JPH0764871B2 - 蛋白質の相互分離方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は蛋白質の相互分離方法に関する。

従来の技術 サイトカインやペプチドホルモンなど種々の生理活性蛋
白質の存在が明らかにされ、また近年の遺伝子工学技術
の進歩は、これら生理活性蛋白質の大量生産、臨床への
適用の途を開きつつある。

しかし、これらの蛋白質は遺伝子工学手法により製造さ
れるため、しばしば混合物中の他の物質から、最終的に
必要な生産物を分離せねばならないという問題が生じて
いる。特に問題になるのは、必要な蛋白質をコードする
遺伝子の発現により産生する遺伝子産物が、しばしば必
要な蛋白質とそのアミノ末端にメチオニンが付加した第
二番目の蛋白質との混合物であることである。付加され
たメチオニン（Met）は、所望の遺伝子の発現の開始を
指示する翻訳開始コドンATGの発現と、発現産物から付
加したMet基を除く宿主細胞の発現系の不首尾に由来す
るものである。この問題は、原核性宿主および真核性宿
主の両者で生ずるが、とりわけ原核性宿主における遺伝
子の発現においてしばしば生ずる。

必要とする蛋白質とそのN-Met類似体とが混合物として
産生する場合、二つの分子種の物理化学的性状における
相違は、あるとしても非常に小さいものであるため、相
互に分離することは、極めて困難なことである。

メチオニン残基は分子量約131で、中程度に疎水性を有
し、かつ解離基を持たないため電気的に中性のアミノ酸
残基である。従って蛋白質のようなそれ自体多数の解離
基や疎水性基および親水性基を有する巨大分子のアミノ
末端にメチオニン残基が１残基付加しても蛋白質全体の
物理化学的性質には通常大きな影響を及ぼさないと予想
され、アミノ末端にメチオニン残基が付加した分子種と
付加していない分子種とを相互に分離することはきわめ
て困難であると考えられる。

この難しい問題は、多くの蛋白質において存在し、とり
わけ発現用の宿主として大腸菌を用いて発現する蛋白質
を、これらのN-Met類似体から分離する場合において、
厳しいものがある。

発明が解決しようとする問題点 同じ蛋白質であってもアミノ末端にメチオニン残基の付
加した分子種とそうでない分子種とは蛋白質の高次構造
が相互に異なる可能性があり、両者の間でin vivoおよ
びin vitroでの生物活性や生物学的安定性に差のある可
能性もある。また、メチオニン残基のアミノ末端への付
加が抗原性の増加あるいは減少をもたらす可能性もあり
得よう。従って、生理学上及び産業利用上の観点からア
ミノ末端にメチオニン残基の付加した分子種とそうでな
い分子種とを分離して両者をそれぞれ実質的に純粋な形
で取り出すことが望まれる。

問題を解決するための手段 本発明者らは、蛋白質とそのアミノ末端にさらにメチオ
ニン残基を有する蛋白質（N-Met蛋白質）とを相互に分
離することを目的として鋭意研究を行った結果、それら
が意外にもヒドロキシアパタイトに対して異なる吸着力
を有する事実を見い出した。本発明者らは、この知見に
基づきさらに研究した結果、本発明を完成した。

本発明は、蛋白質および該蛋白質にメチオニン残基が付
加し該蛋白質と同様の生理活性を有する蛋白質（Met−
蛋白質）の混合物を、ヒドロキシアパタイトに対する両
者の親和性の差異を利用す分離手段に付すことを特徴と
する蛋白質と該蛋白質にメチオニン残基が付加した蛋白
質（Met−蛋白質）との相互分離方法である。

本願明細書において「蛋白質」とは、糖鎖を有するもの
もしくは有さないもののいずれをも含み、また、例えば
化学反応もしくは酵素反応により、化学的または構造的
に修飾されたポリペプチドを包含する、アミノ酸の１次
構造からなる高分子物質を意味する。

