JPH0634746B2 - インターロイキンの増収法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はインターロイキンの増収法に関する。

従来の技術 サイトカインやペプチドホルモンなど種々の生理活性蛋
白質の存在が明らかにされ、また近年の遺伝子工学技術
の進歩は、これら生理活性蛋白質の大量生産、臨床への
適用の途を開きつつある。

インターロイキン−２［以下ＩＬ−２と略称する。なお
ＩＬ−２は、Ｔ細胞増殖因子(TCGF)とも呼ばれる。］
は、レクチンやアロ抗原等で刺激されたＴ細胞によって
産生されるリンホカインである［サイエンス，第193
巻，1007頁(1976)]。

ＩＬ−２を利用して、これまでにキラーＴ細胞やヘルパ
ーＴ細胞、さらにはナチュラルキラー細胞などのクロー
ンが多数得られている［たとえば、ネイチャー，第268
巻，154頁(1977)]。このようなＴ細胞やナチュラルキラ
ー細胞のクローン化という直接的用途のほかに、ＩＬ−
２を用いてある特殊な抗原、たとえば腫瘍抗原を認識し
破壊する抗原特異的なキラーＴ細胞をインビトロで選択
的に増殖させることができる。このようにして増殖させ
た腫瘍特異的キラーＴ細胞を動物に移入して腫瘍の増殖
を抑制阻止することが可能である［ザ・ジャーナル・オ
ブ・イムノロジー，第125巻，1904頁(1980)]。

これらの実験事実はＩＬ−２が抗腫瘍剤として用いられ
る可能性を示すものである。ＩＬ−２はまた、胸腺機能
を欠如しているヌードマウスのヘルパーＴ細胞機能を回
復させること［ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イム
ノロジー，第10巻，719頁(1980)]や、同種細胞に対する
キラーＴ細胞の誘導を回復させること［ネイチャー，第
284巻，278頁(1980)]が知られており、免疫機能低下疾
患への応用も期待できる。

また、インターフェロン−α（以下、ＩＦＮ−αと略記
する）およびインターフェロン−γ（以下、ＩＦＮ−γ
と略記する）は、ウイルスや核酸によって活性化された
リンパ球によって産生されるリンホカインであり、細胞
に作用してその細胞を抗ウイルス状態にするという生物
活性をもち、感染防禦系や腫瘍免疫系において重要な働
きをしている。

これらサイトカインなど蛋白質は、天然物として得るこ
とができるが、極めて限られた量である。しかし近年遺
伝子組換え技術の進歩によって、これら蛋白質の遺伝子
を組入れた発現ベクターを持つ大腸菌などの培養物から
生物学的に活性な蛋白質として取得できる途が開けた
［ＩＬ−２：ネイチャー，第３０２巻，３０５頁（１９
８３）：ヌクレイック・アシッズ・リサーチ，第１１
巻，４３０７頁（１９８３），ＩＦＮ−α：ジャーナル
・オブ・インターフェロン・リサーチ，第１巻，３８１
（１９８１），ＩＦＮ−γ：ネイチャー，第２９５巻，
５０３頁（１９８２）］。

発明が解決しようとする問題点 蛋白質の生合成は、真核生物，原核生物を問わずメチオ
ニンに対応するメッセンジャーRNAコドンAUGから開始さ
れるために、生成される蛋白質にはＮ末端にメチオニン
残基を持つ分子種と持たない分子種の両者が存在する可
能性がある。事実大腸菌においては、多くの菌体蛋白の
Ｎ末端がメチオニンであり（コーン・スタンプ，アウト
ラインス・オブ・バイオケミストリー，４版，ジョン・
ウィリー・アンド・サンズ，1976年）、又大腸菌のイニ
シェーション・ファクターIF−３にはＮ末端にメチオニ
ン残基を持つ分子種と持たない分子種の両者が存在する
こと［ホッペ・ザイラー，ツァイシュリフト・フェア・
フィジオロジッシェ・ヘミー，第354巻，1415頁(1973)]
などが知られている。又組換えＤＮＡ技術を用いて大腸
菌で製造される蛋白質に関しては、Ｎ末端へのメチオニ
ン残基の付加率がＩＦＮ−αにおいて約50％［ジャーナ
ル・オブ・インターフェロン・リサーチ，第１巻，381
頁(1981)]，ヒト成長ホルモンにおいて100％［ネイチャ
ー，第293巻，408頁(1981)]にも達する事が知られてい
る。しかし、これらのメチオニン残基の付加率を制御し
た例は今までのところ報告されていない。

