JP2000506388A

JP2000506388A - 近共通スプライス部位を有する無イントロン遺伝子の発現を増大させるためのウイルスのシス作用性転写後調節配列の用途

Info

Publication number: JP2000506388A
Application number: JP9532696A
Authority: JP
Inventors: アール．イル，チャールズ; ビドリングマイアー，スコット
Original assignee: ジイミューンリスポンスコーポレイション
Priority date: 1996-03-11
Filing date: 1997-03-10
Publication date: 2000-05-30
Also published as: EP0888451A1; US5744326A; CA2248539A1; WO1997033994A1; AU715567B2; AU2071797A

Abstract

(57)【要約】一つまたはそれ以上の近共通スプライス配列を有する無イントロン遺伝子と、該遺伝子とともに転写され、細胞の核から細胞質への遺伝子転写物の輸出を生じる、ウイルスのシス作用性転写後調節要素の一つまたはそれ以上のコピーとを含む発現ベクターが開示される。好適実施態様では、該ベクターは、核酸結合剤に解放できるよう結合されたプラスミドと、細胞表面の成分に結合するリガンドとで構成された分子複合体の形態で、特定の細胞への送達のために標的化する。開示されたとおりのウイルスのシス作用性転写後調節要素の使用は、近共通スプライス部位を有する無イントロン遺伝子の発現を増大することができる。

Description

【発明の詳細な説明】近共通スプライス部位を有する無イントロン遺伝子の発現を増大させるためのウイルスのシス作用性転写後調節配列の用途［発明の背景］逆転写を通じて複製するいくつかのウイルスは、一定の調節配列に依存して、スプライスされていないか、または部分的にスプライスされた転写物が、ウイルスタンパク質として発現される細胞質へと輸出されるのを調節することが示されている。例えば、ＨＩＶ−１というレトロウイルスは、Revタンパク質に加えて、Rev応答要素（ＲＲＥ）に依存して、細胞核から細胞質への一定の転写物の輸出を支配し、それによってそれらの発現を促進する［例えばCullen et al.(1991 )Science 16:346-350；およびRosen et al．(1990)AIDS 4:499-509を参照されたい］。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、その複製サイクルの間に逆転写を経験し、シス作用性要素に依存して、遺伝子転写物の細胞質蓄積を調節するもう一つのウイルスである。特に、ＨＢＶの公知のタンパク質生成物のすべてが、一本鎖の環状ゲノム上にコードされており、スプライスされない（非スプライス）転写物から翻訳される。エンハンサーIIを包含し、表面遺伝子転写物内の表面遺伝子コーディング領域の下流に位置する、転写後調節要素（ＰＲＥ）と呼ばれる領域は、ＲＮＡレベルでシスに作用して、転写の開始、または細胞質ＲＮＡの安定性にいかなる影響もない核から細胞質へのこれらＨＢＶ転写物の輸出を可能にすることが示されている [例えばHuang et al．(1995)Molec．and Cell．Biol．15(7):3864 -3869；Huang et al．(1994)J．Virol．68(5):3193-3199；Huang et al（1993） Molec．and Cell．Biol．13(12):7476-7486を参照されたい]。表面遺伝子転写終結部位の下流の位置へのＰＲＥ配列の再配置の効果は、細胞質の表面遺伝子転写物の数の４分の１の減少より多大であるが、核の表面遺伝子にはそうではない [ Huang et at．(1995)、前掲]。ＨＢＶの生活環の中でのＰＲＥの機能は、細胞質へのＨＢＶ表面遺伝子転写物の、スプライスされることのない輸出を可能にすることであることが、Ｈuangら (1995)、前掲によって示唆されている。著者らは、細胞質へのそれらの転写物の輸出を可能にすることによって、高等な真核生物の、生来イントロンを欠く遺伝子の発現を活性化する一群のＲＮＡシス要素の一例を代表し得る可能性があることも示唆している。［発明の要約］本発明は、一ヶ所またはそれ以上の近共通スプライス部位を有する無イントロン遺伝子の発現を、ウイルスのシス作用性転写後調節要素（ＰＲＥ）の一つまたはそれ以上のコピーを、それが該遺伝子とともに転写され、細胞の核から細胞質への遺伝子転写物の輸出を生じるよう、操作できるように（すなわち機能的に）該遺伝子に結合することによって増大させる方法を提供する。一実施態様では、該ＰＲＥ配列を、停止シグナルの３’であり、かつポリアデニル化シグナルの５ ’である位置で遺伝子に結合させる。本発明は、更に、(ａ)遺伝子が細胞内で転写されるよう、プロモーター配列に機能的に結合された一つまたはそれ以上の近共通スプライス配列を有する無イントロン遺伝子と、(ｂ)該遺伝子とともに転写され、細胞の核から細胞質への遺伝子転写物の輸出を生じる、ウイルスのシス作用性転写後調節要素（ＰＲＥ）の一つまたはそれ以上のコピーとを含む発現プラスミドを提供する。一実施態様では、ＰＲＥは、Ｂ型肝炎ウイルスに由来する。ＨＢＶの好適なＰＲＥは、SEQ ID ＮＯ:１のヌクレオチド配列を含む。もう一つの実施態様では、一つまたはそれ以上の近共通スプライス配列を有する無イントロン遺伝子（例えばｃＤＮＡ）は、血液凝固因子、例えばVIII因子またはIX因子をコードする。該発現プラスミドは、in vitroまたはin vivoのいずれでも細胞に移入して、ＰＲＥ配列の不在下で得られる発現に比して増大した、無イントロン遺伝子の発現を得ることができる。好適実施態様では、発現プラスミドを、プラスミド、および核酸結合剤（例えばポリカチオン）と、細胞の表面上の成分に結合するリガンドとで構成される結合体の分子的複合体を形成することによって、特定の細胞への送達の標的とする。一実施態様では、該リガンドは、肝細胞上に存在するアシアロ糖タンパク質受容体に結合する。［図面の簡単な説明］図１は、(ａ)ヒトＢドメイン欠失VIII因子ｃＤＮＡの５’および３’結合近共通スプライシング配列とともに、これらの近共通配列がヒトＢドメイン欠失VIII 因子ｃＤＮＡ内のどこに位置するかの地図を示す。図２は、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）のRev応答要素（ＰＲＥ）(SEQ ID ＮＯ:18)、およびＢ型肝炎ウイルスの転写後調節要素（ＰＲＥ）の算出された二次ＲＮＡ構造を示す。図３は、３’ＳＶ４０介在配列（ＩＶＳ）およびＨＢＶＰＲＥ配列（SEQ ID ＮＯ:１）を保有するか、または保有しないＢドメイン欠失VIII因子をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドを移入した、ＨＵＨ−７細胞でのヒトＢドメイン欠失VIII因子ＲＮＡのレベルを比較するノーザンブロット分析を示す。図４は、VIII因子発現ベクター中のＨＢＶＰＲＥ配列（SEQ ID ＮＯ:１）および３’ＳＶ４０ＩＶＳの存在が生起した、ヒトＢドメイン欠失VIII因子の発現に対する効果を示すグラフ表示である。タンパク質レベルは、ＥＬＩＳＡと活性との双方によって測定した。