また「Met−蛋白質」とは、上記「蛋白質」にさらにメ
チオニン基が付加したものを意味する。本発明は、とり
わけ、所望の蛋白質およびそれと同一もしくは同様の生
理活性を有するMet−蛋白質に係るものである。本発明
における好ましいMet−蛋白質は、所望の蛋白質の生理
活性を奏するに十分な、該蛋白質とのアミノ酸配列上の
類似性を有するものである。

本願明細書において「生理活性」とは、生理学的および
免疫学的活性および効果を含むインビボもしくはインビ
トロで生存していてもいなくてもよい細胞，細胞の一
部，細胞もしくは他の生理学的作用に基づく生産物およ
び生物学的物質を含む生体および（または）生理物質へ
の活性または効果を意味する。

上記蛋白質およびそれにメチオニン残基が付加した蛋白
質（Met−蛋白質）の混合物は、通常遺伝子組換え技術
で製造でき、通常エシェリヒア（Escherichia）属菌，
バチルス（Bacillus）属菌，酵母，動物細胞を用いて発
現させることにより製造できる。

上記蛋白質としては、各種生理活性蛋白質が挙げられ、
例えば、インターロイキン（インターロイキン−1,イン
ターロイキン−２など）,B細胞増殖因子（BGF）,B細胞
分化因子（BDF），マクロファージ活性化因子（MAF），
リンホトキシン（LT），腫瘍壊死因子（TNF）などのサ
イトカイン；トランスホーミンググロースファクター
（TGF-α）；エリスロポエチン，上皮細胞増殖因子，イ
ンスリン，ヒト成長ホルモンなどペプチド蛋白質ホルモ
ン;B型肝炎ウイルス抗原，インフルエンザ抗原，口蹄疫
ウイルス抗原，マラリア原虫抗原などの病原性微生物抗
原蛋白質；ペプチダーゼ（例、ティシュプラスミノーゲ
ン アクチベーター，ウロキナーゼ，セラペプターゼな
ど）やリゾチームなどの酵素；ヒト血清アルブミン（HS
A）などの血中蛋白成分が挙げられる。

これら蛋白質の中でも、分子量約3,000〜50,000、とり
わけ約5,000〜30,000のもの、またアミノ酸数として約3
0〜500、とりわけ約50〜300のものに対して、本発明の
蛋白質の相互分離方法は有利に適用ができる。

本発明の蛋白質としては、特に、インターロイキン−２
が好ましい。

ここでインターロイキン−２とは天然のヒトインターロ
イキン−２と同様の生物学的もしくは免疫学的活性例え
ばインターロイキン−２レセプターや抗インターロイキ
ン−２抗体との結合能、を有するものであればいずれで
もよく、具体的には第１図で示されるアミノ酸配列を有
するポリペプチド（I;但しＸは水素原子）や、その生物
学的もしくは免疫学的活性に必要な一部分のアミノ酸配
列からなるフラグメントでもよく、例えばポリペプチド
（Ｉ）のアミノ末端から１個のアミノ酸（EPC公開91539
号公報）または４個のアミノ酸を欠くフラグメント（特
開昭60-126088号公報）やカルボキシル末端部分の数個
のアミノ酸を欠くフラグメントなどが挙げられ、さらに
上記ポリペプチド（Ｉ）の構成アミノ酸の一部が欠損し
ているか他のアミノ酸に置換されたもの、例えば125位
のシステイン残基がセリン残基に置換されたもの（特開
昭59-93093号公報）でもよい。これらのポリペプチド
は、非グリコシル化ポリペプチドであることが好まし
く、とりわけ第１図に示すアミノ酸配列を有するインタ
ーロイキン−２が好ましい。

本明細書においては、第１図で示されるアミノ酸配列を
有するポリペプチドにおいてＸが水素原子であるものを
IL-2と、Ｘがメチオニン残基であるものをMet-IL-2とそ
れぞれ略称することもある。