本発明者らはＩＬ−２遺伝子を組入れた大腸菌を用いる
ＩＬ−２蛋白質の製造法について研究中、大腸菌で生産
されるＩＬ−２蛋白質には、Ｎ−末端にメチオニン残基
のないＩＬ−２、すなわちＮ末端アミノ酸がアラニン残
基から始まる分子種[Ala-IL-2]とＮ末端にメチオニン残
基の付加したメチオニル・アラニン残基から始まる分子
種[Met-Ala-IL-2]の２種が混在しており、後者の量が前
者に比べ著しく多いことを見出した。

また同様に、大腸菌で生産されるＩＦＮ−αやＩＦＮ−
γにおいても、それぞれＮ末端がシステイン残基から始
まる分子種[Cys−ＩＦＮ−αおよびCys−ＩＦＮ−γ］
にＮ末端にメチオニン残基の付加したメチオニル・シス
テイン残基から始まる分子種[Met-Cys−ＩＦＮ−αおよ
びMet-Cys−ＩＦＮ−γ］が５〜５０％混在しているこ
とを見い出した。

Ｎ末端にメチオニン残基を有する蛋白質は、対応する天
然型蛋白質と同様の生物活性を示すと考えられている
が、異なる物質であり、従って天然型のアミノ酸配列を
有する蛋白質の製造法としては、必ずしも十分なものと
はいえない。

問題を解決するための手段 本発明は、上記サイトカインにおいて特にインターロイ
キンの増収法に関し、翻訳開始コドンＡＴＧの下流にイ
ンターロイキンの構造遺伝子を、かつその上流にλPLプ
ロモーターを含有する発現ベクターを有する大腸菌の培
養によりインターロイキンを製造する方法において、当
該大腸菌を（１）鉄イオン源または（および）マンガン
イオン源および（２）天然物由来の窒素源を添加した培
地で培養することを特徴とするＮ末端に翻訳開始コドン
ＡＴＧに対応するメチオニン残基のないインターロイキ
ンの増収法を提供するものである。

上記インターロイキンとしては、インターロイキン−
１、ＩＬ−２などが挙げられる。

とりわけ、ＩＬ−２を大腸菌の培養により製造する場合
に本発明の方法は有利に適用できる。

ここでＩＬ−２とは天然のヒトＩＬ−２と同様の生物学
的もしくは免疫学的活性例えばＩＬ−２レセプターや抗
ＩＬ−２抗体との結合能、を有するものであればいずれ
でもよく、具体的には第１図で示されるアミノ酸配列を
有するポリペプチド（Ｉ）や、その生物学的もしくは免
疫学的活性に必要な一部分のアミノ酸配列からなるフラ
グメントでもよく、例えばポリペプチド（Ｉ）のＮ末端
から１個のアミノ酸（ＥＰＣ公開９１５３９号公報）ま
たは４個のアミノ酸を欠くフラグメント（特願昭５８−
２３５６３８号（昭和５８年１２月１３日出願）、該出
願は特開昭６０−１２６０８８号として公開されてい
る、明細書参照）やＣ末端部分の数個のアミノ酸を欠く
フラグメントなどが挙げられ、さらに上記ポリペプチド
（Ｉ）の構成アミノ酸の一部が欠損しているか他のアミ
ノ酸に置換されたもの、例えば１２５位のシステイン残
基がセリン残基に置換されたもの（特開昭５９−９３０
９３号公報）でもよい。こられのポリペプチドは、非グ
リコシル化ポリペプチドであることが好ましい。