図５は、ヒトＢドメイン欠失VIII因子の発現に対する発現ベクター中のＨＢＶＰＲＥ配列（SEQ ID ＮＯ:１）および３’ＳＶ４０介在配列（ＩＶＳ）の、ヒト成長ホルモンの発現に対して正規化した効果を示すグラフ表示である。タンパク質レベルは、放射線免疫検定によって測定した。図６は、ヒトＢドメイン欠失VIII因子をコードし、ＨＢＶＰＲＥ配列（SEQ ID ＮＯ:１）と３’ＩＶＳ配列との双方を含むプラスミドpMT₂F8PREIVSpAGH-E/Oを有する、標的とされる複合体の注射の１、４、７および10日後のヒトＢドメイン欠失VIII因子の発現のin vivoでのレベルを示すグラフ表示である。図７は、ＨＢＶＰＲＥ配列(SEQ ID ＮＯ:１)および３’ＳＶ４０ＩＶＳを保有するか、または保有しないＢドメイン欠失VIII因子をコードするｃＤＮＡを含む、４種類の発現ベクター構成体の地図を示す。図８は、３’ＩＶＳを保有するＢドメイン欠失VIII因子をコードするｃＤＮＡを含む、pMT2LAVIIIという発現ベクターの地図を示す。［発明の詳細な説明］本発明は、一ヶ所またはそれ以上の近共通スプライス部位を有する無イントロン遺伝子の発現を増大させるための、ウイルスのシス作用性転写後調節要素または「ＰＲＥ」の用途に関係する。ＰＲＥという配列は、該無イントロン遺伝子に (例えば適切な発現ベクター中で)、(ａ)該遺伝子とともに転写され、そのため遺伝子転写物中に存在するように、かつ（ｂ）細胞核から、それが発現される細胞質への該遺伝子転写物の輸送を支配するシス作用性配列としてのその機能を保持するように、結合される。このような方式での遺伝子とＰＲＥとの結合を、今後は「機能的な」結合と呼ぶことにする。Ｉ．ウイルスの「ＰＲＥ」配列本明細書に用いられる限りで、用語「ウイルスのシス作用性転写後調節要素」または「ＰＲＥ」は、転写後レベルで（すなわち遺伝子転写物中で）シスに作用して、非スプライス遺伝予転写物（すなわちイントロンを含まない）の細胞質での蓄積を増加させ、一ヶ所またはそれ以上の近共通スプライス部位を有するウイルス配列を意味する。遺伝子転写物の細胞質での蓄積の増加は、ＰＲＥ配列の不在下で得られるレベルと比較して測定される。ＰＲＥ配列は、逆転写を通じて複製するウイルス、特に、そのタンパク質産物が非スプライス転写物から翻訳されるウイルスに共通して見出される。これらの配列は、細胞核から、それらが発現される細胞質への非スプライスウイルス転写物の輸送を調節する。ＰＲＥ配列が特定されているウイルスの例は、レトロウイルス、例えば、ヒトおよびネコ免疫不全ウイルス（ＨＩＶおよびＦＩＶ）[例えばCullen et al．(1991)J．Virol．65:1053；およびCullen et al．(1991)Cell 58:423-426を参照されたい]、ならびにＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）[例えばHuan g et al．(1995)Molec．and Cell．Biol．15(7):3864-3869；Huang et al．(199 4)J．Virol．68(5):3193-3199;Huang et al（1993）Molec．and Cell．Biol．13 (12):7476-7486を参照されたい]を包含する。本発明の一実施態様では、ＰＲＥは、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に由来する。好適なＨＢＶのPＲＥは、エンハンサーIIを包含し、表面抗原遺伝子の転写された部分内にある約587ヌクレオチドの配列（SEQ ID NO：１）である(図９を参照されたい)。このＰＲＥ配列は、シスに機能して、これらの転写物の細胞質での蓄積を促進することによって、表面遺伝子転写物の定常状態でのレベルを上昇させることが示されている。 11．無イントロン遺伝子本発明に用いるのに適した遺伝子は、本明細書に定義したとおり、一ヶ所またはそれ以上の近共通スプライス部位を有するいかなる無イントロン遺伝予も包含する。本明細書に用いられる限りで、用語「無イントロン遺伝子」は、スプライスされてなくて翻訳されるｍＲＮＡをコードする遺伝子を意味する。そのような遺伝子は、一般に、共通３’供与体または５’受容体スプライス部位を全く保有しない。すべての場合に、この遺伝子は、細胞による発現に適した形態でなければならず、一般的には、適切なベクター(例えば発現ベクター)、例えばプラスミドに含まれる。例えば、この無イントロン遺伝子は、標的細胞内で機能する適切な遺伝的調節要素に機能的に結合されなければならない。そのような調節配列は、例えば、遺伝子の転写を推進するプロモーター配列を包含する。適切なプロモーターは、非常に様々なウイルスプロモーター、例えばＳＶ４０およびＣＭＶプロモーターを包含する。該無イントロン遺伝子は、コードされたタンパク質の細胞内目的地および／または細胞外分泌への往来を与える、適切なシグナル配列も包含してよい。該シグナル配列は、タンパク質の生来の配列、または外来の配列であってよい。遺伝子発現、加工および分泌に要する調節配列は、当技術に認識されており、適切な細胞での望みのタンパク質の発現を支配するように選ばれる。したがって、本明細書に用いられる限りで、用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーその他の発現制御要素を包含する。そのような調節配列は、公知であり、Go eddelのGene expression Technology:Methods in Enzymology，p.185，Academic Press，San Diego，CA(1990)で考察されている。無イントロン遺伝子（近共通スプライス部位を保有し得る）の本発明に用い得る一分類群は、ｃＤＮＡである。ｃＤＮＡは、一般的には、既にスプライスされたｍＲＮＡから逆転写され、その結果、代表的にはイントロンを保有しないが、後に外来イントロン（例えばウイルスの介在配列(ＩＶＳ)）を付加してもよい。低レベルの発現を示すｃＤＮＡは、一ヶ所またはそれ以上の近共通スプライス部位を有することがあり、そのため、本発明に用いるのに非常に適している。無イントロン遺伝子は、望みのいかなるタンパク質（例えば、治療上または診断上の価値を有する）をコードすることもできる。一実施態様では、この無イントロン遺伝子（例えばｃＤＮＡ）は、血液凝固因子（またはその変種、類似体、もしくは変更バージョン(例えばキメラタンパク質)）の全部または一部をコードする。例えば、該遺伝子は、ヒトＢドメイン欠失VIII因子（SEQ ID ＮＯ:２の第 2,965〜7,377塩基）をコードできるが、これは、５’（Ａ／Ｃ）ＡＧＧＴ（Ａ／Ｇ）ＡＧＴ共通スプライス配列と同一の９塩基中６〜７塩基を有する少なくとも６ケ所の近共通５’（供与体）スプライス部位を保有する（図１を参照されたい）。加えて、このＢドメイン欠失ｃＤＮＡは、少なくとも14ヶ所の近共通３’（受容体）スプライス部位（SEQ ID ＮＯ:４〜17）を有する（図１を参照されたい）。このＢドメイン欠失VIII因子配列は、他の遺伝子に対するｃＤＮＡと比較して、低レベルの発現を示す。しかし、下記の実施例で立証されるとおり、Ｂドメイン欠失VIII因子ｃＤＮＡの低い発現は、遺伝子をＰＲＥ配列に機能的に結合することによって有意に上昇させることができる。