JPH06510278A - 分泌タンパク質をコードする遺伝子の標的への配達 - Google Patents

分泌タンパク質をコードする遺伝子の標的への配達

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JPH06510278A
JPH06510278A JP5500892A JP50089292A JPH06510278A JP H06510278 A JPH06510278 A JP H06510278A JP 5500892 A JP5500892 A JP 5500892A JP 50089292 A JP50089292 A JP 50089292A JP H06510278 A JPH06510278 A JP H06510278A
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ウー　ジョージ　ワイ．
ウィルソン　ジェームス　エム．
ウー　キャサリン　エイチ．
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ユニバーシティ オブ コネチカット
ザ　ボード　オブ　リージェンツ　オブ　ザ　ユニバーシティ　オブ　ミシガン
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ゛・　ンパ　コード　る遺−の　・への　゛政府援助 アメリカ合衆国政府からの研究助成金の援助を受けて、本発明に先立つ研究の一 部を行なった。
発明Ω背景 様々な種類の細胞において、多数の分泌タンパク質が研究されており、それらは 、全て同様の分泌経路をとる。タンパク質は、小胞体の細胞質側に位置するリポ ソーム上で行われる翻訳の過程で、細胞質内で合成される。次に、タンパク質は 、小胞体内−ゴルジ体へと運搬され、最終的に細胞から分泌される。
タンパク質の分泌は、シグナルペプチドによって指示される。シグナルペプチド は、通常、タンパク質のアミン末端に位置する。このペプチドは、タンパク質が リポソームから小胞体内へ移行する際に除去されるため、成熟した分泌タンパク 質では見られない。
ホルモンあるいは酵素などの分泌タンパク質は、様々な生物過程に関与している 。そのようなタンパク質の欠損や不十分な分泌の結果、著しい異常が発生するこ とがある。分泌タンパク質生産の欠陥を軽減、あるいは、矯正するための方法が 必要とされている。
介胛Ω概要 本発明は、ｉｎ　ｖｉｖｏ　（生体内）で、分泌タンパク質をコードする遺伝子 を特定の細胞に標的設定して、そのタンパク質をその標的細胞によって分泌させ るための、可溶性の分子複合体に関するものである。分子複合体は、望ましい分 泌タンパク質をコードする発現可能な遺伝子と、細胞特異的結合剤と遺伝子結合 剤の共役体と、の複合体から構成される。細胞特異的結合剤は、細胞表面の構造 、典型的にはレセプター、に特異的であり、その表面構造は、例えば肝細胞のア シアロ糖タンパク質レセプターのように、エンドサイト−シスによって、結合し たリガンドのインターナリゼーションを媒介する。細胞特異的結合剤は、天然、 あるいは、合成のリガンド（例えば、タンパク質、ポリペプチド、糖タンパク質 など）でもよい。あるいは、結合した複合体のインターナリゼーションを媒介す る細胞表面構造に特異的に結合するような、抗体、あるいは、抗体の類似体でも よい。共役体の遺伝子結合剤は、ポリカチオンのような化合物であり、これは、 細胞外の条件下では遺伝子と安定に複合体を形成し、細胞内の条件下では遺伝子 を放出して、細胞内で遺伝子が機能できるようにする。
遺伝子と担体との複合体は、生理的流体中に可溶性で、安定である。この複合体 はｉｎ　ｖｉｖｏ　（生体内）で投与され、表面構造を媒介したエンドサイト− シス経路を介して、標的細胞によって特異的に取り込まれる。トランスフェクト された細胞によって、取り込まれた遺伝子が発現されて、遺伝子にコードされて いる産物が生産され、分泌される。
本発明の分子複合体を用いて、ｉｎ　ｖｉｖｏ　（生体内）で細胞を特異的にト ランスフェクトして、望ましいタンパク質を合成、分泌させることができる。こ の選択的なトランスフェクションは、遺伝子治療や、分泌可能なタンパク質産物 生産のために選択的な遺伝的改変が必要とされるような、その他の適用において 、有用である。遺伝子治療では、正常遺伝子を特定の細胞へ標的設定して、分泌 タンパク質の関与する遺伝的あるいは後天的異常を、軽減あるいは矯正すること ができる。
そのような異常には、対応する内在遺伝子の欠陥によって引き起こされる血液凝 固異常が含まれる。
区皿Ｑ国単ケ説■ 図１に、それぞれ分泌タンパク質アルブミンをコードする遺伝子を含むプラスミ ドベクターｐａｌｂ３及びｐａｌｂ２の構造を示す。ｐａｌｂ３は、ラットアル ブミン・プロモーターとマウスアルブミン・エンハンサ−領域によって調節され るヒト血清アルブミンの構造遺伝子を含む。ｐａｌ、ｂ２は、コントロールベク ターであり、アルブミン遺伝子が高レベルで発現するために必要なマウスアルブ ミン・エンハンサ−領域を欠く。
図２に、本発明の方法により肝細胞へ標的設定されたプラスミドＤＮＡの存在と 量を示す、サザンプロットを示す。
図３に、肝細胞によってベクター由来の血清アルブミン遺伝子が転写されている ことを示す、肝臓ＲＮＡのドツトプロットを示す。
図４に、肝細胞中にベクター由来のヒト血清アルブミンｍＲＮＡが存在すること を確認する、リボヌクレアーゼ保護分析の結果を示す。
図５に、ラット血清中にヒト血清アルブミンが存在することを示す、ウェスタン プロットを示す。
図６に、ラット血清中のヒトアルブミンのレベルを、ｐａｌｂ’注射及び部分肝 切除後の時間の関数として示す。
発Ｕ詳顧広説肌 可溶性の標的設定可能な分子複合体を用いて、分泌タンパク質をコードする遺伝 子を、ｉｎ　ｖｉｖｏ　（生体内）で、標的細胞あるいは組織へ選択的に配達す る。分子複合体は、配達される遺伝子と、標的細胞に特異的な結合剤と遺伝子結 合剤から成る担体と、の複合体から構成される。複合体は、標的細胞によって選 択的に取り込まれ、遺伝子産物が発現され、分泌される。
遺伝子は、一般的にはＤＮＡの形で、望ましい分泌タンパク質（あるいは、糖タ ンパク質）をコードする。典型的には、遺伝子は、望ましいタンパク質を、標的 細胞によってプロセシング・分泌されるために適した形で、コードする。例えば 、遺伝子は、産物が細胞によって分泌されるための適切なシグナル配列をコード する。シグナル配列は、タンパク質の本来の配列であっても、外来の配列であ。
でもよい。構造遺伝子は、遺伝子産物が標的細胞によって発現されるために必要 な、適切な遺伝子制御因子に連結される。それらには、標的細胞内で機能可能な プロモーターと、任意にエンハンサ−エレメント、が含まれる。遺伝子は、遺伝 子の発現と遺伝子にコードされている産物の分泌に必要な遺伝子制御因子ととも に、プラスミドあるいは転移性遺伝因子などの発現ベクター内に含まれていても よい。
複合体の担体成分は、細胞特異的結合剤と遺伝子結合剤との共役体である。細胞 特異的結合剤は、例えばエンドサイト−シスのような過程によってインターナリ セーションを媒介する細胞表面構造に特異的に結合する。表面構造は、タンノく り質、ポリペプチド、炭水化物、脂質、あるいは、それらの組み合わせであって もよい。典型的には、リガンドのエンドサイト−シスを媒介する表面レセプター である。従って、結合剤は、レセプターに結合する天然あるいは合成のリガンド であってもよい。リガンドは、細胞表面構造によって認識されるために充分なよ うに官能基を露出したタンパク質、ポリペプチド、糖タンパク質、あるいは、糖 ペプチドであってもよい。また、例えばウィルス、細胞（例えば、哺乳類、細菌 、原生動物の）のような生物体の一部分、あるいは、リポソームのような人工の 担体であってもよい。
