JPH06503714A

JPH06503714A - 細胞内に導入されたポリヌクレオチドの長時間発現

Info

Publication number: JPH06503714A
Application number: JP3516079A
Authority: JP
Inventors: ウー　ジョージ　ワイ．; ウー　キャサリン　エイチ．
Original assignee: ユニバーシティオブコネチカット
Priority date: 1990-09-25
Filing date: 1991-09-23
Publication date: 1994-04-28
Also published as: EP0556197A1; EP0556197A4; CA2092319A1; WO1992005250A1; AU8628291A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】細胞内に導入したポリヌクレオチドの長時間発現背景外来遺伝子を、生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ）の細胞を標的として、その内部で発現させることができる。この場合、ＤＮＡの可溶性錯体及び２つの結合成分、即ち、１）損傷を与えることなく強力な相互作用によりポリヌクレオチドを結合することができるポリーＬ−リシン等のポリカチオン、２）所定の細胞に特異な細胞表面分子を特異的に標的とする配位子、からなる担体系が用いられる（Ｗｕ、　Ｇ、Ｙ、　＆　Ｗｕ。

Ｃ，Ｈ，（１９８ｇ）　Ｌ」」１」）ニー匹し１４６２１−１４６２４参照）。

前記錯体は、特異的に標的細胞に結合して、細胞内に取り込まわ７その結果、ＤＮＡが細胞内に取り込まれる。

この方法によって細胞内に導入された外来ＤＮＡの発現は、一時的なものである。遺伝子治療に応用する際、短時間の発現が望ましい場合もあるが、多くの適用例では、ポリヌクレオチドを長時間発現させることが必要となる。このため、ＤＮＡを生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ）の細胞に導入し、ＤＮＡを長時間発現させる方法の開発が望まれている。

及吸り型！本発明は、ポリヌクレオチドを標的細胞内に導入して、導入されたポリヌクレオチドを細胞内で持続的に発現させる方法に関する。本発明の方法は、細胞内に特異的に取り込まれる標的ポリヌクレオチド錯体としてポリヌクレオチドを生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ）に投与するステップと、細胞複製が行われるように標的細胞を刺激するステップと、を備える。細胞が複製されることにより、複製促進が行われない場合の一時的な発現時間と比較して、導入されたポリヌクレオチドの発現を長時間持続させることができる。

標的ポリヌクレオチド錯体は、標的細胞の表面に存在する分子に特異的に結合する細胞特異性結合剤に、　（細胞内条件下で）放出可能なように、結合して錯形成するポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドは、細胞特異性結合剤に結合されているポリカチオン等のポリヌクレオチド結合剤を介して、細胞特異性結合剤に結合される。細胞表面成分に結合する結合剤は、例えば、細胞表面レセプター、望ましくは、細胞内取り込み作用により配位子の内在化を媒介する細胞表面レセプターに対する配位子でもよいし、あるいは、細胞表面抗原に対する抗体等のレセプターでもよい。また、標的ポリヌクレオチド錯体は、生理的流体に可溶であることが望ましい。

標的細胞を刺激して細胞複製を引き起こす方法としては、外科的手段あるいは薬理学的手段が考えられる。例えば、所定の細胞によって構成されている再生可能な器官あるいは組織を部分的に切除することにより、細胞の複製を促進させてもよいし、あるいは、細胞複製を促進させる薬剤を用いてもよい。

本発明の方法は、細胞内に導入されたポリヌクレオチドを持続的に発現させることが望ましいような遺伝子治療、その他の適用例に有効である。

図面の簡単な説明図１は、標的遺伝子発現の経時変化を示すものである。２匹のラットからなる複数の群に、アシアロオロソムコイド（ＡｓＯＲ）−ポリーＬ−リシンーポリヌクレオチド（ＣＡＴ遺伝子）錯体を注射し、−日間隔でラットを殺して、肝臓検体を取り出し、均質化した後、同量のホモジネートタンパク質のＣＡＴ活性を測定した図２は、標的ＣＡＴ遺伝子発現に及ぼす部分肝切除の影響を示すものである。

Ａｓ０Ｒ−ポリーＬ−リシンーポリヌクレオチド錯体をラットに注射し、その３０分後に６６％の部分肝切除を行い、肝臓のＣＡＴ活性の経時変化を測定した。

図３は、部分肝切除を行ってから１１週間経過した時点における肝臓内の標的ＤＮＡの状態を示すサザン・プロットを示す。ＤＮＡを肝臓から抽出し、制限酵素で切断した後、以下の実施例に詳述されるように、バルブＣＡＴ標準を用いて、アガロース゛ゲル電気泳動を行った。その後、検体をニトロセルロースに移し、３２ｐでラベルしたＣＡＴｃＤＮＡプローブとハイブリッド形成させることにより、検体の測定を行った。