近共通スプライス配列が特定されている、血液凝固因子をコードする無イントロン遺伝子のもう一つの例は、IX因子をコードするｃＤＮＡである[例えばYull et al．(1995)PNAS 92:10899-10903を参照されたい]。 III．「近共通」スプライス部位本発明の無イントロン遺伝子は、一ヶ所またはそれ以上の近共通スプライス部位を有する。本明細書に用いられる限りで、用語「近共通スプライス部位」は、１個もしくはそれ以上のヌクレオチドの付加、削除または置換によって、共通スプライス（５’供与体または３’受容体）配列と異なるヌクレオチド配列（図１を参照されたい）を意味する。好ましくは、近共通スプライス部位は、共通５’ および３’スプライス配列と50％を超えて、より好ましくは約70〜80％相同である。このレベルの相同性は、共通３’および５’スプライス部位を探求かつ結合する細胞性スプライセオソームが該近共通配列を認識できるようにすると考えられる。その結果、近共通スプライス配列を有する無イントロン遺伝子転写物は、タンパク質へと翻訳され得る細胞質に輸送されるのではなく、スプライシングが生じる細胞の核内で連結されるものと考えらる。遺伝子転写物の細胞でのスプライシングは、次の共通配列:（Ａ／Ｃ）ＡＧＧＴ（Ａ／Ｇ）ＡＧＴを有する５’（供与体）スプライス部位とのスプライセオソームの結合を必要とする。次いで、スプライセオソームは、次の共通配列:（Ｔ／Ｃ）...≧11（ピリミジントラック）...（Ｃ／Ｔ）ＡＧＧを有する３’（受容体）スプライス部位へと続く分岐点配列を求めて３’方向に走査する。この３’ スプライス部位が見出されたならば、スプライセオソームは、転写物のＧＴの５ ’を５’供与体スプライス部位で、またＡＧの３’を３’受容体部位で切断することになる。上記により、一ヶ所またはそれ以上の近共通スプライス部位を有する遺伝子は、それらのヌクレオチド配列を、上記に開示した３’および５’共通配列と高度に相同である（例えば50〜90％を超えて相同である）配列の存在について分析することによって特定することができる。概して、共通スプライス部位を全く（すなわちイントロンを全く）保有せずに、そのような近共通スプライス部位を有する遺伝子は、それらの転写物が細胞質へと充分に輸送されないために、低レベルのタンパク質発現を示すことになる。しかし、この低レベルの発現は、一般的には、本明細書に記載したとおり、ウイルスのＰＲＥ配列を遺伝子に結合することによって補正する（すなわち上昇させる）ことができる。 IV．近共通スプライス部位を有する無イントロン遺伝子とのＰＲＥ配列の機能的な結合本発明のウイルスＰＲＥは、無イントロン遺伝子に、例えば発現ベクター中で、（ａ）該遺伝子とともに転写され、そのため遺伝子転写物中に存在するように、かつ（ｂ）細胞核から、それが発現される細胞質への該遺伝子転写物の輸送を支配するシス作用性配列としてのその機能を保持するように、結合される。発現ベクターは、該遺伝子の発現に要する適切な遺伝的調節要素、例えば前記のそれ（例えばプロモーターやエンハンサー要素）を有するいかなるベクターであることもできる。そのような発現ベクターは、当技術に周知であり、商業的に利用できる入手源から購入できる。一実施態様では、遺伝子の終止コドンの下流の（すなわち翻訳されない領域内の）、かつポリアデニル化シグナルの上流の（すなわち転写される領域内の）位置で、ＰＲＥを遺伝子に結合する。ＰＲＥは、開始コドンの上流であり、遺伝子の翻訳に干渉しない（例えば、好ましくはリーダー配列内ではない）位置で遺伝子に結合してもよい。ＰＲＥ配列は、１コピーとしてか、または多数の（すなわち２またはそれ以上の）コピーとして遺伝子に結合してよい。Ｖ．遺伝子の送達および発現本明細書に記載したとおり、適切な発現プラスミド内で、一つまたはそれ以上のウイルスＰＲＥ配列を、一ヶ所またはそれ以上の近共通スプライス部位を有する無イントロン遺伝子に結合した後、プラスミドは、in vitroまたはin vivoのいずれでも細胞に送達することができる。例えば、標準的なトランスフェクションの手法、例えばリン酸カルシウム沈降を用いて、in vitroでプラスミドを細胞に移入することができる。これに代えて、例えば、静脈内または筋内注射によって、invivoでプラスミドを細胞に送達できる。本発明の好適実施態様では、発現プラスミドを、核酸結合剤と、細胞表面の成分に結合するリガンドとで構成される担体分子に解放できるように結合し、それによってポリヌクレオチド−担体複合体を形成することによって、特定の細胞への送達のための標的とする。ポリヌクレオチド−担体複合体の担体分子は、少なくとも二つの機能を果たす：すなわち、（１）標的細胞によるインターナリゼーション以前の細胞外でのポリヌクレオチドの有意な分離を防ぐのに充分なだけ（in vivo、ex vivoまたはin vitroのいずれでも）安定的となる方式で、ポリヌクレオチド（例えばプラスミド）を結合させ、また（２）ポリヌクレオチド−担体複合体が細胞によって内部化されるように、標的細胞の表面の成分に結合する。一般に、担体は、細胞に特異的なリガンドと、例えば複合される、陽イオン部分とで構成される。細胞特異性リガンドは、細胞表面成分、例えばタンパク質、ポリペプチド、炭水化物、脂質またはそれらの組合せに結合する。代表的には、細胞表面受容体に結合する。陽イオン部分は、例えば静電気によって、ポリヌクレオチドに結合する。担体分子のリガンドは、細胞表面受容体を結合させる天然または合成のいかなるリガンドであることもできる。リガンドは、細胞表面の成分が認識するのに充分なだけ露出される官能基を有する、タンパク質、ポリペプチド、糖タンパク質、糖ペプチドまたは糖脂質であることができる。ウイルス、細胞（例えば哺乳動物、細菌、原生動物のそれ）のような生物の構成要素であることもできる。これに代えて、リガンドは、細胞表面成分を結合させる抗体、抗体フラグメント(例えばＦ（ａｂ'）２フラグメント)、またはそれらの類似体（例えば一本鎖抗体）を含むことができる[例えばChen et al．(1994)FEBS Letters 338:167-16 9；Ferkol et al．(1993)J．Clin．Invest．92:2394-2400；およびRojanasakul et al．(1994)Pharmaceutical Res．11(12):1731-1736を参照されたい]。そのような抗体は、標準的手順によって製造することができる。担体を形成する際に役立つリガンドは、標的としようとする特定の細胞に応じて変化すると思われる。肝細胞を標的とするには、ガラクトース末端炭水化物を有するタンパク質およびポリペプチド、例えば、天然の糖タンパク質から得られる炭水化物系統を用いることができる。例えば、末端ガラクトース残基を有するか、または（例えば、化学的もしくは酵素的脱シアリル化によって）末端ガラクトース残基を露出させるように酵素で処理できるかのいずれかの天然の糖タンパク質を用いることができる。一実施態様では、リガンドは、アシアロ糖タンパク質、例えばアシアロオロソムコイド、アシアロフェチュイン、または脱シアリル化された水疱性口内炎ウイルスである。これに代えて、肝細胞を標的とするのに適したリガンドは、ガラクトース末端炭水化物（例えばガラクトース、マンノース、乳糖、アラビノガラクタン等々）を、例えば還元的ラクトサミン化によって、ガラクトース非保有タンパク質またはポリペプチド（例えばポリカチオン）に化学的に結合することによって調製できる。