結合剤は、細胞表面構造に結合する抗体、あるいは、−重鎖抗体のような抗体の 類似体であってもよい。
担体を形成するために利用できるリガンドは、標的設定する特定の細胞によって 異なる。肝細胞を標的設定するためには、末端の炭水化物基を露出した糖タンパ ク質、例えば、アシアロ糖タンパク質（ガラクトース末端）、を用いることがで きる。しかし、ポリペプチドホルモンなどの、その他のリガンドを用いることも できる。アシアロ糖タンパク質の例としては、アシアロオロソムコイド、アシア ロフェチュイン、脱シアル酸化水はう注口内炎ウィルスが含まれる。このような リガンドは、末端にシアル酸残基、末端から２番目にガラクトース残基を有する 糖タンパク質を、化学的あるいは酵素的に脱シアル酸化することによって得られ る。あるいは、還元的ラクトサミネーションによって、ガラクトース末端の炭水 化物と、ガラクトースを持たないタンパク質とを連結して、アシアロ糖タンノ々 り質を形成することもできる。
その他のリガンドを用いて、分子複合体を、その他の細胞表面レセプターに標的 設定することができる。例えば、マクロファージ（リンノぐ腫）にはマンノース を、繊維芽細胞（繊維肉腫）にはマンノース−６−リン酸糖タンパク質を、腸細 胞には内因子−ビタミンＢ１２を、そして、脂肪細胞にはインスリンを、用いる ことができる。あるいは、細胞表面結合剤は、レセプター、あるいは、細胞表面 のリガンド（抗原）に結合する抗体のようなレセプター様分子であってもよい。
そのような抗体は、常法によって作成可能である。
遺伝子結合剤は、配達される遺伝子と複合体を形成する。遺伝子の複合体形成は 、標的細胞によってインターナリゼーションされる前に、細胞外で遺伝子が有意 に遊離することを防止するために、ｉｎ　ｖｉｖｏ　（生体内）で十分に安定で なければならない。しかし、複合体は、細胞内の適切な条件下では切断可能であ り、遺伝子が機能可能な形で放出される。例えば、複合体は、リソソームの酵素 に富んだ酸性の環境下では、不安定であってもよい。遺伝子結合剤と発現可能な 遺伝子との間の静電気的親和性に基づ（非共有結合によって、細胞外での安定性 と、細胞内条件での放出可能と、が達成される。
好ましい遺伝子結合剤は、負に帯電したポリヌクレオチドに結合するポリカチオ ンである。これらの正に帯電した物質は、非共有結合によって遺伝子と結合して 、細胞外では安定で、細胞内では放出可能な、可溶性の標的設定可能な分子複合 体を形成する。適切なポリカチオンはポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニ チン、並びに、ヒストン、アビジン、プロタミンなどのような塩基性タンパク質 である。好ましいポリカチオンは、ポリリジンである（例えば、３．８００から ６０，０００ダルトンの範囲）。発現可能な遺伝子を放出可能なように連結する ために利用可能な、その他の非共有結合には、水素結合、疎水結合、静電気的結 合を単独、あるいは、それらの結合と、ポリヌクレオチドに結合する抗ポリヌク レオチド抗体や、ビオチン化ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに結合するス トレプトアビジンあるいはアビジン、との組み合わせ、が含まれる。
細胞特異的結合剤と遺伝子結合剤とを化学的に結合することによって、担体を作 成する。その結合は、典型的には共有結合である。好ましい結合はペプチド結合 である。これは、Ｊｕｎｇ、　Ｇ、ら、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、 　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　１０１：５９９−６０６（１９８１）による記載 のように、水溶性カルバジイミドを用いて形成することができる。代替の結合は 、ジスルフィド結合である。
担体形成に用いられる特定の細胞特異的結合剤と遺伝子結合剤に応じて、結合反 応を最適化することができる。結合形成を最大にし、担体成分による凝集体形成 を最小にするために、反応条件を設定することができる。細胞特異的結合剤と遺 伝子結合剤との最適な比率は、経験的に決定される。ポリカチオンを使用した場 合、成分のモル比は、ポリカチオンの大きさと遺伝子の大きさによって変化する 。一般に（オ、この比は、１０１から１：１の範囲であり、好ましくは、５゜１ である。結合しなかった成分と凝集物は、分子ふるい、あるいは、イオン交換ク ロマトグラフィー（例えば、アクアポア１Ｍ陽イオン交換、ライナン）によって 、担体から分離される。
分泌性タンパク質をコードする遺伝子は、段階的な透析操作によって、担体と複 合体を形成する。ポリリジンのようなポリカチオンから成る担体で用いられる好 ましい方法では、透析操作は、２ＭＮａＣ１透析物から始まり、１５ＭＮａＣ＋ 溶液で終了する。ＮａＣ１濃度が徐々に減少する結果として、遺伝子が担体に結 合する。場合によっては、特に、遺伝子と担体の濃度が低い場合には、透析は不 要である。遺伝子と担体を単純に混合し、インキュベートする。
分子複合体は、同じ遺伝子を１コピ一以上、あるいは、一種又はそれ以上の種類 の遺伝子を含んでもよい。好適には、遺伝子と担体との比率は、約１：５から５ １であり、好ましくは、約１２である。
本発明の分子複合体は、非経口的に投与可能である。好ましくは、静脈注射され る。複合体は溶液として、生理的に受容可能な賦形剤とともに投与される。
遺伝子産物を一時的に発現し、分泌させることを目的として、細胞をｉｎ　ｖｉ ｖ。
（生体内）でトランスフェクトすることができる。発現と分泌を長期化させるた めに、遺伝子を繰り返し投与することができる。あるいは、外科的または薬理学 的手段によって、トランスフェクトされた細胞を刺激し、分裂させて、取り込ま れた遺伝子の発現を長期化することも可能である。例えば、１９９０年９月２５ 日こ出願された米国特許出願、出願番号第５８８，０１３号で開示されている事 項は、本発明でも参考として引用されている。
本発明の方法を、遺伝子治療に用いることもできる。分泌タンパク質をコードす る遺伝子を、珂工匹（生体内）で標的細胞へ選択的に配達することで、遺伝子に コードされている産物の発現と分泌がその細胞から行われる。例えば、正常遺伝 子を特定の細胞に標的設定することで、対応する遺伝子の遺伝的あるいは後天的 な欠陥によって引き起こされた代謝あるいは遺伝的異常を、矯正または軽減する ことができる。
本発明の分子複合体を用いて、広い範囲の遺伝子を特定の細胞あるいは組織へ配 達することができる。好ましくは、肝臓のアシアロ糖タンパク質レセプターシス テムを用いて、レセプターを媒介するエンドサイト−シスの過程によって則」盟 （生体内）で肝臓をトランスフェクトすることにより、肝臓へ複合体を標的設定 することができる。肝臓は、組織ゲノムあたりのタンパク質合成速度が最高であ る。従って、本発明の分子複合体を用いて、肝臓を特異的に標的設定し、治療用 分泌タンパク質を高効率で生産させて、肝臓の異常あるいはその他の組織の異常 を治療することができる。
