mカコジル酸カリ、0.3M Tris（塩基）
PH7.6、２ｍＭ ジチオスレイトール、１
ｍＭ C₀Cl₂、0.15ｍＭ dCTP、30ユニツ
トターミナルトランスフエラーゼ）中で３
分間37℃で作用させ二重鎖DNAの３両端
に約20個のデオキシシチジン鎖を伸長させ
た。これらの一連の反応で約300nｇのデ
オキシシチジン鎖をもつた二重鎖DNAを
得た。 (1)Ａ(v) 大腸菌プラスミドの開裂ならびに
dGテイルの付加 一方、10μｇの大腸菌プラスミド
pBR322DNAに制限酵素PstIを50μの反
応液［10μｇ DNA、50ｍＭ NaCl、６
ｍＭ Tris・HCl（PH7.4）、６ｍＭ
MgCl₂、６ｍＭ ２−メルカプトエタノー
ル、100μｇ／ml牛血清アルブミン、20ユ
ニツトのPstI］中で３時間37℃で作用させ
てpBR322DNA中に１ケ所存在するPstI認
識部位を切断し、フエノールで除蛋白した
後、ターミナルトランスフエラーゼを50μ
の反応液［DNA10μｇ、0.14Mカコジル
酸カリ、0.3M Tris（塩基）PH7.6、２ｍＭ
ジチオスレイトール、１ｍＭ C₀Cl₂、
0.15ｍＭ dGTP、30ユニツトターミナル
トランスフエラーゼ］中で３分間37℃で作
用させ上記プラスミドpBR322DNAの3′両
端に約８個のデオキシグアニン鎖を延長さ
せた。 (1)Ａ(vi) cDNAの会合ならびに大腸菌の形質
転換 このようにして得られた合成二重鎖
DNA0.1μｇと上記プラスミドpBR322
0.5μｇを0.1M NaCl、50ｍＭ Tris・HCl
PH7.6、１ｍＭ EDTAよりなる溶液中
で65℃２分間、45℃２時間加熱しその後徐
冷して会合させエネアら方法［ジヤーナル
オブ モレキユラー バイオロジー、
96、495（1975）］に従つて大腸菌x1776を
形質転換させた。 (1)Ａ(vii) cDNA含有プラスミドの単離 こうして約8500のテトラサイクリン耐性
株が単離され、これら各々のDNAをニト
ロセルロースフイルターの上に固定した
［グルンステインとホグネス、プロシーデ
イング オブ ナシヨナル アカデミー
サイエンス USA、72、3961（1975）］。 一方、ゴエデルらの報告［ネイチヤー、
295、503（1982）］のＩ−IFNのアミノ酸配
列をもとにしてアミノ酸No.１−５（Cys・
Tyr・Cys・Gln・Asp）及びアミノ酸No.77
−82（Lys・Gln・Asp・Met・Asn・Val）
より推測できる塩配列（それぞれ
5′TCCTGGCA^A _GTA^A _GC³′および5′AC^G _A
TTCAT^G _ATC^T _CTC^T _CT³′）をトリエステル法
［クレアら、プロシーデイング オブ ナ
シヨナル アカデミー サイエンス
USA、75、5765（1978）］を用いて化学合
成した。このオリゴヌクレオチドに対して
T4ポリヌクレオチドカイネースを用いて
50μの反応液（オリゴヌクレオチド0.2μ
ｇ、50ｍＭ Tris・HCl PH8.0、10ｍＭ
MgCl₂、10ｍＭメルカプトエタノール、
50μCiγ−³²PATP、３ユニツトT4ポリヌ
クレオチドカイネース）中で１時間37℃で
反応させ、5′末端を³²Pで標識した。この
標識されたオリゴヌクレオチドをプローブ
としてラウンらの方法［ヌクレイツク ア
シズ リサーチ、９、6103（1981）］に従つ
て上記のニトロセルロースフイルター上に
固定したDNAに会合させ、オートラジオ
グラフイーによつて上記二種類のオリゴヌ
クレオチドプローブに反応する菌株を４個
単離した。これらの菌株の各々の菌体から
プラスミドDNAをアルカリ性［バーンボ
イムとドリー、ヌクレイツク アシズ リ
サーチ、７、1513（1979）］によつて単離し
た。次にプラスミドDNAの挿入部を制限
酵素Pstにより切り出し、分離したプラ
スミドのうちでその挿入部の長さの最も長
い断片を含むものをえらび、このプラスミ
ドをPHIT3709と名ずけた。 このプラスミドの制限酵素地図を第１図
に示す。 次にこのPHIT3709プラスミドに挿入さ
