JP3222461B2 - 新規タンパク質―ポリカチオン結合体 - Google Patents

新規タンパク質―ポリカチオン結合体

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JP3222461B2 JP50847191A JP50847191A JP3222461B2 JP 3222461 B2 JP3222461 B2 JP 3222461B2 JP 50847191 A JP50847191 A JP 50847191A JP 50847191 A JP50847191 A JP 50847191A JP 3222461 B2 JP3222461 B2 JP 3222461B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒト又は動物の細胞中に核酸を輸送するた
めの新規タンパク質−ポリカチオン結合体に関する。
近年、治療に活性な物質としての核酸の重要性がます
ます高まってきた。
アンチセンスRNA及びDNAは、特定の遺伝子配列を選択
的に阻害する効果的な薬剤であることが証明されてい
る。これらの活性方法は、in vivoにおいて特定の遺伝
子（例えば規則性が解かれた腫瘍遺伝子又はウイルス遺
伝子）の発現を阻害する治療用薬剤としてそれらを使用
できるようにすることである。核酸の強い負電荷のた
め、細胞膜を通って行われるそれらの吸収が部分的に限
られるので、たとえ細胞内のそれらの濃度は低くとも、
短いアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞内へ移入
し、その中でそれらの阻害活動を行える（ザメニック
（Zamecnik）ら、1986年）ことが既に示されてきた。
選択的に遺伝子を阻害する他の方法としては、リボザ
イムの適用がある。細胞への輸送が制限要因の一つであ
るため、細胞中で可能な限り高い濃度の活性なリボザイ
ムをここで再び保証する必要がある。
治療用使用における制限要因の一つである生きている
細胞への核酸の輸送を改善するために既に多くの解決法
が提案されている。。
これらの可能な解決法の一つは、直接核酸を修飾する
こと、例えば電荷を帯びたホスホジエステル基を電荷を
帯びていない基と置換することである。直接的な修飾の
他の可能な方法は、ヌクレオシド類似体を使用すること
である。
これらの提案のいくつかは、問題を解決するための理
論的に見込みのあるアプローチを表しているが、それら
は様々な不利益、例えば標的分子への結合性の低下、不
十分な阻害効果及び多分毒性を示す。
オリゴヌクレオチドの直接的な修飾に対する代替えと
してのアプローチには、オリゴヌクレオチドそれ自体に
電荷を帯びさせないこと、及び必要とされる性質をそれ
に与える基、例えば細胞への輸送を容易にする分子と共
にそれを提供することがある。
遺伝子を阻害することに加えて、遺伝子治療で生きて
いる細胞に核酸を導入するための効果的なシステムも必
要性とされる。このため、in vivoにおいて治療に活性
な遺伝子産物の合成を達成するため、例えば遺伝子欠損
の場合に不完全な遺伝子を置換するために遺伝子を細胞
にしまい込む。遺伝子治療が有望なアプローチを構成す
る、遺伝学的に引き起こされる疾病への可能な使用の例
としては、血友病、β−地中海貧血、“重症複合免疫不
全症”（SCID）及び遺伝学的に引き起こされる酵素アデ
ノシンデアミナーゼの欠乏により引き起こされる症候群
があげられる。この“慣用の”遺伝子治療は、一回の処
置により永久的な治療を達成するという原理に基づいて
いる。しかしながら、治療に効果的なDNA（又はmRNA）
が、必要に応じて一回又は繰り返して薬（“遺伝子治療
剤”）のように投与される治療方法も必要性とされる。
この原理に関して可能な適用は、接種により分泌された
タンパク質抗原又は非分泌タンパク質抗原をコードする
機能的な核酸の投与により、体液性又は細胞性免疫が達
成されるという免疫の調節をすることである。遺伝子欠
損の例としては、筋ジストロフィー（ジストロフィン
（dystrophin）遺伝子）、膵嚢胞性繊維炎（輸送膜調節
遺伝子）及び高コレステロール血（HDLレセプター遺伝
子）があげられ、そこで欠損遺伝子をコードする核酸は
個々の要求に適合するような形態に処理され得る。遺伝
子治療による治療方法は体内で合成される細胞毒性又は
免疫調節活性（immunomodulating activity）のあるホ
ルモン、成長因子又はタンパク質にとって非常に意味の
ある方法である。
遺伝子治療における核酸の使用にこれまで最も発展し
てきた科学技術は、細胞への遺伝子の輸送にレトロウイ
ルス系を使用することである（ウイルソン（Wilson）
ら、1990年、カシッド（Kasid）ら、1990年）。しかし
ながら、少なくともわずかの割合で、例えばウイルスの
感染（内因性ウイルスの組み換え、あるいは次に起こる
病原型への可能な突然変異による）又は癌の形成による
副作用の危険性を含むので、レトロウイルスの使用は問
題がある。さらに、レトロウイルスにより達成されるよ
うな患者の体細胞の安定な形質転換はすべての場合にお
いて要求されるのではない。それは、例えば、もし副作
用が起こったならば回復するための治療をより困難にす
るかもしれないということのみが理由である。
それゆえに、細胞における非複製DNAの発現を可能に
する代替えの方法の探索がなされてきた。
in vitroにおいて哺乳類の細胞の遺伝子形質転換に関
して様々な公知技術があるが、in vivoでのそれらの使
用は制限される（それらには、リポソーム、エレクトロ
ポレーション（electroporation）、マイクロインジェ
クション、細胞融合、DEAE−デキストラン又はリン酸カ
ルシウム沈殿法によるDNAの導入があげられる）。
in vivoにおける遺伝子の転移に関する方法を開発す
るための近年の努力は、カチオン性脂質薬剤のリポフェ
クチン（lipofectin）の使用に集中されてきた；この薬
剤により注入されたプラスミドは、体内での発現が可能
なことが示されてきた（ナベル（Nabel）ら、1990
年）。
近年に開発された他の方法では、DNAを吸収したタン
グステン又は金のミクロ粒子が使用され、そこで細胞を
高エネルギーで攻撃できる（ジョンストン（Johnsto
n）、1990年、ヤング（Yang）ら、1990年）。DNAの発現
は、様々な組織で示されてきた。
標的とされる方法において、細胞中にDNAを輸送する
ためのin vivoで使用できる可溶性の系（システム）
は、肝細胞に関して開発され、そして、それは肝細胞表
面に提供されるレセプターが反応する糖タンパク質へポ
リリジンをカップリングする原理に基づいている。その
後、DNAを添加し、可溶性糖タンパク質／ポリリジン/DN
A複合体を形成することにより、複合体を細胞に吸収さ
せ、一旦吸収されると、DNA配列が発現される（ウー
（G.Y.Wu）、ウー（C.H.Wu）、1987年）。
このシステムは、肝細胞に特有であり、かつその機能
に関してはアシアログリコプロテインレセプターにより
比較的よく特徴付けられる吸収機構により定義される。
広範囲に適用可能であり、有効な輸送システムには、
トランスフェリン−ポリカチオン結合体により細胞に核
酸を吸収するためのトランスフェリンレセプターが使用
される。このシステムはヨーロッパ特許出願A1 388 758
の主題である。複合体のポリカチオン成分として様々な
重合度のポリリジンとプロタミンを使用すると、トラン
スフェリン−ポリカチオン/DNA複合体は生きている細胞
に効果的に吸収され、インターナライズされることが示
された。このシステムを使用すると、なかでもerbB−腫
瘍遺伝子を阻害するリボザイム遺伝子は、erbB−形質転
換された女性の細胞に導入され、erbB阻害効果が示され
た。
本発明の目的は、高次の真核細胞、特にＴ細胞系の細
胞に選択的に核酸を輸送することが可能なシステムを提
供することである（便宜のため、Ｔ細胞系の細胞を以下
Ｔ細胞という。この語には、前駆体Ｔ細胞、及び成熟Ｔ
細胞を含めそれらから分化する系があげられる）。
Ｔリンパ球（Ｔ細胞）は、胸腺において分化する。そ
れらの機能の一つは、抗原応答においてＢ細胞を助ける
ことである。Ｔ細胞の特徴の一つは、遊離の抗原ではな
く、抗原の断片のみを認識することである。Ｔ細胞は、
Ｔ細胞抗原レセプター（TCR）により標的細胞の表面で
この種のペプチド抗原断片を認識する。また、TCRはMHC
（腫瘍組織適合遺伝子複合体）分子に結合した抗原と相
互作用する。特定の抗原の認識は、MHCの非多型性部位
（non−polYmorphous region）をもつ他のレセプター、
CD4又はCD8の協力を必要とする。標的細胞上でのTCR
と、MHC分子をもつCD4又はCD8のいずれかとの相互作用
は、胸腺の発達の間、Ｔ細胞の特定の能力の形成のため
に必要であり、成熟Ｔ細胞の抗原−特異的活性化を可能
にする。クラスI MHC分子と会合した抗原を認識するＴ
細胞（主にキラー細胞）は、CD8を発現する；クラスII
と会合した抗原を認識する細胞（主にヘルパー細胞）
は、CD4を発現する。免疫応答の範囲内のCD4+細胞の仕
事は、Ｂ細胞の機能を導くことと同様に、マクロファー
ジを活性化して、リンパ系細胞への成長及び分化の因子
の分泌、及び非リンパ系細胞機能を導く因子の分泌を促
すこと、さらに、サプレッサー、NK及び細胞障害性のＴ
細胞の機能を引き起こすことである（ファウチ（Fauc
i）、1988年）。
Ｔ細胞上だけでなく、より少ない程度で単球／マクロ
ファージにも存在する、分子量55,000の糖タンパク質、
CD4は、免疫の認識におけるその重要な役割の他に、ウ
イルスに対するレセプターとして働くことにより、HIV