遺伝的な血液凝固因子欠失の治療に、本発明の方法を使用することができる。
これには、凝固因子ｌｌ−Ｘ１ｌｌのうちの何れかが欠失した場合も含まれる。
因子ＶＳＶＩ　Ｉ、ＩＸ、Ｘ、あるいは、ＸＩは、通常、肝臓で合成される。因 子Ｖｌｌｌは、通常、内皮細胞と肝臓の実質細胞で合成される。好適な実施例で は、凝固因子をコードする遺伝子と、アシアロ糖タンパク質とポリカチオンの共 役体と、で複合体を形成する。結果として生成する可溶性の複合体を、前記欠失 で悩む患者の肝細胞を標的設定して、肝細胞をトランスフェクトするために充分 で、かつ、凝固活性が効果的に作用するような血中レベルを達成するために、因 子が充分に分泌されるために充分な量で、非経口的に投与する。
本発明を、下記の実施例で、さらに説明する。
実施例 例よ ポリーＬ−リジンと結合したアシアロオロソムコイドから成るアシアロ糖タンパ ク質−ポリカチオン共役体を用いて、肝細胞上に存在するアシアロ糖タンパク質 レセプターを介して肝細胞を特異的に標的設定することができる、可溶性のＤＮ Ａ複合体を作成した。ＤＮＡは、マウスアルブミン・エンハンサー−ラットアル ブミン・プロモーター・エレメントによって調節されるヒト血清アルブミンの構 造遺伝子を含む、プラスミドｐａｌｂ”から構成される。
分子複合体■作成 翳 遺伝的代謝異常の動物モデルとして、ナガセ無アルブミン血症ラットを選択した 。この系統は、血清アルブミンｍＲＮＡのスプライシングに欠陥を有し、その結 果、血中の血清アルブミンは、実質的に検出できないレベルである（Ｎａｇａｓ ｅ。
Ｓ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２０５：５９０−５９１（１９７９）　；　５ｈａｌ ａｂｙ、Ｆ、と５ｈａｆｒｉｔｚ、Ｄ、Ａ、、Ｐｒｏｃ、Ｎ≠狽戟B ＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（Ｊ４臥１；：２６５２−２６７５６（１９９０））　 、　２００−２５０　ｇの雄ナガセ無アルブミン血症ラットは、Ｊａｙａｎｔａ 　Ｒａｙ　Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ博士（アルバート・アインシュタイン医科大学、 ブロンクス、ニューヨーク）より提供された。これらを明暗サイクル下で飼育し 、自由摂食させた。
ヒト　アルブミン遺−゛　ベクター ｐａ　ｌ　ｂＨ３ＡＳｐａ　Ｉ　ｂ”、及び、ｐａｌｂ”の関連部分の構造を図 １に示す。
ＸＧＰＲＴ、キサンチン−グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ＭＬ Ｖ、モロニー・マウス白血病ウィルス；　Ｒ３ＡＰｒｏ、ラットアルブミン・プ ロモーター；Ｈ３ＡｃＤＮＡ、ヒト血清アルブミンｃＤＮＡ；黒丸、翻訳開始部 位：Ｘ、翻訳停止部位。
プラスミドｐａｌｂ”は、ラットアルブミン・プロモーターとマウスアルブミン ・エンハンサ−領域によって調節されるヒト血清アルブミンｃＤＮＡを発現する 、哺乳類発現ベクターである（図１）。方向性式にクローニングされた断片を用 いて、三部分連結反応を１回行ない、このベクターを構築した。断片Ａ　プラス ミドＭＴＥＶ、ＪＴのＸｂａｌからＢｇｌｌＩまでの断片（３，７ｋｂ）。この 断片の関連配列は、Ｐｆａｒｒ、　Ｄ、Ｓ、ら、　ＤＮＡ　４：４６１−４６７ （１９８８）に記載の前駆体由来であり、ウシ成長ホルモン遺伝子のポリアデニ ル化シグナルを含むゲノムＤＮＡの２３１ｂｐの断片と、ＰＵＣｌ　９由来のβ −ラクタマーゼ及び原核生物複製開始点と、キサンチン−グアニン・ホスホリボ シルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）を発現する真核生物の転写単位と、を含 む。断片Ｂ：マウスアルブミン遺伝子の５゛側（−１２から−９に、ｂ）に位置 するエンハンサ−を含む配列を、マウスゲノムライブラリーから単離された組換 えラムダファージのｐＢＲ３２２サブクローンより切り出した。Ｇｏｒｉｎ、　 Ｍ、Ｂ、ら、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５６：１９５４−１９５９（ １９８１）。エンハンサ−・エレメントをＥｃｏＲＶからＢｇｌｌｌの断片で切 り出し、合成リンカ−でＥｃｏＲＶ部位をＸｈｏ１部位へ変換した。断片Ｃを、 以前に記述されていないレトロウィルスベクターｐａ　Ｉ　ｂＨ３Ａより、Ｘｈ ｏｌからＮｈｅｌの断片（２４０５ｂｐ）として切り出した。この断片は、以下 の配列を含む。：ラットアルブミン遺伝子のヌクレオチド−４４３のＸｂａ１部 位（Ｘｈｏ１部位へ変換）から、ヌクレオチド＋４５のＢｓｔＥ１１部位までの ゲノムＤＮＡ　（ＵｒａｎＯｌＹ、ら、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６ １：３２４４−３２５１（１９８６））　；ヒト血清アルブミンのｃＤＮＡ配列 のヌクレオチド＋５０のＢｓ　ｔＥＩ　Ｉ部位から、ヌクレオチド＋１７８７の Ｈｉｎｄ１１１部位（ＢａｍＨＩ部位へ変換）まで（Ｕｒａｎｏ、　Ｙ、ら、同 上）；モロニー・マウス白血病ウィルスのヌクレオチド７６７４のＣｌａＩ部位 （ＢａｍＨ１部位へ変換）から、ヌクレオチド７８４６のＮｈｅ１部位までの３ °　フランキング配列（Ｖａｎ　Ｂｅｖｅｒｅｎ、　Ｃ，、Ｃｏｆｆ１ｎ、　Ｊ 、、　ａｎｄ　Ｈｕｇｈｅｓ、　Ｓ、著、　ＲＮＡ　Ｔｕｍｏｒ　Ｖｉ■ ｕｓｅｓ、Ｗｅｉｓｓ、　Ｒ，、Ｔｅ１ｃｈ、　Ｎ、、　Ｖａｒｍｕｓ、　Ｂ、 、　ａｎｄ　Ｃｏｆｆ１ｎ、　Ｊ、編集、コールド・スプリング・ハーバ−・ラ ボラトリ−、コールド・スプリング・ｔ　Ｓ　−／　＜−、ニューヨーク州、第 二板、ｐｐ、７６６−７８３　（１９８５））。
アルブミン・エンハンサ−を持たないコントロールベクターｐａｌｂ２を、上述 のように、三部分連結反応を１回行なって構築した（図１）。断片Ａ、プラスミ ドＭＴＥＶ、ＪＴのＸｂａｌからＫｐｎＩまでの断片（２８７６ｂｐ）、ＰＵＣ １９由来のβ−ラクタマーゼ遺伝子と原生生物の複製開始点と、ＸＧＰＲＴを発 現する真核生物の転写単位と、を含む。断片ＢニブラスミドＭＴＥＶ、ＪＴのＫ ｐｎＩから５ａｌｌまでの断片（７８０ｂｐ）で、ＸＧＰＲＴ転写単位の残りの 部分を含む。断片Ｃ：上述のｐａ　Ｉ　ｂＨ３ＡのＸｈｏｌからＮｈｅｌまでの 断片（２４０５ｂｐ）。アルブミン・プロモーターによって、高レベルの発現力 （行われるためには、エンハンサ−領域が必要であることから（Ｐｉｎｃｋｅｒ ｔ、　Ｃ沈ら、釦ｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏ　ｍｅｎｔ　ｌ：２６Ｂ−２７ ６（１９８７））　、Ｉ）　ａ　ｌ　ｂ　’プラスミドを、プラスミドＤＮＡの 非特異的な効果に対するコントロールとして用いた。
ベクターをＥ、ｃｏｌｉ中にクローニングし、前述のように精製した（Ｂｉｒｂ ｏｉｍ、Ｅ、ＣとＤｏｌｙ、　Ｊ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　 ７：１５１３−１５１８（１９７９））　、臭化エチジウムで染色したアガロー スゲル中の電気泳動によって、純度を確認した（Ｍａｎｉａｔｉｓ。
