JPS62175191A - インターロイキンの増収法 - Google Patents

インターロイキンの増収法

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JPS62175191A
JPS62175191A JP61045667A JP4566786A JPS62175191A JP S62175191 A JPS62175191 A JP S62175191A JP 61045667 A JP61045667 A JP 61045667A JP 4566786 A JP4566786 A JP 4566786A JP S62175191 A JPS62175191 A JP S62175191A
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ifn
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Kazuaki Kitano
北野　一昭
Shigeru Fujimoto
茂 藤本
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は蛋白質の増収法に関する。
従来の技術 ザイトカインやペプチドホルモンなど種々の生理活性蛋
白質の存在が明らかにされ、また近年の遺伝子工学技術
の進歩は、これら生理活性蛋白質の大量生産、臨床への
適用の途を開きつつある。
インターロイキン−２［以下Ｉ　Ｌ　−２と略称する。
なおＩ　Ｌ−２は、′■゛細胞増殖因子（ＴＣＧＩυと
も呼ばれる。］は、レクチンやアロ抗原等で刺激された
Ｔ細胞によって産生されるリンホカインである［サイエ
ンス、第１９３巻、　１０（１７頁（１９７６）Ｉ。
ＩＬ−２を利用して、これまでにキラーＴ細胞やヘルパ
ー′Ｆ細胞、さらにはナチュラルキラー細胞などのクロ
ーンが多数得られている［たとえば、ネイチャー、第２
６８巻、１５４頁（１９７７）］。このようなＴ細胞や
ナチュラルキラー細胞のクローン化という直接的用途の
ほかに、Ｔ　Ｌ−２を用いである特殊な抗原、たとえば
腫瘍抗原を認識し破壊する抗原特異的なキラーＴ岬胞を
インビトロで選択的に増殖させることができる。このよ
うにして増殖させた腫瘍特異的キラーＴ細胞を動物に移
入して腫瘍の増殖を抑制阻止することが可能である［ザ
・ジャーナル・オブ・イムノロジー、第１２５巻、　＋
９０４頁（１９ｆ３０）コ。
これらの実験事実はＩＬ〜２が抗腫瘍剤として用いられ
る可能性を示すものである。ｆ　Ｌ−２はまた、胸腺機
能を欠如しているヌードマウスのヘルパーＴ細胞機能を
回復させること［ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イ
ムノロノー２第１０巻。
７］９頁（１，９８［１）］や、同種細胞７こ対するキ
ラー７゛細胞の誘導を回復させろこと［ネイチャー、第
２８４巻。
２７８百（１９，８０）］が知られており、免疫機能低
下疾患への応用も期待できる。
また、インターフェロン−α　（以下、ＩＦＮ−αと略
記オる）およびインターフェロン−γ（以下、Ｉ　ＦＮ
−γと略記する）は、ウィルスや核酸によって活性化さ
れたリンパ球によって産生されろリンホカインであり、
細胞に作用してその細胞を抗ウイルス状態にするという
生物活性をもち、感染防禦系や腫傷免疫系において重要
な働きをしている。
これらザイトカインなど蛋白質は、天然物として得ろこ
とができるか、極めて限られた量である。
しかし近年遺伝子組換え技術の進歩によって、これら蛋
白質の遺伝子を組入れた発現ベクターを持つ大腸菌など
の培養物から生物学的に活性な蛋白質として取得てきる
途が開けたＩ　Ｉ　１．、−２　　ネイヂャー、第３０
２巻、３０５頁（＋９８３）ヌクレイツク・アノッズ・
リザーヂ、第１１巻、４３０７頁（１９８３）、ＩＦＮ
−α　ツヤ　ナル・才ブ・インターフェロン・リザーヂ
、第＋　ｙｌ、３８　］（］　９８１）、　ｒ　ｐＮ−
γ　ネイチャー１第２９５巻。
５０３頁（＋９８２）］。
発明が解決しようとする問題点 蛋白質の生合成は、真核生物、原核生物を問わ一４゛メ
ヂオニンに対応するメノセノノヤーＲＮＡ′：Ｊｌ：ン
ＡＵＧから開始されろために、生成されろ蛋白質にはＮ
末端にメチオニン残基をＮｉつ分子種と持たない分子種
の両者か存在する可能性かある。Ｔ］、ｉ実大腸閉にお
いて（Ｊ、多くの菌体蛋白のＮ末端がメチオニンであり
（コーン・スタンプ、アウトラインス・オブ・バイオケ
ミスｊ・リー、４版、ンヨン・ウィリー・アンド・ザン
ズ、　１９７６年）、又大腸菌のイニシェーション・フ
ァクターＩＦ−３にはＮ末端にメチオニン残基を持つ分
子種と持たない分子種の両者が存在すること［ホッペ・
ザイラー、ツァインコリフト・フェア・フィシオロジソ
シェ・ヘミ−９第３５４巻、　１４１５頁（］、９７３
）］などが知られている。又組換えＤＮＡ技術を用いて
大腸菌で製造される蛋白質に関しては、Ｎ末端へのメチ
オニン残基の付加率がＴＦＮ−αにおいて約５０％［ジ
ャーナル・才ブ・インターフェロン・リサーヂ、第１巻
、３８１頁（１９８１）］、ヒト成長ホルモンにおいて
１００％［ネイチャー、第２９３巻、４０８頁０９８１
）］にも達する事が知られている。しかし、これらのメ
チオニン残基の付加率を制御した例は今までのところ報
告されていない。
本発明者らはＴ＞２遺伝子を組入れた大腸菌を用いろＴ
　１．、−２蛋白質の製造法について研究中、大腸菌で
生産されろＩ　Ｌ　−２蛋白質には、Ｎ−末端にメチオ
ニン残基のないＩ　Ｌ−２、すなわちＮ末端アミノ酸が
アラニン残基から始まる分子種［ＡＩａ−ＩＬ−２］と
Ｎ末端にメチオニン残基の付加したメヂオニル・アラニ
ン残基から始まる分子種［Ｍｅｔ−Ａｌａ−ＩＬ−２］
の２種が混在しており、後者の量が前者に比べ著しく多
いことを見出した。
また同様に、大ｎＥｉｒ′Ａで生産されるＩＦＮ　　α
やｆＦＮ−γにおいても、それぞれＮ末端がシスティン
残基から始まる分子種［Ｃｙｓ　−Ｉ　ＦＮ−αおよび
Ｃｙｓ−ＩＦＮ−γ］にＮ末端にメチオニン残基の付加
したメヂオニル・システィン残基から始まる分子種［Ｍ
ｅｔ−Ｃｙｓ　−Ｔ　Ｆ　Ｎ　−ａおよびＭｅｔ−Ｃｙ
ｓ−ＩＦＮ−γ］が５〜５０％混在しているこ七を見い
出した。
Ｎ末端にメチオニン残基を有する蛋白質は、対応する天
然型蛋白質と同様の生物活性を示すと考えられているが
、異なる物質であり、従って天然型のアミノ酸配列を有