インターロイキンの構造遺伝子としては、上記インター
ロイキンのアミノ酸配列をコードするＤＮＡであれば、
天然由来のまたは合成によるＤＮＡのいずれでもよい。

例えば、ＩＬ−２については第１図で示されるアミノ酸
配列をコードする第２図で示される塩基配列を有するＤ
ＮＡ（IV）が挙げられる。

上記構造遺伝子（ＤＮＡ）は翻訳開始コドンＡＴＧの下
流に存在するが、該遺伝子はＡＴＧに直結してその下流
に存在してもよく、またＡＴＧと該遺伝子の間に発現さ
れないスペーサーもしくは他の構造遺伝子が介在してい
てもよい。とりわけＡＴＧと構造遺伝子が直結している
のが好ましい。

上記遺伝子（ＤＮＡ）は、その上流にλファージの増殖
に関与するλＰＬプロモーターを有している。

上記遺伝子およびプロモーターは、通常ベクターに組込
まれ発現ベクターとして使用される。該ベクターの製造
のためのプラスミドとして、例えばColE １由来のpBR3
22［ジーン，第２巻，95頁(1977)]が最もよく利用され
るが、その他のプラスミドであっても、大腸菌内で複製
保持されるものであれば、いずれも用いることができ
る。その例としては、pBR313［ジーン，第２巻，75頁(1
977)],pBR324,pBR325［ジーン，第４巻，121頁(1978)],
pBR327,pBR328［ジーン，第９巻，287頁(1980)],pKY228
9［ジーン，第３巻，１頁(1978)],pKY2700［生化学，第
52巻，770頁(1980)],pACYC177およびpACYC184［ジャー
ナル・オブ・バクテリオロジー，第134巻，1141頁(197
8)],pRK248,pRK646,pDF41［メソッズ・イン・エンジー
モロジー，第68巻，268頁(1979)]などが挙げられる。

また、バクテリオファージ、たとえばλファージを使用
したλgt系のλgt・λＣ［プロシージング オブ ナシ
ョナル アカデミー オブ サイエンス USA，第71
巻，4579頁(1974)]，λgt・λＢ［同誌第72巻，3416頁
(1975)]，λDam［ジーン，第１巻，255頁(1977)]やシャ
ロンベクター［サイエンス，第196巻，161頁(1977)；ジ
ャーナル・オブ・ビロロジー，第29巻，555頁(1979)]，
繊維状ファージを使用したベクターなども発現ベクター
として使用可能である。

上記発現ベクターの構築は、公知の方法に従って行なえ
ばよい［例えば、ネイチャー，第302巻，305頁(1983)，
ヌクレイック・アシッズ・リサーチ，第11巻，4307頁(1
983)，特開昭５７−７９８９７号公報，特開昭５８−１
８９１９７号公報］。

インターロイキンの構造遺伝子を組入れた発現プラスミ
ドを導入する宿主菌としては、大腸菌(Escherichia col
i＝E.coli)が用いられるが、なかでも大腸菌K-12株由来
のものが、取扱い、安全性の面から特に好ましい。該大
腸菌K-12株由来のものとしては294株，ＲＲ−１株，Ｄ
Ｈ−１株，Ｎ4830株，Ｃ−４株などが有利に用いられ
る。

294株は公知菌株であり［プロシーディング・オブ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・USA第73
巻，4174頁(1976)]、又財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）
にＩＦＯ−１４１７１として寄託もされている。

ＲＲ−１株はジーン，第２巻，７５頁（１９７７）に、
ＤＨ １株はネイチャー第217巻，1110頁(1968)に、N48
30株はセル，第25巻，713頁(1981)に記載されている。N
4830株は温度感受性cIリプレッサーを宿主中に持ってい
るため、発現プロモーターとしてλPLを用いる際には特
に有用でありファーマシアP-Lビオケミカル社より入手
可能である。

Ｃ−４株は本願出願人によりＩＦＯにＩＦＯ−１４４２
１として、昭和６０年２月１６日からＦＲＩにＦＥＲＭ
ＢＰ−９６６として寄託されている。

本発明で使用する大腸菌は、宿主大腸菌をインターロイ
キンの構造遺伝子発現ベクターで形質転換することによ
り製造でき、形質転換は、例えばジャーナル・オブ・モ
レキュラー・バイオロジー，第53巻，159頁(1970)，メ
ソッズ・イン・エンジモロジー，第68巻，253頁(197
9)，ジーン，第３巻，279頁(1978)，プロシージング・
オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・US
A，第69巻,2110頁(1972)などに記載されている手段によ
って行うことができる。