Ｔ、、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　Ｅ、Ｆ、、　ａｎｄ　５ａＩＩｌｂｒｏｏｋ、　Ｇ 、著、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂ盾窒≠狽盾窒凵@Ｍ ａｎｕａｌ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　Ｅ、Ｆ、　ａｎｄ　Ｉａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ 、１Ｍ集、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、コールド・スプリ ング・ハーバ−、ニューヨーク州、ｐｐ、　１５０−１６１　（１９８２））。
・　口　なりＮＡ プールしたヒト血清より調製したアジアロオロソムコイド（Ｗｕ、　Ｇ、Ｙ、と Ｗｕ、　Ｃ。
Ｂ、、Ｊ、　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ、２６３：１４６２１−１４６２４（１９８８ ）　；Ｔｈ１ｔｅｈｅａｄ、　Ｄ、ＬとＳａｍｍｏｎｓ、　g，Ｇ、。
Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、　Ａｃｔａ、　１２４：２０９−２１１（ １９６６））を、水溶性カルボジイミドを用いて、前述のように、ポリーＬ−リ ジン（シグマ・ケミカル社。セントルイス、ミズーリ州）、分子量３，８００に 結合させた（Ｊｕｎｇ、　Ｇ、ら、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ。
Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　１０１：５９９−６０６（１９８１））　。簡単に は、ポリーＬ−リジンの１５４倍モル過剰の１−エチル−３−（３−ジメチルア ミノプロピル）カルボジイミド（ピアース・ケミカル社、ロックフォード、イリ ノイ州）を用いて、アシアロオソソムコイドを、ｐＨ７，４で、７倍モル過剰の ポリーＬ−リジンと処理した。２４時間後に、共役体産物をゲル濾過クロマトグ ラフィーで精製し、前述のように、プラスミドＤＮＡを用いたゲル遅延分析によ って適定した（Ｗｕ、　Ｇ、Ｙ、とＷｕ、　Ｃ，Ｈ，。
Ｊ、　Ｂｉｏｌ　Ｃｔ＋ｅｍ、　２６２：４４２９−４４３２（１９８７）。共 役体とＤＮＡの最適な比率は、ｐａｌｂ３に関しては２．５：１、ｐａｌｂ”に 関しては２．０１と決定された。これ以降の全実験において、これらの比率を用 いた。注射に先立って、複合体ＤＮＡを、０４５μ膜（ミリポア社、ベッドフォ ード、マサチューセッツ州）を通して濾過した。
−の・　配 ２匹ずつのラットの群を、ケタミンーキシラジンで麻酔し、無菌生理食塩水中の ５００　ｕ　ｇ／ｍ　Ｉの複合体ｐａ　Ｉ　ｂ３ＤＮＡＳｐａ　Ｉ　ｂ’ＤＮＡ 、あるいは、生理食塩水のみを、尾静脈から静脈注射した。１５分後、ラットに ６６％の肝切除を施した（Ｗａｙｆｏｒｔｈ、　Ｈ，Ｂ、著、Ｅｘｐｅｒｉｍｅ ｎｔａｌ　ａｎｄ　Ｓｕｒｇｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　ｔｈ■ Ｒａｔ、アカデミツク・プレス、ニューヨーク州、（１９８０））。異なる間隔 おきに、血液を採取し、ラットを屠殺して、肝臓を切除し、ホモジナイズした。
フェノール−クロロホルム抽出によってＤＮＡを単離した（Ｂｌｉｎ、　Ｎ、と ５ｔａｆｆｏｒｄ、　Ｄ、Ｗ、　Ｎｕｃｌ、＾ａｉｄｓ　Ｒｅｓ、　３：２３０ ３−２３０８（１９７６））。
宿　されたＤＮＡの ヒト血清アルブミンＤＮＡ配列の量及び状態を、サザンプロット分析によって決 定した（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｅ、Ｍ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　９８： ５０３−５１７（１９７５））　、標的設定されたＤＮＡを注射後、２週間後に 肝臓ＤＮＡを単離した。全細胞ＤＮＡを単離し、ＢａｍＨＬ　Ｘｈｏｌ、あるい は、Ｎｒｕ　Ｉで処理した。５ａｐ−標識プローブを用いて、ハイブリッド形成 によってバンドを検出した。プローブは、１）プラスミドＭＴＥＶ、ＪＴ由来の β−ラクタマーゼ遺伝子を含むＥｃｏＲＩからＢａｍＨＩまでの２３０７ｂｐの 断片、あるいは、２）ヒト血清アルブミンｃＤＮＡ由来の３゛−領域（１０８３ ｂｌ）のＢｇｌＩＩからＢａｍＨＩまでの断片）、である。
図２に、標的設定したｐａ　１ｂ３ＤＮＡを注射し、続いて部分肝切除を行なっ たナガセ無アルブミン血症ラット由来の肝ＤＮＡのＤＮＡプロットの、典型的な オートラジオグラムを示す。トランスフェクトさ、れていないナガセラット肝由 来のＢａｍＨＩＤＮＡ　（１０μｇ）に、次のようにｐａｌｂ”プラスミドＤＮ Ａを追加した：レーン”０”はプラスミドを含まない：レーン“　ＩＣ”は１コ ピー含む（７，５ｐｇプラスミド）、レーゾＩＯＣ”は１０コピー含む（７５ｐ ｇプラスミド）、レーゾ　１００Ｃ”はプラスミド／二倍体ゲノムを１００コピ ー含む（７５０ｐｇプラスミド）。トランスフェクトされていないナガセラット 肝由来のＸｈｏｌ及びＮｒｕＩＤＮＡ　（１０ｔｔｇ）を、レージｏ”では単独 で、レーゾ５０Ｃ”では５０コピーのプラスミド／二倍体ゲノム存在下（３７５ ｐｇプラスミド）で、分析した。複合体ｐａ　Ｉ　ｂ”ＤＮＡを注射後２週間後 に採取した肝臓由来のＤＮＡを、レーン“ｐａｌｂ””で分析した。アルブミン ｃＤＮＡプローブを用いて、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで消化したＤＮＡプロット のハイブリッド形成を行なった：アルブミン不含プラスミドプローブＭＴＥＶ、 ＪＴ、つまり、β−ラクタマーゼ遺伝子を含むＥｃｏＲＩからＢａｍＨＩまでの ２３０７ｂｐの断片を用いて、Ｎｒｕ　Ｉ消化物のハイブリッド形成を行なった 。分子の大きさの標準を、右端にキロベースで示す。（ＮＣ＝ニックの入った環 状ＤＮＡ、Ｌ＝線状ＤＮＡ５ＳＣ＝スーパーコイルＤＮＡ）全細胞ＤＮＡをＢａ ｍＨＩで制限消化することにより、ｐａｌｂ３プラスミド由来のヒトアルブミン 遺伝子挿入配列が、２１００ｂｐの断片として遊離した。標準ｐａｌｂｓの添加 量の増加から予測されるとおりに、レーン”ＩＣ”、”ＩＯＣ”、”　１００Ｃ ″では、挿入配列の大きさである約２．ｌｋｂのバンドで、ハイブリッド形成が 比例的に増加していることが観察される（図２の左のゲル）。約９ｋｂに検出さ れる別のバンドは、ラット固有の配列に対する交差ハイブリッド形成のためであ ると考えられ（なぜならば、レーン”０”で示されるように、このバンドは、非 処理ラット由来のサンプル中にも存在するため）、このバンドを、各サンプル中 の細胞ＤＮＡ量の内部標準として用いた。非処理ラット由来のＤＮＡ中、レーン ”０”には、挿入配列に対応する大きさのバンドは検出されなかった。しかし、 ｐａｌｂ３で処理したラット、レーン”ｐａｌｂ’“では、挿入配列で期待され る位置に、強いシグナルが検出され、定量したところ、平均１０００コピー／二 倍体ゲノムのコピー数であることが判明した。アルブミンの挿入配列よりも大き いバンドは検出されず、アルブミン構造遺伝子の著しい転位がおこらなかったこ とが示された。