する蛋白質の製造法としては、必ずしも十分なものとは
いえない。
、Ｉ７″ｉ旺解旦μｋ」やμｍ千１λ 本発明は、翻訳開始コドンΔＴＧの下流に蛋白質の構造
遺伝子を含有する発現ベクターを有する大腸菌の培養に
より蛋白質を製造する方法において、当該大腸菌を（１
）鉄イオン源または（および）マンガンイオン源および
（２）天然物由来の窒素源を添加した培地で培養するこ
とを特徴とするＮ−末端に翻訳開始フトンＡＴＧに対応
するメチオニン残基のない蛋白質の増収法を提供ずろも
のである。
上記蛋白質としては、各種生理活性蛋白質が挙げられ、
例えば、インターフェロン（例、ＩＰ’Ｎ〜α、Ｉ　Ｆ
Ｎ−βｊ　ＦＮ−γなと）、インターロイキン（インタ
ーロイキン−１，ＩＦＮ２など）、Ｂ細胞増殖因子（Ｂ
ＧＦ）、Ｂ細胞分化因子（ＢＤＦ）、マクロファージ活
性化因子（ＭＡＦ）、リンホトキシン（ＬＴ）、腫瘍壊
死因子（ＴＮＦ）などのサイトカイン；トランスポーミ
ンググロースファクター（ＴＧＦ−α）：エリスロポエ
ヂン、上皮細胞増殖因子。
インスリン、ヒト成長ホルモンなどペプチド蛋白質ホル
モン：Ｂ型肝炎ウィルス抗原、インフルエンザ抗原１ロ
蹄疫ウイルス抗原、マラリア原虫抗原などの病原性微生
物抗原蛋白質；ペプチダーゼ（例、ティシコプラスミノ
ーゲン　アクチベーター、ウロキナーゼ、セラチオペプ
チダーゼなど）やリゾデームなどの酵素；ヒト血清アル
ブミン（Ｈ８Ａ）などの血中蛋白成分が挙げられる。
とりわけ、ＴＬ−２やＩＩ”Ｎ−αおよびＩＦＮ−γを
大腸菌の培養により製造する場合に本発明の方法は合判
に適用できる。
ここでＩＬ−２とは天然のヒトＩＬ−２と同様の生物学
的もしくは免疫学的活性例えばＩ　１．、−＝　２レセ
プターや抗ＩＬ−２抗体との結合能、を存するものであ
ればいずれでもよく、具体的には第１図で示されるアミ
ノ酸配列を有するポリペプチド（１）や、その生物学的
らしくは免疫学的活性に必要な一部分のアミノ酸配列か
らなるフラグメントてもよく、例えばポリペプチド（１
）のＮ末端から１個のアミノ酸（ＥＰＣ公開９１５３９
号公報）または４個のアミノ酸を欠くフラグメント（特
願昭５８−２３５６３８号（昭和５８年１２月１３日出
願）、該出願は特開昭６０−１２６０８８号として公開
されている、明細書参照）やＣ末端部分の数個のアミノ
酸を欠くフラグメントなどが挙げられ、さらに上記ポリ
ペプチド（１）の構成アミノ酸の−・部が欠損している
か他のアミノ酸に置換されたもの、例えば１２５位のシ
スティン残基がセリン残基に置換されたもの（特開昭５
９−９３０９３号公報）でもよい。これらのポリペプチ
ドは、非グリコジル化ポリペプチドであることが好まし
い。
ここでＩＦＮ−αとは天然のヒトＩＦＮ−αと同様の生
物学的もしくは免疫学的活性例えばＩＦＮ−αレセプタ
ーや抗ＩＦＮ−α抗体との結合能を有するものであれば
いずれでもよく、例えば第３図で示されるアミノ酸配列
を有するポリペプチド（ｎ）が挙げられる。さらにＩＰ
Ｎ−αの生物学的もしくは免疫学的活性に必要な一部分
のアミノ酸配列からなるフラグメントでもよく、たとえ
ばポリペプチド（ｎ）のＮ末端部分の数個のアミノ酸を
欠くフラグメントやＣ末端部分の数個のアミノ酸を欠く
フラグメントなどが挙げられ、さらに上記ポリペプチド
（ＴＩ）の構成アミノ酸の一部が欠損しているか他のア
ミノ酸に置換されたものでもよい。とりわけＩＦＮ−α
Ａが好ましい。
ここでＩＦＮ−γとは天然のヒトＩＦ’Ｎ−γと同様の
生物学的もしくは免疫学的活性例えばＩＦＮ−γレセプ
ターや抗Ｉ　Ｐ’Ｎ−γ抗体との結合能を有するもので
あればいずれでもよく、例えば第４図で示される１４６
個のアミノ酸からなるポリペプチド（ＩＩＩ）やポリペ
プチド（ＩＩＩ）の種々のフラグメントが挙げられる。
種々のフラグメントとしては、例えばポリペプチド（Ｉ
Ｉ［）のＮ末端部分の４個以下のアミノ酸が欠落したＮ
末端部欠落分子種やポリペプチド（ＩＩＩ）もしくはＮ
末端欠落分子種の第１３１番アミノ酸残基以降の部位で
切断されたＣ末端部欠落分子種などが挙げられる。さら
に上記ＩＦ’Ｎ−γは上記ポリペプチドのシスティン残
基がセリンもしくはスレオニンに置換されたものでもよ
い。とりわけポリペプチド（ＩＩＩ）か好ましい。
蛋白質の構造遺伝子としては、上記蛋白質のアミノ酸配
列をコードするＤＮＡであれば、天然由来のまたは合成
によるＤＮＡのいずれでもよい。
例えば、ＩＬ−２については第１図で示されるアミノ酸
配列をコードする第２図で示される塩基配列を有するＤ
ＮＡ（ＩＶ）が、ＩＦＮ−αについては第３図で示され
るアミノ酸配列（ＩＦＮ−αＡ）をコードするＤＮＡ（
Ｖ：例えば特開昭５７一７９８９７号公報）が、ＩＦＮ
−γについては第４図で示されろアミノ酸配列をコード
するＩ）　Ｎ　Ａ（■例えば特開昭５８、−、、１８９
１９７号公報）が挙げられろ。
１−組構造遺伝子（ＤＮＡ、）は翻訳開始コドンＡ　Ｔ
Ｇの下流に存在するが、該遺伝子ＬＩ　Ａ　’Ｉ’　Ｇ
に直結してその下流にｒ７：在してもよく、またＡＴＧ
と該遺伝子の間に発現されないスペーサーもしくは他の
構造遺伝子が介在していてもよい。とりわ＋′ＩΔＴ　
Ｇ　ｈ　ｊ、゛、ｉ凸遺伝ｒか直結しているのが好まし
い。
ヒ記遺伝子（１）Ｎ△）は、その」−流にプロモーター
を有していることか好ましく、該プロモーターとしては
、λファージの増殖に関与ずろλＰ１．。
λＰＲプロモーター、トリプトファノ（ｔｒｐ）プ〔フ
モーター、ラクトース（ｌａｃ）プロモーター２蛋白質
鎖伸長因子Ｔｕ（ｔｕｆ　Ｂ）プロモーター、　ｒｅｃ
　Ａプロモーター、などのいずれを用いたちのであって
もよい。
とりわけ、λＰＩ、およびｔｒｐプロモーターは本発明
において有利にイ吏用することができろ。
」二足遺伝−ｒおよびプロモーターは、通常ベクターに
組込まれ発現ベクターとして使用されろ。該ベクターの
製造のためのプラスミドとして、例んばＣｏ１Ｅ　ｌ由
来のｐＲＲ？、２２［ノーン、第２ａ、９５頁（１９７
７）ｉｔか最もよく利用されろか、その他のプラスミド
てあ−・てム、大腸菌内て複製保持されろ乙のであれば
゛、いずれも用いろことかできろ。その例としては、ｐ
ＢＲ３１３［レーン、第２巻、７５頁（１，９７７）］
。
ｐＢＲ３２／ｌ、　ｐＢＲ３２５［ジーン、第４巻、１
２１頁（１９７８）］　。
ｐＩＩＲ３２７，ｐＢＲ３２ｇ［ジーン、第９巻、２８
７頁（１９８０）］。
ｐＫＹ２２８９ｒジーン、第３巻１１頁（＋９７８）１
．　ｐＫＹ２７ＧＯ［生化学、第５２巻、７７０頁（１
，９８０）］、　１）ＡＣＹＣｌ、７７およびｐＡｃＹ
