DE4110410C2 - Neue Protein-Polykation-Konjugate - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft neue Protein-Polykation-
Konjugate für den Transport von zu Polykationen affinen
Verbindungen, insbesondere Nukleinsäuren, in
menschliche oder tierische Zellen.
Nukleinsäuren als therapeutisch wirksame Substanzen
haben in den letzten Jahren zunehmend an Bedeutung
gewonnen.
Antisense RNAs und -DNAs haben sich als wirksame Mittel
für die selektive Inhibierung bestimmter Gensequenzen
erwiesen. Ihre Wirkungsweise ermöglicht ihre Anwendung
als Therapeutika zur Blockierung der Expression
bestimmter Gene (wie deregulierter Onkogene oder
viraler Gene) in vivo. Es wurde bereits gezeigt, daß
kurze Antisense- Oligonukleotide in Zellen importiert
werden und dort ihre inhibierende Wirkung ausüben
können (Zamecnik et al., 1986), wenngleich ihre
intrazelluläre Konzentration, u. a. wegen ihrer
beschränkten Aufnahme durch die Zellmembran auf Grund
der starken negativen Ladung der Nukleinsäuren, gering
ist.
Ein weiterer Ansatz zur selektiven Inhibierung von
Genen besteht in der Anwendung von Ribozymen. Auch hier
besteht das Bedürfnis, eine möglichst hohe
Konzentration von aktiven Ribozymen in der Zelle zu
gewährleisten, wofür der Transport in die Zelle einer
der limitierenden Faktoren ist.
Es wurden bereits mehrere Lösungen vorgeschlagen, den
Transport von Nukleinsäuren in lebende Zellen, der bei
deren therapeutischer Anwendung einen der limitierenden
Faktoren darstellt, zu verbessern.
Einer dieser Lösungswege besteht in direkten
Modifikationen der Nukleinsäuren, z. B. durch
Substitution der geladenen Phosphodiestergruppen durch
ungeladene Gruppen. Eine weitere Möglichkeit der
direkten Modifikation besteht in der Verwendung von
Nukleosidanalogen.
Wenn auch einige dieser Vorschläge einen grundsätzlich
vielversprechenden Ansatz der Lösung des Problems
darstellen, weisen sie doch verschiedene Nachteile auf,
z. B. geringere Bindung an das Zielmolekül, geringere
Hemmwirkung, mögliche Toxizität.
Ein alternativer Ansatz zur direkten Modifikation der
Oligonukleotide besteht darin, das Oligonukleotid als
solches unverändert zu belassen und mit einer Gruppe zu
versehen, die ihm die aufgestrebten Eigenschaften
verleiht, z. B. mit Molekülen, die den Transport in die
Zelle erleichtern.
Bedarf an einem effizienten System für das Einführen
von Nukleinsäure in lebende Zellen besteht außerdem im
Rahmen der Gentherapie. Dabei werden Gene in Zellen
eingeschleust, um in vivo die Synthese therapeutisch
wirksamer Genprodukte zu erzielen, z. B. um im Falle
eines genetischen Defekts das fehlende Gen zu ersetzen.
Beispiele für weitere Anwendungsmöglichkeiten sind
genetisch bedingte Erkrankungen, bei denen die
Gentherapie einen erfolgversprechenden Ansatz
darstellt, sind Hämophilie, beta-Thalessemie und
"Severe Combined Immune Deficiency"(SCID), ein Syndrom,
das durch einen genetisch bedingten Mangel des Enzyms
Adenosindeaminase hervorgerufen wird. Die "klassische"
Gentherapie beruht auf dem Prinzip, durch eine
einmalige Behandlung eine dauernde Heilung zu erzielen.
Daneben besteht jedoch Bedarf an Behandlungsmethoden,
bei denen die therapeutisch wirksame DNA (oder auch
mRNA) wie ein Medikament ("Gentherapeutikum") je nach
Bedarf einmalig oder wiederholt verabreicht wird.
Anwendungsmöglichkeiten für dieses Prinzip bestehen bei
der Immunregulation, wobei durch Verabreichung
funktioneller Nukleinsäure, die für ein sekretiertes
Protein-Antigen oder für ein nicht-sekretiertes
Protein-Antigen kodiert, mittels einer Impfung eine
humorale oder intrazelluläre Immunität erzielt wird.
Beispiele für genetische Defekte, bei denen eine
Verabreichung von Nukleinsäure, die für das defekte Gen
kodiert, in individuell auf den Bedarf abgestimmter
Form verabreicht werden kann, sind Muskeldystrophie
(Dystrophin-Gen), Cystische Fibrose (Transmembran-
Regulations-Gen), Hypercholesterolämie (HDL-Rezeptor-
Gen). Gentherapeutische Behandlungsmethoden sind
weiters potentiell dann von Bedeutung, wenn Hormone,
Wachstumsfaktoren oder cytotoxisch oder
immunmodulierend wirkende Proteine im Organismus
synthetisiert werden sollen.
Die bisher am weitesten fortgeschrittenen Technologien
für die Anwendung von Nukleinsäuren im Rahmen der
Gentherapie benutzen retrovirale Systeme für den
Transfer von Genen in die Zelle (Wilson et al., 1990,
Kasid et al., 1990). Die Verwendung von Retroviren ist
jedoch problematisch, weil sie, zumindest zu einem
geringen Prozentsatz, die Gefahr von Nebenwirkungen wie
Infektion mit dem Virus (durch Rekombination mit
endogenen Viren und mögliche anschließende Mutation zur
pathogenen Form) oder Entstehung von Krebs in sich
birgt. Außerdem ist die stabile Transformation der
somatischen Zellen des Patienten, wie sie mit Hilfe von
Retroviren erzielt wird, nicht in jedem Fall
wünschenswert, weil dadurch die Behandlung, z. B. bei
Auftreten von Nebeneffekten, nur mehr schwierig
rückgängig gemacht werden kann.
Es wurde daher nach alternativen Methoden gesucht, um
die Expression von nicht-replizierender DNA in der
Zelle zu ermöglichen.
Für die Gentransformation von Säugetierzellen in vitro
sind verschiedene Techniken bekannt, deren
Anwendbarkeit in vivo jedoch beschränkt ist (dazu
zählen das Einbringen von DNA mittels Liposomen,
Elektroporation, Mikroinjektion, Zellfusion,
DEAE-Dextran oder die Calciumphosphat-
Präzipitationsmethode).
Neuere Bestrebungen, Methoden für den in vivo
Gentransfer zu entwickeln, konzentrieren sich auf die
Verwendung des kationischen Lipidreagens Lipofektin,
von dem gezeigt werden konnte, daß ein mit Hilfe dieses
Reagens injiziertes Plasmid im Organismus exprimiert
wird (Nabel et al., 1990).
Eine weitere kürzlich entwickelte Methode benutzt
Mikropartikel aus Wolfram oder Gold, an denen DNA
absorbiert ist, mit denen die Zelle mit hoher Energie
beschossen werden (Johnston, 1990, Yang et al., 1990).
Expression der DNA konnte in verschiedenen Geweben
nachgewiesen werden.
Ein in vivo anwendbares lösliches System, das DNA
zielgerichtet in die Zellen befördert, wurde für
Hepatozyten entwickelt und beruht auf dem Prinzip,
Polylysin an ein Glykoprotein, auf das ein an der
Hepatozytenoberfläche vorhandener Rezeptor anspricht,
zu koppeln und daraufhin durch Zugabe von DNA einen
löslichen Glykoprotein/Polylysin/DNA-Komplex zu bilden,
der in die Zelle aufgenommen wird und nach Aufnahme des
Komplexes in die Zelle die Expression der DNA-Sequenz
ermöglicht (G.Y. Wu, C.H. Wu, 1987).
Dieses System ist spezifisch für Hepatozyten und wird
hinsichtlich seiner Funktion durch den relativ gut
charakterisierten Aufnahmemechanismus durch den
Asiologlykoproteinrezeptor definiert.
Ein breiter anwendbares, effizientes Transportsystem
benutzt den Transferrinrezeptor für die Aufnahme von
Nukleinsäuren in die Zelle mittels Transferrrin-
Polykation-Konjugaten. Dieses System ist Gegenstand der
Europäischen Patentanmeldung A1 388.758. Es konnte
gezeigt werden, daß Transferrin-Polykation/DNA-Komplexe
effizient in lebende Zellen aufgenommen und
internalisiert werden, wobei als Polykationanteil der
Komplexe Polylysin verschiedenen Polymerisationsgrades
und Protamin verwendet wurden. Mit Hilfe dieses Systems
wurde u. a. ein das erbB-Onkogen inhibierendes
Ribozymgen in erbB-transformierte Hühnerzellen
eingebracht und die erbB inhibierende Wirkung
nachgewiesen.
Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde,
ein System bereitzustellen, mit Hilfe dessen ein
selektiver Transport von Nukleinsäuren in höhere
eukaryotische Zellen, insbesondere Zellen der T-Zell-
Abstammungslinie ("T-cell lineage") ermöglicht wird.
(Im folgenden werden Zellen der T-Zell-Abstammungslinie
der Einfachheit halber als T-Zellen bezeichnet.
Darunter sind Vorläufer-T-Zellen sowie die daraus
diversifizierenden Linien einschließlich der reifen
T-Zellen zu verstehen).
T-Lymphozyten (T-Zellen) differenzieren im Thymus. Eine
ihrer Aufgaben ist die Unterstützung der B-Zellen bei
der Antigenantwort. Eines der Charakteristika von
T-Zellen ist, daß sie kein freies Antigen erkennen,
sondern Fragmente von Antigenen. T-Zellen erkennen ein
solches Peptid-Antigen-Fragment auf der Oberfläche von
Zielzellen durch einen T-Zell-Antigenrezeptor (TCR),
der mit einem an ein MHC (major histocompatibility
complex)-Molekül gebundenen Antigen in Wechselwirkung
tritt. Die spezifische Antigenerkennung erfordert die
Mitwirkung eines weiteren Rezeptors, CD4 oder CDB, mit
nicht-polymorphen Regionen von MHC. Dieses
Zusammenwirken von TCR und entweder CD4 oder CD8 mit
einem MHC-Molekül auf Zielzellen ist für die Ausbildung
der spezifischen Fähigkeiten von T-Zellen während der
thymischen Entwicklung erforderlich und erlaubt die
antigenspezifische Aktivierung reifer T-Zellen.
T-Zellen, die mit Klasse I MHC Molekülen assoziiertes
Antigen erkennen (vorwiegend Killerzellen), exprimieren
CD8; Zellen, die Klasse II-assoziierte Antigene
erkennen (vorwiegend Helferzellen), exprimieren CD4.
Aufgaben von CD4+-Zellen im Rahmen der Immunantwort
sind neben der Induktion der H-Zellfunktion die
Aktivierung von Makrophagen, die Sekretion von
Wachstums- und Differenzierungsfaktoren für lymphoide
Zellen, die Sekretion von Faktoren, die nicht-lymphoide
Zellfunktionen induzieren, die Induktion der
Suppressor-, der NK- und der cytotoxischen
T-Zellfunktion (Fauci, 1988).
Neben seiner wichtigen Rolle bei der Immunerkennung
spielt CD4, ein Glykoprotein mit einem Molekulargewicht
von 55.000, das außer auf T-Zellen auch in geringerem
Ausmaß auf Monozyten/Makrophagen vorhanden ist, eine
entscheidende Rolle bei der Infektion mit dem HIV-
Virus, indem es als Rezeptor für das Virus fungiert.
HIV ist der Erreger von AIDS ("acquired
immunodeficiency syndrome"), einer schweren Erkrankung,
die mit einer progressiven und irreversiblen Schädigung
des Immunsystems einhergeht. Diese wird vor allem durch
eine selektive Verringerung von CD4+-T-Zellen
hervorgerufen.