本発明においては、上記大腸菌を鉄イオン源または（お
よび）マンガンイオン源を添加した培地で培養する。

培地に添加する鉄イオン源およびマンガンイオン源に関
し、鉄イオン源とは、溶液にしたときに鉄イオンとなる
物質あるいは鉄イオンの形で利用される物質をいい、例
えば鉄の塩が挙げられる。好ましくは２価もしくは３価
の鉄の無機塩（例、塩化第１鉄，塩化第２鉄，硫酸第１
鉄，硫酸第２鉄，リン酸第２鉄，硝酸第２鉄など）であ
り、とりわけ３価の鉄の鉱酸塩（例、塩化第２鉄，硫酸
第２鉄など）が好ましい。

マンガンイオン源とは、溶液にしたときマンガンイオン
となる物質あるいはマンガンイオンの形で利用される物
質をいい、例えばマンガンの塩が挙げられる。好ましく
はマンガンの無機塩（例、硫酸マンガン，塩化マンガ
ン，炭酸マンガン，リン酸マンガンなど）であり、とり
わけマンガンの鉱酸塩（例、硫酸マンガン，塩化マンガ
ンなど）が好ましい。

鉄イオン源およびマンガンイオン源は、それぞれ単独で
または併用して添加するが、これらの水溶液で添加する
のが好ましい。

鉄イオン源およびマンガンイオン源はそれぞれ10^-6〜10
^-3モル、好ましくは２×10^-5〜５×10^-4モル添加するの
がよく、これらを併用する場合は、それぞれ上記濃度範
囲で加える。

上記大腸菌の培養のための天然物由来の窒素源を添加し
た培地とは、公知の基礎培地に、カザミノ酸，ペプト
ン，イーストエキス、麦芽エキスなど天然物から得られ
る窒素源を添加した培地をいう。これら本発明に用いら
れる培地の組成の一例を第１表に例示する。

本発明の増収法は、酸性で、例えばpH４．８〜６．０に
調整した培地に接種し、当該pH範囲を維持しつつ生育さ
せることにより培養することによっても行うことができ
る。上記pHは５．０〜５．８、とりわけpH５．５付近に
調整することが好ましい。なお、生育が十分達成された
後は、上記pH領域外、例えばより酸性側で培養してもよ
い。所望によりpH調整を行う場合は培地を作製し滅菌す
る前または後に無機塩基または鉱酸を用いて行い、大腸
菌を接種後生育中、さらに所定のpH領域を維持するため
にpH調整を行う。

通常培養によりpHは低下するので塩基性物質、例えばア
ンモニア，水酸化ナトリウム，炭酸ナトリウムなど無機
塩基を添加することにより行うが、所望により硫酸など
の鉱酸を添加することもできる。とりわけアンモニア水
が好ましく、アンモニアを用いる場合は、培地の窒素源
ともなりうる。

宿主菌が栄養要求性を示す場合には、たとえば要求する
アミノ酸（例、Ｌ−リジン，Ｌ−アルギニン，Ｌ−メチ
オニン，Ｌ−ロイシン，Ｌ−プロリン，Ｌ−イソロイシ
ン，Ｌ−バリン，Ｌ−トリプトファンなど）を約10ない
し1000mg/の割合で適宜添加することが好ましい。

又培養中必要に応じて、グルコースやカザミノ酸などの
成分を追加することも可能である。さらに組換え大腸菌
を選択的に増殖させるために、プラスミド中に保持され
ている薬剤耐性等の遺伝子に応じて、耐性を示す薬剤
（テトラサイクリンなど）を添加してもよい。