ｃ１８４ｒジャーナル・オブ・バクテリオ〔ノン−９第
１３４巻、１１．４１頁（１，９７８）］、　１）ＲＫ
２４８．　ｌ）Ｉ髪に６４６．　ｐｉ）Ｆ４］ｉ−メソ
ソズ・イン・エンジーモ［ｌンー、第６８巻。
２６８真（１，９７９）］などが挙げられろ。
また、バクテリオファージ、たとえはえファージを使用
したλｇｔ系のλｇ［・λＣ［プロソーンングオブナノ
ヨナルアカデミーオブザイエンスＵＳＡ　、第７１在、
　４５７９頁（１９７４）］、　　λｇｔ・λ＋＋１同
誌第７２巻、３４＋６頁（１，９７５）］、　　λＤａ
ｍ［ジーン１第１Ｌ２５５頁（１９７７）１やンヤロン
ヘクター［サイエンス、第１９６巻、１６１頁（１９７
７）　；　ジャーナル・オブ・ピロロン−９第２９巻、
５５５頁（１，９７９）］、繊紹、状ファージを使用し
たベクターなども発現ベクタ″−として使用可能である
。
」二記発現ヘクターの構築は、公知の方法に従って行な
えばよい［例えば、ネイチャー、第３０２巻。
３０５頁（１，９８３）、ヌクレイツク・アシッズ・リ
ザーヂ、第１１巻、　４３０７Ｎ（１９８３）、特開昭
５７−７９８９７号公報、特開昭５８−１８９１９７号
公報］。
蛋白質の構造遺伝子を組入れた発現プラスミドを導入す
る宿主菌としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｌ＋１ａ
ｃｏｌｉ　＝Ｆ、、　ｃｏｌｉ）が用いられろが、なか
でも大腸菌に一１２株由来のちのが、取扱い、安全性の
面から特に好ましい。該大腸菌に一１２株由来のものと
しては２９４株、ＲＲ−１株、ＤＨ−１株、Ｎ　４８３
０株。
Ｃ−４株などが有利に用いられる。
２９４株は公知菌株であり［プロシープインク・オブ・
ナノヨナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・ＩＪｓＡ
第７３巻、　４１．７４頁（１，９７６）］、又財団法
人発酵研究所（ＴＰＯ）にＩＦＯ−１４，１７１として
寄託もされている。
ＲＲ−１株はジーン、第２巻、７５頁（１１）７７）に
、ＤＩ−１１株はネイチャー第２１７巻、１１．１０頁
（１９６８）に、Ｎ４８３０株はセル、第２５巻、７１
３頁（１９８］−）に記載されている。Ｎ４８３（１株
は温度感受性Ｃ１リプレツザーを宿主中に持っているた
め、発現プロモーターとしてλ円、を用いろ際には特に
有用でありファーマンア＋１−１、ビオケミカル社より
入手可能である。
Ｃ−４株は本願出願人によりＩＦＯにＩ　Ｆ　Ｏ−１４
、４，２１として、昭和６０年２月１６日からＦＲｌに
Ｆ’ＥＲＭ　　Ｂｌ）−９６６として寄託されている。
本発明で使用する大腸菌は、宿主大腸菌を蛋白質の構造
遺伝子発現ベクターで形質転換ずろことにより製造でき
、形質転換は、例えばンヤー→−ル・オブ・モレキュラ
ー・バイオロジー、第５３巻。
１．５９頁（１，９７０）　、メソッズ・イン・エンジ
モロンー。
第６８在、２５３頁（＋９７９）、ノーン、第３へ、２
７９頁（＋９７８）。
プロンージング・オブ・ナンヨナル・アカデミ−・オブ
・ザイエンス・ｔｌｓＡ　、第６９巻、２１１０頁（１
９７２）などに記載されている手段によって行うことが
できる。
本発明においては、」二足大腸菌を鉄イオン源または（
および）マンガンイオン源を添加した培地で培養する。
培地に添加する鉄イオン源およびマンガンイオン源に関
し、鉄イオン源とは、溶液にしたとき？こ鉄イオンとな
る物質あるいは鉄イオンの形で利用される物質をいい、
例えば鉄の塩が挙げられる。
好ましくは２価もしくは３価の鉄の無機塩（例、塩化第
１鉄、塩化第２鉄、硫酸第１鉄、硫酸第２鉄。
リン酸第２鉄、硝酸第２鉄など）であり、とりわけ３価
の鉄の鉱酸塩（例、塩化第２鉄、硫酸第２鉄など）が好
ましい。
マンガンイオン源とは、溶液にしたときマンガンイオン
となる物質あるいはマンガンイオンの形で利用される物
質をいい、例えばマンガンの塩が挙げられろ。好ましく
はマンガンの無機塩（例、硫酸マンガン、塩化マンガン
、炭酸マンガン、リン酸マンガンなと）であり、とりイ
つげマンガンの鉱酸塩（例、硫酸マンガン、塩化マンガ
ンなど）が好ましい。
鉄イオン源およびマンガンイオン源は、それぞれ単独で
または併用して添加ずろが、これらの水溶液で添加する
のが好ましい。
鉄イオン源およびマンガンイオン源はそれぞれ１０−６
〜１０′−１モル、好ましくは２　Ｘ　ｌｏ−５〜５Ｘ
ＩＯ−’モル添加するのがよく、これらを併用する場合
は、それぞれ上記濃度範囲で加える。
上記大腸菌の培養のための天然物由来の窒素源を添加し
た培地とは、公知の基礎培地に、カザミノ酸、ペプトン
、イーストエキス、麦芽エキスなと天然物から得られる
窒素源を添加した培地をいう。
これら本発明に用いられる培地の組成の一例を第１表に
例示する。
本発明の増収法は、酸性で、例えばｐＨ４，８〜６０に
調整した培地に接種し、当該ｐＨ範囲を維持しつつ生育
させることにより培養することによつでも行うこ七がで
きる。とりわけｔｒｐプロモーターを保持する大腸菌に
おいて上記方法は有利に適用できる。上記ｐＨは５．０
〜５．８、とりわけＩ）Ｈ５，５付近に調整することが
好ましい。なお、生育が十分達成された後は、上記１）
Ｈ領域外、例えばより酸性側で培養してもよい。所望に
よりＩ）Ｈ調整を行う場合は培地を作製し滅菌する前ま
たは後に無機塩基または鉱酸を用いて行い、大腸菌を接
種後生胃中、さらに所定のｐＨ領域を維持する□ために
ｐＨ調整を行う。
通常培養により１）Ｉ−１は低下するので塩基性物質、
例えばアンモニア、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム
など無機塩基を添加することにより行うが、所望により
硫酸などの鉱酸を添加することもできる。とりわけアン
モニア水が好ましく、アンモニアを用いる場合は、培地
の窒素源ともなりうる。
また、たとえばｔｒｐプロモーターを使用した組換え体
では、プロモーターを効率よく働かせるために、例えば
３−β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えるこ
とも出来る。
＝１６− さらに宿主菌が栄養要求性を示す場合には、たとえば要
求するアミノ酸（例、Ｌ−リジン、１、−アルギニン、
Ｌ−メチオニン、Ｌ−ロイシン、Ｉ、−プロリン、し−
イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−）リプトファンなど）