露出した末端ガラクトース残基を有し、すべて肝細胞を標的とすることができる、他の非常に様々な合成糖タンパク質を形成する方法は、例えば、Chen e t al．(1994)Human Gene Therapy 5:429-435およびFerkol et al．(1993)FASEB 7:1081-1091(ＥＤＣを用いたポリカチオン性ヒストンおよびアルブミンのガラクトシル化)；Perales et al．(1994)PNAS 91:4086-4090およびMidoux et al．(1993)Nucleic Acids Research 21(4):871-878(α−Ｄ−ガラクトピラノシルフェニルイソチオシアネートと４−イソチオシアナトフェニルβ−Ｄ−ラクトシドとを用いたポリリシンのラクトシル化およびガラクトシル化)；Martinez- Fong（1994）Hepatology 20(6):1602-1608(シアノホウ水素化ナトリウムを用いたポリリシンのラクトシル化、およびＳＰＤＰを用いたアシアロフェチュイン− ポリリシン複合体の調製)；ならびにPlank et al．(1992)Bioconjugate Chem．3 :533-539（合成担体ペプチドとの４個の末端ガラクトース残基の還元的結合と、その後のＳＰＤＰを用いたポリリシンとの担体の結合）に記載されている。その他の細胞表面受容体をポリヌクレオチド−担体複合体の標的とするために、該複合体の担体成分は、その他の形式のリガンドを含むことができる。例えば、マンノースは、マクロファージ（リンパ腫）およびクッパー細胞を標的とするのに用いることができ、マンノース−６−リン酸の糖タンパク質は、繊維芽細胞（繊維肉腫）を標的とし、内因性因子−ビタミンＢ₁₂および胆汁酸［Kramer et al．(1992)J．Biol．Chem．267:18598-18604を参照されたい］は腸細胞を標的とし、インスリンは脂肪細胞および筋細胞を標的とし[例えばRosenkranz et al．( 1992)Experimental Cell Research 199:323-329およびHuckett et al．(1990)Ch emical Pharmacology 40(2):253-263を参照されたい]、トランスフェリンは平滑筋細胞を標的とし[例えばWagner et al．(1990)PNAS 87:3410-3414および米国特許第5,354,844号明細書（Beug et al.）を参照されたい]、アポリポプロテインＥは神経細胞を標的とし、肺表面活性因子、例えばプロテインＡは上皮細胞を標的とする［例えばRoss et al．(1995)Human Gene Therapy 6:31-40を参照されたい］のにそれぞれ用いることができる。担体分子の陽イオン部分は、負に荷電したポリヌクレオチドに電気的に結合できる、正に荷電したいかなる種であることもできる。担体に用いるのに好適な陽イオン部分は、ポリカチオン、例えばポリリシン(例えばポリ−Ｌ−リシン)、ポリアルギニン、ポリオルニチン、スペルミン、ヒストンのような塩基性タンパク質[Chen et al.、前掲]、アビジン、プロタミン[例えばWagner et al.、前掲を参照されたい]、改質アルブミン（すなわちＮ−アシル尿素アルブミン[例えばHu ckett et al.、前掲を参照されたい]）およびポリアミドアミンカスケード重合体［例えばHaensler et al．(1993)Bioconjugate Chem．4:372-379を参照されたい］である。好適なポリカチオンは、（例えば3,800〜60,000ダルトンの範囲の）ポリリシンである。一実施態様では、該担体は、約100〜120リシン残基の鎖長に相当する、約17,0 00ダルトンの分子量を有するポリリシン（26,000ダルトンのＭＷを有する臭化水素酸塩として購入）を含む。もう一つの実施態様では、該担体は、約15〜10リシン残基の鎖長に相当する、約2,600ダルトンの分子量を有するポリカチオン（4,0 00ダルトンのＭＷを有する臭化水素酸塩として購入）を含む。該担体は、当技術に周知の標準的な架橋結合試薬を用いて、陽イオン部分と細胞特異性リガンドとを結合させることによって形成することができる。結合は、代表的には共有結合である。好適な結合は、ペプチド結合である。これは、McKe eら(1994)Bioconjugate Chem．5:306-311、またはJung，G.ら(1981)Biochem．Bi ophys．Res．Commun．101:599-606、またはGrabarekら(1990)，Anal．Biochem． 185:131が記載したとおり、水溶性カルボジイミド、例えば塩酸１−エチル−３ −（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）で形成することができる。これに代る結合は、ジスルフィド結合であって、架橋結合試薬、例えばＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート(ＳＰＤＰ)、クロラムブシルのＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、Ｎ−スクシンイミジル−（４−ヨードアセチル）アミノベンゾアート(ＳＩＡＢ)、スルホＳＩＡＢ、およびスルホースクシンイミジル−４−マレイミドフェニルブチラート（スルホＳＭＰＢ）を用いて形成することができる。強い非共有結合、例えばアビジン −ビオチン相互作用も、陽イオン部分を様々な細胞結合剤に結合させて、適切な担体分子を形成するのに用いることができる。結合反応は、担体を形成するのに用いた特定の陽イオン部分および細胞結合剤について最適化することができる。陽イオン部分対細胞結合剤の最適比（重量比）は、経験的に決定できる。この比は、担体に用いようとする陽イオン部分（例えばポリカチオン）の大きさ、および複合させようとするポリヌクレオチドの大きさとともに変動することになる。しかし、一般的には、この比は、約0.2〜5.0 （陽イオン部分：リガンド）の範囲にわたる。結合しなかった成分および凝集体は、分子ふるいまたはイオン交換クロマトグラフィー（例えばAquapore（商品名、Rainin）による陽イオン交換）によって担体から分離することができる。本発明の一実施態様では、アシアロオロソムコイドおよびポリリシンの複合体で構成される担体を、架橋結合剤の１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３− エチルカルボジイミドで形成する。透析の後、分離用酸−尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ｐＨ４〜５）によって、複合体を未複合成分から分離する。複合体は、カルボキシメチル官能化カラム（1993年４月５日出願の米国特許願第08 /043,008号明細書を参照されたい。その教示は、引用によって本明細書に組み込まれる）で更に精製することができる。担体分子の形成に続いて、(ａ)標的細胞によるインターナリゼーション以前の細胞外でのポリヌクレオチドの有意な分離を防ぐのに充分なだけ、ポリヌクレオチドが（in vivo、ex vivoまたはin vitroのいずれでも）安定するように、(ｂ) ポリヌクレオチドが、適切な条件下で機能的な形態で細胞内に放出されるように、(ｃ)ポリヌクレオチドが損傷しないように、かつ(ｄ)担体が、細胞と結合できるその能力を保持するように、ポリヌクレオチド（例えばプラスミド）を担体に結合する。