上記した鉄イオン源またはマンガンイオン源は、通常本
培養の培地にあらかじめ所定の濃度で添加するが、種培
養の培地にも添加することができる。

培養は通常15〜45℃で行われる。λPLプロモーター保持
株では25〜35℃で増殖させたのち42℃付近へシフトアッ
プさせる事により遺伝子を有利に発現させる。

培養は、通常、通気攪拌培養によって行われる。培地中
の酸素濃度を飽和酸素濃度の約５%(V/V)以上になるよう
に保ちつつ培養を行なうと、目的とするインターロイキ
ンの生産量が増大されるので有利である。このために、
培養途中に純酸素を空気と混合して通気することも効果
的である。

かくして生成されるインターロイキンは公知の方法によ
って測定することができる。

例えばＩＬ−２の測定にはＩＬ−２依存性細胞株を用い
ることができるが、ヒトＩＬ−２はヒト以外にラットお
よびマウスなどのＩＬ−２依存性細胞の増殖をも促進す
ることが知られている［イムノロジカル・レビュー，第
５１巻，２５７頁(1980)]ので、ＩＬ−２依存性ヒト細
胞株のみならずラットまたはマウスのＩＬ−２依存性細
胞株を用いることができる［ジャーナル・オブ・イムノ
ロジー，第１３０巻，９８１頁および９８８頁（１９８
３）］。

特にマウスのＩＬ−２依存性細胞株は、長期間安定に継
代維持され得るので再現性の高い測定結果が得られる。

本明細書において全ＩＬ−２の生産量は、ＩＬ−２依存
性マウス細胞を用いて放射性チミジンの取込みを指標と
する方法［バイオケミカル・バイオフイジカル・リサー
チ・コミュニケイションズ，第１０９巻，３６３頁（１
９８２）］によって測定した。

Ala-IL-2の生産量は、菌体からＩＬ−２を７Ｍ−塩酸グ
アニジンで抽出した後透析し、後述するFPLC(Fast Prot
ein Liquid Chromatography)に付してAla-IL-2画分とMe
t-Ala-IL-2画分を分離し、両画分のＩＬ−２活性を上述
の方法で求め、Ala-IL-2の生成比率を算出し、全ＩＬ−
２生産量にこの比率を乗ずる事によって求めた。

精製標品についてはFPLC法で分離されるインターロイキ
ンの280nm吸光度の比率より求めた。

本発明で製造されるインターロイキンを培養菌体から抽
出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体を集め、
菌体を塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤を含む緩衝液
に懸濁し、冷所で攪拌したのち、遠心分離によりインタ
ーロイキンを含む上澄液を得る方法、あるいは緩衝液に
懸濁し、超音波処理，リゾチームおよび（または）凍結
融解によって菌体を破壊したのち、遠心分離によりイン
ターロイキンを含む上澄液を得る方法などが適宜用い得
る。

上記上澄液からインターロイキンを分離，精製するに
は、自体公知の分離，精製法を適切に組み合わせて行う
ことができる。これらの公知の分離，精製法としては、
塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法，透析
法，限外ろ過法，ゲルろ過法およびＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利
用する方法，イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電
の差を利用する方法，アフィニティークロマトグラフィ
ーなどの特異的親和性を利用する方法，逆相高速液体ク
ロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法，等
電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが
挙げられる。特に、ヒトＩＬ−２蛋白質は高い疎水性を
有しているので、疎水性カラムクロマトグラフィーとり
わけ逆相系カラムを用いる高速液体クロマトグラフィー
は該蛋白質の精製に極めて有効である。

上記ＩＬ−２蛋白質が、Ala-IL-2とMet-Ala-IL-2の混合
物である場合、所望により例えば本願出願人が既に出願
したPCT/JP84/00460（国際出願日：１９８４年９月２６
日）に開示した等電点の差異に基づく分離手段によりAl
a-IL-2を単離することができる。

すなわち等電点の差異に基づく分離手段としては、等電
点の差が0.01〜0.2程度である蛋白質を相互に分離する
方法であればどんなものでも適用でき、たとえばアンホ
ラインを利用する密度勾配等電点電気泳動，ゲル等電点
電気泳動法，等速度電気泳動法などの電場の中で蛋白質
を泳動させる方法やクロマトホーカシング法，FPLC法(F
ast Protein Liquid Chromatography),DEAE(diethyl-am
inoethyl)−およびCM(carboxymethyl)-PH勾配イオン交
換カラムクロマトグラフ法などのカラム中にPH勾配を作
成して担体から蛋白質を順に脱離して溶出させる方法な
ど自体公知の方法やこれらを組合せた方法などが挙げら
れる。これらの分離法に用いられる試薬および器具類は
いずれも市販されているものであり容易に入手可能であ
る。

