JPH0889278A - 遺伝子導入用修飾蛋白質及びその製法 - Google Patents
遺伝子導入用修飾蛋白質及びその製法Info
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- JPH0889278A JPH0889278A JP6270102A JP27010294A JPH0889278A JP H0889278 A JPH0889278 A JP H0889278A JP 6270102 A JP6270102 A JP 6270102A JP 27010294 A JP27010294 A JP 27010294A JP H0889278 A JPH0889278 A JP H0889278A
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
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- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
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- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 本発明は、少なくとも１つ以上のグルタミン
残基を有する生理活性ペプチド又は生理活性蛋白質とア
ミノ供与体を有し核酸を包含する能力を有する高分子物
質とを、トランスグルタミナーゼ（Ｇｌｕｔａｍｉｎｙ
ｌ−ｐｅｐｔｉｄｅ：ａｍｉｎｅ γ−ｇｌｕｔａｍｙ
ｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）の存在下に反応せしめて、
該グルタミン残基のγ−位酸アミドにおいて該アミノ供
与体のアミノ基と酸アミド結合を形成せしめることを特
徴とする核酸包含用の生理活性ペプチド又は生理活性蛋
白質の製造方法、そのペプチド又は蛋白質誘導体、及
び、核酸包含物質に関する。 【効果】 生理活性ペプチド又は生理活性蛋白質の特性
を損なうことなく、核酸を包含する能力を有する高分子
物質が結合したペプチド又は蛋白質誘導体を得ることが
できる。また、当該誘導体を用いることにより選択的に
遺伝子を細胞に導入することができる。
残基を有する生理活性ペプチド又は生理活性蛋白質とア
ミノ供与体を有し核酸を包含する能力を有する高分子物
質とを、トランスグルタミナーゼ（Ｇｌｕｔａｍｉｎｙ
ｌ−ｐｅｐｔｉｄｅ：ａｍｉｎｅ γ−ｇｌｕｔａｍｙ
ｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）の存在下に反応せしめて、
該グルタミン残基のγ−位酸アミドにおいて該アミノ供
与体のアミノ基と酸アミド結合を形成せしめることを特
徴とする核酸包含用の生理活性ペプチド又は生理活性蛋
白質の製造方法、そのペプチド又は蛋白質誘導体、及
び、核酸包含物質に関する。 【効果】 生理活性ペプチド又は生理活性蛋白質の特性
を損なうことなく、核酸を包含する能力を有する高分子
物質が結合したペプチド又は蛋白質誘導体を得ることが
できる。また、当該誘導体を用いることにより選択的に
遺伝子を細胞に導入することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、ｉ）生体の細胞の特
定な受容体に結合する能力を持つ生理活性ペプチド又は
生理活性蛋白質と、ｉｉ）核酸、特にＤＮＡと親和性を
持ちこれを包含する能力を有する高分子物質の２者の結
合体及びその製法に関する。この結合体は特定な受容体
を持つ細胞に結合し、この結合体が包含している核酸を
細胞内に導入することができる。生体特定細胞又は特定
臓器又は癌細胞への遺伝子を導入する遺伝子治療を目的
とした結合体及びその作成法に関する発明である。
定な受容体に結合する能力を持つ生理活性ペプチド又は
生理活性蛋白質と、ｉｉ）核酸、特にＤＮＡと親和性を
持ちこれを包含する能力を有する高分子物質の２者の結
合体及びその製法に関する。この結合体は特定な受容体
を持つ細胞に結合し、この結合体が包含している核酸を
細胞内に導入することができる。生体特定細胞又は特定
臓器又は癌細胞への遺伝子を導入する遺伝子治療を目的
とした結合体及びその作成法に関する発明である。
【０００２】生理活性ペプチド又は生理活性蛋白質が数
多く知られている。以下これらをまとめて生理活性ペプ
チドと称することがある。例えば、インターロイキン
（ＩＬ）−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、
−８、−９、−１０、−１１、−１２、Ｇ−ＣＳＦ、Ｇ
Ｍ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、エリスロポエチン（Ｅｒｙｔ
ｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）、幹細胞因子（Ｓｔｅｍ ｃｅ
ｌｌ ｆａｃｔｏｒ）、ｍｐｌ−リガンド（ｍｐｌ−ｌ
ｉｇａｎｄ）、α−、β−、γ−インターフェロン、ソ
マトスタチン、バソプレッシン（ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉ
ｎ）、インシュリン（Ｉｎｓｕｌｉｎ）、 成長ホルモ
ン（Ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ）、サブスタンスＰ
（Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐ）等、人体中で生理的に働い
ているペプチドとこれらを改変したペプチド、ボンベシ
ンの様に動物由来のもの、ジフテリア毒素の様な微生物
由来のもの、レクチンの様な植物由来のもの等、広く天
然界より生理活性ペプチドが得られている。抗体も生理
活性ペプチドに含まれる。抗体としてはヒトのモノクロ
ーナル抗体ばかりでなく、動物のモノクローナル抗体も
含まれる。生理活性ペプチドの多くは対応する受容体に
特異的に結合することによりその生理機能を発揮する。
抗体は対応する抗原と特異的に結合する。また、可溶性
受容体は生体に存在している物と遺伝子組み換え法によ
り人為的に作る物があるが、これら可溶性受容体も生体
膜上の受容体同様対応するリガンドに特異的に結合す
る。
多く知られている。以下これらをまとめて生理活性ペプ
チドと称することがある。例えば、インターロイキン
（ＩＬ）−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、
−８、−９、−１０、−１１、−１２、Ｇ−ＣＳＦ、Ｇ
Ｍ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、エリスロポエチン（Ｅｒｙｔ
ｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）、幹細胞因子（Ｓｔｅｍ ｃｅ
ｌｌ ｆａｃｔｏｒ）、ｍｐｌ−リガンド（ｍｐｌ−ｌ
ｉｇａｎｄ）、α−、β−、γ−インターフェロン、ソ
マトスタチン、バソプレッシン（ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉ
ｎ）、インシュリン（Ｉｎｓｕｌｉｎ）、 成長ホルモ
ン（Ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ）、サブスタンスＰ
（Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐ）等、人体中で生理的に働い
ているペプチドとこれらを改変したペプチド、ボンベシ
ンの様に動物由来のもの、ジフテリア毒素の様な微生物
由来のもの、レクチンの様な植物由来のもの等、広く天
然界より生理活性ペプチドが得られている。抗体も生理
活性ペプチドに含まれる。抗体としてはヒトのモノクロ
ーナル抗体ばかりでなく、動物のモノクローナル抗体も
含まれる。生理活性ペプチドの多くは対応する受容体に
特異的に結合することによりその生理機能を発揮する。
抗体は対応する抗原と特異的に結合する。また、可溶性
受容体は生体に存在している物と遺伝子組み換え法によ
り人為的に作る物があるが、これら可溶性受容体も生体
膜上の受容体同様対応するリガンドに特異的に結合す
る。
【０００３】これら特異的結合を利用して特定の生理活
性ペプチドを標的分子として利用する事が考えられてい
る。例えばＩＬ−６分子にジフテリアトキシンを結合
し、ＩＬ−６受容体を持つ癌細胞へ特異的にトキシンを
送り込み、癌細胞を殺す試みがなされている。癌特異的
抗原を認識するモノクローナル抗体に制癌剤を結合さ
せ、制癌剤を癌細胞に特異的に送り込む事も同様に有効
な方法として開発されている。
性ペプチドを標的分子として利用する事が考えられてい
る。例えばＩＬ−６分子にジフテリアトキシンを結合
し、ＩＬ−６受容体を持つ癌細胞へ特異的にトキシンを
送り込み、癌細胞を殺す試みがなされている。癌特異的
抗原を認識するモノクローナル抗体に制癌剤を結合さ
せ、制癌剤を癌細胞に特異的に送り込む事も同様に有効
な方法として開発されている。
【０００４】さらに、ドラッグデリバリーシステム（Ｄ
ＤＳ）において、生理活性ペプチドを利用する試みは遺
伝子治療の領域でも重要である。Ｇｅｏｒｇｅ Ｙ．Ｗ
ｕらは、化学的方法によりオロソムコイド（ｏｒｏｓｏ
ｍｕｃｏｉｄ）などの生理活性ペプチドにポリリジン
（プラス荷電を持つ）を結合させ、この複合体でＤＮＡ
プラスミド（マイナス荷電）を包み、オロソムコイドに