一般に、担体とポリヌクレオチドとの間の結合は、非共有結合である。適切な非共有結合は、例えば、静電結合、水素結合、疎水性結合、抗ポリヌクレオチド抗体の結合、挿入剤に仲介される結合、およびポリヌクレオチド含有ビオチニル化ヌクレオチドとのストレプトアビジンまたはアビジンの結合を包含する。しかし、例えば、化学的な架橋結合剤（例えば、「アンチセンスオリゴヌクレオチドの複合体、その治療上の用途」と題する、国際公開特許第WO-A-91/0475 3号明細書（Cetus Corp.）に記載されたような）を用いて、担体をポリヌクレオチドに直接（例えば共有結合で）結合することもできる。ポリヌクレオチド−担体複合体を形成するために、担体分子を含有する溶液を、複合させようとするポリヌクレオチドと結合させる。該溶液は、担体分子の凝集（すなわち電荷遮蔽剤の不在下で生じると思われる凝集）を阻害するのに充分な量の電荷遮蔽剤を含有する。一実施態様では、担体溶液は、上記のとおり（例えば、陽イオン部分と細胞結合剤との複合によって）担体分子を形成し、次いで、担体分子を、担体分子の凝集を阻害するのに充分な量の電荷遮蔽剤と混合することによって調製することができる。本明細書に用いられる限りで、用語「電荷遮蔽剤」は、(ａ)個々の陽イオン担体の間、および／もしくは同じ担体分子の異なる部分間の電荷相互作用（例えば水素結合）を軽減し；ならびに／または陽イオン担体分子と溶媒との間の電荷相互作用を軽減することができるいかなる作用因も包含するものとする。本明細書に用いられる限りで、用語「凝集を阻害する」は、陽イオン担体分子の凝集の脱凝集および／または防止を意味する。本明細書に用いられる限りで、用語「担体分子の凝集を阻害するのに充分な」は、ポリヌクレオチドと複合させたとき、担体分子が細胞に容易に取り込まれ、および／または生理学的障壁（例えば血液−組織障壁）を容易に通過できる脱凝集のレベルを意味する。一般的には、このレベルの分散性は、レーザー光散乱分析によって測定される限りで、担体分子が約20nmまたはそれ以下、好ましくは約 15nmまたはそれ以下、最も好ましくは約10nmまたはそれ以下の半径を有するときに達成される。(単独でか、またはポリヌクレオチドと複合させた)担体分子の凝集のレベルを決定するその他の方法は、例えば、ショ糖密度勾配分析、電子顕微鏡測定(ＥＭ)、円偏光二色性（ＣＤ）および分光光度測定（例えば260nmでの吸光度）を包含する。本発明の好適実施態様では、電荷遮蔽剤は塩である。適切な塩は、例えば、塩化ナトリウム(ＮａＣｌ)、硫酸ナトリウム(Ｎａ₂ＳＯ₄)、リン酸ナトリウム(ＮａＨ₂ＰＯ₄)、硫酸アンモニウム（(ＮＨ₄)ＳＯ₄、リン酸アンモニウム(ＮＨ₄Ｈ₂ ＰＯ₄)、硫酸カリウム(Ｋ₂ＳＯ₄)、リン酸カリウム(ＫＨ₂ＰＯ₄)、塩化カリウム (ＫＣｌ)、硫酸マグネシウム(ＭｇＳＯ₄)、リン酸マグネシウム(ＭｇＨＰＯ₄)、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ₂）および塩化リチウム(ＬｉＣｌ)、ならびに他の様々なものを包含する。特に好適な実施態様では、塩は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）である。担体分子を実質的に脱凝集させるのに用い得るその他の電荷遮蔽剤は、例えば、ポリオキシエチレン脂肪エーテルのＢＲＩＪ群、ＳＰＡＮというソルビタン脂肪酸エステル、およびＴＷＥＥＮというソルビタン脂肪酸エステルのポリオキシエチレン誘導体（すべてデラウエア州WilmingtonのICI Americas，Inc.より入手できる）のような洗剤や両親媒性界面活性剤を包含する。塩（例えばＮａＣｌ）を電荷遮蔽剤として用いるときは、担体分子の凝集を阻害するのに適切である塩の量は、担体分子の濃度に応じて変動することになる。しかし、この濃度は、一般的には、少なくとも約1.0Ｍまたはそれ以上である。例えば、担体分子を約0.5〜20mg／mlの濃度で含有する溶液に対しては、塩は、約1.0〜10Ｍの濃度で加えることができる。好適実施態様では、担体分子は、約3 .0〜7.0mg／ml、好ましくは約5.0〜6.0mg/ml、最も好ましくは約5.6mg／mlの濃度で担体溶液中に存在する。担体分子をこれらの濃度として、担体溶液は、それぞれ、約1.0〜5.0Ｍ、好ましくは約4.0〜5.0Ｍ、最も好ましくは約4.7Ｍの塩濃度で調製することができる。しかし、担体分子の凝集を阻害するのに適切である与えられたいかなる電荷遮蔽剤の量も、経験的に決定することができる。例えば、担体分子の試料を、前記のような様々な濃度の電荷遮蔽剤として調製することができ、そうして、担体分子の凝集のレベルを、上記に開示した手法（例えばレーザー光散乱分析、ショ糖密度勾配分析、電子顕微鏡測定(ＥＭ)、円偏光二色性（ＣＤ）および分光光度測定）のいずれかによって調べることができる。電荷遮蔽剤に加え、担体溶液は、担体分子の凝集を更に阻害するための、その他の分散剤を任意に含むこともできる。陽イオン担体分予の凝集は、主として、担体分子の正味の正電荷が関与する分子間および分子内会合（例えば水素結合）に起因すると考えられる。したがって、担体分子の正味の正電荷を減らす作用因は、これらの分子的会合を緩和し、陽イオン担体分子の分散性を促進することができる。上記により、本発明の一実施態様では、担体溶液は、電荷遮蔽剤に加えて、電荷中和剤を含む。本明細書に用いられる限りで、用語「電荷中和剤」は、陽イオン担体分子の正電荷の一部を（例えば脱プロトン化によって）中和できるいかなる作用因も包含する。本発明の好適実施態様では、電荷中和剤は、塩基である。適切な塩基は、例えば、水酸化ナトリウム(ＮａＯＨ)、水酸化カリウム(ＫＯＨ) 、水酸化アンモニウム(ＮＨ₄ＯＨ)、アルキルアミン、アルコキシドおよびトリエタノールアミンを包含する。特に好適な実施態様では、塩基は、水酸化ナトリウムである。陽イオン担体溶液は、担体分子の正電荷の一部を中和するのに充分な量の電荷中和剤を含有する。この部分的中和は、担体分子の電荷会合および凝集を緩和するが、担体分子に付随する全体的な正味正電荷は依然として維持する(その結果、負に荷電したポリヌクレオチドを静電的に結合させることができる)。本発明の一実施態様では、電荷中和剤は、担体分子の正電荷の約5〜20％（例えば約10 ％）を中和するのに充分な量として、担体溶液に加える。電荷中和剤は、電荷遮蔽剤の前後、またはそれと同時に担体溶液に加えてよい。塩基を電荷中和剤として用いるときは、担体溶液は、それぞれ、約0.5〜20mg ／ml、好ましくは約３〜７mg／ml、より好ましくは約５〜６mg／ml、最も好ましくは約5.6mg／mlの濃度で担体分子を含有する担体溶液に対して、約10〜1,000mM 、好ましくは約10〜100mM、より好ましくは約50〜70mM、最も好ましくは約59mM の塩基（例えばＮａＯＨ）の濃度で調製することができる。そうして、担体溶液を活発に混台して、分子的な担体凝集体の分散を促進することができる。複合させようとするポリヌクレオチドを、担体溶液と複合させ（かつ平衡に到達させ）て、実質的に分散した、可溶性であるポリヌクレオチド−体複合体を形成する。ポリヌクレオチドを担体溶液と複合させる結果、ポリヌクレオチド−担体溶液は、最終的濃度の電荷遮蔽剤と、任意には、ポリヌクレオチドを損傷しないか、またはその実質的ないかなる配座変化（例えば変性）も誘導しない電荷中和剤とを含有するため、実質的に機能的に、かつ担体分子と複合するのに適した形態に存続する。