Seit seiner Entdeckung wurde das HIV-Virus eingehend
hinsichtlich seiner molekularen Biologie, seiner
Infektiosität und der Mechanismen der Pathogenese
untersucht.
HIV ist ein RNA-Retrovirus, das ursprünglich HTLV-III,
LAV oder ARV bezeichnet wurde. Das früher als HIV
bezeichnete Virus wird derzeit häufig auch als HIV-1
bezeichnet, um es von einem in westafrikanischen
Patienten nachgewiesenen Virus (HIV-2) zu
unterscheiden, das Verwandtschaft zum SIV-Virus
aufweist und ein von AIDS nicht unterscheidbares
Krankheitsbild verursacht.
Das HIV-Virusgenom ist gut charaktierisiert. Es weist
eine Länge von ca. 10 kb auf und umfaßt die
flankierenden LTR ("long terminal repeat") Sequenzen,
die regulatorische Sequenzen für die Replikation
enthalten, sowie mindestens neun Gene. Diese Gene
umfassen nicht nur die allen replikationsfähigen Viren
gemeinsamen gag, pol und env-Gene, sondern auch Gene,
die an der Reifung und Morphogenese beteiligt sind
(vpu und vif), Gene, beteiligt an der Regulation der
Virusreplikation (tat, rev und nef) und ein Gen
unbekannter Funktion (vpr). Das tat-Gen spielt eine
wichtige Rolle bei der Amplifikation der
Virusreplikation, indem es für ein Protein mit
trans-Aktivatorfunktion für die HIV-Genexpression
kodiert.
Nach seiner Bindung an das CD4-Molekül, das für HIV ein
Rezeptor mit hoher Affinität ist (Dalgleish et al.,
1984; Klatzmann et al., 1984; McDougal et al., 1986),
wird das Virus in die Zelle aufgenommen und von seiner
Hülle befreit. Zum Ablauf dieses Vorganges existieren
widersprüchliche Ansichten. Es wurde u. a.
vorgeschlagen, daß bei diesem Vorgang Rezeptor
vermittelte Endozytose eine Rolle spielt (Maddon et
al., 1986; Pauza und Price, 1988). Dagegen spricht
jedoch die Beobachtung, daß für den Eintritt des Virus
in die Zelle die Fusion des transmembranen Teils (gp41)
der Virushülle mit der Zellmembran unabhängig vom
pH-Wert erforderlich ist (Stein et al., 1987). Weiters
wurde beobachtet, daß humanes CD4 exprimierende
Mauszellen trotz Bindung des Virus an die Zelle nicht
produktiv infiziert werden können. Dieses Ergebnis kann
so interpretiert werden, daß außer CD4 gegebenenfalls
noch andere Proteine auf humanen CD4+-Zellen für die
Internalisierung des Virus mitverantwortlich sind.
Die Bindung des HIV-Virus an das CD4-Molekül erfolgt
über das Virus-Hüllprotein (env).
Das Primärprodukt des env-Gens, gp160, ist ein
Precursor, dessen Spaltung (während der Reifung auf dem
Weg durch das ER und den Golgi-Apparat) die
Virionproteine gp120 und gp41 ergibt. Die Spaltung von
gp160 ist für die Fusion des Virus mit der Zelle und
für die Infektiosität erforderlich. gp120 ist das
äußere Hüll-Glycoprotein und auf der Außenseite der
Membran infizierter Zellen und von Viruspartikeln
vorhanden. Es weist keine Membran-Verankerungsdomäne
auf und bleibt mit der Membran ausschließlich durch
nichtkovalente Bindung mit gp41 verbunden.
gp120 enthält die für die Bindung des Virus an den
Rezeptor wesentliche Determinante. Die hochaffine
Bindung zwischen dem Virus und der Zellmembran wird
durch Wechselwirkung zwischen einem Abschnitt von
40 Aminosäuren am C-Terminus von gp120 und einer Domäne
nahe dem N-Terminus von CD4 vermittelt. Wenn auch
zwischen den verschiedenen HIV-Stämmen erhebliche
Unterschiede in den gp120 Sequenzen bestehen, sind die
CD4-Bindungsdomänen zwischen HIV-1, HIV-2 und den
verwandten SIV-Viren konserviert. Es wurden
proteolytische Fragmente von 95 und 25 kDa isoliert,
die offensichtlich domänenartige Unterteilungen von
gp120 darstellen und an CD4 in gleicher Weise zu binden
vermögen wie das ursprüngliche gp120 (Nygren et al.,
1988).
Über den Ablauf des Fusionsvorganges gibt es
verschiedene Theorien; unbestritten ist jedoch die
Schlüsselrolle von gp41 für diesen Vorgang. gp41 weist
eine hydrophobe Sequenz mit starker Homologie zu
Fusionssequenzen am N-Terminus von Transmembran-
Proteinen anderer Viren auf. Es wurde beobachtet, daß
die env-Proteine ein Oligomeres bilden, wobei
möglicherweise ein allosterisches Rearrangement des
Oligomeren auf der Virusmembran das Einbringen des
gp41-N-Terminus in die Ziel-Zellmembran und die Fusion
fördert (derselbe Effekt wird für die Syncitienbildung
zwischen infizierten Zellen verantwortlich gemacht).
Einer der als aussichtsreich angesehenen Ansätze, die
HIV-Infektion zu blockieren, ist die Neutralisierung
durch eine lösliche, sekretierte Form des CD4-Antigens
(Smith et al.; 1987), die um die Bindung an gp120
konkurriert.
Eine therapeutische Möglichkeit, nach bereits erfolgter
HIV-Infektion des Organismus die noch nicht infizierten
Zellen zu schützen bzw. die Aktivierung des latenten
Virus in den befallenden Zellen zu verhindern, besteht
in der Verabreichung von die Virusreplikation
inhibierenden Nukleinsäuremolekülen.
Für derartige therapeutische Anwendungen von
Nukleinsäuren ist deren effiziente Aufnahme in die
Zelle erforderlich.
Es wurde überraschend festgestellt, daß Proteine, die
an ein Zelloberflächenprotein binden, das von T-Zellen
exprimiert wird, für den Transport von Nukleinsäuren in
Zellen, die das Zelloberflächenprotein exprimieren,
herangezogen werden können, wenn sie mit Polykationen
konjugiert werden.
Es wurde festgestellt, daß der vom HIV-Virus bei der
Infektion benutzte Rezeptor, CD4, für den Transport von
Nukleinsäure in die Zelle ausgenutzt werden kann, indem
die zu importierende Nukleinsäure mit einem
Protein-Polykation-Konjugat komplexiert wird, dessen
Proteinanteil ein Protein mit der Fähigkeit ist, an
CD4 zu binden, und CD4 exprimierende Zellen mit den
erhaltenen Protein-Polykation/DNA-Komplexen in
Berührung gebracht werden.
Weiters konnte gezeigt werden, daß mit Hilfe von
Antikörper-Polykation-Konjugaten, enthaltend einen
Antikörper gegen CD7, DNA in Zellen der
T-Zell-Abstammungslinie ("T-cell lineage") eingeführt
und in diesen Zellen exprimiert wird. (CD7 ist ein
Zelloberflächenprotein mit derzeit noch unbekannter
physiologischer Rolle, das auf Thymocyten und reifen
T-Zellen nachgewiesen wurde. CD7 ist ein verläßlicher
Marker für die akute T-Zellenleukämie (Aruffo und Seed,
1987).
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnte somit
anhand von Protein-Polykation-Konjugaten mit
verschiedenen Proteinen, denen die Fähigkeit gemeinsam
ist, an T-Zelloberflächenproteine zu binden,
nachgewiesen werden, daß mit Hilfe solcher Konjugate in
Zellen, die das jeweilige T-Zell-Oberflächenantigen
exprimieren, Internalisierung und Expression von
DNA erzielt werden kann.
Die Erfindung betrifft somit neue Protein-Polykation-
Konjugate, die befähigt sind, mit Nukleinsäuren oder
Nukleinsäureanalogen Komplexe zu bilden, wobei der
Proteinanteil ein Protein mit der Fähigkeit ist, an ein
Zelloberflächenprotein, das von T-Zellen exprimiert
wird, zu binden, so daß die gebildeten Komplexe in
Zellen, das Zelloberflächenprotein exprimieren,
insbesondere T-Zellen, aufgenommen werden.
Im folgenden werden Proteine bzw. Fragmente davon mit
der Fähigkeit, an Zelloberflächenproteine von T-Zellen
zu binden, als T-Zell-bindende Proteine (TZBPs)
bezeichnet.
Vertreter von Proteinen mit der Fähigkeit zur Bindung
an CD4 (bzw. CD7) werden als "CD4 (CD7) bindendes
Protein" oder "CD4BP (CD7BP)" bezeichnet.
Gegenstand der Erfindung sind weiters TZBP-
Polykation/Nukleinsäure-Komplexe, in denen die
erfindungsgemäßen Konjugate mit einer in die
Zielzellen, die das T-Zelloberflächenantigen
exprimieren, an das das TZBP bindet, zu
transportierenden Nukleinsäure komplexiert ist.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnte gezeigt
werden, daß DNA in Form der erfindungsgemäßen Komplexe
effizient in Zellen, die das jeweilige
T-Zelloberflächenantigen exprimieren, an das das TZBP
bindet, aufgenommen und exprimiert wird, wobei die
Aufnahme von DNA in die Zelle mit steigendem
Konjugatgehalt zunahm.
Im Falle der Verwendung von Antikörpern als TZBPs
kommen alle diejenigen, insbesondere monoklonalen
Antikörper gegen T-Zelloberflächenprotein bzw.
Fragmente davon in Betracht, die an das jeweilige
Zelloberflächenprotein binden, z. B. Fab'-Fragmente
(Pelchen-Matthews et al., 1989).
Dazu zählen monoklonale Anti-CD4-Antikörper, die ein
gp120-Epitop aufweisen, das mit dem Virus um die
Bindung an dieses Epitop zu konkurriert.
Anstelle konventioneller monoklonaler Antikörper bzw.
deren Fragmente können Antikörperabschnitte, bestehend
aus einer Kombination von Segmenten der schweren und
leichten Kette oder gegebenenfalls der schweren Kette
allein, verwendet werden. Die Herstellung solcher
"alternativer" Antikörper durch Klonierung mittels
Polymerase-Kettenreaktion und Expression in E.coli
wurde kürzlich beschrieben (Sastry et al., 1989;
Orlandi et al., 1989 Chaudhary et al., 1990).
Als CD4BPs kommen weiters HIV-1-gp120 bzw. homologe
Proteine verwandter Retroviren bzw. Fragmente davon in
Betracht. Zur Verwendung im Rahmen der vorliegenden
Erfindung geeignete gp120-Fragmente sind diejenigen,
die zur Hindung an CD4 befähigt sind (Lasky et al.,
1987), z. B die 95-kDa und 25-kDa-Fragmente, von denen
nachgewiesen wurde, daß sie an CD4 binden
(Nygren et al.; 1988). Solche Fragmente können z. B
erhalten werden, indem entweder zunächst das gesamte
gp120 Protein auf rekombinantem Weg hergestellt und
anschließend proteolytisch gespalten wird. Eine
alternative Methode besteht in der rekombinanten
Herstellung der Fragmente selbst.
Die Wahl des TZBP wird vor allem durch die Zielzellen
bestimmt, z. B. durch bestimmte Oberflächenantigene oder
Rezeptoren, die für einen Zelltyp spezifisch bzw.
weitgehend spezifisch sind und somit einen gerichteten
Import der Nukleinsäure in diesen Zelltyp ermöglichen.