対する受容体を持つ肝細胞にＤＮＡを送り込む遺伝子療
法を開発した（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，１
４６２１，１９８８）。この結合体は静注することによ
り遺伝子を肝臓へ導入でき、遺伝子輸送体として大きな
期待が持たれている。導入する遺伝子により治療する対
象は異なるが、例えば、チミジンカイネース遺伝子を肝
臓に導入し、チミジンカイネースで活性化される抗癌剤
ガンシクロビルを投与し、肝臓だけで制癌剤が活性化さ
れることにより、副作用の少ない癌治療を行なうことも
遺伝子治療の一つの方法である。
ＤＳ）において、生理活性ペプチドを利用する試みは遺
伝子治療の領域でも重要である。Ｇｅｏｒｇｅ Ｙ．Ｗ
ｕらは、化学的方法によりオロソムコイド（ｏｒｏｓｏ
ｍｕｃｏｉｄ）などの生理活性ペプチドにポリリジン
（プラス荷電を持つ）を結合させ、この複合体でＤＮＡ
プラスミド（マイナス荷電）を包み、オロソムコイドに
対する受容体を持つ肝細胞にＤＮＡを送り込む遺伝子療
法を開発した（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，１
４６２１，１９８８）。この結合体は静注することによ
り遺伝子を肝臓へ導入でき、遺伝子輸送体として大きな
期待が持たれている。導入する遺伝子により治療する対
象は異なるが、例えば、チミジンカイネース遺伝子を肝
臓に導入し、チミジンカイネースで活性化される抗癌剤
ガンシクロビルを投与し、肝臓だけで制癌剤が活性化さ
れることにより、副作用の少ない癌治療を行なうことも
遺伝子治療の一つの方法である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】遺伝子治療を目的とし
て核酸を人体に投与した場合には、核酸が酵素的に速や
かに分解されてしまう、また、ＤＮＡが容易に細胞内に
進入できないなどの問題がある。さらに、遺伝子治療に
おいて遺伝子がゲノムに挿入される場合は挿入部位によ
り細胞の機能を損なう場合があり、また、導入遺伝子に
よる発現産物が細胞の機能を損なう場合もある。このた
めに、ｉ）核酸を分解されない状態で細胞に到達させる
こと、ｉｉ）核酸を高率に細胞内へ導入する必要があ
り、かつ、できるかぎり治療上必要な特定の細胞に遺伝
子を導入することが望まれる。
て核酸を人体に投与した場合には、核酸が酵素的に速や
かに分解されてしまう、また、ＤＮＡが容易に細胞内に
進入できないなどの問題がある。さらに、遺伝子治療に
おいて遺伝子がゲノムに挿入される場合は挿入部位によ
り細胞の機能を損なう場合があり、また、導入遺伝子に
よる発現産物が細胞の機能を損なう場合もある。このた
めに、ｉ）核酸を分解されない状態で細胞に到達させる
こと、ｉｉ）核酸を高率に細胞内へ導入する必要があ
り、かつ、できるかぎり治療上必要な特定の細胞に遺伝
子を導入することが望まれる。
【０００６】前記の問題を解決するためには、核酸の分
解を抑えるために核酸を何等かのポリマーで包含するこ
とが一つの解決法であり、核酸を特定の細胞内へ導入す
る為に細胞上の特定のレセプターと結合するリガンドと
核酸包含体を結合し、リガンド−レセプター結合による
エンドサイトーシスを利用して核酸を特定細胞内へ導入
することが一つの解決法である。この場合に、核酸を包
含するポリマーとリガンドである生理活性ペプチドを結
合しておくことが必要である。
解を抑えるために核酸を何等かのポリマーで包含するこ
とが一つの解決法であり、核酸を特定の細胞内へ導入す
る為に細胞上の特定のレセプターと結合するリガンドと
核酸包含体を結合し、リガンド−レセプター結合による
エンドサイトーシスを利用して核酸を特定細胞内へ導入
することが一つの解決法である。この場合に、核酸を包
含するポリマーとリガンドである生理活性ペプチドを結
合しておくことが必要である。
【０００７】一般に生理活性ペプチドと修飾するポリマ
ーの結合を化学反応により行なうと両者の活性が損なわ
れ易い点と種々の副反応により副成物ができて、一定の
高純度の品質保証が要求される医薬品としての品質維持
が困難となる。核酸を包含する能力を有する高分子物質
と生理活性ペプチドとの結合を、穏和な条件下で特異的
に行うための実用的製法の開発が必要とされていた。
ーの結合を化学反応により行なうと両者の活性が損なわ
れ易い点と種々の副反応により副成物ができて、一定の
高純度の品質保証が要求される医薬品としての品質維持
が困難となる。核酸を包含する能力を有する高分子物質
と生理活性ペプチドとの結合を、穏和な条件下で特異的
に行うための実用的製法の開発が必要とされていた。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記の問
題点を解決するために研究を重ねた結果、核酸を包含す
る能力を有する高分子物質と生理活性ペプチドとを、ト
ランスグルタミナーゼを用いることにより、穏和な条件
で結合させることができることを見出した。トランスグ
ルタミナーゼ（ＥＣ２．３．２．１３）（系続名：ｐｒ
ｏｔｅｉｎ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ：γ−ｇｌｕｔａｍｙ
ｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）はペプチドまたは蛋白質中
のグルタミン残基とアミノ基を有する物質のアミノ基を
特異的に結合させることのできる公知の酵素である。ト
ランスグルタミナーゼについては、既に種々の文献で報
告されているが、その一例として次のものを挙げること
ができる。 （イ）Ｊ．Ｅ．Ｆｏｌｋ ｅｔ ａｌ，Ａｄｖ．Ｐｒｏ
ｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．３１，１−１３３，１９７７ （ロ）Ｊ．Ｅ．Ｆｏｌｋ ｅｔ ａｌ，Ａｄｖ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌ，３８，１０９−１９１，１９７３ （ハ）Ｈ．Ｂｏｈｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢ
ｉｏｃｈｅｍ．２０，６７−７５，１９７８ （ニ）Ｌ．Ｌｏｒａｎｄ ｅｔ ａｌ，Ｈａｎｄｂｏｏ
ｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２，Ｐｒｏｔ
ｅｉｎｓ，ｅｄ Ｇ．Ｄ．Ｆａｓｍａｎ，ｐｐ．６６９
−６８５，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ：ＣＲＣ．３ｒｄ ｅ
ｄ． （ホ）Ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ ａｎｄ ｒａｂｂｉｔ
ｌｉｖｅｒ ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ：Ｔ．
Ａｂｅ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１
６，５４９５−５５０１（１９７７） （ヘ）ｈｕｍａｎ ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ
ｔｒａｎｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ：Ｓ．Ｃ．Ｂｒｅｎｎ
ｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．
Ａｃｔａ ５２２，７４−８３，１９７８ （ト）Ｒａｔ ｃｏａｇｕｌａｔｉｎｇ ｇｌａｎｄ
ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ：Ｊ．Ｗｉｌｓｏｎ
ｅｔ ａｌ Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．，３８，１８０９
（Ａｂｓｔｒ．），（１９７９）
題点を解決するために研究を重ねた結果、核酸を包含す
る能力を有する高分子物質と生理活性ペプチドとを、ト
ランスグルタミナーゼを用いることにより、穏和な条件
で結合させることができることを見出した。トランスグ
ルタミナーゼ（ＥＣ２．３．２．１３）（系続名：ｐｒ
ｏｔｅｉｎ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ：γ−ｇｌｕｔａｍｙ
ｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）はペプチドまたは蛋白質中
のグルタミン残基とアミノ基を有する物質のアミノ基を
特異的に結合させることのできる公知の酵素である。ト
ランスグルタミナーゼについては、既に種々の文献で報
告されているが、その一例として次のものを挙げること
ができる。 （イ）Ｊ．Ｅ．Ｆｏｌｋ ｅｔ ａｌ，Ａｄｖ．Ｐｒｏ
ｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．３１，１−１３３，１９７７ （ロ）Ｊ．Ｅ．Ｆｏｌｋ ｅｔ ａｌ，Ａｄｖ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌ，３８，１０９−１９１，１９７３ （ハ）Ｈ．Ｂｏｈｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢ
ｉｏｃｈｅｍ．２０，６７−７５，１９７８ （ニ）Ｌ．Ｌｏｒａｎｄ ｅｔ ａｌ，Ｈａｎｄｂｏｏ
ｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２，Ｐｒｏｔ