れたcDNA配列の一次構造（塩基配列）を
ジヌクレオチド合成鎖停止法とマキサム−
ギルバートの方法によつて決定した。その
一次構造は第２図の通りであつた（特願昭
58−49681号明細書参照：PHIT3709のＩ−
IFN暗号領域（コドンNo.S1〜No.146）の塩
基配列はその後公表された文献［ヌクレイ
ツク アシツズ リサーチ、10、2487
（1982）中の第３図］に記載されたものと
同一である。 (1)Ｂ 発現プラスミドならびに発現用形質転換
体の製造 (1)Ｂ(i) ptrp601およびptrp701の構築 発現プラスミドとして大腸菌のトリプト
フアン合成のプロモーター部分［プロモー
ター、オペレーターを含むDNA断片、276
塩基対、ペネツトら、ジヤーナル オブ
モレキユラー バイオロジー、121、113
（1978）］を含むプラスミドptrp601（ベクタ
ーはpBR322）を構築した。 一方、プラスミドpBR322を制限酵素
EcoRおよび制限酵素Avaで切断し、
得られたテトラサイクリン耐性遺伝子を含
むEcoR−Ava断片ののりしろ部分を
DNAポリメラーゼラージフラグメント
でうめた。この断片をT4DNAリガーゼを
用いてptrp601のPvuの切断部位に結合
させptrp701を構築した（第３図）。 (1)Ｂ(ii) ptrp771の構築 次にptrp701に２ケ所存在する制限酵素
Cla切断部位の一つを消去するた、
ptrp701をClaで部分分解して二つのCla
切断部位のうち一方のみが切断されたも
のを得た。生じたのりしろ部分をDNAポ
リメラーゼラージフラグメントでうめた
のち、T4DNAリガーゼで再度結合させて
ptrp771を得た（第３図）。 (1)Ｂ(iii) PHITtrp1101の構築 PHIT3709を制限酵素Pstで切断してＩ
−IFNの構造遺伝子を含むPst断片を得
た。この断片を制限酵素BstNで部分分
解し、Ｉ−IFN構造遺伝子内にあるBstN
部位の切断されたBstN−Pst断片を
得た。Bst切断部位ののりしろ部分を
DNAポリメラーゼラージフラグメント
でうめたのち、前述したトリエステル法に
よつて化学合成した蛋白合成開始コドン
ATGを含むオリゴヌクレオチドアダプタ
ー CGATAATGTGTTACTGCC TATTACACAATGACGG をT4DNAリガーゼで結合させた。 一方、上記アダプターを結合させたＩ−
IFN遺伝子をptrp771を制限酵素Pstと制
限酵素Claで切断して得た断片のトリプ
トフアプロモーターの下流に挿入して
T4DAリガーゼを用いて結合させ、Ｉ−
IFN発現プラスミドPHITtrp1101を構築し
た（第４図）。 (1)Ｂ(iv) PHITtrp2101の構築および発現用形
質転換体の製造 PHITtrp1101をさらに改良して次の通り
PHITtrp2101を構築した。 まずptrp601を制限酵素Claおよび制限
酵素Hpaで処理してtrpプロモーターを
含むCla−Hpa断片0.33Kbを得た。こ
の断片を、Claで切断しアルカリホスフ
アターゼ処理したPHITtrp1101にT4DNA
リガーゼを用いて結合させtrpプロモータ
ーが二つ直列に入つたPHITtrp2101を得た
（第５図）。 このプラスミドPHITtrp2101を用いてコ
ーエンらの方法［前出］に従つて、大腸菌
294を形質転換させ、このプラスミドを含
む菌株エシエリヒア コリ（E.coli）
294／PHITtrp2101を得た。 (2) 発現用形質転換体の培養 E.coli294／PHITtrp2101を8μｇ／mlのテトラ
サイクリン、0.4％カザミノ酸、１％グルコー
スを含むM9培地200mlを分注した１マイヤー
中で37℃で培養し、生育がKU220に達した時
に3β−インドリールアクリル酸（IAA）を30μ
ｇ／mlになるように加えて更に４時間培養し
た。 (3) ヒト免疫インターフエロン蛋白質の精製 (3)Ａ ヒトＩ−IFN含有上清の製造 上記(2)で得られた培養液1.2を遠心分離
して菌体を集め、これを60mlの10％シユクロ
ース含む0.05M Tris・HCl PH7.6に懸濁し