注射後及び部分肝切除後２週間後のｐａｌｂ３処理肝臓サンプル中の、プラスミ ドＤＮＡの分子的な状態を調べるために、全細胞ＤＮＡを、プラスミド中の切断 部位が一カ所であるＸｈｏＩで消化して、アルブミンｃＤＮＡプローブとハイブ リッド形成を行なった。ｐａｌｂ’処理肝臓ＤＮＡを消化することによって、線 状化プラスミドの大きさに対応するバンドが生じることを、図２の中央のゲルの レーゾｐａｌｂ３”に示す。ラット固有の配列へのハイブリッド形成が、１４ｋ ｂ以上の大きさのバンドの形で観察された。
プラスミドに対応する大きさのＤＮＡバンドが、確かにプラスミド由来であるこ とを確認するために、ｐａｌｂ３処理ラット由来の肝臓からの全細胞ＤＮＡを、 プラスミド中に制限部位を持たないＮ　ｒ　ｕ　Ｉで消化した。サンプルを、β −ラクタマーゼ遺伝子を有し、アルブミン配列を欠く、プラスミドＭＴＥＶ、Ｊ Ｔの断片で検索した。ここでは、ニックが入った環状型、及び、スーパーコイル 型のプラスミドに対応する２本の主要なバンドが観察された。線状プラスミドに 対応する小さなバンドも検出された。これらのデータから、この実験で肝臓に保 持されたＤＮＡの大部分は、組み込まれていない環状プラスミドＤＮＡとして存 在することが示された。しかし、ハイブリッドを形成する高分子量のＤＮＡが存 在することから、少数のプラスミドＤＮＡが、宿主ゲノムに組み込まれている可 能性を除去することはできない。エンハンサ−を欠（ｐａｌｂ’プラスミドで処 理したラットも、同様のパターンを示した。
ヒトアルブミンｍＲＮＡの　ＲＮＡド・・トブロ・・ト標的設定された複合体Ｄ ＮＡが転写されているかどうかを調べるために、注射後及び部分肝切除後２週間 後に、ヒト血清アルブミンｍＲＮＡの存在について、無アルブミン血症ラットの 肝臓をドツトプロットにより定量した。標的設定されたＤＮＡあるいはコントロ ールで処理し、部分肝切除後２週間目のナガセ無アルブミン血症ラット肝臓から 抽出されたＲＮＡで、典型的なドツトプロットを行なった。
肝臓より、全ＲＮＡをＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉらの方法により抽出した（Ｃｈｏ Ｅｚｙｎｓｋｉ、　Ｐ。
と５ａｃｃｉ、　Ｎ、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１６２：１５６−１５ ９（１９８７））　ａデオキシリボヌクレアーゼ・フリー・リボヌクレアーゼ処 理、あるいは、未処理のＲＮＡを、３０μｇから始めて連続的に（１：２）希釈 し、ニトロセルロース・フィルター上にアプライした。そして、ヒトアルブミン 配列に特異的な３１ｐ標識１９７−の合成ｃＤＮＡ（ヒトアルブミンｃＤＮＡの ６９５−７１５塩基対の領域に対応するアルブミン・メツセンジャー配列に相補 的である）で、ハイブリッド形成を行なった。Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、、　Ｆ ｒ１ｔｓｃｈ、　Ｅ、Ｆ、、　ａｎｄ　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、編集、コール ド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク州、ｐｐ７．３５−７．５５（１９８ ９）。列１、生理食塩水で処理した無アルブミン血症ラット；列２、標的設定可 能なｐａｌｂ２複合体で処理した無アルブミン血症ラット、列３、標的設定可能 なｐａｌｂ”複合体で処理した無アルブミン血症ラット：列４、ハイブリッド形 成前にサンプルをデオキシリボヌクレアーゼ・フリー・リボヌクレアーゼで消化 したこと以外は、列３と同一：列５、正常スプレージ・ドーレー系ラット由来の ＲＮＡ、ＮＡＲ，ナガセ無アルブミン血症ラッ図３に示すように、生理食塩水の みを与えられたラット肝臓由来のＲＮＡ、最上列、及び、エンハンサ−を欠（対 照プラスミドであるｐａｌｂ”を与えられたラット、第２列、は、ヒトアルブミ ンに特異的なｃＤＮＡプローブとハイブリッドを形成しなかった。しかし、第３ 列では、ｐａｌｂ３を与えられたラット由来のＲＮＡが、確かに、強いシグナル を発生することが示された。第４列（列３のサンプルを、ハイブリッド形成前に 、デオキシリボヌクレアーゼ・フリー・リボヌクレアーゼで消化した）では、先 に列３で観察されたハイブリッド形成が、デオキシリボヌクレアーゼ・フリー・ リボヌクレアーゼによって完全に消滅しており、シグナルが確かにＲＮＡの存在 によるものである、という結論が支持された。最後の列では、未処理の正常なス プレージ・ドーレー系ラットの肝臓由来のＲＮＡは、プローブとハイブリッドを 形成しないことが示され、列３で検出されたシグナルが、ラット固有の配列に対 するハイブリッド形成によるものではないことが示された。
ヒトアルブミンｍ、　ＲＮ　Ａの逝：リポヌクレアーだ保護分析ベクター特異的 Ｒ，Ｎ　Ａプローブを用いたりボヌクレアーゼ保護分析と、それに続く部分肝切 除によって、肝組織中にベクター由来のヒト血清アルブミンｍＲＮＡが存在する ことが、さらに証明された。
肝臓よりＲＮＡを抽出し、ベクター特異的プローブを用いて、リボヌクレアーゼ 保護分析によって分析した（Ｍｅｌｔｏｎ、　Ｄ沈ら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ １ｄｓ　Ｒｅｓ、１２ニア０３５−７０５６（１９８４））。組換えヒトアルブ ミン転写物の３゛非転写領域に存在するモロニー・レトロウィルス由来配列を、 ｐＧＥＭ−３２（ｆ＋）のＢａｍＨ１部位とｘｂａ１部位との間にクローニング して、先の記載とおりに、この配列に相補的なＲＮＡプローブである３Ｚ−ｅｎ ｖを、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで合成し、３ｆｆｐで標識したｔＪｉｌｓｏｎ、Ｊ、Ｍ 、ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、８７：８４３７−８４４１（１ ９９０））。
ベクター由来配列を含む転写物を発現するように、前もってトランスフェクトさ れたＮＩＨ３Ｔ３細胞株からのＲＮＡと、トランスフェクトされていないＮＩＨ ３Ｔ３細胞からのＲＮＡを、それぞれポジティブ、及び、ネガティブ・コントロ ールとして使用した。肝組織より、全ＲＮＡを前述のように抽出し、Ｍｅｌｔｏ ｎらの方法に従って、リボヌクレアーゼ保護分析によって、各１００μｇを分析 した（前述）。レーン”３Ｔ３″は、ベクター由来配列を含む転写物を発現する ＮＩＨ３Ｔ３細胞からのＲＮＡ　（２００ｎ　ｇ）を含む。リボヌクレアーゼＡ に耐性な１７２ｂｐの断片が、矢印で示す期待通りの位置に検出された。レーン “ｐａｌｂ２”は、ｐａｌｂ２をトランスフェクトした２週間後に採取した無ア ルブミン血症ラットの肝臓由来のＲＮＡ　（１００ａｇ）を含む、レーダｐａｌ ｂ’−は、ｐａｌｂ”をトランスフェクトした２週間後に採取した無アルブミン 血症ラットの肝臓由来のＲＮＡ（１００μｇ）を含む。最も右側のレーンに、分 子量マーカーを示す。
プローブが、ベクター配列を含む転写物を発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞からのＲＮ Ａ（ポジティブ・コントロール）とハイブリッドを形成したことによって、図４ のレーン”３Ｔ３”に示されるように、リボヌクレアーゼＡ消化耐性の、１７２ ｂｐ　（矢印）の期待通りの大きさのバンドが生じた。無アルブミン血症う・ン トにｐａ　ｌ　ｂ’ＤＮＡ複合体をトランスフェクトして、部分肝切除を行って から２週間後に採取した肝臓のＲＮＡの分析からも、期待通りの大きさく１７２ ｂｐ）の保護されたバンドが検出された。より大きいバンドも存在したが、これ は、おそらく、リボヌクレアーゼによるハイブリッドの消化力坏完全であったた めである。