ｅｉｎｓ，ｅｄ Ｇ．Ｄ．Ｆａｓｍａｎ，ｐｐ．６６９
−６８５，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ：ＣＲＣ．３ｒｄ ｅ
ｄ． （ホ）Ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ ａｎｄ ｒａｂｂｉｔ
ｌｉｖｅｒ ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ：Ｔ．
Ａｂｅ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１
６，５４９５−５５０１（１９７７） （ヘ）ｈｕｍａｎ ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ
ｔｒａｎｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ：Ｓ．Ｃ．Ｂｒｅｎｎ
ｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．
Ａｃｔａ ５２２，７４−８３，１９７８ （ト）Ｒａｔ ｃｏａｇｕｌａｔｉｎｇ ｇｌａｎｄ
ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ：Ｊ．Ｗｉｌｓｏｎ
ｅｔ ａｌ Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．，３８，１８０９
（Ａｂｓｔｒ．），（１９７９）
【０００９】また、トランスグルタミナーゼはその由来
により、種々のものが知られている。例えば、微生物由
来のトランスグルタミナーゼ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｔ
ｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ、以下単にＢＴＧと記
す。Ｈ．Ａｎｄｏ ｅｔ ａｌ，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，５３（１０），２６１３−２６１７
（１９８９），Ｋ．Ｗａｓｈｉｚｕ ｅｔ ａｌ，Ｂｉ
ｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５８
（１），８２−８７（１９９４）などで報告れてい
る。）、肝トランスグルタミナーゼ（ｌｉｖｅｒ ｔｒ
ａｎｓｇｌｕｔａｍｆａｓｅ）、 血漿子ＸＩＩＩ（ａ
ｐｌａｓｍａ ｆａｃｔｏｒ ＸＩＩＩａ）、血小板−
胎盤因子ＸＩＩＩａ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｎｄ ｐｌ
ａｃｅｎｔａｌ ｆａｃｔｏｒ ＸＩＩＩａ）、ヘアー
ホリックトランスグルタミナーゼ（Ｈａｉｒ−ｆｏｌｌ
ｉｃｌｅ ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｎａｓｅ）、 上皮ト
ランスグルタミナーゼ（Ｅｐｉｄｅｍａｌ ｔｒａｎｓ
ｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ）、プロステイトトランスグル
タミナーゼ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ ｔｒａｎｓｇｌｕｔａ
ｍｉｎａｓｅ）などの動物由来のトランスグルタミナー
ゼ（Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎ
ａｓｅ）などが知られている。本発明で用いられるトラ
ンスグルタミナーゼとしては、いずれの由来のものも使
用することができるが、ＢＴＧを用いるのが好ましい。
により、種々のものが知られている。例えば、微生物由
来のトランスグルタミナーゼ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｔ
ｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ、以下単にＢＴＧと記
す。Ｈ．Ａｎｄｏ ｅｔ ａｌ，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，５３（１０），２６１３−２６１７
（１９８９），Ｋ．Ｗａｓｈｉｚｕ ｅｔ ａｌ，Ｂｉ
ｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５８
（１），８２−８７（１９９４）などで報告れてい
る。）、肝トランスグルタミナーゼ（ｌｉｖｅｒ ｔｒ
ａｎｓｇｌｕｔａｍｆａｓｅ）、 血漿子ＸＩＩＩ（ａ
ｐｌａｓｍａ ｆａｃｔｏｒ ＸＩＩＩａ）、血小板−
胎盤因子ＸＩＩＩａ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｎｄ ｐｌ
ａｃｅｎｔａｌ ｆａｃｔｏｒ ＸＩＩＩａ）、ヘアー
ホリックトランスグルタミナーゼ（Ｈａｉｒ−ｆｏｌｌ
ｉｃｌｅ ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｎａｓｅ）、 上皮ト
ランスグルタミナーゼ（Ｅｐｉｄｅｍａｌ ｔｒａｎｓ
ｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ）、プロステイトトランスグル
タミナーゼ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ ｔｒａｎｓｇｌｕｔａ
ｍｉｎａｓｅ）などの動物由来のトランスグルタミナー
ゼ（Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎ
ａｓｅ）などが知られている。本発明で用いられるトラ
ンスグルタミナーゼとしては、いずれの由来のものも使
用することができるが、ＢＴＧを用いるのが好ましい。
【００１０】トランスグルタミナーゼによる結合の場合
は反応が特異的な位置に限られる為に副成物の種類も少
なく、制御もしやすい利点がある。また、酵素反応であ
るために、化学反応に対して以下の優位点がある。 ｉ） 結合対象物の機能を失わせずに特定の位置での結
合物を作成できる可能性が高い。 ｉｉ） 結合反応条件が生理的条件であるために、結合
対象物を変性させない。 ｉｉｉ） 品質を一定に保てる為、高品質の医薬品が製
造できる。
は反応が特異的な位置に限られる為に副成物の種類も少
なく、制御もしやすい利点がある。また、酵素反応であ
るために、化学反応に対して以下の優位点がある。 ｉ） 結合対象物の機能を失わせずに特定の位置での結
合物を作成できる可能性が高い。 ｉｉ） 結合反応条件が生理的条件であるために、結合
対象物を変性させない。 ｉｉｉ） 品質を一定に保てる為、高品質の医薬品が製
造できる。
【００１１】一方、蛋白質と蛋白質を結合させる方法は
遺伝子同士を結合させる組換えＤＮＡの技術を用いる方
法がある。組換えＤＮＡ法に対して、トランスグルタミ
ナーゼを用いる方法は以下の利点が有る。 ｉ） 組換えＤＮＡ法に比して、ＤＮＡから直接合成で
きない物質、例えば、糖鎖、糖蛋白、糖脂質、ＰＥＧ等
も結合させることができる。 ｉｉ） 組換えＤＮＡ法では一方の蛋白質のＮ末端或は
Ｃ末端にもう一方の蛋白質を結合させた融合蛋白質しか
作れない。 ｉｉｉ） 組換えＤＮＡ法ではＮ末端或はＣ末端にもう
一方の蛋白質が結合した融合蛋白質しか得られないの
で、活性中心が蛋白質の末端に存在してると、この融合
蛋白質は活性を失う可能性が高い。 一方、トランスグルタミナーゼを用いると、グルタミン
のアミノ基に限定してアミノ基を有する物質を結合させ
る訳で、組換えＤＮＡ法とは異なる結合体が得られる。
ＢＴＧでの結合の制御により、両者の活性を保持した結
合体が得られる。
遺伝子同士を結合させる組換えＤＮＡの技術を用いる方
法がある。組換えＤＮＡ法に対して、トランスグルタミ
ナーゼを用いる方法は以下の利点が有る。 ｉ） 組換えＤＮＡ法に比して、ＤＮＡから直接合成で
きない物質、例えば、糖鎖、糖蛋白、糖脂質、ＰＥＧ等
も結合させることができる。 ｉｉ） 組換えＤＮＡ法では一方の蛋白質のＮ末端或は
Ｃ末端にもう一方の蛋白質を結合させた融合蛋白質しか
作れない。 ｉｉｉ） 組換えＤＮＡ法ではＮ末端或はＣ末端にもう
一方の蛋白質が結合した融合蛋白質しか得られないの
で、活性中心が蛋白質の末端に存在してると、この融合
蛋白質は活性を失う可能性が高い。 一方、トランスグルタミナーゼを用いると、グルタミン
のアミノ基に限定してアミノ基を有する物質を結合させ
る訳で、組換えＤＮＡ法とは異なる結合体が得られる。
ＢＴＧでの結合の制御により、両者の活性を保持した結
合体が得られる。
【００１２】本発明の核酸を包含する能力を有する高分
子物質と生理活性ペプチドとの結合は、使用するトラン
スグルタミナーゼの酵素反応条件下で反応させることが
できる。たとえば、ＢＴＧを使用する場合には温度４〜
５５℃、好ましくは３０〜５０℃で、ｐＨが５〜８、好
ましくはｐＨ６〜７で反応させることができる。
子物質と生理活性ペプチドとの結合は、使用するトラン
スグルタミナーゼの酵素反応条件下で反応させることが
できる。たとえば、ＢＴＧを使用する場合には温度４〜
５５℃、好ましくは３０〜５０℃で、ｐＨが５〜８、好
ましくはｐＨ６〜７で反応させることができる。
【００１３】トランスグルタミナーゼ活性測定法。 本発明でいうトランスグルタミナーゼの活性単位は次の
ように測定される。すなわち、温度３７℃、ｐＨ６．０
のトリス緩衝液中動物由来酵素の場合は５ｍＭのＣａ