た。この菌体懸濁液に0.2Mフエニル−メチ
ル−スルフオニルフルオライド（PMSF）
0.3ml、5M NaCl2.4ml、0.2Mエチレンジア
ミンテトラアセテート（EDTA）2.4ml、IM
スペルミジン2.4ml、５mg／mlリゾチーム2.4
mlを加え０℃１時間放置したのち、37℃で５
分処理し、これを更にARTEK社（米国）製
超音波破砕器で０℃30秒処理した。 この溶菌液を105000×ｇで１時間遠心分離
して上清66mlを集めた。 (3)Ｂ 抗体カラムを用いるヒトＩ−IFNの精製 上記(3)Ａで得た上清60mlを１ｍＭ
EDTA、0.15M NaClを含む20ｍＭ Tris・
HCl、PH7.6（TEN）で150mlに希釈したの
ち、参考例２の方法で調製した抗Ｉ−IFN抗
体カラム（９ml）にかけた。TENで十分洗
浄したのち、さらに0.01％ノニデツトＰ−40
（シエル社製）0.5M NaClを含むTENで洗
浄した。次に0.25M NaClを含む0.1M酢酸で
Ｉ−IFNを溶出し、溶出液はただちに1Mト
リスHCl PH7.6で中和した。得られた溶液
を蒸留水に対し４℃、16時間透析し、これを
アセトン−ドライアイスで凍結乾燥に付し粉
末とした。 結果は以下の通りである。 【表】 処理
ここで得られた最終のヒト免疫インターフエ
ロン蛋白質の比活性（WISH細胞に対する
VSVの細胞変性効果阻止試験によるウイル
ス活性測定による（前出））は、7.5×10⁷U／
mgであつた。この蛋白質を以下の実験に供し
た。 (3)Ｃ ヒト免疫インターフエロン蛋白質の性状 上記(3)Ｂで得られたヒトＩ−IFN蛋白質の
性状は下記のとおりであつた。 (3)Ｃ(i) 分子量 上記(3)Ｂで得られた蛋白質を２−メルカ
プトエタノールで処理してSDS−ポリアク
リルアミドゲル（17.5％）電気泳動（15ｍ
Ａ、６時間）にかけ、クマジーブルーで染
色したところ、蛋白質は単一のバンドとし
て確認できた（第６図）。なお同時に泳動
させた分子量マーカーの泳動距離と蛋白質
の泳動距離との関係から蛋白質の分子量は
17000±1000と推定された（第７図）。一
方、２−メルカプトエタノールで処理しな
かつた蛋白質は分子量33000±2000の位置
にもう一本のバンドが検出された。この値
はＩ−IFNの分子量17000±1000の約２倍
に相当することから、このバンドはＩ−
IFNの二量体に由来すると考えられる。 (3)Ｃ(ii) アミノ酸分析 前記(3)Ｂで得られた蛋白質をガラス製加
水分解用試験管にとり、200倍量（Ｖ／Ｗ）
の４％チオグリコール酸を含む定沸点塩酸
を加えて、減圧下に封管したのち、110℃
で24、48、72時間加水分解した。加水分解
後、開管し、塩酸を減圧下で除去し、残渣
を0.02N塩酸に溶解して日立製835型高速
アミノ酸分析計によりアミノ酸分析を実施
した。 シスチンおよびシステインは、ハースの
方法［メソツズ イン エンチモロジー、
11、197（1967）］に従い、上記蛋白質を過
ギ酸酸化したのち、上記と同様に24時間加
水分解して、アミノ酸分析計によりシステ
イン酸として定量した。アミノ酸分析値
は、24、48および72時間の加水分解で得ら
れた値を平均して求めた。但し、セリン、
スレオニン、チロシンおよびトリプトフア
ンの値は加水分解時間を０時間に外挿して
求めた。その結果を第３表に示す。 【表】 (3)Ｂ(iii) アミノ末端アミノ酸分析 前記(3)Ｂで得られた蛋白質をハースの方
法［メソツズ イン エンチモロジー、
11、197（1967）］に従つて過ギ酸酸化した
のち、エドマン分解法の岩永らによる変法
［ヨーロピアン ジヤーナル オブ バイ
オケミストリー、８、189（1969）］により
そのアミノ末端アミノ酸分析を実施した。
生成したフエニルチオヒダントイン−アミ
ノ酸（PTH−アミノ酸）はウルトラフエ
アーODSカラム［アルテツクス社製（U.
S.A.）、4.6×250mm、粒子径5μｍ］を用い、
アルチヤーの方法［アルテツクス クロマ
トグラム、３、８（1980）］により、バリア
ン製高速液体クロマトグラフ5040型（U.S.