ウイルスの感染に重要な役割を担う。HIVは、AIDS（後
天性免疫不全症候群）の病原体であり、AIDSは進行性で
あり、免疫系に不可逆な損傷を起こす深刻な疾患であ
る。これはCD4+−Ｔ細胞の選択的な減少により、特に引
き起こされる。
その発見後、HIVウイルスは、その分子生物学、感染
性及び病理発生の機構に関して徹底的に研究されてき
た。
HIVは、最初のHTLV−III、LAV又はARVと呼ばれていた
RNAレトロウイルスである。HIVとして先に知られていた
ウイルスは、西アフリカの患者に見出されたウイルス
（HIV−２）とそれを区別するために、最近はしばしばH
IV−１として知られる。HIV−２は、SIV−ウイルスに関
連し、AIDSと区別できない症候群を引き起こす。
HIVウイルスゲノムは、具体的に特徴付けられる。そ
れは、約10kbの長さであり、側面に位置するLTR配列
（末端反復配列）からなり、その配列は少なくとも９の
遺伝子だけでなく複製に関する調節配列を含む。これら
の遺伝子には、すべての複製可能なレトロウイルスに共
通するgag、pol及びenv遺伝子だけでなく、成熟及び形
態形成に関与する遺伝子（vpu及びvif）、ウイルスの調
節に関与する遺伝子（tat、rev及びnef）、及び機能が
知られていない一つの遺伝子（vpr）を含む。tat遺伝子
は、HIV遺伝子発現に関してトランスアクチベータ機能
を持つタンパク質をコードすることによりウイルス複製
の増幅に重要な部分である。
HIVに高い親和性を持つレセプターであるCD4分子に結
合した後（ダルグライシュ（Dalgleish）ら、1984年；
クラッツマン（Klatzmann）ら、1984年；マクドーガル
（McDougal）ら、1986年）、ウイルスは細胞に吸収さ
れ、その外殻から遊離される。この方法には、相反する
見解がある。なかでも、この方法に、レセプター媒介エ
ンドサイトーシスが関与することが提案されている（マ
ドン（Maddon）ら、1986年；パウザ（Pauza）及びプラ
イス（Price）、1988年）。しかしながら、これは、ウ
イルスが細胞に入るために、pHがかかわりなく細胞膜と
融合することがウイルスの外殻のトランスメンブラーナ
ル部分（transmembranal part）（gp41）には必要であ
るという観察と矛盾する。（ステイン（Stein）ら、198
7年）。細胞へのウイルスの結合にもかかわらず、ヒトC
D4を発現するマウス細胞は生産的に感染され得ないこと
も観察されている。この結果は、CD4と同様に、ヒトCD4
+細胞上の他のタンパク質がウイルスのインターナリゼ
ーションに重要な役割を演じていると解釈することがで
きる。
HIVウイルスは、ウイルスの外被のタンパク質（env）
によりCD4分子に結合する。
env遺伝子の最初の生成物、gp160は前駆体であり、そ
の分裂は、（ER及びゴルジ器官を通る途中での成熟の間
に）ウイルス粒子タンパク質gp120及びgp41を生じる。g
p160の分裂は、細胞とウイルスの融合、及び感染に必要
である。gp120は、外殻糖タンパク質であり、感染した
細胞の膜の外側及びウイルス粒子に存在する。それは膜
固定ドメインをもっていないので、gp41への非共有結合
により単独で膜に付着したままである。gp120は、レセ
プターに対するウイルスの結合に関する必須の決定要素
を含む。ウイルスと細胞膜の間の高い親和性結合は、gp
120のＣ末端の40アミノ酸の部位と、CD4のＮ末端に近い
ドメインとの間の相互作用により達成される。異なるHI
V種間のgp120配列に実質的な差異はあるが、HIV−１、H
IV−２及び近縁のSIVウイルス間のCD4結合ドメインは保
護されている。95及び25kDaのタンパク質加水分解断片
は単離されており、それは明らかにgp120のドメイン様
部分であり、最初のgp120のような同様の方法においてC
D4に結合可能である（ニグレン（Nygren）ら、1988
年）。
融合方法の順序に関しては様々な理論がある；しかし
ながら、この方法におけるgp41の主要な役割に関しての
議論はなされてない。gp41は疎水性配列を持ち、それは
他のウイルストランスメンブランタンパク質のＮ末端の
融合配列としっかりと一致する。envタンパク質がオリ
ゴマーを形成し、一方ウイルス膜上での可能なオリゴマ
ーのアロステリック転位は標的細胞膜へのgp41−Ｎ末端
の導入を促進し、融合も促進することが観察されてきた
（同様の効果は、感染した細胞間において融合細胞の形
成の原因であると思われる）。
HIV感染の遮断に関する問題の最も有望なアプローチ
の一つは、gp120への結合を競う可溶で分泌型のCD4抗原
による中和であることが明らかである（スミス（Smit
h）ら;1987年）。
一度、体がHIVに感染すると、まだ感染していない細
胞を保護すること、又は冒された細胞中の潜伏性ウイル
スの活動を防ぐという治療可能性は、ウイルス複製を阻
害する核酸分子を投与することにある。
この種の核酸の治療への適用のため、それらが細胞に
効果的に吸収されるべきであるということが必須であ
る。
本発明の範囲内において、Ｔ細胞に発現される細胞表
面のタンパク質に結合するタンパク質は、もしそれらが
ポリカチオンと結合するならば、細胞表面タンパク質を
発現する細胞の中へ核酸を輸送するために使用できるこ
とが驚くべきことに見出された。
感染の間、HIVウイルスにより使用されるレセプタ
ー、即ち、CD4は移入されるべき核酸とタンパク質−ポ
リカチオン結合体（ここでタンパク質はCD4に結合可能
なタンパク質である）を複合させることにより、また、
CD4を発現する細胞と得られたタンパク質−ポリカチオ
ン/DNA複合体を接触させることにより細胞に核酸を輸送
するために使用できるということを見出した。
CD7に対する抗体を含む抗体−ポリカチオン結合体に
より、DNAはＴ細胞由来の細胞に導入され、それらの細
胞中で発現されることも示された。（CD7は、胸線細胞
及び成熟Ｔ細胞に見出されてきたが、その生理学的な役
割はまだ知られていない細胞表面のタンパク質である。
CD7は急性Ｔ細胞性白血病に関する信頼性のあるマーカ
ーである（アルフォ及びシード（Aruffo及びSeed）、19
87年））。
本発明の範囲内において、Ｔ細胞表面のタンパク質に
結合する能力を分かつすべてである。様々なタンパク質
をもつタンパク質−ポリカチオン結合体により、DNAの
インターナリゼーション及び発現は、問題のＴ細胞表面
の抗原を発現する細胞中においてそのような結合体の助
けをもって行われ得るということが立証された。
従って、本発明は核酸との複合体を形成可能な新規タ
ンパク質−ポリカチオン結合体に関し、そのタンパク質
はＴ細胞に発現される細胞表面タンパク質に結合可能で
あり、その結果細胞表面のタンパク質を発現する細胞、
特にＴ細胞に吸収され得る。
以下の説明において、Ｔ細胞の細胞表面タンパク質に
結合可能なタンパク質又はその断片を、Ｔ細胞結合タン
パク質（TCBP）という。
CD4（又はCD7）に結合可能なタンパク質の例を、“CD
4（CD7）結合タンパク質”又は“CD4BP（CD7BP）”とい
う。
さらに本発明は本発明による結合体が核酸と複合化さ
れたTCBP−ポリカチオン／核酸複合体に関しており、こ
こで核酸はTCBPが結合すべきＴ細胞表面抗原を発現する
標的細胞へ輸送されるべきものである。
本発明の構成において、本発明による複合体の形態に
おけるDNAは細胞に能率的に吸収され、この細胞はTCBP
が結合するほかならぬＴ細胞表面抗原を発現し、このDN
Aはそこで発現し、結合体含有量が増加するにつれて細
胞へのDNAの取り込みが増加することが立証された。
もし、抗体がTCBPとして使用されるべきならば、問題
の細胞表面タンパク質に結合するＴ細胞表面タンパク質
に対するどのような抗体、特にモノクローナル抗体、又
はその断片、例えばFab断片も使用可能である（ペルシ
ャン−マシュウ（Pelchen−Matthew）ら、1989年）。
これらにはgp120を持つ抗−CD4抗体が含まれ、それは
このエピトープに結合するためにウイルスと競う。
慣用のモノクローナル抗体又はその断片の代わりに、
重鎖と軽鎖の組合せ、あるいは重鎖のみの部分からなる
抗体部分を使用することが可能である。E.Coliにおける
ポリメラーゼ連鎖反応によるクローニング及び発現によ
る、そのような“代わりの（alternative）”抗体の製
造は簡単に記載されてきた（サストリー（Sastry）ら、
1989年；オーランジ（Orlandi）ら、1989年；チャウド
ハリー（Chaudhary）ら、1990年）。
CD4BPとして、HIV−１−gp120又は関連したレトロウ
イルスの対応したタンパク質又はその断片も使用可能で
ある。本発明の範囲内での使用に好適的なgp120断片
は、CD4に結合可能なもの（ラスキー（Lasky）ら、1987
年）、例えば、CD4に結合することが示されてきた95−k
Da及び25−kDa断片（ニグレン（Nygren）ら、1988年）
である。例えば、そのような断片は、まず遺伝子組み換
え方法により完全なgp120タンパク質を製造し、続いて
タンパク分解酵素による分裂（proteolytic cleaving）
を行うか、あるいは遺伝子組み換え方法によりそれらの
断片を製造することにより得てもよい。
TCBPの選択は、標的細胞、例えばあるタイプの細胞に
特有か、大部分が特有である一定の表面抗原又はレセプ
ターにより特に決定され、従ってそのタイプの細胞への
核酸の直接の導入を可能にしている。
結合体に含まれるタンパク質が結合する表面抗原次第
で本発明による結合体は、Ｔ細胞表面タンパク質を発現
し、かつ核酸で処理されるべき細胞に関しては、選択性
を狭くするか広くすることを可能にする。そして、それ