しかし、等モル量のｐａ　ｌ　ｂ２ＤＮＡ複合体を用いてトランスフェクトし、 部分肝切除を行ってから２週間後に採取した無アルブミン血症ラット肝臓では、 図４のレーン“ｐａｌｂ２”に示すように、同じ条件においても保護配列が検出 されなかった。同様に、トランスフェクトされていないＮＩＨ３Ｔ３細胞のＲＮ Ａや、トランスフェクトされていない無アルブミン血症ラットのＲＮＡでは、保 護配列が形成されなかった。このことから、ｐａ　Ｉ　ｂ”ＤＮＡのトランスフ ェクト後に検出された１７２ｂｐのバンドは、ベクター由来ではない固有のＲＮ Ａ配列に対する非特異的なハイブリッド形成によるものではない、ことが示され た。ラット固有のアルブミンと組換えヒトアルブミンのプローブを用いて、ＲＮ Ａに対してリボヌクレアーゼ保護分析を行なうことによって、トランスフェクト された無アルブミン血症のラット肝臓内のヒトアルブミンｍＲＮＡレベルは、正 常ラットのラットアルブミンｍＲＮＡレベルの、０．０１％から０．　１％であ ることが示された（データ未公開）。
血史旦上血清１匹グ主２９分析 アフィニティー精製ウサギ由来抗ヒトアルブミン抗体を用いたウェスタンプロッ トによって、ヒト血清アルブミンの同定と定量を行なった（Ｂｕｒｎｅｔｔｅ、 　Ｗ、　Ｎ、　。
Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１１２：１５−２０３（１９８１））　、標的 設定されたｐａｌｂ３で無アルブミン血症ラットを処理して、部分肝切除を行っ てから２週間後に採取したラット血清の代表的なウェスタンプロットを、図５に 示す。血清あるいは標準アルブミンを、ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動にア プライして、ニトロセルロースに移し、特異的なウサギ由来抗ヒトアルブミン抗 体で処理した。続いて、ゲルを、アルカリ・ホスファターゼ共役ヤギ由来抗ウサ ギ１ｇＧとともにインキュベートして、ＢＣＩＰ、／ＮＥＴにさらして発色させ た。
詳細には、ヒト血清アルブミン１０μｇ１ラット血清アルブミン１０μｇ１正常 ラット由来、未処理無アルブミン血症ラット由来、処理済み無アルブミン血症ラ ット由来の血清釜４μｍを、１０％５ＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲル上にアプ ライしくＬａｅｍｍｌｉ、　Ｕ、に、　Ｎａｔｕｒｅ　２２７：６８０−６８５ （１９７０））、１５０Ｖで４．５時間泳動を行なった。ヒト血清アルブミン、 ２０μｇをレーン１に示す：標準ラット血清アルブミン、２０μｇ、レーン２： ヒトアルブミン、２０μｇ１未処理無アルブミン血症ラット血清４μｌ中、レー ン３．未処理無アルブミン血症ラット由来血清４μＩ、レーン４：正常スプレー ジ・ドーレー・ラット由来血清４μｌル−ン５　：　ｐａ　Ｉ　ｂ”ＤＮＡ複合 体で処理した無アルブミン血症ラット由来血清４μｍ、レーン６、生理食塩水の みで処理した無アルブミン血症ラット由来血清４μｍ、レーン７　；　ｐａ　Ｉ 　ｂ’ＤＮＡ複合体で処理した無アルブミン血症ラット由来血清４μｍ、レーン ８゜ トランス・プロット・セル（バイオラッド）を用いて、ゲルを電気泳動的にニト ロセルロース上に移し、プロット−（ＰＢＳに溶解した１０％脱脂粉乳）でクエ ンチングして、抗ヒトアルブミン抗体で処理し、続いて、アルカリ・ホスファタ ーゼ共役抗ウサギＩｇＧとともにインキュベートした。続いてフィルターを洗浄 し、ＢＣＩＰ／ＮＥＴで発色させた（カークガード・アンド・ぺり−・ラボ社） 。
図５のレーン１−５は、抗ヒト血清アルブミン抗体のヒトアルブミンに対する特 異性を示している。標準ヒトアルブミンのプロット上ではシングル・バンドが検 出されたが、等量の標準ラット血清アルブミンでは、染色は検出されなかった、 レーン２゜アルブミンは様々な血清成分と結合することが知られている。ラット 血清成分との結合によって、ヒトアルブミンの電気泳動的な移動度が変化するか どうかを調べるために、標準ヒトアルブミンを、未処理無アルブミン血症ラット 由来の血清と混和した。レーン３のように、ヒトアルブミンの移動位置が変化し ていないことから、これには著しい効果がないことが示された。約１３０ｋＤａ のバンドは、アルブミンニ量体の存在によるものと考えられる。
正常ラット血清、レーン４：あるいは、未処理無アルブミン血症ラット血清、レ ーン５、に対する反応がないことから、抗アルブミン抗体の特異性がさらに確認 された。しかし、ｐａ、ｌ　ｂ３ＤＮＡ複合体を受け取った無アルブミン血症ラ ットでは、アルブミンの大きさに対応するバンドが検出された。注射後２週間後 の血中ヒト血清アルブミンの量は、およそ３０μｇ／ｍｌであると定量された、 レーン６゜生理食塩水のみを受け取ったコントロール動物、レーン７、あるいは 、エンハンサ−を欠（ｐａｌｂ”、レーン８、では、同じ条件下においても、検 出可能なヒトアルブミンは生産されなかった。
血中へのヒトアルブミンの出現のタイムコースを図６に示す。ラットをｐａｌｂ ３ＤＮＡ複合体で処理して、続いて部分肝切除を行なった。一定の間隔おきに血 清を採取し、血中のヒト血清アルブミンのレベルを、図４について説明したとお りにウェスタンプロットで決定した。レーン１−３は、標準ヒトアルブミン、０ ゜１．１．０．１０μｇを含む。レーン４−１１は、それぞれ注射後２４時間、 ４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間後の血清４μ ｍを含む。血清サンプルあるいは標準ヒトアルブミンを、ポリアクリルアミド・ ゲル電気泳動上にアプライし、ニトロセルロースに移して、特異的なウサギ由来 抗ヒトアルブミン抗体で処理した。フィルターを洗浄し、その後、アルカリ・ホ スファターゼ共役ヤギ由来抗ウサギＩｇＧとともにインキュベートし、ＢＣＩＰ ／ＮＥＴにさらして発色させた。
ｐａ　Ｉ　ｂ’ＤＮＡ複合体で処理した代表的な無アルブミン血症ラット由来の 血清、レーン４、には、２４時間後の時点では、検出可能な血中アルブミンは含 まれていなかった。しかし、４８時間後には、ｐａ　ｌ　ｂＸＤＮＡ処理無アル ブミン血症ラット由来の血清中で、およそ０．０５μｇ／ｍｌのレベルでヒトア ルブミンが検出された。ヒトアルブミンのレベルは時間と共に上昇し、２週間目 、レーン８、には、３４μｇ／ｍ」のプラトーに達した。そして、注射後４週間 にわたって、有意に変化することなしに、このレベルを保持した、レーン１１゜ トランスフェクション後、少なくとも４週間は、ＥＬＩＺＡ法によって抗ヒトア ルブミン抗体は検出されなかった（データ未公開）。
鑓又 ポリーＬ−リジンと結合したアシアロオロソムコイドから構成されるアシアロ糖 タンパク質−ポリカチオン共役体を用いて、肝細胞表面に存在するアシアロ糖タ ンパク質レセプターを介して肝細胞を特異的に標的設定することができる、可溶 性のＤＮＡ複合体を作成した。ＤＮＡは、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原の遺伝子を 含むプラスミドから構成される。