盈吸の詳廻望胆皿標的錯体の形でポリヌクレオチドを投与することにより、生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ）の標的細胞内にポリヌクレオチドを選択的に取り込ませることができる。標的ポリヌクレオチド錯体は、標的細胞の表面成分に結合する細胞特異性結合剤に放出可能に結合されるポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチド錯体は、生体内（ｉｎｖｉｖｏ）に投与されると、所定の細胞に特異的に結合し、細胞内に取り込まれる。

前記ポリヌクレオチドの内、最も一般的なものは、ＤＮＡである。ＤＮＡは、標的細胞内で発現されるように生成物を暗号化する構造遺伝子と、標的細胞内における構造遺伝子生成物の発現を制御する適当な遺伝子制御物質（助触媒、促進剤等）と、を含む。プラスミドあるいは組み替え可能な遺伝子物質等のベクターにより、目的となるＤＮＡの運搬が行われる。

ポリヌクレオチドを細胞内に導入する好適なシステムに関しては、米国特許出願番号第５０４．０６４号（１９９０年４月２日出願）に詳述されている。

ポリヌクレオチドを配位子に直接結合させることにより、ポリヌクレオチド錯体を形成してもよいが、ポリヌクレオチド結合剤を介してポリヌクレオチドを配位子に結合させる方がより望ましい。この場合、一般的に、ポリヌクレオチド結合剤は、配位子に共有結合される。ポリヌクレオチド結合剤は、ポリヌクレオチドを錯形成させる能力を有し、ポリヌクレオチド錯体として細胞内に内在化された後、ポリヌクレオチドを官能基の形で錯体から放出することができるようなものでなければならない。この結合は、細胞外で安定、即ち、細胞内在化より前に細胞外でポリヌクレオチドが解離することがないように十分な強度を有し、しかも、ポリヌクレオチドを細胞内で放出することができるよう！こ細胞内部の適当な条件下で分離するものでなければならない。例えば、ポリヌクレオチド結合成分とポリヌクレオチドとの結合は、静電引力に基づく非共有結合である。

ポリヌクレオチド結合剤の好適な例としては、負の電荷を有するポリヌクレオチドに結合するポリカチオンが挙げられる。静の電荷を有するポリカチオンは、非共有結合性の確実で強固な錯形成を行い、可溶性で、標的設定可能な、ポリヌクレオチド錯体を形成する。この場合、結合したポリヌクレオチドを損傷させるようなことはない。ポリカチオンとして、例えば、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、あるいは、ヒストン、アビジン、プロタミン等の塩基性タンパク質を用いることができる。

また、ポリヌクレオチド結合剤とポリヌクレオチドとを、例えば、水素結合。

疎水結合、静電結合、あるいは、それらの組み合わせ等、その他の非共有結合により結合させてもよい。この例としては、抗ポリヌクレオチド抗体とポリヌクレオチドとの結合、ビオチニレート化されたヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドとストレプアビジンあるいはアビジンとの結合が挙げられる。

ポリヌクレオチド錯体に、２つ以上のポリヌクレオチド分子が含まれていてもよい。ポリヌクレオチドと配位子−ポリヌクレオチド結合錯体との望ましい比率は、約０．５ないし１である。但し、この値は、錯体の溶解度や毛細管と羽化性に及ぼす影響等の因子によって変化する。

細胞特異性結合剤は、標的細胞の表面レセプター（受容体）に結合する配位子、あるいは、細胞表面の配位子（抗原）に結合する抗体等のレセプターあるいはレセプター様分子である。例えば、細胞内取り込み作用により配位子の内在化を媒介する細胞表面レセプターに対する配位子を、結合剤として用いることが望ましい。レセプター特異性配位子としては、細胞レセプターにより認識可能なように充分露出されている官能基を有するタンパク質が挙げられる。また、ウィルス及び細菌、原生類、哺乳類細胞等の生物有機体の構成成分、あるいは、リポソーム等の人工キャリヤー（担体）をレセプター特異性配位子として用いてもよい。

標的細胞の種類により、用いられる配位子も異なる。例えば、所定の炭水化物基の露出末端を有する糖タンパク質を用いることもできるし、あるいは、ポリペプチド・ホルモン等を配位子として用いることもできる。肝細胞を特異的に標的とする場合には、アシアロ糖タンパク質（ガラクトース末端）を配位子として用いることが望ましい。アシアロ糖タンパク質の例としては、アシアロオロソムコイド、アシアロフェツイン、デシアリレート化水庖性口内炎ウィルスが挙げられる。これらのアシアロ糖タンパク質は、シアル酸末端と前末端ガラクトース残基を有する糖タンパク質を化学的あるいは酵素的にデシアリレート化することにより形成される。あるいは、ラクトースまたはその他のガラクトース末端を有する炭水化物（例えば、アラビノガラクタン）を還元性ラクトサミン化により、非ガラクトース保有タンパク質に結合させることにより、肝細胞を標的とするアシアロ糖タンパク質配位子を形成するようにしてもよい。