ゆえに治療に有効か、遺伝子治療に有効な核酸の使用に
適応性がある。
本発明の範囲内において結合体構成成分として、細胞
に結合するTCBPを使用することは便利である。なぜな
ら、結合体/DNA複合体は特にエンドサイトーシスにより
吸収されるか、又は細胞膜成分との融合によりTCBPの結
合／吸収が行われるからである。
本発明の範囲内において、TCBPの適合のために必須な
ことは、 ａ）それらは、核酸が導入されるべき細胞の特定のタイ
プにより認識されるべきであり、もしそれらがポリカチ
オンと結合したとしても、それらの結合力は影響されな
いか、又は実質的に影響を受けないこと、及び ｂ）この性質の範囲内で、それらを使用するルートによ
り、細胞内へ核酸を“ピギーバック”方式で運ぶ事が可
能なことである。
もし、ａ）及びｂ）に定義される条件と合うならば、
基本的には、Ｔ細胞表面抗原／レセプターに結合するす
べてのタンパク質は、本発明による使用に好適である。
これらにはＴ細胞表面タンパク質に対する抗体があげら
れ、それらは細胞の分化の特定の状態の一つ以上の例、
例えばCD4、CD44、CD7、CD3、CD8に対する抗体及びそれ
らに対応している抗体断片に特定的に発現される。
腫瘍細胞を標的とした使用のためにＴ細胞に特定的に
発現された細胞表面タンパク質、いわゆる腫瘍マーカ、
例えばCD7に対する抗体を使用することは特に好適であ
る。
本発明の目的のため、抗体及びgp120（断片）の他
に、ａ）及びｂ）で言及した要件を満足させる天然の抗
原すべてを使用することが可能である。
本発明に好適なポリカチオンには、例えば、ポリリジ
ン、ポリアルギニン、ポリオルニチンのような同種のポ
リカチオン、又は正電荷を帯びた二つ以上のアミノ酸を
持つ異種のポリカチオンがあげられ、これらポリカチオ
ンはあるいはポリエチレンイミンのような非ペプチド合
成ポリカチオンと同じように、異なる長さの鎖を持って
いる。他の好適なポリカチオンは、ヒストン又はプロタ
ミン、又はその類似体のようなポリカチオン性の天然の
DNA−結合タンパク質又はその断片である。
以下の化合物を、ポリカチオン又はポリカチオン性の
（ポリ）ペプチドとして使用してもよい： ａ）プロタミン：これらは、低分子量（MWが約8000ま
で）の強塩基性タンパク質であり、それは一般に基に配
置された正電荷を帯び、それらのポリカチオン性に基づ
いて核酸の負電荷を中和するアミノ酸基（特にアルギニ
ン）を持つ（ワラント（Warrant）ら、1978年）。本発
明の範囲で使用してもよいタンパク質は、天然起源か、
又は遺伝子組換えにより製造されたものであり、それと
同時に多数の複製物を製造するか、分子サイズ及びアミ
ノ酸配列によって修飾物を作ってもよい。相当する化合
物は化学的に合成されたものであってもよい。例えば、
合成プロタミンは、天然のプロタミンにおいては輸送機
能に関して望ましくない機能を持つ（例えばDNAの凝
縮）他の好適なアミノ酸及び／又はCD4BPとの所望され
る結合を可能にする一端を備えるアミノ酸（例えばシス
テイン）でアミノ酸基を置換することによって合成され
てもよい。
ｂ）ヒストン：これらは、高い割合で正に荷電したアミ
ノ酸（リジン及びアルギニン）を含むクロマチンに存在
する低分子量DNA結合タンパク質である。そのアミノ酸
は、それらをDNAのヌクレオチド配列に独立して結合さ
せることを可能とし、それらをヌクレオソームに保持し
ている。アルギニン豊富（arginine−rich）のヒスト
ン、H3及びH4は特に好適である（フェルセンフェルド
（Felsenfeld））、1978年）。製造及び修飾に関して
は、所見をプロタミンの適用について上記した。
ｃ）合成のポリペプチド、例えば同種のポリペプチド
（ポリリジン、ポリアルギニン）、又は異種のポリペプ
チド（正に荷電した２以上のアミノ酸からなるもの）。
ｄ）ポリエチレンイミンのような非ペプチドカチオン。
輸送されるべき特定の核酸に合わせて、正電荷の合計
が約20〜500となるようにポリカチオンのサイズを選ぶ
のが好ましい。
本発明によるTCBP−ポリカチオン結合体を、ペプチド
のカップリングに公知の方法で化学的に製造してもよ
く、もし必要ならばリンカーでのカップリング反応前に
個々の成分を提供されてもよい（この手段は、もしカッ
プリングに好適な官能基、例えばメルカプト基又はアル
コール基が入手できない時に必要である）。このリンカ
ーは、まず個々の成分の官能基と反応し、次に修飾した
個々の成分をカップリングさせる二官能価の化合物であ
る。
特にそれらの安定性に関するが、結合体の所望される
性質によって、カップリングを以下により行ってもよ
い。
ａ）還元条件下、再び切断され得るジスルフィドの橋か
け（例えば、スクシンイミジル−ピリジルジチオプロピ
オネートを使用すること（ヤング（Jung）ら、1981
年））。
ｂ）生物学的条件下、広く安定な化合物の使用（例え
ば、マレイミドリンカーとリンカー結合のスルフヒドリ
ル基を反応させることによりチオエーテルを第二の成分
へ結合する）。
ｃ）生物学的条件下で不安定な橋かけ、例えば僅かな酸
性条件下で不安定なエステル結合、又はアセタール又は
ケタール結合。
遺伝子組み換えにより本発明の結合体を製造すること
も可能であり、この利点は、正確に定義され、かつ均一
な化合物が得られることであり、一方、化学的なカップ
リングにより分離されるべき結合体の混合物を製造す
る。
本発明の結合体の遺伝子組み換え体の製造を、キメラ
ポリペプチドの製造に公知の方法を用いて行ってもよ
い。ポリカチオン性ペプチドは、それらのサイズ及びア
ミノ酸配列を換えてもよい。遺伝子工学による製造は、
例えば細胞表面タンパク質への結合性の増加、好適な変
異、又は細胞表面タンパク質に結合する役割を担う分子
の部分にまで短くされたTCBP成分の使用（例えば、gp12
0断片又は“代わりの”抗体を使用すること）により結
合体のTCBP部の修飾を可能にするという利点を持つ。TC
BP成分をコードする配列を含むベクターを使用すること
は、本発明による結合体の遺伝子組み換え製造に特に適
切であり、またポリカチオン性ペプチドをコードする所
望の配列が挿入されるポリリンカーも同様である。この
方法において、所望の配列を含むプラスミドがそこから
選ばれる発現プラスミドのセットを得ることは可能であ
り、それは本発明の結合体の発現に必須なものとして使
用されるべきである。
集合体が形成されればよいということに留意すべきで
あるが、TCBP対ポリカチオンのモル比は好ましくは10:1
〜1:10である。しかしながら、もし必要ならば、この比
は広い範囲であってもよい。但し、細胞に輸送されるべ
き核酸との複合が起こる条件を満足すること、及び形成
される複合体が細胞表面タンパク質と結合し、細胞内に
運ばれることが保証されるという条件の下である。この
ことは、個々の場合において行われる簡単な試験により
確認することができる。例えば、Ｔ細胞表面抗原を発現
する細胞系と本発明による複合体を接触させ、次に細胞
中の核酸又は遺伝子産物の存在についてそれらを調査す
ること、例えばサザンブロット分析、放射能ラベルした
相補的な核酸分子とのハイブリダイゼーション、PCRを
用いた増幅、又はレポータ遺伝子の遺伝子産物を見つけ
ることによる。
選択された特定の比は、ポリカチオン分子のサイズ及
び正に荷電した基の数及び分配に特に依存しており、そ
の基準は輸送されるべき核酸のサイズ、構造及び可能な
修飾に適合している。ポリカチオンは同一でも異なって
いてもよい。
TCBPとして抗体を使用した時の具体的な適用のため
に、特に好適な抗体を見つけるためのスクリーニングと
して、ポリカチオンに直接抗体をカップリングすること
は有益ではない：有効な化学的結合に関しては、大量
（1mgより多く）の出発抗体を使用することが一般的に
必要であり、さらに任意により抗体結合ドメインを不活
性にするかもしれない。この問題を避け、好適な抗体の
すばやいスクリーニングを可能とするために、細胞のト
ランスフェクションのすぐ前にタンパク質ＡのFc−結合
ドメインにより、所望により既に核酸と複合された形態
において、抗体を次に結合するタンパク質Ａポリカチオ
ン結合体をなによりもまず製造する（スロリア（Suroli
a）ら、1982年）。タンパク質Ａ結合体と形成した核酸
複合体を、処理されるべき特定の型の細胞に核酸を移入
するため、それらの安定性について抗体の素早い試験を
可能にする。適切なポリカチオンとタンパク質Ａのカッ
プリングを、抗体との直接のカップリングと同様に行
う。タンパク質Ａ−抗体−ポリカチオン結合体を用いた
時、抗体と処理されるべき細胞をまずインキュベート
し、過剰の抗体から細胞を遊離し、次にタンパク質Ａ−
ポリカチオン／核酸複合体とそれらを処理することは有
益である。使用されるポリカチオンによって、タンパク
質Ａ結合体は遺伝子組み換え方法により製造されてもよ
い。
細胞へ輸送されるべき核酸はDNA又はRNAであり、それ
らはヌクレオチド配列を制限しない。本発明のための
“核酸”という語は、修飾された核酸も含む。但し、修
飾が核酸のポリアニオン性及び本発明の結合体との複合
に影響を与えないことを条件とする；これらの修飾に
は、例えば、ホスホロチオエートによるホスホジエステ
ル基の置換又はヌクレオシド類似体の使用があげられ
る。そのような修飾は、当業者に一般的であり；代表的
な方法において修飾した核酸及び核酸類似体と一般的に
指称される核酸の概要及びそれらの作用の原理はゾン
（Zon）（1988年）による論文に記載されている。
核酸のサイズに関して、本発明は広い範囲も可能とす
る。本発明の結合体により課せられる理論上の上限はな
い。但し、TCBP−ポリカチオン／核酸複合体が細胞に輸
送されることが保証されることが条件となる。下限は、