２＋存在下で、微生物由来酵素の場合は非存在下でベン
ジルオキシカルボニルーＬ−グルタミングリシン及びヒ
ドロキシルアミンを基質とする反応系で、トランスグル
タミナーゼを作用せしめ、生成したヒドロキサム酸をト
リフロロ酢酸存在下で鉄錯体をを形成させた後、５２５
ｎｍにおける吸光度を測定し、ヒドロキサム酸量を検量
線により求め、１分間に１μモルのヒドロキサム酸を生
成せしめた酵素をトランスグルタミナーゼの活性単位、
１ユニット（１Ｕ）とする。
ように測定される。すなわち、温度３７℃、ｐＨ６．０
のトリス緩衝液中動物由来酵素の場合は５ｍＭのＣａ
２＋存在下で、微生物由来酵素の場合は非存在下でベン
ジルオキシカルボニルーＬ−グルタミングリシン及びヒ
ドロキシルアミンを基質とする反応系で、トランスグル
タミナーゼを作用せしめ、生成したヒドロキサム酸をト
リフロロ酢酸存在下で鉄錯体をを形成させた後、５２５
ｎｍにおける吸光度を測定し、ヒドロキサム酸量を検量
線により求め、１分間に１μモルのヒドロキサム酸を生
成せしめた酵素をトランスグルタミナーゼの活性単位、
１ユニット（１Ｕ）とする。
【００１４】本発明のアミノ供与体を有し、核酸を包含
する能力を有する高分子物質としては、分子中にアミノ
基を有し、核酸、特にＤＮＡを包含できる能力を有する
ものであれば特に制限はないが、次のような条件を満た
すものが好ましい。 ｉ） ＤＮＡを分解より保護する能力が高いこと ｉｉ） 生体内の循環系のいずれかの箇所で非特異的に
補捉されてしまわないこと。 ｉｉｉ）生体に有害でないこと。 ｉｖ） 受容体に関与してＤＮＡが細胞内に入り、さら
に細胞内で発現する際に阻害的に働かないこと。 このような条件を満たすものとしては、アミノ基を有す
るペプチド又は蛋白質が好ましく、一般にＤＮＡプラス
ミドはマイナスに荷電されていることからプラスに荷電
されている高分子物質を挙げることができる。より好ま
しい高分子物質としては、ポリリジンを挙げることがで
きる。その分子量は５，０００〜２００，０００、好ま
しくは１０，０００〜１００，０００のものが挙げらら
れる。
する能力を有する高分子物質としては、分子中にアミノ
基を有し、核酸、特にＤＮＡを包含できる能力を有する
ものであれば特に制限はないが、次のような条件を満た
すものが好ましい。 ｉ） ＤＮＡを分解より保護する能力が高いこと ｉｉ） 生体内の循環系のいずれかの箇所で非特異的に
補捉されてしまわないこと。 ｉｉｉ）生体に有害でないこと。 ｉｖ） 受容体に関与してＤＮＡが細胞内に入り、さら
に細胞内で発現する際に阻害的に働かないこと。 このような条件を満たすものとしては、アミノ基を有す
るペプチド又は蛋白質が好ましく、一般にＤＮＡプラス
ミドはマイナスに荷電されていることからプラスに荷電
されている高分子物質を挙げることができる。より好ま
しい高分子物質としては、ポリリジンを挙げることがで
きる。その分子量は５，０００〜２００，０００、好ま
しくは１０，０００〜１００，０００のものが挙げらら
れる。
【００１５】また、本発明の生理活性ペプチドとして
は、アミノ酸配列中にグルタミンを有するもので、組
織、臓器、細胞などに特異的に結合できるものであれ
ば、特に制限はないが、前記した生理活性ペプチド又は
蛋白質が好ましく、より好ましくはインターロイキン−
２、インターロイキン−６などを挙げることができる。
併せて、核酸、特にＤＮＡを標的とする為の生理活性ペ
プチドと標的とする細胞、臓器の例を挙げる。本発明に
適した生理活性ペプチド又は蛋白質の例を以下に示す。
は、アミノ酸配列中にグルタミンを有するもので、組
織、臓器、細胞などに特異的に結合できるものであれ
ば、特に制限はないが、前記した生理活性ペプチド又は
蛋白質が好ましく、より好ましくはインターロイキン−
２、インターロイキン−６などを挙げることができる。
併せて、核酸、特にＤＮＡを標的とする為の生理活性ペ
プチドと標的とする細胞、臓器の例を挙げる。本発明に
適した生理活性ペプチド又は蛋白質の例を以下に示す。
【００１６】標的分子：ＩＬ−２又は、抗ＩＬ−２受容
体抗体（α鎖、β鎖、またはγ鎖に対する抗体）。 標的細胞、臓器と治療目的： １）ＩＬ−２受容体はＡＴＬのような特定の白血病細胞
に発現されている場合がある。この細胞を消去する。 ２）他家臓器或は骨髄細胞を移植した場合、拒絶反応が
起きる。拒絶反応の発症には活性化されたＴ細胞が関与
しており、このＴ細胞はＩＬ−２受容体を発現してい
る。この細胞を消去する。 ３）慢性関節リウマチではＩＬ−２受容体を発現してい
るリンパ球が局所に存在し、自己抗体を産生に関与する
事により、病気の発症・進行に関連している。この細胞
を消去する。
体抗体（α鎖、β鎖、またはγ鎖に対する抗体）。 標的細胞、臓器と治療目的： １）ＩＬ−２受容体はＡＴＬのような特定の白血病細胞
に発現されている場合がある。この細胞を消去する。 ２）他家臓器或は骨髄細胞を移植した場合、拒絶反応が
起きる。拒絶反応の発症には活性化されたＴ細胞が関与
しており、このＴ細胞はＩＬ−２受容体を発現してい
る。この細胞を消去する。 ３）慢性関節リウマチではＩＬ−２受容体を発現してい
るリンパ球が局所に存在し、自己抗体を産生に関与する
事により、病気の発症・進行に関連している。この細胞
を消去する。
【００１７】標的分子：ＩＬ−６又は、抗ＩＬ−６受容
体抗体（ｇｐ８０、またはｇｐ１３０に対する抗体）。 標的細胞、臓器と治療目的 １）ＩＬ−６受容体を持つ白血病細胞がある。この白血
病細胞を消去する。 ２）慢性関節リウマチではＩＬ−６受容体を発現してい
るリンパ球が局所に存在し、自己抗体を産生する事が病
気の発生・進行に関連している。このリンパ球を消去す
る。
体抗体（ｇｐ８０、またはｇｐ１３０に対する抗体）。 標的細胞、臓器と治療目的 １）ＩＬ−６受容体を持つ白血病細胞がある。この白血
病細胞を消去する。 ２）慢性関節リウマチではＩＬ−６受容体を発現してい
るリンパ球が局所に存在し、自己抗体を産生する事が病
気の発生・進行に関連している。このリンパ球を消去す
る。
【００１８】標的分子：抗巨核球抗体。 標的細胞、臓器と治療目的：巨核球特異抗原を持つ細
胞。血小板減少症に対して、巨核球にＩＬ−６，ＩＬ−
１１，ｍｐｌ−ｌｉｇａｎｄ等の遺伝子を導入し、巨核
球の選択的増殖、成熟を誘導する。 標的分子：抗ＣＤ３４抗体。 標的細胞、臓器と治療目的：ＣＤ３４を持つ骨髄細胞。
遺伝的に欠損している遺伝子、例えば、ＡＤＡを骨髄細
胞へ導入し遺伝病を治療する。または薬剤耐性遺伝子を
骨髄に導入し薬剤耐性とした後に化学療法で癌治療す
る。
胞。血小板減少症に対して、巨核球にＩＬ−６，ＩＬ−
１１，ｍｐｌ−ｌｉｇａｎｄ等の遺伝子を導入し、巨核
球の選択的増殖、成熟を誘導する。 標的分子：抗ＣＤ３４抗体。 標的細胞、臓器と治療目的：ＣＤ３４を持つ骨髄細胞。
遺伝的に欠損している遺伝子、例えば、ＡＤＡを骨髄細
胞へ導入し遺伝病を治療する。または薬剤耐性遺伝子を
骨髄に導入し薬剤耐性とした後に化学療法で癌治療す
る。
【００１９】標的分子：抗ＣＤ４抗体。 標的細胞、臓器と治療目的：ＣＤ４を持つ細胞。ＨＩＶ
感染した細胞にＨＩＶの増殖を抑制する遺伝子を導入し
ＡＩＤＳを治療する。
感染した細胞にＨＩＶの増殖を抑制する遺伝子を導入し
ＡＩＤＳを治療する。
【００２０】標的分子：重合ＨＳＡ又は抗アルブミン受
容体抗体。 標的細胞、臓器と治療目的：重合ＨＳＡは肝臓のアルプ
ミン受容体に結合する。肝癌に対し対応する癌抑制遺伝
子を導入し癌治療する。
容体抗体。 標的細胞、臓器と治療目的：重合ＨＳＡは肝臓のアルプ
ミン受容体に結合する。肝癌に対し対応する癌抑制遺伝
子を導入し癌治療する。
【００２１】標的分子：抗ＥｒｂＢ２抗体。 標的細胞、臓器と治療目的：ＥｒｂＢ２を有する癌。癌
細胞に癌抑制遺伝子を導入して癌治療する。
細胞に癌抑制遺伝子を導入して癌治療する。
【００２２】標的分子：ＥＧＦ。 標的細胞、臓器と治療目的：卵巣癌等ＥＧＦ受容体を持
つ癌細胞に癌抑制遺伝子を導入して癌治療する。
つ癌細胞に癌抑制遺伝子を導入して癌治療する。
【００２３】標的分子：大腸癌特異的癌抗原に対する抗
体。 標的細胞、臓器と治療目的：大腸癌細胞に癌抑制遺伝子
を導入して癌治療する。
体。 標的細胞、臓器と治療目的：大腸癌細胞に癌抑制遺伝子
を導入して癌治療する。
【００２４】プラス電荷を持つ高分子物質は水溶液中で
マイナス電荷を持つＤＮＡ分子を包含し、これを保護す
る。この高分子物質にターゲッティング（標的）分子で
ある生理活性ペプチドとを結合させた結合体とＤＮＡ分
子を混合することにより、ＤＮＡをターゲッティング分
子で包んだ複合体を形成することができる。この複合体
はインビボ投与でターゲッティング分子に対応する組織
に遺伝子を特異的に導入し、蛋白質を発現することがで
きる。以下の例ではこのような高分子物質としてポリリ
ジンを挙げているが、ＤＮＡを包含する分子は必ずしも
ポリリジンに限定されたものではなく、ＤＮＡと何等か
の親和性を持つ物質で、生体に害の無い循環器系のどこ
かでトラップされにくい物質であれば特に制限はない。
本発明の生理活性ペプチド又は生理活性蛋白質と核酸を
包含する能力を有する物質との結合体、及び、その結合
体と核酸との複合体との例を次に示すが、本発明の前記
結合体及び複合体がこれらに限定されるものではない。
マイナス電荷を持つＤＮＡ分子を包含し、これを保護す
る。この高分子物質にターゲッティング（標的）分子で
ある生理活性ペプチドとを結合させた結合体とＤＮＡ分
子を混合することにより、ＤＮＡをターゲッティング分
子で包んだ複合体を形成することができる。この複合体
はインビボ投与でターゲッティング分子に対応する組織
