BRPI0408116B1 - Polipeptídeos de hialuronidase solúveis conjugados a polímero, composições farmacêuticas compreendendo polipeptídeos ph20 solúveis, seus usos e processo de preparação, e ácidos nucléicos que codificam polipeptídeos de hialuronidase solúveis - Google Patents

Abstract

GLICOPROTEÍNA HIALURONIDASE SOLÚVEL (sHASEGP), PROCESSO PARA A SUA PREPARAÇÃO, USOS E COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS COMPREENDENDO A MESMA. A invenção refere-se à descoberta de novas Glicoproteínas Hialuronidase ativas neutras solúveis (sHASEGPs), métodos de fabricação, e seu uso para facilitar a administração de outras moléculas ou para aliviar as patologias associadas com glicosaminoglicano. Os domínios de polipeptídeo minimamente ativos dos domínios de sHASEGP ativos neutros solúveis são descritos os quais incluem peptídeos líderes que intensificam a secreção de sHASEGP. A invenção ainda compreende formas sialadas e pegiladas de uma sHASEGP recombinante para intensificar a estabilidade e os farmacocinéticos sobre as enzimas de matadouro de ocorrência natural. Ainda descritas são as formulações adequadas de uma glicoproteína sHASEGP recombinante substancialmente purificada derivada de uma célula eucariótica que gera a própria glicosilação requerida com relação à sua atividade ideal.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA COM O(S) PEDIDO(S) RELACIONADO(S)

[001] Este pedido reivindica a prioridade sob 35 U.S.C.§119(e) para a U.S. Número de Série 60/452.360, depositada em 05 de março de 2003, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Campo da Invenção

[002] A presente invenção refere-se de uma forma geral relacionada com as Glicoproteínas Hialuronidase solúvel, ativa neutra (sHASEGP), suas partes, particularmente os domínios da Hialuronidase. Mais especificamente, a invenção refere-se às modificações químicas, composições farmacêuticas, plasmídeos de expressão, métodos para fabricação e métodos terapêuticos usando as Glicoproteínas Hialuronidase e seus domínios e as moléculas de ácido nucléico codificadoras para a modificação terapêutica de glico- saminoglicanos no tratamento de doença e para o uso para aumentar a difusão de outras moléculas injetadas menores do que 200 nanômetros de diâmetro em um animal.

Informação Antecedente

[003] Os Glicosaminoglicanos (GAGs) são polissacarídeos lineares complexos da matriz extracelular (ECM). GAG’s são caracterizados pela repetição das estruturas de dissacarídeo de uma hexosamina N-substituída e um ácido urônico, [hialuronan (HA), sulfato de condroitina (CS), condroitina (C), sulfato de dermatan (DS), sulfato de heparan (HS), heparina (H)], ou uma glactose, [sulfato de queratano (KS)]. Exceto para HA, todos existem covalen- temente ligados às proteínas de núcleo. Os GAGs com suas proteínas de núcleo são estruturalmente referidos como proteoglicanos (PGs).

[004] Hialuronan (HA) é observado em mamíferos predominantemente nos tecidos conjuntivos, pele, cartilagem, e no fluido sinovial. O Hialuronan é também o principal constituinte do vítreo dos olhos. No tecido conjuntivo, a água de hidratação associada com o hialuronan cria espaços entre os tecidos, assim criando um ambiente condutivo para o movimento das células e proliferação. O Hialuronan desempenha um papel chave nos fenômenos biológicos associados com a motilidade celular incluindo o desenvolvimento rápido, regeneração, reparo, embriogênese, desenvolvimento embriológico, cicatrização de ferimentos, angiogênese e tumorigênese (Toole 1991 Cell Biol. Extracell. Matrix, Hay (ed), Plenum Press, New York, 1384-1386; Bertrand et al. 1992 Int. J. Cancer 52:1-6; Knudson et al, 1993 FASEB J. 7:1233-1241). Além disso, os níveis de hialuronan se correlacionam com a agressividade do tumor (Ozello et al. 1960 Cancer Res. 20:600-604; Takeuchi et al. 1976, Cancer Res. 36:2133-2139; Kimata et al. 1983 Cancer Res. 43:1347-1354).

[005] O HA é observado na matriz extracelular de muitas células, especialmente no tecido conjuntivo macio. Ao HA foram designadas várias funções fisiológicas, tais como homeostasia da proteína em água e plasma (Laurent TC et al (1992) FASEB J 6: 2397-2404). A produção de HA aumenta na proliferação das células e pode desempenhar um papel na mitose. Foi também implicado na locomoção e migração celular. O HA parece desempenhar papéis importantes na regulação, desenvolvimento e diferenciação celular (Laurent et al, supra).

[006] O HA foi usado na medicina clínica. Suas propriedades protetoras e reológicas do tecido têm provado serem úteis na cirurgia oftálmica para proteger o endotélio córneo durante a cirurgia de catarata. O HA no soro é diagnóstico de doença do fígado e várias condições inflamatórias, tais como artrite reumatóide. O edema intersticial causado pelo acúmulo de HA pode causar disfunção em vários órgãos (Laurent et al, supra).

[007] As interações de proteína Hialuronan também estão envolvidas na estrutura da matriz extracelular ou "substância fundamental".

[008] As Hialuronidases são um grupo de enzimas ativas neutras e ácidas observadas em todo o reino animal. As Hialuronidases variam com respeito a especificidade do substrato e mecanismo de ação.

[009] Existem três classes gerais de hialuronidases: 1. Hialuronidases tipo mamífero, (EC 3.2.1.35) que são endo-beta-N-acetilexosaminidases com tetrassacarídeos e hexassacarídeos como os produtos finais principais. Elas possuem atividades tanto hidrolíticas quanto de transglicosidase, e podem degradar os sulfatos de hialuronan e de condroitina (CS), especificamente C4-S e C6-S. 2. Hialuronidases bacterianas (EC 4.2.99.1) degradam o hi- aluronan e, suas várias extensões, CS e DS. Elas são endo-beta-N-acetilexo- saminidases que operam mediante uma reação de eliminação beta que produz principalmente produtos finais de dissacarídeo. 3. Hialuronidases (EC 3.2.1.36) de sanguessugas, outros parasitas e crustáceos são endo-beta-glicuronidases que geram produtos finais de tetrassacarídeo e hexassacarídeo através da hidrólise da ligação beta 1-3.

[0010] As hialuronidases de mamífero podem ser ainda divididas em dois grupos: enzimas ativas neutras e ativas ácidas. Existem seis genes semelhantes a hialuronidase no genoma humano, HYAL1, HYAL2, HYAL3 HYAL4, HYALP1 e PH20/SPAM1. O HYALP1 é um pseudogene, e o HYAL3 não foi mostrado possuir atividade enzimática com respeito a qualquer substrato conhecido. O HYAL4 é uma condroitinase e carece de atividade voltada para o hialuronan. O HYAL1 é a enzima ativa ácida prototípica e o PH20 é a enzima ativa neutra prototípica. As hialuronidases ativas ácidas, tais como HYAL1 e HYAL2 carecem de atividade catalítica em pH neutro. Por exemplo, o HYAL1 não possui atividade catalítica in vitro acima de pH 4,5 (Frost et al Anal Biochemistry, 1997). O HYAL2 é uma enzima ativa ácida com uma atividade específica muito baixa in vitro.

[0011] As enzimas semelhantes a hialuronidase podem também ser caracterizadas por aquelas que são bloqueadas na membrana plasmática através de uma âncora de glicosilfosfatidil inositol tal como um HYAL2 humano e PH20 humano (Danilkovitch-Miagkova, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 15 de abril de 2003;100(8):4580-5, Phelps et al., Science 1988) e aquelas que são solúveis tais como HYAL1 humano (Frost et al, Biochem Biophys Res Commun. 9 de julho de 1997;236(1):10-5). No entanto, existem variações de espécie para espécie: bovina, o PH20 por exemplo é muito frouxamente ligado à membrana plasmática e não é ancorado através de uma âncora sensível a fosfolipase (Lalancette et al, Biol Reprod. agosto de 2001; 65(2):628-36.). Este aspecto único de hialuronidase bovina tem permitido o uso de enzima hialu- ronidase solúvel em testículos bovinos como um extrato para uso clínico (Wydase®, Hyalase®). Outras espécies de PH20 são enzimas ancoradas por lipídeo que não são insolúveis sem o uso de detergentes ou lipases. Por exemplo, o PH20 humano é ancorado na membrana plasmática através de uma âncora GPI. Esforços para se fazer constructos de DNA de PJ20 que não devem introduzir uma âncora de lipídeo no polipeptídeo resultaram em uma enzima cataliticamente inativa ou uma enzima insolúvel (Arming et al Eur J Biochem. 1° de agosto de 1997; 247(3):810-4). Hialuronidase de esperma de símio de ocorrência natural é observada em uma forma tanto solúvel quanto ligada à membrana. Embora a forma ligada à membrana 64kDa possua atividade enzimática em pH 7,0, a forma 54kDa é apenas ativa com pH 4,0 (Cherr et al, Dev Biol. 10 de abril de 1996; 175(1):142-53.). Desta maneira, as formas solúveis de PH20 são freqüentemente deficientes de atividade enzimática sob as condições neutras.

[0012] As condroitinases são enzimas observadas em todo o reino animal. Estas enzimas degradam os glicosaminoglicanos através de uma reação de endoglicosidase. Exemplos específicos de Condroitinases conhecidas incluem a Condroitinase ABC (derivada da Proteus vulgaris; Pedido de Patente Japonesa Aberta à Inspeção Público N° 6-153947, T. Yamagata, H. Saito, O. Habuchi, e S. Suzuki, J. Biol. Chem., 243, 1523 (1968), S. Suzuki, H. Saito, T. Yamagata, K. Anno, N. Seno, Y. Kawai, e T. Furuhashi, J. Biol. Chem., 243, 1543 (1968)), Condroitinase AC (derivada de Flavobacterium he- parinum; T. Yamagata, H. Saito, O. Habuchi, e S. Suzuki, J. Biol. Chem., 243, 1523 (1968)), Condroitinase AC II (derivada de Arthrobacter aurescens; K. Hi- yama, e S. Okada, J. Biol. Chem., 250, 1824 (1975), K. Hiyama e S. Okada, J. Biochem. (Tokyo), 80, 1201 (1976)), Hialuronidase ACIII (derivada de Fla- vobacterium sp. Hp102; Hirofumi Miyazono, Hiroshi Kikuchi, Keiichi Yoshida, Kiyoshi Morikawa, and Kiyochika Tokuyasu, Seikagaku, 61, 1023 (1989)), Chondroitinase B (derived from Flavobacterium heparinum; Y. M. Michelacci e C. P. Dietrich, Biochem. Biophys. Res. Commun., 56, 973 (1974), Y. M. Mi- chelacci e C. P. Dietrich, Biochem. J., 151, 121 (1975), Kenichi Maeyama, Akira Tawada, Akiko Ueno, e Keiichi Yoshida, Seikagaku, 57, 1189 (1985)), Condroitinase C (derivada de Flavobacterium sp. Hp102; Hirofumi Miyazono, Hiroshi Kikuchi, Kelichi Yoshida, Kiyoshi Morikawa, e Kiyochika Tokuyasu, Seikagaku, 61, 1023 (1939)), et al. mais.

[0013] As glicoproteínas são compostas de uma cadeia de poli- peptídeo covalentemente ligada a uma ou mais porções de carboidrato. Existem duas amplas categorias de glicoproteínas que possuem carboidratos acoplados através de ligações N-glicosídicas ou O-glicosídicas em sua proteína constituinte. Os glicanos ligados a N e O são ligados aos polipeptídeos através das ligações asparagina-N-acetil-D-glicosamina e serina (treonina)-N-acetil- D-galactosamina, respectivamente. Os oligossacarídeos ligados a N complexos não contêm resíduos de manose terminais. Eles contêm apenas resíduos de N-acetilglicosamina, galactose e/ou ácido siálico terminais. Os oligossaca- rídeos híbridos contêm resíduos de manose terminais assim como resíduos de N-acetilglicosamina, galactose e/ou ácido siálico terminais.

[0014] Com as glicoproteínas ligadas a N, um precursor de oli- gossacarídeo é ligado ao grupo amino de asparagina durante a síntese de peptídeo no retículo endoplásmico. A porção de oligossacarídeo é depois se- qüencialmente processada por uma série de enzimas específicas que se anulam e adicionam porções de açúcar. O processamento ocorre no retículo en- doplásmico e continua com a passagem através do mecanismo de Golgi cis, medial e trans.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0015] São fornecidos aqui os membros da família da Glicopro- teína Hialuronidase ativa neutra solúvel, particularmente as Glicoproteínas Hi- aluronidases PH-20 solúveis humanas (também aqui referidas como sHASEGPs). A sHASEGP aqui fornecida é um membro da família de sHASEGP, aqui designada como uma sHASEGP. O domínio da Hialuronidase solúvel, e seu uso são também fornecidos.

[0016] A invenção baseia-se na descoberta de que uma atividade de hialuronidase ativa neutra solúvel pode ser produzida com rendimento elevado em um sistema de expressão de mamífero mediante a introdução de ácidos nucléicos que necessitam de uma região estrita que codifica aminoácidos no terminal carbóxi do PH20 cDNA humano. Modificações adicionais da sHASEGP para intensificar a secreção mediante o uso de peptídeos lideres não-nativos são também fornecidas. São ainda fornecidos métodos para modificar a sHASEGP para prolongar sua meia-vida por meio do masca- ramento da proteína com polietileno glicol e modificações pós-traducionais para glicosilação nativa. Tentativas anteriores para gerar uma sHASEGP humana ativa neutra eliminada foram malsucedidas. Foi concluído que as mutilações do polipeptídeo de sHASEGP humano resultaram tanto em uma perda de atividade enzimática neutra, quanto em uma incapacidade das células em eliminar a proteína recombinante mos sistemas de expressão de mamífero (Arming, et al Eur J Biochem 1° de agosto;247 (3):810-4). É crítico gerar sHASEGP secretada de atuação neutra para a produção comercial e utilidade terapêutica como uma hialuronidase. A invenção, aqui apresentada, supera tal desafio.

[0017] A invenção ainda compreende uma glicoproteína sHASEGP humana cataliticamente ativa em que a sHASEGP possui pelo menos uma porção de açúcar ligada a N. Os estudos aqui apresentados demonstram que o PH20 humano requer glicanos ligados a N para atividade catalítica, ao passo que as hialuronidases de bovino e veneno de abelha permanecem ativos sem tais glicanos ligados a N. Um domínio de hialuronidase humana desprovido de porções ligadas a N é cataliticamente inativo. Assim a tecnologia de DNA recombinante clássico não permite a produção de uma sHASEGP humana cataliticamente ativa, ao contrário da HASEGP de veneno de abelha, que pode ser produzida em E. coli.

[0018] A invenção inclui métodos e células para a geração de um polipeptídeo de glicoproteína de sHASEGP ligada a N, mediante o uso de uma célula capaz de introduzir ditas porções de açúcar ligadas a N ou mediante a introdução de ditas porções ligadas a N em um polipeptídeo de sHASEGP. Métodos de identificar apropriadamente as sHASEGP glicosiladas são ainda apresentados.

[0019] As glicoproteínas sHASEGP Super-Sialadas catalitica- mente ativas são também fornecidas. As sHASEGPs Super-sialadas possuem maior meia-vida comparadas com as sHASEGPs de testículos bovinos e ovinos não-sialados de ocorrência natural, e são assim preferíveis tanto para a estabilidade de enzima quanto para uso como drogas intravenosas. A invenção fornece métodos para a preparação sHASEGPs Super-Sialadas, composições e usos destas.

[0020] As proteínas codificadas por variantes de ligação de sHASEGP deficiente de âncora GPI naturais são também fornecidas.

[0021] São fornecidas ainda composições da sHASEGP compreendendo, uma glicoproteína sHASEGP solúvel com um íon de metal, em que o íon de metal é Cálcio, Magnésio ou Sódio. As sHASEGPs são muito favoravelmente ativas na presença de ditos metais. As formulações consistindo em sHASEGP na presença de ditos íons de metal são também fornecidas.

[0022] Modificações da sHASEGP para prolongar ainda mais a meia-vida são fornecidas. As modificações químicas de uma sHASEGP com polímeros tais como polietileno glicol e dextrano são fornecidas. Tais modificações protegem as sHASEGP’s da remoção da circulação e do sistema imune assim como receptores de glicosilação para manose e asialoglicopro- teína. São ainda fornecidos métodos para se ligar a grupos funcionais específicos tais como sítios de glicosilação, positivamente carregados de aminoá- cidos e cisteínas.

[0023] Ensaios para se identificar os efetores, tais como compostos, incluindo moléculas pequenas, e condições, tais como pH, temperatura e intensidade iônica, que modulam a ativação, expressão ou atividade da sHASEGP são também aqui fornecidos. Nos ensaios exemplares, os efeitos dos compostos de teste na capacidade de um domínio de Hialuronidase da sHASEGP clivar um substrato conhecido, tipicamente um glicosaminoglicano ou proteoglicano, são avaliados. Os agentes, geralmente compostos, particularmente moléculas pequenas, que modulam a atividade do domínio de Hia- luronidase, são compostos candidatos para a modulação da atividade da sHASEGP. Os domínios de Hialuronidase podem também ser usados para produzir anticorpos específicos de Hialuronidase com atividade perturbadora da função. Os domínios de Hialuronidase aqui fornecidos incluem, mas não são limitados a, o domínio de glicosil-hidrolase N-terminal com partes truncadas C-terminais deste que apresentam atividade catalítica in vitro.

[0024] As moléculas de ácido nucléico que codificam as proteínas e os domínios de Hialuronidase são também fornecidos. As moléculas de ácido nucléico que codificam um domínio de Hialuronidase solúvel ou suas partes cataliticamente ativas e aquelas que codificam a sHASEGP de compri-mento total são fornecidas. O ácido nucléico que codifica o domínio de Hialu- ronidase e ácido nucléico a jusante é apresentado na SEQ ID No. 6; e o domínio de Hialuronidase de sHASEGP é apresentado na SEQ ID No. 1 (ami- noácidos 35-464). A seqüência de proteína e a codificação da seqüência de ácido nucléico da sHASEGP de comprimento total são apresentadas nas SEQ ID Nos. 1 e 6.

[0025] São também fornecidos moléculas de ácido nucléico que hibridizam tal ácido nucléico que codifica a sHASEGP juntamente com o seu comprimento total ou juntamente com pelo menos cerca de 70%, 80% ou 90% do comprimento total e codifica o domínio de Hialuronidase ou parte deste são fornecidos. A hibridização é geralmente efetuada sob as condições de severidade pelo menos baixa, geralmente pelo menos moderada, e freqüentemente elevada.

[0026] O fragmento de ácido nucléico isolado é o DNA, incluindo genômico ou cDNA, ou é RNA, ou pode incluir outros componentes, tais como ácido nucléico da proteína ou outros análogos de nucleotídeo. O ácido nu- cléico isolado pode incluir componentes adicionais, tais como promotores he- terólogos ou nativos, e outras seqüências reguladoras transducionais ou translacionais, estes genes podem ser ligados a outros genes, tais como genes repórter ou outros genes indicadores ou genes que codificam os indicadores.

[0027] É também fornecido uma molécula de ácido nucléico isolada que inclui a seqüência de moléculas que é complementar à seqüência de nucleotídeo que codifica a sHASEGP ou a porção desta.

[0028] São também fornecidos seus fragmentos ou oligonucleo- tídeos que podem ser usados como sondas ou iniciadores e que contêm pelo menos cerca de 10,14,16 nucleotídeos, geralmente menos do que 1000 ou menos do que ou igual a 100, apresentados na SEQ ID NO. 6 (ou o seu com-plemento); ou contêm pelo menos cerca de 30 nucleotídeos (ou o seu complemento) ou contêm oligonucleotídeos que se hibridizam juntamente com o seu comprimento total (ou pelo menos cerca de 70, 80 ou 90% deste) em quaisquer de tais fragmentos ou oligonucleotídeos. O comprimento dos fragmentos é uma função do propósito para o qual eles são usados e/ou a complexidade do genoma de interesse. Geralmente as sondas e os iniciadores contêm menos do que cerca de 50, 150 ou 500 nucleotídeos.

[0029] São também fornecidos plasmídeos contendo qualquer uma das moléculas ácido nucléico aqui fornecidas. As células contendo os plasmídeos são da mesma forma fornecidas. Tais células incluem, mas não são limitadas a elas, células bacterianas, células de levedura, células fúngicas, células de plantas, células de inseto e células de animal.

[0030] São também fornecidos sistemas de expressão de mamífero intensificados usando guias de sinal capazes de secreção eficiente de sHASEGP. Um exemplo de tal seqüência de aminoácido de peptídeo líder secretório eficiente e proteína de fusão com sHASEGP é observado na SEQ ID Nos. 43 e 46.

[0031] É também fornecido um método de produção da sHASEGP mediante o desenvolvimento das células descritas acima sob condições pelas quais a sHASEGP é expressa pelas células, e recuperação do polipeptídeo ou glicoproteína sHASEGP expresso. Métodos para o isolamento de ácido nucléico que codifica outras sHASEGPs são da também fornecidos.

[0032] São também fornecidas células, geralmente células eu- carióticas, tais como células de mamífero e células de levedura, em que o polipeptídeo de sHASEGP é expresso sobre a superfície das células. Tais células são usadas nos ensaios de triagem do droga para identificar compostos que modulam a atividade do polipeptídeo de sHASEGP. Estes ensaios, incluindo os ensaios de ligação in vitro, e os ensaios com base na transcrição em que a transdução de sinal mediada direta ou indiretamente, tal como através da ativação dos fatores pró-crescimento, pela sHASEGP é avaliada.

[0033] São também fornecidos peptídeos codificados por tais moléculas de ácido nucléico. Incluídos entre estes polipeptídeos está o domínio de Hialuronidase da sHASEGP ou um polipeptídeo com mudanças de ami- noácido tal que a especificidade e/ou atividade da Hialuronidase permanece substancialmente não-mudada. Em particular, uma glicoproteína sHASEGP de mamífero substancialmente purificada é fornecida que inclui um ativo neutro secretado cataliticamente.

[0034] A invenção da mesma forma inclui um domínio catalítico de Hialuronidase e pode adicionalmente incluir outros domínios. A sHASEGP pode formar homodímeros e pode também formar heterodímeros com alguma outra proteína, tal como uma proteína ligada a membrana. É também fornecida uma glicoproteína substancialmente purificada incluindo uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade com a sHASEGP onde a identidade percentual é determinada usando algoritmos padrão e penalidades de abertura que maximizam a identidade percentual.

[0035] As variantes de ligação da sHASEGP, particularmente aquelas com um domínio de Hialuronidase cataliticamente ativa, são aqui contempladas.

[0036] Em outras modalidades, os polipeptídeos substancialmente purificados que incluem um domínio de Hialuronidase de um polipeptí- deo de sHASEGP ou uma parte cataliticamente ativa deste, mas que não incluem a seqüência inteira dos aminoácidos apresentados na SEQ ID No. 1 são fornecidos. Entre estes estão os polipeptídeos que incluem uma seqüên- cia de aminoácidos que possui pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% de identidade da seqüência na SEQ ID No. 1 ou 3.

[0037] Em uma modalidade específica, um ácido nucléico que codifica uma glicoproteína de Hialuronidase eucariótica, designada sHASEGP, é fornecido. Em particular, o ácido nucléico inclui a seqüência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID No. 6, particularmente apresentado como nucleotídeos 106-1446 da SEQ ID NO. 6, ou uma parte da que codifica um polipeptídeo cataliticamente ativo.

[0038] São também fornecidas moléculas de ácido nucléico que hibridizam sob condições de severidade pelo menos baixa, geralmente severidade moderada, mais tipicamente severidade elevada na SEQ ID NO. 6 ou degenerações destas.

[0039] Em uma modalidade, o fragmento de ácido nucléico isolado hibridiza com uma molécula de ácido nucléico contendo a seqüência de nucleotídeo apresentada em SEQ ID No: 6 (ou degeneração desta) sob condições de severidade elevada. Uma sHASEGP de comprimento total é apre-sentada na SEQ ID No. 1 e é codificada pela SEQ ID NO. 6 ou suas degenerações.

[0040] São também fornecidos muteínas do domínio de Hialuro- nidase da sHASEGP, particularmente muteínas em que o resíduo Cys no domínio de Hialuronidase que é livre, isto é, não forma ligações de dissulfeto com qualquer outro resíduo Cys no domínio de Hialuronidase, é substituído com uma outra substituição de aminoácido, tipicamente, embora não necessariamente, com uma substituição de aminoácido conservadora ou uma substituição que não elimina a atividade, e muteínas em que um sítio(s) de glicosi- lação específica é/são eliminado(s).

[0041] Os polipeptídeos de sHASEGP, incluindo, mas não são limitados a suas variantes de ligação, e os ácido nucléicos que codificam as sHASEGPs, e domínios, derivados e análogos destes são aqui fornecidos. As glicoproteínas de Hialuronidase secretadas de cadeia única que possuem uma funcionalidade terminal equivalente àquela gerada pela ativação de uma peptidase de sinal para formar a sHASEGP são da mesma forma fornecidas. Existem sete sítios de glicosilação ligada a N potenciais em N82, N166, N235, N254, N368, N393, N490 da sHASEGP como exemplificado na SEQ ID NO: 1. Ligações de dussulfeto formam-se entre os resíduos Cys C60-C351 e os resíduos Cys C224 a C238 para formar o domínio de Hialuronidase do núcleo. No entanto, as cisteínas adicionais são requeridas no término de carbóxi para atividade catalítica de enzima neutra tal que a sHASEGP dos aminoácidos de 36 a Cys 464 em a SEQ ID No.1 compreende o domínio de hialuronidase da sHASEGP humana minimamente ativo. Assim, o sítio de glicosilação ligado a N N-490 não é requerido para a atividade de sHASEGP apropriada.

[0042] A glicosilação ligada a N das sHASEGP’s é crítica com relação a sua atividade e estabilidade catalítica. Embora a alteração do tipo de glicano que modifica uma glicoproteína possa ter efeitos dramáticos sobre uma antigenicidade de proteína, flexibilidade estrutural, solubilidade e estabilidade, a maioria das enzimas não são consideradas requererem a glicosila- ção para a atividade de enzima ideal. As sHASEGPs são desta maniera únicas quanto a isso, em que a remoção da glicosilação ligada a N pode resultar em inativação completa aproximada da atividade de Hialuronidase. A presença de glicanos ligados a N é crítica para gerar uma sHASEGP ativa. Sistemas de expressão da proteína adequados para a introdução de resíduos de glicosilação ligados a N críticos sobre a sHASEGP são incluídos. Adicionalmente, a introdução de polipeptídeo de sHASEGP desglicosilado na presença de extratos capazes de introduzir os glicanos ligados a N são incluídos. Em um aspecto da invenção, a glicosilação complexa coberta com sialação é descrita enquanto outras coberturas com resíduos de manose livres são contempladas igualmente. Preferivelmente, resíduos de ácido siálico são observados nos resíduos terminais de glicosilação ligada a N sobre a sHASEGP.