特定の用途に対する特異的な理由、例えば、10より少な
いヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドは不
十分な特異性のために使用することができない、という
理由の結果から得られる。本発明による結合体を使用し
た時、プラスミドを細胞に運ぶことができる。
本発明の結合体により、異なる核酸を同時に細胞に運
ぶことも可能である。
好適な核酸の例として、ウイルス複製の必須な遺伝子
部分に対する相補性のため、ウイルス阻害効果を持つ上
述のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はリボザイムが
あげられる。
相補性のために阻害効果を持つ本発明のTCBP−ポリカ
チオン−核酸複合体の好ましい核酸成分はアンチセンス
DNA、アンチセンスRNA又はリボザイム、又はそれらをコ
ードする遺伝子である。リボザイム及びアンチセンスRN
Aを使用したとき、それらをコードする遺伝子を、所望
によりキャリヤー遺伝子とともに使用することは特に有
益である。RNAそれ自体の導入に比較すると、遺伝子を
細胞に導入することにより、RNAのかなりの増幅が達成
され、その結果として、生物学的反応の阻害をしようと
するのに十分な供給が保証される。特に好適なキャリヤ
ー遺伝子は、ポリメラーゼIIIによる転写に必要とされ
る転写ユニット、例えばtRNA遺伝子である。例えば、転
写が行われる時、リボザイムがコンパクトなポリメラー
ゼIII転写物の一部であるという方法において、リボザ
イム遺伝子をそれらに挿入してもよい。ポリメラーゼII
Iにより転写されるリボザイム遺伝子とキャリヤー遺伝
子を含む好適な遺伝子ユニットは、ヨーロッパ特許出願
A1 0 387 775に開示されている。本発明の輸送システム
の助けによって、細胞内の増加した遺伝子の初期濃度を
確保することにより、遺伝子ユニットの効果を強めるこ
とができる。
一般原則として、HIV遺伝子のすべての配列の遮断が
ウイルスの複製及び発現の阻害を引き起こし、その配列
は、AIDSの治療に使用することができる相補性アンチセ
ンスオリゴヌクレオチド又はリボザイム又はそれらをコ
ードする遺伝子の構造の標的配列として好適である。第
一に重要な標的配列は、調節機能を持つ配列、特にtat
−、rev−又はnef−遺伝子である。他の好適な配列は、
LTRの開始、ポリアデニル化、tRNAプライマー結合部位
（PBS）のスプライシング配列（splicing tRNA primer
binding site（PBS））、又はtar−配列である。
ウイルス遺伝子に相補性な結果として阻害を行う核酸
分子の他に、活性の異なる機構を持つ遺伝子、例えば、
いわゆるトランスドミナント突然変異体を含むウイルス
タンパク質をコードする遺伝式を使用することも可能で
ある（ヘルスコビッツ（Herskowitz）、1987年）。細胞
中の遺伝子産物の発現により、それらの機能により、相
当する野性型ウイルスタンパク質を抑制するタンパク質
が得られ、その結果として、そのタンパク質はウイルス
複製に関するその通常の機能を行えず、ウイルス複製は
効果的に阻害される。基本的に、複製及び発現に必須な
ウイルスタンパク質のトランスドミナント変異体、例え
ば、HIV−複製の阻害効果を持つことが示されてきたgag
−、tat−及びrev−変異体が好適である（トロノ（Tron
o）ら、1989年；グリーン（Green）ら、1989年；マリン
（Malim）ら、1989年）。
治療に有効な核酸の他の例は、癌遺伝子に阻害効果を
持つ核酸である。
本発明によって、その遺伝子又は部位を細胞に輸送す
ることも可能である。そして、その発現生成物は、標的
細胞へのシグナル伝達に正の効果を示すようにシグナル
の伝達に機能し、例えばＴ細胞の残存が増加される。
免疫治療のための第一の標的細胞は、細胞毒活性のあ
るいわゆるキラー細胞型のＴ細胞であり、それはTIL
（腫瘍浸潤リンパ球）ともいわれる。本発明による結合
体を、これらの細胞へDNAを導入するためのレトロウイ
ルスベクターを用いる遺伝子輸送の代替として使用して
もよい。このDNAは、これらの細胞の細胞毒活性を増加
することができるタンパク質、例えばTNF又はINF−αを
コードする遺伝子を好ましく含む。キラー細胞に導入さ
れるこのDNAには、IL−２の発現により細胞の増殖の局
部的強化を達成するためのIL−２遺伝子を含ませてもよ
い。理論的には、Ｔ細胞表面タンパク質を発現する細胞
に治療又は遺伝子治療効果を示すすべての遺伝子又は遺
伝子部位は、本発明の目的に適している。
核酸対結合体の比は、広い範囲内で変化させてもよ
く、また核酸のすべての電荷を中和することは絶対的に
必要ではない。この比は、基準、例えば輸送されるべき
核酸のサイズ及び構造、ポリカチオンのサイズ、その電
荷の数及び分配に従って個々のケースに適合されなけれ
ばならないであろう。その結果、特定の適用について、
核酸の輸送可能性と生物学的活性の間に都合のよい比が
ある。この比は、ゲルにおけるDNAの移動のスピードを
遅らせることにより（例えば、アガロースゲル上の移動
度の変化により）、又は密度勾配遠心法により、初期に
段階的に調節することができる。この準備的な比を得た
後、細胞内の核酸の利用可能な最大の活性を得ること
と、核酸中に残存している負電荷が細胞への輸送を妨害
しないように結合体の割合をできるだけ減らすことを目
的として、放射能ラベルした複合体を用いて輸送試験を
行うことは適切かもしれない。
TCBP−ポリカチオン／核酸複合体の製造を、ポリイオ
ン化合物の複合についてそれ自体公知の方法により行っ
てもよい。コントロールされない凝集又は沈澱を避ける
一つの可能な方法は、高い希釈度（50μg/ml）で二つ
の成分を混合することである。
エンドサイトーシスにより、より高次の真核細胞に吸
収され得るTCBP−ポリカチオン−核酸複合体は、結合体
中のポリカチオンと同じであってもよい非共有結合型の
一つ以上のポリカチオンを追加的に含んでもよい。それ
は、結合体により達成される核酸のインターナリゼーシ
ョン及び／又は発現を増加するためである。
未公開のドイツ特許出願第41 04 186.0の主題の方法
を用いると、少なくともトランスフェクション／発現と
同じ効果を達成するのに、細胞に移入されるべき核酸の
量を基準として、より少量のTCBP−ポリカチオン結合体
が必要とされる。そして、それは一つの点では合成に費
用がかからないことを意味している。複合体内の多量の
TCBP分子により占められ、その結果として追加の複合体
を加えることができないこと、かついくつもの近隣の
“ドッキング部位”の持つ影響を避けることが必要とさ
れる時、より少量の結合体が有益かも知れない。複合体
に含まれるTCBPの量を必要最小限に制限すること、即
ち、できるだけ結合体の量を少なくすること、及び遊離
ポリカチオンでそれを希釈することは、処理されるべき
標的細胞に少量の細胞表面タンパク質が存在する時に特
に有益である。
そのような方法を用いて、それ自体特に有効でない結
合体の機能を、実質的に増加させることができ、既に高
い有効性がある結合体の機能をさらに増加させることが
できる。
本発明の複合体の質的な組成に関して、細胞に移入さ
れるべき核酸及びTCBPがなによりもまず、一般的に決定
される。細胞中で達成されるべき生物学的効果、例え
ば、阻害されるべき又は（遺伝子治療に使用される時
に）発現されるべき遺伝子又は遺伝子部位の標的配列に
より、例えば不完全な遺伝子を置換するために、核酸を
第一に明確にする。核酸は、例えば、特定の適用の安定
化に必要なため、所望により修飾されてもよい。
核酸及びTCBPの決定から始まり、ポリカチオンは、こ
れらのパラメーター、特に負電荷の実質的な中和に関し
て臨界的に重要な核酸のサイズに合わせられる。
複合体に含まれてもよい非共有結合のポリカチオンを
選ぶ時、結合体により達成することができる核酸のイン
ターナリゼーション／発現と比較して、これらの物質の
添加が核酸のインターナリゼーション／発現を増加させ
るであることが重要である。
質的組成のように、複合体の定量的な組成は、互いに
機能的に関連した多数の基準によっても決定される。複
合体の成分として非共有結合ポリカチオンの供給を決定
する時、核酸の凝縮が必要か望ましいかのどちらかであ
るということと、それがどの程度までであるかというこ
と、全複合体が持つべき電荷がどのようであるかという
こと、細胞の特定のタイプへの結合及びインターナリゼ
ーションの容量がどの程度までかということ、及びそれ
が増加することが所望されるか又は必要なのはどの程度
までかということを決定することはきわめて重要であ
る。複合体の組成に関する他のパラメーターは、細胞表
面タンパク質に関するTCBPの影響の受けやすさであり、
その重要なファクターはこのタンパク質が細胞に相対的
に複合体内に存在するという点である。他の必須の点
は、それが予定される機能を行うために細胞中における
該核酸の受け入れやすさである。
複合体中に非共有結合型で含まれるポリカチオンは、
結合体に含まれるポリカチオンと同様か、又は異なって
いてもよい。それらを選択するために必須の基準は、核
酸のサイズ、特にそれらの凝縮に関し；より小さい核酸
分子であること、凝縮していることは一般的に必要とさ
れない。性質及び量に関しこのポリカチオンの選択は、
結合体、特にその結合体に含まれるポリカチオンの価値
によっても行われ：例えば、もしポリカチオンがDNA凝
集力を持たないか、又は非常に少ない物質であるなら
ば、広範囲にこの性質を持つこれらのポリカチオンを使
用することは、複合体の効果的なインターナリゼーショ
ンを達成するために一般的に適切である。もし、結合体
に含まれるポリカチオンが、それ自体核酸を凝縮する物