上記蛋白質とMet−蛋白質との混合物としては、混合比
率が任意のものでよく、該混合物は、約50％以上の純
度、さらに好ましくは、約80％以上の純度を有するもの
が用いられる。

本発明方法において用いられるヒドロキシアパタイト
は、リン酸カルシウムの一種であり、式Ca₁₀(PO₄)₆(OH)
₂で表わされる。

ヒドロキシアパタイトはクロマトグラフィー用，高速液
体クロマトグラフィー用のいずれかでもよく、クロマト
グラフィー用としてはバイオゲルHT,バイオゲルHTP（い
ずれもバイオラッド社製,U.S.A），ハイドロキシアパタ
イト（株式会社日本ケミカル製）などが、高速液体クロ
マトグラフィー用カラムとしてはヒドロキシアパタイト
カラム（三井東圧株式会社製），バイオゲルHPHTカラム
（バイオラッド社製）,KBカラム（高研株式会社製）な
どが挙げられる。

本発明方法における分離手段としては、たとえば通常の
クロマトグラフィー，高速液体クロマトグラフィー用が
挙げられる。

クロマトグラフィーの条件としては、あらかじめ開始緩
衝液で平衡化したヒドロキシアパタイトカラムに蛋白質
を負荷して、溶出緩衝液を用いて蛋白質を分離溶出す
る。開始緩衝液としては、pH約５以上のリン酸緩衝液を
用い、最も一般的には約0.01M以下のリン酸緩衝液（pH
約6.8）を用いる。試料蛋白質の負荷量はヒドロキシア
パタイト1ml当たり約１〜5mgが適当である。溶出緩衝液
としては一般に開始緩衝液と同じpH値をもつ高濃度のリ
ン酸緩衝液を用いるが、酢酸イオン，シュウ酸イオン，
炭酸イオン，硫酸イオンを用いても溶出が可能である。
溶出法としては、段階的溶出法と濃度勾配法のどちらを
用いてもよい。

高速液体クロマトグラフィーの条件としては、上述のク
ロマトグラフィーの条件とほぼ同様である。具体的には
たとえば市販のヒドロキシアパタイトカラム（0.78×10
cm,三井東圧株式会社製）を用いる高速液体クロマトグ
ラフィーでは平衡化緩衝液としてpH約5.5〜10.5の、好
ましくはpH約6.5〜８の0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液を
用い、リン酸ナトリウム緩衝液の濃度を上昇させること
により溶出を行う。通常約0.1〜100mgの蛋白質をのせて
約0.1〜5ml/minの好ましくは約0.5〜1.5ml/minの流速で
高速液体クロマトグラフィーを行う。

所望により上記の方法に従って分離した蛋白質のみを含
む画分，該蛋白質にさらにメチオニン残基が付加した蛋
白質のみを含む画分から実質的に純粋な蛋白質，該蛋白
質にさらにメチオニン残基が付加した蛋白質（Met−蛋
白質）をそれぞれ採取することができる。この目的のた
めには、自体公知の塩折法，疎水クロマトグラフ法，ゲ
ルろ過法，イオン交換クロマトグラフ法や高速液体クロ
マトグラフ法などの蛋白質の精製に一般的に用いられる
方法を適宜組み合わせて行なわれる。

本発明は遺伝子工学技術で製造した蛋白質から、その対
するMet−蛋白質を実質的に含まないよう分離すること
ができる。本発明により製造される蛋白質は、対応する
Met−蛋白質を重量比で３％以下、好ましくは２％以
下、とりわけ１％以下しか含まないものである。また、
本発明により製造されるMet−蛋白質は、対応する蛋白
質を重量比で３％以下、好ましくは２％以下、とりわけ
１％以下しか含まないものである。

本発明により製造される蛋白質およびそれにメチオニン
残基が付加した蛋白質（Met−蛋白質）は、いずれも天
然の対応する蛋白質と同様の生物学的もしくは免疫学的
活性を有し、高純度に精製されており夾雑蛋白質、発熱
物質がきわめて少ないので注射剤原体等として安全に使
用される。