を約１０ないしｌｏｏＯｍｇ／の割合で適宜添加するこ
とが好ましい。
第１表　使用されろ培地の例 グルコース　　　１０ｇ／σ　　　ｌｏｇ／ｆ２　　１
０ｇ／ＱＮａ、ＨＰｏ、　　　　　　６ｇ／Ｑ３ｇ＃！
　　　　−Ｋｌ（、ＰＯ４３ｇ／ｆ２　　　３ｇ＃！　
　　３ｇ＃！ＮａＣｌ　　　　　　０．５ｇ／ρ　　０
．５ｇ／ρ　０．５ｇ／ρＮｌｌ、Ｃ＋　　　　　　　
Ｉｇ＃！　　　　Ｉｇ／１１！　　　Ｉｇ＃！Ｍｇ５Ｏ
，・７１１２０　０．３４ｇ／Ｑ０．３４ｇ／（２０，
３４ｇ／１２又培養中必要に応じて、グルコースやカザ
ミノ酸などの成分を追加することも可能である。さらに
組換え大腸菌を選択的に増殖させるために、プラスミト
中に保持されている薬剤耐性等の遺伝子に応じて、耐性
を示す薬剤（テトラザイクリンなど）を添加してもよい
。
−１−記した鉄イオン源また（Ｊマンガンイオン源は、
通常本培養の培地にあらかしめ所定の濃度で添加するが
、種培養の培地にも添加することができろ。
培養は通常１５〜４５６Ｃで行われる。たとえばλＰＲ
またはλ円４プロモーター保持株では２５〜３５℃で増
殖させたのち４２℃付近ヘシフＩ・アップさせる事によ
り遺伝子を有利に発現させる。その他のプロモーター保
持株では生育開始からその半ばまで３７°Ｃ付近に保ち
、増殖するにつれて温度を下げ２０〜３０°Ｃに保つこ
とにより高い生産性を得ろ事が出来ろ。
培養は、通常、通気攪拌培養によって行われる。
培地中の酸素濃度を飽和酸素濃度の約５％（Ｖ／Ｖ）以
１−になるように保ちつ−）培養を行なうと、目的とオ
ろ蛋白質の生産車が増大されるので有利である。このた
めに、培養途中に純酸素を空気と混合して通気すること
も効果的である。
かくして生成されろ蛋白質は公知の方法に５Ｊ−って測
定することかできろ。
例えばＩ　Ｌ−２の測定にはＥ　Ｌ　−２依存性細胞株
を用いろことかできるが、ヒｌ−Ｉ　Ｌ　−２（Ｊヒト
以外にラッ１−およびマウスなどのＩ　Ｌ　、、−、−
２依存性細胞の増殖をも促進ずろことか知られている［
イムノロジカル・レビュー、第５１巻、２５ｒ頁（１９
８０）］ので、ｌ　Ｌ　−２依存性ヒＩ・細胞株のめな
らずラッＩ・またはマウスのＩ　ｎ、　−２依存性細胞
株を用いることかできろ［ジャーナル・オブ・イムノロ
ン−１第１３０巻、９８１頁および９８８頁（＋９８３
）］。
特にマウスの１．　Ｌ　−２依存性細胞株（ｊ１長ｊυ
ｊ間安定に継代維持され得るので再現性の高し）測定結
果が得られる。
本明細占において全１１．−２の生産；賃は、Ｉ　Ｌ−
２依存性マウス細胞を用いて放ＩＪ＝Ｉ性デミノンの取
込みを指標とｌ−ろ方法［バイオケミカル・バイオフィ
ジカル・リザーヂ・コミュニケイノヨンズ。
第１０９巻、３６３頁（１，９８２）］によって測定し
た。
Δ１ａ−ＩＬ−２の生産型は、菌体からＩ　Ｌ−２を７
Ｍ−塩酸グアニジンで抽出した後透析し、後述するＦＰ
ＬＣ（Ｐａｓｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈ
ｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）に付してＡｌａ−ＩＬ−２
画分とＭｅｔ−Ａｌａ−ＩＬ−２画分を分離し、両両分
のＩＬ−２活性を上述の方法で求め、Ａｌａ−ＩＬ−２
の生成比率を算出し、全Ｉ　Ｌ−２生産量にこの比率を
乗する事によって求めた。
精製標品については、ＦＰＬＣ法で分離される蛋白質の
２８０頁ｍ吸光度の比率より求めた。
また、ＩＦＮは抗ウイルスアッセイ法［ジャーナル・オ
ブ・ヒロロジー７第３７巻、７５５ｍ（＋９８＋）］又
はエンザイム・イムノアッセイ法［ジャーナル・オブ・
イムノロジカル・メソソズ。
第８０巻、５５頁（１９８５）］によって測定されろ。
生成されるＩＦＮ中のＮ末端メヂオニン付着ＩＦＮの割
合は菌体より所定の方法で抽出。
精製したＩＦＮ蛋白について、たとえばＩＦＮ−αＡの
場合には精製標品をＦ　Ｐ　Ｌ　Ｃ法でＮ末端メヂオニ
ン付着分子種と非付着分子種を分離しその一２８０ｎ吸
光度の比率より求めた。■ＦＮ−γの場合には、グンノ
ル化法又はペブヂトノーケノザーによってＮ末端メヂオ
：−ン含量を求めろことにより算出した。
本発明で製造されろ蛋白質を倍径菌体から抽出ずろに際
しては、培養後、公知の方法で菌体を集め、菌体を塩酸
グアニジンなどの蛋白質変性剤を含む緩衝液に懸濁し、
冷所て攪拌したのち、遠心分離により蛋白質を含む上澄
液を得ろ方法、あるいは緩衝液に懸濁し、超音波処理、
リゾデームおよび（または）凍結融解によって１泊体を
破壊したのち、遠心分離により蛋白質を含む上澄液を得
る方法などが適宜用い得る。
−１−記」二層液から蛋白質を分離、精製オろには、自
体公知の分離、精製法を適切に組み合わせて行うことが
できる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や
溶媒沈澱法などの溶解度を利用上る方法、透析法、限外
ろ適法、ゲルろ適法およびＳｌ）　Ｓ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法なとの主として分子蚤の差を利用ず
ろ方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差
を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーな
どの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマ
トグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法。
等重点電気泳動法などの等重点の差を利用する方法など
が挙げられる。特に、ヒトＩＬ−２蛋白質は高い疎水性
を有しているので、疎水性カラムクロマトクラフィーと
りわけ逆相系カラムを用いる高速液体クロマトグラフィ
ーは該蛋白質の精製に極めて有効である。またＩＦＮ−
αおよびＩＦＮ−γにおいては、それぞれのＩＦＮに特
異的な結合能を有するモノクローナル抗体を用いろ精製
方法は極めて有効である。
上記ＩＬ−２蛋白質が、Ａｌａ−ＩＬ−２とＭｅｔ−八
Ｉａ−ＩＬ−２の混合物である場合、所望により例えば
本願出願人が既に出願したＰＣＴ／ＪＰ８４１００４６
０（国際出願臼。
１９８４年９月２６日）に開示した等電点の差異に基づ
く分離手段によりＡｌａ−ＩＬ−２を単離することがで
きろ。
すなわち等電点の差異に基づく分離手段とじては、等電