に遺伝子を特異的に導入し、蛋白質を発現することがで
きる。以下の例ではこのような高分子物質としてポリリ
ジンを挙げているが、ＤＮＡを包含する分子は必ずしも
ポリリジンに限定されたものではなく、ＤＮＡと何等か
の親和性を持つ物質で、生体に害の無い循環器系のどこ
かでトラップされにくい物質であれば特に制限はない。
本発明の生理活性ペプチド又は生理活性蛋白質と核酸を
包含する能力を有する物質との結合体、及び、その結合
体と核酸との複合体との例を次に示すが、本発明の前記
結合体及び複合体がこれらに限定されるものではない。
【００２５】ポリリジン−ＩＬ−６／チミジンカイネー
ス遺伝子発現プラスミド： ＩＬ−６レセプター（ｒｅ
ｃｐｔｏｒ）発現滑膜細胞への自殺遺伝子導入による慢
性リウマチ治療。ＩＬ−６レセプター（ｒｅｃｅｐｔｏ
ｒ）を持つ癌、例えば骨髄腫への自殺遺伝子挿入による
癌治療。 ポリリジン−抗ＣＤ１４抗体／ＡＤＡ遺伝子発現プラス
ミド： ＳＣＩＤ患者、血液幹細胞へのＡＤＡ遺伝子導
入による治療。 ポリリジン−抗ＣＤ１４抗体／βグロブリン遺伝子発現
プラスミド： 血液幹細胞への正常βグロプリン遺伝子
挿入によるサラセミア治療。 ポリリジン−抗ＣＤ４抗体／チミジンカイネース発現プ
ラスミド： ＨＩＶ感染Ｔ細胞への自殺遺伝子導入によ
るＡＩＤＳ治療。 ポリリジン−抗ＣＤ４抗体／リバーストランスクリプタ
ーゼ（ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｐｔａｓｅ）アン
チセンス遺伝子発現プラスミド： ＨＩＶ感染Ｔ細胞で
のＨＩＶ増殖抑制遺伝子導入によるＡＩＤＳ治療。 次に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、
本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
ス遺伝子発現プラスミド： ＩＬ−６レセプター（ｒｅ
ｃｐｔｏｒ）発現滑膜細胞への自殺遺伝子導入による慢
性リウマチ治療。ＩＬ−６レセプター（ｒｅｃｅｐｔｏ
ｒ）を持つ癌、例えば骨髄腫への自殺遺伝子挿入による
癌治療。 ポリリジン−抗ＣＤ１４抗体／ＡＤＡ遺伝子発現プラス
ミド： ＳＣＩＤ患者、血液幹細胞へのＡＤＡ遺伝子導
入による治療。 ポリリジン−抗ＣＤ１４抗体／βグロブリン遺伝子発現
プラスミド： 血液幹細胞への正常βグロプリン遺伝子
挿入によるサラセミア治療。 ポリリジン−抗ＣＤ４抗体／チミジンカイネース発現プ
ラスミド： ＨＩＶ感染Ｔ細胞への自殺遺伝子導入によ
るＡＩＤＳ治療。 ポリリジン−抗ＣＤ４抗体／リバーストランスクリプタ
ーゼ（ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｐｔａｓｅ）アン
チセンス遺伝子発現プラスミド： ＨＩＶ感染Ｔ細胞で
のＨＩＶ増殖抑制遺伝子導入によるＡＩＤＳ治療。 次に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、
本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２６】
実施例１ 分子量の異なるポリリジンを用いたポリリジ
ン結合ＩＬ−６の作成 １０ｍｇのポリリジン臭酸塩（分子量７，９００、４
５，７００、または８３，８００、Ｓｉｇｍａ社製）を
４ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に
溶解する。これに５０μｌのＢＴＧ溶液（１４Ｕ／ｍｌ
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５）を添加し
て、室温で３０分放置する。これに２ｍｌのｒｈＩＬ−
６溶液（２ｍｇ／ｍｌ １０ｍＭ クエン酸ナトリウ
ム、ｐＨ７．０）を加え攪はん後、３７℃で２．５時間
（分子量７，９００場合）または２０時間（分子量４
５，７００または８３，８００）放置する。反応液を逆
層ＨＰＬＣで精製する。
ン結合ＩＬ−６の作成 １０ｍｇのポリリジン臭酸塩（分子量７，９００、４
５，７００、または８３，８００、Ｓｉｇｍａ社製）を
４ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に
溶解する。これに５０μｌのＢＴＧ溶液（１４Ｕ／ｍｌ
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５）を添加し
て、室温で３０分放置する。これに２ｍｌのｒｈＩＬ−
６溶液（２ｍｇ／ｍｌ １０ｍＭ クエン酸ナトリウ
ム、ｐＨ７．０）を加え攪はん後、３７℃で２．５時間
（分子量７，９００場合）または２０時間（分子量４
５，７００または８３，８００）放置する。反応液を逆
層ＨＰＬＣで精製する。
【００２７】分子量７，９００のポリリジンを用いた場
合の反応液のクロマトグラフィーのパターンを図１に示
す。図１中で、ピーク１（２２．１４分）はポリリジン
を示し、ピーク２（２７．５７分）はポリリシン結合ｒ
ｈＩＬ−６を示し、ピーク３（２９．６６分）はｒｈＩ
Ｌ−６を示す。図１中の４の部分はポリリジン結合ｒｈ
−ＩＬ６画分を示す。使用したカラムは、Ｖｙｄａｃ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ４ ２１４ＴＰ５４（４．６×２５
０ｍｍ）で、溶媒はＡ：０．１％トリフルオロ酢酸（Ｔ
ＦＡ）及びＢ：０．１％ＴＦＡ−８０％アセトニトリル
で、流速は１ｍｌ／ｍｉｎ．であった。当該クロマトグ
ラフィーの溶出プログラムを表１に示す。
合の反応液のクロマトグラフィーのパターンを図１に示
す。図１中で、ピーク１（２２．１４分）はポリリジン
を示し、ピーク２（２７．５７分）はポリリシン結合ｒ
ｈＩＬ−６を示し、ピーク３（２９．６６分）はｒｈＩ
Ｌ−６を示す。図１中の４の部分はポリリジン結合ｒｈ
−ＩＬ６画分を示す。使用したカラムは、Ｖｙｄａｃ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ４ ２１４ＴＰ５４（４．６×２５
０ｍｍ）で、溶媒はＡ：０．１％トリフルオロ酢酸（Ｔ
ＦＡ）及びＢ：０．１％ＴＦＡ−８０％アセトニトリル
で、流速は１ｍｌ／ｍｉｎ．であった。当該クロマトグ
ラフィーの溶出プログラムを表１に示す。
【００２８】
【表１】
【００２９】ポリリジン結合ＩＬ−６画分を集め、さら
に同じ逆層ＨＰＬＣにかけて濃縮する。溶出条件はＡバ
ッファー中のＢバソファー濃度を０％から１００％まで
５分で直線的に増加させて溶出した（Ａ、Ｂ溶媒（バッ
ファー）は図１のものと同じである。）。ポリリジン結
合ＩＬ−６画分を更にゲル濾過クロマトグラフィーで精
製した。 カラム ：Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５（１ｘ１０ｃ
ｍ）、 バッファー：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５Ｍ
ＮａＣｌ（ｐＨ８．５）、流速２ｍｌ／ｍｉｎ。 得られた精製ポリリジン結合ＩＬ−６の純度をＨＰＬＣ
で調べた。このクロマトグラフィーのパターンを図２に
示す。図２の１中のピーク（イ）は、ｒｈＩＬ−６（Ｒ
ｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ１４．１２分）を、 図２
の２中のピーク（ロ）は分子量７，９００のポリリジン
が結合したｒｈＩＬ−６（Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍ
ｅ １２．３８分）を、図２の３中のピーク（ハ）は分
子量４５，７００のポリリジンが結合したｒｈＩＬ−６
（Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ １２．１６分）を、
図２の４中のピーク（ニ）は分子量８３，８００のポリ
リジンが結合したｒｈＩＬ−６（Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ
ｔｉｍｅ １１．４６分）をそれぞれ示している。 当該ＨＰＬＣの条件は、カラム：Ｖｙｄａｃ Ｐｒｏｔ
ｅｉｎ Ｃ４ ２１４ＴＰ５４（４．６×２５０ｍ
ｍ）。 溶媒 ：Ａは０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、Ｂ
は０．１％ＴＦＡ−８０％アセトニトリル。 流速 ：１ｍｌ／分であった。 溶出プログラムを表２に示す。
に同じ逆層ＨＰＬＣにかけて濃縮する。溶出条件はＡバ
ッファー中のＢバソファー濃度を０％から１００％まで
５分で直線的に増加させて溶出した（Ａ、Ｂ溶媒（バッ
ファー）は図１のものと同じである。）。ポリリジン結
合ＩＬ−６画分を更にゲル濾過クロマトグラフィーで精
製した。 カラム ：Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５（１ｘ１０ｃ
ｍ）、 バッファー：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５Ｍ
ＮａＣｌ（ｐＨ８．５）、流速２ｍｌ／ｍｉｎ。 得られた精製ポリリジン結合ＩＬ−６の純度をＨＰＬＣ
で調べた。このクロマトグラフィーのパターンを図２に
示す。図２の１中のピーク（イ）は、ｒｈＩＬ−６（Ｒ
ｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ１４．１２分）を、 図２
の２中のピーク（ロ）は分子量７，９００のポリリジン