質であり、また、もし効果的なインターナリゼーション
のために核酸の適切な凝縮が達成されるならば、他の機
構により発現を増加させるポリカチオンを使用すること
は適切である。
複合体に、所望により含まれてもよい非共有結合ポリ
カチオンに必須なことは、核酸を凝縮すること及び／又
は細胞中における望ましくない分解から核酸を保護する
ことが可能なことである。
さらに本発明は、Ｔ細胞表面抗原を発現するヒト又は
動物へ核酸を導入する方法に関し、それは、生理学的条
件下で好ましく可溶であるTCBP−ポリカチオン／核酸複
合体を細胞、特にＴ細胞と接触させることによる。
本発明の範囲内で、ルシフェラーゼ遺伝子をレポータ
ー遺伝子として使用し、DNA成分を形成した。（ルシフ
ェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子として使用したトラ
ンスフェリン−ポリカチオン/DNA複合体を用いた予備試
験において、ルシフェラーゼ遺伝子の移入の有効性は、
他の核酸を使用できるかどうかを示すことが分かった；
質的条件において、使用される核酸はタンパク質−ポリ
カチオン−DNAの使用を制限するファクターではな
い。） 本発明の特定の態様に関して、細胞における核酸の分
解が阻害されるか、又は妨げられる条件を作ることは有
用かも知れない。
核酸の分解が阻害される条件は、いわゆるリソソーマ
トロピック物質（lysosomatropic substances）の添加
により提供されてもよい。これらの物質は、リソソーム
中のプロテアーゼ及びヌクレアーゼの活性を阻害するこ
とで知られており、従って核酸の分解を妨害することが
できる（ルスマン＆マヌーソン（Luthmann ＆ Magnusso
n）、1983年）。
これらの物質には、クロロキン、モネンシン、ニゲリ
シン（nigercin）、塩化アンモニウム及びメチルアミン
があげられる。
本発明の範囲内でリソソーマトロピック物質の群より
選ばれる物質を使用することの必要性は、特に処理され
るべき細胞のタイプによるか、又は種々の抗体を使用す
るならば、複合体が細胞に吸収される種々の機構による
であろう。従って、例えば、本発明の範囲内において、
種々の抗体（モノクローナル抗CD4抗体）を使用したと
き、細胞内へのDNAの移入がクロロキンにより種々の影
響を受けることが分かった。
ともかく、予備試験により本発明の範囲内でそのよう
な物質の必要性又は適性を試験することは必要である。
さらに本発明は、治療又は遺伝子治療に有効な一つ以
上の核酸を、有効成分としてTCBP−ポリカチオン結合体
と複合して含む医薬組成物に関する（TCBP−ポリカチオ
ン結合体及び核酸を個々に産出させ、治療への使用直前
に複合化してもよい）。
治療に有効な核酸の例としては、上述したアンチセン
スオリゴヌクレオチド又はリボザイム、又はそれらをコ
ードする遺伝子、又はトランスドミナント変異体をコー
ドする遺伝子があげられ、それらは特定の標的細胞に含
まれる内因性又は外因性遺伝子、又は遺伝子産物に阻害
効果を示す。これらには、例えば、それらの配列特異性
（トランスドミナント変異体をコードする標的配列に対
する相補性（ヘルスコビッツ（Herskowitz）、1987
年））によってHIVに対して細胞性免疫を生じさせ（バ
ルチモア（Baltimore）、1988年）、感染後のAIDS症候
群の治療、又はウイルスの活性化を防止するのに使用で
きる遺伝子があげられる。
医薬用製剤を、ヒト又は動物の体内のウイルス配列、
例えばHIV又は近縁のレトロウイルスを阻害するために
使用してもよい。近縁のレトロウイルスを阻害すること
による治療の適用の例としては、HTLV−１ウイルスによ
り引き起こされる増殖性Ｔ細胞白血病の治療があげられ
る。
ウイルス性Ｔ細胞白血病の治療の他に、本発明は非ウ
イルス性白血病を治療するために使用してもよい。近
年、リンパ性白血病の形成において腫瘍遺伝子（abl、b
cr、ras、rat、ｃ−myc、Ｎ−myc）が関わっていること
が示されてきた；観察された具体的な染色体の転座に基
づくと、他の腫瘍遺伝子があることが考えられる。これ
ら腫瘍遺伝子のDNA配列の知識並びにクローニングは、
腫瘍遺伝子−阻害核酸分子の構造について基礎を形成
し、そのために本発明に一層可能な治療用の使用に関し
て基礎を形成する。
その使用の他の重要な分野としては遺伝子治療があげ
られる。理論では、本発明の遺伝子治療の範囲におい
て、Ｔ細胞表面タンパク質を発現する標的細胞でそれら
のすべての遺伝子又はその部位を使用することは可能で
ある。また、その発現は、このタイプの細胞において一
般的に引き起こされる欠乏を置換することにより、又は
免疫応答を作動させることにより治療効果を示す。
本発明の適用に関して重点をＴリンパ球系の細胞の例
に置いてきたが、他の細胞系の例に置いてもよい。但
し、それらの細胞がＴ細胞表面タンパク質を発現するこ
とを条件とする。
図の概要 図1:抗CD4−ポリリジン/pRSVL複合体のCD4+−CHO細胞へ
の移入 図2:抗CD4−ポリリジン/pRSVL複合体のCD4+−CHO細胞へ
の移入 図3:gp120−ポリリジン/pRSVL複合体のCD4+−CHO細胞へ
の移入 図4:非共有結合ポリ（Ｄ）リジン240を含むgp120−ポリ
リジン190/pRSVL複合体のCD4+−CHO細胞への移入 図5:gp120−ポリリジン120/pRSVL複合体のCD4+−ヒラ細
胞への移入 図6:抗CD7−ポリリジン190結合体によるH9細胞へのDNA
の輸送及び発現 図7:タンパク質Ａ−ポリリジン結合体を用いたCD4+細胞
のトランスフェクション 本発明を以下の実施例により説明する。
実施例１ 抗CD4−ポリリジン90結合体の製造 サクシンイミジル−ピリジルジチオプロピロネート
（SPDP）での修飾後、ジスルフィド架橋を導入すること
により、文献から公知の方法と同様にしてカップリング
を行った（ヤング（Jung）ら、1981年）。
50mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.8中に1.7mgの抗CD4
抗体（OKT4A、Ortho Diagnostic Systems）を含む溶液
を、10mMのSPDPのエタノール溶液（Pharmacia）11μｌ
と混合した。
周囲温度で１時間後、混合物をSephadex G 25ゲルカ
ラム（溶離剤100mM HEPES緩衝液pH7.3）に通して濾過
し、75nmolのピリジルジチオプロピオネート基で修飾し
た抗CD4を1.4mg得た。ポリ（Ｌ）リジン90（FITCにより
蛍光標識した平均重合度90リジン基（Sigma））をSPDP
で同様に修飾し、ジチオトレイトール及びその次のゲル
濾過での処理により、遊離メルカプト基で修飾された形
態にした。20mM酢酸ナトリウム緩衝液0.5ml中に120nmol
のメルカプト基で修飾した38nmolのポリリジン90を含む
溶液を、上述の修飾した抗CD4と酸素の遮断下で混合
し、周囲温度で一晩静置した。結合体をゲル浸透クロマ
トグラフィー（Superose12、500mMグアニジン塩酸塩pH
7.3）により単離した;25mM HEPES pH7.3中での透析後、
相当する結合体を得た。それは11nmolをポリリジン90で
修飾された抗CD4抗体1.1mgからなる。
実施例２ 抗CD4−ポリリジン190結合体の製造 0.3mlの50mM HEPES pH7.8中に1.0mg（6.25nmol）の抗
CD4抗体（OKT4A、Ortho Diagnostic Systems）を含む溶
液を、1mMのサクシンイミジル−ピリジルジチオ−プロ
ピロネート（SPDP、Pharmacia）のエタノール溶液37μ
ｌと混合した。周囲温度で１時間後、混合物をSephadex
G 25カラム（溶離剤100mM HEPES緩衝液pH7.9）で濾過
し、30nmolのピリジルジチオプロピオネート基で修飾し
た抗CD4を0.85mg得た。ポリ（Ｌ）リジン190（FITCによ
り蛍光標識した平均重合度190リジン基（Sigma））をSP
DPで同様に修飾し、ジチオトレイトール及びその次のゲ
ル濾過での処理により、遊離メルカプト基で修飾された
形態にした。30mM酢酸ナトリウム緩衝液0.13ml中に、25
nmolメルカプト板で修飾した7.7nmolのポリリジン190を
含む溶液を、上述の修飾した抗CD4（0.5mlの300mM HEPE
S pH7.9）と酸素の遮断下で混合し、周囲温度で一晩静
置した。反応混合物に、5M NaClを添加して含量約0.6M
に調節した。結合体をイオン交換クロマトグラフィー
（Mono S、Pharmacia、50mM HEPES pH7.3、塩勾配0.6M
〜3M NaCl）により単離した;10mM HEPES pH7.3中での透
析後、相当する結合体を得た。それは3.9nmolのポリリ
ジン190で修飾された抗CD4抗体0.35mg（2.2nmol）から
なる。
実施例３ gp120−ポリリジン190結合体の製造 サクシンイミジル−ピリジルジチオプロピロネートで
の修飾後にジスルフィド架橋を導入することか、又はＮ
−ヒドロキシサクシンイミド６−マレイミドカプロエー
ト（EMCS、Sigma）での修飾後にチオエーテル架橋をす
るかのいずれかにより、カップリングを文献から公知の
方法と同様に行った（フジワラら、1981年）。
ａ）ジスルフィド架橋されたgp120−ポリリジン190結合
体： 50mM HEPES pH7.8中に、3mgの組換え体gp120（1986
年、ラスキー（Lasky）らにより記載された方法により
製造された）を含む溶液を、10mMのSPDPエタノール溶液
７μｌと混合した。周囲温度で１時間後、混合物をSeph
adex G 25ゲルカラム（溶離剤100mM HEPES緩衝液pH7.