点の差かＯ吋〜０．２程度である蛋白質を相互に分離す
る方法であればどんなものでも適用でき、たとえばアン
ポラインを利用ケる密度勾配等重点電気泳動、ゲル等電
点電気泳動法１笠速度電気泳動法なとの電場の中で蛋白
質を泳動さＵ゛る方法やクロマトポーカンフグ法、　Ｆ
ＰＬＣ法（ＦａｓｔＰｒｏｔｅｉｎ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃ
ｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、ＤＥΔＩＥ（ｄｉｅＬ
ｈｙｌ−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）−およびＣＭ　（ｃａ
ｒｂｏｘｙｍｃｔｈｙｌ）−ｐＨ勾配イオン交換カラム
クロマトグラフ法などのカラム中にｐＨ勾配を作成して
担体から蛋白質を順に脱離して溶出させる方法など自体
公知の方法やこれらを組合せた方法などが挙げられろ。
これらの分離法に用いられる試薬および器具類はいずれ
ら市販されているものであり容易に入手ｉ’ｉＪ能−ζ
♂うろ。
また所望により、Ｃｙｓ、−ＩＦＮ−ａとＭｅｔ−Ｃｌ
３−ＩＦＮ−αの混合物においても、」−記聞様にして
相互に分離することができろ。
かくして精製されるＮ末端に翻訳開始コドンΔＴＧに対
応するメチオニン残基のない蛋白質は、それぞれ天然の
蛋白質など公知の蛋白質と同様の一２３＝ 生理活性を有し、医薬品等として使用することができる
。
Ａｌａ−１１、−２蛋白質は公知の！Ｌ−２と同様に、
たとえば腫瘍抗原を認識し、破壊する抗原特異的なキラ
ーＴ細胞や抗原感作の経験の有無と無関係に腫瘍を殺す
能力をもつところのナチュラルキラー細胞をインビトロ
で選択的に増殖させることができ、またこのキラーＴ細
胞を生体へ移入する際に、該ＩＬ−２を同時に接種する
ことにより、その抗腫瘍効果を増大させることから、温
血動物（例、マウス、ラット、ウサギ、犬、ネコ、ブタ
、ウマ、ヒツジ、ウン、ヒトなど）の腫瘍の予防、治療
や免疫機能低下疾患の治療のために用いることができる
。
」二足Ａｌａ−ＩＬ−２蛋白質を腫瘍の予防、治療剤と
して用いるには、当該蛋白質を自体公知の担体と混合稀
釈して、たとえば注射剤、カプセル剤などとして非経口
的にまたは経口的に投与することができろ。さらに、前
述したようにインビトロで増殖させたキラーＴ細胞やナ
チュラルキラー細胞と共にまたは単独で使用することが
できる。
また上記Δ１ａ−ＩＬ−２蛋白質は、公知の天然から分
離されたヒトＩ　Ｌ−２と実質的に同じ生物活性を有す
るのでこれと同様に使用することができ、細胞のＩＬ−
２受容体との解離定数かきわめて小さいことから、極く
小量の投与で良い。
ＩＦＮは、抗ウィルス作用、抗腫瘍作用、細胞増殖阻害
作用、免疫増強作用などを有するので、哺乳動物（例、
ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、マウス、う・ソト）などのウ
ィルス感染症、腫瘍などの治療に用いろことができる。
たとえば、該ＩＦＮを抗ウィルス剤、抗腫瘍剤、細胞増
殖阻害剤、免疫増強剤として用いるには、ＩＦＮを自体
公知の薬理的に許容しうる担体、賦形剤、希釈剤なとと
混合して、注射剤として非経口的に静脈注射又は筋肉注
射などにより投与する。その投与量は正常人１日当り約
１０万ないし１億単位好ましくは約１００万ないし５０
００万単位である。また、」−記ヒト以外の哺乳動物に
対しての投与量は、２０００ないし２００万単位／　ｋ
ｇ／日、さらに好ましくは約２万ないし１００万単位／
　ｋｇ／日である。
忙用湛夫μｍ害痰列 以下に実施例および参考例を挙げて本発明を更により具
体的に説明する。
なお実施例中に開示する形質転換体につき通商産業省工
業技術院微生物工業技術研究所（Ｆｌｉｔ）および口４
回状人発酵研究所（ＩＦＯ）にそれぞれ第２表に示す寄
託番号で寄託されている。
第２表 実施例１ 参考例１（ｉｉ）で得たＥ、ｃｏｌｔ　Ｎ４８３０／ｐ
ＴＢ２８５をＩ７培地（ハクｌ−）リプトン１．Ｏｇ／
Ｌ　バクトイ−ストエキス５ｇ／Ｌ食塩５ｇ／ρ）にア
ンピシリンナトリウム５０ｍｇ／（！、およびテトラザ
イクリン塩酸１５ｍｉ！／夕を添加した培地５０ｍ１に
接種し、３７℃−夜回転１辰帰培養した。この培養液を
修正Ｍ−９培地２．５Ｑ宛分Ｌ１ニジ、第３表に示す各
種金属塩を添加した５０容ツヤ−ファーメンタ−に移し
、通気量２５り／分、栂拌１１０００ｒｐ　、温度３０
℃で培養を開始した。途中生育が１０００りＬ／　ソｈ
　１位１：ａ　Ｌ　タ１ｌＨ２°Ｃヘ／Ａ！ｒ　度ヲｌ
：／　’）　ｌ”　−ｆ　ツブし更に４時間培養を続け
た後、集菌凍結した１、夫々の凍結菌体についてΔ１ａ
−１１．．−２の生産性を調へ第３表の結果を得た。
（以下余白） 添加金属イ、ｔ　７”（モル）　　　　　　　　ΔＩａ
−ＩＬ−２０　　　　Ｑ　　　　０　　　０　　　０　
　　０　　１００４ＸＩＯ−５４ＸＩＯ’　２Ｘ１０−
５３Ｘ１０−５７Ｘ１０−５２Ｘ］０−５５００４ＸＩ
Ｏ−５０００００４７０ ０４ｘｌＦ’０　　　０　　　０　　　０　　３２０刈
各金属イオンは下記の化合物で夫々添加した。
ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ２０，ＦｅＣｌ３・６Ｈ７Ｏ，Ｃ
ｕＳＯ４・５Ｈ７Ｏ。
ＺｎＳＯ４・７ＨｐＯ。
ＣａＣＬ　・２ＨｐＯ，ＣＯＣｌ２　”　６１１２０×
２金属イオン無添加を１００とした時の相対値で示した
。
第３表から明らかなとおり、Ｍｎ”十または（および）
　ｐ　ｅ　４　＋＋を添加するとΔ］、ａｌＬ−２生産
性か著しく向上したにもかかわらず、他の金属イオン源
（ＣＵ＋＋。
Ｚｎ”、　Ｃａ”、　Ｃｏ”）を添加しても何等生産性
か向上しなかった。
実施例２ 実施例Ｉと同様にして種々の濃度のＭｎイオンを添加し
たＭ−３３培地にてＥ、ｃｏｌｉ　Ｎ４８３０／ｐＴＢ
２８５株を培養し、第４表に示す結果を得た。
第４表　マンガンイオンの添加効果 ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ２０（モル）　　Ａｌａ−１１、
−２生産性８２Ｘ　ｔｏ−５３１０ ４ＸｌＯ−’　　　　　　　　　４９０８Ｘ　１０−５
６００ ２　Ｘ　１０”−’　　　　　　　　　３６０８無添加
培地での生産性を１００とした。
実施例３ 実施例Ｉと同様にして種々の濃度のＦｅイオンを添加し
たト３３培地にてＥ、ｃｏｌｉ　Ｎ４８３０／＋）Ｔ８
２８５株を培養し第５表の結果を得た。