[0043] Os oligossacarídeos ligados a N caem em vários tipos principais (oligomanose, complexo, híbrido, sulfatado), todos dos quais possuem (Man) núcleos 3-GlcNAc-GlcNAc- ligados através do nitrogênio de amida de resíduos de Asn que estão na categoria das seqüências -Asn-Xaa- Thr/Ser-(onde Xaa não é Pro). A glicosilação em um sítio de -Asn-Xaa-Cys- foi relatado com relação à proteína de coagulação C. Os sítios Ligados a N são freqüentemente de forma indireta designados pelo aparecimento de um ciclo "em branco" durante o seqüenciamento. A identificação positiva pode ser feita após a liberação do olissacarídeo pela PNGase, que converte o ASN glicosilado em Asp. Após a liberação de PNGase F, os oligossacarídeos ligados a N podem ser purificados usando a cromatografia de Bio-Gel P-6, com a reunião de oligossacarídeo submetida à cromatografia de troca de ânion com pH elevado preparativa (HPAEC) (Townsend et al., (1989) Anal. Biochem. 182, 1-8). Certos isômeros de oligossacarídeo podem ser resolvidos usando HPAEC. Resíduos de fucose mudarão as posições de eluição mais no princípio no cromatograma HPAEC, enquanto os resíduos de ácido siálico adicionais aumentarão o tempo de retenção. O tratamento concorrente das glico- proteínas cujas estruturas de oligossacarídeo são conhecidas (por exemplo, fetuína bovina, glicoproteína ácida a-1, ovalbumina, RNAse B, transferrina) pode facilitar a escolha dos picos de oligossacarídeo. Os oligossacarídeos coletados podem ser caracterizados por uma combinação de análises de ligação composicional e metilação (Waegheet al., (1983) Carbohydr Res. 123, 281-304.), com configurações anoméricas designadas por espectroscopia de RMN (Van Halbeek (1993) em Methods Enzymol 230).

[0044] As formulações de sHASEGP’s são da mesma forma fornecidas. As sHASEGPs podem ser formuladas nas formas liofilizadas e soluções estabilizadas. As formulações contendo íons de metal específicos, tais como cálcio, magnésio ou sódio, são úteis para a atividade ideal em pH neutro. Além das formulações de solução estabilizada, as formulações de liberação lenta são aqui contempladas para a remoção prolongada de glicosamino- glicanos. Da mesma forma aqui fornecido são kits que fornecem seringas pré- embaladas de sHASEGP’s para a administração de pequenos volumes de sHASEGP para procedimentos cirúrgicos intra-oculares et al. procedimentos de pequeno volume. Formulações de sal equilibradas para uso ex vivo em procedimentos de tecnologia reprodutiva artificial são também fornecidas.

[0045] Métodos para o uso de sHASEGP’s na remoção de glico- saminoglicanos são também fornecidos. As sHASEGPs abrem canais no espaço intersticial através da degradação de glicosaminoglicanos que permitem a difusão de moléculas menores do que 500 nm no tamanho. Estes canais permanecem por um período de 24 a 48 horas dependendo da dose e formulação. Tais canais podem ser usados para facilitar a difusão de moléculas exogenamente adicionadas tais como fluidos, moléculas pequenas, proteínas, ácidos nucléicos e vetores da terapia genética e outras moléculas menores do que 500 nm de tamanho.

[0046] As sHASEGPs podem da mesma forma ser usadas para remover os glicosaminoglicanos em excesso tais como aqueles que ocorrem seguinte a isquemia, reperfusão, inflamação, arteriosclerose, edema, câncer, lesão da medula espinhal e outras formas de escoriação. Em alguns exemplos, as sHASEGP’s podem ser liberadas sistemicamente mediante a infusão intravenosa. Isto pode ser útil quando o acesso local não for facilmente disponível tal como o coração ou cérebro ou no caso de neoplasma disseminado em que a doença é através do corpo. As sHASEGP’s Super-Sialadas são preferíveis para aumentar a meia-vida no soro e distribuição sobre as enzimas hialuronidases nativas que carecem de ácidos siálicos terminais.

[0047] Em algumas circunstâncias, tais como lesão da medula espinhal, glaucoma e tratamentos cosméticos, a liberação controlada é preferida.

[0048] Em outras indicações, uma dose de atuação curta única é preferível. A remoção temporária de glicosaminoglicanos pode ser usada para intensificar a liberação de soluções e drogas nos espaços intersticiais. Isto pode ser útil para a difusão de anestesia e para a administração de fluidos, moléculas e proteínas terapêuticas. A administração subcutânea e intramuscular de moléculas na presença de sHASEGP’s da mesma forma facilitam sua distribuição sistêmica mais rapidamente. Tais métodos são muito úteis quando o acesso intravenoso não está disponível ou onde a liberação sistêmica mais rápida de moléculas for necessária. A liberação de outras moléculas grandes tais como o Fator VIII, que são fracamente biodisponíveis após a administração subcutânea, podem ser injetadas com sHASEGP’s para au-mentar sua disponibilidade.

[0049] Usos de sHASEGP’s para a remoção enzimática dos oó- citos circunjacentes da matriz cumulus são também fornecidos. A remoção da matriz de cúmulo usando uma sHASEGP purificada sem os contaminantes tóxicos de hialuronidase derivada do extrato permite recuperação mais suave do oócito com maiores viabilidades. Além do mais, as sHASEGP’s podem ser fabricadas sem o uso de extratos de gado ou outros organismos que transportam vírus et al. patógenos tais como encefalopatias espongiformes transmissíveis.

[0050] Injeções de volumes pequenos de sHASEGP para uso in- tra-ocular podem também ser usadas para espaços pequenos. As SHASEGPs podem ser injetadas para o interior da câmara do olho para remover os substratos viscoeláticos em excesso que são administrados durante a cirurgia. A injeção intra-ocular de sHASEGP’s pode também ser usada para reduzir a pressão intra-ocular no glaucoma, para dissolver os agregados vítreos, ou "flutuantes", para limpar a hemorragia vítrea, para o tratamento de degeneração macular, para promover o deslocamento vítreo da retina na reti- nopatia diabética e para ser misturada com outras enzimas para promover a reformação da córnea juntamente com lentes corretivas. Será reconhecido que em alguns exemplos, o uso de uma sHASEGP de longa duração tal como uma sHASEGP peguilada será desejável.

[0051] As co-formulações de sHASEGP com outras substâncias podem também ser visionadas com relação a canetas injetáveis para administração subcutânea de pequeno volume ou rápida. Exemplos tais como Epipen®, insulina, et al. fluidos podem ser formulados. Os métodos da invenção incluem a administração do polipeptídeo de sHASEGP ou composições farmacêuticas contendo sHASEGP antes, simultaneamente ou seguinte a administração de outras moléculas terapêuticas. A sHASEGP pode ser administrada em um sítio diferente do sítio de administração da molécula terapêutica ou a sHASEGP pode ser administrada em um sítio da mesma como o sítio de administração da molécula terapêutica.

[0052] Portanto, é aqui fornecido uma família de glicoproteínas hialuronidases ativas neutras secretadas eucarióticas designadas sHASEGP’s, e domínios funcionais, especialmente seus domínios de Hialuro- nidase (ou catalítico), muteínas et al. derivados e análogos destes. Da mesma forma aqui fornecido são os ácidos nucléicos que codificam as sHASEGPs. Adicionalmente fornecidos são as formulações e usos terapêuticos de ditas sHASEGP’s para tratar doença e para o uso como enzimas de modificação do tecido.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0053] A Figura 1 é um mapa de vetor do Vetor HZ24 sHASEGP.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A. DEFINIÇÕES:

[0054] A não ser que definida de outra maneira, todas as técnicas e termos científicos aqui usados possuem o mesmo significado como é comumente compreendido por uma pessoa versada na técnica a qual a invenção pertente. Todas as patentes, pedidos de patente, pedidos e publicações publicadas, seqüências do Genbank, websites et al. materiais publicados referidos aqui em toda a descrição, a não ser que observada de outra maneira, são incorporadas por referência em sua totalidade. No evento que existir uma pluralidade de definições para os termos inclusos, aquelas nesta seção pre- velecem.

[0055] Onde a referência é feita a um URL ou outros tais indicadores ou endereços, fica compreendido que tais identificadores podem mudar e informação particular na internet pode vir e ir, mas informação equivalente pode ser observada mediante pesquisa na internet. Referência a isto evidencia a disponibilidade e disseminação pública de tal informação.

[0056] Como aqui usado, as abreviações para quaisquer grupos de proteção, aminoácidos et al. compostos, são, a não ser que indicado de outra maneira, de acordo com seu uso comum, abreviações reconhecidas, ou a IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature (ver, (1972) Bio- chem. 11: 942-944).

[0057] Como aqui usado, Hialuronidase eucariótica refere-se a uma família diversa de endoglicosaminidases glicosaminoglicano, em que um resíduo de glutamato na Hialuronidase hidrolisa as ligações beta 1,4 dos sulfatos de hialuronan e condroitina através de um mecanismo catalítico de base ácida.

[0058] De particular interesse são as sHASEGP’s de origem de mamífero, incluindo ser humano. Aqueles versados nesta técnica reconhecem que, em geral, as substituições de aminoácido isoladas em regiões não essenciais de um polipeptídeo substancialmente não alteram a atividade biológica (ver, por exemplo, Watson et al., (1987) Molecular Biology of the Gene, 4a Edição, The Benjamin/Cummings Pub. co., p. 224).

[0059] Como aqui usado, sHASEGP ancorada na membrana, refere-se a uma família de Hialuronidases ancoradas pela membrana que compartilham aspectos estruturais comuns como aqui descrito.

[0060] Como aqui usado, hialuronidase solúvel refere-se a um polipeptídeo caracterizado por sua solubilidade sob condições fisiológicas. HASEGP solúvel pode ser distinta, por exemplo, pela sua divisão na fase aquosa de uma solução de Triton X-114 aquecida a 37 oC (Bordier et al J Biol Chem. 25 de fevereiro de 1981; 256(4):1604-7). A HASEGP ancorada por lipídeo por outro lado dividirá na fase rica em detergente, mas dividirá na fase fraca de detergente ou aquosa seguinte ao tratamento com Fosfolipase-C.

[0061] Assim, referência, por exemplo, à "sHASEGP" abrange todas as glicoproteínas codificadas pela família do gene de sHASEGP, incluindo mas não limitada a elas: sHASEGP humana, sHASEGP de camundongo, ou uma molécula equivalente obtida de qualquer outra fonte ou que tenha sido preparada sinteticamente ou que apresente a mesma atividade. Seqüências de moléculas de ácido nucléico codificadoras e as seqüências de aminoácido codificadas de sHASEGP’s exemplares e/ou domínios destas são apresentadas, por exemplo na SEQ ID NO: 4. O termo da mesma forma abrange a sHASEGP com substituições de aminoácido que substancialmente não alteram a atividade de cada membro e da mesma forma abrange variantes de junção destas. As substituições adequadas, incluindo, embora não necessa-riamente, substituições conservadoras de aminoácidos, são conhecidas por aqueles versados nesta técnica e podem ser preparadas sem eliminar a atividade biológica, tal como a atividade catalítica, da molécula resultante.

[0062] Como aqui usado, uma sHASEGP, quando aqui referenciada, inclui pelo menos uma ou todas ou qualquer combinação de: um polipeptídeo codificado pela seqüência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO. 6 ou por uma seqüência de nucleotídeos que inclui nucleotídeos que codificam aminoácidos 1-509 da SEQ ID No. 1; um polipeptídeo codificado por uma seqüência de nucleotídeos que hibridiza sob condições de severidade baixa, moderada ou elevada na seqüência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO. 6; um polipeptídeo que inclui a seqüência de aminoácidos apresentada como aminoácidos 1-509 da SEQ ID No. 1; um polipeptídeo que inclui uma seqüência de aminoácidos temdo pelo menos cerca de 60%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de seqüência com a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID No. 1 ou como aminoáci- dos 1-448 da SEQ ID No. 4.

[0063] Em particular, o polipeptídeo de sHASEGP, com os domínios de Hialuronidase como indicado na SEQ ID No. 4 é fornecido. O poli- peptídeo é um polipeptídeo de cadeia única ou duas cadeias. Menores porções deste que retêm a atividade de Hialuronidase são da mesma forma fornecido. Os domínios de Hialuronidase das sHASEGPs variam no tamanho e constituição, incluindo inserções e anulações de alças superficiais. Assim, para os propósitos inclusos, o domínio catalítico é uma parte de uma sHASEGP, como aqui definido, e é homólogo a um domínio de outras seqüên- cias semelhantes a hialuronidase, tais como HYAL1, HYAL2, HYAL3, que foram anteriormente identificadas; não foi reconhecido, no entanto, que uma forma de cadeia isolada do domínio de Hialuronidase humana pode funcionar nos ensaios in vitro. Os resíduos de Aspartato e Glutamato necessários para a atividade estão presentes nos motivos conservados.

[0064] Como aqui usado, um "domínio de hialuronidase neutro de uma sHASEGP solúvel" refere-se a um domínio beta 1,4 endoglicosamini- dase de uma sHASEGP que apresenta atividade Hialuronidase em PH neutro, é solúvel sob condições como descrito e compartilha homologia e aspectos estruturais com os domínios da família hialuronidase glicosil-hidrolase, mas contém seqüências adicionais no término carbóxi que são requeridas com relação a atividade neutra. Portanto é pelo menos a parte mínima do domínio que apresenta atividade de Hialuronidase como avaliado por ensaio in vitro padrão e permanece solúvel. Contemplado aqui são tais domínios de Hialuro- nidase e as partes cataliticamente ativas destes. São também fornecidas as formas truncadas do domínio de Hialuronidase que incluem o fragmento menor deste que atua cataliticamente como uma forma de cadeia única.

[0065] Um domínio de Hialuronidase de uma sHASEGP, quando aqui referenciado, inclui pelo menos uma ou todas ou qualquer combinação de uma parte cataliticamente ativa de: um polipeptídeo de glicoproteína ligada a N que inclui a seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID No. 1; um polipeptídeo codificado por uma seqüência de nucleotídeos que hibridiza sob condições de severidade baixa, moderada ou elevada na seqüência de nucle- otídeos apresentada na SEQ ID NO. 6; um polipeptídeo que inclui a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID No. 1; um polipeptídeo que inclui um seqüência de aminoácidos tendo pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de seqüência com a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID No. 1; e/ou um domínio de Hialuro- nidase um polipeptídeo codificado por uma variante de união da sHASEGP.

[0066] Desta maneira, para os propósitos inclusos, o domínio de Hialuronidase é uma parte de uma sHASEGP, como aqui definido, e é homólogo a um domínio de outras sHASEGP’s. Assim como com a classe maior de enzimas da família de hialuronidase, os domínios catalíticos de sHASEGP compartilham um grau elevado de identidade da seqüência de aminoácido. Os resíduos Asp e Glu necessários para a atividade estão presentes em motivos conservados.

[0067] Por forma ativa significa uma forma ativa in vivo e/ou in vitro. Como aqui descrito, o domínio de Hialuronidase também pode existir como uma glicoproteína secretada solúvel. É aqui mostrado que, pelo menos in vitro, as formas de cadeia única da sHASEGP’s e os domínios catalíticos ou suas partes enzimaticamente ativas (tipicamente truncações de C-terminal) apresentam atividade de Hialuronidase. Fornecidas aqui portanto são as formas isoladas dos domínios de Hialuronidase das sHASEGP’s e seu uso nos ensaios de triagem de droga in vitro para identificação de agentes que modulam a atividade das mesmas.

[0068] Como aqui usado, o domínio cataliticamente ativo de uma sHASEGP refere-se ao domínio de endoglicosaminidase ativo neutro como definido pela atividade in vitro com respeito a um substrato de glicosaminogli- cano.

[0069] As sHASEGPs de interesse incluem aquelas que são ativas contra os sulfatos de condroitina e proteoglicanos de sulfato de condroi- tina in vivo e in vitro; e aquelas que são ativas contra hialuronan. Como aqui usado, uma sHASEGP humana é aquela codificada por ácido nucléico, tal como DNA, presente no genoma de um ser humano, incluindo todas as variantes alélicas e variações conservadoras contanto que elas não sejam as variantes observadas em outros mamíferos.

[0070] Como aqui usado, "ácido nucléico que codifica um domínio de Hialuronidase ou parte cataliticamente ativa de uma sHASEGP" será interpretado como se referindo a um ácido nucléico que codifica apenas o domínio de Hialuronidase de cadeia única recitado ou sua parte ativa, e não as outras partes contíguas da sHASEGP como uma seqüência contínua.

[0071] Como aqui usado, "doença" ou "distúrbio" refere-se a uma condição patológica em um organismo resultante de, por exemplo, infecção ou defeito genético, e caracterizado pelos sintomas identificáveis.

[0072] Como aqui usado, uma variante de união refere-se a uma variante produzida por processamento diferencial de um transcrito primário do ácido nucléico genômico, tal como DNA, que resulta em mais do que um tipo de mRNA. As variantes de união da sHASEGPs são aqui fornecidas.

[0073] Como aqui usado, o domínio de Hialuronidase de uma proteína da sHASEGP refere-se ao domínio de Hialuronidase de uma sHASEGP que apresenta atividade de endoglicosaminidase neutra. Por isso é pelo menos a parte mínima da proteína que apresenta atividade de endogli- cosaminidase como avaliado por ensaios padrão in vitro. Domínios de Hialu- ronidase humana exemplares incluem pelo menos uma parte suficiente das seqüências de aminoácidos apresentadas na SEQ ID No. 4 para apresentar atividade de endoglicosaminidase.

[0074] Também contempladas são as moléculas de ácido nu- cléico que codificam um polipeptídeo que possui atividade endoglicosamini- dase em um ensaio de Hialuronidase in vitro e que têm pelo menos 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade da seqüência com o comprimento total de um domínio de Hialuronidase de um polipeptídeo de sHASEGP, ou que hibridizam juntamente com o seu comprimento total ou juntamente com pelo menos cerca de 70%, 80% ou 90% do comprimento total em um ácido nucléico que codifica um domínio de Hialuronidase, particularmente sob condições de severidade moderada, geralmente elevada.

[0075] Com relação aos domínios de Hialuronidase, os resíduos na região N-terminal podem ser críticos contudo não suficientes para a atividade. É aqui mostrado que o domínio de Hialuronidase da sHASEGP é cata- liticamente ativa. Em conseqüência, o domínio de Hialuronidase geralmente requer os seus aminoácidos N-terminais para atividade; a parte C-terminal pode ser truncada até que a última Cisteína ainda requeira aminoácidos adicionais para ser idealmente ativa. A quantidade que pode ser removida pode ser determinada empiricamente mediante o teste do polipeptídeo com relação à atividade Hialuronidase em um ensaio in vitro que avalia a clivagem catalítica.

[0076] Portanto as partes menores dos domínios de Hialuroni- dase, particularmente os domínios de cadeia única, daqueles que retêm a atividade Hialuronidase, são contempladas. Tais versões menores geralmente são versões truncadas C-terminal dos domínios de Hialuronidase. Os domínios de Hialuronidase variam no tamanho e constituição, incluindo inserções e anulações nas alças superficiais. Tais domínios apresentam estrutura conservada, incluindo pelo menos um aspecto estrutural, tal como o doador de próton, e/ou outros aspectos de domínios de Hialuronidase das endoglicosa- minidases. Assim, para os propósitos inclusos, o domínio de Hialuronidase é uma parte da cadeia única de uma sHASEGP, como aqui definido, mas é homólogo em seus aspectos estruturais e retenção da seqüência de similaridade ou homologia do domínio de Hialuronidase de outras seqüências semelhantes a hialuronidase. A glicoproteína apresenta atividade de Hialuronidase como uma cadeia única.

[0077] Como aqui usado, por homólogo significa aproximadamente maior do que 25% de identidade de seqüência de ácido nucléico, tal como 25% 40%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95%. Se necessário a homologia percentual será especificada. Os termos "homologia" e "identidade" são fre- qüentemente usados de modo trocável. Em geral, as seqüências são alinhadas de modo que a ordem mais elevada igual é obtida (ver, por exemplo: Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part/, Griffin, A. M., e Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; e Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. e Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carillo et al. (1988) Slam J Applied Math 48]: 1073)

[0078] Por identidade de seqüência, os números de aminoácidos conservados são determinados por programas de algoritmos de alinhamento padrão, e são usados com penalidades de abertura por omissão estabelecidas por cada fornecedor. As moléculas de ácido nucléico substancialmente homólogas devem hibridizar tipicamente em severidade moderada ou em severidade elevada todas juntamente com o comprimento do ácido nucléico ou juntamente com pelo menos cerca de 70%, 80% ou 90% da molécula de ácido nucléico de comprimento total. Da mesma forma são contempladas as moléculas de ácido nucléico que contêm códons degenerados em vez de códons na hibridização da molécula de ácido nucléico.

[0079] Se todas as duas moléculas de ácido nucléico tiverem se- qüências de nucleotídeo que são pelo menos, por exemplo, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% "idênticas" podem ser determinadas usando algoritmos de computador conhecidos tais como o programa "FASTA", usando por exemplo, os parâmetros de omissão como em Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444 outros programas incluem o pacote de programa GCG (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego, 1994, e [CARILLO ETA/.] (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073). Por exemplo, a função BLAST da base de dados do National Center for Biotechnology Information pode ser usada para determinar a identidade. Outros programas comercial ou publicamente disponíveis incluem, DNAS- TAR"MEGALIGN"PROGRAM (Madison, WI) e a University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWG)"Gap" program (Madison WI)). A homologia ou identidade percentual das proteínas e/ou moléculas de ácido nucléico pode ser determinada, por exemplo, mediante a comparação da informação de se- qüência usando um programa de computador GAP, por exemplo, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48: 443, como revisado por Smith e Waterman Adv. Appl. Math (1981) 2:482). Resumidamente, o programa GAP define similarmente qual o número de símbolos alinhados (isto é, nucleotídeos ou aminoá- cidos) que são similares, dividido pelo número total de símbolos na mais curta das duas seqüências. Os parâmetros de omissão para o programa GAP podem incluir: (1) uma matriz de comparação unária (contendo um valor de 1 para identidades e 0 para não-identidades) e a matriz de comparação ponderada de Gribskov et al (1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745, como descrito por Schwartz e Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979); (2) uma penalidade de 3,0 para cada abertura e um adicional de 0,10 penalidade para cada símbolo em cada abertura; e (3) nenhuma penalidade para as aberturas finais. Portanto, como aqui usado, o termo "identidade" representa uma comparação entre um teste e um polipeptídeo ou polinucleotídeo de referência.

[0080] Como aqui usado, o termo pelo menos "90% idêntico a" refere-se às identidades percentuais de 90 a 99,99 em relação aos polipeptí- deos de referência. A identidade em um nível de 90% ou mais é indicativo do fato de que, adotando para propósitos de exemplificação, um comprimento de polinucleotídeo de teste e referência de 100 aminoácidos são comparados. Não mais do que 10% (isto é, 10 dos 100) de aminoácidos no polipeptídeo de teste diferem daqueles dos polipeptídeos de referência. Comparações similares podem ser feitas entre um polinucleotídeo de teste e de referência. Tais diferenças podem ser representadas como mutações de ponto aleatoriamente distribuídas sobre o comprimento inteiro de uma seqüência de aminoácido ou elas podem ser agrupadas em uma ou mais locações de comprimento variável até o máximo tolerável, por exemplo, diferença de aminoácido de 10/100 (aproximadamente 90% de identidade). As diferenças são definidas como substituições de ácido nucléico ou aminoácido, ou anulações. No nível de ho- mologias ou identidades acima de cerca de 85 a 90%, o resultado deve ser independente do programa e os parâmetros de abertura fixados; tais níveis elevados de identidade podem ser avaliados facilmente, freqüentemente sem contar com software.

[0081] Como aqui usado, preparador refere-se a um oligonucle- otídeo contendo dois ou mais desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos, tipicamente mais do que três, dos quais síntese de um produto de extensão de preparador pode ser iniciada. Condições experimentais conduzentes com a síntese incluem a presença de trifosfatos de nucleosídeo e um agente para a polimerização e extensão, tal como DNA polimerase, e um tampão, temperatura e pH adequados.

[0082] Como aqui usado, animais incluem qualquer animal, tais como, mas não são limitadas a, cabras, vacas, cervo, ovelha, roedores, porcos e seres humanos. Animais não-humanos, excluem os seres humanos como o animal contemplado. As sHASEGPs aqui fornecidas são de qualquer fonte, animal, planta, procariótica e fúngica. A maioria das sHASEGP’s são de origem animal, incluindo origem de mamífero.

[0083] Como aqui usado, a terapia genética envolve a transferência de ácido nucléico heterólogo, tal como DNA, para o interior de certas células, células alvo, de um mamífero, particularmente um ser humano, com um distúrbio ou condições para as quais tal terapia é procurada. O ácido nu- cléico, tal como DNA, é introduzido para dentro das células alvos selecionadas em uma maneira tal que o ácido nucléico heterólogo, tal como DNA, é expresso e um produto terapêutico codificado desse modo é produzido.

[0084] Alternativamente, o ácido nucléico heterólogo, tal como DNA, pode de alguma maneira mediar a expressão do DNA que codifica o produto terapêutico, ou pode codificar um produto, tal como um peptídeo ou RNA que de alguma maneira media, direta ou inderetamente, a expressão de um produto terapêutico. A terapia genética pode também ser usada para liberar o ácido nucléico que codifica um produto genético que substitui um gene defectivo ou suplementa um produto genético produzido pelo mamífero ou pela célula em que é introduzido. O ácido nucléico introduzido pode codificar um composto terapêutico, tal como um inibidor do fator de crescimento deste, ou um fator da necrose tumoral ou inibidor deste, tal como um receptor, que não é normalmente produzido no hospedeiro mamífero ou que não é produ-zido em quantidades terapeuticamente eficazes ou em um momento terapeu- ticamente útil. O ácido nucléico heterólogo, tal como DNA, que codifica o produto terapêutico pode ser modificado antes da introdução para o interior das células do hospedeiro aflito de modo a intensificar ou de outra maneira alterar o seu produto ou expressão. A terapia genética pode também envolver a liberação de um inibidor ou represssor ou outro modulador da expressão genética.