Die erfindungsgemäßen Konjugate ermöglichen je nach
Oberflächenantigen, an das das im Konjugat enthaltene
Protein bindet, eine engere oder breitere Selektivität
hinsichtlich der mit Nukleinsäure zu behandelnden, das
T-Zelloberflächenprotein exprimierenden Zellen und
somit einen flexiblen Einsatz therapeutisch oder
gentherapeutisch wirksamer Nukleinsäure.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind als Konjugat-
Komponente TZBPs geeignet, die an die Zelle binden,
wodurch die Konjugat/DNA-Komplexe, insbesondere über
Endozytose, internalisiert werden, oder TZBPs, deren
Bindung/Internalisierung über Fusion mit
Zellmembranelementen erfolgt.
Wesentlich für die Eignung von TZBPs im Rahmen der
vorliegenden Erfindung ist,
- a) daß sie vom spezifischen Zelltyp, in den die Nukleinsäure eingebracht werden soll, erkannt werden und ihre Bindungsfähigkeit nicht oder nicht wesentlich beeinträchtigt wird, wenn sie mit dem Polykation konjugiert werden, und
- b) daß sie im Rahmen dieser Eigenschaft in der Lage sind, Nukleinsäure auf dem von ihnen benutzten Weg in die Zelle "huckepack" mitzunehmen.
Unter der Voraussetzung, daß sie die unter a) und b)
definierten Bedingungen erfüllen, sind grundsätzlich
alle an T-Zelloberflächenantigene/Rezeptoren bindenden
Proteine für die Anwendung im Rahmen der vorliegenden
Erfindung geeignet. Dazu zählen Antikörper gegen
T-Zelloberflächenproteine, die spezifisch auf einem
oder mehreren Vertretern von Zellen eines bestimmten
Differenzierungszustandes exprimiert werden,
z. B. Antikörper gegen CD4, CD44, CD7, CD3, CD8 bzw. die
entsprechenden Antikörperfragmente.
Für die gezielte Anwendung auf Tumorzellen kommen vor
allem Antikörper gegen spezifisch auf T-Zellen
exprimierte Zelloberflächenproteine, sog. Tumormarker,
in Betracht, z. B. CD7.
Neben Antikörpern und gp120(Fragmenten) sind im Rahmen
der vorliegenden Erfindung alle natürliche Antigene,
die die unter a) und b) angeführten Bedingungen
erfüllen, geeignet.
Zu im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeigneten
Polykationen zählen homologe Polykationen wie
Polylysin, Polyarginin, Polyornithin oder heterologe
Polykationen mit zwei oder mehr unterschiedlichen
positiv geladenen Aminosäuren zu verstehen, wobei diese
Polykationen verschiedene Kettenlänge aufweisen können,
weiters nichtpeptidische synthetische Polykationen wie
Polyethylenimin. Geeignete sind weiters natürliche
DNA bindende Proteine polykationischen Charakters wie
Histone oder Protamine bzw. Analoge oder Fragmente
davon.
Als Polykationen bzw. (poly)Peptide polykationischen
Charakters können folgende Verbindungen verwendet
werden:
- a) Protamine: Dabei handelt es sich um kleine (MG bis ca. 8000), stark basische Proteine, deren positiv geladene Aminosäurereste (vor allem Arginine) für gewöhnlich in Gruppen angeordnet sind und die auf Grund ihres polykationischen Charakters die negativen Ladungen von Nukleinsäuren neutralisieren (Warrant et al., 1978). Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendbaren Protamine können natürlichen Ursprungs oder auf rekombinantem Weg hergestellt sein, wobei Mehrfachkopien hergestellt bzw. Modifikationen hinsichtlich Molekülgröße und Aminosäuresequenz vorgenommen werden können. Entsprechende Verbindungen können auch chemisch synthetisiert werden. Bei der Synthese eines künstlichen Protamins kann z. B. so vorgegangen werden, daß Aminosäurereste, die beim natürlichen Protamin Funktionen haben, die für die Transportfunktion unerwünscht sind (z. B. Kondensation von DNA) durch geeignete andere Aminosäuren ersetzt werden und/oder an einem Ende eine Aminosäure (z. B. Cystein) vorgesehen wird, die die gezielte Konjugation mit CD4BP ermöglicht.
- b) Histone: Dies sind im Chromatin vorhandene kleine DNA-bindende Proteine mit einem hohen Anteil an positiv geladenen Aminosäuren (Lysin und Arginin), der sie befähigt, unabhängig von der Nukleotidsequenz an DNA zu binden und sie in Nukleosome zu falten, wozu besonders die argininreichen Histone H3 und H4 geeignet sind (Felsenfeld, 1978). Bezüglich der Herstellung und der Modifikationen gilt grundsätzlich das für Protamine Gesagte.
- c) Synthetische Polypeptide, wie homologe Polypeptide (Polylysin, Polyarginin) oder heterologe Polypeptide (bestehend aus zwei oder mehr Vertretern positiv geladener Aminosäuren).
- d) Nichtpeptische Kationen wie Polyethylenimine.
Die Größe der Polykationen wird bevorzugt so gewählt,
daß die Summe der positiven Ladungen etwa 20 bis
500 beträgt, sie wird auf die zu transportierende
Nukleinsäure abgestimmt.
Die erfindungsgemäßen TZBP-Polykation-Konjugate können
auf chemischem Weg in für die Kopplung von Peptiden an
sich bekannter Weise hergestellt werden, wobei, falls
erforderlich, die Einzelkomponenten vor der
Kopplungsreaktion mit Linkersubstanzen versehen werden
(diese Maßnahme ist dann erforderlich, wenn von
vornherein keine für die Kopplung geeignete
funktionelle Gruppe, z. B. eine Mercapto- oder
Alkoholgruppe, verfügbar ist. Bei den Linkersubstanzen
handelt es sich um bifunktionelle Verbindungen, die
zunächst mit funktionellen Gruppen der
Einzelkomponenten zur Reaktion gebracht werden, worauf
die Kopplung der modifizierten Einzelkomponenten
durchgeführt wird.
Je nach gewünschten Eigenschaften der Konjugate,
insbesondere im Hinblick auf deren Stabilität, kann die
Kopplung erfolgen über
- a) Disulfidbrücken, die unter reduzierenden Bedingungen wieder gespalten werden können (z. B. bei Verwendung von Succinimidylpyridyldithiopropionat (Jung et al., 1981).
- b) Unter biologischen Bedingungen weitgehend stabile Verbindungen (z. B. Thioether durch Reaktion von Maleimido-Linkern mit Sulfhydrylgruppen des an die zweite Komponente gebundenen Linkers).
- c) Unter biologischen Bedingungen labile Brücken, z. B. Esterbindungen, oder unter schwach sauren Bedingungen instabile Acetal- oder Ketalbindungen.
Es ist auch möglich, die erfindungsgemäßen Konjugate
auf rekombinantem Weg herzustellen, was den Vorteil
hat, genau definierte, einheitliche Verbindungen
erhalten zu können, während bei der chemischen Kopplung
Konjugat-Gemische entstehen, die aufgetrennt werden
müssen.
Die rekombinante Herstellung der erfindungsgemäßen
Konjugate ist nach für die Herstellung von chimären
Polypeptiden bekannten Methoden durchführbar. Dabei
können die polykationischen Peptide hinsichtlich ihrer
Größe und Aminosäuresequenz variiert werden. Die
gentechnologische Herstellung bietet auch den Vorteil,
den TZHP-Anteil des Konjugats modifizieren zu können,
indem z. B. durch geeignete Mutationen die
Bindungsfähigkeit an das Zelloberflächenprotein
gesteigert werden kann oder ein TZBP-Anteil, verkürzt
auf den für die Hindung an das Zelloberflächenprotein
maßgeblichen Teil des Moleküls, verwendet wird
(z. B Verwendung von gp120-Fragmenten oder
"alternativer" Antikörper). Besonders zweckmäßig für
die rekombinante Herstellung der erfindungsgemäßen
Konjugate ist die Verwendung eines Vektors, der die für
den TZBP-Anteil kodierende Sequenz sowie einen
Polylinker enthält, in den die jeweils benötigte für
das polykationische Peptid kodierende Sequenz
eingesetzt wird. Auf diese Weise kann ein Satz von
Expressionsplasmiden erhalten werden, von dem bei
Bedarf das die gewünschte Sequenz enthaltende Plasmid
zur Expression des erfindungsgemäßen Konjugats
herangezogen wird.
Das molare Verhältnis Antikörper : Polykation beträgt
bevorzugt 10 : 1 bis 1 : 10, wobei zu berücksichtigen ist,
daß es zur Ausbildung von Aggregaten kommen kann.
Dieses Verhältnis kann jedoch bei Bedarf innerhalb
weiterer Grenzen liegen, solange die Bedingung erfüllt
ist, daß Komplexierung der Nukleinsäure(n) stattfindet
und gewährleistet ist, daß der gebildete Komplex an das
Zelloberflächenprotein gebunden und in die Zelle
befördert wird. Dies kann durch einfach durchzuführende
Versuche von Fall zu Fall überprüft werden, z. B indem
Zellinien, die das T-Zelloberflächenantigen
exprimieren, mit den erfindungsgemäßen Konjugaten in
Berührung gebracht werden und daraufhin auf das
Vorhandensein von Nukleinsäure in der Zelle untersucht
werden, z. B. durch Southern Blot Analyse,
Hybridisierung mit radioaktiv markierten komplementären
Nukleinsäuremolekülen, durch Amplifikation mit Hilfe
der PCR oder durch Nachweis des Genproduktes eines
Reportergens.
Für bestimmte Anwendungsfälle bei Verwendung von
Antkörpern als TZBPs, vor allem für das Screening zum
Auffinden geeigneter Antikörper, kann es vorteilhaft
sein, den Antikörper nicht direkt an das Polykation zu
koppeln: für eine effiziente chemische Kopplung ist im
allgemeinen eine größere Menge (mehr als 1 mg)
Ausgangsantikörper erforderlich, außerdem wird durch
die Kopplung gegebenenfalls die Antikörper-
Bindungsdomäne inaktiviert. Um dieses Probleme zu
umgehen und ein rasches Screening geeigneter Antikörper
zu ermöglichen, kann zunächst ein
Protein A- Polykation-Konjugat hergestellt werden,
an das anschließend, gegebenenfalls in bereits mit
Nukleinsäure komplexierter Form, unmittelbar vor der
Transfektion der Zellen, der Antikörper über die
Fc-Bindungsdomäne von Protein A gebunden wird
(Surolia et al., 1982). Die mit den
Protein A-Konjugaten gebildeten Nukleinsäure-Komplexe
ermöglichen ein rasches Testen von Antikörpern auf ihre
Eignung für den Import von Nukleinsäure in den
jeweiligen zu behandelnden Zelltyp. Die Kopplung von
Protein A mit dem jeweiligen Polykation erfolgt in
analoger Weise wie die direkte Kopplung mit dem
Antikörper. Bei der Anwendung von
Protein-A-Antikörper-Polykation-Konjugaten kann es
vorteilhaft sein, die zu behandelnden Zellen zuerst mit
dem Antikörper zu inkubieren, die Zellen von
überschüssigem Antikörper zu befreien und anschließend
mit dem Protein A-Polykation/Nukleinsäure-Komplex zu
behandeln. Die Herstellung von Protein A-Konjugaten
kann je nach verwendetem Polykation auf rekombinantem
Weg erfolgen.