かくして精製されるＮ末端に翻訳開始コドンＡＴＧに対
応するメチオニン残基のないインターロイキンは、天然
のインターロイキンなど公知のインターロイキンと同様
の生理活性を有し、医薬品等として使用することができ
る。

Ala-IL-2蛋白質は公知のＩＬ−２と同様に、たとえば腫
瘍抗原を認識し、破壊する抗原特異的なキラーＴ細胞や
抗原感作の経験の有無と無関係に腫瘍を殺す能力をもつ
ところのナチュラルキラー細胞をインビトロで選択的に
増殖させることができ、またこのキラーＴ細胞を生体へ
移入する際に、該ＩＬ−２を同時に接種することによ
り、その抗腫瘍効果を増大させることから、温血動物
（例、マウス，ラット，ウサギ，犬，ネコ，ブタ，ウ
マ，ヒツジ，ウシ，ヒトなど）の腫瘍の予防，治療や免
疫機能低下疾患の治療のために用いることができる。

上記Ala-IL-2蛋白質を腫瘍の予防，治療剤として用いる
には、当該蛋白質を自体公知の担体と混合稀釈して、た
とえば注射剤，カプセル剤などとして非経口的にまたは
経口的に投与することができる。さらに、前述したよう
にインビトロで増殖させたキラーＴ細胞やナチュラルキ
ラー細胞と共にまたは単独で使用することができる。

また上記Ala-IL-2蛋白質は、公知の天然から分離された
ヒトＩＬ−２と実質的に同じ生物活性を有するのでこれ
と同様に使用することができ、細胞のＩＬ−２受容体と
の解離定数がきわめて小さいことから、極く小量の投与
で良い。

作用および実施例 以下に実施例および参考例を挙げて本発明を更により具
体的に説明する。

なお実施例中に開示する形質転換体につき通商産業省工
業技術院微生物工業技術研究所(FRI)および財団法人発
酵研究所(IFO)にそれぞれ第２表に示す寄託番号で寄託
されている。

実施例１ 参考例１（ii）で得たE.coli N4830/pTB285をＬ培地
（バクトトリプトン10g/，バクトイーストエキス5g/
，食塩5g/）にアンピシリンナトリウム50mg/，お
よびテトラサイクリン塩酸15mg/を添加した培地50ml
に接種し、37℃一夜回転振盪培養した。この培養液を修
正Ｍ−９培地2.5宛分注し、第３表に示す各種金属塩
を添加した５容ジャーファーメンターに移し、通気量
2.5／分，攪拌1000rpm，温度30℃で培養を開始した。
途中生育が1000クレット単位に達した時42℃へ温度をシ
フトアップし更に４時間培養を続けた後、集菌凍結し
た。夫々の凍結菌体についてAla-IL-2の生産性を調べ第
３表の結果を得た。

第３表から明らかなとおり、Mn⁺⁺または（および）Fe
⁺⁺⁺を添加するとAla-IL-2生産性が著しく向上したにも
かかわらず、他の金属イオン源(Cu⁺⁺,Zn⁺⁺,Ca⁺⁺,Co⁺⁺)
を添加しても何等生産性が向上しなかった。