[0085] Como aqui usado, ácido nucléico heterólogo é o ácido nu- cléico (se o DNA codifica o RNA) e proteínas que não são normalmente produzidas in vivo pela célula em que ele se expressa ou que media ou codifica os mediadores que alteram a expressão do ácido nucléico endógeno, tal como DNA, por afetar a transcrição, tradução ou outros processos bioquímicos reguláveis. O ácido nucléico heterólogo, tal como DNA, pode também ser referido como ácido nucléico exógeno, tal como DNA. Qualquer ácido nucléico, tal como DNA, em que uma pessoa versada na técnica reconheceria ou consideraria como heterólogo ou exógeno na célula em que é expresso, é aqui incluído por ácido nucléico heterólogo; o ácido nucléico heterólogo inclui ácido nucléico adicionado de modo exógeno que é também expresso de modo en-dógeno. Exemplos de ácido nucléico heterólogo incluem, mas não são limitados a, ácido nucléico que codifica proteínas marcadoras rastreáveis, tais como uma proteína que confere resistência à droga, ácido nucléico que codifica substâncias terapeuticamente eficazes, tais como agentes anticâncer, enzimas e hormônios, e ácido nucléico, tal com DNA, que codifica outros tipos de proteínas, tais como anticorpos. Os anticorpos que são codificados por ácido nucléico heterólogo podem ser secretados ou expressos na superfície da célula em que o ácido nucléico heterólogo foi introduzido.

[0086] O ácido nucléico heterólogo é geralmente não-endógeno para a célula em que é introduzido, mas foi obtido a partir de uma outra célula ou preparado sinteticamente.

[0087] De uma forma geral, embora não necessariamente, tal ácido nucléico codifica o RNA e as proteínas que não são normalmente produzidas pela célula em que é expresso.

[0088] Como aqui usado, um produto terapeuticamente eficaz é um produto que é codificado pelo ácido nucléico heterólogo, tipicamente DNA, que, após a introdução do ácido nucléico para dentro de um hospedeiro, um produto é expresso que melhora ou elimina os sintomas, manifestações de uma doença herdada ou adquirida ou que cure a doença.

[0089] Como aqui usado, a recitação de que uma glicoproteína consiste essencialmente no domínio de Hialuronidase significa que a parte da sHASEGP única do polipeptídeo é um domínio de Hialuronidase ou uma parte cataliticamente ativa deste. O polipeptídeo pode opcionalmente incluir, e ge-ralmente incluirá, seqüências derivadas de não sHASEGP adicionais de ami- noácidos.

[0090] Como aqui usado, domínio refere-se a uma parte de uma molécula, por exemplo, glicoproteínas ou os ácido nucléicos codificadores, que é estrutural e/ou funcionalmente distinta de outras partes da molécula.

[0091] Como aqui usado, Hialuronidase refere-se a uma enzima catalisando hidrólise de glicosaminoglicanos.

[0092] Para clareza a referência à Hialuronidase refere-se a todas as formas, e as formas particulares serão especificamente designadas. Para os propósitos inclusos, o domínio de Hialuronidase inclui as formas ligadas a membrana e solúveis de uma proteína sHASEGP.

[0093] Como aqui usado, ácidos nucléicos incluem DNA, RNA e seus análogos, incluindo ácidos nucléicos da proteína (PNA) e misturas destes. Os ácidos nucléicos podem ser de filamento único ou duplo. Quando refere-se às sondas ou iniciadores, opcionalmente rotulados, com um rótulo de- tectável, tal como um fluorescente ou radiorrótulo, as moléculas de filamento único são contempladas. Tais moléculas são tipicamente de um comprimento tal que seu alvo é estatisticamente único ou de número de cópia baixo (tipicamente menos do que 5, geralmente menos do que 3) para sondar ou iniciar uma biblioteca. Geralmente uma sonda ou preparador contém pelo menos 14, 16 ou 30 contíguos de seqüência complementar a ou idêntica a um gene de interesse. As sondas e iniciadores podem ser de 10, 20, 30, 50, 100 ou mais ácidos nucléicos de extensão.

[0094] Como aqui usado, ácido nucléico que codifica um fragmento ou parte de uma sHASEGP refere-se a um ácido nucléico que codifica apenas o fragmento ou porção recitado de sHASEGP, e não as outras partes contíguas da sHASEGP.

[0095] Como aqui usado, ligação operativa de ácido nucléico he- terólogo às seqüências reguladoras ou efetoras de nucleotídeos, tais como promotores, intensificadores, sítios de parada transcricionais e translacionais, e outras seqüências de sinal, refere-se à conexão entre tal ácido nucléico, tal como DNA, e tais seqüências de nucleotídeos. Por exemplo, a ligação operativa de DNA heterólogo a um promotor refere-se à conexão física entre o DNA e o promotor tal que a transcrição de tal DNA é iniciada a partir do promotor por uma RNA polimerase que especificamente reconhece, se liga e transcreve o DNA no quadro de leitura. Assim, operativamente ligado ou operacionalmente associado refere-se à conexão funcional de ácido nucléico, tal como DNA, com seqüências reguladores e efetoras de nucleotídeos, tal como promotores, intensificadores, sítios de parada transcricionais e translacionais, e outras seqüências de sinal. Por exemplo, a ligação operativa de DNA a um promotor refere-se à conexão física e funcional entre o DNA e o promotor tal que a transcrição de tal DNA é iniciada a partir do promotor por uma RNA polimerase que especificamente reconhece, se liga e transcreve o DNA. De modo a otimizar a expressão e/ou transcrição in vitro, pode ser necessário remover, adicionar ou alterar as partes não traduzidas 5’ dos clones para eliminar os códons de iniciação da tradução extra potencial alternativa inapro- priada (isto é, de partida) ou outras seqüências que podem interferir com a expressão ou reduzi-la, no nível de transcrição ou tradução. Alternativamente, sítios de ligação em ribossoma de consenso (ver, por exemplo, Kozak J. Biol. Chem. 266: 19867- 19870 (1991)) podem ser inseridos imediatamente 5’ do códon de partida e podem intensificar a expressão. O desejo de (ou necessidade para) tal modificação pode ser empiricamente determinada.

[0096] Como aqui usado, uma seqüência complementar a pelo menos uma parte de um RNA, com referência aos oligonucleotídeos anti-sentido, significa uma seqüência tendo expressão suficiente para ser capaz de hibridizar com o RNA, geralmente sob condições de severidade moderada ou elevada, formando um duplex estável; no caso de ácidos nucléicos anti-sentido de sHASEGP de filamento duplo, um filamento único do DNA duplo (ou dsRNA) pode assim ser testado, ou formação tripla pode ser analisada. A capacidade de hibridizar depende do grau de expressão e o comprimento do ácido nucléico anti-sentido. Geralmente, quanto mais extenso o ácido nucléico de hibridização, tanto mais ligações imperfeitas de base com uma sHASEGP que codifica o RNA podem conter e ainda formar um dúplex estável (ou tríplex, quando o caso couber). Uma pessoa versada na técnica pode verificar um grau tolerável de ligação imperfeita mediante o uso de procedimentos padrão para determinar o ponto de fusão do complexo hibridizado.

[0097] Para os propósitos inclusos, as substituições de aminoá- cido podem ser feitas em qualquer uma das sHASEGPs e seus domínios de Hialuronidase contanto que a proteína resultante apresente atividade Hialuro- nidase. As substituições de aminoácido contempladas incluem substituições conservadoras, tais como aquelas apresentadas na Tabela 1, que não eliminam a atividade proteolítica. Como aqui descrito, as substituições que alteram as propriedades das proteínas, tais como a remoção dos sítios de clivagem et al. tais sítios, são também contempladas; tais substituições são geralmente não-conservadoras, mas podem ser facilmente efetuadas por aqueles versados na técnica.

[0098] As substituições conservadoras adequadas de aminoáci- dos são conhecidas por aqueles versados nesta técnica e podem ser preparadas geralmente sem alterar a atividade biológica, por exemplo, atividade enzimática, da molécula resultante. Aqueles versados nesta técnica reconhecem que, em geral, as substituições de aminoácido isoladas nas regiões não- essenciais de um polipeptídeo não alteram substancialmente a atividade biológica (ver, por exemplo, Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4a Edição, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. co., p.224). Também incluídos dentro da definição, é o fragmento cataliticamente ativo de uma sHASEGP, particularmente uma parte da Hialuronidase de cadeia única. As substituições de aminoácido conservadoras são feitas, por exemplo, de acordo com aquelas apresentadas na TABELA 1 como se segue:

[0099] TABELA 1 Substituição Conservadora de Resíduo Original Ala (A) Gly; Ser, Abu Arg (R) Lys, orn Asn (N) Gln ; His Cys (C) Ser Gin (Q) Asn Glu (E) ASP Gly (G) Ala ; Pro His (H) Asn; Gin Ile (I) Leu; Val ; Met; Nle ; Nva Leu (L); Val ; Met; Nle ; Nv Lys (K) Arg; Gin ; Glu Met (M) Leu; Tyr; Ile ; NLe Val Ornitina Lys; Arg Phe (F) Met; Leu; Tyr Ser (S) Thr Thr (T) Ser Trp (W) Tyr Tyr (Y) Trp; Phe Val (V) ILE; Leu; Met; Nle ; Nv. Outras substituições são também admissíveis e podem ser determinadas empiricamente ou de acordo com as substituições conservadoras.

[00100] Como aqui usado, Abu é ácido 2-aminobutírico; Orn é ornitina. Como aqui usado, os aminoácidos, que ocorrem nas várias seqüên- cias de aminoácido que aparecem inclusas, são identificados de acordo com suas abreviações de três letras ou uma letra bem-conhecidas. Os nucleotí- deos, que ocorrem nos vários fragmentos de DNA, são designados com as designações de uma letra padrão usadas rotineiramente na técnica.

[00101] Como aqui usado, uma sonda ou preparador com base em uma seqüência de nucleotídeo aqui apresentada, inclui pelo menos 10, 14, tipicamente pelo menos 16 seqüências contíguas de nucleotídeos da SEQ ID NO: 6, e sondas de pelo menos 30, 50 ou 100 seqüências contíguas de nucleotídeos da SEQ ID NO: 6. O comprimento da sonda ou preparador para a hibridização única é uma função da complexidade do genoma de interesse.

[00102] Como aqui usado, a melhora dos sintomas de um distúrbio particular mediante a administração de uma composição farmacêutica particular refere-se a qualquer diminuição, quer permanente quer temporária, duradoura ou transitória, que pode ser atribuída ou associada com a adminis-tração da composição.

[00103] Como aqui usado, polinucleotídeos anti-sentidos referem-se ás seqüências sintéticas de bases de nucleotídeo complementares ao mRNA ou o sentido do filamento do DNA de filamento duplo. Mistura de poli- nucleotídeos sentido e anti-sentido sob condições apropriadas resulta na ligação das duas moléculas, ou hibridização. Quando estes polinucleotídeos se ligam ao (hibridizam com) mRNA, a inibição da síntese de proteína (tradução) ocorre. Quando estes polinucleotídeos se ligam ao DNA de filamento duplo, a inibição da síntese de RNA (transcrição) ocorre.

[00104] A inibição resultante da tradução e/ou transcrição leva a uma inibição da síntese da proteína codificada pelo filamento sentido. A molécula de ácido nucléico anti-sentido tipicamente contém um número suficiente de nucleotídeos para especificamente se ligar a um ácido nucléico alvo, geralmente pelo menos 5 nucleotídeos contíguos, freqüentemente pelo menos 14 ou 16 ou 30 nucleotídeos contíguos ou nucleotídeos modificados complementares à parte de codificação de uma molécula de ácido nucléico que codifica um gene de interesse, por exemplo, ácido nucléico que codifica um domínio de Hialuronidase de cadeia única de uma sHASEGP.

[00105] Como aqui usado, uma série refere-se a uma coleção de elementos, tais como anticorpos, contendo três ou mais membros. Uma série endereçável é aquela em que os membros da série são identificáveis, tipicamente pela posição em um suporte de fase sólida. Portanto, em geral os membros da série são imobilizados em locais identificáveis discretos sobre a superfície de uma fase sólida.

[00106] Como aqui usado, anticorpo refere-se a uma imunoglo- bulina, quer natural quer parcial ou completamente produzida de forma sintética, incluindo qualquer derivado deste que retenha a capacidade de ligação específica do anticorpo. Por isso anticorpo inclui qualquer proteína tendo um domínio de ligação que é homólogo ou substancialmente homólogo a um domínio de ligação a imunoglobulina. Os anticorpos incluem membros de quaisquer reivindicações de imunoglobulina, incluindo IgG, IgM, IgA, IgD e IgE.

[00107] Como aqui usado, fragmento de anticorpo refere-se a qualquer derivado de um anticorpo que seja menor do que o comprimento total, retendo pelo menos uma parte da capacidade de ligação específica do anticorpo de comprimento total. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, mas não são limitados a, Fab, Fab’, F(AB)2, Fvs de cadeia única (scFV), FV, diacorpo diacorpo dsFV e fragmentos Fd. O fragmento pode incluir múltiplas cadeias ligadas juntas, tais como por pontes de dissulfeto. Um fragmento de anticorpo geralmente contém pelo menos cerca de 50 aminoácidos e tipicamente pelo menos 200 aminoácidos.

[00108] Como aqui usado, um fragmento de anticorpo Fv é composto de um domínio pesado variável (VH) e um domínio leve variável ligado por interações não-covalentes.

[00109] Como aqui usado, um dsFV refere-se a um Fv com uma ligação de dissulfeto intramolecular planejada.

[00110] Como aqui usado, um fragmento F(AB)2 é um fragmento de anticorpo que resulta da digestão de uma imunoglobulina com pep- sina em pH 4,0-4,5; pode ser recombinantemente expresso para produzir o fragmento equivalente.

[00111] Como aqui usado, os fragmentos Fab são fragmentos de anticorpo que resultam da digestão de uma imunoglobulina com papaína; eles podem ser recombinantemente expressos para produzir o fragmento equivalente.

[00112] Como aqui usado, scFVs refere-sem aos fragmentos de anticorpo que contêm uma cadeia leve variável V, e cadeia pesada variável (VH) covalentemente conectados por um articulador de polipeptídeo em qualquer ordem. O articulador é de um comprimento tal que os dois domínios variáveis são ligados com ponte sem interferência substancial. Os ligantes incluídos são resíduos n (Gly-Ser) com um pouco de resíduos Glu ou Lys dispersos em todas as partes para aumentar a solubilidade.

[00113] Como aqui usado, anticorpos humanizados refere-sem a anticorpos que são modificados para incluir seqüências humanas de amino- ácidos de modo que a administração a um ser humano não provoca uma resposta imune. Métodos para a preparação de tais anticorpos são conhecidos. Por exemplo, para produzir tais anticorpos, o hibridoma ou outra célula proca- riótica ou eucariótica, tal como um E. coli ou célula CHO, que expressa o anticorpo monoclonal, é alterada por técnicas de DNA recombinante para expressar um anticorpo em que a composição de aminoácido da região não variável se baseia em anticorpos humanos. Programas de computador foram designados para identificar tais regiões.

[00114] Como aqui usado, diacorpo são scFV diméricos; diacor- pos tipicamente possuem ligantes de peptídeo mais curtos do que ScFVs, e eles geralmente dimerizam.

[00115] Como aqui usado, produção por meios recombinantes mediante o uso de métodos de DNA recombinante significa o uso dos métodos bem-conhecidos de biologia molecular para expressar proteínas codificadas pelo DNA clonado.

[00116] Como aqui usado o termo avaliação é planejado para incluir a determinação quantitativa e qualitativa no sentido de se obter um valor absoluto para a atividade de uma sHASEGP, ou um domínio desta, presente na amostra, e também de se obter um índice, relação, porcentagem, visual ou outro valor indicativo do nível de atividade. A avaliação pode ser direta ou indireta e as espécies químicas realmente detectadas não necessitam naturalmente de ser o produto da proteólise propriamente dito, mas pode, por exemplo, ser um derivado deste ou alguma outra substância.

[00117] Como aqui usado, atividade biológica refere-se às atividades in vivo de um composto ou respostas fisiológicas que resultam após a administração in vivo de um composto, composição ou outra mistura. A atividade biológica, desta maneira, abrange os efeitos terapêuticos e atividade farmacêutica de tais compostos, composições e misturas. As atividades biológicas podem ser observadas em sistemas in vitro designados para testar ou usar tais atividades. Assim, para os propósitos inclusos a atividade biológica de uma luciferase é sua atividade oxigenase por meio da qual, após oxidação de um substrato, luz é produzida.

[00118] Como aqui usado, atividade funcional refere-se a um po- lipeptídeo ou parte deste que desempenha uma ou mais atividades associadas com uma proteína de comprimento total.

[00119] Atividades funcionais incluem, mas não são limitados a, atividade biológica, atividade catalítica ou enzimática, antigenicidade (capacidade de ligar ou competir com um polipeptídeo para ligação a um anticorpo antipolipeptídeo), imunogenicidade, capacidade para formar multímeros, a ca-pacidade para especificamente se ligar a um receptor ou ligando para o poli- peptídeo.

[00120] Como aqui usado, um conjugado refere-se aos compostos aqui fornecidos que incluem uma ou mais sHASEGPs, incluindo uma sHASEGP, particularmente domínios de Hialuronidase de cadeia única desta, e um ou mais agentes de direcionamento. Estes conjugados incluem aqueles produzidos por meios recombinantes como proteínas de fusão, aqueles produzidos por meio químico, tais como por acoplamento químico, através do, por exemplo, acoplamento aos grupos sulfidrila, e aqueles produzidos por qualquer outro método por meio do qual pelo menos uma sHASEGP, ou um domínio desta, é ligada, direta ou indiretamente através do(s) articulador(es) a um agente de direcionamento.

[00121] Como aqui usado, um agente de direcionamento é qualquer porção, tal como uma proteína ou parte eficaz desta, que fornece ligação específica do conjugado a um receptor da superfície celular, que, pode internalizar o conjugado ou parte da sHASEGP deste. Um agente de direcionamento pode também ser aquele que promove ou facilita, por exemplo, o isolamento ou purificação por afinidade do conjugado; a ligação do conjugado a uma superfície; ou a detecção do conjugado ou complexos contendo o conjugado.

[00122] Como aqui usado, um conjugado de anticorpo refere-se a um conjugado em que o agente de direcionamento é um anticorpo.

[00123] Como aqui usado, derivado ou análogo de uma molécula refere-se a uma parte derivada ou uma versão modificada da molécula.

[00124] Como aqui usado, uma quantidade eficaz de um composto para o tratamento de uma doença particular é uma quantidade que é suficiente para melhorar, ou de alguma maneira reduzir os sintomas associados com a doença. Tal quantidade pode ser administrada como uma dosagem única ou pode ser administrada de acordo com um regime, pelo qual é eficaz. A quantidade pode curar a doença mas, tipicamente, é administrada de modo a melhorar os sintomas da doença. A administração repetida pode ser requerida para se obter a melhora desejada dos sintomas.

[00125] Como aqui usado, equivalente, quando refere-se a duas seqüências de ácidos nucléicos, significa que as duas seqüências em questão codificam a mesma seqüência de aminoácidos ou proteínas equivalentes. Quando equivalente for usado na referência de duas proteínas ou peptídeos, significa que as duas proteínas ou peptídeos possuem substancialmente a mesma seqüência de aminoácido com apenas substituições de aminoácido (tal como, mas não limitado a, mudanças conservadoras tais como aquelas apresentadas na Tabela 1 acima) que substancialmente não alteram a atividade ou função da proteína ou peptídeo. Quando equivalente refere-se a uma propriedade, a propriedade não necessita estar presente ao mesmo tempo (por exemplo, dois peptídeos podem apresentar diferentes taxas do mesmo tipo de atividade enzimática), mas as atividades são geralmente de uma forma substancial as mesmas. Complementar, quando se referir a duas seqüências de nucleotídeo, significa que as duas seqüências de nucleotídeos são capazes de hibridizar, tipicamente com menos do que 25%, 15%, 5% ou 0% de ligações imperfeitas entre os nucleotídeos opostos. Se necessário a porcentagem da capacidade de expressão será especificada. Tipicamente as duas moléculas são selecionadas tais que elas se hibridizarão sob as condições de severidade elevada.

[00126] Como aqui usado, um agente que modula a atividade de uma proteína ou expressão de um gene ou ácido nucléico, ou diminui ou aumenta ou de outra maneira altera a atividade da proteína ou, da mesma maneira supra ou subregula ou de outra maneira altera a expressão do ácido nucléico em uma célula.

[00127] Como aqui usado, inibidor da atividade de uma sHASEGP abrange qualquer substância que proíbe ou diminui a produção, modificação(ões) pós-traducional(is), maturação ou localização da membrana da sHASEGP ou qualquer substância que interfira com a eficácia proteolítica desta ou a diminua, particularmente de uma forma de cadeia única em um ensaio de triagem in vitro.

[00128] Como aqui usado, um método para o tratamento ou prevenção de doença neoplástica significa que qualquer um dos sintomas, tais como tumor, metástase deste, a vascularização dos tumores ou outros parâmetros pelos quais a doença é caracterizada são reduzidos, melhorados, prevenidos, colocados em um estado de remissão ou mantidos em um estado de remissão. Também significa que as marcas da doença neoplástica e metás- tase podem ser eliminadas, reduzidas ou prevenidas pelo tratamento. Exemplos não limitativos das marcas incluem degradação não-controlada da membrana de base e matriz extracelular próxima, migração, divisão e organização das células endoteliais em novos capilares que funcionam, e a persistência de tais capilares que funcionam.

[00129] Como aqui usado, sais, ésteres ou outros derivados far- maceuticamente aceitáveis dos conjugados incluem quaisquer sais, ésteres ou derivados que podem ser facilmente preparados por aqueles versados nesta técnica usando métodos conhecidos para tal derivatização e que produzem compostos que podem ser administrados aos amimais ou seres humanos sem efeitos tóxicos substanciais e que ou são ativos farmacêuticos ou são pró-drogas.

[00130] Como aqui usado, uma pró-droga é um composto que, após a administração in vivo, é metabolizado ou de outra maneira convertido na forma biológica, farmacêutica ou terapeuticamente ativa do composto. Para produzir uma pró-droga, o composto ativo farmacêutico é modificado tal que o composto ativo é regenerado por processos metabólicos. A pró-droga pode ser designada para alterar a estabilidade metabólica ou as características de transporte de uma droga, para mascarar os efeitos colaterais ou toxicidade, para melhorar o sabor de uma droga ou alterar outras características ou propriedades de uma droga. Em virtude do conhecimento dos processos farmacodinâmicos e metabolismo do droga in vivo, aqueles versados nesta técnica, assim que um composto farmaceuticamente ativo é conhecido, pode projetar pró-drogas do composto (ver, por exemplo, Nogrady (1985) Medicinal Chemistry A Biochemical Approach, Oxford University Press, New York, páginas 388-392).

[00131] Como aqui usado, uma droga identificada pelos métodos de triagem aqui fornecidos refere-se a qualquer composto que é um candidato para uso como um produto terapêutico ou como um composto de vanguarda para o projeto de um produto terapêutico. Tais compostos podem ser moléculas pequenas, incluindo moléculas orgânicas pequenas, peptídeos, mi- méticos de peptídeo, moléculas anti-sentido ou dsRNA, tal como RNAi, anticorpos, fragmentos de anticorpos, anticorpos recombinantes et al. tais compostos que podem servir como candidatos a droga ou compostos de vanguarda.

[00132] Como aqui usado, um peptidomimético é um composto que imita a conformação e certos aspectos estereoquímicos da forma biologicamente ativa de um peptídeo particular. Em geral, os peptidomiméticos são designados para imitar certas propriedades desejadas de um composto, mas não as propriedades indesejáveis, tais como flexibilidade, que leva a uma perda de uma conformação biologicamente ativa e avaria na ligação. Os pep- tidomiméticos podem ser preparados a partir dos compostos biologicamente ativos mediante a substituição de certos grupos ou ligações que contribuem com as propriedades indesejáveis com bioisósteres. Os bioisósteres são conhecidos daqueles versados na técnica. Por exemplo, o bioisóstero de meti- leno CH2S foi usado como uma substituição de amida nos análogos de ence- falina (ver., por exemplo, Spatola (1983) pp. 267-357 em Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, Weistein, Ed. volume 7, Marcel Dekker, New York). Morfina, que pode ser administrada oralmente, é um composto que é peptidomimético da endorfina de peptídeo. Para os propósitos inclusos, peptídeos cíclicos são incluídos entre os peptidomiméti- cos.

[00133] Como aqui usado, uma região promotora ou elemento promotor refere-se a um segmento de DNA ou RNA que controla a transcrição do DNA ou RNA ao qual é operativamente ligado. A região promotora inclui seqüências específicas que são suficientes para o reconhecimento, ligação e início da transcrição da RNA polimerase.

[00134] Essa parte da região promotora é referida como o promotor. Além disso, a região promotora inclui seqüências que modulam esta atividade de reconhecimento, ligação e início da transcrição da RNA polime- rase. Estas seqüências podem ser fatores de atuação cis ou podem ser res- ponsivos à atuação trans. Os promotores, dependendo da natureza da regulação, podem ser constitutivos ou regulados. Promotores exemplares contemplados para uso procariotas incluem os promotores T7 e T3 bacteriófagos.

[00135] Como aqui usado, um receptor refere-se a uma molécula que possui uma afinidade para um dado ligando. Os receptores podem ser moléculas de ocorrência natural ou sintéticas. Os receptores podem também ser referidos na técnica como antiligandos. Como aqui usado, o receptor e antiligando são intercambiáveis. Os receptores podem ser usados em seu estado não-alterado ou como agregados com outras espécies. Os receptores podem ser ligados, covalente ou não covalentemente, ou em contato físico com um membro de ligação, ou direta ou indiretamente através de uma substância ou articulador de ligação específica. Exemplos de receptores, incluem, mas não são limitados a,: anticorpos, receptores da membrana celular, receptores superficiais e receptores de internalização, anticorpos monoclonais e anti-soro reativo com determinantes antigênicos específicos tais como nos vírus, células ou outros materiais, drogas, polinucleotídeos, ácidos nucléicos, peptídeos, fatores, lecitinas, açúcares, polissacarídeos, células, membranas celulares e organelas.

[00136] Exemplos de receptores e aplicações usando tais receptores, incluem mas não são restritos a: a) enzimas: proteínas ou enzimas de transporte específico essenciais para a sobrevivência de microorganismos, que podem servir como alvos para a seleção de antibiótico [ligando]; b) anticorpos: a identificação de um sítio de ligação de ligando na molécula de anticorpo que combina com o epítopo de um antígeno de interesse pode ser investigada; a determinação de uma seqüência que imita um epítopo antigênico pode resultar no desenvolvimento de vacinas das quais o imunógeno se baseia em uma ou mais de tais seqüências ou resultar no desenvolvimento de agentes ou compostos de diagnóstico relacionados úteis nos tratamentos terapêuticos tais como para doenças auto-imunes; c) ácidos nucléicos: identificação de ligando, tal como proteína ou RNA, sítios de ligação; d) polipeptídeos catalíticos: polímeros, incluindo polipeptídeos, que são capazes de promover uma reação química que envolve a conversão de um ou mais reagentes a um ou mais produtos; tais polipeptídeos de uma forma geral incluem um sítio de ligação específico para pelo menos um reagente ou intermediário de reação e uma funcionalidade ativa próxima ao sítio de ligação, em que a funcionalidade é capaz de quimicamente modificar o reagente ligado (ver, por exemplo, a Patente U.S. número 5.215.899); e e) receptores de hormônio: a determinação dos ligandos que se ligam com afinidade elevada a um receptor é útil no desenvolvimento das terapias de substituição do hormônio; por exemplo, a identificação de ligandos que se ligam a tais receptores pode levar ao desenvolvimento de drogas para controlar a pressão sangüínea; e f) receptores de opiáceo: a determinação de ligandos que se ligam aos receptores de opiáceo no cérebro é útil no desenvolvimento de substituições menos viciantes com relação à morfina e drogas relacionadas.