ＦｅＣｌ３’　６Ｈ９０（モル）　　　ΔＩａ−ＩＬ−
２生産性８７Ｘ　ＩＦ５３７０ ４ｘｌＯ−’　　　　　　　　　４１０ゞ無添加培地で
の生産性を１００とした。
実施例４ 形質転換体Ｅ、ｃ○Ｉｉ　ＤＨＩ／ｐＴＦ４　［特願昭
５８−２２５０７９号（昭和５８年１１月２８０出願）
、該出願は特開昭６０−１１５５２８号として公開され
ている、実施例３］をＬ培地に７　ｍｇ／　　のテトラ
ザイクリンリン塩酸を添加した液体培地（ｐ＋１７．０
）５０ｍｌに接種し、３７℃で一夜回転振盪培養した。
この培養液を修正Ｍ−９培地２５　及び同培地にＦｅＣ
１，・６Ｈ２０４Ｘ　１０−’モル、　ＭｎＳＯ４・４
−６Ｈ７０４Ｘ１０−５モルを添加した培地２５　を仕
込んた５　容ツヤ−ファーメンタ−に接種し、通気量２
５７分。
攪拌１０００　ｒｐｍ、温度３７℃で培養を開始した。
途中生育が約５００クレツト単位に達した時に３０℃へ
、約１０００クレツト単位に達したときに２５℃へ温度
を変更Ｉ７．２４時間培養した。集菌、凍結しノコ菌体
よりＩ　Ｌ−２を抽出し、Ａｌａ−１ｆ−２の生産性を
調へ第６表の結果を得た。
第６表 金属イオン（モル）　　　ＡｌａｉＬ−２生産性′Ｍｎ
”　　　Ｆｅ”＋４ ［）　　　　　　　０　　　　　　　　　　　１．００
４ＸＩＯ−５４ＸＩＯ−’　　　　　　２３０８金属塩
無添加培地での生産性を１００とした。
実施例５ Ｉｌ、　ｃｏｌｉ　Ｎ４８３０／ｐＴＢ２８５を２５０
ｍ１容三角フラスコ内のし一培地にアンピッリン・すト
リウム５０ｍｇ／を含む液体培地（ｐｉｆ　７．０）５
（１ｍｌ　６本に接種して３０°Ｃで一晩回転振盪培養
した。この培養液を（八）アンピシリン・ナトリウム５
０ｍｇ／　　を含むＭ−３３培地２５　および（Ｂ）ア
ンピノリン・ナトリウ１＼５ｏｍｇ／　。
Ｍｎ５Ｏ，−４〜６Ｎ、０　８ｘｌＦ５モルおｊ−びｐ
Ｏｃ］ａ・６Ｈ７０４Ｘ］Ｏ−’モルを含むＭ　−３３
培地２５　に夫々１２５ｍ１づつ接種し、通気量２．５
　／ｍｉｎ。
＝３１− 攪拌１１０００ｒｐ、温度３０℃で培養を開始し、途中
ｐｎはアンモニア水て６５に保った。また、グルコース
濃度が０５％以下になったときに、グルコースおよびカ
ザミノ酸を夫々１％づつ添加した。さらに、生育が１０
（１（ｌクレット単位に達したときに４２℃へ温度を変
更し、変更後４時間目に培養を終了し、得られた培養液
を夫々遠心分離し、菌体を集め一８０°Ｃて凍結して保
存した。
得られた凍結菌体夫々１．２ｇを７Ｍ塩酸グアニジン０
、１Ｍ　Ｔｒｉｓ−１１ＣＩを含む抽出液ｃｐＨ７，０
）１．ＯＱｍｌに均一に懸澗し、４℃て１時間攪拌した
後、２８．ＯＯＯｘｇで２０分間遠心分離し上清を得た
。
得られた夫々の」−清を０．０１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
緩衝液（ｐｔｌ　８．５）に対して透析後１９，０００
ｘｇで１０分間遠心分離して得た上清を０．ＯＩＭ　Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液（ｐｉｆ８．５）で平衡化したＤ
Ｅ５２（ＤＥＡＥ−セルロース、ワットマン社製、イギ
リス）カラム（５０ｍｌ容）に通して蛋白を吸着後、Ｎ
ａＣ１濃度直線勾配（０−０，１５Ｍ　ＮａＣ１，１）
を作成して、Ｔ　Ｉ、−２を溶出させ、活性画分を夫々
得た。
旧記で得られた活性画分をＹＭ−５メンプラン（アミコ
ン社製、アメリカ）を用いて、夫々的５ｍｌに濃縮し、
Ｏ，１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）−１Ｍ　Ｎ
ａＣ１ｆｆＵ衝液で平衡化したセファクリルＳ−２００
（ファルマシア製。
スウェーデン）カラ１＼（５００ｍｌ容）を用いてゲル
ろ過を行った。活性画分夫々的３０ｍ１をＹＭ５メンプ
ランで夫々的２．５ｍｌに濃縮した。得られたａ輸液を
、ウルトラボアＲＰＳＣ（アルテックス社製、アメリカ
）カラムに吸着させ、トリフルオロ酢酸−アセＩ・ニト
リル系を溶出溶媒とする高速液体クロマトクラフィーを
行った。カラム、ウルトラボアＲＰＳＣ（４、６ｘ　７
５ｍｍ）　：カラム温度、３０°Ｃ：溶出溶媒Ａ、０１
％トリフルオロ酢酸−９９，９％水、溶出溶媒Ｂ、０１
％トリフルオロ酢酸−９９９％アセトニトリル、溶出プ
ログラム、０分（６８％Δ＋３２％Ｂ）−２５分（５５
％八」４５％Ｂ）−３５分（４５％Ａ＋５５％Ｂ）−４
５分（３０％Ａ＋７０％Ｂ）＝４８分（１００％Ｂ）；
溶出速度、　０．８ｍｌ／ｍｉｎ：検出波長、　２３０
ｎｍ０ 本条件下で保持時間約３９分の活性画分、夫々的１０ｍ
１を集めた。
かくして得られたΔ１ａ−ＩＬ−２および１１１ｅｔ−
Ａｌａ−ＩＩ、−２の混合物を含む液を凍結乾燥後、０
．００５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５，０）夫々
５ｍｌに溶解後、０．０２５Ｍジェタノールアミン−塩
酸緩衝液（ｐＨ９，４）で平衡化したＦＩ’ＬＣ用モノ
Ｐカラム（０，５ｘ　２０ｃｍ、ファルマシア製）にの
せ、ついで１％（Ｖ／Ｖ）ファルマライト（８−１０，
５）−５，２％（Ｖ、／Ｖ）ポリバッファー９６−塩酸
緩衝液（ｐｔ１８．０）を用いてモノＰカラムに吸着し
たタンパク質を溶出した。なお、ＦＰＬＣは室温下、流
速３０ｍ１／ｈておこなった。溶出容量１７〜１９ｍ１
の活性画分を夫々分取後、ポリバッファーを除去ずろた
め・、トリフルオロ酢酸−アセトニトリル系を溶出溶媒
とする高速液体クロマトグラフィーを行った：カラム、
ウルトラボアＲＰＳＣ（１，ＯＸ　２５ｃｍ、アルテン
クス社製）；カラム温度２溶出溶媒Ａ、　Ｂは前記とお
なじ；溶出プログラム、０分（５５％Ａ＋４５％Ｂ）−
４分（５５％Ａ＋４５％Ｂ）−２８分（４２％Ａ＋５８
％Ｂ）−３８分（３４％Δ＋６６％Ｂ）−４３分（２０
％Ａ＋８０％Ｂ）−４４分（５５％Ａ＋４５％Ｂ）：溶
出速度３．０ｍｌ／ｍｉｎ。
得られたΔＩａ−１１．−２画分、夫々を凍結乾燥に付
し、白色粉末を７１また。
金属塩無添加の培地（Ａ）から（−Ｉられた上記粉末量
ｔｅｌ：　ｌ　、　５：（ｍｇてあろのに対し、金属塩
添加培地（Ｂ）からＬＪ：６．３１ｍｇの粉末がｉＷら
れた。
ごれら２つの標品について、気相ブ［ｌティンノークエ
ンザー（アプライド・ハイオノステムズ社製４７０Ａ型
）を用い、自動エドマン分解法によりＮ末端アミノ酸の
同定をおこなったところ、夫々９８％以−１−がＡｌａ
であることが確認された。また他の蛋白化学的諸性質（