が結合したｒｈＩＬ−６（Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍ
ｅ １２．３８分）を、図２の３中のピーク（ハ）は分
子量４５，７００のポリリジンが結合したｒｈＩＬ−６
（Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ １２．１６分）を、
図２の４中のピーク（ニ）は分子量８３，８００のポリ
リジンが結合したｒｈＩＬ−６（Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ
ｔｉｍｅ １１．４６分）をそれぞれ示している。 当該ＨＰＬＣの条件は、カラム：Ｖｙｄａｃ Ｐｒｏｔ
ｅｉｎ Ｃ４ ２１４ＴＰ５４（４．６×２５０ｍ
ｍ）。 溶媒 ：Ａは０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、Ｂ
は０．１％ＴＦＡ−８０％アセトニトリル。 流速 ：１ｍｌ／分であった。 溶出プログラムを表２に示す。
【００３０】
【表２】
【００３１】いずれの精製ポリリジン結合ＩＬ−６もほ
ぼ単一のピークを示した。
ぼ単一のピークを示した。
【００３２】（結果）ＢＴＧはいずれの分子量のポリリ
ジンをもＩＬ−６に結合させる能力があることが示され
た。
ジンをもＩＬ−６に結合させる能力があることが示され
た。
【００３３】実施例２ ｉ）ポリリジン結合ＩＬ−６のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性 （方法）ＩＬ−６依存性マウスハイブリドーマＭＨ６０
ＢＳＦ２（Ｍａｔｓｕｄａ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ，Ｅｕ
ｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１８，９５１，１９８８）を
サブクローニングしたＭＨ６０．３２株を用いた。９６
穴プレートを用いて各ウエルに以下の溶液を加える。 ａ）培地にて段階的に稀釈した検体溶液１００μｌ。 ｂ）培地にて３回洗浄し１００μｌの培地に懸濁した５
×１０３個のＭＨ６０。３７℃、５％ＣＯ２下で６０時
間培養後細胞数をＭＴＴアッセイ法で測定した。ＭＴＴ
アッセイは以下のように行なった。各ウエルにＭＴＴ溶
液（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−
２，５−ジフェニル テトラゾリウム ブロマイド １
ｍｇ／ｍｌＰＢＳ溶液）５０μｌを加え培養後上清１５
０ｍｌを除き、ＭＴＴ溶解液（２０％ＳＤＳ０．０４Ｎ
ＨＣｌ溶液）１００μｌを加えて一晩培養する。マイク
ロプレートリーダーで吸光度（５７０ｎｍ−６３０ｎ
ｍ）を測定した。 本実験で使用した培地はＰＲＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ
社）、１０％ＦＣＳ（非動化）である。
ＢＳＦ２（Ｍａｔｓｕｄａ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ，Ｅｕ
ｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１８，９５１，１９８８）を
サブクローニングしたＭＨ６０．３２株を用いた。９６
穴プレートを用いて各ウエルに以下の溶液を加える。 ａ）培地にて段階的に稀釈した検体溶液１００μｌ。 ｂ）培地にて３回洗浄し１００μｌの培地に懸濁した５
×１０３個のＭＨ６０。３７℃、５％ＣＯ２下で６０時
間培養後細胞数をＭＴＴアッセイ法で測定した。ＭＴＴ
アッセイは以下のように行なった。各ウエルにＭＴＴ溶
液（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−
２，５−ジフェニル テトラゾリウム ブロマイド １
ｍｇ／ｍｌＰＢＳ溶液）５０μｌを加え培養後上清１５
０ｍｌを除き、ＭＴＴ溶解液（２０％ＳＤＳ０．０４Ｎ
ＨＣｌ溶液）１００μｌを加えて一晩培養する。マイク
ロプレートリーダーで吸光度（５７０ｎｍ−６３０ｎ
ｍ）を測定した。 本実験で使用した培地はＰＲＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ
社）、１０％ＦＣＳ（非動化）である。
【００３４】（結果）ＭＨ６０の増殖活性において、ポ
リリジン結合ＩＬ−６（分子量７，９００）のｉｎｖｉ
ｔｒｏにおける活性試験の結果を図３に示す。この結果
ポリリジン結合ＩＬ−６の活性はＩＬ−６の活性と同等
であることがわかる。また、分子量４５，７００又は８
３，８００のポリリジンと結合したポリリジン結合ＩＬ
−６も同様の活性を示した。
リリジン結合ＩＬ−６（分子量７，９００）のｉｎｖｉ
ｔｒｏにおける活性試験の結果を図３に示す。この結果
ポリリジン結合ＩＬ−６の活性はＩＬ−６の活性と同等
であることがわかる。また、分子量４５，７００又は８
３，８００のポリリジンと結合したポリリジン結合ＩＬ
−６も同様の活性を示した。
【００３５】ｉｉ）ポリリジン結合ＩＬ−６のｉｎ ｖ
ｉｖｏ活性 （方法）６週令前後で体重２５ｇの健康なＩＣＲ系雌マ
ウスを用い、試料０．１ｍｌ皮下注射する。試料はＰＢ
Ｓで稀釈し、対象はＰＢＳとする。試験動物は１群５
匹。投与は１日２回（朝夕）、５日目の朝まで、合計９
回投与する。最後の投与から４〜８時間目に各試験動物
の心臓から採血し、抗凝固剤と混合して採血後３時間以
内にその血小板数を電気抵抗変化検出法により測定す
る。単位容積当りの平均血小板数を求めた。 （結果）表３に分子量７，９００のポリリジンを結合さ
せたポリリジン結合ＩＬ−６の場合の結果を示す。表３
で示されるように、ＩＬ−６に対しポリリジン−ＩＬ−
６はｉｎ ｖｉｖｏにおいて血小板数を亢進させた。ま
た、分子量４５，７００又は８３，８００のポリリジン
を結合させたポリリジン結合ＩＬ−６も、各々表３に示
したと同様な活性を示した。
ｉｖｏ活性 （方法）６週令前後で体重２５ｇの健康なＩＣＲ系雌マ
ウスを用い、試料０．１ｍｌ皮下注射する。試料はＰＢ
Ｓで稀釈し、対象はＰＢＳとする。試験動物は１群５
匹。投与は１日２回（朝夕）、５日目の朝まで、合計９
回投与する。最後の投与から４〜８時間目に各試験動物
の心臓から採血し、抗凝固剤と混合して採血後３時間以
内にその血小板数を電気抵抗変化検出法により測定す
る。単位容積当りの平均血小板数を求めた。 （結果）表３に分子量７，９００のポリリジンを結合さ
せたポリリジン結合ＩＬ−６の場合の結果を示す。表３
で示されるように、ＩＬ−６に対しポリリジン−ＩＬ−
６はｉｎ ｖｉｖｏにおいて血小板数を亢進させた。ま
た、分子量４５，７００又は８３，８００のポリリジン
を結合させたポリリジン結合ＩＬ−６も、各々表３に示
したと同様な活性を示した。
【００３６】
【表３】
【００３７】実施例３ ポリリジン結合ＩＬ−６とＤＮ
Ａとの複合体の形成 （方法）１μのＤＮＡ溶液（２μｇ／μｌ）に１００μ
ｌ ポリリジン結合ＩＬ−６（０．３ｍｇ／ｍｌ ０．
２Ｍリン酸ナトリウムｐＨ６．０）を加えて１５秒ボル
テックスで攪はん後、室温にて３０分放置し両者の複合
体を形成させた。ポリリジン結合ＩＬ−６とＤＮＡの複
合体とＤＮＡのみを０．８％寒天ゲルで泳動し、ＥｔＢ
ｒ存在下での紫外線で複合体の形成能力を確認した。
Ａとの複合体の形成 （方法）１μのＤＮＡ溶液（２μｇ／μｌ）に１００μ
ｌ ポリリジン結合ＩＬ−６（０．３ｍｇ／ｍｌ ０．
２Ｍリン酸ナトリウムｐＨ６．０）を加えて１５秒ボル
テックスで攪はん後、室温にて３０分放置し両者の複合
体を形成させた。ポリリジン結合ＩＬ−６とＤＮＡの複
合体とＤＮＡのみを０．８％寒天ゲルで泳動し、ＥｔＢ
ｒ存在下での紫外線で複合体の形成能力を確認した。
【００３８】（結果） ｉ） 図４にこの電気泳動のパターンを示す。図４中の
１及び４はマーカー（λ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ で消化
（Ｄｉｇｅｓｔ））、図４中の２はプラスミドベクター
（ｐＳＶ−β−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ Ｖｅｃｔ
ｏｒ）、図４中の３はＤＮＡとポリリジン結合ＩＬ−６
の複合体をそれぞれ示している。図４に示すように、Ｄ
ＮＡはポリリジン結合ＩＬ−６と複合体を形成すると
０．８％寒天ゲルで泳動しなくなり、原点に留まる。こ
れは、ＢＴＧを用いて調製したポリリジン結合ＩＬ−６
がＤＮＡと複合体を形成した結果であり、ポリリジン結
合ＩＬ−６がＤＮＡと複合体を形成する能力を保有して
いることを示している。また、図４では分子量７，９０
０のポリリジンを結合したポリリジン結合ＩＬ−６の場
合を示しているが、分子量４５，７００又は８３，８０
０のポリリジンが結合したポリリジン結合ＩＬ−６の場
合も同様な結果を示した。
１及び４はマーカー（λ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ で消化
（Ｄｉｇｅｓｔ））、図４中の２はプラスミドベクター
（ｐＳＶ−β−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ Ｖｅｃｔ
ｏｒ）、図４中の３はＤＮＡとポリリジン結合ＩＬ−６
の複合体をそれぞれ示している。図４に示すように、Ｄ
ＮＡはポリリジン結合ＩＬ−６と複合体を形成すると
０．８％寒天ゲルで泳動しなくなり、原点に留まる。こ
れは、ＢＴＧを用いて調製したポリリジン結合ＩＬ−６
がＤＮＡと複合体を形成した結果であり、ポリリジン結
合ＩＬ−６がＤＮＡと複合体を形成する能力を保有して