たとえば、本発明により得られるIL-2およびMet-IL-2は
いずれも正常なＴ細胞やナチュラルキラー細胞をその機
能を保持させたまま増殖させる活性を有する。したがっ
て、本発明により得られるIL-2およびMet-IL-2は、それ
ぞれＴ細胞やナチュラルキラー細胞をインビトロで長期
にわたり増殖，継代したりクローン化するのに使用でき
る。なお、この性質を利用してヒトインターロイキン−
２の活性を測定することができる。

さらに、本発明により得られるIL-2およびMet-IL-2は、
たとえば腫瘍抗原を認識し、破壊する抗原特異的なキラ
ーＴ細胞や抗原感作の経験の有無と無関係に腫瘍を殺す
能力をもつところのナチュラルキラー細胞をインビトロ
で選択的に増殖させることができ、またこのキラーＴ細
胞を生体へ移入する際に、本発明により得られるIL-2ま
たはMet-IL-2を同時に接種することにより、その抗腫瘍
効果を増大させることから、温血動物（例、マウス，ラ
ット，ウサギ，犬，ネコ，ブタ，ウマ，ヒツジ，ウシ，
人など）の腫瘍の予防，治療や免疫機能低下疾患の治療
のために用いることができる。

本発明により得られるIL-2およびMet-IL-2はそれぞれ夾
雑蛋白質による抗原性がなく低毒性である。

本発明により得られるIL-2またはMet-IL-2を腫瘍の予
防，治療剤として用いるには、当該物質を自体公知の担
体，賦形剤，希釈剤と混合希釈して、たとえば注射剤，
カプセル剤などとして非経口的にまたは経口的に投与す
ることができる。さらに、前述したようにインビトロで
増殖させたキラーＴ細胞やナチュラルキラー細胞と共に
または単独で使用することができる。

本発明のIL-2およびMet-IL-2は、公知の天然から分離さ
れたヒトインターロイキン−２と実質的に同じ生物活性
を有するのでこれと同様に使用することができ、細胞の
インターロイキン−２受容体との解離定数がきわめて小
さいことから、極く小量の投与で良い。

Ｔ細胞をインビトロで増殖させる目的に使用するために
は、本発明のIL-2またはMet-IL-2を約0.01〜１ユニット
/ml、好ましくは約0.1〜0.5ユニット/mlの濃度で培地に
添加して用いることができる。

インターロイキン−２の生物活性の測定は、インターロ
イキン−２依存性細胞を用いる方法［バイオケミカル・
アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケ−シ
ョンズ（Biochem. Biophys. Res. Commun.），109,363
（1982）］により行なうことができる。

Ｔ細胞をインビトロで増殖させる目的に使用する具体的
としては、たとえば、20％ウシ胎児血清を含むRPMI 164
0培地にヒト末梢血より分離したＴ細胞（１×10⁶個/m
l）およびＸ線（1500ラッド）照射したＢ細胞トランス
ホフォーマント（１×10⁶個/ml）を加えて37℃,5％CO₂
存在下で３日間リンパ球混合培養を行なって得られるア
ロ抗原感作Ｔ細胞を含む細胞浮遊液に本発明のIL-2また
はMet-IL-2を0.1〜0.5ユニット/mlの濃度で加え約一週
間ごとに培地交換しながら約１か月間培養を続ける方法
などが挙げられる。

本願明細書および図面において、アミノ酸を略号で表示
する場合、IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nome
nclatureによる略号あるいは当該分野における慣用略号
に基づくものであり、その例を次に挙げる。また、アミ
ノ酸に関し光学異性体がありうる場合は、特に明示しな
ければＬ−体を示すものとする。