9）で濾過し、67nmolのピリジルジチオプロピオネート
基で修飾したrgp120を2.8mg（23nmol）を得た。抗CD4結
合体に関して上述したように蛍光標識し、23nmolのメル
カプト基で修飾した6.6nmolのポリリジン190を30mM酢酸
ナトリウム120μｌ中に含む溶液を、修飾したrgp120と
酸素の遮断下で混合し、周囲温度で一晩静置した。反応
混合物に5M NaClを添加して含量を約0.6Mに調節した。
結合体をイオン交換クロマトグラフィー（Mono S、Phar
macia、50mM HEPES pH7.3、塩勾配0.6M〜3M NaCl）によ
り単離した;25mM HEPES pH7.3中での分別及び透析後、
二つの結合体の画分Ａ及びＢを得た。それは1.3nmolの
ポリリジン190で修飾されたrgp120、0.33mg（画分Ａの
場合）、及び3.2nmolのポリリジン190で修飾されたrgp1
20、0.34mg（画分Ｂ）からなる。
ｂ）チオエーテル架橋されたgp120−ポリリジン190結合
体： 0.45mlの100mM HEPES pH7.9中に2mgの組換え体gp120
を含む溶液を、10mMのEMCSのジメチルホルムアミド溶液
17μｌと混合した。周囲温度で１時間後、混合物をSeph
adex G 25ゲルカラム（溶離剤100mM HEPES緩衝液7.9）
で濾過した。その後、生成した溶液（1.2ml）を、蛍光
標識し、（抗CD4結合体に関して）上述したように30nmo
lのメルカプト基（90μｌの30mM酢酸ナトリウムpH5.0）
で修飾した9.3nmolのポリリジン190の溶液と酸素を遮断
した状態で、反応させ、周囲温度で一晩静置した。反応
混合物に5M NaClを添加して含量を約0.6Mに調節した。
結合体をイオン交換クロマトグラフィー（Mono S、Phar
macia、50mM HEPES pH7.3、塩勾配0.6M〜3M NaCl）によ
り単離した;25mM HEPES pH7.3中での分別及び透析後、
三つの結合体の画分Ａ、Ｂ及びＣを得た。それは1.9nmo
lのポリリジン190で修飾されたrgp120、0.40mg（画分Ａ
の場合）、及び2.5nmolのポリリジン190で修飾したrgp1
20、0.25mg（画分Ｂ）、又は1.6nmolのポリリジン190で
修飾したrgp120、0.1mg（画分Ｃ）からなる。
実施例４ 抗CD7−ポリリジン190結合体の製造 50mM HEPES pH7.9中に1.3mgの抗CD7抗体（Immunotec
h）を含む溶液を、1mMのSPDP（Pharmacia）のエタノー
ル溶液49μｌと混合した。周囲温度で１時間後、混合物
をSephadex G 25ゲルカラム（溶離剤50mM HEPES緩衝液p
H7.9）で濾過し、33nmolのピリジルジチオプロピオネー
ト基で修飾した抗CD7を1.19mg（7.5nmol）得た。FITCに
より蛍光標識したポリ（Ｌ）リジン190をSPDPで同様に
修飾し、ジチオトレイトール及びその次のゲル濾過での
処理により、遊離メルカプト基で修飾した形態にした。
30mM酢酸ナトリウム緩衝液0.2ml中に、35nmolのメル
カプト基で修飾した11nmolのポリリジン190を含む溶液
を、酸素を遮断した状態で、（300mM HEPES pH7.9 0.5m
l中の）上述の修飾した抗CD7と反応させ、周囲温度で一
晩静置した。反応混合物を5M NaClの添加により調節
し、含量を約0.6Mにした。結合体をイオン交換クロマト
グラフィー（Mono S、Pharmacia、50mM HEPES pH7.3、
塩勾配0.6M〜3M NaCl）により単離した;10mM HEPES pH
7.3中での透析後、相当する結合体を得た。それは6.2nm
olのポリリジン190で修飾された抗CD7抗体0.51mg（3.2n
mol）からなる。
実施例５ 抗体ポリカチオン結合体とDNAとの複合体の製造 DNAの希釈液（150mM NaCl、20mM HEPES pH7.3中、30
μg/ml又はそれ以下）と実施例１、２及び４で得られた
抗体−ポリリジン結合体（100μg/ml又はそれ以下）と
を混合することにより、複合体を製造した。使用したDN
Aは、トリトン−Ｘ溶菌標準法（Triton−X lysis stand
ard method）（マニアテス（Maniatis）、1982年）、引
き続きCsCl/EtBr平衡密度勾配遠心法、ブタノール−１
を用いた脱色及び10mMトリス/HCl pH7.5、1mM EDTA中で
の透析により製造したpRSVLプラスミドDNA（デウェット
（De Wet）ら、1987年）である。DNA複合体の沈降を防
ぐため、ホスフェート−フリーの緩衝液を使用した（ホ
スフェートは結合体の溶解度を減少する）。
実施例６ 抗CD4−ポリリジン90結合体によるCD4+CHO−細胞へのDN
Aの輸送及び発現 この実施例及び以下の実施例において、レポーター遺
伝子（reporter gene）としてフォティヌスピラリスル
シフェラーゼ（Photinus pyralis luciferase）遺伝子
を含む、プラスミドDNAを使用し、遺伝子の輸送及び発
現を調査した。実験の結果を示す図において、ルシフェ
ラーゼ活性について示された値は、無傷の細胞サンプル
の活性に関する。
CD4+CHO−細胞（ラスキー（Lasky）ら、1987年）を、
10％FCS（牛胎児血清）を加えたハム（Ham）のＦ−12培
地へ、Ｔ−25バイアル当たり５×105細胞の割合で播種
した。18時間後、細胞を血清を含まないハムのＦ−12培
地で二回洗浄し、この培地（5ml）中、37℃で５時間イ
ンキュベートした。
抗CD4ポリリジン/pRSVL複合体を、実施例５に記載し
たように製造し、最終濃度を150mM NaCl、20mM HEPES p
H7.5中、DNA10μg/500μｌにした。抗CD4ポリリジン90
（8.4nmolのポリリジン90/1mgの抗CD4）を、明記した質
量比（1.9〜8.1、抗CD4の質量として表した）で使用し
た。サンプル１〜４では、複合体を血清を含まずに100
μＭクロロキンを含むハムのＦ−12培地の細胞に添加
し；サンプル５及び６では、クロロキンを含まないもの
を使用した。４時間のインキュベーションの後、細胞
を、10％FCSを加えた培地で２回洗い、この培地中でイ
ンキュベートした。サンプル５及び６において、同量の
血清含有培地を細胞に加えた。20時間後、すべての細胞
を新鮮な血清含有培地で洗い、48時間後に採取した。同
量のタンパク質の相当する抽出物のアリコート（各サン
プルの約1/5）を、ルシフェラーゼ活性について調べた
（デウェット（De Wet）ら、1987年）。生物発光をクリ
ニルメート（clinilumate）を用いて測定した（バーソ
ルド（Berthold）、ワイルドバッハ（Wildbach、FW
G）。これらの調査の結果を図１に示す。本発明の結合
体によりDNAがCD4+細胞に移入されたこと、及び移入さ
れたDNAが発現したこと、またDNA移入の有効性が抗CD4/
ポリリジンの含有量と比例することが分かった。
実施例７ 抗CD4−ポリリジン190結合体によるCD4+CHO細胞へのDNA
の輸送及び発現 まず、CD4+CHO細胞を実施例６に記載したように培養
した。pRSVL 10μｇ及び、2:1又は3:1の抗CD4−ポリリ
ジン90（実施例１を参照されたい）又はgp120ポリリジ
ン（実施例３を参照されたい）の過剰量を含む結合体/D
NA複合体（この複合体は実施例５のように製造した）
を、100μＭクロロキンを含むか含まずに細胞に加え
た。37℃でさらに４時間後、クロロキンを含むサンプル
を10％ウシ胎児血清を含むハムの培地で２度洗った。一
方、同じ培地5mlをクロロキンを含まないサンプルに加
えた。細胞を37℃でさらに20時間インキュベートし、ア
リコートをそれらのルシフェラーゼについて実施例６の
述べたように調べた。それらの試験結果を図２に示す。
実施例８ CD4+CHO細胞へのgp120−ポリリジン/pRSVL複合体の移入 ａ）gp120−ポリリジン/DNA複合体の製造 HBS 330μｌでDNA 6μｇを周囲温度でまず希釈するこ
とにより、複合体を製造した（100μg/mlより少な
い）。使用したDNAはpRSVLプラスミドDNAであった（実
施例５を参照されたい）。実施例３に包含されるgp120
−pL190結合体のアリコート（実施例３に明記した量）
を170μl HBSで希釈した。それぞれのケースの結合体の
希釈液をDNA希釈液に素早く加え、30分間インキュベー
トし、その後トランスフェクション用に使用した。
ｂ）CD4+細胞のトランスフェクション CD4+CHO細胞（ラスキー（Lasky）ら、1987年）を、10
％FCS（ウシ胎児血清）を合わせたハムのＦ−12培地
（ハム（Ham）、1965年）に、Ｔ−25バイアル当たり６
×105細胞の割合で播種した。
18時間後、細胞を血清を含まないハムのＦ−12培地で
２度洗い、この培地（5ml）中、37℃で５時間インキュ
ベートした。その後、gp120−pL/pRSVL複合体の溶液を
細胞に加えた。４時間後、10％ウシ胎児血清を含むDME
培地（ダルベッコ改質イーグル培地）の同量を各サンプ
ルに加えた。24時間後、細胞を調べ、抽出物を調製し、
同様のタンパク質含有物のアリコート（全材料の約1/
5）を、前述の実施例の様にルシフェラーゼ活性につい
て調べた。図３に示した値は、６×105細胞のルシフェ
ラーゼ活性に相当する。gp120−pL結合体の活性は構成