Bei den in die Zelle zu transportierenden Nukleinsäuren
kann es sich um DNAs oder RNAs handeln, wobei
hinsichtlich der Nukleotidsequenz keine Beschränkungen
bestehen. Die Nukleinsäuren können modifiziert sein,
sofern die Modifikation den polyanionischen Charakter
der Nukleinsäuren nicht beeinträchtigt; zu diesen
Modifikationen zählen z. B. die Substitution der
Phosphodiestergruppe durch Phosphorothioate oder in der
Verwendung von Nukleosidanalogen. Derartige
Modifikationen sind dem Fachmann geläufig, eine
Übersicht über Vertreter modifizierter Nukleinsäuren,
die im allgemeinen als Nukleinsäureanaloga bezeichnet
werden, sowie deren Wirkprinzip, sind in der Übersicht
von Zon (1988) angegeben.
Bezüglich der Größe der Nukleinsäuren ermöglicht die
Erfindung ebenfalls Anwendungen in einem weiten
Bereich. Hinsichtlich der oberen Grenze besteht keine
durch die erfindungsgemäßen Konjugate bedingte
prinzipielle Limitierung, solange gewährleistet ist,
daß die TZBP-Polykation/Nukleinsäurekomplexe in die
Zelle befördert werden. Eine etwaige Begrenzung nach
unten ergibt sich aus anwendungsspezifischen Gründen,
weil z. B. Antisense-Oligonukleotide unter etwa
10 Nukleotiden auf Grund zu geringer Spezifität kaum
für die Anwendung in Frage kommen. Mit Hilfe der
erfindungsgemäßen Konjugate können auch Plasmide in die
Zelle befördert werden.
Es ist auch möglich, gleichzeitig verschiedene
Nukleinsäuren mit Hilfe der erfindungsgemäßen Konjugate
in die Zelle zu befördern.
Beispiele für geeignete Nukleinsäuren sind die bereits
angeführten Antisenseoligonukleotide oder Ribozyme mit
Komplementarität zu für die Virusreplikation
essentiellen Genabschnitten.
Bevorzugt als Nukleinsäureanteil der erfindungsgemäßen
TZBP-Polykation-Nukleinsäurekomplexe mit inhibierender
Wirkung aufgrund von Komplementarität ist
Antisense-DNA, Antisense-RNA oder ein Ribozym bzw. das
dafür kodierende Gen. Bei der Anwendung von Ribozymen
und Antisense-RNAs ist es besonders vorteilhaft, die
dafür kodierenden Gene, gegebenenfalls zusammen mit
einem Carriergen, einzusetzen. Durch die Einführung des
Gens in die Zelle wird gegenüber dem Import der RNA als
solcher eine beträchtliche Amplifikation der RNA und
damit ein für die angestrebte Hemmung der biologischen
Reaktion ausreichender Vorrat gewährleistet. Besonders
geeignete Carriergene sind die für die Transkription
durch Polymerase III erforderlichen
Transkriptionseinheiten, z. B. tRNA-Gene. In diese
können z. B. Ribozymgene derart eingefügt werden, daß
bei Transkription das Ribozym Teil eines kompakten
Polymerase III-Transkripts ist. Geeignete genetische
Einheiten, enthaltend ein Ribozymgen und ein von
Polymerase III transkribiertes Carriergen, sind in der
Europäischen Patentanmeldung A1 0 387 775 geoffenbart.
Mit Hilfe des Transportsystems gemäß der vorliegenden
Erfindung kann die Wirkung dieser genetischen Einheiten
verstärkt werden, indem eine erhöhte
Ausgangskonzentration des Gens in der Zelle
gewährleistet wird.
Als Zielsequenzen für die Konstruktion komplementärer
Antisenseoligonukleotide oder Ribozyme bzw. der dafür
kodierenden Gene, die bei der Therapie von AIDS zur
Anwendung kommen können, sind grundsätzlich sämtliche
Sequenzen des HIV-Gens geeignet, deren Blockierung die
Inhibierung der viralen Replikation und Expression zur
Folge hat. In erster Linie in Frage kommende
Zielsequenzen sind Sequenzen mit regulatorischer
Funktion, vor allem des tat-, rev- oder nef-Gens.
Geeignete Sequenzen sind weiters die Initiations-,
Polyadenylierungs-, Splicing tRNA Primer-Bindungsstelle
(PBS) der LTR-Sequenz oder die tar-Sequenz.
Außer Nukleinsäuremolekülen, die aufgrund ihrer
Komplementarität zu viralen Genen inhibieren, können
auch Gene mit anderem Wirkmechanismus eingesetzt
werden, z. B. solche, die für Virusproteine, enthaltend
sog. trans-dominante Mutationen, kodieren (Herskowitz,
1987). Die Expression der Genprodukte in der Zelle
resultiert in Proteinen, die in ihrer Funktion das
entsprechenden Wildtyp-Virusprotein dominieren, womit
dieses seine für die Virusreplikation normalerweise
geleistete Aufgabe nicht erfüllen kann und die
Virusreplikation wirksam inhibiert wird. Geeignet sind
grundsätzlich trans-dominante Mutanten von
Virusproteinen, die für die Replikation und Expression
erforderlich sind, z. B. Gag-, Tat- und Rev-Mutanten,
von denen inhibierende Wirkung auf die HIV-Replikation
nachgewiesen wurde (Trono et al., 1989; Green et al.,
1989; Malim et al., 1989).
Vertreter therapeutisch wirksamer Nukleinsäuren sind
weiters solche mit inhibierender Wirkung auf Onkogene.
Mit Hilfe der vorliegenden Erfindung können auch Gene
bzw. Abschnitte davon in die Zelle transportiert
werden, deren Expressionsprodukte eine Funktion bei der
Signalübertragung haben, um auf diese Weise die
Signalübertragung in den Zielzellen positiv zu
beeinflussen und damit z. B. die Überlebensfähigkeit von
T-Zellen zu steigern.
Prinzipiell sind sämtliche Gene bzw. Genabschnitte im
Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignet, die in in
den das T-Zelloberflächenprotein exprimierenden Zellen
einen therapeutischen oder gentherapeutischen Effekt
haben.
Das Verhältnis Nukleinsäure: Konjugat kann innerhalb
eines weiten Bereichs schwanken, wobei es nicht
unbedingt erforderlich sein muß, sämtliche Ladungen der
Nukleinsäure zu neutralisieren. Dieses Verhältnis wird
von Fall zu Fall nach Kriterien wie Größe und Struktur
der zu transportierenden Nukleinsäure, Größe des
Polykations, Anzahl und Verteilung seiner Ladungen,
derart einzustellen sein, daß ein für die jeweilige
Anwendung günstiges Verhältnis zwischen
Transportfähigkeit und biologischer Aktivität der
Nukleinsäure besteht. Dieses Verhältnis kann zunächst
grob eingestellt werden, etwa an Hand der Verzögerung
der Wanderungsgeschwindigkeit der DNA in einem Gel
(z. B. mittels "Mobility Shift" auf einem Agarosegel)
oder durch Dichtegradientenzentrifugation. Nach Erhalt
dieses vorläufigen Verhältnisses kann es zweckmäßig
sein, im Hinblick auf die in der Zelle maximal
verfügbare Aktivität der Nukleinsäure Transportversuche
mit dem radioaktiv markierten Komplex durchzuführen und
den Konjugat-Anteil gegebenenfalls derart zu
reduzieren, daß die verbleibenden negativen Ladungen
der Nukleinsäure dem Transport in die Zelle nicht
hinderlich sind.
Die Herstellung der TZBP-Polykation/Nukleinsäure-
Komplexe kann nach in an sich für die Komplexierung
polyionischer Verbindungen bekannten Methoden
vorgenommen wurden. Eine Möglichkeit, unkontrollierte
Aggregation bzw. Ausfällung zu vermeiden, besteht
darin, die beiden Komponenten bei hoher Verdünnung
(≦ 100 µg) zu mischen.
Die über Endozytose in höhere eukaryotische Zellen
aufnehmbaren TZBP-Polykation-Nukleinsäure-Komplexe
können zusätzlich eine oder mehrere Polykationen in
nicht-kovalent gebundener Form, die gegebenenfalls
identisch sind mit dem Polykation im Konjugat, derart
enthalten, daß die durch das Konjugat erzielte
Internalisierung und/oder Expression der Nukleinsäure
gesteigert wird.
Mit Hilfe derartiger Maßnahmen, die Gegenstand der
unveröffentlichten Deutschen Patentanmeldung
Nr. 41 04 186.0 sind, wird bei zumindest gleicher
Transfektions/Expressions-Effizienz eine geringere
Menge, bezogen auf die in die Zelle zu importierende
Nukleinsäure-Menge, TZBP-Polykation-Konjugat benötigt,
was einerseits einen geringeren Synthese-Aufwand
bedeutet. Eine geringere Konjugatmenge kann
andererseits dann von Vorteil sein, wenn der Effekt
vermieden werden soll, daß durch eine größere Anzahl
von TZBP-Molekülen innerhalb eines Komplexes gleich
mehrere benachbarte "Andock-Stellen" besetzt werden und
in der Folge für weitere Komplexe nicht mehr verfügbar
sein können. Die Anzahl der in den Komplexen
enthaltenen Menge an TZBP auf das erforderliche Minimum
zu beschränken, d. h. die Konjugatmenge möglichst gering
zu halten und mit freiem Polykation zu verdünnen, ist
insbesondere auch dann von Vorteil, wenn die Zahl von
Zelloberflächenproteinen auf den zu behandelnden
Zielzellen gering ist.
Mit Hilfe solcher Maßnahmen kann die Leistungsfähigkeit
von Konjugaten, die für sich weniger effizient sind,
beträchtlich erhöht werden und die Leistungsfähigkeit
von an sich schon sehr effizienten Konjugaten noch
weiter gesteigert werden.
Hinsichtlich der qualitativen Zusammensetzung der
erfindungsgemäßenm Komplexe werden im allgemeinen
zunächst die in die Zelle zu importierende Nukleinsäure
und das TZBP festgelegt. Die Nukleinsäure wird vor
allem durch den in der Zelle zu erzielenden
biologischen Effekt definiert, z. B. durch die
Zielsequenz des zu inhibierenden oder - im Falle der
Anwendung im Rahmen der Gentherapie - des zur
Expression zu bringenden Gens bzw. Genabschnitts,
z. B. zwecks Substitution eines defekten Gens.
Gegebenenfalls ist die Nukleinsäure modifiziert,
bedingt z. B. durch eine für den jeweiligen
Anwendungsfall erforderliche Stabilität.
Ausgehend von der Festlegung von Nukleinsäure und TZBP
wird das Polykation auf diese Parameter abgestimmt,
wobei die Größe der Nukleinsäure, vor allem im Hinblick
auf eine weitgehende Neutralisierung der negativen
Ladungen, eine wesentliche Rolle spielt.
Für die Wahl der gegebenenfalls in den Komplexen
enthaltenen nicht-kovalent gebundenen Polykationen ist
entscheidend, daß durch ihren Zusatz gegenüber der
durch die Konjugate erzielbaren
Internalisierung/Expression der Nukleinsäure eine
Steigerung bewirkt wird.
Ebenso wie die qualitative Zusammensetzung richtet sich
auch die quantitative Zusammensetzung der Komplexe nach
mehreren Kriterien, die miteinander in funktionellem
Zusammenhang stehen, z. B. ob und in welchem Ausmaß es
erforderlich oder erwünscht ist, die Nukleinsäure zu
kondensieren, welche Ladung der Gesamtkomplex aufweisen
soll, in welchem Ausmaß Bindungs- und
Internalisierungsfähigkeit für den jeweiligen Zelltyp
gegeben ist und in welchem Ausmaß deren Steigerung
erwünscht bzw. erforderlich ist. Weitere Parameter für
die Zusammensetzung des Komplexes sind die
Zugänglichkeit des TZBPs für das
Zelloberflächenprotein, wobei dafür die Art maßgeblich
ist, wie dieses Protein innerhalb des Komplexes der
Zelle gegenüber präsentiert wird. Wesentlich ist
weiters die Zugänglichkeit der Nukleinsäure in der
Zelle, um deren bestimmungsgemäße Funktion auszuüben.