実施例２ 実施例１と同様にして種々の濃度のMnイオンを添加した
M-33培地にてE.coli N4830/pTB285株を培養し、第４表
に示す結果を得た。

実施例３ 実施例１と同様にして種々の濃度のFeイオンを添加した
M-33培地にてE.coli N4830/pTB285株を培養し第５表の
結果を得た。

実施例４ Ｅ．coli N4830/pTB285を250ml容三角フラスコ内のＬ−
培地にアンピシリン・ナトリウム50mg/を含む液体培
地(pH7.0)50ml６本に接種して30℃で一晩回転振盪培養
した。この培養液を(A)アンピシリン・ナトリウム50mg/
を含むM-33培地2.5および(B)アンピシリン・ナトリ
ウム50mg/，ＭｎＳＯ_４・４〜６Ｈ_２Ｏ ８×10^-5モ
ルおよびＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ ４×10^-4モルを含むM-
33培地2.5に夫々125mlづつ接種し、通気量2.5/mi
n，攪拌1000rpm，温度30℃で培養を開始し、途中pHはア
ンモニア水で6.5に保った。また、グルコース濃度が0.5
％以下になったときに、グルコースおよびカザミノ酸を
夫々１％づつ添加した。さらに、生育が1000クレット単
位に達したときに42℃へ温度を変更し、変更後４時間目
に培養を終了し、得られた培養液を夫々遠心分離し、菌
体を集め-80℃で凍結して保存した。

得られた凍結菌体夫々12gを７Ｍ塩酸グアニジン0.1M Tr
is-HClを含む抽出液(pH7.0)100mlに均一に懸濁し、４℃
で１時間攪拌した後、28,000×ｇで20分間遠心分離し上
清を得た。

得られた夫々の上清を0.01M Tris-HCl緩衝液(pH8.5)に
対して透析後19,000×ｇで10分間遠心分離して得た上清
を0.01M Tris-HCl緩衝液(pH8.5)で平衡化したDE52(DEAE
-セルロース，ワットマン社製，イギリス）カラム(50ml
容）に通して蛋白を吸着後、NaCl濃度直線勾配(0〜0.15
M NaCl,1)を作成して、ＩＬ−２を溶出させ、活性画分
を夫々得た。

上記で得られた活性画分をYM-5メンブラン（アミコン社
製，アメリカ）を用いて、夫々約５mlに濃縮し、0.1M T
ris-HCl(pH8.0)-1M NaCl緩衝液で平衡化したセファクリ
ルS-200（ファルマシア製，スウエーデン）カラム(500m
l容）を用いてゲルろ過を行った。活性画分夫々約30ml
をYM-5メンブランで夫々約2.5mlに濃縮した。得られた
濃縮液を、ウルトラポアRPSC（アルテックス社製，アメ
リカ）カラムに吸着させ、トリフルオロ酢酸−アセトニ
トリル系を溶出溶媒とする高速液体クロマトグラフィー
を行った。カラム，ウルトラポアRPSC(4.6×75mm)；カ
ラム温度，30℃：溶出溶媒A,0.1％トリフルオロ酢酸-9
9.9％水；溶出溶媒B,0.1％トリフルオロ酢酸-99.9％ア
セトニトリル；溶出プログラム，０分(68%A+32%B)-25分
(55%A+45%B)-35分(45%A+55%B)-45分(30%A+70%B)-48分(1
00%B)；溶出速度，0.8ml/min；検出波長，230nm。

本条件下で保持時間約39分の活性画分，夫々約10mlを集
めた。

かくして得られたAla-IL-2およびMet-Ala-IL-2の混合物
を含む液を凍結乾燥後、0.005M酢酸アンモニウム緩衝液
(pH5.0)夫々５mlに溶解後、0.025Mジエタノールアミン
−塩酸緩衝液(pH9.4)で平衡化したFPLC用モノＰカラム
(0.5×20cm，ファルマシア製）にのせ、ついで１％(V/
V)ファルマライト(8-10.5)-5.2%(V/V)ポリバッファー96
-塩酸緩衝液(pH8.0)を用いてモノＰカラムに吸着したタ
ンパク質を溶出した。なお、FPLCは室温下、流速30ml/h
でおこなった。溶出容量17〜19mlの活性画分を夫々分取
後、ポリバッファーを除去するため、トリフルオロ酢酸
−アセトニトリル系を溶出溶媒とする高速液体クロマト
グラフィーを行った：カラム，ウルトラポアRPSC(1.0×
25cm，アルテックス社製）；カラム温度，溶出溶媒A,B
は前記とおなじ；溶出プログラム，０分(55%A+45%B)-４
分(55%A+45%B)-28分(42%A+58%B)-38分(34%A+66%B)-43分
(20%A+80%B)-44分(55%A+45%B)；溶出速度3.0ml/min。