Ｃ末端アミノ酸、アミノ酸組成分析、ペプヂッドマソピ
ンク）は全く同一であること乙あわせて確認された。
実施例６ 第３図に示すアミノ酸配列をコードオろヒｌ−ＩＦＮ−
αΔ遺伝子を組入れた発現プラスミドを１−８ｊツＥ、
　ｃｏｌｉ２９４　（ＡＴ　ＣＣ３１４４６）／ＩＩＩ
Ｌ（！　Ｉ　Ｆ−Ａ−ｔｒｐ　２５株［ＥＰＣ公開第４
３９８０号公報実施例Ｉ参照］を１７培地にテトラザイ
クリン塩酸５ｍｇ／ｉ！を添加した培地５０減に接種し
、３７°Ｃ−夜回転振盪培養した。この培養液を修正Ｍ
　−、、−９３５−一 培地２．５ρ宛分注し、第７表に示す各種金属塩を添加
した５ｇ容レジャーファーメンタ−移し、通気量２５ρ
／分、攪拌１０００ｒｐｍ、温度３７℃で培養を開始し
、生育５００クレット単位で３０’Ｃへ、生育１０００
クレツト単位で２５°Ｃへ温度を下げ２４時間培養した
。途中グルコース濃度が０２％以下になった時グルコー
スを１％宛添加した。培養終了後、夫々の培養液を遠心
分離にかけ菌体を集め、ＩＯ％ンコクロース、０．２Ｍ
　ＮａＣ１，Ｉ　ＯｍＭエヂレンノアミンテトラアセテ
ート（ＥＤＴＡ）。
１０ｍＭスペルミンン、２ｍＭフェニルメヂルスルポニ
ルフルオライド（ＰＭＳ　Ｆ）、０．２ｍｇ／滅リゾデ
ームを含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　　（１）Ｈ７
，６）１００旋に懸濁し、４°Ｃで１時間攪拌したのち
、３７°Ｃで５分間保温し、これをさらに超音波破砕器
（アルチック社製２米国）で、０℃　４０秒処理した。
この溶菌液をＩＩ、３００Ｘｇで１時間遠心分離して上
清９５旋を集めた。
この上清９５滅をＩｍＭ　　ＥＤＴＡ、　　０．１５Ｍ
ＮａＣ１を含む２０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（１）Ｉ
−Ｉ　　７．６）（’］”ＥＮ）で３００滅に希釈した
のち、抗ＩＦＮ−αＡ抗体カラム（２０旋）にか（Ｊた
。
ＴＥＮで十分洗浄したのち、さらに０．１％）・ウィー
ン２０（和光純薬工業株式会社製）を含む０２Ｍ酢酸で
ＩＰＮ−αＡを溶出し活性画分を集め、ｐＴ（４，５に
調整したのち０Ｍセルロースカラムに吸着させ、十分洗
浄後、０．１．５Ｍ　　ＮａＣ１を含む０．０２５Ｍ酢
酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５，０）にて溶出した。再
び活性画分を集めて凍結乾燥に付し、夫々表に示す量の
ヒト白血球ｒＦＮ−αＡ粉末を得ノこ。
得られた夫々の標品は５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動で単一バンドを与え、その分子量は１９０００
±１０００．抗ウィルス活性は２〜３　Ｘ　Ｉ　Ｏ８Ｕ
／ｍｇであった。また得られた標品をＭｏｎｏ　Ｐカラ
ムによろＦＰＬＣに付１５、ポリバッファー、　ｐ　Ｈ
６、７→ｐｌ−（５，５でクロマトフオーカシングを行
いＮ末端にメヂオニンが付着した分子種と、付着しない
分子種を分離し、Ｎ末メチオニン付着分子種の割合を求
め第７表の結果を得た。即ちマンカンおよび／または鉄
イオンを添加ずろことにｊ二〇実質的にＮ未メチオニン
付着分子種を含まないＩＦＮ−αΔの生産がなされた。
実施例７ 特ＩＪＩ昭５８−１８９１９７号公報実施例８記載の第
４図に示すアミノ酸配列をコー　ドするヒトＩＰＮ−−
γ遺伝子を組入れた発現プラスミドを持つＥ、　ｃｏｌ
ｉ　ＲＲ−１（ｐＲＫ２４８ｃＴＬｓ、　ｐＴ１ｃ２３
　＋／ＩＦＮ−９００）を１７培地にアンピノリンナト
リウム５０ｍｇ／Ｑ、テＩ・ラザイクリン塩酸１０Ｄ１
０を添加した培地５０Ｔｎ１に接種し３０℃−夜回転培
養した。この培養液をＭ−３３培地２．５Ｑ宛を分注し
、第８表に示づ一各種金属塩を添加した５（２容ジャー
ファーメンタ−に移し、通気量２、！Ｍ／分、攪拌１０
００ｐｐｍ、温度３００Ｃで培養した。対数増殖期、生
育が７００クレット弔位付近でグルコース１％とカザミ
ノ酸１％を追加すると同時に培養温度を３０°Ｃより４
２°Ｃに−１−昇させ、更に４時間培養を続＋−Ｊた。
途中クルコース濃度か０２％以下になった時、グルコー
スおよびカザミノ酸を各１％宛添加した。
培養終了後火々の培養液を遠心分離にかけて菌体を集め
たのち凍結して保存した。
凍結菌体各１００ｇに７Ｍ塩酸グアニジンを含む１００
ｍＭ！・リス塩酸緩衝液（ｐｌ−ｉ　７．０’）を３０
０滅加え抽出したのち遠心分離により」二／ｉｌＩをえ
た。
この」二清液を１３７ｍＭ塩化ナトリウム、２７ｍＭ塩
化カリウム、８ｍＭリン酸二ナトリウムおよび１４７ｍ
Ｍリン酸−カリウムからなる緩衝液（以下Ｐ、Ｂ、Ｓと
略す）で７０倍に希釈（２、再度遠心して澄明な」ｍｍ
を得た。この十清液をモノクロー−３９〜 ナル抗体［γ２−１］、、Ｉ　　ＭｏΔｂ；特開昭５９
−８０６４６号公報］カラム（５０轍）にか（′Ｊ１十
分十分洗浄後２酸塩酸クアニジンむ２０ｍＭリン酸緩衝
液（ｒｌｒ−１７，０）で溶出し活性画分を集めた。こ
れを更にセファクリールＳ−２００（ファルマシア社製
）、次いてセファデックスＧ−２５カラムにか（′３、
夫々活性画分を集めて、精製ＩＦＮ−γ標品を得た。夫
々の培地からの取得量は第８表に示される。
得られた夫々の標品はＩＦＮ−γ純度９５％以」二、３
〜４　ｘ　ｌ　ＯＪ　Ｕ／ｍｇの抗ウィルス活性を示し
た。得られた標品をダンクル化したのち、ＨＰ　Ｌ　Ｃ
にてダンクルメチオニンを分離定量して全分子種に対す
るＮ末メヂオニン付着分子種の割合を求め第８表の結果
を得た。
即ち鉄およびマンガンイオンを添加することにより、実
質的にＮ末メヂオニンイ１着分子種の混在しない［ＦＮ
−γの生産がなされた。
実施例８ 参考例２で得たＥ、　ｃｏｌｉ　　Ｃ−４／Ｉ）ＴＦ４
１ＪをＬ−培地にテトラザイクリン塩酸５ｍｇ１ｇを添
加した培地ＩＱに接種し、３７°ＣＩ６．５時間回転振
盪培養（２０Ｏｒｐｍ：Ｎ、た。この培養液の１２５轍
宛を（１）Ｉ）Ｈ５、５に調整したＭ−０３培地及び（
２）ｐＨ５、５に調整したＭ−０３培地に２０ｍｇ／（
ｉＦｅＣρ３−６Ｈ２０と１．０ｍｇ／ρＭｎ５Ｏ，’
　４〜６Ｈ２０を添加した培地を各々２５ρ宛分注、殺
菌した５ρ容ジャーファーメンタ−に移植し、通気量２
．５Ｑ、／分、撹拌１１０００ｒｐ　３４．５℃で１４
％アンモニア水および５Ｎ硫酸を用いてｐ＋＋ｓ、ｓを
維持して培養した。途中生育が約５００クレツト単位に
達した時温度を２７．５℃に下げ、更に約１０００クレ
ツト単位になった時点で２２．５℃に下げ全体で２４時