成分の比に依存し、低いgp120:ポリリジン比（画分Ｃ、
トレース５及び６）を持つ結合体では高い活性がある
が、一方、高いgp120:ポリリジン比（画分Ａ、トレース
１及び２）を有する画分にはとても低いか活性がないこ
とが分かる。
実施例９ 非共有結合ポリリジンを含むgp120−ポリリジン/pRSVL
複合体のCD4+CHO細胞への移入 実施例８のトランスフェクションについて不十分な結
果を示したgp120−pL結合体（画分Ａ及びＢ）を、遊離
ポリリジンの添加がDNAの取り込みを向上するかどうか
を見るために調べた。DNA6μｇ及び結合体12μｇを使用
し、DNAとの複合前に、１又は３μｇのポリリジン240を
結合体に加えた。トランスフェリン結合体に関して得ら
れた結果によると、ルシフェラーゼ活性の急な増加が観
察された（それぞれ260倍と5.2倍）（図４）。
実施例10 CD4+ヒラ細胞へのgp120−ポリリジン/pRSVL複合体の移
入 10％FCSを合わせたDME培地に、CD4+ヒラ細胞（マドン
（Maddon）ら、1986年）又はコントロールとしての普通
のヒラ細胞を、T25バイアル当たり６×105細胞の割合で
播種し、その後CHO細胞に関して実施例６に記載したよ
うに培養した。細胞を、結合体対DNAの明記した比にお
いて、gp120−ポリリジン/pRSVL複合体と接触させた
（図５）（gp120−ポリリジン結合体A,B,Cは、実施例3b
で結合させた材料をMono Sで分離した３つの画分であ
る）。各画分のgp120対ポリリジンのモル比を図に示し
た。血清を含まずに結合体と接触させた４時間後、血清
を含む培地を加え、20時間後に細胞を調べた。細胞抽出
物からの、同一のタンパク質含有量に標準化したアリコ
ートを、それぞれのルシフェラーゼ活性について調べ
た。図に示した値は、６μg DNAを用いてトランスフェ
クトした６×105細胞のルシフェラーゼ活性に相当す
る。
実施例11 抗CD7−ポリリジン190結合体によるH9細胞へのDNAの輸
送及び発現 ａ）Ｔ細胞系H9の細胞（マン（Mann）ら、1989年）を、
20％FCS、1ml当たり100ユニットのペニシリン、100μg/
mlのストレプトマイシン及び1mMグルタミンを補ったRPM
I 1640培地中で培養した。トランスフェクションの直前
に、細胞を遠心分離により集め、1ml当たり100,000細胞
（サンプル当たり1,000,000細胞）の割合で新鮮な培地
に取り、それをトランスフェクション用に使用した。抗
CD7結合体との比較として、トランスフェリン結合体を
使用した。トランスフェリン−ポリリジン結合体をEP−
A 1 388 758に記載されたように製造した；使用した抗C
D7結合体は実施例４に記載したものである。DNAとの複
合を、実施例５に記載したように行った。H9細胞におけ
る一過性トランスフェクション（transient transfecti
on）のために使用したDNAは、プラスミドpHLuciであ
り、それはルシフェラーゼについてコードする配列と合
わさったHIV−LTR配列とそれに続くSV40−イントロン／
ポリＡ部位を含んでいる：プロテアーゼ2A遺伝子を含む
Hind IIIフラグメントをpHIV/2A（サン及びバルチモア
（Sun and Baltimore、1989年）から取り除き、ルシフ
ェラーゼをコードする配列を含むpRSVL（デウェット（D
e Wet）ら、1987年）のHind III/Sma Iフラグメントに
より置き換えた。（平滑末端をKlenow fragmentを用い
て作った後）二つのフラグメントをHind III部位により
接合し、その後、平滑なSma I部位を介して平滑なHind
III部位につないだ。ルシフェラーゼ遺伝子配列の正確
な配置を持つクローンを選択した。このプラスミドは、
強い転写活性のためにTAT遺伝子生成物を必要とする。
これは、プラスミドpCMVTATでのコトランスフェクショ
ン（co−transfection）により製造され、それはCMV即
時初期プロモター（immediate early promoter）（ヤコ
ボビッツ）Jakobovits）ら、1990年）のコントロール
下、HIV−TAT遺伝子についてコードする。トランスフェ
クション用に使用されるDNA複合体は、pHLuci 5μｇ及
びpCMVTAT 1μｇの混合物を含む。DNA/ポリカチオン複
合体（500μｌ）を細胞サンプル10mlに加え、100μＭク
ロロキンの存在において、４時間インキュベートした。
その後、細胞を新鮮な培地で洗い、40時間後に採取し、
前述の実施例に記載したようにそれらのルシフェラーゼ
活性について調べた。（ルシフェラーゼの明るさのユニ
ットにおける）結果を図６に示す:DNA6μｇと複合させ
た抗CD7−ポリリジン結合体の量が増加するにつれてル
シフェラーゼ活性は増加することが分かった（サンプル
1,2及び３）。複合体形成のために結合体６μｇを遊離
ポリリジン１μｇとともに使用した時、活性がさらに増
加したが、（サンプル４）、ポリリジンをさらに添加す
ると遺伝子輸送に影響を及ぼした（サンプル５）ことが
観察された（トランスフェリン−ポリリジン結合体で行
った比較試験を６及び７に示した。）。
ｂ）抗体結合体を用いたトランスフェクションに関し、
プラスミドpSSTNEOを用いてさらに一連の試験を行っ
た。マーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子を含むこの
プラスミドを、抗CD4、抗CD7及び（比較のため）トラン
スフェリン−ポリリジン190結合体を用いてH9細胞に導
入した（106細胞当たりDNA6μｇを使用した；最適なト
ランスフェクション条件を一過性（transient）ルシフ
ェラーゼアッセイを用いて予備試験において測定してお
いた）。プラスミドpSSTNEOは、pUCu座の大きなSstフラ
グメントを含んでおり、それはHSV TK−neoユニットを
含む。単一Nde I部位を含む63bpフラグメントをAsp718
部位に導入した。その後トランスフェクトした細胞のア
リコート（明記した数の細胞を含む）を、1000μg/ml G
418を含む半固形メチルセルロース培地において希釈し
た。これを行うために、半固形培地にさらに標準要求量
のG418 0.5〜1mg/ml及びメチルセルロース20mg/mlを含
む培地中、ネオマイシンマーカーを含むDNAでのトラン
スフェクションの三日後、細胞のアリコートを取り出し
た。（半固形選択培地を製造するために、460mlの水に
メチルセルロース20gを含む溶液を、無菌条件下で製造
した。）その後、無菌条件下で製造した、２倍濃縮した
栄養供給（supplemented nutrient）培地（500ml）をメ
チルセルロース溶液と合わせた。その容量を１リットル
に調製し、培地を４℃で一晩攪拌した。この培地のアリ
コート50mlを血清10mlと混合し、所望により−20℃で貯
蔵後、容量を血清を含まない完全培地で100mlに調製し
た。この段階でG418を加えた。メチルセルロース培地の
アリコート2.5mlを細胞懸濁液のアリコート50〜100μｌ
と混合し、この混合物の約1mlを培地皿に注いだ。イン
キュベーションをCO2雰囲気下、37℃で行った。約10〜1
4日後、G418耐性細胞を数えた（200より多い細胞を含む
コロニーのみを陽性として数えた）。結果を図４に示す
（これは、抗生物質培地に置いた10日後の1000細胞当た
りG418耐性コロニーの数を示す）。
実施例12 タンパク質−Ａポリリジン190結合体の製造 100mM HEPES pH7.9 0.5mlにタンパク質−A 4.5mgを含
む溶液を10mMのSPDPのエタノール溶液30μｌと混合し
た。周囲温度で２時間後、混合物をSephadex G25ゲルカ
ラム（溶出液50mM HEPES緩衝液pH7.9）を通して濾過
し、245nmolのピリジルジチオプロピオネート基で修飾
したタンパク質−Ａを3.95mg（94nmol）得た。FITCによ
って蛍光標識したポリ（Ｌ）リジン190をSPDPで同様に
修飾し、ジチオトレイトール及びその次のゲル濾過での
処理により、遊離メルカプト基で修飾した形態にした。
30mM酢酸ナトリウム緩衝液0.8ml中に、150nmolのメルカ
プト基で修飾した53nmolのポリリジン190を含む溶液
を、上記の修飾したタンパク質−Ａと酸素の排除下で混
合し、周囲温度で一晩静置した。反応混合物を、5M NaC
lの点画により約0.6Mの含量に調節した。結合体をイオ
ン交換クロマトグラフィーにより分離した（Mono S、Ph
armacia、50mM HEPES pH7.3、塩勾配0.6〜3M NaCl）；
分別及び25mM HEPES pH7.3中での透析後、二つの結合体
の画分Ａ及びＢを得た。それは5nmolのポリリジン190で
修飾されたタンパク質Ａ、1.15mg（27nmol）（画分Ａの
場合）、及び40nmolのポリリジン190で修飾されたタン
パク質−Ａ、2.6mg（6.2nmol）（画分Ｂ）からなる。DN
Aとの複合体を実施例５と同様に製造した。
実施例13 タンパク質Ａ−ポリリジン結合体を用いたCD4+細胞のト
ランスフェクション CD4+発現ヒラ細胞（実施例10を参照されたい）をT25
バイアル当たり６×105の割合で播種し、その後10％FCS
を合わせたDME培地中で培養した。図７に示したところ
の細胞を抗体（抗−CD4 gp55kD、IOT4、Immunotech）