哺乳類細胞の表面上には様々な種類のレセプターが存在するため、肝細胞以外の細胞を特異的に標的とする場合、例えば、マクロファージ（リンパ踵）にはマンノース、繊維芽細胞（繊維肉腫）にはマンノース−６−リン酸糖タンパク質、腸細胞には内因性因子−ビタミンＢＩ２、脂肪細胞にはインシュリンが配位子として用いられる。

ポリヌクレオチド錯体は、生理的流体に可溶であることが望ましい。タンパク性配位子とポリヌクレオチド結合剤としてポリカチオンを用いることにより、可溶性ＤＮＡ錯体を生成することができる。ポリヌクレオチド錯体は、通常、生理的に受容可能な賦形剤に内包させて、生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ）の標的細胞のレセプターを飽和するのに充分な量だけ、非経口投与される。

一方、標的細胞は、ポリヌクレオチド投与前、あるいは、投与後（通常１２時間以内）に、細胞複製を誘発するように刺激される。

この場合、標的細胞を外科的あるいは薬理学的手段で刺激して、細胞複製を起こさせることができる。外科的手段としては、標的細胞によって構成されている再生可能な器官あるいは組織を部分的に切除することにより、細胞の複製（耳９を促進させることができる。例えば、部分肝切除を行うことにより、肝細胞の複製を誘発することができる。あるいは、標的細胞の細胞複製を促進させる薬斉り例えば、ナヘノピン、ガラクトサミン、四塩化炭素、またＪｉ　これらの類似体を用いてもよい。更く細胞複製を誘発させる因子やホルモンを用いることもできる。例えば、インシュリンとグルカゴンを組み合わせることにより、肝細胞の複製を誘発することができる。また、この場合、　（標的ポリヌクレオチド錯体を追加投与する場合でも、しない場合でも）最初の刺激剤投与後、所定の間隔をおいて、刺激剤を追加投与することにより、ポリヌクレオチドの発現を更に長くすることもできる。

工ないし２日後にピークに達して、約４日後に消失する、一過性の外来遺伝子発現とは異なり、本発明の方法によれば、ポリヌクレオチドを投与してから約８週間後に、遺伝子発現がピークに達し、その後も、少なくとも４力月間、かなりのレベルで遺伝子発現が持続するような、持続的遺伝子発現を達成することができる。この持続的遺伝子発現のユニークな特徴として、発現レベルが時間と共に。

増加することが、挙げられる。

遺伝子発現を持続させるこの方法は、人間及び動物の遺伝的代謝異常に対する遺伝子治療に有効である。外来遺伝子発現を長時間持続させることにより、遺伝子を余り頻繁ではなく定期的に投与する治療法を実用化することができる。更に標的ＤＮＡの複製により、宿主中で所望遺伝子の質量を増加させることができる。

即ち、受容体細胞の複製を誘発することにより、遺伝子再投与の必要性をなくすことができる。

以下の実施例に基づいて、発明を更に詳細に説明する。

去施例実施例１：部分肝切除による持続的遺伝子発現社社及び方法標的設定可能なポリヌクレオチドキャリヤー（担体）の調製：肝細胞を特異的に標的とするようなキャリヤー系を形成するために、まず、オロソムコイドをプールされていたヒト血清から単離しく米国赤十字Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ。

ＣＴ）　（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ、　Ｄ、Ｈ，、＆　Ｓａｍｍｏｎｓ、　Ｈ，Ｇ、　（１９６６）　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、　Ａモ狽＝@１２４：２０９−２１１）　、不溶化したノイラミニダーゼ（タイプＸ−Ａ：シグマ）でデシアリレート化し、アシアロオロソムコイド（ＡｓＯＲ）を形成した（Ｋａｗａｓａｋｉ、　Ｔ、＋＆　Ａａｈｗｅｌｌ、　Ｇ、　（１９７７）　Ｌ」蝕り３匡Ｌ２５２：６５３６−６５４３）　、残余シアル酸の濃度は１０％未満であった（Ｗａｒｒｅｎ、　Ｌ、　（１９５９）　ＬＪ圏り３厘Ｌ２３４：１９１７ −１９７５）　、　／’ロラン＆パーカーの方法（Ｈａｌｌｏｒａｎ、　Ｍ、Ｊ、、　＆　Ｐａｒｋｅｒ、　ＣＪ、　（１９６６）　、Ｌユｍｍｕｎｏ１．９６：３７３−３７８）に従い、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ピアース・ケミカル社）を用いて、ポリーＬ−リシン（平均Ｍｒ＝３．８００、シグマ）を、２：１のモル比で、ＡｓＯＲに結合させ、精製し、既に知られている方法に従って分析した（Ｗｕ、　Ｇ、Ｙ、　＆　Ｗｕ、　Ｃ，Ｈ，（１９ｇ？）　Ｌ」１江−９旦し並２：　４４２９−４４３２）。