いることを示している。また、図４では分子量７，９０
０のポリリジンを結合したポリリジン結合ＩＬ−６の場
合を示しているが、分子量４５，７００又は８３，８０
０のポリリジンが結合したポリリジン結合ＩＬ−６の場
合も同様な結果を示した。
【００３８】実施例４ ポリリジン結合ＩＬ−６による
ＩＬ−６受容体保有細胞への特異的遺伝子導入（１） （方法）実施例３と同様な方法で調製したＤＮＡ２０μ
ｇ、ポリリジン結合ＩＬ−６１０μｇ相当の複合体を培
養細胞に加えた。継代培養細胞を１×１０５個の６穴プ
レート中の２ｍｌ培地に移して数時間培養したものに、
前述のポリリジン結合ＩＬ−６／ＤＮＡ複合体を添加し
た。３７℃、５％ＣＯ２下で４８時間培養後、以下のよ
うにβ−ガラクトシダーゼ（ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓ
ｅ）の発現量を測定した。使用細胞はＩＬ−６受容体保
有細胞としてＵ２６６を、ＩＬ−６受容体を保持しない
細胞としてＣＥＭを用いた。使用したＤＮＡはｐＳＶ−
β−ガラクトシダーゼ ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社、
ＵＳＡ製）。β−ガラクトシダーゼ活性はＰｒｏｍｅｇ
ａ社のＴｅｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ（参考文
献、Ｆ．Ｃ．Ｌｕｃｉｂｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ、Ｍｅ
ｔ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ １，９，
１９８９）によった。
ＩＬ−６受容体保有細胞への特異的遺伝子導入（１） （方法）実施例３と同様な方法で調製したＤＮＡ２０μ
ｇ、ポリリジン結合ＩＬ−６１０μｇ相当の複合体を培
養細胞に加えた。継代培養細胞を１×１０５個の６穴プ
レート中の２ｍｌ培地に移して数時間培養したものに、
前述のポリリジン結合ＩＬ−６／ＤＮＡ複合体を添加し
た。３７℃、５％ＣＯ２下で４８時間培養後、以下のよ
うにβ−ガラクトシダーゼ（ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓ
ｅ）の発現量を測定した。使用細胞はＩＬ−６受容体保
有細胞としてＵ２６６を、ＩＬ−６受容体を保持しない
細胞としてＣＥＭを用いた。使用したＤＮＡはｐＳＶ−
β−ガラクトシダーゼ ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社、
ＵＳＡ製）。β−ガラクトシダーゼ活性はＰｒｏｍｅｇ
ａ社のＴｅｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ（参考文
献、Ｆ．Ｃ．Ｌｕｃｉｂｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ、Ｍｅ
ｔ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ １，９，
１９８９）によった。
【００３９】（結果）結果を表４に示す。表４で示され
るように、ＩＬ−６受容体保有細胞Ｕ２６６はＩＬ−６
受容体を保有しない細胞ＣＥＭに比して有意にβ−ガラ
クトシダーゼ活性が高かった。また、Ｕ２６６の場合、
ポリリジン結合ＩＬ−６またはＤＮＡのみと培養した細
胞のβ−ガラクトシダーゼ活性に対し、ポリリジン結合
ＩＬ−６とＤＮＡとの複合体と培養した細胞のβ−ガラ
クトシダーゼ活性は高かった。
るように、ＩＬ−６受容体保有細胞Ｕ２６６はＩＬ−６
受容体を保有しない細胞ＣＥＭに比して有意にβ−ガラ
クトシダーゼ活性が高かった。また、Ｕ２６６の場合、
ポリリジン結合ＩＬ−６またはＤＮＡのみと培養した細
胞のβ−ガラクトシダーゼ活性に対し、ポリリジン結合
ＩＬ−６とＤＮＡとの複合体と培養した細胞のβ−ガラ
クトシダーゼ活性は高かった。
【００４０】
【表４】
【００４１】実施例５ ポリリジン結合ＩＬ−６による
ＩＬ−６受容体保有細胞への特異的遺伝子導入（２） （方法）ポリリジン結合ＩＬ−６、およびＤＮＡとポリ
リジン結合ＩＬ−６複合体の作成は実施例３と同様に作
成した。ＤＮＡ、ポリリジン結合ＩＬ−６またはそれら
の複合体を添加した培地で培養した。添加量、培養法は
実施例３と同様。ＩＬ−６受容体を保有する細胞として
Ｕ２６６、Ｕ９３７、Ｈｅｐｇ２又はＨｅｐ３Ｂを使用
した。使用したポリリジン結合ＩＬ−６のポリリジンの
分子量は７，９００であり、また使用したＤＮＡはｐＳ
Ｖ２ＣＡＴ（Ｇｏｒｍａｎ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ ａｌ，Ｍｏ
ｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２，１０４４，１９８２）
である。クロラムフェニコール アセチルトランスフェ
ラーゼ（Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ａｃｅｔｙ
ｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＣＡＴ））活性はＭｕｒｒ
ａｙの方法（Ｍｕｒｒａｙ，Ｉ．Ａ．，ｅｔ ａｌ，Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９、６６４
８、１９９１）を用いて測定した。
ＩＬ−６受容体保有細胞への特異的遺伝子導入（２） （方法）ポリリジン結合ＩＬ−６、およびＤＮＡとポリ
リジン結合ＩＬ−６複合体の作成は実施例３と同様に作
成した。ＤＮＡ、ポリリジン結合ＩＬ−６またはそれら
の複合体を添加した培地で培養した。添加量、培養法は
実施例３と同様。ＩＬ−６受容体を保有する細胞として
Ｕ２６６、Ｕ９３７、Ｈｅｐｇ２又はＨｅｐ３Ｂを使用
した。使用したポリリジン結合ＩＬ−６のポリリジンの
分子量は７，９００であり、また使用したＤＮＡはｐＳ
Ｖ２ＣＡＴ（Ｇｏｒｍａｎ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ ａｌ，Ｍｏ
ｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２，１０４４，１９８２）
である。クロラムフェニコール アセチルトランスフェ
ラーゼ（Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ａｃｅｔｙ
ｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＣＡＴ））活性はＭｕｒｒ
ａｙの方法（Ｍｕｒｒａｙ，Ｉ．Ａ．，ｅｔ ａｌ，Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９、６６４
８、１９９１）を用いて測定した。
【００４２】（結果）表５に示すように、ＤＮＡのみま
たはポリリジン結合ＩＬ−６のみを添加して培養した細
胞のＣＡＴ活性に対し、ＤＮＡとポリリジン結合ＩＬ−
６の複合体を添加して培養した細胞のＣＡＴ活性は有意
に高く、当該複合体による遺伝子の導入が示された。
たはポリリジン結合ＩＬ−６のみを添加して培養した細
胞のＣＡＴ活性に対し、ＤＮＡとポリリジン結合ＩＬ−
６の複合体を添加して培養した細胞のＣＡＴ活性は有意
に高く、当該複合体による遺伝子の導入が示された。
【００４３】
【表５】
【００４４】
【発明の効果】トランスグルタミナーゼを用いることに
より、グルタミンを有する生理活性ペプチド又は蛋白質
のグルタミン残基の部分で、特異的にかつ穏和な条件で
当該ペプチド又は蛋白質と、アミノ基を有し核酸（ＤＮ
Ａなど）を包含する能力を有する高分子物質を結合する
ことができる。生理活性ぺプチド又は蛋白質の特性を消
失することなく、核酸を包含することができるので、当
該生理活性ペプチド又は蛋白質の組織、臓器、細胞など
に特異的に集積する特性を利用して、核酸を細胞内へ選
択的かつ高効率で導入することができる。これにより、
本発明は遺伝子治療等へ応用することがでる。
より、グルタミンを有する生理活性ペプチド又は蛋白質
のグルタミン残基の部分で、特異的にかつ穏和な条件で
当該ペプチド又は蛋白質と、アミノ基を有し核酸（ＤＮ
Ａなど）を包含する能力を有する高分子物質を結合する
ことができる。生理活性ぺプチド又は蛋白質の特性を消
失することなく、核酸を包含することができるので、当
該生理活性ペプチド又は蛋白質の組織、臓器、細胞など
に特異的に集積する特性を利用して、核酸を細胞内へ選
択的かつ高効率で導入することができる。これにより、
本発明は遺伝子治療等へ応用することがでる。
【図１】ポリリジンとＩＬ−６の反応液のクロマトグラ
フィーのパターンを示す。
フィーのパターンを示す。
【図２】精製ポリリジン結合ＩＬ−６のクロマトグラフ
ィーのパターンを示す。
ィーのパターンを示す。
【図３】ＩＬ−６とポリリジン結合ＩＬ−６のｉｎ ｖ
ｉｔｒｏでの活性の結果を示す。
ｉｔｒｏでの活性の結果を示す。
【図４】ポリリジン結合ＩＬ−６のＤＮＡ複合体の形成
を示す電気泳動パターンを示す。
を示す電気泳動パターンを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 9/10 15/09 // Ａ６１Ｋ 48/00
Claims (11)
- 【請求項１】 少なくとも１つ以上のグルタミン残基を
有する生理活性ペプチド又は生理活性蛋白質とアミノ供
与体を有し、核酸を包含する能力を有する高分子物質と