[00137] Como aqui usado, amostra refere-se a qualquer coisa que possa conter um analito para a qual a análise do analito é desejado. A amostra pode ser uma amostra biológica, tal como um fluido biológico ou um tecido biológico. Exemplos de fluidos biológicos incluem urina, sangue, plasma, soro, saliva, sêmen, evacuação, esputo, fluido cérebro espinhal, lágrimas, muco, esperma, fluido amniótico ou coisa parecida. Os tecidos biólo- gicos são agregados de células, geralmente de uma espécie particular juntamente com sua substância intracelular, que formam um dos materiais estruturais de uma estrutura humana, animal, planta, bacteriana, fúngica ou viral, incluindo os tecidos conjuntivos, epiteliais, musculares e nervosos. Exemplos de tecidos biológicos também incluem órgãos, tumores, linfonodos, artérias e células individuais.

[00138] Como aqui usado: severidade de hibridização na determinação do percentual de ligação imperfeita é como se segue: 1) severidade elevada: 0,1 x SSPE, 0,1% SDS, 65°C 2) severidade média: 0,2 x SspE, 0,1% SDS, 50°C 3) severidade baixa: 1,0 x SspE, 0,1% SDS, 50°C. Aqueles versados nesta técnica sabem que a etapa de lavagem seleciona com relação aos híbridos estáveis e também conhecem os ingredientes de SspE (ver, por exemplo, Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis, em Molecular Cloning, A Labo-ratory Manual, Cold spring Harbor Laboratory Press 1989 Vol 3, p. B. 13, ver, também, os numerosos catálogos que descrevem as soluções de laboratório comumente usadas). SspE é NaCl 0,18 tamponando com fosfato de pH 7,4. Além disso, aqueles versados na técnica reconhecem que a estabilidade dos híbridos é determinada por TmT que é uma função da concentração de íon de sódio e temperatura (Tm = 81,5°C-16,6 + 0,41 (% G+C)-600/L)) de modo que os únicos parâmetros nas condições de lavagem críticas para a estabilidade híbrida são a concentração de íon de sódio na SspE (ou SSC) e temperatura.

[00139] Fica compreendido que as severidades equivalentes podem ser alcançadas usando tamponantes, sais e temperaturas alternativos. Por meio de exemplo e não limitação, os procedimentos usando as condições de severidade baixa são como se segue (ver também Shilo e Weinberg, Proc. Natl. Acad Sci USA 78: 6789-6792 (1981)): Os filtros contendo DNA são pré- tratados por 6 horas a 40 C em uma solução contendo 35% formamida, 5X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM EDTA, 0,1% PVP, 0,1% Ficoll 1% BSA, e 500 ug/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado (10x) SSC é 1,5 M cloreto de sódio, e 0,15 M citrato de sódio, ajustado para um pH de 7).

[00140] As hibridizações são realizadas na mesma solução com as seguintes modificações: 0,02% PVP, 0,02% Ficoll 0,2% BSA, 100VG/M DNA de esperma, 10% (peso/vol) sulfato de dextrano, e 5-20 X 106 cpm sonda rotulada 32P é usada. Os filtros são incubados na mistura de hibridização por 18 a 20 horas a 40 oC e depois lavados por 1,5 hora a 55 oC em uma solução contendo 2X SSC, 25 mM Tris-HCI (pH 7,4), 5 mM EDTA, e 0,1% SDS. A solução de lavagem é substituída com solução nova e incubada um adicional de 1,5 hora a 60 oC. Os filtros são manchados secos e expostos para auto- rradiografia. Se necessário, os filtros são lavados por um terceiro tempo em 65 a 68 oC e re-expostos a película. Outras condições de severidade baixa que podem ser usadas são bem-conhecidas na técnica, por exemplo, como empregado para hibridizações de espécies cruzadas.

[00141] Por meio de exemplo e não por meio de limitação, os procedimetos usando as condições de severidade moderada incluem, por exemplo, mas não são limitados a, os procedimentos usando tais condições de severidade moderada como se segue: Filtros contendo DNA são pré-trata- dos por 6 horas a 55 oC em uma solução contendo 6X SSC, 5X solução de Denhart, 0,5% SDS e 100 ug/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado. As hibridizações são realizadas na mesma solução e 5-20 X 106 sonda rotulada 32P é usada. Os filtros são incubados na mistura de hibridização por 18 a 20 horas a 55oC e depois lavados duas vezes por 30 minutos a 60oC em uma solução contendo 1X SSC e 0,1% SDS. Os filtros são manchados secos e expostos para auto-radiografia. Outras condições de severidade moderada que podem ser usadas são bem-conhecidas na técnica. A lavagem dos filtros é feita a 37 oC por 1 hora em uma solução contendo 2X SSC, 0,1% SDS.

[00142] Por meio de exemplo e não por meio de limitação, os procedimentos usando as condições de severidade elevada são como se segue: Pré-hibridização dos filtros contendo DNA é realizada por 8 horas durante a noite em 65 oC em tampão composto de 6X SSC, 50 mM Tris-HCI (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,02% PVP, 0,02% Ficoll, 0,02% BSA, e 500 ug/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado. Os filtros são hibridizados por 48 horas a 65°C na mistura de pré-hibridização contendo 100 ug/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado e 5-20 X 106 CPM sonda rotulada 32P. A lavagem dos filtros é feita em 37oC por 1 hora em uma solução contendo 2X SSC, 0,01% PVP, 0,01% Ficoll, e 0,01% BSA. Isto é seguido por uma lavagem em 0,1X SSC a 50oC por 45 minutos ants da autorradiografia. Outras condições de severidade elevada que podem ser usadas são bem-conhecidas na técnica.

[00143] O termo substancialmente idêntico ou substancialmente homólogo ou similar varia com o contexto como compreendido por aqueles versados na técnica pertinente e geralmente significa pelo menos 60% ou 70%, preferivelmente significa pelo menos 80%, 85% ou mais preferivelmente pelo menos 90%, e o mais preferível pelo menos 95% de identidade.

[00144] Como aqui usado, substancialmente idêntico a um produto significa suficientemente similar de modo que a propriedade de interesse é suficientemente não trocada a fim de que o produto substancialmente idêntico possa ser usado em vez do produto.

[00145] Como aqui usado, substancialmente puro significa suficientemente homogêneo para parecer livre de impurezas facilmente detectá- veis como determinado por métodos padrão de análise, tais como a cromato- grafia de camada fina (TLC), eletroforese de gel e cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), usados por aqueles versados na técnica para avaliar tal pureza, ou suficientemente puro tal que outra purificação não detecta- velmente alteraria as propriedades físicas e quimicas, tais como atividades enzimáticas e biológicas, da substância. Métodos para a purificação dos compostos para produzir compostos substancialmente de forma química puros são conhecidos por aqueles versados na técnica. Um composto substancialmente de forma química puro pode, no entanto, ser uma mistura de estereoi- sômeros ou isômeros. Em tais exemplos, outra purificação pode aumentar a atividade específica do composto.

[00146] Como aqui usado, células alvo refere-se a uma célula que expressa uma sHASEGP in vivo.

[00147] Como aqui usado, substância de teste (ou composto de teste) refere-se a um composto quimicamente definido (por exemplo, moléculas orgânicas, moléculas inorgânicas, moléculas orgânicas/inorgânicas, proteínas, peptídeos, ácidos nucléicos, oligonucleotídeos, lipídeos, polissacarí- deos, sacarídeos ou híbridos entre estas moléculas tais como glicoproteínas, etc.) ou misturas de compostos (por exemplo, uma biblioteca de compostos de teste, extratos naturais ou sobrenadantes de cultura, etc.) cujos efeitos em uma sHASEGP, particularmente uma forma de cadeia única que inclui o domínio de Hialuronidase ou uma parte suficiente deste com relação à atividade, como determinado por um método in vitro, tal como os ensaios aqui fornecidos.

[00148] Como aqui usado, os termos um agente terapêutico, regime terapêutico, radioprotetor ou quimioterapêutico significam drogas convencionais e terapias de droga, incluindo vacinas, que são conhecidas por aqueles versados na técnica. Os agentes radioterapêuticos são bem-conhe- cidos na técnica.

[00149] Como aqui usado, tratamento significa qualquer maneira em que os sintomas de uma condição, distúrbio ou doença são melhorados ou de outra maneira beneficamente alterados.

[00150] Tratamento também abrange aqui qualquer uso farmacêutico das composições.

[00151] Como aqui usado, vetor (ou plasmídeo) refere-se a elementos distintos que são usados para introduzir ácido nucléico heterólogo dentro das células para a sua expressão ou replicação. Os vetores tipicamente permanecem epissomais, mas podem ser designados para efetuar a integração de um gene ou parte deste em um cromossoma do genoma. Também contemplados são os vetores que são cromossomas artificiais, tais como cromossomas artificiais de levedura e cromossomas artificiais de mamífero. A seleção e uso de tais veículos são bem-conhecidos por aqueles versados na técnica. Um vetor de expressão inclui vetores capazes de expressar DNA que é operativamente ligado com as seqüências reguladoras, tais como as regiões promotoras, que são capazes de efetuar a expressão de tais fragmentos de DNA. Assim, um vetor de expressão refere-se a um constructo de DNA ou RNA, tal como um plasmídeo, um fago, vírus recombinante ou outro vetor que, após a introdução dentro de uma célula hospedeira apropriada, resulta na expressão do DNA clonado. Os vetores de expressão apropriados são bem-co- nhecidos por aqueles versados na técnica e incluem aqueles que são replicáveis em células eucarióticas e/ou células procarióticas e aqueles que permanecem epissomais ou aqueles que se integram dentro do genoma da célula hospedeira.

[00152] Como aqui usado, seqüência de ligação da proteína refere-se a uma seqüência de proteína ou peptídeo que é capaz de ligação específica a outras seqüências de proteína ou peptídeo de uma forma geral, a uma série de seqüências de proteína ou peptídeo ou a uma seqüência de proteína ou peptídeo particular.

[00153] Como aqui usado, rótulo de epítopo refere-se a uma extensão curta de resíduos de aminoácido correspondendo a um epítopo para facilitar a análise bioquímica e imunológica subseqüente da proteína ou pep- tídeo rotulado do epítopo. A rotulagem do epítopo é obtida mediante a inclusão da seqüência do rótulo de epítopo na seqüência que codifica a proteína em um vetor de expressão apropriado. As proteínas rotuladas do epítopo podem ser purificadas por afinidade usando anticorpos altamente específicos erguidos contra os rótulos.

[00154] Como aqui usado, seqüência de ligação de metal refere- se a uma seqüência de proteína ou peptídeo que é capaz de ligação específica com os íons de metal de uma forma geral, a uma série de íons de metal ou a um íon de metal particular.

[00155] Como aqui usado, uma combinação refere-se a qualquer associação entre dois ou entre mais ítens.

[00156] Como aqui usado, uma composição refere-se a qualquer mistura. Pode ser uma solução, uma suspensão, líquido, pó, uma pasta, aquoso, não-aquoso ou qualquer combinação destes.

[00157] Como aqui usado, fluido refere-se a qualquer composição que possa fluir. Os fluidos assim abrangem as composições que estão na forma de semi-sólidos, pastas, soluções, misturas aquosas, géis, loções, cremes e outras tais composições.

[00158] Como aqui usado, um extrato celular refere-se a uma preparação ou fração que é produzida a partir de uma célula submetida a lise ou rompida.

[00159] Como aqui usado, um agente é dito ser aleatoriamente selecionado quando o agente for escolhido de forma aleatória se considerar as seqüências específicas envolvidas na associação de uma proteína isolada ou com seus substratos associados, pares de ligação, etc. Um exemplo de agentes aleatoriamente selecionados é o uso de uma biblioteca química ou uma biblioteca combinatória de peptídeo, ou um caldo de crescimento de um organismo ou meio condicionado.

[00160] Como aqui usado, um agente é dito de ser racionalmente selecionado ou designado quando o agente é escolhido em uma base não aleatória que leva em conta a seqüência do sítio alvo e/ou sua conformação em conexão com a ação do agente. Como descrito nos Exemplos, existem propostos sítios de ligação com relação a Hialuronidase e sítios (catalíticos) na glicoproteína tendo a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 4. Os agentes podem ser racionalmente selecionados ou racionalmente designados mediante a utilização das seqüências de peptídeo que confeccionam estes sítios. Por exemplo, um agente peptídeo racionalmente selecionado pode ser um peptídeo cuja seqüência de aminoácido é idêntica ao ATP ou sítios ou domínios de ligação de calmodulina.

[00161] Os oligossacarídeos são considerados de terem um extremidade redutora e uma extremidade não-redutora, quer sim quer não o sa- carídeo na extremidade redutora seja de fato um açúcar de redução. De acordo com a nomenclatura aceita, os oligossacarídeos são aqui representados com a extremidade não-redutora na esquerda e a extremidade redutora na direita. Todos os oligossacarídeos aqui descritos são descritos com o nome ou abreviação com relação ao sacarídeo não-redutor (por exemplo, Gal), seguido pela configuração da ligação glicosídica (.alfa. ou .beta.), a ligação de anel, a posição do anel do sacarídeo de redução envolvido na ligação, e depois o nome ou abreviação do sacarídeo redutor (por exemplo, GlcNAc). A ligação entre dois açúcares pode ser expressa, por exemplo, como 2,3 2.fw darw.3, ou (2,3). Cada sacarídeo é uma piranose.

[00162] Como aqui usado, a porção de açúcar Ligada a N refere- se a um oligossacarídeo ligado a uma sHASEGP através do nitrogênio de amido dos resíduos Asn. Os oligossacarídeos Ligados a N caem em vários tipos principais (oligomanose, complexo, híbrido, sulfatado), todos dos quais possuem (Man) 3-GlcNAc-GlcNAc-núcleos ligados através do nitrogênio de amido dos resíduos de Asn que caem dentro das seqüências -Asn-Xaa- Thr/Ser- (onde Xaa não é Pro). Os sítios Ligados a N são freqüentemente de forma indireta designados pelo aparecimento de um ciclo em "branco" durante o seqüenciamento. A identificação positiva pode ser feita após a liberação do oligossacarídeo por PNGase F, que converte a Asn glicosilada em Asp. Após a liberação de PNGases, os oligossacarídeos Ligados a N podem ser purificados usando a cromatografia de Bio-Gel P-6, com a reunião de oligossaca- rídeo submetida à cromatografia de troca de ânion com pH elevado preparativa (HPAEC) (Townsend et al., (1989) Anal. Biochem. 182, 1-8). Certos isô- meros de oligossacarídeo podem ser resolvidos usando HPAEC. Resíduos de fucose mudarão as posições de eluição mais no princípio no cromatograma HPAEC, enquanto os resíduos de ácido siálico adicionais aumentarão o tempo de retenção. O tratamento concorrente das glicoproteínas cujas estruturas de oligossacarídeo são conhecidas (por exemplo, fetuína bovina, glico- proteína ácida a-1, ovalbumina, RNAse B, transferrina) pode facilitar a escolha dos picos de oligossacarídeo. Os oligossacarídeos coletados podem ser caracterizados por uma combinação de análises de ligação composicional e me- tilação (Waeghe et al., (1983) Carbohydr Res. 123, 281-304.), com configura-ções anoméricas designadas por espectroscopia de RMN (Van Halbeek (1993) in Methods Enzymol 230).

[00163] Alternativamente, os oligossacarídeos pode ser identificados por eletroforese de carboidrato assitida por fluorescência (FACE) Cal- lewaert et al. (2001) Glycobiology 11, 275-281.

[00164] Como aqui usado, o termo "ácido siálico" refere-se a qualquer membro de uma família de açúcares carboxilados de nove carbonos. O membro mais comum da família de ácido siálico é o ácido N-acetilneuramí- nico (ácido 2-ceto-5-acetamindo-3,5-didesóxi-D-glicero-D-galactononulopira- nos-1-ônico (freqüentemente abreviado como Neu5Ac, NeuAc ou NANA)). Um segundo membro da família é o ácido N-glicolil-neuramínico (Neu5Gc ou NeuGc), em que o grupo N-acetila de NeuAc é hidroxilado. Um terceiro membro da família de ácido siálico é o ácido 2-ceto-3-desóxi-nonulosônico (KDN) (Nadano et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 11550-11557; Kanamori et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 21811-21819. Também incluídos são os ácidos siálicos 9- substituídos tais como um 9-O-C.sub.1 -C.sub.6 acil-Neu5Ac como 9-O-lactil- Neu5Ac ou 9-O-acetil-Neu5Ac, 9-desóxi-9-flúor-Neu5Ac e 9-azido-9-desóxi- Neu5Ac. Para revisão da família de ácido siálico, ver, por exemplo, Varki (1992) Glycobiology 2: 25-40; Sialic Acids: Chemistry, Metabolism and Function, R. Schauer, Ed. (Springer-Verlag, N.Y. (1992)). A síntese e uso dos compostos de ácido siálico em um procedimento de sialação são apresentados no pedido internacional WO 92/16640, publicado 01 de outubro de 1992.

[00165] Como aqui usado, PNGase refere-se a uma N-glicosi- dase F específica do peptídeo Asparagina tal como a peptídeo-N-glicosidase F de Flavobacterium maningoseptum. As enzimas PNGASE são caracterizadas por sua especificidade com respeito aos oligossacarídeos Ligados a N em vez de ligados a O. A caracterização da eficácia de PNGASE pode ser definida por ambas SDS PAGE eletroforese, ou eletroforese de carboidrato assitida por fluorescente.

[00166] Como aqui usado, sialação substancialmente terminada refere-se aos oligossacarídeos Ligados a N que terminam com resíduos de ácido siálico como um açúcar terminal. Os ácidos siálicos terminais podem ser identificados pela análise FACE de carboidratos liberados seguinte o tra-tamento com neuraminidase.

[00167] O tempo de duração circulatório das glicoproteínas no sangue é altamente dependente da composição e estrutura de seus grupos de carboidrato Ligado a N. Este fato é de relevância direta para as glicoprote- ínas terapêuticas que são destinadas a serem administradas parenteralmente. Em geral, o tempo de duração circulatório máximo de uma glicoproteína requer que seus grupos de carboidrato Ligados a N terminem na seqüência NeuAc-Gal-GlcNAc. Sem o ácido siálico terminal (NeuAc), a glicoproteína é rapidamente liberada do sangue por um mecanismo que envolve o reconhecimento da N-acetilgalactosamina básica (GalNAc) ou resíduos de galactose (Gal) (Goochee et al. (1991) Biol/Technology 9: 1347-1355). Por esta razão, a garantia da presença de ácido siálico terminal ou de grupos de carboidrato Ligado a N de glicoproteínas terapêuticas é uma consideração importante para o seu desenvolvimento comercial.

[00168] As glicoproteínas em circulação são expostas à(s) siali- dase(s) (ou neuraminidase) que pode(m) remover os resíduos de ácido siálico terminais. Tipicamente a remoção do ácido siálico expõe os resíduos de galactose, e estes resíduos são reconhecidos e ligados por receptores específicos da galactose nos hepatócitos (revisto em Ashwell and Harford (1982) Ann. Rev. Biochem. 51:531). O fígado também contém outros receptores específicos de açúcar que são mediadores da remoção das glicoproteínas da circulação. As especificidades de tais receptores também incluem N-acetilglicosa- mina, manose, fucose e fosfomanose. As glicoproteínas liberadas pelos receptores de galactose dos hepatócitos sofrem degradação substancial e de-pois entram na bílis; as glicoproteínas liberadas pelo receptor de manose das células Kupffer entram no sistema reticuloendotelial (revisto em Ashwell e Harford (1982) Ann. Rev. Biochem. 51:53).

[00169] Como aqui usado, Ativo Neutro refere-se a uma glico- proteína sHASEGP com atividade catalítica com respeito a um substrato de glicosaminoglicano in vitro em um PH entre 5 e 8 sob as condições de sal menores do que 150 mM e intensidade de tamponamento menor do que 50 mM.

[00170] Como aqui usado, uma solução estabilizada refere-se a uma sHASEGP que retém mais do que 60% de sua atividade inicial após armazenagem em temperatura ambiente por 30 dias.

[00171] Como aqui usado, a não ser que de outra maneira especificada, uma unidade é expressa em unidades de redução da turvação (TRU). Uma TRU é definida como a quantidade de atividade de hialuronidase requerida para reduzir a turvação de uma solução acidificada de ácido hialu- rônico e é equivalente às unidades de U.S.P./National Formulary (NF XIII) (NFU). A análise de enzima semelhante a ELISA aqui descrita pode ser relacionada com a TRU, a NFU e a U.S.P. através de uma curva padrão de uma amostra de hialuronidase (por exemplo, padrão USP ou WHO) padronizada através da U.S.P. Portanto, as atividades da enzima determinadas pela análise de enzima semelhante a ELISA são realmente relativas a TRU, visto que a atividade da enzima não é realmente medida usando o ensasio turbidomé- trico (Dorfman et al., 1948, J. Biol. Chem. 172:367).

[00172] Como aqui usado, a potência é definida pela quantidade de proteína sHASEGP requerida para degradar o substrato in vitro com base em uma Unidade Redutora da Turvação ou Unidade Redutora da Turvação Relativa.

[00173] Como aqui usado, atividade específica refere-se às Unidades de atividade por mg de proteína. A quantidades de proteína sHASEGP é definida pela absorção de uma solução de sHASEGP em 280 nm adotando um coeficiente de extinção molar de aproximadamente 1,7, em unidades de M-1 cm-1.

[00174] Polietileno glicol (PEG) foi amplamente usado em bio- materiais, biotecnologia e medicina principalmente porque o PEG é um polímero biocompatível, não-tóxico, não-imunogênico e solúvel em água (Zhao e Harris, ACS Symposium Series 680: 458-72, 1997). Na área de liberação da droga, os derivados de PEG têm sido amplamente usados em ligação covalente (isto é, "PEGilação") às proteínas para reduzir a imunogenicidade, pro- teólise e liberação renal e para intensificar a solubilidade (Zalipsky, Adv. Drug Del. Rev. 16:157-82, 1995). Similarmente, o PEG tem sido ligado à drogas relativamente hidrofóbicas de peso molecular baixo para intensificar a solubilidade, reduzir a toxicidade e alterar a biodistribuição. Tipicamente, as drogas PEGilados são injetados como soluções.

[00175] Uma aplicação estritamente relacionada é a síntese de redes ou formulações de PEG degradáveis reticuladas para uso na liberação de droga visto que muito da mesma química usada no projeto de veículos de droga solúveis degradáveis pode também ser usada no projeto de géis degradáveis (Sawhney et al., Macromolecules 26: 581-87, 1993). É da mesma forma sabido que complexos intermacromoleculares podem ser formados pela mistura de soluções de dois polímeros complementares. Tais complexos são geralmente estabilizados por interações eletrostáticas (poliânion-policátion) e/ou ligações de hidrogênio (poliácido-polibase) entre os polímeros envolvidos, e/ou por interações hidrofóbicas entre os polímeros em um circundante aquoso (Krupers et al., Eur. Polym J. 32:785-790, 1996). Por exemplo, a mistura de soluções de ácido poliacrílico (PAAc) e óxido de polietileno (PEO) sob as próprias condições resulta na formação de complexos com base principalmente na ligação de hidrogênio. A dissociação destes complexos em condições fisiológicas foi usada para a liberação de drogas livres (isto é, não PEGi- lados). Além disso, complexos de polímeros complementares foram formados tanto de homopolímeros quanto de copolímeros.

[00176] Em um aspecto, o polietileno glicol possui um peso molecular variando de cerca de 3 kD a cerca de 50 kD, e preferivelmente de cerca de 5 kD a cerca de 30 kD. A ligação covalente do PEG à droga (conhecido como "PEGilação") pode ser executada por técnicas de síntese química conhecidas. Por exemplo, em um aspecto da presente invenção, a PEGilação da proteína pode ser executada pela reação de PEG ativado por NHS com a proteína sob condições de reação adequadas.

[00177] Embora numerosas reações tenham sido descritas para a PEGilação, aquelas que são de uma forma geral mais aplicáveis conferem direcionalidade, utilizam condições de reação suaves, e não necessitam processamento extensivo a jusante para remover os catalisadores tóxicos ou subprodutos. Por exemplo, monometóxiPEG (mPEG) possui apenas uma hi- droxila terminal reativa, e assim seu uso limita algumas heterogeneidades da mistura do produto PEG-proteína resultante. A ativação do grupo hidroxila na extremidade do polímero oposta ao grupo de metóxi terminal é geralmente necessária para executar a PEGilação eficiente da proteína, com o objetivo sendo produzir PEG derivatizado mais suscetível ao ataque nucleofílico. O nucleófilo de ataque é geralmente o grupo de epsílon-amino de um resíduo de lisila, mas outras aminas podem também reagir (por exemplo, a alfa-amina N-terminal ou as aminas do anel de histidina) se as condições locais forem favoráveis. Uma ligação mais direcionada é possível nas proteínas contendo uma lisina ou cisteína isolada. O último resíduo pode ser direcionada por PEG- maleimida para a modificação específica por tiol. Alternativamente, PEG hi- drazida pode ser reagida com a sHASEGP oxidada por periodato e reduzida na presença de NaCNBH3. Mais especificamente, açúcares de CMP PEGilados podem ser reagidos com a sHASEGP na presença de glicosil- transferases apropriadas. Uma técnica é a técnica de "PEGilação" onde várias moléculas poliméricas são acopladas no polipeptídeo em questão. Quando se usa esta técnica o sistema imune tem dificuldades no reconhecimento dos epítopos sobre a superfície do polipeptídeo responsável pela formação de anticorpos, desse modo reduzindo a resposta imune. Com relação aos polipep- tídeos introduzidos diretamente no sistema circulatório do corpo humano para dar um efeito fisiológico particular (isto é, produtos farmacêuticos), a resposta imune potencial típica é uma resposta de IgG e/ou IgM, enquanto os polipep- tídeos que são inalados através do sistema respiratório (isto é, polipeptídeo industrial) potencialmente podem causar uma resposta IgE (isto é, resposta alérgica). Uma das teorias esclarecendo a resposta imune reduzida é que o(s) epítopo(s) protege(m) a(s) molécula(s) polimérica(s) sobre a superfície do po- lipeptídeo responsável pela resposta imune resultando na formação de anticorpo. Uma outra teoria ou pelo menos um fator parcial é que quanto mais pesado o conjugado for, tanto mais resposta imune reduzida é obtida.