Die in nicht kovalent-gebundener Form in den Komplexen
gegebenenfalls enthaltenen Polykationen können gleich
oder verschieden sein von den im Konjugat enthaltenen.
Ein wesentliches Kriterium für deren Auswahl ist die
Größe der Nukleinsäure, insbesondere im Hinblick auf
deren Kondensierung; bei kleineren Nukleinsäure-
Molekülen ist im allgemeinen eine Kompaktierung nicht
erforderlich. Die Auswahl der Polykationen nach Art und
Menge wird außerdem auf das Konjugat abgestimmt, wobei
vor allem das im Konjugat enthaltene Polykation zu
berücksichtigen ist: ist das Polykation z. B eine
Substanz, die keine oder nur geringe Fähigkeit zur
DNA-Kondensation aufweist, ist es im Hinblick auf eine
effiziente Internalisierung der Komplexe im allgemeinen
zweckmäßig, solche Polykationen einzusetzen, die diese
Eigenschaft in stärker ausgeprägtem Maß besitzen. Ist
der das im Konjugat enthaltene Polykation selbst eine
Nukleinsäure kondensierende Substanz und wird bereits
eine im Hinblick auf effiziente Internalisierung
ausreichende Kompaktierung der Nukleinsäure bewirkt,
wird zweckmäßigerweise ein Polykation verwendet, das
aufgrund anderer Mechanismen eine Steigerung der
Expression bewirkt.
Wesentlich für das gegebenenfalls im Komplex zusätzlich
enthaltene nicht-kovalent gebundene Polykation ist
seine Fähigkeit, Nukleinsäure zu kondensieren und/oder
diese vor unerwünschtem Abbau in der Zelle zu schützen.
Gegenstand der Erfindung ist weiters ein Verfahren zum
Einführen von Nukleinsäure(n) in menschliche oder
tierische Zellen, wobei bevorzugt ein unter
physiologischen Bedingungen löslicher Antikörper-
Polykation/Nukleinsäure-Komplex mit den Zellen in
Berührung gebracht wird.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde als
DNA-Komponente das Luciferase-Gen als Reporter-Gen
verwendet. (Aufgrund von in Vorversuchen erhaltenen
Ergebnissen mit Transferrin-Polykation/DNA-Komplexen,
in denen das Luciferase-Gen als Reportergen verwendet
wurde, war gezeigt worden, daß aus der Effizienz des
Imports des Luciferase-Gens auf die Anwendbarkeit
anderer Nukleinsäuren geschlossen werden kann und die
verwendete Nukleinsäure in qualitativer Hinsicht kein
limitierender Faktor für die Anwendung von Protein-
Polykation-DNA-Komplexen ist.
Es kann für bestimmte Ausführungsformen der
vorliegenden Erfindung vorteilhaft sein, Bedingungen zu
schaffen, unter denen der Abbau der in die Zelle
importierten Nukleinsäure verringert oder ausgeschaltet
wird.
Bedingungen, unter denen der Abbau von Nukleinsäuren
inhibiert wird, können durch Zusatz sog. lysosomatroper
Substanzen geschaffen werden. Von diesen Substanzen ist
bekannt, daß sie die Aktivität von Proteasen und
Nukleasen in Lysosomen hemmen und somit den Abbau von
Nukleinsäuren verhindern können (Luthmann u. Magnusson,
1983).
Zu diesen Substanzen zählen Chloroquin, Monensin,
Nigericin, Ammoniumchlorid und Methylamin.
Das Erfordernis für die Anwendung einer Substanz aus
der Gruppe der lysosomatropen Substanzen im Rahmen der
vorliegenden Erfindung richtet sich u. a. nach dem zu
behandelnden Zelltyp oder bei Verwendung
unterschiedlicher Antikörper gegebenenfalls nach
unterschiedlichen Mechanismen, über die die Aufnahme
der Komplexe in die Zelle erfolgt. So wurde z. B. im
Rahmen der vorliegenden Erfindung eine unterschiedliche
Beeinflussung des DNA-Imports in die Zelle durch
Chloroquin bei Verwendung unterschiedlicher Antikörper
(monoklonale Anti-CD4-Antikörper) festgestellt.
Es ist in jedem Fall notwendig, das Erfordernis bzw.
die Eignung derartiger Substanzen im Rahmen der
vorliegenden Erfindung in Vorversuchen zu testen.
Gegenstand der Erfindung sind weiters pharmazeutische
Zubereitungen, enthaltend als wirksame Komponente eine
oder mehrere therapeutisch oder gentherapeutisch
wirksame Nukleinsäure(n), komplexiert mit einem
TZBP-Polykation-Konjugat (TZBP-Polykation-Konjugat und
Nukleinsäure können auch getrennt vorliegen und
unmittelbar vor der therapeutischen Anwendung
komplexiert werden).
Als therapeutisch wirksame Nukleinsäuren kommen die
bereits angeführten Antisenseoligonukleotide oder
Ribozyme bzw. die dafür kodierenden Gene oder für
trans-dominante Mutanten kodierende Gene in Betracht,
die inhibierende Wirkung auf in in den jeweiligen
Zielzellen enthaltene endogene oder exogene Gene oder
Genprodukte haben. Darunter sind z. B. diejenigen Gene
zu verstehen, die aufgrund ihrer Sequenzspezifität
(Komplementarität zu Zielsequenzen, Kodierung für
trans-dominante Mutanten (Herskowitz, 1987)) eine
intrazelluläre Immunität (Baltimore, 1988) gegen
HIV bewirken und bei der Therapie des AIDS-Syndroms
oder zur Verhinderung der Aktivierung des Virus nach
der Infektion verwendet werden können.
Die pharmazeutischen Zubereitungen können verwendet
werden, um im menschlichen oder tierischen Organismus
virale Sequenzen, z. B. HIV oder verwandte Retroviren zu
inhibieren. Ein Beispiel für die therapeutische
Anwendung durch Inhibierung eines verwandten Retrovirus
ist die Behandlung der proliferativen T-Zelleukämie,
die durch das HTLV-1 Virus hervorgerufen wird.
Neben der Behandlung viraler T-Zelleukämien kommt für
die Anwendung der vorliegenden Erfindung auch die
Therapie nicht-viraler Leukämien in Betracht. Die
Beteiligung von Onkogenen (abl, bcr, Ha, Ki, ras, rat,
c-myc, N-myc) an der Entstehung lymphatischer Leukämien
wurde in jüngster Zeit nachgewiesen; die Existenz
weiterer Onkogene wird aufgrund von beobachteten
spezifischen Chromosomentranslokationen für
wahrscheinlich erachtet. Die Klonierung dieser
Oncogene bietet die Grundlage für die Konstruktion
oncogen-inhibierender Nukleinsäuremoleküle und damit
für eine weitere therapeutische Einsatzmöglichkeit der
vorliegenden Erfindung.
Ein weiteres wichtiges Anwendungsgebiet ist die
Gentherapie. Prinzipiell können im Rahmen der
Gentherapie mit Hilfe der vorliegenden Erfindung all
diejenigen Gene bzw. Abschnitte davon in ein
T-Zelloberflächenprotein exprimierende Zielzellen
eingeführt werden, deren Expression in diesem Zelltyp
einen therapeutischen Effekt erzielt, z. B. durch
Substitution genetisch bedingter Defekte oder Auslösen
einer Immunantwort.
Obwohl das Schwergewicht in der Anwendung der Erfindung
auf Vertreter von Zellen der T-Lymphozyten-
Abstammungslinie gelegen ist, kann sie natürlich auch
auf Verteter anderer Zellspezies, sofern diese Zellen
das T-Zelloberflächenprotein exprimieren, angewendet
werden.
Fig. 1: Import von anti-CD4-Polylysin/pRSVL-Komplexen
in CD4+-CHO-Zellen
Fig. 2: Import von anti-CD4-Polylysin/pRSVL-Komplexen
in CD4+-CHO-Zellen
Fig. 3: Import von gp120-Polylysin/pRSVL-Komplexen in
CD4+ CHO-Zellen
Fig. 4: Import von gp120-Polylysin190/pRSVL-Komplexen,
enthaltend nicht-kovalent gebundenes
Poly(D)Lysin240, in CD4+ CHO-Zellen
Fig. 5. Import von gp120-Polylysin120/pRSVL-Komplexen
in CD4+ HeLa-Zellen
Fig. 6: Transfer und Expression von DNA in H9-Zellen
mittels antiCD7-Polylysin190-Konjugaten
Fig. 7: Transfektion von CD4+-Zellen mit Protein A-
Polylysin-Konjugaten
Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele
illustriert.
Die Kopplung erfolgte analog literaturbekannter
Methoden durch Einführung von Disulfidbrücken nach
Modifizierung mit Succinimidyl-Pyridyldithio-propionat
(SPDP, Jung et al., 1981).
Eine Lösung von 1,7 mg antiCD4-Antikörper (OKT4A,
Ortho Diagnostic Systems) in 50 mM
Natriumphosphatpuffer pH 7,8 wurde mit 11 µl 10 mM
ethanolischer Lösung von SPDP (Pharmacia) versetzt.
Nach 1 h bei Raumtemperatur wurde über eine Gelsäule
Sephadex G 25 filtriert (Eluens 100 mM HEPES-Puffer
pH 7,3), wobei 1,4 mg antiCD4, modifiziert mit 75 nmol
Pyridyldithiopropionatresten, erhalten wurden.
Poly(L)lysin 90 (durchschnittlicher Polymerisationsgrad
von 90 Lysinresten (Sigma), Fluoreszenzmarkierung
mittels FITC) wurde analog mit SPDP modifiziert und
durch Behandlung mit Dithiothreitol und nachfolgender
Gelfiltration in die mit freien Mercaptogruppen
modifizierte Form gebracht.
Eine Lösung von 38 nmol Polylysin 90, modifiziert mit
120 nmol Mercaptogruppen, in 0,5 ml 20 mM
Natriumacetatpuffer, wurde unter Sauerstoffausschluß
mit oben angeführtem modifiziertem antiCD4 gemischt und
über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die
Isolierung der Konjugate erfolgte durch Gelpermeations
chromatographie (Superose 12, 500 mM Guanidinium
hydrochlorid, pH 7,3); nach Dialyse gegen 25 mM HEPES
pH 7,3 wurden entsprechende Konjugate, bestehend aus
1,1 mg antiCD4-Antikörper, modifiziert mit
11 nmol Polylysin 90, erhalten.
Eine Lösung von 1,0 mg (6.25 nmol) antiCD4-Antikörper
(OKT4A, Ortho Diagnostic Systems) in 0,3 ml 50 mM HEPES
pH 7,8 wurde mit 37 µl 1 mM ethanolischer Lösung von
Succinimidyl-Pyridyldithio-propionat (SPDP, Pharmacia)
versetzt. Nach 1 h bei Raumtemperatur wurde über eine
Gelsäule Sephadex G 25 filtriert (Eluens 100 mM
HEPES-Puffer pH 7,9), wobei 0,85 mg (5,3 nmol) antiCD4,
modifiziert mit 30 nmol Pyridyldithiopropionatresten,
erhalten wurden. Poly(L)lysin190 (durchschnittlicher
Polymerisationsgrad von 190 Lysinresten (Sigma),
Fluoreszenzmarkierung mittels FITC) wurde analog mit
SPDP modifiziert und durch Behandlung mit
Dithiothreitol und nachfolgender Gelfiltration in die
mit freien Mercaptogruppen modifizierte Form gebracht.