（サンプル当たり３μｇ）と周囲温度で１時間、プレイ
ンキュベートした。一方では、タンパク質Ａポリリジン
190/DNA複合体を、pRSVL 6μｇ及び明記した量のタンパ
ク質Ａ−ポリリジン190と追加の遊離ポリリジンを含むH
BS 500μｌ中において、実施例５に記載したように製造
した。１時間のインキュベーションの終わりに、細胞を
4.5μｌの新鮮な培地に置き、DNAサンプル500μｌを37
℃下で細胞に加えた。４時間、100μＭクロロキンを含
むサンプル（サンプル９〜12）を新鮮な培地中で洗い、
一方、サンプル１〜８はDNAを採取するまでインキュベ
ートした。ルシフェラーゼアッセイのため、細胞を20時
間後に採取した。試験の結果を図７に示した。ルシフェ
ラーゼ活性は、DNA複合体中のタンパク質Ａ−ポリリジ
ンの存在で決定される（サンプル１〜４、５、６）こと
がわかった。サンプル５〜８、11、12において、タンパ
ク質Ａ複合体によるDNAの輸送は、抗体の前処理がなく
とも行われた；しかしながら、もし細胞が細胞表面のタ
ンパク質CD4（サンプル１〜４、９、10）を認識する抗
体と前処理されたならば、DNA移入は、約30％増加し
た。クロロキンの存在は、DNA発現のどのような増加も
引き起こさないということもわかった（例えば、サンプ
ル１〜８とサンプル９〜12）。
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−549
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 48/00 48/00 Ａ６１Ｐ 31/18 Ａ６１Ｐ 31/18 35/00 35/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 ビルンシュティール マックス エル オーストリア アー1100 ウィーン グ ルンデッケルガッセ 49 (72)発明者 コッテン マシュー オーストリア アー1130 ウィーン マ クシングシュトラーセ 22―24―３―８ (72)発明者 ワーグナー エルンシュト オーストリア アー2103 ランゲンツェ ルスドルフ シュトレーベルスドルフェ ルシュトラーセ 18 (56)参考文献 特表 平１−502119（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ. 263［29］（1988）ｐ．14621−14624 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 14/00 - 19/00 C12N 15/87 - 15/90 A61K 31/711 A61K 39/395 A61K 48/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (27)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ヒト又は動物の細胞に吸収される可溶性の
    複合体を、核酸又は核酸類似体と形成することができる
    新規タンパク質−ポリカチオン結合体であって、該結合
    体のタンパク質成分が、抗CD−３抗体、抗CD−８抗体、
    抗CD−４抗体、及びHIV gp120又は近緑のレトロウイル
    スの相同のタンパク質からなる群から選ばれることを特
    徴とする、新規タンパク質−ポリカチオン結合体。
  2. 【請求項２】結合体のタンパク質成分が、Ｔ細胞表面タ
    ンパク質に向けられるモノクローナル抗体又はその断片
    であることを特徴とする、請求項１記載の結合体。
  3. 【請求項３】結合体がCD4に結合することが可能なタン
    パク質を含むことを特徴とする請求項１又は２記載の結
    合体。
  4. 【請求項４】結合体が、gp120結合エピトープを含むモ
    ノクローナル抗−CD4抗体又はその断片を含むことを特
    徴とする請求項３記載の結合体。
  5. 【請求項５】結合体が、タンパク質として、CD4に結合
    するHIV−1 gp120又は近縁のレトロウイルスの相同タン
    パク質又はその断片を含むことを特徴とする請求項３記
    載の結合体。
  6. 【請求項６】結合体が、Ｔ細胞に発現した腫瘍マーカー
    に結合するタンパク質を含むことを特徴とする請求項１
    又は２記載の結合体。
  7. 【請求項７】結合体が、CD7に結合するタンパク質を含
    むことを特徴とする請求項６記載の結合体。
  8. 【請求項８】結合体が、ポリカチオンに直接結合された
    形態で抗体を含むことを特徴とする請求項２、４、６又
    は７のいずれか１項記載の結合体。
  9. 【請求項９】ポリカチオンに結合されたタンパク質Ａに
    より結合された形態における抗体を含むことを特徴とす
    る２、４、６又は７のいずれか１項記載の結合体。
  10. 【請求項１０】請求項９記載の抗体結合体を製造するた
    めのタンパク質Ａ−ポリカチオン結合体。
  11. 【請求項１１】ポリカチオンが修飾されたプロタミンで
    あることを特徴とする請求項１記載の結合体。
  12. 【請求項１２】ポリカチオンが合同の同種又は異種のポ
    リペプチドであることを特徴とする請求項１記載の結合
    体。
  13. 【請求項１３】ポリペプチドがポリリジンであることを
    特徴とする請求項12記載の結合体。
  14. 【請求項１４】ポリカチオンが約20〜500の正電荷を持
    つことを特徴とする請求項１〜13のいずれか１項記載の
    結合体。
  15. 【請求項１５】Ｔ細胞結合タンパク質対ポリカチオンの
    モル比が約10:1〜1:10であることを特徴とする請求項11
    〜14のいずれか１項記載の結合体。
  16. 【請求項１６】ヒト又は動物の細胞に吸収される新規タ
    ンパク質−ポリカチオン／核酸複合体であって、該結合
    体のタンパク質成分が、Ｔ細胞系の細胞により発現され
    る細胞表面タンパク質に結合可能なタンパク質であり、
    その結果、形成される複合体がＴ細胞表面タンパク質を
    発現する細胞に取り込まれることを特徴とする前記複合
    体。
  17. 【請求項１７】複合体が、結合成分として請求項１〜９
    又は11〜15に記載した結合体の一つを含むことを特徴と
    する請求項16記載の複合体。
  18. 【請求項１８】複合体が、結合体のポリカチオンと同一
    であるか又は異なる非共有結合ポリカチオンをさらに含
    み、その結果、結合体により達成される核酸のインター
    ナリゼーション及び／又は発現が増加することを特徴と
    する請求項16又は17のいずれか１項記載の複合体。
  19. 【請求項１９】複合体が、ウイルス阻害核酸を含むこと
    を特徴とする請求項16〜18のいずれか１項記載の複合
    体。
  20. 【請求項２０】複合体が、HIV−１ウイルス又は近縁の
    レトロウイルスの複製及び発現を阻害する核酸を含むこ
    とを特徴とする請求項19記載の複合体。
  21. 【請求項２１】阻害核酸が、HIV−１ゲノムの配列に相
    補的であることを特徴とする請求項20記載の複合体。
  22. 【請求項２２】複合体が、腫瘍遺伝子阻害核酸を含むこ
    とを特徴とする請求項16〜18のいずれか１項記載の複合
    体。
  23. 【請求項２３】複合体が、核酸として治療又は遺伝子治
    療に活性な遺伝子又は遺伝子部位を含むことを特徴とす
    る請求項16〜18のいずれか１項記載の複合体。
  24. 【請求項２４】請求項16〜23記載の複合体の一つを、請
    求項１〜９又は11〜15記載のタンパク質−ポリリジン結
    合体の一つ及び核酸又は核酸類から、非共有結合ポリカ
    チオンの存在下で形成し、インビトロで、Ｔ細胞表面タ
    ンパク質を発現する細胞と該複合体とを接触させること
    によりＴ細胞表面タンパク質を発現する細胞に核酸又は
    核酸類を導入する方法。
  25. 【請求項２５】複合体の形成を、細胞中の核酸の分解が
    阻害される条件下で行うことを特徴とする請求項24記載
    の方法。
  26. 【請求項２６】タンパク質Ａ、請求項11〜14記載のポリ
    カチオンの一つ及び請求項19〜23記載の核酸の一つから
    なるタンパク質Ａ−ポリカチオン結合体から複合体を形
    成し、この複合体を、Ｔ細胞表面タンパク質に向けられ
    た複合体の結合体成分に結合している抗体の存在下、イ
    ンビトロで、該表面タンパク質を発現する細胞と接触さ
    せる請求項24又は25記載の方法。
  27. 【請求項２７】ヒト又は動物の細胞に吸収される可溶性
    の複合体を、核酸又は核酸類似体と形成することができ
    るタンパク質−ポリカチオン結合体であって、該結合体
    のタンパク質成分が、Ｔ細胞系の細胞により発現される
    細胞表面タンパク質に結合可能なタンパク質であり、そ
    の結果、形成される複合体がＴ細胞表面タンパク質を発
    現する細胞に取り込まれるものである、前記タンパク質
    −ポリカチオン結合体を含有することを特徴とする、ヒ
    ト又は動物の細胞中への核酸の輸送剤。
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