[00178] As moléculas poliméricas acopladas ao polipeptídeo podem ser qualquer molécula polimérica adequada com um peso molecular como defindo de acordo com a invenção, incluindo homopolímeros naturais e sintéticos, tais como polióis (isto é, poli-OH), poliaminas (isto é, poli-NH.sub.2) e ácidos policarboxílicos (isto é, poli-COOH), et al. heteropolímeros, isto é, polímeros compreendendo um ou mais grupos de acoplamento diferentes, por exemplo, um grupo hidroxila e grupos de amina.

[00179] Exemplos de moléculas poliméricas adequadas incluem as moléculas poliméricas selecionadas do grupo compreendendo óxidos de polialquileno (PAO), tais como polialquileno glicóis (PAG), incluindo polipropi- leno glicóis (PEG), metoxipolietileno glicóis (mPEG) e polipropileno glicóis, éteres PEG-glicidílicos (Epox-PEG), polietileno glicóis (PEGs) ramificados por PEG-oxicarbonilimidazol (CDI-PEG), álcool polivinílico (PVA), policarboxila- tos, polivinilpirrolidona, poli-D,L-aminoácidos, anidrido de ácido polietileno-co- maléico, anidrido de ácido poliestireno-co-málico, dextranos incluindo carbo- ximetil-dextranos, heparina, albumina homóloga, celuloses, incluindo metilcelulose, carboximetilcelulose, etilcelulose, hidroxietilcelulose, carboxie- tilcelulose e hidroxipropilcelulose, hidrolisados de quitosano, amidos tais como hidroxietil-amidos e hidróxi propil-amidos, glicogênio, agaroses e derivados destes, goma guar pululano, inulina, goma xantana, carragenina, pectina, hi- drolisados de ácido algínico e biopolímeros.

[00180] As moléculas poliméricas preferidas são moléculas poli- méricas não-tóxicas tais como (m)polietileno glicol (mPEG) que ainda requer uma química relativamente simples para o seu acoplamento covalente aos grupos de ligação sobre a superfície da enzima.

[00181] Os óxidos de polialquileno geralmente observados (PAO), tais como óxidos de polietileno, tais como PEG e especialmente mPEG, são as moléculas poliméricas preferíveis, quando estas moléculas po- liméricas, em comparação com os polissacarídeos tais como dextrano, pulu- lano et al. mais, possuem poucos grupos reativos capazes de reticulação, o que é indesejável.

B. PERFIS DE EXPRESSÃO DO TECIDO DA sHASEGP.

[00182] Embora anteriormente considerado ser específico dos testículos, a sHASEGP humana é expressa em múltiplos tecidos nos seres humanos quando se usa técnicas mais sensíveis tais como RT-PCR. O transcrito de sHASEGP é observado na medula (cérebro), endotélio microvascular, próstata, mama, retina, melanócito humano reunido, coração fetal e útero de grávida. A sHASEGP é também expressa nos tumores celulares de germe. A detecção com base em RT-PCR dos transcritos de sHASEGP é geralmente requerida para detectar os níveis nos tecidos diferentes do testículo.

C. ENSAIOS PARA ATIVIDADE DA ENZIMA Shasegp ENSAIO DE MICROTÍTULO TURBIDOMÉTRICO PARA ATIVIDADE DE HI- ALURONIDASE

[00183] A aticidade Hialuronidase pode ser detectada por meio de um ensaio turbidométrico modificado em solução de soro acidificado. Os reagentes requeridos são como se segue:

[00184] Os seguintes reagentes são preparados: Solução Tam-ponante de Acetato - 14,0 g de acetato de potássio e 25,0 ml de ácido acético glacial em água para preparar 1000 ml. Solução Tamponante de Fosfato - 2,5 g de fosfato de sódio monobásico, 1,0 g de fosfato de sódio anídrico dibásico e 8,2 g de cloreo de sódio em água para preparar 1000 ml. Solução Estoque Diluente de Enzima - 500 ml de Solução Tamponante de Fosfato com 500 ml de água. Solução Operacional Diluente de Enzima - 33 mg de gelatina hidro- lisada em 50 ml de Solução Estoque Diluente de Enzima preparada dentro de 2 horas de uso. Solução Tamponante de Estabilização da Amostra (Sol. "SSB") - 125 μl de uma Solução de Albumina de Soro Humano a 20% e 50 μl de uma solução de Cloreto de Cálcio 1 M em 50 ml de Solução Operacional Diluente de Enzima e misturar completamente. Solução Estoque de Soro - Diluir 1 volume de Soro de Cavalo com 9 volumes de Solução Tamponante de Acetato. Ajustar com ácido clorídrico 4 N para um pH de 3,1 e deixar a solução repousar em temperatura ambiente por 18 a 24 h. Armazenar a solução em 4 oC, e usar dentro de 30 dias. Solução Operacional de Soro - 10 ml da Solução Estoque de Soro em 30 ml da Solução Tamponante de Acetato, ajustado para a temperatura ambiente. Solução Estoque de Ácido Hialurônico - Ácido Hialu- rônico de Sódio em uma concentração de 5,0 mg/ml de água. Solução Operacional de Ácido Hialurônico - 0,75 ml da Solução Estoque de Ácido Hialurô- nico em 4,25 ml da Solução Tamponante de Fosfato. Solução Estoque Padrão - Um recipiente de Hialuronidase Padrão de Referência USP em uma concentração de 1000 unidades/ml em água, dividida em alíquotas em partes de 50 μl, e armazenadas a -20 oC. Solução Operacional Padrão - 40 μl de Solução Estoque Padrão em 960 μl de Solução Operacional Diluente de Enzima gelada para se obter uma solução tendo uma concentração conhecida de 40 unidades/ml, preparada imediatamente antes do uso no ensaio.

[00185] Todas as amostras de enzima são diluídas em uma placa de 96 cavidades de "Ligação Baixa de Proteína" de acordo com as seguintes normas: a) A faixa de sensibilidade máxima deste ensaio está entre 10 a 30 unida- des/ml. Para minimizar o número de vezes um ensaio deve ser repetido de modo a obter resultados que estão dentro da faixa, primeiro determinar o número aproximado de unidades totais/ml com relação a amostra, e depois escolher uma diluição (número integral) tal que a concentração final seja de aproximadamente 20 unidades/ml. b) Volumes de Amostra mínimos necessários para executar o ensaio são como se segue: Frações FPLC = 50 μl, Sobrenadantes da Cultura tecidual = 1 ml, Material Purificado/Concentrado/Etapa Final = 10 μl c) Para amostras com diluições seriais, diluições de 1:10 na placa de 96 cavidades de "Ligação Baixa de Proteína" são preparadas em triplicatas mediante o uso de pipeta 360 μl da Solução "SSB" e 40 μl da Amostra em cada cavidade.

[00186] Para preparação de Padrão USP preparar a Curva de Padrão USP na placa de 96 cavidades de "LIgação Baixa de Proteína" como se segue:Curva padrão USP

[00187] Para preparação do Controle de Ácido Hialurônico nas colunas 1-3, o Controle H.A. na placa de 96 cavidades de "Fundo Plano" é preparado como se segue: Controles H.A.

[00188] A Placa de Reação: 30 μl por cavidade de Solução Operacional de Ácido Hialurônico são pipeta usando uma pipetados de transferência de 8 canais de 50 μl em uma placa de microtítulo de 96 cavidades de "Fundo Plano" deixando as cavidades H1-H3 vazios. 60 μl/cavidade de Solução Operacional Diluente de Enzima são com pipetados nas cavidades H1-H3 da mesma placa como o controle HA.

[00189] Solução Operacional de Soro: 40 ml de Solução Operacional de Soro são dispensadas em uma bacia de transferência e próximas ao Bloco Térmico.

[00190] Estágio de preaquecimento: Logo que ambas as placas foram preparadas a placa de 96 cavidades de Ligação Baixa de Proteína contendo as amostras diluídas, protótipos, controles e a placa de 96 cavidades de Fundo Plano contendo as Soluções Operacionais de Ácido Hialurônico são colocadas em um bloco térmico e deixadas aquecer por 5 min a 37 oC.

[00191] A reação é iniciada pela adição de Enzima no Substrato: 30 μl da placa de enzima na totalidade das cavidades na coluna n° 1 da placa de fundo plano de 96 cavidades (contendo o substrato) usando uma pipeta de 8 canais de 5 a 50 μl. A mistura de reação de Enzima/Substrato é aspirada 5 vezes (puxar a solução para cima e para baixo com a transferência durante os primeiros 15 segundos para garantir mistura de amostra completa. Após misturar a enzima e o substrato, as extremidades são expelidas e uma nova série de extremidades carregadas na pipeta de transferência para a próxima coluna. Um cronômetro é recomeçado, e no momento (t) = 0:30, este processo é repetido para a coluna 2. No próximo intervalo de 30 segundos (t) = 1:00, este processo é repetido para a coluna 3. Este processo é repetido movendo da esquerda para a direita através da placa, cada 30 segundos até que todas as cavidades contenham tanto enzima quanto substrato.

[00192] Interrupção da reação: Quando o cronômetro alcança 6 minutos (t) = 6:00, 240 μl da Solução Operacional de Soro são pipetados em cada cavidade, usando uma pipeta de transferência de 8 canais de 50 a 300 μl, para dentro da coluna 1 da placa de fundo plano de 96 cavidades do Reservatório de Reagente de 50 ml adjacente. A mistura é aspirada 3 vezes (puxar a solução para cima e para baixo com a pipeta de transferência) durante os primeiros 10 segundos para garantir mistura completa. O processo é repetido cada 30 segundos, prosseguindo a partir das colunas de 1 a 12. Após conclusão da última coluna (coluna 12), a placa de reação é removida do bloco térmico e colocada a placa na bandeja de leitura da leitora da placa em 640 nM. Uma curva linear apropriada é gerada a partir da curva padrão que permite extrapolação das amostras de teste.

ENSAIOS ALTERNATIVOS PARA HIALURONIDASE ENSAIO DE MICROTÍTULO DE HIALURONAN BIOTINILADO

[00193] Os grupos de carboxila livres nos resíduos de ácido glu- curônico de Hialuronan são biotinilados a biotina em uma reação da etapa usando biotina-hidrazida (Pierce), Sulfo NHS (Pierce) e 1-etil dimetilaminopro- pil-carbodiimida (Sigma). Este substrato de HA biotinilado a biotina é covalen- temente acoplado a uma placa de microtítulo de 96 cavidades em uma segunda reação. Na conclusão da reação de enzima, substrato residual é detectado com uma reação de avidina-peroxidase que pode ser lida em uma leitora de placa ELISA padrão. Quando o substrato for covalentemente ligado à placa de microtítulo, artefatos tais como a remoção dependente do pH do substrato biotinilado não ocorrem. A sensibilidade permite medição rápida da atividade Hialuronidase das células cultivadas e amostras biológicas com uma variação interanálise de menos do que 10%.

[00194] A atividade específica da Hialuronidase é expressa em unidades redutoras da turvação (TRU). Uma TRU é definida como a quantidade de atividade Hialuronidase requerida para reduzir a turvação de uma solução acidificada de ácido hialurônico e é equivalente às unidades U.S.P./National Formulary (NF XIII) (NFU). A análise de enzima semelhante a ELISA usada para purificação é relacionada com a unidade TRU, a NFU e a U.S.P. através de uma curva padrão de uma amostra de Hialuronidase (por exemplo, USP) padronizada através da U.S.P. Portanto, as atividades da enzima determinadas pela análise de enzima semelhante a ELISA são realmente relativas a TRU, visto que a atividade da enzima não é realmente medida usando o ensasio turbidométrico (Dorfman et al., 1948, J. Biol. Chem. 172:367).

[00195] Muitos ensaios de Hialuronidase basearam-se na medição da geração de novos grupos de N-acetilamino redutores (Bonner e Can- tey, Clin. Chim. Acta 13:746-752, 1966), ou perda da viscosidade (De Salegui et al., Arch. Biochem. Biophys. 121:548-554, 1967) ou turvação (Dorfman e Ott, J. Biol. Chem. 172:367, 1948). Com os substratos purificados todos estes métodos são suficientes para a determinação da presença ou ausência de atividade endoglicosamídica.

[00196] Os substratos de glicosaminoglicano substancialmente purificados podem também ser usados em um Ensaio de Deslocamento de Gel. Os glicosaminoglicanos são misturados com a sHASEGP recombinante para testar a atividade endoglicosidase que resulta em um deslocamento na mobilidade do substrato dentro do gel. Sulfato de condroitina-4, sulfato de dermatan, sulfato de heparano podem ser obtidos da Sigma Chemical. O Hialu- ronan do cordão umbilical humano pode ser obtido da ICN. Cada substrato de teste é diluído em 0,1 mg/ml em uma faixa de tampão de pH 3,5 a 7,5. Amostras de 10 μl de sHASEGP purificadas ou meio condicionado de sHASEGP que expressam as células são tanto misturadas com 90 μl de substrato de teste em tamponante desejado como incubadas por 3 horas a 37 oC. Seguinte a incubação as amostras são neutralizadas com tamponante de amostra (Tris EDTA PH 8,0, Bromophenol Blue e glicerol) seguido por eletroforese. Os gli- cosaminoglicanos são detectados mediante o manchamento dos géis em 0,5% Alcian Blue em 3% Ácido Acético Glacial durante a noite seguido pela retirada da mancha em 7% de Ácido Acético Glacial. A degradação é determinada mediante a comparação da mobilidade do substrato na presença e ausência de enzima.

[00197] A atividade Hialuronidase pode da mesma forma ser detectada por zimografia de gel no substrato (Guentenhoner et al., 1992, Matrix 388-396). Neste ensaio uma amostra é aplicada a um ácido hialurônico contendo gel SDS-PAGE e as proteínas na amostra separadas por eletroforese. O gel é depois incubado em um tamponante de ensaio de enzima e subse- qüentemente manchado para detectar o ácido hialurônico no gel. A atividade Hialuronidase é visualizada como uma zona clareada no gel do substrato.

[00198] D. IDENTIFICAÇÃO E ISOLAMENTO DOS GENES DO POLIPEPTÍDEO DE sHASEGP

[00199] O gene do polipeptídeo de sHASEGP e/ou seus domínios, podem ser obtidos por métodos bem-conhecidos na técnica para o isolamento de DNA. Qualquer método conhecido por aqueles versados na técnica para a identificação de ácidos nucléicos que codificam os genes desejado podem ser usados. Qualquer método disponível na técnica pode ser usado para se obter cDNA ou clone de DNA genômico de comprimento total (isto é, abrangendo a região de codificação inteira) que codifica um polipeptídeo de sHASEGP. Por exemplo, a reação da cadeia de polimerase (PCR) pode ser usada para amplificar uma seqüência que é expressa nos tecidos normais, por exemplo, ácidos nucléicos que codificam um polipeptídeo de sHASEGP (SEQ. Nos: 1 e 2), em uma biblioteca genômica ou de cDNA. Os iniciadores de oligonucleotídeo que hibridizam as seqüências nos terminais 3’ e 5’ das seqüências identificadas podem ser usados como iniciadores para amplificar as seqüências da PCR a partir de uma amostra de ácido nucléico (RNA ou DNA, geralmente uma biblioteca de cDNA, de uma fonte apropriada (por exemplo, testículo, próstata, mama)).

[00200] A PCR pode ser realizada, por exemplo, mediante o uso de um formador de ciclo térmico Perkin-Elmer Cetus e Taq polimerase (Gene Amp.). O DNA sendo amplificado pode incluir mRNA ou cDNA ou DNA genô- mico de qualquer espécie eucariótica. Pode-se escolher para a sintetização vários iniciadores degenerados diferentes, para uso nas reações PCR.

[00201] É também possível variar a severidade das condições de hibridização usadas na preparação das reações PCR, para amplificar os homólogos de ácido nucléico (por exemplo, para obter seqüências de polipep- tídeo da sHASEGP a partir de espécies diferentes dos seres humanos ou para obter seqüências humanas com homologia para polipeptídeo de sHASEGP) por permitir maior ou menor grau de similaridade de seqüência de nucleotídeo entre a seqüência de nucleotídeo conhecida e o homólogo de ácido nucléico sendo isolado. Para a hibridização de espécies cruzadas, condições de seve-ridade baixa a severidade moderada são usadas. Para a mesma hibridização das espécies, condições moderadamente severas a altamente severas são usadas. As condições podem ser empiricamente determinadas.

[00202] Após a amplificação bem-sucedida do ácido nucléico contendo toda ou uma parte da seqüência de polipeptídeo da sHASEGP identificada ou de um ácido nucléico que codifica todo ou uma parte de um homólogo de polipeptídeo da sHASEGP, em que o segmento pode ser molecular-mente clonado e seqüenciadodo, e usado como uma sonda para isolar um cDNA completo ou clone genômico. Isto, por sua vez, permite a determinação da seqüência de nucleotídeo completa do gene, a análise de sua expressão, e a produção de seu produto de proteína para a análise funcional. Assim que a seqüência de nucleotídeo for determinada, um quadro de leitura aberto que codifica o produto de proteína do gene de polipeptídeo da sHASEGP pode ser determinado por qualquer método bem-conhecido na técnica para a determinação dos quadros de leitura abertos, por exemplo, usando programas de computador publicamente disponíveis para a análise da seqüência de nucle- otídeo. Logo que um quadro de leitura aberto for definido, é rotineiro determinar a seqüência de aminoácido da proteína codificada pelo qaudro de leitura aberto. Desta maneira, as seqüências de nucleotídeo dos genes de polipeptídeo da sHASEGP inteiros assim como as seqüências de aminoácido das proteínas de polipeptídeo da sHASEGP e análogos podem ser identifica-das.

[00203] Qualquer célula eucariótica potencialmente pode servir como a fonte de ácido nucléico para a clonagem molecular do gene de poli- peptídeo da sHASEGP. Os ácidos nucléicos podem ser isolados de vertebrados, mamíferos, ser humano, suíno, bovino, felino, aviário, equino, canino, assim como fontes adicionais de primata, insetos, plantas et al. organismos. O DNA pode ser obtido por procedimentos padrão conhecidos na técnica de DNA clonado (por exemplo, uma "biblioteca" de DNA), mediante a síntese química, mediante a clonagem de cDNA ou mediante a clonagem de DNA lgen- ômico, ou seus fragmentos, purificado da células desejada (ver, por exemplo, Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Glover, D. M. Ed., 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U. K. Vol. 1 ,11. Os clones derivados do DNA genômico podem conter regiões de DNA reguladoras e íntron além de regiões de codificação; os clones derivados de cDNA conterão somente seqüências éxon. Para qualquer fonte, o gene é clonado em um vetor adequado para a sua propagação.

[00204] Na clonagem molecular do gene de DNA genômico, fragmentos de DNA são gerados, alguns dos quais codificarão o gene desejado.

[00205] O DNA pode ser clivado em sítios específicos usando várias enzimas de restrição.

[00206] Alternativamente, pode-se usar DNAse na presença de manganês para fragmentar o DNA, ou o DNA pode ser fisicamente cisalhado, por exemplo, mediante sonicação. Os fragmentos de DNA lineares depois podem ser separados de acordo com o tamanho por técnicas padrão, incluindo mas não limitados a, eletroforese de gel de agarose e poliacrilamida e croma- tografia de coluna.

[00207] Assim que os fragmentos de DNA forem gerados, a identificação do fragmento de DNA específico contendo o gene desejado pode ser executada de várias maneiras.

[00208] Por exemplo, uma parte do gene (de qualquer espécie) de polipeptídeo da sHASEGP (por exemplo, um produto da amplificação da PCR obtido como descrito acima ou um oligonucleotídeo tendo uma seqüên- cia de uma parte da seqüência de nucleotídeo conhecida) ou seu RNA específico, ou um fragmento deste será purificado e rotulado, e os fragmentos de DNA gerados podem ser peneirados mediante a hibridização de ácido nu- cléico na sonda rotulada (Benton e Davis, Science 196: 180 (1977); Grunstein e Hogness, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 72: 3961 (1975)). Aqueles fragmentos de DNA com homologia substancial na sonda hibridizarão. É também possível identificar o fragmento apropriado mediante a digestão da enzima de restrição e comparação dos tamanhos de fragmento com aqueles esperados de acordo com um mapa de restrição conhecido se tal estiver disponível ou mediante a análise e comparação da seqüência de DNA com a seqüência de nucleotídeo conhecida de polipeptídeo sHASEGP. Outra seleção pode ser realizada na base das propriedades do gene. Alternativamente, a presença do gene pode ser detectada por ensaios com base nas propriedades físicas, químicas ou imunológicas de seu produto expresso. Por exemplo, os clones de cDNA ou clones de DNA que hibridizam-selecionam a propriedade do mRNA podem ser selecionados os quais produzem uma proteína que, por exemplo, possui migração eletroforética similar ou idêntica, comportamento de focaliza- ção isoelétrico, mapas de digestão proteolíticos, propriedades antigênicas, atividade Hialuronidase. Se um anticorpo de polipeptídeo anti-sHASEGP estiver disponível, a proteína pode ser identificada pela ligação do anticorpo rotulado com os clones de sintetização de polipeptídeo da sHASEGP putativos, em um procedimento tipo ELISA (ensaio imunossorvente ligado a enzima).

[00209] Alternativas ao isolamento do DNA genômico de poli- peptídeo da sHASEGP incluem, mas não são limitados a, quimicamente sintetizar a seqüência genética a partir de uma seqüência conhecida ou mascarar o cDNA com o mRNA que codifica o polipeptídeo de sHASEGP.

[00210] Por exemplo, o RNA para a clonagem de cDNA do gene de polipeptídeo da sHASEGP pode ser isolado das células que expressam a proteina. Os ácidos nucléicos identificados e isolados então podem ser inseridos em um vetor de clonagem apropriado. Um grande número de sistemas vetor-hospedeiro conhecidos na técnica pode ser usado. Os possíveis vetores incluem, mas não são limitados a, plasmídeos ou vírus modificados, mas o sistema vetor deve ser compatível com a célula hospedeira usada. Tais vetores incluem, mas não são limitados a, bacteriófagos tais como derivados lâm- bda, ou plasmídeos tais como derivados de plasmídeo pBR322 ou pUC ou o vetor Bluescript (Stratagene, La Jolla, CA). A inserção em um vetor de clonagem pode, por exemplo, ser executada mediante a ligação do fragmento de DNA em um vetor de clonagem que possui terminais coesivos complementares.

[00211] Se os sitios de restrição complementares usados para fragmentar o DNA não estiverem presentes no vetor de clonagem, as extremidades das moléculas de DNA podem ser enzimaticamente modificadas. Alternativamente, qualquer sítio desejado pode ser produzido pela ligação das seqüências de nucleotídeo (ligantes) nos terminais de DNA; estes ligantes ligados podem incluir oligonucleotídeos específicos quimicamente sintetizados que condificam as seqüências de reconhecimento da endonuclease de restrição. Em um método alternativo, o vetor clivado e o gene de polipeptídeo da sHASEGP podem ser modificados pela junção homopolimérica.

[00212] As moléculas recombinantes podem ser introduzidas nas células hospedeiras através da transformação, transfecção, infecção, ele- troporação, precipitação de cálcio et al. métodos, de modo que muitas cópias da seqüência genética sejam geradas.

[00213] Nas modalidades específicas, a transformação de células hospedeiras com moléculas de DNA recombinantes que incorporam o gene de polipeptídeo da sHASEGP isolado, cDNA ou seqüência de DNA sintetizada, permite a geração de múltiplas cópias do gene.

[00214] Assim, o gene pode ser obtido em grandes quantidades por transformantes em crescimento, isolando as moléculas de DNA recombi- nante dos transformantes e, quando necessário, recuperando o gene inserido do DNA recombinante isolado.

E. VETORES, PLASMÍDEOS E CÉLULAS QUE CONTÊM ÁCIDOS NUCLÉI- COS QUE CODIFICAM UM POLIPEPTÍDEO DE sHASEGP OU SEU DOMÍNIO DE HIALURONIDASE E EXPRESSÃO DE VETORES E CÉLULAS DE POLIPEPTÍDEOS DE sHASEGP

[00215] Para a expressão recombinante de um ou mais dos po- lipeptídeos de sHASEGP, o ácido nucléico contendo toda ou uma parte da seqüência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo de sHASEGP pode ser inserido em um vetor de expressão apropriado, isto é, um vetor que contém os elementos necessários para a transcrição e tradução da seqüência de codificação da proteína inserida. Os sinais transcricionais e translacionais necessários podem também ser fornecidos pelo promotor nativo para os genes de sHASEGP, e/ou suas regiões de flanqueamento.

[00216] Também fornecidos são os vetores que contêm ácido nucléico que codifica a sHASEGP que podem ser introduzidos em um sistema de expressão capaz de produzir uma sHASEGP ativa neutra solúvel.

[00217] As células contendo os vetores são também fornecidos. As células incluem as células eucarióticas e procarióticas, e os vetores adequados para uso inclusos.

[00218] As células eucarióticas, incluindo as células de Ovário de Hamster Chinês deficientes de diidroflato reductase (DG44), contendo os vetores são fornecidas. As células adequadas incluem células de levedura, células fúngicas, células de planta, células de inseto e células de animal. As células são usadas para produzir um polipeptídeo de sHASEGP ou seu domínio de Hialuronidase mediante (a) o desenvolvimento das células descritas acima sob condições pelas quais o polipeptídeo de sHASEGP codificado ou domínio de Hialuronidase do polipeptídeo de sHASEGP é expresso pela célula, e depois (b) a recuperação da proteína de domínio de Hialuronidase expressa. Nas modalidades exemplificadas, o domínio de Hialuronidase é se- cretado no meio.

[00219] Em uma modalidade, os vetores que incluem uma se- qüência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que possui atividade Hialuronidase e contém toda ou uma parte de somente o domínio de Hialuro- nidase, ou múltiplas cópias deste, de uma proteína sHASEGP são fornecidos. Também fornecidos são os vetores que compreendem uma seqüência de nu- cleotídeos que codifica o domínio de Hialuronidase e as partes adicionais de uma proteína sHASEGP e incluindo uma proteína sHASEGP de comprimento total, assim como múltiplas cópias destes, são também fornecidos. Os vetores pode ser selecionados quanto à expressão da proteína sHASEGP ou seu domínio Hialuronidase na células ou tal que a proteína sHASEGP seja expressa como uma proteína secretada. Alternativamente, os vetores podem incluir os sinais necessários para secreção de proteínas codificadas. Quando o domínio Hialuronidase for expressão o ácido nucléico é ligado ao ácido nucléico que codifica um sinal de secreção, tal como a Saccharomyces cerevisiae, uma seqüência de sinal do fator união ou uma parte desta, ou a seqüência de sinal nativo.