Gly:グリシン Ala:アラニン Val:バリン Leu:ロイシン Ile:イソロイシン Ser:セリン Thr:スレオニン Cys:システイン 1/2Cys:ハーフシスチン Met:メチオニン Glu:グルタミン酸 Asp:アスパラギン酸 Lys:リジン Arg:アルギニン His:ヒスチジン Phe:フェニルアラニン Tyr:チロシン Trp:トリプトファン Pro:プロリン Asn:アスパラギン Gln:グルタミン Asp/Asn:アスパラギン酸およびアスパラギン Glu/Gln:グルタミン酸およびグルタミン 後述の参考例１で得られた形質転換体エシェリヒア・コ
リ（Escherichia coli）N4830/pTB285は、財団法人発酵
研究所（IFO）に昭和60年（1985年）４月25日から受託
番号IFO 14437として寄託され、また本形質転換体は、
昭和60年（1985年）４月30日から通商産業省工業技術院
微生物工業技術研究所（FRI）に受託番号FERM P-8199と
して寄託され、該寄託はブタベスト条約に基づく寄託に
切換られて受託番号FERM BP-852として同研究所（FRI）
に保管されている。

実施例 以下の実施例および参考例により本発明をより具体的に
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。

なお、生物活性の測定はインターロイキン−２依存性細
胞を用いるBiochem.Biophys.Res.Commun.,109,363（198
2）に記載の方法に従って行った。

実施例１ ヒドロキシアパタイトカラムを用いる高速液
体クロマトグラフィーによるIL-2とMet-IL-2との分離： 参考例１（vi）で得られたIL-2およびMet-IL-2の混合物
である非グリコシル化ヒトインターロイキン２を含む0.
005M酢酸アンモニウム緩衝液（pH5.0）（蛋白質濃度1.0
3mg/ml）2ml（2.06mg）を高速液体クロマトグラフィー
用ヒドロキシアパタイトカラム（0.78×10cm,4.8ml,三
井東圧株式会社製）にのせ、以下の条件下で蛋白質を溶
出した。カラム温度,25℃；溶出溶媒A,0.01Mリン酸ナト
リウム緩衝液（pH7.5）；溶出溶媒B,0.25Mリン酸ナトリ
ウム緩衝液（pH7.5）；溶出プログラム,0分（95％Ａ＋
５％Ｂ）−45分（87％Ａ＋13％Ｂ）−65分（87％Ａ＋13
％Ｂ）；流速,0.6ml/min;検出波長,280nm、本条件下に
おいて、非グリコシル化インターロイキン２は保持時間
43分で溶出されるピーク１と保持時間54分で溶出される
ピーク２とに分離された。そこで、これらを分取後、高
速液体クロマトグラフィーで用いたリン酸ナトリウムを
除去するため、トリフルオロ酢酸−アセトニトリル系を
溶出溶媒とする高速液体クロマトグラフイーを行った。

カラム，ウルトラポアRPSC（1.0×25cm,アルテックス
社，アメリカ）；カラム温度,30℃；溶出溶媒A,0.1％ト
リフルオロ酢酸−99.9％水；溶出溶媒B,0.1％トリフル
オロ酢酸−99.9％アセトニトリル；溶出プログラム,0分
（55％Ａ＋45％Ｂ）−４分（55％Ａ＋45％Ｂ）−28分
（42％Ａ＋58％Ｂ）−38分（34％Ａ＋66％Ｂ）−43分
（20％Ａ＋80％Ｂ）−44分（55％Ａ＋45％Ｂ）；溶出速
度3.0ml/min。このクロマトグラフイーによって得られ
た溶液をそれぞれ凍結乾燥に付し、白色粉末を得た。ヒ
ドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーにおける
ピーク１およびピーク２から得られたものを、それぞれ
P1およびP2となずけた。P1の収量は0.80mg（38.8％）,P
2の収量は0.46mg（22.3％）であった。