間培養を続げた。途中６時間口よりグルコース及びカザ
アミノ酸各々２ｇ／ｆ！割合で添加した。２４時時間口
培養液についてΔＩａ−ＩＬ−２生産能を凋へ第９表の
結果を得た。
培養液から集菌し凍結した湿菌体各々１２ｇから実施例
５と同じ方法によりｒＬ−２を抽出し、Ａｌａ−ＩＬ−
２を精製したところ、（１）の培地で生育した菌体から
は２　、１　ｍｇ、　（２）の培地で生育した菌体から
はＩＯ，ＯｍｇのＡｌａ−ＴＩ−、−２を得た。
第　　９　　表 金属塩　　　　　ΔＩａ−ＩＬ−２生産性ＰｅＣρ３　
・６Ｈ３０２０ｍｇ＃！　　　　５０　ｇＭｎＳＯ４・
４〜６Ｈ７Ｏｌ０ｍｇ＃ 参考例　Ｉ　ヒトＩ　Ｌ　−２を産生ずる形質転換体の
製造（１） （［）　　ヒトＩ　１．、−２遺伝子を有するプラスミ
ドｐｌＬＯＴ　１．３５８［特願昭５８−２２５０７９
号（昭和５８年１１月２８日出願）、該出願は特開昭６
０−１．１５５２８号として公開されている。明細書実
施例Ｉ（＼・１１）参照］を制限酵素即士Ａｌで切断し
た。得られた１２９４ｂｐＤＮＡ断片をｉ”４ＤＮΔポ
リメラーセで平滑末端とし、Ｔ０ｎ）ＮΔリガーセを用
いて、ｊ、’、ｇ−ｏｌｌ　ｌリンツＪ　−ｄ’ｌ’Ｇ
ｃＣＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣ八を結合させた。得ら
れたＩ）　Ｎ　ＡをＥｇｏ−Ｒ１で消化し、翻訳開始コ
ドンΔＴＧおよびヒト丁ｒ、　−２遺伝子を有するＤＮ
Ａ断片を得た。
このＤＮＡ断片を、あらかじめＥｃｏＲｌ　−Ｐｓ　ｔ
　１部位を消化したｐｔｒｐ７８１．［ヌクレイツク・
アンス・リサーチ、第１１巻、　３０７７頁（１９８３
）］にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて挿入した。かくして
得られた発現用プラスミドＩ）ＴＰＩはｔｒｐプロモー
ターの下流に翻訳開始コドンとヒトＩ　Ｌ　−２遺伝子
を有する（第５図）。
プラスミドｐＴＦＩを制限酵素５ｔｕｌで切断し、知見
器リンカ−と結合させた。このプラスミドＤＮＡを制限
酵素Ｂａｍ旧およびα狙Ｒ１で処理し、ついでＥｃｏＲ
ｌ−Ｂａｍ旧部位にλＰＬプロモーターを有するプラス
ミドｐＴ８２８１に挿入した。かくして得た発現用プラ
スミドをｐＴ８２８５と命名した（第６図）。
（ｉｉ）　　上記で得たプラスミドｐＴＢ２８５でＥ、
ｃｏｌｉＮ４８３０をコーエンらの方法［プロシージン
ゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・ザイエン
スＵＳＡ、第６９巻、　２１．１０頁（１９７２）］に
従い形質転換し、上記プラスミドを含有する形質転換体
エシェリヒア　コリＮ４８３０／Ｉ）ＴＢ２８５を得た
。
参考例２　ヒトＩ　Ｌ　−２を産生ずる形質転換体の製
造（ＩＩ） ヒトＴ　Ｌ　−２構造遺伝子を含有する発現プラスミ　
トｐＴＦ４をＥ、ｃｏｌｉ　　ＤＨＩ／ｐＴＦ４［ＥＰ
Ｃ公開第１４５３９０号公報参考例３］からＢｉｒｎｂ
ｏｉｍ、　　Ｈ，Ｃ，らの方法［ヌクレイツク・アンッ
ズ・リザーチ　第７巻、＋５１３頁（１９７９）］に記
載された方法で単離し、該プラスミドでＥ、ｃ。
１ｉ　　ＰＲＩ３ｒジャーナル・才ブ・バクテリオワジ
ー。第９７巻、１５２２頁（１９６９）］をＣｏｈｅｎ
　。
Ｓ、Ｎ　　らの方法［プロン−ディンゲス・才ブ・ザ・
ナショナル・アカデミ−・オブ・ザイエンス。
ＵＳＡ、第６９巻２＋１０頁（１，９７２）］により形
質転換し、得られた形質転換体を、それぞれ２００ｍタ
容二角フラスコ内のバクト・トリプトン（ディフコ・ラ
ボラトリーズ、アメリカ月％、バクト・イーストエキス
（同）、）０．５％９食塩０．５％およびテトラザイク
リン塩酸塩５ｍｇ／ρを含む培地５０旋（ｐ＋（７，０
）に接種し、３７℃で一夜培養した。　一方修正Ｍ−９
培地にビタミンＢ、塩酸塩をＩｍｇ／Ｑ添加した培地３
０滅宛を含むくぼみつき２００旋三角フラスコに」−記
種培養液を各々接種し、３７℃で４時間、３０℃で４時
間、２５℃で１０時間培養を続（づ、ＩＬ−２生産性の
特にすぐれたＥ、ｃｏｌｉ　　Ｃ−４／ｐＴＦ４株を選
択した。
発明の効果 翻訳開始コドンＡＴＧの下流に蛋白質の構造遺伝子を含
有する発現ベクターを有する大腸菌の培養により蛋白質
を製造する方法において、当該大腸菌を（１）鉄イオン
源または（および）マンガンイオン源および（２）天然
物由来の窒素源を添加した培地で培養することを特徴上
するＮ末端に翻訳開始コドンＡＴＧに対応するメチオニ
ン残基のない蛋白質の増収法を提供するものである。
本発明の方法により、天然の蛋白質と同一のアミノ酸配
列を有する蛋白質などＮ末端に翻訳開始コドンΔＴＧに
対応するメチオニン残基のない蛋白質を増収することが
できる。
【図面の簡単な説明】
第１図はヒトＩＬ−２のアミノ酸配列を示す。 第２図はヒトＩ　Ｌ　−２をコードするＤＮＡの塩基配
列の一例を示す。 第３図はヒトＴＦＮ−αＡのアミノ酸配列を示第４図は
ヒ１−ＪＦＮ−γのアミノ酸配列を示す。 第５図および第６図は参考例に記載したプラスミドｐＴ
ＦＩおよびｐＴＢ２８５の構築図をそれぞれ示す。 ｐＴＦｌ ミｃｏＲＩ 図 Ｃ０ＲＩ ６°゛４５．。 ａｍＨＩ 、／

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 翻訳開始コドンＡＴＧの下流に蛋白質の構造遺伝子を含
    有する発現ベクターを有する大腸菌の培養により蛋白質
    を製造する方法において、当該大腸菌を（１）鉄イオン
    源または（および）マンガンイオン源および（２）天然
    物由来の窒素源を添加した培地で培養することを特徴と
    するＮ末端に翻訳開始コドンＡＴＧに対応するメチオニ
    ン残基のない蛋白質の増収法。
JP61045667A 1985-04-30 1986-03-03 インターロイキンの増収法 Expired - Lifetime JPH0634746B2 (ja)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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JPS60217898A (ja) * 1984-03-28 1985-10-31 シタス　コーポレイシヨン 異種タンパス質の製造方法

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