Eine Lösung von 7,7 nmol Polylysin190, modifiziert mit
25 nmol Mercaptogruppen, in 0,13 ml 30 mM
Natriumacetatpuffer wurde unter Sauerstoffausschluß mit
oben angeführtem modifiziertem antiCD4 (in 0,5 ml
300 mM HEPES pH 7,9) gemischt und über Nacht bei
Raumtemperatur stehen gelassen. Das Reaktionsgemisch
wurde durch Zugabe von 5 M NaCl auf einen Gehalt von
ungefähr 0,6 M gebracht. Die Isolierung der Konjugate
erfolgte durch Ionenaustauschchromatographie (Mono S.
Pharmacia, 50 mM HEPES pH 7,3, Salzgradient 0,6 M bis
3 M NaCl); nach Dialyse gegen 10 mM HEPES pH 7,3 wurden
entsprechende Konjugate, bestehend aus 0,35 mg
(2,2 nmol) antiCD4-Antikörper, modifiziert mit
3,9 nmol Polylysin190, erhalten.
Die Koppelung erfolgte analog literaturbekannter
Methoden entweder durch Einführung von Disulfidbrücken
nach Modifizierung mit Succinimidyl-Pyridyldithio
propionat im Falle der antiCD4-Konjugate) oder durch
Thioether-Verknüpfung nach Modifizierung mit
6-Maleimidocapronsaeure-N-hydroxysuccinimidester
(EMCS, Sigma) (Fujiwara et al., 1981).
- a) Disulfidverknüpfte gp120-Polylysin 190-Konjugate:
Eine Lösung von 3 mg rekombinantem gp120 (hergestellt
nach der von Lasky et al., 1986, beschriebenen Methode)
in 50 mM HEPES pH 7,8 wurde mit 7 µl 10 mM
ethanolischer Lösung von SPDP versetzt. Nach 1 h bei
Raumtemperatur wurde über eine Gelsäule Sephadex G 25
filtriert (Eluens 100 mM HEPES-Puffer pH 7,9) und man
erhielt dabei 2,8 mg (23 nmol) rgp120, modifiziert mit
67 nmol Pyridyldithiopropionatresten.
Eine Lösung von 6,6 nmol Polylysin 190,
fluoreszenzmarkiert und wie oben für die
antiCD4-Konjugate beschrieben, modifiziert mit
23 nmol Mercaptogruppen, in 120 µl 30 mM Natriumacetat
wurde unter Sauerstoffausschluß mit dem modifizierten
rgp120 gemischt und über Nacht bei Raumtemperatur
stehen gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde durch
Zugabe von 5 M NaCl auf einen Gehalt von ungefähr
0,6 M gebracht. Die Isolierung der Konjugate erfolgte
durch Ionenaustauschchromatographie (Mono S. Pharmacia,
50 mM HEPES pH 7,3, Salzgradient 0,6 M bis 3 M NaCl);
nach Fraktionierung und Dialyse gegen 25 mM HEPES
pH 7,3 wurden zwei Konjugatfraktionen A und B,
bestehend aus 0,33 mg rgp120 modifiziert mit
1,3 nmol Polylysin 190 (im Falle der Fraktion A), bzw.
0,34 mg rgp120 modifiziert mit 3,2 nmol Polylysin 190
(Fraktion B) erhalten.
- a) Thioether-verknüpfte gp120-Polylysin 190-Konjugate:
Eine Lösung von 2 mg rekombinantem gp120 in 0,45 ml
100 mM HEPES pH 7,9 wurde mit 17 µl einer 10 mM Lösung
von EMCS in Dimethylformamid versetzt. Nach 1 h bei
Raumtemperatur wurde über eine Gelsäule Sephadex G 25
filtriert (Eluens 100 mM HEPES-Puffer 7,9). Die
Produktlösung (1,2 ml) wurde sogleich unter
Sauerstoffausschluß umgesetzt mit einer Lösung von
9,3 nmol Polylysin 190, fluoreszenzmarkiert und wie
oben (antiCD4-Konjugate) beschrieben modifiziert mit
30 nmol Mercaptogruppen (in 90 µl 30 mM Natriumacetat
pH 5,0), und über Nacht bei Raumtemperatur stehen
gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde durch Zugabe von
5 M NaCl auf einen Gehalt von ca. 0,6 M gebracht. Die
Isolierung der Konjugate erfolgte durch
Ionenaustauschchromatographie (Mono S. Pharmacia,
50 mM HEPES pH 7,3, Salzgradient 0,6 M bis 3 M NaCl);
nach Fraktionierung und Dialyse gegen 25 mM HEPES
pH 7,3 wurden drei Konjugatfraktionen A, B und C
erhalten, bestehend aus 0,40 mg rgp120 modifiziert mit
1,9 nmol Polylysin 190 (im Falle der Fraktion A), bzw.
0,25 mg rgp 120 modifiziert mit 2,5 nmol Polylysin 190
(Fraktion B), bzw. 0,1 mg rgp 120 modifiziert mit
1,6 nmol Polylysin 190 (Fraktion C).
Eine Lösung von 1,3 mg antiCD7-Antikörper (Immunotech)
in 50 mM HEPES pH 7,9 wurde mit 49 µl 1 mM
ethanolischer Lösung von SPDP (Pharmacia) versetzt.
Nach 1 h bei Raumtemperatur wurde über eine Gelsäule
Sephadex G 25 filtriert (Eluens 50 mM HEPES-Puffer
pH 7,9) wobei 1,19 mg (7,5 nmol) antiCD7, modifiziert
mit 33 nmol Pyridyldithiopropionatresten, erhalten
wurden. Poly(L)lysin190, Fluoreszenzmarkierung mittels
FITC, wurde analog mit SPDP modifiziert und durch
Behandlung mit Dithiothreitol und nachfolgender
Gelfiltration in die mit freien Mercaptogruppen
modifizierte Form gebracht.
Eine Lösung von 11 nmol Polylysin190, modifiziert mit
35 nmol Mercaptogruppen, in 0,2 ml 30 mM
Natriumacetatpuffer wurde unter Sauerstoffausschluß mit
oben angeführtem modifiziertem antiCD7 (in 0,5 ml
300 mM HEPES pH 7,9) gemischt und über Nacht bei
Raumtemperatur stehen gelassen. Das Reaktionsgemisch
wurde durch Zugabe von 5 M NaCl auf einen Gehalt von
ungefähr 0,6 M gebracht. Die Isolierung der Konjugate
erfolgte durch Ionenaustauschchromatographie (Mono S.
Pharmacia, 50 mM HEPES pH 7,3, Salzgradient 0,6 M bis
3 M NaCl); nach Dialyse gegen 10 mM HEPES pH 7,3 wurden
entsprechende Konjugate, bestehend aus 0,51 mg
(3,2 nmol) antiCD7-Antikörper, modifiziert mit
6,2 nmol Polylysin190, erhalten.
Die Komplexe wurden hergestellt, indem verdünnte
Lösungen von DNA (30 µg/ml oder weniger in 150 mM NaCl,
20 mM HEPES pH 7,3) mit den in den vorangegangenen
Beispielen erhaltenen Antikörper-Polylysin-Konjugaten
(100 µg/ml oder weniger) vermischt wurden. Als
DNA wurde pRSVL Plasmid-DNA (De Wet et al., 1987)
verwendet, hergestellt mittels Triton-X Lyse Standard-
Methode (Maniatis, 1982), gefolgt von CsCl/EtBr
Gleichgewichtsdichtegradienten-Zentrifugation,
Entfärbung mit Butanol-1 und Dialyse gegen 10 mM
Tris/HCl pH 7,5, 1 mM EDTA.
Um ein Ausfällen der DNA-Komplexe zu verhindern, wurde
phosphatfreier Puffer verwendet (Phosphate verringern
die Löslichkeit der Konjugate).
In diesem und den folgenden Beispielen wurde Plasmid-
DNA, enthaltend das Photinus pyralis-Luciferase-Gen als
Reporter-Gen, verwendet, um Gentransfer und Expression
zu untersuchen. In den Figuren, die die Ergebnisse der
Versuche darstellen, beziehen sich die dargestellten
Werte für die Luciferase-Aktivität auf die Aktivität
der gesamten Zellprobe.
CD4+ CHO-Zellen (Lasky et al., 1987) wurden zu
5 × 105 Zellen pro T-25-Flasche in Ham's F-12-Medium
(Ham, 1965) plus 10% FCS (fötales Kälberserum)
ausgesät.
18 h später wurden die Zellen zweimal mit Ham's
F-12-Medium ohne Serum gewaschen und in diesem Medium
(5 ml) 5 h lang bei 37°C bebrütet.
Anti-CD4-Polylysin/pRSVL Komplexe wurden bei
Endkonzentrationen von DNA von 10 µg/500 µl in
150 mM NaCl, 20 mM HEPES pH 7,5 hergestellt, wie in
Beispiel 5 beschrieben. Anti-CD4-Polylysin 90
(8,4 nmol Polylysin90/mg anti-CD4) wurde in den
angegebenen Masse-Verhältnissen (von 1,9 bis 8,1,
ausgedrückt als Masse von anti-CD4) eingesetzt. In den
Proben 1-4 wurden die Komplexe den Zellen in Ham's
F-12-Medium ohne Serum, enthaltend 100 µM Chloroquin
zugefügt; in den Proben 5 und 6 wurde Chloroquin
weggelassen. Nach einer 4stündigen Inkubation wurden
die Zellen zweimal mit Medium plus 10% FCS gewaschen
und in diesem Medium inkubiert. In den Proben 5 und
6 wurde dasselbe Volumen an Serum enthaltendem Medium
zu den Zellen gefügt. Nach 20 h wurden alle Zellen mit
frischem, Serum enthaltendem Medium gewaschen und 48 h
später geerntet. Aliquots von Extrakten (ca. 1/5 jeder
Probe, entsprechend gleicher Proteinmenge, wurden auf
Luciferase-Aktivität untersucht (De Wet et al., 1987).
Die Bioluminiszenz wurde unter Verwendung des
Clinilumats (Berthold, Wildbach, BRD) gemessen. Das
Ergebnis dieser Untersuchungen ist in Fig. 1
dargestellt. Es zeigte sich, daß DNA mit Hilfe der
erfindungsgemäßen Konjugate in CD4+-Zellen importiert
wird und die importierte DNA exprimiert wird, wobei
die Effizienz des DNA-Imports proportional dem
anti-CD4/Polylysin-Gehalt ist.
Zunächst wurden CD4+ CHO-Zellen gezüchtet, wie in
Beispiel 6 angegeben. Konjugat/DNA -Komplexe,
hergestellt wie in Beispiel 5 angegeben,
enthaltend 10 µg pRSVL und entweder einen 2 : 1 oder
3 : 1 Massenüberschuß an antiCD4-Polylysin 90
(s. Beispiel 1) oder gp120-Polylysin (s. Beispiel 3),
wie in Fig. 2 angegeben, wurden in Abwesenheit oder
Gegenwart von 100 µM Chloroquin den Zellen hinzugefügt.
Nach weiteren 4 h bei 37°C wurden die Proben mit
Chloroquin zweimal mit Ham's Medium, enthaltend
10% fötales Kälberserum gewaschen, während den Proben
ohne Chloroquin 5 ml desselben Mediums zugefügt wurden.
Die Zellen wurden weitere 20 h bei 37°C inkubiert und
Aliquots auf Luciferaseaktivität untersucht, wie in
Beispiel 6 angegeben. Das Ergebnis dieser Versuche
zeigt Fig. 2.