次に得られたP1およびP2について蛋白化学的分析を行っ
た。P1およびP2それぞれ45μｇ（3nmol）を用い、気相
プロテインシークエンサー（アプライド・バイオシステ
ムズ社製470A型）を用いる自動エンドマン分解法により
P1およびP2のアミノ末端アミノ酸配列を決定した。フェ
ニルチオヒダントインアミノ酸（PTH−アミノ酸）はミ
クロパックSP-C18カラム（バリアン社製）を用いる高速
液体クロマトグラフイーにより同定した。ステップ１〜
４で検出されたPTH−アミノ酸を第１表に示す。

カルボキシル末端アミノ酸の分析は次のようにして行っ
た。すなわちP1およびP2をヒドラジン分解用ガラス管に
とり、無水ヒドラジンを加えて減圧下に封管したのち10
0℃で６時間加熱した。得られたヒドラジン分解物をベ
ンズアルデヒド処理したのち、遊離アミノ酸を日立製83
5型アミノ酸分析計により測定した。その結果、P1およ
びP2ともにスレオニンのみが検出され、回収率はそれぞ
れ30.3％および28.5％であった。このことからP1および
P2のカルボキシル末端アミノ酸はスレオニンと同定され
た。アミノ酸組成分析は４％チオグリコール酸を含む定
沸点塩酸を加えて減圧下に封管後、110℃で24,48,72時
間、加水分解し、日立製835型アミノ酸分析計により実
施した。シスチンおよびシステインは過ギ酸酸化したの
ち、減圧下定沸点塩酸中で24時間加水分解してアミノ酸
分析計によりシステイン酸として定量した。アミノ酸分
析値は24,48および72時間の加水分解で得られた値を平
均して求めた。ただし、セリンおよびスレオニンの値は
加水分解時間を０時間に外挿して求めた。その結果を第
２表に示す。アミノ末端アミノ酸配列分析およびアミノ
酸組成分析の結果から、P1は第１図中Ｘ＝メチオニン残
基で示される分子種（（Met-IL-2）を、P2は第１図中Ｘ
＝水素原子で示される分子種（IL-2）をそれぞれ97％お
よび95％以上の純度で含んでいることが確認された。

参考例１ 非グリコシル化ヒトインターロイキン−２の
製造 （ｉ）発現用プラスミドの構築 ヒトインターロイキン−２遺伝子を有するプラスミドpI
LOT 135-8［特開昭60-115528号公報］を制限酵素HgiAI
で切断した。得られた1294bpDNA断片をT4DNAポリメラー
ゼで平滑末端とし、T4DNAリガーゼを用いて、EcoRIリン
カーdTGCCATGAATTCATGGCAを結合させた。得られたDNAを
EcoRIで消化し、翻訳開示コドンATGおよびヒトインター
ロイキン−２遺伝子を有するDNA断片を得た。

このDNA断片を、あらかじめ、EcoRI-PstＩ部位を消化し
たptrp781［ヌクレイック・アシズ・リサーチ（Nucleic
Acids Research），第11巻,3077頁（1983）］にT4DNA
リガーゼを用いて挿入した。かくして得られた発現用プ
ラスミドpTF1はtrpプロモーターの下流に翻訳開示コド
ンとヒトインターロイキン−２遺伝子を有する。

プラスミドpTF1を制限酵素StuＩで切断し、BamHIリンカ
ーと結合させた。このプラスミドDNAを制限酵素Bam HI
およびEcoRIで処理し、ついでEcoRI−Bam HI部位にλPL
プロモーターを有するプラスミドpTB281に挿入した。か
くして得た発現用プラスミドをpTB285と命名した。

（ii）形質転換体の製造 上記で得たプラスミドpTB285でエシェリヒアコリ（Esch
erichia coli）N4830をコーエンらの方法［プロシージ
ングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンス（Pro.Natl.Acad.Sci.USA），第69巻,2110頁（197
2）］に従い形質転換し、上記プラスミドを含有する形
質転換体エシェリヒア コリN4830/pTB285（IFO 14437,
FERM BP-852）を得た。