一般的には、これは、電荷遮蔽剤（例えば塩）の1.0Ｍ未満、好ましくは0.75Ｍ未満、最も好ましくは0.5Ｍ未満（例えば約0.15〜0.5Ｍ）の最終濃度、および電荷中和剤の10mM未満、好ましくは4.0mM未満、最も好ましくは約2.0mMの濃度に相当する。一実施態様では、担体溶液と併せる前(またはそれと同時に)、ポリヌクレオチドを、例えばnMレベルの純水で希釈して、担体溶液と併せたたときに、電荷遮蔽剤（例えば塩）および電荷中和剤（例えば塩基）の望みの最終濃度が得られる濃度にする。塩（例えばＮａＣｌ）を電荷遮蔽剤として含む担体溶液にポリヌクレオチドを加えるときは、ポリヌクレオチドは、1.0Ｍ未満、好ましくは0.75Ｍ未満、より好ましくは約0.15〜0.5Ｍ、最も好ましくは約0.3Ｍ（生理的濃度の約２倍）の最終塩濃度（すなわち担体溶液との混合後の）が得られる濃度まで希釈することができる。この塩濃度では、担体分子は、高レベルの分散性を維持し、ポリヌクレオチドは機能的に存続する。担体溶液が、電荷遮蔽剤とともに電荷中和剤（例えば塩基）を含有するならば、ポリヌクレオチドの添加後の担体溶液中の電荷中和剤の最終濃度は、ポリヌクレオチドの機能を実質的に損傷、変更または阻害しない濃度でもあるべきである。例えば、塩基を電荷中和剤として用いるときは、ポリヌクレオチド−担体溶液は、50mM未満、好ましくは10mM未満、より好ましくは4.0mM未満(例えば約1.0〜4 .0mM)、最も好ましくは約2.0mMの最終塩基濃度を有することができる。本発明の好適実施態様では、ポリヌクレオチド−担体複合体が形成される最終溶液は、(ａ)約3.0〜7.0mg／ml、好ましくは約5.0〜6.0mg／mlの担体分子濃度、 (ｂ)約0.15〜0.5Ｍ、好ましくは約0.3Ｍの塩濃度、(ｃ)約1.0〜4.0mM、好ましくは約2.0mMの塩基濃度、および（ｄ）ＤＮＡの適切な最終濃度（例えば10μg／ml ）を有する。ポリヌクレオチドは、溶液に可溶性で存続する安定的な複合体を形成するのに適した量で、担体溶液と併せる。一般的には、ポリヌクレオチドは、約１：0.2 〜１：20（例えば約１：１〜１：10、または約１：1.5〜１：５）の重量対重量（ｗ：ｗ）比（ポリヌクレオチド対担体）で担体溶液に加える。これらの重量比（ポリヌクレオチド対担体）で形成された複合体は、それぞれ、約10〜1,000％（例えば約50〜500％または約75〜250％）の対応する電荷中和比（すなわち、正に荷電した担体に対する負に荷電したポリヌクレオチドの中和百分比）を有する。与えられたポリヌクレオチド−担体複合体の性能は、複合体中のポリヌクレオチドの電荷中和のレベルによって影響され得る。与えられた複合体についてのポリヌクレオチドの電荷中和の最適レベルは、ポリヌクレオチド（例えばプラスミドＤＮＡ）の性質、および用いた特定の陽イオン担体分子の大きさや電荷を包含する様々な因子に依存する可能性がある。複合体についてのポリヌクレオチドの電荷中和の適切なレベルは、一般的には、上記に与えた範囲内にあるが、与えられた複合体についての最適レベルは、経験的に決定することができる。例えば、それぞれポリヌクレオチドの電荷中和の程度が変化する特定の複合体について、一連の調製品を製造することができる。次いで、これらの試料の性能を、例えば、各試料で得られる発現のレベルをin vitroまたはin vivoのいずれかの発現検定で測定することによって、試験することができる。複合体の凝集を更に緩和するばかりでなく、複合体の大きさを削減し、それらの均質性を増大させ、それによって、それらの性能（例えば遺伝子発現のレベル）を向上させる追加的段階を講じることもできる。そのような手段は、例えば、複合体の押出し、温度の変動、ｐＨの変化、およびin vivoで生じる阻害作用（例えば、血清中に存在する阻害因子による複合体のオプソニン作用）を緩和する手段を包含する。上記により、本発明のもう一つの実施態様では、ポリヌクレオチド−担体複合体を、形成した後であるが、(in vitroまたはin vivoで)細胞に投与する前に、適切なフィルター越しに押し出す。本明細書に用いられる限りで、用語「押出し」または「押し出す」は、濾過装置越しに複合体を通過させた後、濾過された生成物を捕集することを意味する。複合体の押出しは、有意に、(１)複合体の大きさを減少させ、(２)複合体の均質性を上昇させ、(３)遺伝子発現レベルによって測定した限りで、複合体の性能を向上させる。より大きい複合体を減少させ、より小さい、より均質な複合体の比率を増加させるいかなる押出し装置を用いることもできるが、複合体を押し出すのに好適な装置は、Emulsi-Flex-C5（Avestin ，Inc.，Ottawa、カナダ国）に取り付けた50nmフィルターである。本明細書に記載のとおりに形成したポリヌクレオチド−担体複合体の組成物は、一つまたはそれ以上のウイルスＰＲＥ配列に機能的に結合した、一つまたはそれ以上の近共通スプライス配列を有する無イントロン遺伝子を含む発現ベクター（例えばプラスミド）のためのin vitroまたはin vivoのいずれかでも細胞の標的化に用いることができる。本発明の発現ベクターのin vitro送達のためには、培養細胞を、該細胞によるエンドサイトーシスでの取り込みへと導く条件下で、ポリヌクレオチド−担体複合体とともに適切な培地で温置することができる。本発明の発現ベクターのin vivo送達のためには、ポリヌクレオチド−担体複合体を、製薬上許容され得る担体に組み込んで対象者に投与することができる。本明細書に用いられる限りで、用語「製薬上許容され得る担体」は、本発明のポリヌクレオチド−担体複合体をin vlvoでの投与に対して安定化させるための、例えば生理食塩水および緩衝水溶液、溶媒、分散媒、抗菌および抗真菌剤、等張剤や吸収遅緩剤などを包含する、生理学的に許容され得るいかなる担体も包含するものとする。製薬上の活性物質に対するそのような媒体および薬剤の使用は、当技術に周知である。慣用のいかなる媒体も本発明のポリヌクレオチド−担体複合体に不適格である場合を除き、治療組成物にそれらを用いることが構想される。すべての場合に、該製剤組成物は、無菌でなければならず、容易な注射可能性が存在する程度にまで流動的でなければならない。製造および貯蔵の条件下で安定的でなければならず、汚染作用、および細菌や真菌のような微生物に対して保全されなければならない。分解性酵素（例えばヌクレアーゼ）からのポリヌクレオチド−担体複合体の防護は、組成物に保護コーティングまたはヌクレアーゼ阻害剤を含ませることによって達成できる。微生物の作用の防護は、様々な抗菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成できる。本発明のポリヌクレオチド−担体複合体は、適切ないかなる投与経路によってもin vivoで投与してよい。適切な用量は、選ばれた投与経路に応じて変動してよい。該複合体は、好ましくは、上記に定義されたとおりの製薬上許容され得る担体を含む溶液として、静脈内に注射する。適切な緩衝液中での必要量のポリヌクレオチド−担体複合体を、必要に応じて、上記に列挙した成分の１種類または組合わせとともに組み込んだ後、濾過滅菌することによって、無菌注射液を調製することができる。その他の適切な投与経路は、脈管内、皮下（徐放性移植物を包含）、局所および経口のそれを包含する。