A.）で同定、定量した。その結果、PTH
−メチオニンスルホンおよびPTH−シス
テイン酸が検出された。 上記から明らかなように本発明によれば、7.5
×10⁷U／mg以上の比活性を有する実質的に純粋
な、遺伝子組み換え技術によるヒト免疫インター
フエロン蛋白質を製造することができる。 実施例 ２ ヒト免疫インターフエロン蛋白質の製造および
得られた蛋白質のトリプシン消化ペプチドマツ
プ 実施例１(1)Ｂ(iv)で得たE.coli294／PHITtrp2101
を実施例１と同一の条件で培養し、実施例１(3)Ａ
に記載と同一の条件で菌体を破壊し上清64mlを集
た。 上記上清60mlを実施例１(3)Ｂに記載の条件で、
参考例２に記載の条件で調製した抗Ｉ−IFN抗体
カラムを用いて精製し、凍結乾燥粉末としてヒト
Ｉ−IFN蛋白質（比活性：1.4×10⁷U／mg）1.8mg
を得た。 上記蛋白質50μｇを25ｍＭ酢酸アンモニウム−
水酸化ナトリウム（PH8.0）中でTPCK−トリプ
シン［ワーシントン社製（米国）］と37℃で18時
間反応させて消化し、２−メルカプトエタノール
を添加して37℃でさらに２時間保温したのち、１
％のトリフルオロ酢酸を加えて反応を停止した。
このようにして得られた消化物を0.02％トリフル
オロ酢酸−５％アセトニトリルで平衡化したウル
トラフエアーオクチルカラム［5μｍ、4.6×250
mm、アルテツクス社製（米国）］にかけ、アセト
ニトリルの直線濃度勾配法（５−70％）によつて
温度30℃、流速1.0ml／分で溶出した。モニター
はフルオレスカミンを用いる蛍光法によつて行つ
た。ここで得られたトリプシン消化ペプチドマツ
プの結果は第８図に示すとおりであつた。 実施例 ３ 注射用製剤 本発明のヒトＩ−IFN蛋白質（比活性：２×
10⁷U／mg）５mgを100mlの５％HSA水溶液100ml
に溶解し、メンブランフイルター（孔径0.2μｍ）
を用いてろ過後、無菌条件下100バイアルに分配
する。バイアル中の溶液を無菌的に凍結乾燥し、
用時調製用注射用製剤を得る。 本製剤は用時１mlの蒸留水に溶解する。 参考例 ３ (1) 粗抽出液の製造： 前記の実施例１(1)、(2)および(3)Ａに記載の、
大腸菌294／PHIPtrp2101の培養および抽出によ
り、ヒト免疫インターフエロン（IFN−γ）の
粗抽出液（上清）を得た。 (2) 抗体カラムの製造： 前記参考例２に記載の方法により、抗体カラ
ム（モノクローナル抗体γ2−11.1）を製造し
た。 (3) 抗体カラムを通過させた溶出液の製造： 抗体カラムを通過させた溶出液は、上記(1)項
粗抽出液から、本発明方法に従い、次のように
して製造した。 110mlのIFN−γの粗抽出液を、１ｍＭ
EDTAおよび0.15M NaClを含む20ｍＭ Tris
−HCl（PH7.6）（TEN）で希釈し250mlとなし、
希釈液を上記２項の抗体カラム（12ml）にかけ
た。カラムをTENで、次いで、0.01％Nonidet
Ｐ−40（Sheel社製）および0.5M NaClを含有
するTENで充分に洗浄した。つぎに、0.25M
NaCl含有0.1M酢酸溶液でIFN−γを溶出し
た。溶出液をただちに、1M Tris−HCl（PH
7.6）で中和し、抗体カラムを通過させた溶出
液40mlを得た。 (4) CPG（cotrolled−pore glass）ビーズを用い
て、Leyら、ヨーロピアン・ジヤーナル・オ
ブ・イムノロジー（Eur.J.Immunol.）、10、
877（1980）に記載の方法に従つて、次の工程に
よりCPG−(1)溶出液およびCPG−(2)溶出液を
得た。なお、CPGビーズは、CPG−10（120−
200メツシユ、75−125μｍ、Serva社、西ドイ
ツ製）を用いた。 【表】 ↓
【表】 ↓
CPG−(2)溶出
液(6ml)
(5) 上記(1)項で得られた粗抽出液、上記(3)項で得
られた抗体カラムを通過させた溶出液および上
記(4)項で得られたCPGの溶出液の抗ウイルス
活性を、前述の方法により測定した。 また、該粗抽出液と該溶出液は、前記実施例