Ｂ　：ウイルス　２、　コード　る遺−゛　ベクターＴ、　Ｊａｋｅ　Ｌｉａｎ ｇ博士（マサチューセッツ・ジェネラル病院、ボストン、マサチューセッツ州） より、プラスミドｐＳＶＨＢＶｓを入手した。このプラスミド（約３．６ｋｂｐ ）は、ｐＵＣ誘導体であり、ＳＶ４０の複製開始点と、ＳＶ４０プロモーターで 調節されるＢ型肝炎ウィルス表面抗原の読み枠を（１９８４ｂｐの挿入配列の一 部分として）含む。プラスミドを上述の通りにクローニングして、精製した。
・　口　なりＮＡ− アシアロオロソムコイド（ＡＳＯＲ）を上述のように調製した。Ｎ−サクシニミ ジル３−（２−ピリジルジチオ）プロパネート（ＳＰＤＰ）を用いて、ジスルフ ィド結合を介して、ＡＳＯＲとポリーＬ−リジン（シグマ・ケミカル社、セント ・ルイス、ミズーリ州）、Ｍｒ＝５９．０００を（モル比７：１）結合させ、標 識共役体を作成した。また、１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル ）カルボジイミド（ピアース・ケミカル社、ロックフォード、イリノイ州）を用 いて、ｐＨ７，４で、ＡＳＯＲとポリーＬ−リジン、Ｍｒ＝４１．Ｚｏｏ　（モ ル比１・１）を結合させた。
高圧液体クロマトグラフィー・システム（ライナン）用いたカチオン交換クロマ トグラフィーで、アクアポアｃ−ａｏｏカラム（ライナン）と、０．１Ｍ酢酸ナ トリウムｐＨ５，，０，２，５，２，２５，２，０の段階的溶出法を用いて、共 役体を精製した。２３０ｎｍのＵ、　Ｖ　吸収で検出されるカラムから溶出する 第二のピークが、最適な共役体であると決定された（Ｊｕｎｇ、　Ｇ、ら、駐釜 匣１」四節ｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　１０１：５９９−６０６（１９８ １））。
ゲル遅延分析法を用いて、可溶性の複合体を形成するだめの共役体とＤＮＡの最 適な混和比率を、上述のように決定した。等量のＤＮＡを含む、１５ＭＮａＣ１ 中のサンプルを１．１５ＭＮａＣ１中の様々な量の共役体と混和して、ゲル中の ＤＮＡの移動を完全に遅延させるような共役体とＤＮＡの比率を決定した。ＤＮ Ａの５０−７５％に結合するために必要な共役体の量を算出し、分子複合体の作 成に使用した（複合体の可溶性を確実にするため）。可溶性の分子複合体を作成 するために、一定の速度で攪拌しながら、共役体溶液を、ＤＮＡ溶液中へ、螺動 ポンプを用いて、Ｏ，１ｍｌ／分の速度で非常にゆっくりと添加した。一部を採 取して、Ａ２６０ｎｍを測定し、ＤＮＡ量をモニターした。さらに、別個に一部 を採取し、アガロースゲル上で泳動して、複合体の形成を確認した。複合体を含 む溶液を、０．４５μ膜フイルターを通して濾過し、生理食塩水で洗浄した。
一部を採取して、上述のように試験を行なった。
１５１１弗顆■化ｑ記曙 １５０ｇの雌ラット（スプレージ・ドーレー系）各２匹のグループを、ヘタミン ・キシラジンで麻酔し、非常にゆっ（りと尾静脈から静脈注射を行なった。一方 の群のラットに、５ＰＤＰを用いてポリーＬ−リジン、Ｍｒ＝５９，０００で調 製した共役体と、ＤＮＡ５ｍｇと、の複合体を投与した。もう一方のラットの群 には、カルボジイミド結合を用いてポリーＬ−リジン、Ｍｒ＝４１．１００で調 製した共役体と、ＤＮＡ１．４ｍｇと、の複合体を投与した。２４時間おきに、 ラットより採血して、血清を調製し、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原の分析を行なっ た。（アウスザイム・モノクローナル、ＨＢＶ検出用ＥＩＡキット、アボット） 血清２００μｌを用いて、結果として生じる溶液の色の変化を、Ａ４９２″ｍで 測定した。結果を表１に示す。
血清２００μｌに関する結果をＡ４９２″ｍにおける光学濃度単位として示す。
時間（日） ラツト １．０１２　。０２４　．２６１　．３３　．２３２　．０１１　．０４８　． １３７　．２Ｂ　、２５　．２２　．１０　．０９　．１７５　．３３　．１５ ３．０１６　．２６　．２２　．０８ ４．０１８　．２２　．２４　．１６ ＳＰＤＰ結合によって調製された共役体とＤ　Ｎ　Ａ　５　ｍ　ｇより構成され る可溶性の分子複合体を受け取ったラット（ラット＃１と＃２）で検出されたＨ ＢＶ表面抗原の発現は、少なくとも４日間持続し、−貫して上昇し続けて１，３ ３の最大値に達した。カルボジイミド結合によって調製された共役体とＤＮＡ１ ．４ｍｇより構成される可溶性の分子複合体を受け取ったラット（ラット＃３と ＃４）で検出された発現も、少なくとも３日間持続し、−貫して上昇し続けて、 約、２５の最大値に達した。
変更例 当業者には、通常の実験方法を用いて、ここに記載された特定の操作についての 多数の変更例を実施することができることが、理解できるであろう。そのような 変更例も、本発明の要旨に含まれ、以下のクレームによって網羅される。
Ｘｈｏｌ　８ｓ＋ＥＩＩ　ａａｍ＋ＩＮｈｅｌＦＩＧ、３ ｋｄ 補正書の写しく翻訳文）提８書（特許法第１８４条の８）平成５年１２月６日

Claims (48)

    【特許請求の範囲】
  1. １．分泌タンパク質をコードする遺伝子を、特定の細胞に標的設定するための可 溶性の分子複合体であって、別記複合体が、分泌タンパク質をコードする発現可 能な遺伝子と、細胞特異的結合剤と遺伝子結合剤から構成される担体と、の複合 体から構成され、前記遺伝子結合剤が、細胞外の条件下では遺伝子と複合体を形 成し、細胞内の条件下では発現可能な分子として遺伝子を放出する、ことを特徴 とする可溶性の分子複合体。
  2. ２．前記発現可能な遺伝子がＤＮＡである、ことを特徴とする請求項１記載の可 溶性の分子複合体。
  3. ３．前記発現可能な遺伝子がアルブミンをコードする、ことを特徴とする請求項 １記載の可溶性の分子複合体。
  4. ４．前記発現可能な遺伝子が血液凝固因子をコードする、ことを特徴とする請求 項１記載の可溶性の分子複合体。
  5. ５．前記血液凝固因子が、因子Ｖ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩから構成 される群より選択される、ことを特徴とする請求項４記載の可溶性の分子複合体 。
  6. ６．前記遺伝子結合剤がポリカチオンである、ことを特徴とする請求項１記載の 可溶性の分子複合体。
  7. ７．前記ポリカチオンがポリリジンである、ことを特徴とする請求項６記載の可 溶性の分子複合体。
  8. ８．前記細胞特異的結合剤が細胞表面のレセプターに結合し、前記表面レセプタ ーがエンドサイトーシスを媒介する、ことを特徴とする請求項１記載の可溶性の 分子複合体。
  9. ９．前記細胞特異的結合剤が、アシアロ糖タンパク質レセプターのリガンドであ る、ことを特徴とする請求項８記載の可溶性の分子複合体。
  10. １０．前記リガンドがアシアロ糖タンパク質であり、前記標的細胞が肝細胞であ る、ことを特徴とする請求項９記載の可溶性の分子複合体。
  11. １１．前記発現可能な遺伝子が、非共有結合によって遺伝子結合剤と複合体を形 成する、ことを特徴とする請求項１記載の可溶性の分子複合体。
  12. １２．前記細胞特異的結合剤が、共有結合によって遺伝子結合剤と結合する、こ とを特徴とする請求項１記載の可溶性の分子複合体。
  13. １３．前記発現可能な遺伝子が、細胞内の条件下で、前記遺伝子が機能可能な形 で放出されるように、遺伝子結合剤と複合体を形成する、ことを特徴とする請求 項１記載の可溶性の分子複合体。