[00220] De modo a gerar uma sHASEGP ativa neutra solúvel, as células capazes de introduzir a glicosilação Ligadas a N são requeridas. Na modalidade preferida, as células de Ovário de Hamster Chinês mamífero deficientes de diidrofolato reductase tais como DG44, são eletroporadas com um plasmídeo que codifica um promotor forte de mamífero, tal como CMV, ácido nucléico que codifica uma sHASEGP seguido por um sítio de entrada ribos- sômico interno, o gene de diidrofolato reductase de camundongo e a seqüên- cia de polidenilação SV40 como mostrado na SEQ ID NO: 51. Tais células são depois cultivadas em meio quimicamente definido na ausência de hipoxantina e timidina, seguido por outra amplicação de gene com concentrações crescentes de metotrexato.

[00221] Uma variedade de sistemas vetores hospedeiros pode ser usada para expressar a seqüência de codificação da proteína. Estes incluem, mas não são limitados a, sistemas celulares de mamífero infectados com vírus, por exemplo, vírus de vacínia, adenovírus, etc.); sistemas celulares de inseto infectados com vírus (por exemplo, baculovírus); microorganismos tais como levedura contendo vetores de levedura; ou bactérias transformadas com bacteriófago, DNA, DNA plasmídeo, ou DNA cosmídeo. Os elementos de expressão dos vetores variam em suas intensidades e especificações. Dependendo do sistema hospedeiro-vetor usado, qualquer um de vários elementos de transcrição e tradução adequados pode ser usado. Observar que a expressão bacteriana do DNA da sHASEGP não resultará em uma sHASEGP cata- liticamente ativa per se, mas quando combinada com o próprio mecanismo de glicosilação pode ser artificialmente glicosilada com tal.

[00222] Quaisquer métodos conhecidos por aqueles versados na técnica com relação a inserção de fragmentos de ácido nucléico em um vetor podem ser usados para construir os vetores de expressão contendo um gene quimérico contendo sinais de controle transcricional/traducional apropri-ados e seqüências de codificação da proteína. Estes métodos podem incluir DNA recombinante in vitro e técnicas sintéticas e recombinantes in vivo (re- combinação genética). A expressão das seqüências de ácido nucléico que codificam o polipeptídeo de sHASEGP, ou domínios, derivados, fragmentos ou homólofos deste, pode ser regulada por uma segunda seqüência de ácido nucléico de modo que os genes ou seus fragmentos sejam expressos em um hospedeiro transformado com a(s) molécula(s) de DNA recombinante. Por exemplo, a expressão das proteínas pode ser controlada por qualquer promo- tor/intensificador conhecido na técnica. Em uma modalidade específica, o promotor não é nativo aos genes para o polipeptídeo de sHASEGP. Os promotores que podem ser usados incluem, mas não são limitados a, o promotor primitivo SV40 (Bernoist and Chambon, Nature 290: 304-310 (1981) o promotor contido na repetição do terminal longo 3' do vírus de sarcoma Rous (Yamamoto et al., Ce//22: 787-797 (1980) o promotor da timidina cinase de herpes promoter (Wagner et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1441-1445 (1981), as seqüências reguladoras do gene metalotioneína (Brinster et al., Nature 296: 39-42 (1982)); vetores de expressão procarióticos tais como o promotor β- Lactamase (Villa-Kamaroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731 (1978)) Ou o Promotor TAC Deboer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2125 (1983)); ver também "Useful Proteins from Recombinant Bacteria": em Scientific American 242: 79-94 (1980)); vetores de expressão de planta contendo o promotor de opaline sintetase (Herrar-Estrella et al., Nature 303: 209-213 (1984)) ou o promotor 35S RNA do vírus mosaico da couve-flor (Garder et al., Nucleic Acids RES. 9: 2871 (1981)), e o promotor da enzima fotossintética ribulose bisfosfato carboxilase (Herrera-Estrella et al., Nature 310: 115-120 (1984)); elementos promotores da levedura et al. fungos tais como o promotor Gal4, o promotor do álcool desidrogenase, o promotor da fosfoglicerol cinase, o promotor alcalino fosfatase, e as regiões de controle transcricional de animal que seguem que apresentam especificação tecidual e foram usadas em animais transgênicos: região de controle do gene elastase I que é ativa em células acinases pancreáticas (Swift et al., Cell 38: 639-646 (1984); Ornitz et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409 (1986); Macdonald, Hepatology 7: 425-515 (1987)); região de controle do gene da insulina que é ativa nas células beta pancreáticas (Hanahan et al., Nature 315: 115-122 (1985)), região de controle do gene da imunoglobulina que é ativa nas células linfóides (Grosschedl et al., Cell 38: 647-658 (1984); Adams et al., Nature 318: 533-538 (1985); Alexander et al., Mol. Cell Biol. 7: 1436-1444 (1987)), região de controle do vírus do tumor mamário de camundongo que é ativa nas células tes- ticulares, da mama, linfóide e mastócitos (Leder et al., CELL 45: 485-495 (1986)), região de controle do gene de albumina que é ativa no fígado (PINC- KERT et al., Genes and Devel. 1: 268- 276 (1987)), região de controle do gene de alfa-fetoproteína que é ativa no fígado (Krumlauf et al., Mol. Cell. Biol. 5: 1639-1648 (1985); Hammer et al., Science 235: 53-58 1987)), região de controle do gene de alfa-1 antitripsina que é ativa no fígado (Kelsey et al., Genes And Devel. 1: 161-171 (1987)), região de controle do gene de beta globina que é ativa nas células mielóides (Mogram et al., Nature 315: 338-340 (1985); Kollias et al., CE//46: 89-94 (1986)), região de controle do gene da proteína básica que é ativa nas células oligodendrócitas do cérebro (Readhead et al., Cell 48: 703-712 (1987)), região de controle do gene de cadeia-2 leve de mi- osina que é ativa no músculo esquelético (Sani, Nature 314: 283-286 (1985)), e região de controle do gene gonadotrófico que libera hormônio que é ativa nos gonadotrofos do hipotálamo (Mason et al., Science 234: 1372-1378 (1986)).

[00223] Em uma modalidade específica, um vetor é usado o qual contém um promotor operavelmente ligado aos ácidos nucléicos que codificam um polipeptídeo de sHASEGP, ou um domínio, fragmento, derivado ou homólogo deste, uma ou mais origens de replicação, e opcionalmente, um ou mais marcadores selecionáveis (por exemplo, um gene resistente a antibiótico).

[00224] Os sinais de iniciação específicos podem também ser requeridos para a tradução eficiente de uma seqüência de sHASEGP. Estes sinais incluem o códon de iniciação ATG e seqüências adjacentes. Nos casos onde a sHASEGP, seu códon de iniciação e seqüência a montante são inseridos no vetor de expressão apropriado, nenhum sinal de controle traducional adicional pode ser necessário. No entanto, nos casos onde a seqüência de codificação única, ou uma parte desta, é inserida, sinais de controle transcri- cional exógenos incluindo o códon de iniciação ATG devem ser fornecidos. Além disso, o códon de iniciação deve ser no quadro de leitura correto para garantir a transcrição do suplemento inteiro. Os elementos transcricionais exógenos e os códons de iniciação podem ser de várias origens, tanto naturais quanto sintéticas. A eficiência de expressão pode ser intensificada pela inclusão dos intensificadores apropriados no sistema celular em uso (Scharf D et al (1994) Results Probl Cell Differ 20:125-62; Bittner et al (1987) Methods in Enzymol 153:516-544).

[00225] Além disso, uma cepa de célula hospedeira pode ser escolhida quanto a sua capacidade de modular a expressão das seqüências inseridas ou processar a proteína expressa da maneira desejada. Tais modificações do polipeptídeo incluem, mas não são limitados a, acetilação, carbo- xilação, glicosilação, fosforilação, lipidação e acilação. O processamento pós- traducional que cliva uma forma "prepro" da proteína pode também ser importante para a inserção, flexão e/ou função corretas. As células hospedeiras diferentes tais como CHO (DG44, DXB11 CHO-K1), HeLa, MDCK, 293, W138, etc possuem mecanismo celular específico e mecanismos característicos para tais atividades pós-traducionais e podem ser escolhidas para garantir a modificação e processamento corretos da proteína estrangeira introduzida.

[00226] Para produção de alto rendimento a longo prazo de proteínas recombinantes, a expressão estável é preferível. Por exemplo, as linhagens celulares que estavelmente expressam a sHASEGP podem ser transformadas usando vetores de expressão que contêm origens virais de re- plicação ou elementos de expressão endógenas e um gene marcador seleci- onável. Seguinte à introdução do vetor, as células podem ser deixadas desenvolver por 1 a 2 dias em um meio enriquecido antes delas serem transferidas para meio seletivo. O propósito do marcador selecionável é conferir resistência à seleção, e sua presença permite o crescimento e recuperação das células que properamente expressam as seqüências introduzidas. Pedaços resistentes de células estavelmene transformadas podem ser prosliferados grumos usando técnicas de cultura de tecido apropriadas para o tipo de célula.

[00227] Qualquer número de sistemas de seleção pode ser usado para recuperar as linhagens celulares transformadas. Estes incluem, mas não são limitados a, a timidina cinase do vírus simplex da herpes (Wigler M et al (1977) Cell 11:223-32) e genes de adenina fosforribosiltransferase (Lowy I et al (1980) Cell 22:817-23) que podem ser empregados nas células TK ou APRT, respectivamente. Da mesma forma, antimetabólito, antibiótico ou resistência a herbicida pode ser usado como a base para a seleção; por exemplo, DHFR que confere resistência ao metotrexato (Wigler M et al (1980) Proc Natl Acad Sci 77:3567-70); npt, que confere resistência aos aminoglico- sídeos neomicina e G-418 (Colbere-Garapin F et al (1981) J Mol Biol 150:114) e als ou pat, que conferem resistência ao clorsulfuron e fosfinotricina ace- tiltransferase, respectivamente (Murry, supra). Os genes selecionáveis adicionais foram descritos, por exemplo, trpB, que permite as células utilizarem indol em vez de triptofano, ou hisD, que permite as células utilizarem histinol em vez de histidina (Hartman S C e R C Mulligan (1988) Proc Natl Acad Sci 85:8047-51). Recentemente, o uso de marcadores visíveis tem ganhado popularidade com tais marcadores como antocianinas, beta glicuronidase e seu substrato, GUS, e luciferase e seu substrato, luciferina, sendo amplamente usados não apenas para identificar os transformantes, mas também para quantificar a quantidade de expressão de proteína transitória ou estável atribuível a um sistema vetor específico (Rhodes C A et al (1995) Methods Mol Biol 55:121-131).

IDENTIFICAÇÃO DE TRANSFORMANTES CONTENDO A SEQÜÊNCIA DE POLINUCLEOTÍDEO

[00228] Embora a presença/ausência de expressão do gene marcador sugere que o gene de interesse esteja também presente, a presença e expressão de uma sHASEGP ativa devem ser confirmadas. Por exemplo, se a sHASEGP for inserida dentro de uma seqüência de gene marcador, as células recombinantes contendo sHASEGP podem ser identificadas pela ausência da função do gene marcador. Alternativamente, um gene marcador pode ser colocado em série com uma seqüência de sHASEGP sob o controle de um único promotor. A expressão do gene marcador em resposta à indução ou seleção geralmente indica a expressão da sHASEGP em série igualmente. A detecção de uma sHASEGP ativa neutra propriamente glicosi- lada pode ser determinada por meio de teste do meio condicionado para a atividade da enzima de sHASEGP sob condições apropriadas.

PURIFICAÇÃO DE sHASEGP.

[00229] As células hospedeiras transformadas com uma se- qüência de nucleotídeo da sHASEGP podem ser cultivadas sob condições adequadas para a expressão e recuperação da proteína codificada a partir da cultura celular. A proteína produzida por uma célula recombinante é preferi-velmente secretada, mas pode ser contida intracelularmente dependendo da seqüência e/ou do vetor usado. Como será compreendido por aqueles versados na técnica, os vetores de expressão contendo sHASEGP podem ser designados com seqüências de sinal que facilitam a secreção direta de sHASEGP através de uma membrana celular procariótica ou eucariótica. Outras construções recombinantes podem se unir a sHASEGP com a seqüência de nucleotídeo que codifica um domínio de polipeptídeo que facilitará a purificação de proteínas solúveis (Kroll D J et al (1993) DNA Cell Biol 12:441-53; conforme debate de proteínas de fusão contendo os vetores infra).

[00230] A sHASEGP pode também ser expressa como uma proteína recombinante com um ou mais domínios de polipeptídeo adicionais adicionados para facilitar a purificação da proteína. Tais domínios que facilitam a purificação incluem, mas não são limitados a, peptídeos de quelação de metal tais como módulos de histidina-triptofano que permitem a purificação sobre os metais imobilizados, domínios de proteína que permitem a purificação sobre a imunoglobulina imobilizada, e o domínio utilizado no sistema de extensão FLAGS/purificação por afinidade (Immunex Corp. Seattle Wash). A inclusão de uma seqüência ligante que se pode clivar tal como o Fator XA ou enteroci- nase (Invitrogen, San Diego Calif.) entre o domínio de purificação e a sHASEGP é útil para facilitar a purificação. Um tal vetor de expressão fornece expressão de uma proteína de fusão que compromete uma sHASEGP e contém ácido nucléico que codifica 6 resíduos de histidina seguido por tiorredo- xina e um sítio de clivagem enterocinase. Os resíduos de histidina facilitam a purificação sobre IMIAC (cromatografia por afinidade de íon de metal imobilizado como descrito em Porath et al (1992) Protein Expression and Purification 3: 263-281), enquanto o sítio de clivagem enterocinase fornece um meio para a purificação da quimiocina da proteína de fusão.

[00231] Além da produção recombinante, os fragmentos de sHASEGP podem ser produzidos pela síntese de peptídeo direta usando técnicas de fase sólida (conforme Stewart et al (1969) Solid-Phase Peptide Synthesis, W H Freeman Co, San Francisco; Merrifield J (1963) J Am Chem Soc 85:2149-2154). As sínteses de proteína in vitro podem ser executadas usando técnicas manuais ou por automatição. A sintese automatizada pode ser obtida, por exemplo, usando Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer, Foster City Calif.) de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante. Vários fragmentos de sHASEGP podem ser quimicamente sintetizados separadamente e combinados usando métodos químicos para produzir a molécula de comprimento total.

[00232] Os vetores de expressão contendo as seqüências de codificação, ou partes destas, de um polipeptídeo de sHASEGP, são produzidos, por exemplo, pela subclonagem das partes de codificação no sítio de restrição EcoR1 de cada um dos três vetores PGEX (vetores de expressão de glutati- ona S-transferase (Smith e Johnson, Gene 7: 31-40 (1988)). Isto permite a expressão dos produtos no quadro estrutura de leitura correto. Os vetores e sistemas exemplares para a expressão dos domínios de Hialuronidase dos polipeptídeos de sHASEGP incluem os vetores Pichia bem-conhecidos (disponíveis, por exemplo, da Invitrogen, San Diego, CA), particularmente aqueles designados para secreção das proteínas codificadas. A proteína pode também ser expressa citoplasmicamente, tal como nos corpos de inclusão. Um vetor exemplar é descrito nos exemplos.

[00233] Os plasmídeos para a transformação de céllas E. coli, incluem, por exemplo, os vetores de expressão pET (ver a Patente U.S. número 4.952.496; disponível da Novagen, Madison, WI; ver, também a literatura publicada por Novagen que descreve o sistema).

[00234] Tais plasmídeos incluem pET 11a, que contém o promotor T71ac, terminador T7, e operador E. coli lac induzível, e o gene repressor lac; pET 12A-C, que contém o promotor T7, terminador T7, e o sinal de secreção E. COLI OMPT; e pET 15B e PET19B (Novagen, Madison, WI), que contém uma seqüência líder His-Tag para uso na purificação com uma coluna His e um sítio de clivagem de trombina que permite a clivagem seguinte a purificação sobre a coluna; a região promotora T7 e o terminador T7.

[00235] Os vetores são introduzidos nas células hospedeiras, tais como células Pichia e células bacterianas, tais como E. coli, e as preteínas nelas expressas. As cepas de Pichia exemplares incluem, por exemplo, GS115. Os hospedeiros bacterianos exemplares contêm cópias cromossômi- cas de DNA que codificam a T7 RNA polimerase operavelmente ligada a um promotor induzível, tal como o promotor LACUV (ver, a Patente U.S. número 4.952.496). Tais hospedeiros incluem, mas não são limitados a, a cepa de E. coli lisogênica BL21 (DE3).

[00236] Os domínios de sHASEGP, derivados e análogos podem ser produzidos por vários métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, assim que uma célula recombinante que expressa um polipeptídeo de sHASEGP, ou um domínio, fragmento ou derivado deste for identificada, o produto genético individual pode ser isolado e analisado. Isto é obtido por ensaios com base nas propriedades físicas e/ou funcionais da proteína, incluindo, mas não limitado a eles, rotulagem radioativa do produto seguido pela análise por eletroforese de gel, imunoensaio, reticulação com o produto mar- cador-rotulado, e ensaios de atividade proteolítica.

[00237] Os polipeptídeos de sHASEGP podem ser isolados e purificados por métodos padrão conhecidos na técnica (ou de fontes naturais ou de células hospedeiras recombinantes que expressam os complexos ou proteínas), incluindo mas não restrito à cromatografia de coluna (por exemplo, troca de íon, afinidade, exclusão de gel, pressão elevada de fase reversa e líquida de proteína rápida), centrifugação diferencial, solubilidade diferencial, ou por qualquer outra técnica padrão usada para a purificação das proteínas.

[00238] Em uma modalidade, uma sHASEGP pode ser purificada com homogeneidade do meio condicionado quimicamente definido de HZ24 transfectado e células DG44 amplificadas por metotrexato pela 1) diafil- tração de fluxo tangencial, 2) ligação e eluição a partir da cromatografia de troca de ânion, 3) fluxo através da cromatografia de fenil sefarose, 4) ligação e eluição a partir da cromatografia de fenilboronato e 4) ligação e eluição com cromatografia de hidroxiapatita.

[00239] As propriedades funcionais podem ser avaliadas usando qualquer ensaio adequado conhecido na técnica.

[00240] Alternativamente, assim que um polipeptídeo de sHASEGP ou seu domínio ou derivado for identificado, a seqüência de ami- noácido da proteína pode ser deduzida da seqüência de nucleotídeo do gene que a codifica. Como um resultado, a proteína ou seu domínio ou derivado pode ser sintetizada por métodos químicos padrão conhecidos na técnica (por exemplo, ver Hunkapiller et al, Nature 310: 105-111 (1984)) seguido por glico- silação in vitro.

[00241] Manipulações de seqüências de polipeptídeo de sHASEGP podem ser feitas no nível de proteína. Também aqui contemplado são as proteínas de polipeptídeo da sHASEGP, seus domínios, derivado ou análogos ou fragmentos destas, que são diferencialmente modificadas durante ou após a tradução, por exemplo, por glicosilação, acetilação, fosforila- ção, amidação, pegilação, derivatização, por grupos conhecidos de prote- ção/bloqueio, clivagem proteolítica, ligação a uma molécula de anticorpo ou outro ligando celular.

[00242] Qualquer uma das numerosas modificações químicas podem ser realizada por técnicas conhecidas, incluindo, mas não limitadas a, clivagem química específica por brometo de cianogênio, tripsina, quimiotrip- sina, papaína, V8, NABH4, acetilação, formilação, oxidação, redução, síntese metabólica na presença de tunicamicina et al. de tais agentes.

[00243] Além disso, domínios, análogos e derivados de um poli- peptídeo de sHASEGP podem ser quimicamente sintetizados. Por exemplo, um peptídeo que corresponde a uma parte de um polipeptídeo de sHASEGP, que inclui o domínio desejado ou que media a atividade desejada in vitro pode ser sintetizado pelo uso de um sintetizador de peptídeo.

[00244] Além disso, se desejável, aminoácidos não-clássicos ou análogos de aminoácido químicos podem ser introduzidos como uma substituição ou adição na seqüência de polipeptídeo da sHASEGP.

[00245] Os aminoácidos não-clássicos incluem, mas não são limitados a, os D-isômeros dos aminoácidos comuns, ácido a-amino butírico, ácido 4-aminobutírico, Abu, ácido 2-aminobutírico, E-ABU, e-Ahx, ácido 6- amino hexanóico, Aib, ácido 2-amino isobutírico, ácido 3-amino propiônico, ortinina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, ácido cistéico, t-butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina, cicloexilalanina, β-alanina, flúor-aminoácidos, aminoácidos planejados tais como aminoácidos de β-me- tila, aminoácidos de ca-metila, aminoácidos de na-metila, e análogos de ami- noácido em geral. Além disso, o aminoácido pode ser d (dextrorrotatório) ou l (levorrotatório).

[00246] Nos casos onde os produtos naturais são suspeitos de serem mutantes ou são isolados de novas espécies, a seqüência de aminoá- cido do polipeptídeo de sHASEGP isolada da fonte natural, assim como aquela expressa in vitro, ou a partir dos vetrores de expressão sintetizados in vivo ou in vitro, pode ser determinada a partir da análise da seqüência de DNA, ou alternativamente, por seqüenciamento direto da proteína isolada. Tal análise pode ser executada pelo seqüenciamento manual ou através do uso de um seqüenciadodor de aminoácido automatizado.

[00247] Modificações - Uma variedade de modificações dos po- lipeptídeos de sHASEGP e domínios é aqui contemplada. Uma molécula de ácido nucléico que codificada a sHASEGP pode ser modificada por qualquer uma das numerosas estratégias conhecidas na técnica (Sambrook ET A/. (1990), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). As seqüências podem ser clivadas em sítios apropriados com endonuclease(s) de restrição, seguido por outra modificação enzimática se desejável, isoladas, e ligadas in vivo. Na produção do gene que codifica um domínio, derivado ou análogo de sHASEGP, cuidado deve ser tomado para garantir que o gene modificado retenha o quan- dro de leitura traducional original, não-interrompido por sinais de parada tra- ducional, na região do gene onde a atividade desejada é codificada.

[00248] Adicionalmente, as moléculas de ácido nucléico que codificam a sHASEGP podem ser submetidas a mutação in vitro ou in vivo, para criar e/ou destruir as seqüências de tradução, iniciação e/ou de término, ou criar variações nas regiões de codificação e/ou formar novos sítios de endonuclease de restrição ou destruir aquelas preexistentes, para facilitar outra modificação in vitro. Da mesma forma, como aqui descrito, as muteínas com alterações de seqüência primária, tais como substituições de resíduos Cys e eliminação ou adição de sítios de glicosilação, são contempladas; a sHASEGP da SEQ ID NO: 1 possui sete sítios de glicosilação potencial. Tais mutações podem ser efetuadas por qualquer técnica para a mutagênese conhecida na técnica, incluindo, mas não limitado a eles, mutagênese química e mutagênese direcionada ao sítio in vitro (Hutchinson et al., J. Biol. Chem. 253: 6551-6558 (1978)), uso de ligantes (Pharmacia). Em uma modalidade, por exemplo, um polipeptídeo de sHASEGP ou seu domínio é modificado para incluir um rótulo fluorescente. Em outras modalidades específicas, o polipep- tídeo de sHASEGP é modificado para ter um reagente heterobifuncional, tais agentes heterobifuncionais podem ser usados para reticular a os membros do complexo.

[00249] Além disso, domínios, análogos e derivados de sHASEGP podem ser quimicamente sintetizados. Por exemplo, um peptídeo que corresponde a uma parte de uma sHASEGP, que inclui o domínio desejado ou que media a atividade desejada in vitro, pode ser sintetizado mediante o uso de um sintetizador de peptídeo. Além disso, se desejável, os aminoáci- dos não-clássicos ou análogos de aminoácido químicos podem ser introduzidos como uma substituição ou adição na seqüência de sHASEGP. Os amino- ácidos não-clássicos incluem, mas não são limitados a, os D-isômeros dos aminoácidos comuns, ácido a-amino isobutírico, ácido 4-aminobutírico, Abu, ácido 2-aminobutírico, S-ABU, e-Ahx, ácido 6-amino hexanóico, Aib, ácido 2- amino isobutírico, ácido 3-amino propiônico, ortinina, norleucina, norvalina, hi- droxiprolina, sarcosina, citrulina, ácido cistéico, t-butilglicina, t-butilalanina, fe- nilglicina, cicloexilalanina, β-alanina, flúor-aminoácidos, aminoácidos planejados tais como aminoácidos de ti-metila, aminoácidos de ca-metila, aminoáci- dos de na-metila, e análogos de aminoácido em geral. Além disso, o aminoá- cido pode ser d (dextrorrotatório) ou l (levorrotatório).

F. GERAÇÃO DE UMA sHASEGP GLICOSILADA FUNCIONALMENTE ATIVA COM PORÇÕES DE AÇÚCAR LIGADAS A N

[00250] A sHASEGP humana apropriadamente N-glicosilada é requerida para gerar uma proteína cataliticamente estável. A glicosilação Ligada a N de sHASEGP pode ser obtida através de várias técnicas. A glicosi- lação de sHASEGP pode ser obtida pela introdução de ácidos nucléicos que codificam a sHASEGP nas células de origem eucariótica capaz de glicosilação Ligada a N apropriada ou alternativamente, pelo contato do polipeptídeo de sHASEGP com extratos livres de célula ou enzimas purificadas capazes de introduzir as porções de açúcar Ligados a N desejadas.

SELEÇÃO DE UM SISTEMA DE EXPRESSÃO

[00251] Os sistemas de expressão da célula eucariótica variam na extensão e tipo de glicosilação que eles introduzem em um polipeptídeo ectopicamente expresso. As células CHO são, por exemplo, altamente eficientes na introdução de glicosilação Ligada a N em um polipeptídeo de sHASEGP ativo.

[00252] Os sistemas de expressão eucarióticos adicionais que introduzem glicosilação N-ligada a N para gerar um produto de sHASEGP funcional podem ser testados mediante a introdução de um plasmídeo de expressão de sHASEGP humana em ditas células e testadas com relação a atividade neutra. A glicosilação Ligada a N apropriada pode ser determinada por meio de análise FACE de oligossacarídeos liberados de PNGASE. Os perfís de glicosilação de sHASEGPs cataliticamente ativas são aqui ainda fornecidos. A verificação de glicosilação pode também ser feita mediante o tratamento de sHASEGP de ditas células com PNGASE-F ou mediante o desenvolvimento de tais células em tunicamicina seguinte a introdução de ácidos nucléicos que codificam a sHASEGP.

[00253] N-glicosilação de polipeptídeo de sHASEGP in vitro. O polipeptídeo de sHASEGP pode ser N-glicosilado pelo contato do polipeptídeo de sHASEGP com extratos livres de célula contendo atividade capaz de transferir açúcares Ligados a N ao polipeptídeo de sHASEGP tal como as membranas microssômicas caninas ou através da transcrição e tradução acoplada como é comercialmente disponível (Promega Madison WI).