プラスミドの調製；プラスミドＭＴＢＶ、ＪＴ内のＳＶ４０初期プロモーター（助触媒）をマウスのアルブミンプロモーター（−３３０ないし＋１０塩基対）及び促進剤配列（−１２ないし−８，５キロベース）と置き換えることにより、バルブＣＡＴ構造を生成した（Ｐｉｎｋｅｒｔ、　Ｃ，Ａ、、　０ｒｎｉｔｚ、　Ｄ、Ｍ、、　Ｂｒ１ｎｓｔｅｒ、　Ｒ，Ｌ、、　＆　Ｐａ１ｍ１ｔｅｒ、　ＲCＤ。

（１９８７）　Ｇｅｎｅａ　＆　Ｄｅｖ、　ｉ：２６８−２７６）、プラスミドを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）内でクローン化し、単離して、精製した（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ、　Ｈ，Ｃ，、＆　Ｄｏｌｙ、　Ｊ、　（１９７９）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、ヱ：１５１３−１５１８）。１％アガロースゲル電気泳動によって純度を確認し、細菌性細胞のポリヌクレオチドが存在しないことを実証したハイブリッド形成の実験を行うために、溝変位法に従い、ＣＡＴインサートを３２ｐでラベルした（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　Ｅ、Ｆ、、　＆　Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、　（１９８２）　Ｍｏ１ｅｃｕｌ≠秩@Ｃ１ｏｎｉｎ（：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　ｐｐ、　１５０ −１６１．＝ニーヨーク州コールドスプリング・ハーバ−、コールドスプリング・ハーバ−研究所）。

標的設定可能なキャリヤー−ポリヌクレオチド錯体の形成：バルブＣＡＴプラスミドとＡｓ０Ｒ−ポリーＬ−リシン共役体との間で錯形成を行うための最適の比率を、既に知られている方法に従い、アガロースゲル抑制系を用いて、決定した（Ｎｕ、　Ｇ、Ｙ、　＆　Ｗｕ、　Ｃ，Ｈ，（１９８８）　胆匹加μユ底Ｌ２７：８８７−８９２）。共役体とＤＮＡとのモル比を（ＡｓＯＲ−ポリーＬ−リシン共役体のＡｓＯＲ含有量ベースで）２５：　１にした場合、ゲル中におけるＤＮＡの泳動を完全に抑制することができ、可溶性錯体を形成できることがわかった。そこで、このモル比を、以下の全ての実験で採用した。使用する検体が沈澱物を含むことがないように、注入前に全ての錯体を、０．４５μｍの膜（ミリポア）でろ過した。錯体は、３７℃の食塩水あるいはラットの血清中で少なくとも１時間安定であり、また、４℃の食塩水中で少なくとも２週間安定であった。

標的遺伝子発現：２匹ずつグループ分けされた雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２２０２５０ｇ）胤５８０μｇのバルブＣＡＴ−ＤＮＡをＡｓ０Ｒ−ポリ−ルーリシン− ＤＮＡ錯体の形で含む１ｍ１食塩水、あるいは、コントロールを、静脈内注射して、標的遺伝子の発現を測定した。ラットを一日間隔で殺して、肝臓検体を取り出し、均質化した後、生成されたホモジネートのタンパク質含量を定量しくＢｒａｄｆｏｒｄ、　Ｍ、Ｍ（１９７６）　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　７２：２４ｇ−２５４）　、更に、同量のホモジネートタンパク質のＣＡＴ活性を測定した（Ｇｏｒ＋ｎａｎ、　Ｃ，Ｍ、、　Ｍｏｆｆａｔ、　Ｌ、Ｆ、、　＆　Ｈｏｗａｒｄ、　Ｂ、Ｈ，（＋９８２）Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　２＋１０４４−１０５１）。

また、複数のグループのラットに、Ａｓ０Ｒ−ポリ−ルーリシン−ＤＮＡ錯体を静脈内注射した３０分後、６６％の部分肝切除を行い（Ｗａｙｆｏｒｔｈ、　）１．Ｂ、　（１９８０）　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ａｎｄ　Ｓｕｒｇｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｒａｔ、ニューヨー久　アカデミツク・プレス）、部分肝切除が標的遺伝子発現の経時変化に及ぼす影響を調べた。