適切な用量は、当技術で常套的に実施されるとおり、経験的に決定してよい。マウスには、マウスの20ｇあたり1.0mgまでのポリヌクレオチド、またはマウスの血液の1.4mlあたり約1.0mlの複合体という用量を投与することができる。下記の実施例によって、本発明を更に説明するが、それらを主題の発明を更に限定すると解してはならない。本出願の全体を通じて引用されたすべての参考文献および刊行された特許出願の内容は、参照により、ここに組み込まれる。実施例１:VIII因子ｃＤＮＡおよびＨＢＶＰＲＥ配列を含む発現プラスミドの調製 VIII因子のＢドメイン欠失ｃＤＮＡの翻訳終止コドンの下流に挿入された、ＨＢＶの転写後調節要素（ＰＲＥ）を有する発現ベクターを、下記のとおり調製した。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ゲノムの二つの頭−尾コピーを有するプラスミド pADW-HTDHBVから、587塩基対のstu-1制限フラグメント（SEQ ID NO:１）としてＰＲＥ配列を切り出した。次いで、pADW-HTDの第1,118〜1,704塩基に相当するこのフラグメントを、VIII因子Ｂドメイン欠失ｃＤＮＡとともに、pcDNA1という発現ベクター（InVitrogen，Inc.）にクローニングした。フラグメントは、VIII因子の終止コドンの３’、およびポリアデニル化シグナルの５’の位置で挿入した。得られたプラスミドpCDNAF8ΔK+PREの全部で9,354塩基対の配列を、SEQ ID NO :２として与える。VIII因子ｃＤＮＡ配列のコーディング領域は、SEQ ID NO:2の第2,965塩基から第7,377まで延伸している。587塩基対のＰＲＥフラグメントは、SEQ ID NO:２の第7,611塩基から第8,197まで延伸している。比較の目的で、同じ発現ベクターを、(ａ)終止コドンの３’位およびＰＲＥの５’位でＳＶ４０の介在配列と、ポリアデニル化シグナルとともに(pCDNAF8ΔK+ SV+PRE)；また（ｂ）ＰＲＥフラグメントなしであるが、ＳＶ４０ＩＶＳとともに（pCDNAF8ΔK-SV）構成した。これらの発現ベクターの地図を図７に示す。実施例２:VIII因子ｃＤＮＡおよびＨＢＶＰＲＥ配列を含むプラスミドのin vitr o発現ＨＢＶＰＲＥ配列およびＳＶ４０ＩＶＳの存在によって生じたVIII因子ｍＲＮＡの細胞質での蓄積と発現とに対する効果を調べるために、実施例１で調製したベクターのそれぞれを、O'Mahoneyら［(1994)DNA ＆ Cell Biol．13(12):1227 -1232］が記載したリン酸カルシウム沈降法を用いて、ＨｕＨ−７というヒトの癌腫細胞に2.5μg／mlの濃度で核酸移入した。VIII因子のＢドメイン欠失ｃＤＮＡを含む発現プラスミドpMT2LA8［Pitman et al．(1993)Blood 81(11):2925-293 5］も、細胞に核酸移入した。pMT2LA8の地図を図８に示す。細胞には、ヒト成長ホルモンをコードする2.5ng/mlの発現プラスミド（pCMVHG H）も同時核酸移入して、トランスフェクションレベルを正規化した。ｍＲＮＡレベルを測定するには、トランスフェクションの24時間後の細胞でノーザンブロット分析を実施した。VIII因子ｍＲＮＡのレベルは、標準的手法（すなわち、Sambrook et al.“Molecular Cloning”2nd ed.に記載のようなそれ）によって測定し、グリセルアルデヒドリン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）ＲＮＡに対して正規化した。図３に示したとおり、ＳＶ４０ＩＶＳ配列なしのＰＲＥ配列の存在は、ＰＲＥ配列を含まない発現プラスミドと比較して（図３の列１〜３を参照されたい）、正規化されたVIII因子ｍＲＮＡの量の２〜５倍を超える増加を生じた（列４を参照されたい）。 VIII因子の発現レベルを測定するために、タンパク質検定をトランスフェクションの48時間後に、定量的ＥＬＩＳＡ［Zatloukal et al．(1994)PNAS 91:5148- 5152］および活性検定（KabiCoATest Kabi Inc.、スウェーデン国より購入）によって実施した。ＨＧＨタンパク質レベルは、放射線免疫検定（ＲＩＡ）（Nich ol's Institute）によって測定した。結果を図４および５に示す。図４に示したとおり、発現されたVIII因子タンパク質の活性（KabiCoA Test）および量（ＥＬＩＳＡによって測定）はともに、ＨＢＶＰＲＥ配列を含むプラスミド（−ＳＶ＋ＰＲＥおよび＋ＳＶ＋ＰＲＥ）を核酸移入した細胞で最大であった。図５は、トランスフェクションが正規化された細胞（すなわち、ＨＧＨをコードするプラスミドを同時核酸移入し、ＲＩＡによって測定した細胞）でのVIII因子発現（ＥＬＩＳＡによって測定）の結果を示す。やはり、ＰＲＥ配列の存在（プラスミドpcF8ΔK+PRE）は、ＰＲＥ配列を含まないプラスミドと比較してVIII 因子発現の５倍までの増加を生じた。興味深いことに、最高レベルのVIII因子の発現は、pMT2LAから得られ、プラスミドpcF8ΔK+PREは、それより僅かに低かった。しかし、細胞内に存在するＲＮＡの量については、その逆が真であって、ノーザンブロット分析によって測定した限りで、pcF8ΔK+PREについて最高であり、pMT2LAについては、それより低かった(図３)。これは、pcF8ΔK+PREからのVIII因子転写物のすべてがタンパク質に翻訳されてはいないこと、および発現レベルを最適化するには、追加の遺伝的調節要素がプラスミドに、最も確からしくは５’領域に必要であって、それは、この領域が pMT2LAとpcF8ΔK+PREとで異なるからであることを示唆する。そのような追加の要素は、組織特異性エンハンサー、代替的なプロモーターおよびリーダー配列、またはＰＲＥ配列の追加のコピーを包含し得る。実施例３:VIII因子ｃＤＮＡおよびＨＢＶＰＲＥ配列を含む発現プラスミドの標的化されたin vivo発現 in vivo発現を調べるため、VIII因子Ｂドメイン欠失ｃＤＮＡと、pCEP4というベクター（InVitrogen Inc.）からの要素（例えばＥＢＮＡ−１およびＯｒｉＰ）とを含むプラスミド（pMT₂F8PREIVSpAGH-E/O）を調製した。ＰＲＥ配列は、転写されるが翻訳はされないよう、VIII因子終止コドンの３’およびヒト成長ホルモン遺伝子のポリアデニル化シグナルの５’に定置された。次いで、下記のとおり、プラスミドを肝臓に送達されるよう標的化した。Ｉ．pMT₂F8PREIVSpAGH-E/Oを含む標的化された複合体の形成ＡＳＯＲとポリ−Ｌ−リシンとの複合体を、McKeeら(1994)Bioconjugate Chem ．5:306-311が報告したのと類似するカルボジイミド結合によって調製した。略述すると、１：１：0.5の質量比でのＡＳＯＲ、26kDポリ−Ｌ−リシンおよびＥＤＣを次のように反応させた。ＥＤＣ（乾燥）をＡＳＯＲの攪拌水溶液に直接加えた。26kDのポリリシンを加え、反応混合物をpH5.5〜6.0に調整し、環境温度で２時間攪拌した。ＡＳＯＲの濃度は、最終反応条件下で５mg／mlであった。10mM の最終濃度までのＮａ₃ＰＯ₄（200mM、pH11）の添加によって、反応を急停止した。