[00254] Os oligossacarídeos são considerados terem uma extremidade redutora e uma extremidade não-redutora, quer sim quer não o saca- rídeo na extremidade redutora seja de fato um açúcar de redução. De acordo com a nomenclatura aceita, os oligossacarídeos são aqui representados com a extremidade não-redutora na esquerda e a extremidade redutora na direita. Todos os oligossacarídeos aqui descritos são descritos com o nome ou abreviação com relação ao sacarídeo não-redutor (por exemplo, Gal), seguido pela configuração da ligação glicosídica (.alfa. ou .beta.), a ligação de anel, a posição do anel do sacarídeo de redução envolvido na ligação, e depois o nome ou abreviação do sacarídeo redutor (por exemplo, GlcNAc). A ligação entre dois açúcares pode ser expressa, por exemplo, como 2,3 2.fw darw.3, ou (2,3). Cada sacarídeo é uma piranose.

[00255] Como aqui usado, a porção de açúcar Ligada a N refere- se a um oligossacarídeo ligado a uma sHASEGP através do nitrogênio de amido dos resíduos Asn. Os oligossacarídeos Ligados a N caem em vários tipos principais (oligomanose, complexo, híbrido, sulfatado), todos dos quais possuem (Man) 3-GlcNAc-GlcNAc-núcleos ligados através do nitrogênio de amido dos resídos de Asn que caem dentro das seqüências -Asn-Xaa- Thr/Ser- (onde Xaa não é Pro). Os sítios Ligados a N são freqüentemente de forma indireta designados pelo aparecimento de um ciclo em "branco" durante o seqüenciamento. A identificação positiva pode ser feita após a liberação do oligossacarídeo por PNGase F, que converte a ASN glicosilada em Asp. Após a liberação de PNGase, os oligossacarídeos Ligados a N podem ser purificados usando a cromatografia de Bio-Gel P-6, com a reunião de oligossacarídeo submetida à cromatografia de troca de ânion com pH elevado preparativa (HPAEC) (Townsend et al., (1989) Anal. Biochem. 182, 1-8). Certos isômeros de oligossacarídeo podem ser resolvidos usando HPAEC. Resíduos de fucose mudarão as posições de eluição mais no princípio no cromatograma HPAEC, enquanto os resíduos de ácido siálico adicionais aumentarão o tempo de re-tenção. O tratamento concorrente das glicoproteínas cujas estruturas de oli- gossacarídeo são conhecidas (por exemplo, fetuína bovina, glicoproteína ácida a-1, ovalbumina, RNAse B, transferrina) pode facilitar a escolha dos picos de oligossacarídeo. Os oligossacarídeos coletados podem ser caracteri-zados por uma combinação de análises de ligação composicional e metilação (Waeghe et al., (1983) Carbohydr Res. 123, 281-304.), com configurações anoméricas designadas por espectroscopia de RMN (Van Halbeek (1993) em Methods Enzymol 230).

[00256] Alternativamente, os oligossacarídeos pode ser identificados por eletroforese de carboidrato assitida por fluorescência (FACE) Cal- lewaert et al. (2001) Glycobiology 11, 275-281.

G. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE PORÇÕES DE AÇÚCAR LIGADAS A N SOBRE A sHASEGP.

[00257] A determinação se uma proteína é de fato glicosilada é a etapa inicial na análise de glicoproteína glicano. A eletroforese de gel de poliacrilamida na presença de dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) tem se tornado o método de escolha como a etapa final antes do seqüenciamento da proteína. As proteínas glicosiladas freqüentemente migram como faixas difusas por SDS-PAGE. Uma diminuição na largura de faixa e mudança na posição de migração após o tratamento com peptídeo-N4-(N-acetil-D- glicosaminila) asparagina amidase (PNGase F) são considerados diagnósticos da glicosilação Ligada a N. Se os outros tipos de glicosilação forem predominantes outros métodos devem ser usados. Métodos de manchamento de lectina fornecem uma maneira que é independente da classe de glicosilação (N versus O). As lectinas, proteínas de ligação a carboidrato de vários tecidos de planta, possuem tanto afinidade elevada quanto especificidade limitada para uma ampla faixa de epítopos de açúcar definidos observados nos glica- nos da glicoproteína (Cummings, R. D. (1994) Methods in Enzymol. 230, 6686.). Quando conjugado com biotina ou digoxigenina, elas podem ser facilmente identificadas nas manchas da membrana através de uma reação colo- rimétrica utilizando avidina ou anticorpos antidigoxigenina conjugados com a fosfatase alcalina (Haselbeck, et al. (1993) Methods in Mol. Biol. 14, 161-173.), análogos das reações de anticorpo-fosfatase alcalina secundárias empregados em Western blotting. A triagem com um painel de lectinas com especificidade bem-definida pode fornecer considerável informação a cerca de um complemento de carboidrato da glicoproteína. Muito importante, a amplificação do desenvolvimento da cor é suficientemente elevada em que de 10 a 50 ng de uma glicoproteína pode facilmente ser vista sobre uma mancha de membrana de uma SDS-PAGE. Embora as lectinas apresentem afinidade muito elevada com relação a seus ligandos cognatos, algumas revelam avidez significativa com relação aos epítopos estruturalmente liberados. Assim, é importante cuidadosamente observar a possibilidade de reatividade cruzada quando se escolhe um painel de lecitinas, e aplicar aqueles com a probabilidade mais alta de individualmente distinguir os glicanos Ligados a N complexos, híbridos e de manose elevada das estruturas ligadas a O.

[00258] Análise de monossacarídeo pode também ser usada para determinar se a sHASEGP é glicosilada e como no caso de análise de lectina fornece informação adicional sobre os aspectos estruturais. A análise da composição de monossacarídeo quantitativa i) identifica as proteínas gli- cosiladas, ii) dá a relação molar de açúcares individuais na proteína, iii) sugere, em alguns casos, a presença de classes de oligossacarídeo, iv) é a primeira etapa no planejamento de uma estratégia de elucidação estrutural, e v) fornece certo grau de consistência de produção com relação aos produtos terapêuticos de glicoproteína recombinante. Nos últimos anos a cromatografia de troca de ânion com pH elevado com detecção amperométrica pulsada (HPAEC-PAD) foi extensivamente usada para determinar a composição de monossacarídeo (Townsend, et al. (1995) em Carbohydrate Analysis: High- performance liquid chromatography and capillary electrophoresis (Z. El Rassi ed.). pp. 181-209.). Mais recentemente, métodos de rotulagem com base em fluoróforo foram introduzidos e muitos são disponíveis em forma de kit. Uma vantagem distinta de métodos fluorescentes é um aumento na sensibilidade (50 vezes). Uma desvantagem potencial é que diferentes monossacarídeos podem demonstrar seletividade diferente com relação ao fluoróforo durante a reação de acoplamento, ou no hidrolisado ou na mistura padrão externa. Entretanto, o aumento na sensibilidade e na capacidade de identificar quais mo- nossacarídeos estão presentes a partir de uma pequena porção da quantidade total de glicoproteína disponível, assim como o potencial para maior sensibilidade usando fluorescência induzida por laser torna este método atrativo.

[00259] A análise da composição de monossacarídeo de pequenas quantidades de sHASEGP é melhor executada nas membranas PVDF (PSQ), após ou eletromanchamento (Weitzhandler et al, (1993) J. Biol. Chem. 268, 5121-5130) ou se alíquotas menores forem analisadas em manchas-pon- tos. PVDF é uma matriz para análise de carboidrato visto que nenhum monoou oligossacarídeo se liga à membrana, assim que liberado por hidrólise ácida ou enzimática.

[00260] A análise FACE é um meio eficiente de detectar os perfís de glicosilação de sHASEGPs. FACE® N-Linked Oligossaccharide Profiling (Prozyme) com géis de oligossacarídeo a 30% é um tal mecanismo. Os oli- gossacarídeos clivados a partir de 100 μg de glicoproteínas mediante a diges-tão enzimática com N-Glicanase (a.k.a PNGase), rotulados usando o fluoró- foro ANTS, e separados por eletroforese podem ser usados para a detecção de perfís de glicosilação de sHASEGP. As posições relativas das faixas de oligossacarídeo são determinadas mediante a operação da amostra e diluições da amostra em comparação com um oligossacarídeo padrão de variação crescente que designa a distância de migração em unidades de Grau de Po- limerização (DP).

H. MÉTODOS DE TRIAGEM PARA IDENTIFICAR COMPOSTOS QUE MODULAM A ATIVIDADE DE sHASEGP.

[00261] Vários tipos de ensaios são exemplificados e aqui descritos. Fica entendido que os domínios de Hialuronidase podem ser usados em outros ensaios. É aqui mostrado, no entanto, que os domínios de Hialuro- nidase apresentam atividade catalítica.

[00262] Como tais eles são ideais para ensaios de triagem in vitro.

[00263] Eles podem também ser usados nos ensaios de ligação. Os zimogênios de comprimento total de sHASEGP, as enzimas ativadas e os domínios de Hialuronidase são contemplados para uso em qualquer ensaio de triagem conhecido por aqueles versados na técnica, incluindo aqueles aqui fornecidos. Portanto a descrição que segue, se direcionada aos ensaios de Hialuronidase, é planejada para se aplicar ao uso de um domínio de Hialuro- nidase de cadeia única ou uma parte cataliticamente ativa deste de qualquer Hialuronidase, incluindo uma sHASEGP. Outros ensaios, tais como ensaios de ligação são aqui fornecidos, particularmente para uso com uma sHASEGP, incluindo qualquer variante, tal como as suas variantes de união. I. Ensaios Catalíticos para a identificação dos agentes que modulam a atividade Hialuronidase de uma proteína sHASEGP. Métodos para a identificação de um modulador da atividade catalítica de uma sHASEGP, particularmente um domínio de Hialuronidase de cadeia única ou parte catalitica- mente ativa deste, são aqui fornecidos. Os métodos podem ser praticados por: colocar em contato a sHASEGP, um zimogênio de comprimento total ou forma ativada, e particularmente um domínio de cadeia única desta, com um substrato da sHASEGP na presença de uma substância de teste, e detectar a pro- teólise do substrato, pela qual a atividade da sHASEGP é avaliada, e comparar a atividade com um controle. Por exemplo, um controle pode ser a atividade da sHASEGP avaliada pelo contato de uma sHASEGP, incluindo um zimogênio de comprimento total ou forma ativada, e particularmente um domínio de cadeia única deste, particularmente um domínio de cadeia única deste, com um substrato da sHASEGP, e detectar a proteólise do substrato, por meio do qual a atividade da sHASEGP é avaliada. Os resultados na presença e ausência dos compostos de teste são comparados. Uma diferença na atividade indica que a substância de teste modula a atividade da sHASEGP. Os ativadores da clivagem de ativação da sHASEGP são também contemplados; tais ensaios são discutidos abaixo.

[00264] Em uma modalidade uma pluralidade das substâncias de teste é submetida a triagem simultaneamente no método de triagem acima. Em uma outra modalidade, a sHASEGP é isolada a partir de uma célula alvo como um meio para depois identificar os agentes que são potencialmente específicos com relação à célula alvo.

[00265] Em uma outra modalidade, uma substância de teste é um composto terapêutico, e pelo qual uma diferença da atividade de sHASEGP medida na presença e na ausência da substância de teste indica que a célula alvo responde ao composto terapêutico.

[00266] Um método inclui as etapas de (a) colocar em contato o polipeptídeo de sHASEGP ou seu domínio de Hialuronidase com um composto de teste ou uma pluralidade de compostos de teste sob as condições conducentes para interação entre o ligando e os compostos; e (b) identificar um ou mais compostos na pluralidade que especificamente se liga ao ligando.

[00267] Um outro método aqui fornecido inclui as etapas de a) colocar em contato o polipeptídeo de sHASEGP ou seu domínio de Hialuroni- dase com um substrato do polipeptídeo de sHASEGP, e detectar a degradação do substrato, por meio da qual a atividade do polipeptídeo de sHASEGP é avaliada; b) colocar em contato o polipeptídeo de sHASEGP com um substrato do polipeptídeo de sHASEGP na presença de uma substância de teste, e detectar a degradação do substrato, pela qual a atividade do polipeptídeo de sHASEGP é avaliada; e c) comparar a atividade do polipeptídeo da sHASEGP avaliada nas etapas a) e b), por meio da qual a atividade medida na etapa a) difere da atividade medida na etapa b) indica que a substância de teste modula a atividade do polipeptídeo de sHASEGP.

[00268] Em uma outra modalidade, uma pluralidade das substâncias de teste é submetida a triagem simultaneamente. Na comparação da atividade de um polipeptídeo de sHASEGP na presença e ausência de uma substância de teste para avaliar se a substância de teste é um modulador do polipeptídeo de sHASEGP, é desnecessário avaliar a atividade em paralelo, embora tal medição paralela seja típica. É possível medir a atividade do poli- peptídeo de sHASEGP em um momento e comparar a atividade medida com um valor histórico da atividade do polipeptídeo de sHASEGP.

[00269] Por exemplo, pode-se medir a atividade do polipeptídeo de sHASEGP na presença de uma substância de teste e compará-la com o valor histórico da atividade do polipeptídeo de sHASEGP medida anteriormente na ausência da substância de teste, e vice-versa. Isto pode ser exe-cutado, por exemplo, mediante o fornecimento da atividade do polipeptídeo de sHASEGP em um suplemento ou panfleto fornecido com um kit para conduzir o ensaio.

[00270] Métodos para selecionar substratos para uma sHASEGP particular são descritos nos EXEMPLOS, e os ensaios de Hialuro- nidase particulares são exemplificados.

[00271] Combinações e kits contendo as combinações opcionalmente incluindo instruções para executar os ensaios são fornecidos. As combinações incluem um polipeptídeo de sHASEGP e um substrato do polipeptí- deo de sHASEGP a serem avaliados; e, opcionalmente reagentes para detectar a proteólise do substrato. Os substratos, que podem ser moléculas cromo- gênicas ou fluorogênicas, incluindo glicosaminoglicanos, sujeitos à proteólise por um polipeptídeo de sHASEGP particular, podem ser identificados empiricamente por testar a capacidade do polipeptídeo de sHASEGP em clivar o substrato de teste. Os substratos que são clivados mais eficazmente, isto é, nas concentrações mais baixas e/ou taxa mais rápida ou sob as condições desejáveis, são identificados.

[00272] Aqui adicionalmente fornecido é um kit contendo a combinação descrita acima. O kit opcionalmente inclui instruções para identificar um modulador da atividade de um polipeptídeo de sHASEGP. Qualquer polipeptídeo de sHASEGP é contemplado como alvo para identificar os mo- duladores da sua atividade.

[00273] 2. Ensaios de ligação. Da mesma forma aqui fornecido são os métodos para a identificação e isolamento de agentes, particularmente compostos que se ligam à sHASEGP. Os ensaios são designados para identificar agentes que se ligam ao domínio de Hialuronidase isolado (ou uma pro-teína, diferente de um polipeptídeo de sHASEGP, que contém o domínio de Hialuronidase de um polipeptídeo de sHASEGP), e à forma ativada, incluindo a forma ativada derivada do zimogênio de comprimento total ou de um domínio de Hialuronidase prolongado. Os compostos identificados são candidatos ou levam à identificação dos compostos para tratamentos de distúrbios e doenças envolvendo a atividade de Hialuronidase aberrante. Os polipeptídeos de sHASEGP usados nos métodos incluem qualquer polipeptídeo de sHASEGP como aqui definido, incluindo o domínio de Hialuronidase de cadeia única de sHASEGP ou parte proteoliticamente ativa deste.

[00274] Uma variedade de métodos é aqui fornecida. Estes métodos podem ser executados em solução ou em reações de fase sólida em que o(s) polipeptídeo(s) de sHASEGP ou domínio(s) de Hialuronidase deste(s) são ligados, ou direta ou indiretamente através de um articulador, a um suporte sólido. Os ensaios de triagem são descritos nos Exemplos, e estes ensaios foram usados para identificar os compostos candidatos.

[00275] Para os propósitos inclusos, todos os ensaios de ligação descritos acima são fornecidos para a sHASEGP.

[00276] Métodos para a identificação de um agente, tal como um composto, que especificamente se liga a um domínio de Hialuronidase de cadeia única da sHASEGP, uma sHASEGP ativada de comprimento total ou domínio de Hialuronidase de duas cadeias desta são aqui fornecidos. O método pode ser praticado mediante (a) o contato da sHASEGP com um agente de teste ou uma pluralidade de agentes de teste sob condições conducentes para se ligar entre a sHASEGP e um agente; e (b) a identificação de um ou mais agentes dentro da pluralidade que especificamente se liga à sHASEGP.

[00277] Por exemplo, na prática de tais métodos o polipeptídeo de sHASEGP é misturado com um par de ligação potencial ou um extrato ou fração de uma célula sob as condições que permitem a associação dos pares de ligação potencial com o polipeptídeo. Após a mistura, os peptídeos, poli- peptídeos, proteínas ou outras moléculas que se tornaram associados com uma sHASEGP são separados da mistura. O par de ligação que se liga à sHASEGP pode então ser removido e ainda analisado. Para identificar e isolar um par de ligação, a proteína inteira, por exemplo, a poteína apresentada inteira da SEQ ID NO: 1, pode ser usada. Alternativamente, um fragmento da proteína pode ser usado.

[00278] Uma variedade de métodos pode ser usada para se obter extratos celulares ou fluidos corporais, tais como sangue, soro, urina, suor, fluido sinovial, CSF et al. tais fluidos.

[00279] Por exemplo, as células podem ser rompidas usando métodos de rompimento físico ou químico. Exemplos de rompimento físico incluem, mas não são limitados a, sonicação e cisalhamento mecânico. Exemplos de métodos de lise química incluem, mas não são limitados a, lise por detergente e lise por enzima. Um técnico versado pode facilmente adaptar os métodos para a preparação de extratos celulares de modo a se obter extratos para uso nos presentes métodos.

[00280] Assim que um extrato de uma célula for preparado, o extrato é misturado com a sHASEGP sob condições em que a associação da proteína com o par de ligação pode ocorrer. Uma variedade de condições pode ser usada, incluindo as condições que se parecem com as condições observadas no citoplasma de uma célula humana ou em um fluido corporal, tal como o sangue. Os aspectos, tais como osmolaridade, pH, temperatura, e a concentração de extrato celular usada, podem ser variados para otimizar a associação da proteína com o par de ligação. Similarmente, os métodos para isolamento das moléculas de interesse a partir dos fluidos corporais são conhecidos.

[00281] Após mistura sob condições apropriadas, o complexo ligado é separado da mistura. Uma variedade de técnicas pode ser usada para separar a mistura. Por exemplo, anticorpos específicos a uma sHASEGP podem ser usados para imunoprecipitar o complexo de par de ligação. Alternativamente, técnicas de separação química padrão tais como cromatografia e centrifugação de densidade/sedimento podem ser usadas.

[00282] Após a remoção dos constituintes celulares não associados no extrato, o par de ligação pode ser dissociado do complexo usando métodos convencionais. Por exemplo, a dissociação pode ser executada mediante a alteração da concentração de sal ou pH da mistura.

[00283] Para auxiliar na separação de duplas de pares de ligação associadas do extrato da mistura, a sHASEGP pode ser imobilizada em um suporte sólido. Por exemplo, a proteína pode ser ligada a uma matriz de nitrocelulose ou glóbulos acrílicos. A ligação da proteína ou um fragmento desta a um suporte sólido auxilia na separação das duplas de pares de peptí- deo/ligação det al. constituintes observados no extrato. os pares de ligação identificados podem ser ou uma proteína isolada ou um complexo preparado de duas ou mais proteínas.

[00284] Alternativamente, as moléculas de ácido nucléico que codificam as Hialuronidases de cadeia única podem ser usadas em um sistema híbrido de duas leveduras. O sistema híbrido de duas leveduras foi usado para identificar outras duplas de pares de proteína e pode facilmente ser adaptado para empregar as moléculas de ácido nucléico aqui descritas.

[00285] Um outro ensaio de ligação in vitro, particularmente com relação a uma sHASEGP, utiliza uma mistura de um polipeptídeo que contém pelo menos o domínio catalítico de uma destas proteínas e um ou mais alvos ou substratos de ligação candidatos. Após a incubação da mistura sob condições apropriadas, a capacidade da sHASEGP ou um fragmento de polipeptí- deo desta contendo o domínio catalítico de se ligar ou interagir com o substrato candidato é avaliada. Com relação aos ensaios de ligação livres de célula, um dos componentes inclui ou é acoplado a um rótulo detectável. O rótulo pode fornecer detecção diferente, tal como radioatividade, luminescência, densidade ótica ou de elétron, etc., ou detecção indireta tal como um epítopo tag, uma enzima, etc. Uma variedade de métodos pode ser empregada para detectar o rótulo dependendo da natureza do rótulo et al. componentes de ensaio. Por exemplo, o rótulo pode ser detectado ligado ao substrato sólido ou uma parte do complexo ligado contendo o rótulo pode ser separada do substrato sólido, e o rótulo depois disso detectado.

[00286] 3. A detecção da transdução de sinal de sHASEGP, que é uma proteína ancorada na membrana, pode estar envovida direta ou indiretamente na transdução de sinal diretamente como um receptor da superfície celular ou indiretamente pelas proteínas de ativação, tais como fatores pró- crescimento que podem iniciar a transdução de sinal.

[00287] Além disso, a sHASEGP secretada, tal como o domínio solúvel de sHASEGP como descrito na SEQ ID NO: 4, pode ser envolvida na transdução de sinal ou diretamente pela ligação ou interação com um receptor da superficie celular ou indiretamente pelas proteínas de ativação, tais como os fatores de pró-crescimento que podem iniciar a transdução de sinal. Ensaios para a avaliação da transdução de sinal são bem-conhecidos por aqueles versados na técnica, e podem ser adaptados para uso com o polipeptídeo de sHASEGP.

[00288] Os ensaios para a identificação de agentes que afetam ou alteram a transdução de sinal mediados direta ou indiretamente, tais como através da ativação de um fator de pró-droga, por uma sHASEGP, particularmente o comprimento total ou uma parte suficiente para ancorar o domínio extracelular ou uma parte funcional deste de uma sHASEGP sobre a superfície de uma célula são fornecidos. Tais ensaios, incluem, por exemplo, os ensaios com base na transcrição em que a modulação de um sinal transduzido é avaliada pela detecção de um efeito em uma expressão de um gene repórter (ver, por exemplo, Patente U.S. número 5.436.128).

[00289] 4. Métodos para a Identificação de Agentes que Modulam a Expressão de um Ácido Nucléico que codifica uma sHASEGP. Uma outra modalidade fornece métodos para a identificação de agentes que modulam a expressão de um ácido nucléico que codifica uma sHASEGP. Tais ensaios usam qualquer meio disponível de monitoramento para mudanças no nível de expressão dos ácidos nucléicos que codificam uma sHASEGP.

[00290] Os formatos de ensaio podem ser usados para monitorar a capacidade do agente em modular a expressão de um ácido nu- cléico que codifica uma sHASEGP. Por exemplo, a expressão de mRNA pode ser monitorada diretamente pela hibridização dos ácidos nucléicos. Da mesma forma os ensaios de enzima como descritos podem ser usados para detectar agentes que modulam a expressão da sHASEGP.

[00291] As linhagens celulares são expostas ao agente a ser testado sob condições e tempo apropriadas e o RNA ou mRNA total é isolado por procedimentos padrão (ver, por exemplo, Sambrook et al (1989) MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2a Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press). As sondas para detectar diferenças nos níveis de expressão do RNA entre as células expostas ao agente e controlar as células podem ser preparadas a partir dos ácidos nucléicos. É típico, mas não necessário, projetar as sondas que hibridizam apenas com os ácidos nucléicos alvos sob as condições de severidade elevada. Somente os híbridos de ácido nucléico altamente complementares se formam sob condições de severidade elevada. Consequentemente, a severidade das condições de ensaio determina a quantidade de capacidade complementar que deve existir entre dois filamentos de ácido nucléico de modo a formar um híbrido. A severidade deve ser escolhida para maximizar a diferença na estabilidade entre a sonda: híbrido alvo e sonda potencial: híbridos não-alvos.

[00292] Por exemplo, os fragmentos N e C terminais da sHASEGP podem ser expressos nas bactérias e usados para procurar as proteínas que se ligam a estes fragmentos. As proteínas de fusão, tais com His- tag ou fusão GST nas regiões N ou C terminais da sHASEGP, podem ser preparadas para uso como um substrato. Estas proteínas de fusão podem ser acopladas a, por exemplo, glóbulos de Glutationa-Sefarose e depois sondadas com lisados de célula ou fluidos corporais. Antes da lise, as células ou fluidos corporais podem ser tratadas com um agente candidato que pode mo-dular uma sHASEGP ou proteínas que interagem com os domínios delas. A ligação das proteínas de lisado nas proteínas de fusão pode ser resolvida por SDS-PAGE, isolada e identificada pelo seqüenciamento da proteína ou es- pectroscopia de massa, como é conhecido na técnica.

[00293] As sondas de anticorpo são preparadas mediante a imunização de hospedeiros de mamífero adequados em protocolos de imunização apropriados usando os peptídeos, polipeptídeos ou proteínas se eles forem de comprimento suficiente (por exemplo, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,20, 25,30,35,40 ou mais aminoácidos consecutivos do polipeptídeo de sHASEGP ou se requeridos para intensificar a imu- nogenicidade, conjugados para veículos adequados. Métodos para a preparação de conjugados imunogênicos com veículos, tais como albumina de soro bovino (BSA), hemocianina de lapa de buraco de fechadura (KLH), ou outras proteínas veículoas são bem-conhecidos na técnica. Em algumas circunstâncias, a conjugação direta usando, por exemplo, reagentes de carbodiimida podem ser eficazes; em outros exemplos reagentes de ligação como aqueles fornecidos por Pierce Chemical Co., Rockford, IL, podem ser desejáveis para fornecer acessibilidade ao hapteno. Os peptídeos de hapteno podem ser estendidos no término de amino ou carbóxi com um resíduo Cys ou entremeados com resíduos de cisteína, por exemplo, para facilitar a ligação a um veículo.

[00294] A administração dos imunógenos é conduzida geralmente por injeção por um período de tempo adequado e com o uso de adjuvantes adequados, como é de uma forma geral compreendido na técnica. Durante o plano de imunização, títulos de anticorpos são tomados para determinar a adequação da formação do anticorpo.

[00295] Os anticorpos antipeptídeos podem ser gerados usando peptídeos sintéticos correspondendo aos, por exemplo, aminoácidos terminais de carbóxi da sHASEGP.

[00296] Os peptídeos sintéticos podem ser tão pequenos quanto 1 a 3 aminoácidos no comprimento, geralmente pelo menos 4 ou mais resíduos de aminoácido inteiros. Os peptídeos podem ser acoplados ao KLH usando métodos padrão e podem ser imunizados em animais, tais como coelhos ou ungulados. Os anticorpos policlonais podem então ser purificados, por exemplo, usando glóbulos Actigel contendo o peptídeo covalentemente ligado.