ラットを、８週間にわたって、次々と殺して、肝臓を取り出し、均質化した後、肝臓のＣＡＴ活性を測定した。８週間経過した時点で、ロベクトミーを行い、１１週間経過した時点でラットを殺した。ＣＡＴの測定は全て２度ずつ行った。

持続的遺伝子発現に伴う標的ポリヌクレオチドの状態：フェノール−クロロフォルム法に従って（Ｒｏｗｅ、　Ｄ、Ｗ、、　Ｍｏｅｎ、　Ｒ，Ｃ，、ＤａｖｉｄｓｏｎＪ、Ｎ、、　Ｂｙｅｒｓ　Ｐ、Ｈ，、Ｂｏｒｎａｔｅｉｎ、　Ｐ、、　＆　Ｐａ１ｍ１ｔｅｒ、　Ｒ，Ｄ、　（＋９８７）　Ｌ匹匣畦払■１７：１５８１ −１５９０）、ＤＮＡを肝臓ホモジネートから抽出して、供給される標的ＤＮＡの状態を測定した。まず、！＆初に、パルプＣＡＴプラスミドを切断しないＢｓｔｅＩＩ（２ユニット／μｇポリヌクレオチド）と、プラスミドを単一の部位で切断するＸｂａＩ（２ユニット／μｇポリヌクレオチド）と、ＣＡＴインサートをプラスミドから切断するＢａｍＨＩ　（２ユニット／μｇポリヌクレオチド）と、を用いて、ＤＮＡ検体を切断した。３７℃で１８時間かけてＤＮＡの切断を行った後、検体の濃度を少しずつ増加させ、標準バルブＣＡＴプラスミドを用いて、１％アガロース・ゲル電気泳動を行った。その後、ＤＮＡをニトロセルロースに移し、ｚ２ｐでラベルしたＣＡＴｃＤＮＡプローブとハイブリッド形成させることにより、ＣＡＴ配列を検出した（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｅ、Ｍ、　（１９７５）　ム］鄭工旦技Ｌ９８：５０３−５１７）。

懸図４に、時間の関数として、標的外来遺伝子の発現、ここでは、ＣＡＴ遺伝子の発現を測定した例を示す。ＣＡＴ活性は、注射から２４時間経過した時点で、１０ユニット／肝臓１ｇ、また、４８時間後で、７．６ユニツト／ｇであった。

この遺伝子発現は、一過性のものであり、ＣＡＴ活性が急速に減少して、７２時間後には４．６ユニツト／ｇ、９６時間後には検出不能なまでに低くなった。

肝細胞を標的とする遺伝子発現の経時変化に６６％部分肝切除が及ぼす影響を、図２に示す。レーン３に示すように、肝切除を行ってから２４時間後のＣＡＴ活性は検出不能であるが、徐々に増加して、４８時間後には、２．４ユニット／肝臓１ｇまで回復した。このＣＡＴ活性は、従来の一過性発現における９６時間の限界点を大幅に超えても、検出可能であった。ＣＡＴ活性は、徐々に増加して、８週間後には、最大値である１４．６ユニツト／肝１１１ｇに達し、その後も、肝切除後１１週間まで、１１．３／ｇの高レベルで持続した。

持続的ＣＡＴ遺伝子発現に伴う、肝臓内での標的ＤＮＡの状態を検出した。まず、部分肝切除後１１週間経過した時点で、ＤＮＡ錯体処理肝臓の一部からＤＮＡを抽出した。図３のレーンエないし３は、それぞわ、プラスミドを単一部位で切断するＸｂａＩを用いて切断し、直線状にしたバルブＣＡＴプラスミドを０゜０１ｇｇ、０．０５μｇ、０．１μｇ含むものである。レーン４は、ＢａｍＨＩを用いて、標準バルブＣＡＴプラスミドから切除したＣＡＴインサートの電気泳動位置を示す。また、レーン５に示すように、部分肝切除後１１週間経過した時点で、標的設定可能なりＮＡ錯体で処理した肝臓から細胞ＤＮＡを抽出して、分析した結果、ｍｗＤＮＡには、ＣＡＴｃＤＮＡプローブとハイブリッド形成した高分子量の配列が含まれてい旭この細胞ＤＮＡをＸＢａｍＨＩで切断した結果を、レーン６に示す。ここでは、ＣＡＴインサートが完全に放出さ１１．、（レーン４の）標準パルプＣＡＴプラスミドから切除されたインサートと同様の泳動が観察された４レーン７ないし９は、部分肝切除後１１週間経過した時点で、ＤＮＡ錯体で処理した肝臓から細胞ＤＮＡを抽出してＸｂａＩで切断して、分析した結果を示す。ここでは、自然のままの直線プラスミドよりも分子量の小さい、ハイブリッド形成可能な、複数の断片が形成されたが、ハイブリッド形成可能な配列の大部分は、直線プラスミドよりも大きなサイズのＤＮＡのままであった。プラスミドを切断しない酵素Ｂｓｔｅｌｌで細胞ＤＮＡの制限を行った場合、レーン１０ないし１２に示すように、全て、バルブＣＡＴプラスミドよりも大きさサイズのハイブリッド形成可能な断片が形成された。制限酵素と細胞ＤＮＡとの比を２倍にしても、あるいは、ＸｂａＩ及びＢｓｔｅＩ工を用いたＤＮＡの切断時間を２倍にしても、制限パターンに変化はみられなかった（データは示されていない）。トランスフェクション後１１週間経過した時点で測定した、肝臓検体における複製数は、約１８：１であった。最後に、レーン１３に、部分肝臓切除後１１週間経過した時点で、　（食塩水で処理された）対照肝臓から細胞ＤＮＡを抽出して分析した結果を示す。ここでは、ハイブリッド可能なＣＡＴ配列は形成されておらず、錯体で処理された肝臓のＤＮＡによるハイブリッド形成が、内因性宿主配列に対する非特異的なプローブ結合に起因するものではない、ことがわかる。