を、トランスグルタミナーゼの存在下に反応せしめて、
該グルタミン残基のγ−位酸アミドにおいて該アミノ酸
供与体のアミノ基と酸アミド結合を形成せしめてなる核
酸含有用の蛋白質の製造方法。 - 【請求項２】 トランスグルタミナーセが微生物由来の
トランスグルタミナーゼである請求項１に記載の製造方
法。 - 【請求項３】 請求項１に記載の方法で製造しうる生理
活性ぺプチド又は生理活性蛋白質と遺伝子を包含する能
力を有する高分子物質の結合体。 - 【請求項４】 高分子物質がポリリジンである請求項３
に記載のペプチド又は蛋白質の結合体。 - 【請求項５】 生理活性蛋白質がインターロイキン６で
ある請求項３又は４に記載の蛋白質の結合体。 - 【請求項６】 生理活性蛋白質がインターロイキン２で
ある請求項３又は４に記載の蛋白質の結合体。 - 【請求項７】 請求項３に記載の生理活性ペプチド又は
生理活性蛋白質と遺伝子を包含する能力を有する高分子
物質との結合体、及び、核酸からなる核酸複合体。 - 【請求項８】 核酸がＤＮＡである請求項７に記載の核
酸複合体。 - 【請求項９】 結合体が請求項４、５又は６のいずれか
である請求項７又は８に記載の核酸複合体。 - 【請求項１０】請求項３から６のいずれかに記載の結合
体からなる遺伝子治療用の遺伝子導入用媒体。 - 【請求項１１】請求項７から９のいずれかに記載の核酸
複合体からなる遺伝子治療用の遺伝子導入剤。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6270102A JPH0889278A (ja) | 1994-09-29 | 1994-09-29 | 遺伝子導入用修飾蛋白質及びその製法 |
| CN95116852A CN1129737A (zh) | 1994-09-29 | 1995-09-28 | 基因转移的修饰蛋白及其制备方法 |
| EP95306945A EP0704221A3 (en) | 1994-09-29 | 1995-09-29 | Conjugate for gene transfer and its manufacturing process |
| US08/927,087 US6013526A (en) | 1994-09-29 | 1997-09-10 | Modified protein for gene transfer and process for producing the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6270102A JPH0889278A (ja) | 1994-09-29 | 1994-09-29 | 遺伝子導入用修飾蛋白質及びその製法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0889278A true JPH0889278A (ja) | 1996-04-09 |
Family
ID=17481568
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6270102A Pending JPH0889278A (ja) | 1994-09-29 | 1994-09-29 | 遺伝子導入用修飾蛋白質及びその製法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6013526A (ja) |
| EP (1) | EP0704221A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0889278A (ja) |
| CN (1) | CN1129737A (ja) |
Cited By (4)
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| WO1998013381A1 (fr) * | 1996-09-26 | 1998-04-02 | Ajinomoto Co., Inc. | Proteines modifiees physiologiquement actives et compositions medicamenteuses les contenant |
| JP2008054658A (ja) * | 2006-08-02 | 2008-03-13 | Kyushu Univ | タンパク質への外来分子の部位特異的な連結及びその利用 |
| JP2011169878A (ja) * | 2010-01-22 | 2011-09-01 | Kyushu Univ | 核酸検出用キット |
| WO2014208776A1 (ja) * | 2013-06-28 | 2014-12-31 | 国立大学法人九州大学 | タンパク質－ポリマ複合体、ＴＧａｓｅ基質含有ポリマ、ＴＧａｓｅ基質含有モノマ、タンパク質－ポリマ複合体の製造方法、および固液の界面あるいは界面近傍でタンパク質機能を高める方法 |
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| AU707981B2 (en) * | 1996-05-01 | 1999-07-22 | Fujirebio Inc. | Nucleic acid-bound polypeptide, method of producing nucleic acid-bound polypeptide, and immunoassay using the polypeptide |
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| DE19732917C1 (de) * | 1997-07-30 | 1998-10-15 | Fuchsbauer Hans Lothar | Verfahren zum Transglutaminase-katalysierten Koppeln von Protein oder Peptid an einen Träger |
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| US7485438B2 (en) | 2002-03-01 | 2009-02-03 | Szu-Yi Chou | Method of producing polyvalent antigens |
| US20030219853A1 (en) * | 2002-03-01 | 2003-11-27 | Szu-Yi Chou | Method of cross-linking a compound |
| US20100316764A1 (en) * | 2009-06-10 | 2010-12-16 | Engrain, LLC | Flour supplement compositions and methods for preparing wheat flour |
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| AU2018300069A1 (en) | 2017-07-11 | 2020-02-27 | Synthorx, Inc. | Incorporation of unnatural nucleotides and methods thereof |
| CA3071013A1 (en) | 2017-08-03 | 2019-02-07 | Synthorx, Inc. | Cytokine conjugates for the treatment of proliferative and infectious diseases |
| BR112021014415A2 (pt) | 2019-02-06 | 2021-09-21 | Synthorx, Inc. | Conjugados de il-2 e métodos de uso dos mesmos |
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| WO1992005250A1 (en) * | 1990-09-25 | 1992-04-02 | University Of Connecticut | Prolonging expression of polynucleotides introduced into a cell |
| DE69116495T2 (de) * | 1990-10-19 | 1996-06-13 | Ajinomoto Kk | Rekombinante Transglutaminase |
| DE4104186A1 (de) * | 1991-02-12 | 1992-08-13 | Genentech Inc | Neue, ueber endozytose in hoehere eukaryotische zellen aufnehmbare, nukleinsaeure enthaltende komplexe |
| DE4110409C2 (de) * | 1991-03-29 | 1999-05-27 | Boehringer Ingelheim Int | Neue Protein-Polykation-Konjugate |
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- 1995-09-28 CN CN95116852A patent/CN1129737A/zh active Pending
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