（iii）形質転換体の培養 形質転換体エシェリヒア・コリN4830/pTB285（IFO 1443
7,FERM BP-852）を250ml容フラスコ内のバクト・トリプ
トン（ディフコ・ラボラトリーズ，アメリカ）１％，バ
クト・イーストエキス（ディフコ・ラボラトリーズ，ア
メリカ）0.5％，食塩0.5％およびアンピシリン50μg/ml
を含む液体培地（pH7.0）50mlに接種して37℃で一晩回
転振盪培養した。この培養液をカザミノ酸0.5％，グル
コース0.5％およびアンピシリン50μg/mlを含むM9培地
2.5lの入った5l容ジャーファーメンターに移し35℃で６
時間、ついで42℃でさらに３時間通気攪拌培養して培養
液2.5lを得た。この培養液を遠心分離し、菌体を集め、
−80℃で凍結して保存した。

（iv）抽出 凍結菌体20gを7M塩酸グアニジン0.1M Tris-HClを含む抽
出（pH7.0）100mlに均一に懸濁し、４℃で１時間攪拌し
た後、28,000×ｇで20分間遠心分離し上清を得た。

（ｖ）インターロイキン−２蛋白質の部分精製 得られた上清を0.01M Tris-HC1緩衝液（pH8.5）に対し
て透析後19,000×ｇで10分間遠心分離して得た上清を0.
01M Tris-HCl緩衝液（pH8.5）で平衡化したDE52（DEAE
−セルロース，ワットマン社製，イギリス）カラム（50
ml容）に通して蛋白を吸着後、NaCl濃度直線勾配（０〜
0.15M NaCl,1）を作成して、IL−２を溶出させ、活性
画分を得た。

（iv）インターロイキン−２蛋白質の精製 上記で得られた活性画分をYM−５メンブラン（アミコン
社製，アメリカ）を用いて、5mlに濃縮し、0.1M Tris-H
Cl（pH8.0）−1M NaCl緩衝液で平衡化したセファクリル
Ｓ−200（ファルマシア製，スウエーデン）カラム（500
ml容）を用いてゲルろ過を行った。活性画分40mlをYM−
５メンブランで3mlに濃縮した。得られた濃縮液を、ウ
ルトラポアRPSC（アルテックス社製，アメリカ）カラム
に吸着させ、トリフルオロ酢酸−アセトニトリル系を溶
出溶媒とする高速液体クロマトグラフィーを行った。カ
ラム，ウルトラポアRPSC（4.6×75mm）；カラム温度,30
℃：溶出溶媒A,0.1％トリフルオロ酢酸−99.9％水；溶
出溶媒B,0.1％トリフルオロ酢酸−99.9％アセトニトリ
ル；溶出プログラム,0分（68％Ａ＋32％Ｂ）−25分（55
％Ａ＋45％Ｂ）−35分（45％Ａ＋55％Ｂ）−45分（30％
Ａ＋70％Ｂ）−48分（100％Ｂ）；溶出速度,08.ml/min;
検出波長,230nm。

本条件下で保持時間約39分の活性画分,IL-2およびMet-I
L-2の混合物10mlを集めた。

発明の効果 本発明により蛋白質と該蛋白質にさらにメチオニン残基
が付加した蛋白質との相互分離ができるので、該分離方
法によりえられる蛋白質は、それぞれ医薬品等として有
利に用いることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、IL-2のアミノ酸配列（図中、Ｘ＝水素原子）
およびMet-IL-2のアミノ酸配列（図中、Ｘ＝メチオニン
残基）をそれぞれ示す。 第２図は、実施例１における高速液体クロマトグラフィ
ーの結果を示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】蛋白質およびそのアミノ末端にさらにメチ
   オニン残基を有する蛋白質の混合物を、ヒドロキシアパ
   タイトに対する両者の親和性の差異を利用する分離手段
   に付すことを特徴とする蛋白質とそのアミノ末端にさら
   にメチオニン残基を有する蛋白質との相互分離方法。