実施例２：薬理学的手段による遺伝子発現の持続Ａ、標的遺伝子の発現を非外科的手段によって持続させることができるかどうかを判断するために、マウスのアルブミン制御因子によって動かされるＣＡＴ遺伝子を含むプラスミドｐ９−１２ａ　１ｂＣＡＴを、標的設定可能なりＮＡキャリヤー系と錯形成させた。

既に知られているように、低脂肪血症薬のナヘノピン［２−メチル−２−ｐ−（１，２，３，４−テトラヒドロ−１−ナフチル）−フェノキシプロピオン酸コは、肝細胞に損傷を与えることなく、肝細胞の複製を誘発する強力な刺激剤であるため、この実験では、ナヘノピンを使用した。

まず最初に、ＤＮＡ錯体を注射する時点に対する、ナヘノピン投与の最適な時期を決定した。複数のラット（２００−２５０ｇｍ）群に、錯体あるいは食塩水のコントロールを注射する１２時間、１８時間、及び２４時間前に、２００ｍｇ／ｋｇのナヘノピンを注射した。今までの研究から、標的外来遺伝子の発現が一過性のもので、最高４日間しか持続しないことがわかっているため、ＤＮＡ投与後ヱ旦ｆｆｌ旦友竺應、即ち、一過性の発現が既に存在していない時点で、ナヘノビンを注射した場合の外来遺伝子発現を測定した。錯体とナヘノピンで処理されたラット及びコントロールを１週間経過した時点で殺し、上述のＧｏｒｍａｎらの方法に従い、肝臓のＣＡＴ酵素活性を測定した。この結果、ナヘノビンを前投与するのに最適な時期は、ＤＮＡ錯体投与の２０ないし２４時間前であった。このスケジュールに従って投与した場合、ＣＡＴ遺伝子の発現は、２週間経過した時点で２．３ユニット／肝臓１ｍｇであり、９週間後まで、検出可能なレベルであっ旭次にナヘノピンを繰り返し投与した場合の肝細胞複製に及ぼす影響に関して調べ池上記のように、ラット群にナヘノピンを注射した後、錯体を投与し、更に、同量のナヘノビンを１週間後に再び注入し九更に１週間経過した時点で、ＣＡＴ活性を測定した。この結果、ＣＡＴ活性は、９．３ユニット／ｍｇのレベルまで上昇してい旭更に、錯体及びナヘノピンの両方を繰り返し投与した場合の影響を調べた。ラット群く一週間の間隔をおいて、錯体とナヘノピンを２度ずつ投与した。最初の投与から２週間後にＣＡＴ酵素活性を測定した結果、ＣＡＴレベル）上　７８ユニット／ｍｇまで上昇していたこれ奢九　ナヘノピンを単独で再投与した場合の１４倍、また、錯体とナヘノピンを何れも一度しか投与しなかった場合に比較して３４倍の上昇である。錯体を単独で、あるいは、ナヘノビンを単独で与えられたコントロールラットにおいては注射から１ないし２週間経過した時点で、ＣＡＴ活性が検出不能なレベルまで下がってい九肝臓のＣＡＴ活性を測定する毎に、血清アラニン・アミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）のレベルも測定して、肝細胞に与えうる損傷の評価を行っ池この結果、ナヘノビンを一度あるいは二度投与した場合も、また、ナヘノビンと錯体を一度あるいは二度投与した場合も、血清ＡＬＴレベルはずっと正常であった。