- a) Herstellung von gp120-Polylysin/DNA-Komplexen
Die Komplexe wurden hergestellt, indem zunächst
6 µg DNA in 330 µl HBS bei Raumtemperatur verdünnt
wurden (100 µg/ml oder weniger). Als DNA wurde
pRSVL Plasmid-DNA verwendet (vgl. Beispiel 5). Aliquots
der gp120-pL190 Konjugate (die Mengen sind in Fig. 3
angegeben) wurden in 170 µl HBS verdünnt. Die jeweilige
Konjugatverdünnung wurde rasch der DNA-Verdünnung
hinzugefügt, 30 min inkubieren gelassen und
anschließend für die Transfektion verwendet.
- a) Transfektion von CD4+ Zellen
CD4+ CHO-Zellen (Lasky et al., 1987) wurden zu
6 × 105 Zellen pro T-25-Flasche in Ham's F-12-Medium
(Ham, 1965) plus 10% FCS (fötales Kälberserum)
ausgesät.
18 h später wurden die Zellen zweimal mit
Ham's F-12-Medium ohne Serum gewaschen und in diesem
Medium (5 ml) 5 h lang bei 37°C bebrütet. Darauf hin
wurden die Lösungen der gp120-pL/pRSVL Komplexe den
Zellen beigegeben. Nach 4 Stunden wurde ein gleiches
Volumen DME-Medium (Dulbecco's modified Eagle's Medium)
mit einem Gehalt von 10% fötalem Kälberserum zu jeder
Probe gegeben. Nach 24 Stunden wurden die Zellen
geerntet, Extrakte hergestellt und Aliquots
entsprechend gleichem Proteingehalt (ca. 1/5 des
Gesamtmaterials) wie in den vorigen Beispielen auf
Luciferaseaktivität untersucht. Die in Fig. 3
angegebenen Werte entsprechen der Luciferaseaktivität
von 6 × 105 Zellen. Es wurde festgestellt, daß die
Aktivität der gp120-pL Konjugate vom Verhältnis der
Komponenten abhängt, wobei größere Aktivität bei den
Konjugaten mit niedrigem gp120 : Polylysin-Verhältnis
(Fraktion C, Spuren 5 und 6) und eine sehr geringe oder
keine Aktivität bei der Fraktion mit einem hohen
gp120 : Polylysin-Verhältnis (Fraktion A,
Spuren 1 und 2) festgestellt wurde.
Diejenigen gp120-pL Konjugate, die im Beispiel 8
schlechte Ergebnisse bei der Transfektion gezeigt
hatten (Fraktionen A und B) wurden daraufhin
untersucht, ob ein Zusatz von freiem Polylysin die
DNA-Aufnahme verbessern kann. Es wurden 6 µg DNA und
12 µg Konjugat verwendet, wobei dem Konjugat jeweils
vor der Komplexierung mit DNA 1 oder 3 µg Polylysin240
zugesetzt wurden. Übereinstimmend mit den für die
Transferrin-Konjugate erhaltenen Ergebnissen wurde eine
starke Zunahme der Luciferase-Aktivität (260-fach oder
5,2-fach) beobachtet (Fig. 4).
CD4+HeLa Zellen (Maddon et al., 1986) oder normale
HeLa-Zellen als Kontrolle in DME-Medium plus 10% FCS
wurden zu 6 × 105 Zellen pro T25-Flasche ausgesät und
anschließend gezüchtet, wie in Beispiel 6 für
CHO-Zellen angegeben.
Die Zellen wurden mit gp120-Polylysin/pRSVL-Komplexen
bei den angegebenen Konjugat/DNA-Verhältnissen (Fig. 5)
in Berührung gebracht (bei den gp120-Polylysin-
Konjugaten A, B und C handelt es sich um drei
Fraktionen einer Mono S-Auftrennung des konjugierten
Materials aus Beispiel 3b)). Das molare
gp120 : Polylysin-Verhältnis jeder Fraktion ist in
der Figur angegeben. Nach 4stündigem Kontakt mit den
Konjugaten in Abwesenheit von Serum wurde Serum
enthaltendes Medium zugesetzt und die Zellen nach
20 h geerntet.
Aus den Zellextrakten wurden Aliquots, standardisiert
auf gleichen Proteingehalt, auf Luciferase-Aktivität
untersucht. Die in der Figur angegebenen Werte
entsprechen der Luciferase-Aktivität von 6 × 105 Zellen,
transfiziert mit 6 µg DNA.
- a) Zellen der T-Zellinie H9 (Mann et al., 1989) wurden in RPMI 1640 Medium, ergänzt mit 20% FCS, 100 Einheiten/ml Penicilin, 100 µg/ml Streptomycin und 1 mM Glutamin gezüchtet. Unmittelbar vor der Transfektion wurden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt und zu 100.000 Zellen/ml in frisches Medium aufgenommen (1,000.000 Zellen pro Probe) die zur Transfektion verwendet wurden. Zum Vergleich mit antiCD7-Konjugaten wurden Transferrin-Konjugate verwendet. Transferrin-Polylysin-Konjugate wurden hergestellt, wie in der EP-A 1 388 758 beschrieben; als antiCD7-Konjugate wurden die in Beispiel 4 beschriebenen verwendet. Die Komplexierung mit DNA wurde vorgenommen, wie in Beispiel 5 angegeben. Für die transiente Transfektion in H9-Zellen wurde als DNA das Plasmid pHLuci verwendet, das die HIV-LTR-Sequenz, verbunden mit der für Luciferase kodierenden Sequenz, gefolgt von der SV40-Intron/polyA-Stelle, enthält: Das HindIII-Fragment, enthaltend das Protease 2A-Gen, von pHIV/2A (Sun und Baltimore, 1989) entfernt und durch ein HindIII/SmaI-Fragment von pRSVL (De Wet et al., 1987), enthaltend die für Luciferase kodierende Sequenz, ersetzt. Die beiden Fragmente wurden über die HindIII-Stellen (nach Herstellen glatter Enden mittels Klenow-Fragment) verbunden und dann über die glatte SMA1-Stelle mit der nunmehr glatten Hindlil-Stelle verbunden. Ein Klon mit der richtigen Orientierung der Luciferase-Gensequenz wurde ausgewählt. Dieses Plasmid benötigt für starke Transkriptionsaktivität das TAT-Gen-Produkt. Dieses wird durch Co-Transfektion mit dem Plasmid pCMVTAT, welches für das HIV-TAT-Gen unter der Kontrolle des CMV immediate early promoter kodiert (Jakobovits et al., 1990) bereitgestellt. Die für die Transfektion verwendeten DNA-Komplexe enthielten eine Mischung von 5 µg pHLuci und 1 µg pCMVTAT. Die DNA/Polykation-Komplexe (500 µl) wurden zu der 10 ml Zellprobe hinzugegeben und 4 h lang in Gegenwart von 100 µM Chloroquin inkubiert. Anschließend wurden die Zellen in frisches Medium gewaschen, 40 h später geerntet und auf Luciferase-Aktivität untersucht, wie in den vorangegangenen Beispielen angegeben. Die Ergebnisse (in Luciferase-Lichteinheiten) sind in Fig. 6 dargestellt: Es zeigte sich, daß die Luciferase- Aktivität mit steigenden Mengen von antiCD7-Polylysin- Konjugat, komplexiert mit 6 µg DNA, zunimmt (Proben 1, 2 und 3). Eine weitere Steigerung der Aktivität wurde beobachtet, wenn 6 µg Konjugat zusammen mit 1 µg freiem Polylysin zur Komplexbildung verwendet wurden (Probe 4), ein weiterer Zusatz von Polylysin beeinträchtigte den Gen-Transport (Probe 5). (Die mit Transferrin-Polylysin-Konjugaten durchgeführten Vergleichsversuche sind mit 6 und 7 bezeichnet.)
- b) Eine weitere Versuchsreihe zur Transfektion mit Hilfe der Antikörper-Konjugate wurde unter Verwendung des Plasmids pSSTNEO durchgeführt. Dieses Plasmid, das ein Neomycin-Resistenz-Gen als Marker enthält, wurde unter Verwendung von antiCD4-, antiCD7- und (zum Vergleich) Transferrin-Polylysin190-Konjugaten in H9-Zellen eingeführt (es wurden 6 µg DNA pro 106 Zellen verwendet; die optimalen Transfektionsbedingungen waren in Vorversuchen mit Hilfe transienter Luciferase - Assays ermittelt worden). Das Plasmid pSSTNEO enthält das große Sst-Fragment des pUCu-Locus (Collis et al., 1990), der die HSV TK-neo-Einheit enthält. Ein 63 bp-Fragment, enthaltend eine einzige NdeI-Stelle war in die Asp718-Stelle eingeführt worden. Aliquots der transfizierten Zellen (enthaltend eine definierte Zellzahl) wurden daraufhin in ein halbfestes Methylcellulose-Medium, enthaltend 1000 µg/ml G418, verdünnt. Dazu wurden Aliquots der Zellen 3 Tage nach Transfektion mit DNA, enthaltend den Neomycin-Marker, in ein halbfestes Medium, das zusätzlich zu den normalen Anforderungen 0,5-1 mg/ml G418 und 20 mg/ml Methylcellulose enthielt, ausplattiert. (Zur Herstellung des halbfesten Selektionsmediums wurde unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 20 g Methylcellulose in 460 ml Wasser hergestellt.) Daraufhin wurden 500 ml doppelt konzentriertes, ergänztes Nährmedium, ebenfalls hergestellt unter sterilen Bedingungen, mit der Methylcellulose-Lösung vereinigt, das Volumen auf 1 l gebracht und das Medium über Nacht bei 4°C gerührt. 50 ml Aliquots dieses Mediums wurden, gegebenenfalls nach Lagerung bei -20°C, mit je 10 ml Serum versetzt und das Volumen mit Komplettmedium ohne Serum auf 100 ml gebracht. In diesem Schritt wurde G418 hinzugefügt. Ein 2,5 ml Aliquot des Methylcellulose-Mediums wurde mit einem 50 bis 100 µl Aliquot der Zellsuspension vermischt und ca. 1 ml dieser Mischung in Kulturschalen ausgegossen. Die Bebrütung erfolgte bei 37°C unter CO2-Atmosphäre. Ca. 10 bis 14 Tage später wurden die G418-resistenten Zellen gezählt (nur Kolonien mit mehr als 200 Zellen wurden als positiv gewertet). Die Ergebnisse sind in Fig. 4 dargestellt (es ist die Zahl von G418 resistenten Kolonien/1000 Zellen 10 Tage nach Einbringen in das Antibiotika-Medium aufgetragen).
Eine Lösung von 4,5 mg Protein-A (Pierce, No. 21182,
107 nmol) in 0,5 ml 100 mM HEPES pH 7,9 wurde mit
30 µl 10 mM ethanolischer Lösung von SPDP (Pharmacia)
versetzt. Nach 2 h bei Raumtemperatur wurde über eine
Gelsäule Sephadex G 25 filtriert (Eluens 50 mM
HEPES-Puffer pH 7,9) wobei 3,95 mg (94 nmol) Protein-A,
modifiziert mit 245 nmol Pyridyldithiopropionatresten,
erhalten wurden. Poly(L)lysin190, Fluoreszenzmarkierung
mittels FITC, wurde analog mit SPDP modifiziert und
durch Behandlung mit Dithiothreitol und nachfolgender
Gelfiltration in die mit freien Mercaptogruppen
modifizierte Form gebracht.