１(3)Ｃ(i)に記載のSDS−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法により測定した。 【表】 実験例 １ エンドトキシン量の測定 (1) 材料 (イ)IFN−γ （粗抽出液。参考例３(1)で得られ
た上清。以下の実験例において、「IFN−γ
（粗抽出液）」と称する。） (ロ)IFN−γ （本発明の抗体カラム精製品。参
考例３(3)で得られた精製標品。以下の実施例
において、「IFN−γ（抗体カラム精製品）」
と称する。） (ハ)IFN−γ （CPG−(2)溶出液。参考例３(4)
で得られた溶出液。以下の実験例において、
「IFN−γ（CPG−(2)溶出液）」と称する。） (2) 方法 各製剤中のエンドトキシンの定量を、岩永ら
の方法［ヘモスタホシス（Haemostasis）、７、
183（1987）］に従つて行なつた。 (3) 結果 結果を次の第５表に示す。 【表】 なお、用いられた緩衝液中ののエンドトキシン
量は、1.0nｇ／ml以下であつた。 実験例 ２ 発熱性物質試験 (1) 材料 (イ) IFN−γ （粗抽出液） (ロ) IFN−γ （抗体カラム精製品） (ハ) IFN−γ （CPG−(2)溶出液） (ニ) ウサギは、市川屋（東京）から購入した。 (2) 発熱性物質試験は、日本抗生物質医薬品基
準、厚生省、1982年に従つて行なつた。 (3) 結果 結果を次の第６表に示す。 【表】 注２ 緩衝液は、発熱性物質を含んでいないも
のを用いた。
(4) 結論 臨床適用量に相当するIFN−γをラビツトに
投与したところ、IFN−γ（粗抽出液）および
IFN−γ（CPG−(2)）溶出液）は発熱性物質が
混在するのに対し、IFN−γ（抗体カラム精製
品）は、発熱性物質試験において発熱性物質陰
性である。 実験例 ３ 細胞増殖抑制試験： (1) 材料 (イ) IFN−γ （粗抽出液） (ロ) IFN−γ （抗体カラム精製品） (ハ) IFN−γ （CPG−(2)溶出液） (2) 試験方法 IFN−γ精剤のインビトロにおける細胞増殖
抑制試験を、次の方法で行つた。 腫瘍細胞を細胞培養用フラスコに移し、種々
の濃度のIFN−γ含有標品をこれに加えた。こ
れらの細胞を細胞培養用皿に移し、４〜５時間
培養し、細胞を底につくまで培養した。培地を
IFN−γの種々の濃度を含むものに置き換え、
37℃５日間培養した。増殖抑制活性を、細胞の
増殖を減少させるために必要な濃度を50％とし
て表わした。 (3) 結果 結果を次の第７表に示した。 【表】

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１(1)Ａ(vii)で得られたプラスミド
PHIT3709の制限酵素地図を表わし、〓〓〓部分
はシグナルペプチドと考えられるペプチドをコー
ドする部分を示し、〓〓〓はＩ−IFNポリペプチ
ドをコードする部分を示す。第２図は実施例１(1)
Ａ(vii)で得られたPHIT3709プラスミドの一次構造
（塩基配列）を、第３図は実施例１(1)Ｂ(i)および
(ii)のptrp701およびptrp771、第４図は実施例１(1)
Ｂ(iii)のPHITtrp1101、第５図は実施例１(1)Ｂ(iv)の
PHITtrp2101の構築図をそれぞれ表わす。第６図
は実施例１で得たヒトγI−IFN蛋白質の電気泳動
の結果を、第７図は同蛋白質の分子量測定の結果
を示す。第８図は実施例２で得たトリプシン消化
ペプチドマツプを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 遺伝子組み換え技術により大腸菌形質転換体 から得られ、10⁷U／mg以上の比活性を有し、Ｈ
   −Lys−Arg−Lys−Arg−Ser−Gln−Met−Leu
   −Phe−Arg−Gly−Arg−Arg−Ala−Ser−Gln
   −OHに対するモノクロナール抗体と結合する、
   有効量のヒト免疫インターフエロン蛋白質と製剤
   学的に許容される担体、賦形剤もしくは希釈剤と
   を含有する抗ウイルス、抗腫瘍、細胞増殖抑制ま
   たは免疫増強剤。 ２ エンドトキシン含量が0.01％以下で、 発熱性物質陰性のヒト免疫インターフエロンを
   含有する注射剤である特許請求の範囲第１項記載
   の抗ウイルス、抗腫瘍、細胞増殖抑制または免疫
   増強剤。