ＣＡＴ測定特定時られる肝臓のサザン・プロットの結果、”Ｐ　ｃＤＮＡプローブとハイブリッドして、ＣＡＴ配列を形成可能な物質に対応するバンドが、錯体並びにナヘノビン投与後１週間、２週間及び９週間の時点で観察された。また、錯体及びナヘノビンで処理された肝臓から得られた全細胞ＤＮＡを制限酵素で処理した結果、ＣＡＴ遺伝子を、全細胞ＤＮＡからそのままの形で切断することができたこれ＃戴予想通り、ＣＡＴ遺伝子がそのままの形で保持されていることを示している。

以上のことから、非毒性薬剤を投与して、肝細胞の複製を促進させることにより、標的外来遺伝子の発現を持続させ、増加させることができる、という結論が得ちれた。

Ｂ、化学的な部分肝切除を行った場合の標的外来遺伝子発現の持続性肝細胞を化学的に損傷させることにより、肝細胞複製を誘発し、肝臓の再生を行うことができる。このような役割を果たすものとして、様々な肝臓特異性毒物が知られているが、典型的な例としては、ガラクトサミンが挙げられる。

ｐ９−１２ａ　１ｂＣＡＴプラスミドをＤＮＡキャリヤー系と錯形成させて、ガラクトサミンを投与したことにより、標的遺伝子の発現を持続させることができるかどうか、を調べた。

次に、ガラクトサミンを前注入するための最適な時期を決定した。錯体あるいは食塩水のコントロールを静脈注射する１６時間、２０時間、２４時間、及び、３９時間前に、９００　ｍ　ｇ　／　ｋ　ｇのガラクトサミンを、複数のラット群（２００−２４０ｇｍ）に注射した。１週間後ラットを殺して、肝臓中のＣＡＴ酵素活性を測定し九このデータから、ガラクトサミンの前投与に最適な時期は、２４時間前である、ことがわかった。

ガラクトサミン投与後の標的外来遺伝子発現の経時変化をめた。複数の群のラットに錯体の投与２４時間前にガラクトサミンを投与して、様々な時間間隔で肝臓のＣＡＴ活性を測定した。更に、同じ時に、血清ＡＬＴの値もめた。肝臓内のＣＡＴ活性は、２週間後に６．７ユニツト／ｍｇのピークに達し、錯体及びガラクトサミン投与後少なくとも４週間の間持続した。また、ガラクトサミン注射後２４時間経過した時点での血清ＡＬＴの値は、約１，２００ＩＵのレベルであり、肝細胞がわずかな損傷を受けていることが示された。

これらのデータから、選択的な肝臓前を制御された方法で投与することにより、肝細胞をわずかに損傷させ、肝細胞の複製を誘発し、標的遺伝子の発現を持続させる効果があることが、わかった。

マウスのアルブミン制御因子によって動かされるＣＡＴ遺伝子を含むプラスミドｐ９−１２ａ　１　ｂＣＡＴを、標的設定可能な錯体として、ラットに静脈注射した。この場合、ＣＡＴ活性は一過的なものであり、錯体の注射から９６時間経過した時点で、検出不可能なレベルにまで低下していた。錯体投与の２０ないし２４時間前にナヘノピンを２００ｍｇ／ｋｇ投与することにより、ＣＡＴ遺伝子の発現を２週間の間持続させることができた（２．３Ｕ／ｍｇ）。同量のナヘノピンを単独で最初の投与から１週間後に再投与することにより、最初の注射後２週間の時点におけるＣＡＴ活性を、９．３Ｕ／ｍｇまで増加させることができた４更に、錯体とナヘノピンの両方を最初の注射から１週間後に再投与することにより、最初の注射から２週間経過後のＣＡＴのレベルを、１４倍の７８Ｕ／ｍｇまで増加させることができた。一方、標的設定可能なポリヌクレオチド錯体のみ、あるいは、ナヘノピンのみを２度投与した場合には、２週間後のＣＡＴ活性は、検出不可能なレベルまで低下していた４標的設定可能なポリヌクレオチド錯体とナヘノピンとを与えられたラットは、全て、少なくとも９週間にわたって、高いＣＡＴ活性レベルを保ち続けた。

以上、説明してきたように、非毒性薬剤を投与することにより、肝細胞の複製を促進させて、標的外来遺伝子の発現を増加、持続させることができる。

恋五例当業者には、当然のことであるが、以上説明した実施例の方法は、発明の要旨を超えない範囲内で、様々に変更、修正可能であり、これらの修正、変更も、以下のクレームで網羅されている。