Eine Lösung von 53 nmol Polylysin190, modifiziert mit
150 nmol Mercaptogruppen, in 0,8 ml 30 mM
Natriumacetatpuffer wurde unter Sauerstoffausschluß mit
oben angeführtem modifiziertem Protein-A gemischt und
über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das
Reaktionsgemisch wurde durch Zugabe von 5 M NaCl auf
einen Gehalt von ungefähr 0,6 M gebracht. Die
Isolierung der Konjugate erfolgte durch
Ionenaustauschchromatographie (Mono S. Pharmacia,
50 mM HEPES pH 7,3, Salzgradient 0,6 M bis 3 M NaCl);
nach Fraktionierung und Dialyse gegen 25 mM HEPES
pH 7,3 wurden zwei Konjugatfraktionen A und B,
bestehend aus 1,15 mg (27 nmol) Protein-A, modifiziert
mit 5 nmol Polylysin190 (im Falle der Fraktion A)
bzw. 2,6 mg (6,2 nmol) Protein-A, modifiziert mit
40 nmol Polylysin190 (Fraktion B), erhalten.
Die Komplexe mit DNA wurden analog Beispiel 5
hergestellt.
CD4-exprimierende HeLa-Zellen (s. Beispiel 10) wurden
zu 6 × 105 Zellen/T25-Flasche ausgesät und anschließend
in DME-Medium plus 10% FCS gezüchtet. Wo in Fig. 7
angegeben, wurden die Zellen mit dem Antikörper
(anti-CD4gp55kD, IOT4, Immunotech) (3 µg/Probe)
1 h lang bei Raumtemperatur vorinkubiert. In der
Zwischenzeit wurden Protein A-Polylysin190/DNA-Komplexe
in 500 µl HBS, enthaltend 6 µg pRSVL und die
angegebenen Mengen Protein A-Polylysin190 plus
zusätzliches freies Polylysin, wie in Beispiel 5
hergestellt. Nach Ende der 1stündigen Inkubation wurden
die Zellen in 4,5 ml frisches Medium gegeben und die
500 µl DNA-Probe bei 37°C zu den Zellen zugegeben. Nach
4 h wurden diejenigen Proben, die 100 µM Chloroquin
enthielten (Proben 9-12) in frisches Medium gewaschen,
während die Proben 1-8 bis zur Ernte mit der DNA
inkubiert wurden. Für den Luciferase-Assay wurden die
Zellen 20 h später geerntet. Die Ergebnisse der
Versuche sind in Fig. 7 dargestellt. Es zeigte sich,
daß die Luciferase-Aktivität von der Gegenwart von
Protein A-Polylysin im DNA-Komplex abhängig war
(Proben 1-4, 5, 6). Bei den Proben 5-8, 11, 12 wurde
DNA-Transport mittels des Protein A-Komplexes ohne
Antikörper-Vorbehandlung nachgewiesen; der DNA-Import
wurde jedoch um ca. 30% gesteigert, wenn die Zellen
mit dem Antikörper, der das Zelloberflächenprotein CD4
erkennt, vorbehandelt wurden (Proben 1-4, 9, 10). Es
wurde weiters festgestellt, daß die Anwesenheit von
Chloroquin keine Steigerung der DNA-Expression
hervorruft (vgl. die Proben 1-8 mit den Proben 9-12).
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Yang N. S. et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9568-9572
Zamecnik et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 4143
Zon G., 1988, Pharmaceut. Research 5, No. 9, 539-549
Claims (41)
1. Neue Protein-Polykation-Konjugate, die befähigt
sind, mit Nukleinsäuren oder Nukleinsäureanalogen
lösliche Komplexe zu bilden, die in menschliche
oder tierische Zellen aufgenommen werden, dadurch
gekennzeichnet, daß der Proteinanteil der Konjugate
ein Protein mit der Fähigkeit ist, an ein von
Zellen der T-Zell-Abstammungslinie exprimiertes
Zelloberflächenprotein zu binden, so daß die
gebildeten Komplexe in Zellen, die das
T-Zelloberflächenprotein exprimieren, aufgenommen
werden.
2. Konjugate nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß ihr Proteinanteil ein Antikörper bzw. ein
Fragment davon ist, gerichtet gegen das
T-Zelloberflächenprotein.
3. Konjugate nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
daß ein Antikörper ein monoklonaler ist.
4. Konjugate nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch
gekennzeichnet, daß sie ein Protein mit der
Fähigkeit enthalten, an CD4 zu binden.
5. Konjugate nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
daß sie einen monoklonalen Anti-CD4-Antikörper bzw.
das Fragment davon enthalten, das ein gp120
bindendes Epitop aufweist.
6. Konjugate nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
daß sie als Protein HIV-1 gp120 bzw. ein homologes
Protein verwandter Retroviren oder ein Fragment
davon enthalten, das an CD4 bindet.
7. Konjugate nach Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, daß sie ein Protein enthalten, das
an einen auf T-Zellen exprimierten Tumormarker
bindet.
8. Konjugate nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet,
daß sie ein Protein enthalten, das an CD7 bindet.
9. Konjugate nach einem der Ansprüche 2, 3, 5, 7
oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen
Antikörper in direkt an das Polykation gekoppelter
Form enthalten.
10. Konjugate nach einem der Ansprüche 2, 3, 5, 7
oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen
Antikörper in über an Polykation gekoppeltes
Protein A gebundener Form enthalten.
11. Protein A-Polykation-Konjugate zur Herstellung von
Antikörper-Konjugaten nach Anspruch 10.
12. Konjugate nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß das Polykation ein Protamin ist.
13. Konjugate nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß das Polykation ein Histon ist.
14. Konjugate nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß das Polykation ein synthetisches homologes oder
heterologes Polypeptid ist.
15. Konjugate nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet,
daß das Polypeptid Polylysin ist.
16. Konjugate nach einem der Ansprüche 12 bis 15,
dadurch gekennzeichnet, daß das Polykation ca. 20
bis 500 positive Ladungen aufweist.
17. Konjugate nach einem der Ansprüche 12 bis 16,
dadurch gekennzeichnet, daß das molare Verhältnis
T-Zell-bindendes Protein : Polykation etwa 10 : 1 bis
1 : 10 beträgt.
18. Neue Protein-Polykation/Nukleinsäure-Komplexe, die
in menschliche oder tierische Zellen aufgenommen
werden, dadurch gekennzeichnet, daß der
Proteinanteil der Konjugate ein Protein mit der
Fähigkeit ist, an ein von Zellen der T-Zell-
Abstammungslinie exprimiertes
Zelloberflächenprotein zu binden, so daß die
gebildeten Komplexe in Zellen, die das
T-Zelloberflächenprotein exprimieren, aufgenommen
werden.
19. Komplexe nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet,
daß sie als Konjugat-Anteil eines der in den
Ansprüchen 1 bis 10 oder 12 bis 17 definierten
Konjugate enthalten.
20. Komplexe nach einem der Ansprüche 18 oder 19,
dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich ein
nicht-kovalent gebundenes Polykation, das
gegebenenfalls identisch ist mit dem Polykation des
Konjugats, derart enthalten, daß die durch das
Konjugat erzielte Internalisierung und/oder
Expression der Nukleinsäure gesteigert wird.
21. Komplexe nach einem der Anspruche 18 bis 20,
dadurch gekennzeichnet, daß sie eine
virusinhibierende Nukleinsäure enthalten.
22. Komplexe nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet,
daß sie eine Nukleinsäure enthalten, die
Replikation und Expression des HIV-1 Virus oder
verwandter Retroviren inhibiert.
23. Komplexe nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet,
daß die inhibierende Nukleinsäure Komplementarität
zu Sequenzen des HIV-1-Genoms aufweist.
24. Komplexe nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet,
daß die Nukleinsäure Komplementarität zu Sequenzen
des tat-Gens aufweist.
25. Komplexe nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet,
daß die Nukleinsäure Komplementarität zu Sequenzen
des rev-Gens aufweist.
26. Komplexe nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet,
daß die Nukleinsäure Komplementarität zu Sequenzen
des nef-Gens aufweist.
27. Komplexe nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet,
daß die Nukleinsäure Komplementarität zu
LTR-Sequenzen aufweist.
28. Komplexe nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet,
daß die Nukleinsäure Komplementarität zur
tar-Sequenz aufweist.
29. Komplexe nach einem der Ansprüche 21 bis 28,
dadurch gekennzeichnet, daß sie eine inhibierende
Nukleinsäure in Form eines Ribozyms, gegebenenfalls
zusammen mit einer Carrier-RNA, bzw. des dafür
kodierenden Gens enthalten.
30. Komplexe nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet,
daß sie eine Nukleinsäure in Form einer genetischen
Einheit, bestehend aus einem tRNA-Gen als Carrier-
Gen und einem innerhalb dieses Gens angeordneten
Ribozym-Gen, enthalten.
31. Komplexe nach einem der Ansprüche 21 bis 28,
dadurch gekennzeichnet, daß sie eine inhibierende
Nukleinsäure in Form eines Antisense-
Oligonukleotids enthalten.
32. Komplexe nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet,
daß sie eine Nukleinsäure, kodierend für ein
Virusprotein, das eine trans-dominante Mutation
aufweist, enthalten.
33. Komplexe nach einem der Ansprüche 18 bis 20,
dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Oncogen
inhibierende Nukleinsäure enthalten.
34. Komplexe nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet,
daß sie eine Oncogen-inhibierende Nukleinsäure in
Form eines Ribozyms, gegebenenfalls zusammen mit
einer Carrier-RNA, bzw. des dafür kodierenden Gens
enthalten.
35. Komplexe nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet,
daß sie eine Oncogen-inhibierende Nukleinsäure in
Form eines Ribozyms, gegebenenfalls zusammen mit
einer Carrier-RNA, bzw. des dafür kodierenden Gens
enthalten.
36. Komplexe nach einem der Ansprüche 18 bis 20,
dadurch gekennzeichnet, daß sie als Nukleinsäure
ein therapeutisch oder gentherapeutisch wirksames
Gen bzw. einen Genabschnitt enthalten.
37. Verfahren zum Einführen von Nukleinsäure in Zellen,
die ein T-Zelloberflächenprotein exprimieren, wobei
man aus einem der in Ansprüchen 1 bis 10 oder 12
bis 17 definierten Protein-Polykation-Konjugat und
Nukleinsäure(n) einen der in den Ansprüchen 18 bis
36 definierten Komplexe bildet und Zellen, die das
T-Zelloberflächenprotein exprimieren, mit diesem
Komplex in Berührung bringt.
38. Verfahren nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet,
daß man den Komplex in Gegenwart von nicht-kovalent
gebundenem Polykation bildet.
39. Verfahren nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet,
daß man die Zellen mit dem Komplex unter
Bedingungen in Berührung bringt, unter denen der
Abbau von Nukleinsäure in der Zelle inhibiert wird.
40. Verfahren nach Anspruch 37, wobei man aus einem
Protein A-Polykation-Konjugat, bestehend aus
Protein A und einem der in den Ansprüchen 12 bis 16
definierten Polykationen und einer der in den
Ansprüchen 21 bis 36 definierten Nukleinsäuren
einen Komplex bildet und in Gegenwart eines
Antikörpers, gerichtet gegen ein
T-Zelloberflächenprotein, mit Zellen, die dieses
Oberflächenprotein exprimieren, in Berührung
bringt, wobei der Antikörper an den Konjugat-Anteil
des Komplexes gebunden wird.
41. Pharmazeutische Zubereitung, enthaltend als
wirksame Komponente eine oder mehrere therapeutisch
oder gentherapeutisch wirksame Nukleinsäure(n) in
Form eines der in den Ansprüchen 18 bis 36
definierten Komplexe.
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EP0388758A1 (de) * | 1989-03-16 | 1990-09-26 | BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GmbH | Neue Protein-Polykation-Konjugate |
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- 1991-03-29 DE DE4110410A patent/DE4110410C2/de not_active Expired - Fee Related
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