得られたAla-IL-2画分、夫々を凍結乾燥に付し、白色粉
末を得た。

金属塩無添加の培地(A)から得られた上記粉末量は1.53m
gであるのに対し、金属塩添加培地(B)からは6.31mgの粉
末が得られた。

これら２つの標品について、気相プロティンシークエン
サー（アプライド・バイオシステムズ社製470A型）を用
い、自動エドマン分解法によりＮ末端アミノ酸の同定を
おこなったところ、夫々98％以上がAlaであることが確
認された。また他の蛋白化学的諸性質（Ｃ末端アミノ
酸，アミノ酸組成分析，ペプチッドマッピング）は全く
同一であることもあわせて確認された。

参考例１ ヒトＩＬ−２を産生する形質転換体の製造 （ｉ）ヒトＩＬ−２遺伝子を有するプラスミドplLOT 13
5-8［特願昭58-225079号（昭和58年11月28日出願）、該
出願は特開昭６０−１１５５２８号として公開されてい
る。明細書実施例１（vii）参照］を制限酵素HgiAIで切
断した。得られた1294bpDNA断片をＴ４ＤＮＡポリメラ
ーゼで平滑末端とし、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、Ec
oRIリンカーdTGCCATGAATTCATGGCAを結合させた。得られ
たＤＮＡをEcoRIで消化し、翻訳開始コドンＡＴＧおよ
びヒトＩＬ−２遺伝子を有するＤＮＡ断片を得た。

このＤＮＡ断片を、あらかじめEcoRI-PstI部位を消化し
たptrp781［ヌクレイック・アシズ・リサーチ，第11
巻，3077頁(1983)]にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて挿入
した。かくして得られた発現用プラスミドpTF1はtrpプ
ロモーターの下流に翻訳開始コドンとヒトＩＬ−２遺伝
子を有する（第３図）。

プラスミドpTF1を制限酵素StuIで切断し、Bam HIリンカ
ーと結合させた。このプラスミドＤＮＡを制限酵素Bam
HIおよびEcoRIで処理し、ついでEcoRI-Bam HI部位にλP
Lプロモーターを有するプラスミドpTB281に挿入した。
かくして得た発現用プラスミドをpTB285と命名した（第
４図）。

（ii）上記で得たプラスミドpTB285でＥ．coli N4830を
コーエンらの方法［プロシージングス・オブ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンスUSA，第69巻，2110
頁(1972)]に従い形質転換し、上記プラスミドを含有す
る形質転換体エシェリヒア コリN4830/pTB285を得た。

発明の効果 翻訳開始コドンＡＴＧの下流にインターロイキンの構造
遺伝子を、かつその上流にλＰＬプロモーターを含有す
る発現ベクターを有する大腸菌の培養によりインターロ
イキンを製造する方法において、当該大腸菌を（１）鉄
イオン源または（および）マンガンイオン源および
（２）天然物由来の窒素源を添加した培地で培養するこ
とを特徴とするＮ末端に翻訳開始コドンＡＴＧに対応す
るメチオニン残基のないインターロイキンの増収法を提
供するものである。

本発明の方法により、天然のインターロイキンと同一の
アミノ酸配列を有するインターロイキンなどＮ末端に翻
訳開始コドンＡＴＧに対応するメチオニン残基のないイ
ンターロイキンを増収することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はヒトＩＬ−２のアミノ酸配列を示す。第２図は
ヒトＩＬ−２をコードするＤＮＡの塩基配列の一例を示
す。 第３図および第４図は参考例に記載したプラスミドpTF1
およびpTB285の構築図をそれぞれ示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】翻訳開始コドンＡＴＧの下流にインターロ
   イキンの構造遺伝子を、かつその上流にλＰＬプロモー
   ターを含有する発現ベクターを有する大腸菌の培養によ
   りインターロイキンを製造する方法において、当該大腸
   菌を（１）鉄イオン源または（および）マンガンイオン
   源および（２）天然物由来の窒素源を添加した培地で培
   養することを特徴とするＮ末端に翻訳開始コドンＡＴＧ
   に対応するメチオニン残基のないインターロイキンの増
   収法。