  14. １４．請求項１記載の分子複合体の溶液と、生理的に受容可能な賦形剤と、から 構成される、ことを特徴する薬剤組成物。
  15. １５．分泌タンパク質をコードする遺伝子を、肝細胞へ標的設定するための可溶 性の分子複合体であって、前記複合体が、分泌タンパク質をコードする発現可能 な遺伝子と、アシアロ糖タンパク質レセプターのリガンドとポリカチオンから構 成される担体と、の複合体から構成され、前記ポリカチオンが、細胞外の条件下 では遺伝子と複合体を形成し、細胞内の条件下では発現可能な分子として遺伝子 を放出する、ことを特徴とする可溶性の分子複合体。
  16. １６．前記発現可能な遺伝子がアルブミンをコードする、ことを特徴とする請求 項１５記載の可溶性の分子複合体。
  17. １７．前記発現可能な遺伝子が血液凝固因子をコードする、ことを特徴とする請 求項１５記載の可溶性の分子複合体。
  18. １８．前記血液凝固因子が、因子Ｖ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩから構 成される群より選択される、ことを特徴とする請求項１７記載の可溶性の分子複 合体。
  19. １９．前記ポリカチオンがポリリジンである、ことを特徴とする請求項１５記載 の可溶性の分子複合体。
  20. ２０．前記遺伝子が、前記遺伝子が肝細胞によって発現され、前記遺伝子にコー ドされている産物が肝細胞によって分泌されるために必要な遺伝子調節因子とと もに、発現ベクターに含まれている、ことを特徴とする請求項１５記載の可溶性 の分子複合体。
  21. ２１．前記発現ベクターがプラスミドあるいはウイルスＤＮＡである、ことを特 徴とする請求項２０記載の可溶性の分子複合体。
  22. ２２．因子ＶＩＩＩタンパク質をコードする遺伝子を、肝細胞へ標的設定するた めの可溶性の分子複合体であって、前記複合体が、因子ＶＩＩＩタンパク質をコ ードする発現可能な遺伝子と、アシアロ糖タンパク質レセプターのリガンドとポ リカチオンから構成される担体と、の複合体から構成され、前記ポリカチオンか 、細胞外の条件下では遺伝子と複合体を形成し、細胞内の条件下では発現可能な 分子として遺伝子を放出する、ことを特徴とする可溶性の分子複合体。
  23. ２３．前記ポリカチオンがポリリジンである、ことを特徴とする請求項２２記載 の可溶性の分子複合体。
  24. ２４．因子ＩＸタンパク質をコードする遺伝子を、肝細胞へ標的設定するための 可溶性の分子複合体であって、前記複合体が、因子ＩＸタンパク質をコードする 発現可能な遺伝子と、アシアロ糖タンパク質レセプターのリガンドとポリカチオ ンから構成される担体と、の複合体から構成され、前記ポリカチオンが、細胞外 の条件下では遺伝子と複合体を形成し、細胞内の条件下では発現可能な分子とし て遺伝子を放出する、ことを特徴とする可溶性の分子複合体。
  25. ２５．前記ポリカチオンがポリリジンである、ことを特徴とする請求項２４記載 の可溶性の分子複合体。
  26. ２６．分泌タンパク質をコードする発現可能な遺伝子を、ある生物の特定の細胞 へ標的設定して配達し、前記細胞内で前記遺伝子にコードされている産物を発現 、分泌させるための方法であって、前記方法が、可溶性の分子複合体を前記生物 に投与することから構成され、前記複合体が、分泌タンパク質をコードする発現 可能な遺伝子と、細胞特異的結合剤と遺伝子結合剤から構成される担体と、の複 合体から構成され、前記遺伝子結合剤が、細胞外の条件下では遺伝子と複合体を 形成し、細胞内の条件下では発現可能な分子として遺伝子を放出する、ことを特 徴とする方法。
  27. ２７．前記発現可能な遺伝子がＤＮＡである、ことを特徴とする請求項２６記載 の方法。
  28. ２８．前記発現可能な遺伝子がアルブミンをコードする、ことを特徴とする請求 項２６記載の方法。
  29. ２９．前記発現可能な遺伝子か血液凝固因子をコードする、ことを特徴とする請 求項２６記載の方法。
  30. ３０．前記血液凝固因子が、因子Ｖ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩから構 成される群より選択される、ことを特徴とする請求項２９記載の方法。
  31. ３１．前記遺伝子結合剤がポリカチオンである、ことを特徴とする請求項２６記 載の方法。
  32. ３２．前記ポリカチオンがポリリジンである、ことを特徴とする請求項６記載の 方法。
  33. ３３．前記細胞特異的結合剤が細胞表面のレセプターに結合し、前記表面レセプ ターがエンドサイトーシスを媒介する、ことを特徴とする請求項２６記載の方法 。
  34. ３４．前記細胞特異的結合剤が、アシアロ糖タンパク質レセプターのリガンドで ある、ことを特徴とする請求項３３記載の方法。
  35. ３５．前記リガンドがアシアロ糖タンパク質であり、前記標的細胞が肝細胞であ る、ことを特徴とする請求項３４記載の方法。
  36. ３６．前記分子複合体を静脈注射する、ことを特徴とする請求項２６記載の方法 。
  37. ３７．肝細胞を、ｉｎ　ｖｉｖｏ（生体内）で、分泌タンパク質をコードする遺 伝子で特異的にトランスフェクトするための方法であって、薬理学的に受容可能 な分子複合体の溶液を静脈注射することから構成され、前記複合体が、分泌タン パク質をコードする発現可能な遺伝子と、アシアロ糖タンパク質レセプターのリ ガンドとポリカチオンから構成される担体と、の複合体から構成され、前記ポリ カチオンが、細胞外の条件下では遺伝子と複合体を形成し、細胞内の条件下では 発現可能な分子として遺伝子を放出する、ことを特徴とする方法。
  38. ３８．ある生物の遺伝的あるいは後天的異常を、矯正あるいは軽減させるために 、前記肝細胞をトランスフェクトする、ことを特徴とする請求項３７記載の方法 。
  39. ３９．前記発現可能な遺伝子がアルブミンをコードする、ことを特徴とする請求 項３８記載の方法。
  40. ４０．前記発現可能な遺伝子が血液凝固因子をコードする、ことを特徴とする請 求項３８記載の方法。
  41. ４１．前記血液凝固因子が、因子Ｖ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩから構 成される群より選択される、ことを特徴とする請求項４０記載の方法。
  42. ４２．前記ポリカチオンがポリリジンである、ことを特徴とする請求項３７記載 の方法。
  43. ４３．前記発現可能な遺伝子が、前記遺伝子が肝細胞によって発現され、前記遺 伝子にコードされている産物が肝細胞によって分泌されるために必要な遺伝子調 節因子とともに、発現ベクターに含まれている、ことを特徴とする請求項３７記 載の方法。
  44. ４４．前記発現ベクターがプラスミドあるいはウイルスＤＮＡである、ことを特 徴とする請求項４３記載の方法。
  45. ４５．担体と遺伝子との比率が、１：５から５：１の範囲である、ことを特徴と する請求項１記載の可溶性の分子複合体。
  46. ４６．担体と遺伝子との比率が、１：５から５：１の範囲である、ことを特徴と する請求項１５記載の可溶性の分子複合体。
  47. ４７．担体と遺伝子との比率が、１：５から５：１の範囲である、ことを特徴と する請求項２６記載の方法。
  48. ４８．担体と遺伝子との比率が、１：５から５：１の範囲である、ことを特徴と する請求項３７記載の方法。
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