複合体を、初めに、50mMトリス、pH7.5で溶離するFast Flow QSepharoseという陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（Pharmacia）で精製し、次いで、超純水に対して透析した。約5.6mg／mlの濃度のＡＳＯＲ−ポリ−Ｌ−リシン複合体を、アリコートとして反応容器に採取し、ＮａＣｌの約4.7Ｍの最終濃度を得る量の５ＭのＮａＣｌを、またＮａＯＨの約59mMの最終濃度を得る量の１ＭのＮａＯＨを加えた。溶液を活発に混合した。 10mMトリス塩酸、１ｍＭＥＤＴＡ緩衝液中のVIII因子／ＰＲＥのプラスミドを、nMレベルの純水を加えることによって希釈し、次いで、担体溶液と併せて、30 0mMＮａＣｌおよび２mMＮａＯＨの最終濃度を達成した。複合体は、ＤＮＡの負電荷の50％を中和するのに充分な担体に対するＤＮＡの比で形成した。この比を決定するには、精製した透析複合体溶液のアリコートを凍結乾燥し、秤量し、特定の濃度（重量／体積）で超純水に溶解した。ポリリシンは、280nmで最小吸光度を有するため、280nmでの吸光係数を用いて、複合体のＡＳＯＲ成分（重量／体積）を算出した。複合体の組成は、ＵＶ吸光度によって決定した限りでの、ＡＳＯＲの濃度（重量／体積）との複合体の濃度（重量／体積）の比較によって推計した。二つの決定値の差を、複合体のポリリシン成分に帰した。次いで、決定された陽イオンの組成を用いて、電荷中和に必要な複合体対ＤＮＡの比（体積：体積）を算出した。上記のプロトコルに用いた材料および方法は、次のとおりである：プロタミン、ポリ−Ｌ−リシン（26kD；平均分子量）は、Sigma Chemical Co.，St．Louis ，MOから購入した。１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）は、Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WIから購入した。オロソムコイドは、Alpha Therapeutics，Los Angeles，CAから購入した。アシアロオロソムコイド（ＡＳＯＲ）は、0.1規定硫酸による76℃で１時間の加水分解によって、オロソムコイド（15mg／ml）から調製した。ＡＳＯＲは、1.0規定ＮａＯＨでのpH5.5までの中和、および室温での水に対する徹底的な透析によって、反応混合物から精製した。ＡＳＯＲの濃度は、280nmでの0.92ml・mg^-1・cm^- ¹ という吸光係数を用いて決定した。ＯＲの脱シアリル化を確認するには、Warre n（1959）J．Biol．Chem．234:1971-1975のチオバルビツール酸検定を用いた。上記の方法によって調製したＡＳＯＲは、98％脱シアリル化されていると決定された。 II．標的化したpMT₂F8PREIVSpAGH-E/Oを用いた発現検定 pMTF8PREIVSGHpAE/Oのプラスミド複合体1.0mlを、５匹のマウスに尾静脈を経由して注射した(総ＤＮＡ／マウス：10μg)。注射の１、４、７および10日後にマウスを犠牲に供し、肝臓を取り出し、ＥＬＩＳＡによってVIII因子について検定した。結果は、図６に示すが、有意なVIII因子の発現が10日目までに得られたことを立証している。治療効果には、血液１mlあたり５ngが必要とされるが、１、４、７および10日目に測定したVIII因子の平均レベルは、血液１mlあたり、それぞれ、82.4、72.3、47.5および50.2ngであった。等価のもの本発明は、その好適実施態様を参照して説明されているが、他の実施態様も、同じ結果を達成することができる。当業者は、常套的であることを超えない実験を用いて、本明細書に記載の特定の実施態様に対する無数の等価のものを認識するか、または確認できるものと思われる。そのような等価のものは、本発明の範囲内にあると考えられ、下記のクレームによって包含される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ビドリングマイアー，スコットアメリカ合衆国 06511 コネティカット, ニューヘイブン，パールストリート 23

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）遺伝子が細胞内で転写されるよう、プロモーター配列に機能的に結合された一つまたはそれ以上の近共通スプライス配列を有する無イントロン遺伝子と、（ｂ）該遺伝子とともに転写され、該細胞の核から細胞質への遺伝子転写物の輸出を生じる、ウイルスのシス作用性転写後調節要素の一つまたはそれ以上のコピーとを含むベクター。２．ウイルスのシス作用性転写後調節要素が、Ｂ型肝炎ウイルスに由来する請求項１記載のベクター。３．ウイルスのシス作用性転写後調節要素が、SEQ ID ＮＯ:１のヌクレオチド配列を含む請求項２記載のベクター。４．ウイルスのシス作用性転写後調節要素の二つまたはそれ以上のコピーを含む請求項３記載のベクター。５．遺伝子がｃＤＮＡである請求項１記載のベクター。６．遺伝子が、血液凝固因子をコードする請求項１記載のベクター。７．遺伝子が、VIII因子をコードする請求項６記載のベクター。８．遺伝子が、IX因子をコードする請求項６記載のベクター。９．核酸結合剤と、細胞表面の成分に結台するリガンドとの複合体に解放できるように結合した請求項１記載のベクターを含む分子複合体。 10．核酸結合剤がポリカチオンである請求項９記載の分子複合体。 11．ポリカチオンがポリリシンである請求項９記載の分子複合体。 12．リガンドが、末端炭水化物残基を含む請求項９記載の分子複合体。 13．リガンドが、アシアロ糖タンパク質受容体に結合する請求項９記載の分子複合体。 14．リガンドが、アシアロ糖タンパク質である請求項13記載の分予複合体。 15．リガンドが、ガラクトース、マンノース、乳糖、トランスフェリン、インスリン、抗体およびそのフラグメント、肺表面活性因子、胆汁酸、レクチン、ビタミンＢ₁₂、マンノース−６−リン酸、ウイルス成分、ならびにアポリポタンパク質よりなる群から選ばれる請求項９記載の分子複合体。 16．ウイルスのシス作用性転写後調節要素が、Ｂ型肝炎ウイルスに由来する請求項９記載の分子複合体。 17．ウイルスのシス作用性転写後調節要素が、SEQ ID ＮＯ:１のヌクレオチド配列を含む請求項16記載の分子複合体。 18．遺伝子がｃＤＮＡである請求項９記載の分子複合体。 19．遺伝子が、血液凝固因子をコードする請求項９記載の分子複合体。 20．血液凝固因子がVIII因子である請求項19記載の分子複合体。 21．血液凝固因子がIX因子である請求項19記載の分子複合体。 22．一ヶ所またはそれ以上の近共通スプライス部位を有する無イントロン遺伝子の発現を増大させる方法であって、ウイルスのシス作用性転写後調節要素の一つまたはそれ以上のコピーを、該転写後調節要素が、該遺伝子とともに遺伝子転写物として転写され、細胞の核から細胞質への該遺伝子転写物の輸出を生じるよう、該遺伝子に機能的に結合する段階を含む方法。 23．ウイルスのシス作用性転写後調節要素が、Ｂ型肝炎ウイルスに由来する請求項22記載の方法。 24．ウイルスのシス作用性転写後調節要素が、SEQ ID ＮＯ:１のヌクレオチド配列を含む請求項23記載の方法。 25．遺伝子がｃＤＮＡである請求項22記載の方法。 26．遺伝子が、血液凝固因子をコードする請求項22記載の方法。 27．血液凝固因子がVIII因子である請求項26記載の方法。 28．血液凝固因子がIX因子である請求項26記載の方法。