国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．ポリヌクレオチドを有機体の細胞内に導入して持続的に発現させる方法で、ポリヌクレオチド錯体を前記有機体に投与して、特異的にポリヌクレオチドを細胞内に取り込ませるステップと、前記細胞を刺激して複製を行わせるステップと、を備え、前記ポリヌクレオチド錯体が、細胞の表面分子に結合して、細胞内に内在化される細胞特異性結合剤に放出可能に結合されるポリヌクレオチドを含む、ことを特徴とする方法。
２．前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである、ことを特徴とする請求項１記載の方法。
３．前記ポリヌクレオチドが遺伝子を含む、ことを特徴とする請求項１記載の方法。
４．前記有機体がヒトである、ことを特徴とする請求項１記載の方法。
５．前記ポリヌクレオチド錯体が、更に、ポリヌクレオチド結合剤を含み、前記ポリヌクレオチドが、前記細胞特異性結合剤に、前記ポリヌクレオチド結合剤を介して結合される、ことを特徴とする請求項１記載の方法。
６．前記ポリヌクレオチド結合剤が、ポリカチオンである、ことを特徴とする請求項１記載の方法。
７．前記ポリカチオンがポリリシンである、ことを特徴とする請求項６記載の方法。
８．前記細胞特異性結合剤が、細胞内取り込みを媒介する細胞の表面レセプターに結合する、ことを特徴とする請求項１記載の方法。
９．前記細胞特異性結合剤が、肝細胞のアシアロ糖タンパク質レセプターの配位子である、ことを特徴とする請求項８記載の方法。
１０．前記配位子が、アシアロ糖タンパク質である、ことを特徴とする請求項９記載の方法。
１１．前記細胞によって構成される器官あるいは組織の一部を切除することによって、前記細胞を刺激し、複製を行わせる、ことを特徴とする請求項１記載の方法。
１２．前記細胞を薬剤によって刺激して、複製を行わせる、ことを特徴とする請求項１記載の方法。
１３．前記薬剤が、ナヘノピンあるいはその類似体である、ことを特徴とする請求項１２記載の方法。
１４．前記薬剤がガラクトサミンである、ことを特徴とする請求項１２記載の方法。
１５．ＤＮＡを有機体の肝細胞内に導入して持続的に発現させる方法で、ＤＮＡ錯体を前記有機体に投与して、特異的にＤＮＡを肝細胞内に取り込ませるステップと、前記肝細胞を刺激して複製を行わせるステップと、を備え、前記錯体が、アシアロ糖タンパク質レセプターの配位子共役体に結合するＤＮＡと、ＤＮＡを錯形成し、且つ、肝細胞内でＤＮＡを放出可能なポリカチオンと、を含む、ことを特徴とする方法。
１６．前記アシアロ糖タンパク質レセプターの配位子が、アシアロ糖タンパク質である、ことを特徴とする請求項１５記載の方法。
１７．前記ポリカチオンがポリリシンである、ことを特徴とする請求項１５記載の方法。
１８．部分肝切除によって、前記肝細胞を刺激して、複製を行わせる、ことを特徴とする請求項１５記載の方法。
１９．前記肝細胞を薬理学的手段によって刺激して、複製を行わせる、ことを特徴とする請求項１５記載の方法。
２０．前記薬剤が、ナヘノピンあるいはその類似体である、ことを特徴とする請求項１９記載の方法。
２１．前記薬剤が、ガラクトサミンあるいはその類似体である、ことを特徴とする請求項１９記載の方法。
２２．細胞特異性結合剤に放出可能に結合されるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド錯体の使用法で、ポリヌクレオチドを有機体の細胞内に導入して、例えば、ナヘノピンあるいはその類似体、または、ガラクトサミンあるいはその類似体等の薬剤による細胞刺激条件下で、ポリヌクレオチドを持続的に発現させる、ことを特徴とするポリヌクレオチド錯体の使用法。
２３．治療用ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）を含む有機体の細胞（例えば、肝細胞）を刺激して、細胞複製を行わせ、ポリヌクレオチドを持続的に発現させるために用いられる、ナヘノピンあるいはその類似体。
２４．治療用ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）を含む有機体の細胞（例えば、肝細胞）を刺激して、細胞複製を行わせ、ポリヌクレオチドを持続的に発現させるために用いられる、ガラクトサミンあるいはその類似体。
２５．アシアロ糖タンパク質レセプターの配位子共役体に結合されるＤＮＡと、ポリカチオンと、を含むＤＮＡ錯体の使用法で、ＤＮＡを有機体の肝細胞内に導入して、例えば、ナヘノピンあるいはその類似体、または、ガラクトサミンあるいはその類似体等の薬剤による肝細胞刺激条件下で、ＤＮＡを持続的に発現させる、ことを特徴とするＤＮＡ錯体の使用法。