[00297] Embora os anti-soros anticlonais produzidos desta maneira possam ser satisfatórios para algumas aplicações, para as composições farmacêuticas, o uso de preparações monoclonais é geralmente utilizado. As linhagens celulares imortalizadas que secretam os anticorpos mono- clonais desejados podem ser preparados usando o método padrão de Kohler et al., (Nature 256: 495-7 (1975)) ou modificações que efetuam a imortalização dos linfócitos ou células do baço, como é geralmente conhecido. As linhagens celulares imortalizadas que secretam os anticorpos desejados são submetidas a triagem por imunoensaio em que o antígeno é o hapteno de peptídeo, polipeptídeo ou proteína.

[00298] Quando a cultura celular imortalizada apropriada que secreta o anticorpo desejado for identificada, as células podem ser cultivadas ou in vitro ou mediante a produção in vivo através de fluido ascite. De interesse particular, são os anticorpos monoclonais que reconhecem o domínio catalítico ou sítio de clivagem de ativação (região) de uma sHASEGP.

[00299] Os anticorpos ou fragmentos podem também ser produzidos. As regiões que se ligam especificamente às regiões desejadas de receptor também podem ser produzidas no contexto de quimeras com múltiplas origens de espécie.

[00300] Os agentes que são analisados no método acima podem ser aleatoriamente selecionados ou racionalmente selecionados ou designados.

[00301] Os agentes podem ser, como exemplos, peptídeos, moléculas pequenas e carboidratos. Um técnico versado pode facilmente reconhecer que não existe nenhum limite como para a natureza estrutural dos agentes.

[00302] Os agentes de peptídeo podem ser preparados usando os métodos de síntese de peptídeo de fase sólida padrão (ou fase de solução) como é conhecido na técnica. Além disso, o DNA que codifica estes peptídeos pode ser sintetizado usando instrumentação de síntese de oligonucleotídeo comercialmente disponível e produzido recombinantemente usando sistemas de produção recombinante padrão. A produção usando síntese de peptídeo de fase sólida é necessária se os aminoácidos codificados sem o gene for incluídos.

I. MÉTODOS DE TRATAMENTO

[00303] As sHASEGPs identificadas pelos métodos inclusos são usados para o tratamento ou prevenção de acúmulos anormais de substratos de sHASEGP em um animal, particularmente um mamífero, incluindo um ser humano. Em uma modalidade, o método inclui a administração a um mamífero de uma quantidade eficaz de uma glicoproteína sHASEGP, pela qual a doença ou distúrbio é tratado ou prevenido.

[00304] Em uma outra modalidade, um inibidor de sHASEGP pode ser usado no tratamento de uma quantidade em excesso de atividade Hialuronidase neutra. O mamífero tratado pode ser um ser humano. Os inibidores aqui fornecidos são aqueles identificados pelos ensaios de triagem. Além disso, os anticorpos e ácidos nucléicos anti-sentidos ou RNA de filamento duplo (dsRNA), tal como RNAi, são contemplados. 1. Tratamento anti-sentido: Em uma modalidade específica, como descrito mais acima, a função de polipeptídeo da sHASEGP é reduzida ou inibida pelos ácidos nucléicos anti-sentido de polipeptídeo da sHASEGP, para tratar ou impedir atividade condroitinase excessiva. O uso terapêutico ou profilático de ácidos nucléicos de pelo menos seis nucleotídeos, geralmente até cerca de 150 nucleotídeos, que são anti-sentido a um gene ou cDNA que codifica o polipeptídeo de sHASEGP ou uma parte deste é fornecido. Um ácido nucléico "anti-sentido" de polipeptídeo da sHASEGP como aqui usado refere-se a um ácido nucléico capaz de hibridizar uma parte de um RNA de polipeptídeo de sHASEGP (geralmente mRNA) em virtude de alguma capacidade complementar da seqüência, e geralmente sob condições de severidade elevada. O ácido nucléico anti-sentido pode ser complementar a uma região de codificação e/ou não-codificação de um mRNA de polipeptídeo de sHASEGP. Tais ácidos nucléicos anti-sentido possuem utilidade como produtos terapêuticos que reduzem ou inibem a função do polipeptídeo de sHASEGP, e podem ser usados no tratamento ou prevenção de distúrbios como descrito supra.

[00305] Os ácidos nucléicos anti-sentido de polipeptídeo da sHASEGP são de pelo menos seis nucleotídeos e são geralmente oligonucle- otídeos (variando de 6 a cerca de 150 nucleotídeos incluindo de 6 a 50 nucle- otídeos). A molécula anti-sentido pode ser complementar a todo ou uma parte do domínio de Hialuronidase. Por exemplo, o oligonucleotídeo é de pelo menos 10 nucleotídeos, pelo menos 15 nucleotídeos, pelo menos 100 nucleotí- deos, ou pelo menos 125 nucleotídeos. Os nucleotídeos podem ser DNA ou RNA ou misturas quiméricas ou derivados ou versões modificadas destes, de filamento único ou filamento duplo. O oligonucleotídeo pode ser modificado na porção de base, porção de açúcar ou cadeia principal de fosfato. O oligonu- cleotídeo pode incluir outros grupos anexos tais como peptídeos, ou agentes que facilitam o transporte através da membrana celular

[00306] (ver, por exemplo, Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6553-6556 (1989); Lemaitre et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 648-652 (1987); Publicação PCT N° WO 88/09810, publicada em 15 de dezembro, 1988) ou barreira cerebral sangüínea (ver por exemplo, Publicação de PCT N° WO 89/10134, publicação em 25 de abril, 1988), agentes de clivagem disparados por hibridização (ver por exemplo, Krol et al., BioTechniques 6: 958-976 (1988)) ou agentes de intercalação (ver por exemplo, Zon. Pharm. Res. 5: 539-549 (1988)).

[00307] O ácido nucléico anti-sentido de polipeptídeo da sHASEGP geralmente é um oligonucleotídeo tipicamente DNA ou RNA de filamento único ou um análogo deste ou mistura deste. Por exemplo, o oligo- nucleotídeo inclui uma seqüência anti-sentido em uma porção de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de sHASEGP humano. O oligonucleo- tídeo pode ser modificado em qualquer posição em sua estrutura com substi- tuintes geralmente conhecidos na técnica.

[00308] O oligonucleotídeo anti-sentido de polipeptídeo da sHASEGP pode incluir pelo menos uma porção de base modificada que é selecionada do grupo incluindo, mas não limitado a eles, 5-fluorouracila, 5- bromouracila, 5-clorouracila, 5-iodouracila, hipoxantina, xantina, 4-acetilcito- sina, 5-(carboxihidroxilmetil) uracila, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5- carboximetilaminometiluracila, diidrouracila, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetil- guanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6- adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracila, 5-metoxiaminometil-2-tiou- racila, beta-D-manosilqueosina, 5-apos-metoxicarboximetiluracila, 5-metoxiu- racila, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), vibuto- xosina, pseudouracila, queosina 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracila, 2-tiouracila, 4-tiouracila, 5-metiluracila, metiléster de ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil- 5-oxiacético (v), 5-metil-2-tiouracila, 3-(3-amino-3-n-2-carboxipropil) uracila, (ACP3) w, e 2,6-diaminopurina.

[00309] Em uma outra modalidade, o oligonucleotídeo inclui pelo menos uma porção de açúcar modificada selecionada do grupo incluindo, mas não limitado a eles, arabinose 2-fluoroarabinose, xilulose e hexose. O oligo- nucleotídeo pode incluir pelo menos uma cadeia principal de fosfato modificado selecionada de um fosforotioato, um fosforoditioato, um fosforamidotio- ato, um fosforamidato, um fosfordiamidato, um metilfosfonato, um fosfotriéster de alquila, e um formacetal ou análogo deste.

[00310] O oligonucleotídeo pode ser oligonucleotídeo a-anomé- rico. Um oligonucleotídeo a-anomérico forma híbridos de filamento duplo específicos com RNA complementar em que os filamentos trabalham paralelos um ao outro (Gautier et al., Nucl. Acids Res. 15: 6625-6641 (1987)).

[00311] O oligonucleotídeo pode ser conjugado a uma outra molécula, tal como, mas não limitadas a, um peptídeo; agente de reticulação disparado por hibridização, agente de transporte ou um agente de clivagem disparado por hibridização. Os oligonucleotídeos podem ser sintetizados por mé-todos padrão conhecidos na técnica, por exemplo, mediante o uso de um sin- tetizador de DNA automatizado (tal como são comercialmente disponíveis da Biosearch, Applied Biosystems, etc.). Como exemplos, oligonucleotídeos de fosforotioato podem ser sintetizados pelo método de Stein et al., Nucl. Acids Res. 16: 3209 (1988)), oligonucleotídeos de metilfosfonato podem ser preparados mediante o uso de suportes poliméricos de vidro poroso controlados (Sarin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7448-7451 (1988)), etc. Em uma modalidade específica, o oligonucleotídeo anti-sentido de polipeptídeo da sHASEGP incluem RNA catalítico ou uma ribozima (ver, por exemplo, Publicação Internacional PCT WO 90/11364, publicado em 4 de outubro,1990; Sarver et al., Science 247: 1222-1225 (1990)). Em outra modalidade, o oligonu- cleotídeo é um 2'-0- metilribonucleotídeo (Inoue et al., Nucl. Acids Res. 15: 6131-6148 (1987)), ou um análogo de RNA-DNA quimérico Inoue et al., FEBS Lett. 215: 327-330 (1987)).

[00312] Alternativamente, o oligonucleotídeo pode ser RNA de filamento duplo (dsRNA) tal como RNAi.

[00313] Em uma modalidade alternativa, o ácido nucléico anti- sentido de polipeptídeo de sHASEGP é produzido intracelularmente mediante a transcrição de uma seqüência exógenosa.

[00314] Por exemplo, um vetor pode ser introduzido in vivo tal que é absorvido por uma célula, dentro da qual célula o vetor ou uma parte deste é transcrito, produzindo um ácido nucléico anti-sentido (RNA). Um tal vetor deve conter uma seqüência que codifica o ácido nucléico anti-sentido de polipeptídeo da sHASEGP. Um tal vetor pode permanecer epissomal ou se tornar cromossomicamente integrado, contanto que possa ser transcrito para produzir o RNA anti-sentido desejado. Tais vetores podem ser construídos por métodos de tecnologia de DNA recombinante padrão na técnica. Os vetores podem ser plasmídeos, virais ou outros conhecidos na técnica, usados para replicação e expressão nas células de mamífero. A expressão da seqüência que codifica o RNA anti-sentido de polipeptídeo da sHASEGP pode ser qualquer promotor conhecido na técnica para atuar em células de mamífero, in- cluíndo ser humano. Tais promotores podem ser induzíveis ou constitutivos. Tais promotores incluem, mas não são limitados a, a região promotora prematura SV40 (Bernoist e Chambon, Nature 290: 304-310 (1981), o promotor contido na repetição do terminal longo 3' do vírus de sarcoma de Rous (Yamamoto et al., Ce//22: 787-797 (1980), o promotor da timidina cinase de herpes (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1441-1445 (1981), as se- qüências reguladoras do gene metalotioneína (Brinster et al., Nature 296: 3942 (1982), etc.

[00315] Os ácidos nucléicos anti-sentidos incluem a seqüência complementar de pelo menos uma parte de um transcrito de RNA de um gene de polipeptídeo da sHASEGP, incluindo um gene de polipeptídeo da sHASEGP humano. A capacidade complementar absoluta não é requerida. A quantidade de ácido nucléico anti-sentido de polipeptídeo da sHASEGP que é eficaz no tratamento ou prevenção de doença neoplástica depende da natureza da doença, e pode ser determinada empiricamente por técnicas clínicas padrão.

[00316] Onde possível, é desejável determinar a citotoxicidade anti-sentido nas células in vitro, e depois em sistemas de modelo animal úteis antes do teste e uso em seres humanos.

[00317] 2. Interferência de RNA (RNAi) (ver, por exemplo, Chuang et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 4985) pode ser empregada para inibir a expressão de um gene que codifica uma sHASEGP. Os fragmentos de RNA de interferência (RNAi), particularmente (ds) RNAi de filamento duplo, podem ser usados para gerar perda de função de sHASEGP. Os métodos que se relacionam com o uso de RNAi para silenciar os genes nos orgânicos incluindo, mamíferos, C. elegans, Drosophila e plantas, e seres humanos, são conhecidos (ver, por exemplo, Fire et al. (1998) Nature 391: 806-811; Fire (1999) Trends Genet. 15: 358-363; Sharp (2001) Genes Dev. 15: 485-490; Hammond et al. (2001) Nature Rev, Genet. 2: 110-119; Tuschl (2001) Chem. Biochem. 2: 239-245; Hamilton et al. (1999) Science 286: 950952; Hammond et al. (2000) Nature 404: 293-296; Zamore et al. (2000) Cell 101: 25-33; Bernstein et al. (2001) Nature 409: 363-366; Elbashir et al. (2001) Genes Dev. 15: 188-200; Elbashir et al. (2001) Nature 411: 494-498; Pedido de Patente Internacional n° WO 01/29058; Pedido de Patente Internacional n° WO 99/32619).

[00318] Os constructos que expressam RNA de filamento duplo (dsRNA) são introduzidos em um hospedeiro, tal como um animal ou planta usando um vetor replicável que permanece epissômico ou se integra no ge- noma. Mediante a seleção das seqüências apropriadas, a expressão de dsRNA pode interferir com o acúmulo do mRNA endógeno que codifica uma sHASEGP. O RNAi também pode ser usado para inibir a expressão in vitro.

[00319] As regiões incluem pelo menos cerca de 21 (ou 21) nu- cleotídeos que são seletivos (isto é, únicos) com relação a sHASEGP são usadas para preparar o RNAi. Fragmentos menores de cerca de 21 nucleotí- deos podem ser transformdos diretamente (isto é, in vitro ou in vivo) nas células; as moléculas de RNAi dsRNA maiores são geralmente introduzidas usando vetores que as codificam. Moléculas de dsRNA são pelo menos cerca de 21 bp de extensão ou mais longo, tal como 50, 100, 150, 200 e mais longo. Métodos, reagentes e protocolos para a introdução de moléculas de ácido nu- cléico nas células in vitro e in vivo são conhecidos por aqueles versados na técnica.

[00320] 3. A terapia genética em uma modalidade exemplar, os ácidos nucléicos que incluem uma seqüência de nucleotídeos que codificam um polipeptídeo de sHASEGP ou domínios funcionais ou seus derivados, são administrados para promover função de polipeptídeo da sHASEGP, por meio da terapia genética. A terapia genética refere-se à terapia executada pela administração de um ácido nucléico a um indivíduo. Nesta modalidade, o ácido nucléico produz sua proteína codificada que media um efeito terapêutico mediante a promoção da função de polipeptídeo da sHASEGP. Qualquer um dos métodos para a terapia genética disponível na técnica pode ser usado (ver, Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 12: 488-505 (1993); Wu e Wu, Biotherapy 3: 87-95 (1991); Tolstoshev, An. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596 (1993); Mulligan, Science 260: 926-932 (1993); e Morgan e Anderson, An. Rev. Bio- chem. 62: 191-217 (1993); TIBTECH 11 5: 155-215 (1993). Por exemplo, uma composição terapêutica para a terapia genética inclui um ácido nucléico que codifica o polipeptídeo de sHASEGP que é parte de um vetor de expressão que expressa um polipeptídeo de sHASEGP ou domínio, fragmento ou proteína quimérica deste em um hospedeiro adequado. Em particular, um tal ácido nucléico possui um promotor operavelmente ligado à região de codificação de polipeptídeo da sHASEGP, o promotor sendo induzível ou constitutivo, e, opcionalmente, específico do tecido. Em uma outra modalidade particular, uma molécula de ácido nucléico é usada em que as seqüências de codificação de polipeptídeo da sHASEGP e qualquer outra seqüência desejada são flanqueadas por regiões que promovem a recombinação homóloga em um sítio desejado no genoma, assim fornecendo expressão intracromossômica do ácido nucléico da proteína de sHASEGP (Koller e Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8932-8935 (1989); Zijlstra et al., Nature 342: 435-438 (1989)).

[00321] A liberação do ácido nucléico em um paciente pode ser ou direta, em cujo caso o paciente é diretamente exposto ao ácido nucléico ou vetor que carrega o ácido nucléico, ou indireta, em cujo caso, as células são primeiro transformadas com o ácido nucléico in vitro, depois transplantadas para dentro do paciente. Estes dois métodos são conhecidos, respectivamente, como terapia genética in vivo ou ex vivo.

[00322] Em uma modalidade específica, o ácido nucléico é diretamente administrado in vivo, onde é expresso para produzir o produto codificado. Isto pode ser executado por qualquer um dos numerosos métodos conhecidos na técnica, por exemplo, mediante a construção como parte de um vetor de expressão de ácido nucléico apropriado e a administração de modo que se torne intracelular, por exemplo, mediante infecção usando um vetor retroviral defeituoso ou enfraquecido ou outro viral (ver a Patente U.S. número 4.980.286), ou por injeção direta do DNA nu, ou mediante o uso de bombardeamento de micropartículas (por exemplo, uma pistola genética; Biolistic, Dupont), ou revestimento com lipídeos ou receptores da superfície celular ou agentes de transfecção, encapsulação com lipossomas, micropartículas ou microcápsulas, ou mediante a administração na ligação a um peptídeo que é conhecido de entrar no núcleo, mediante a administração na ligação a um ligando sujeito a endocitose mediada pelo receptor (ver por exemplo, Wu e wu, J. Biol. Chem, 262: 4429-4432 (1987)) (que pode ser usada para direcionar os tipos celulares especificamente expressando os receptores), etc. Em outra modalidade, um complexo de ligando de ácido nucléico pode ser formado em que o ligando é um peptídeo viral fusogênico para romper os endos- somas, permitindo o ácido nucléico evitar a degradação lisossômica. Em mais uma outra modalidade, o ácido nucléico pode ser direcionado in vivo para absorção e expressão específica da célula, mediante o direcionamento de um receptor específico (ver, por exemplo, Publicações PCT WO 92/06180 datada em 16 de abril de 1992 (Wu et al.); WO 92/22635 datada em 23 de dezembro de 1992 (Wilson et al.); WO 92/20316 datada em 26 de novembro de 1992 (Findeis et al.); WO 93/14188 datada 22 de julho de 1993 (Clarke et al.), WO 93/20221 datada 14 de outubro de 1996 (Young)). Alternativamente, o ácido nucléico pode ser introduzido intracelularmente e incorporado dentro do DNA da célula do hospedeiro para expressão, por recombinação homóloga (Koller e Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8932-8935 (1989); Zijistra et al., Nature 342: 435-438 (1989)).

[00323] Em uma modalidade específica, um vetor viral que contém o ácido nucléico de polipeptídeo da sHASEGP é usado. Por exemplo, um vetor retroviral pode ser usado (ver Miller et al., Meth. Enzymol. 217: 581-599 (1993)). Estes vetores retrovirais foram modificados para anular as seqüên- cias retrovirais que não são necessárias para o acondicionamento do genoma viral e integração no DNA da célula hospedeira. O ácido nucléico de polipep- tídeo da sHASEGP a ser usado na terapia genética é clonado no vetor, que facilita a liberação do gene em um paciente. Mais detalhes a cerca dos vetores retrovirais podem ser observados em Boesen et al., Biotherapy 6: 291-302 (1994), que descreve o uso de um vetor retroviral para liberar o gene mdr1 nas células-tronco hematopoiéticas de modo a tornar as células-tronco mais resistentes à quimioterapia.

[00324] Outras referência que ilustram o uso de vetores retrovi- rais na terapia genética são: Clowes et al., J. Clin. Invest. 93: 644-651 (1994); Kiem et al., Blood 83: 1467-1473 (1994); Salmons e Gunzberg, Human Gene Therapy 4: 129-141 (1993); e Grossman e Wilson, Curr. Opin. In Genetics And Devel. 3: 110-114 (1993).

[00325] Os adenovírus são outros vetores virais que podem ser usados na terapia genética. Os adenovírus são veículos especialmente atrativos para a liberação de genes nos epitélios respiratórios. Os adenovírus naturalmente infectam os epitélios respiratórios onde eles causam uma doença suave. Outros alvos com relação a sistemas de liberação com base em ade- novírus são o fígado, o sistema nervoso central, células endoteliais e músculo. Os adenovírus possuem a vantagem de serem capazes de infectar as células não-divisíveis. Kozarsky e Wilson, Current Opinion in Genetics and Development 3: 499-503 (1993) apresentam uma revisão da terapia genética com base em adenovírus. Bout et al., Human Gene Therapy 5: 3-10 (1994) de-monstraram o uso de vetores de adenovírus para a transferência dos genes pra os epitélios respiratórios de macacos resos. Outros exemplos do uso de adenovírus na terapia genética podem ser observados em Rosenfeld et al., Science 252: 431-434 (1991); Rosenfeld et al., Cell 68: 143-155 (1992); e Mastrangeli et al., J. Clin. Invest. 91: 225-234 (1993).

[00326] Adenovírus associado (AAV) também foi proposto para o uso na terapia genética (Walsh et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204: 289300 (1993).

[00327] Um outro método para a terapia genética envolve a transferência de um gene para as células na cultura de tecido por tais métodos com eletroporação, lipofecção, transfecção mediada por fosfato de cálcio, ou infecção viral. Geralmente, o método de transferência inclui a transferência de um marcador selecionável para as células. As células são depois colocadas sob seleção para isolar aquelas células que têm se levantado e estão expressando o gene transferido. Estas células são depois liberadas a um paciente.

[00328] Nesta modalidade, o ácido nucléico é introduzido em uma célula antes da administração in vivo da célula recombinante resultante. Tal introdução pode ser realizada por qualquer método conhecido na técnica, incluindo, mas não limitado a eles, transfecção, eletroporação, microinjeção, infecção com um vetor viral ou bacteriófago contendo as seqüências de ácido nucléico, fusão celular, transferência genética mediada por cromossoma, transferência genética mediada por microcélula, fusão de esferoplasto, etc. Numerosas técnicas são conhecidas na técnica para a introdução dos genes exógenos nas células (ver, por exemplo, Loeffler e Behr, Meth. Enzymol. 217: 599-618 (1993); Cohen et al., Meth. Enzymol. 217: 618-644 (1993); Cline, Pharmac. Ther. 29: 69-92 (1985)) e podem ser usadas, contanto que as funções desenvolventes e fisiológicas das células recebedoras não sejam des-pedaçadas. A técnica deve fornecer a transferência estável do ácido nucléico para a célula, de modo que o ácido nucléico seja expressível pela célula e geralmente herdado e expressivo por sua descendência celular.

[00329] As células recombinantes resultantes podem ser liberadas a um paciente por vários métodos conhecidos na técnica. Em uma modalidade, as células epiteliais são injetadas, por exemplo, subcutaneamente. Em outra modalidade, as células da pele recombinantes podem ser aplicadas como um enxerto de pele no paciente. As células sangüíneas recombinantes (por exemplo, células-tronco ou progenitoras hematopoiéticas) podem ser administradas intravenosamente. A quantidade de células visionadas para uso depende do efeito desejado, estado do paciente, etc., e pode ser determinada por uma pessoa versada na técnica.

[00330] As células em que um ácido nucléico pode ser introduzido para os propósitos de terapia genética abrange qualquer tipo de célula disponível desejada, e incluem, mas não são limitados a, células epiteliais, células endoteliais, queratinócitos, fibroblastos, células musculares, hepatóci- tos; células sangüíneas tais como linfócitos T, linfócitos B, monócitos, macró- fagos, neutrófilos, eosinófilos, megacarócitos, granulócitos; várias células- tronco ou progenitoras, em particular células-tronco ou progenitoras hemato- poiéticas, por exemplo, tais como as células-tronco obtidas da medula óssea, sangue do cordão umbilical, sangue periférico, fígado fetal, e outras fontes destas.

[00331] Por exemplo, uma célula usada para a terapia genética é autóloga para o paciente. Em uma modalidade em que as células recombi- nantes são usadas na terapia genética, um ácido nucléico de polipeptídeo da sHASEGP é introduzido nas células tal que é expressível pelas células ou sua descendência, e as células recombinantes são depois administradas in vivo para efeito terapêutico. Em uma modalidade específica, as células-tronco e progenitoras são usadas. Qualquer célula-tronco e/ou progenitora que pode ser isolada e mantida in vivo pode potencialmente ser usada de acordo com esta modalidade.

[00332] Tais células-tronco incluem, mas não são limitados a elas, células-tronco hematopoiéticas (HSC), células-tronco de tecidos epiteliais tais como a pele e o revestimento do intestino, células do músculo cardíaco embriônico, células-tronco do fígado (Publicação PCT WO 94/08598, datada em 28 de abril de 1994), e células-tronco neurais (Stemple e Anderson, Cell 71: 973-985 (1992)).

[00333] As células-tronco epiteliais (ESC) ou ceratinócitos podem ser obtidas dos tecidos tais como a pele e o revestimento do intestino por procedimentos conhecidos (Rheinwald, Meth. Cell Bio. 21A: 229 (1980)). No tecido epitelial estratificado tal como a pele, renovação ocorre por mitose das células-tronco dentro da camada germinal, a camada mais próxima da lâmina basal. As células-tronco dentro do revestimento do intestino fornecem uma taxa de renovação rápida deste tecido. ESC ou ceratinócitos obtidos da pele ou revestimento do intestino de um paciente ou doador podem ser desenvolvidos em cultura tecidual (Rheinwald, Meth. Cell Bio. 21A: 229 (1980); Pit- telkow e Scott, Cano. Clinic Proc. 61: 771 (1986)). Se os ESC forem fornecidos por um doador, um método para a supressão da reatividade de hospedeiro versus enxerto (por exemplo, administração de irradiação, droga ou anticorpo para promover imunossupressão moderada) também pode ser usado.

[00334] Com respeito às células-tronco hematopoiéticas (HSC), qualquer técnica que fornece o isolamento, propagação e manutenção in vitro de HSC pode ser usada nesta modalidade. As técnicas pelas quais isto pode ser executado incluem (a) o isolamento e estabelecimento das culturas de HSC a partir de células da medula óssea isoladas do hospedeiro futuro, ou um doador, ou (b) o uso de culturas de HSC anteriormente estabelecidas a longo prazo que podem ser alergênicas ou xenogênicas.

[00335] As HSC não autólogas geralmente são usadas com um método de suprimir as reações imunes ao transplante do hospedeiro/paciente futuro. Em uma modalidade particular, as células da medula óssea humana podem ser obtidas da crista ilíaca posterior por aspiração de agulha (ver, por exemplo, Kodo et al., J. Clin. Invest. 73: 1377-1384 (1984)). Por exemplo, as HSC podem ser produzidas altamente enriquecidas ou na forma substancialmente pura. Este enriquecimento pode ser executado antes, durante ou após o cultivo a longo prazo, e pode ser feito por qualquer técnica conhecida na técnica. As culturas a longo prazo de células da medula óssea podem ser estabelecidas e mantidas mediante o uso, por exemplo, de técnicas de cultura celular Dexter modificadas (Dexter et al., J. Cell Physiol. 91: 335 (1977)) ou técnicas de cultura Witlock-Witte (Witlock and Witte, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 3608-3612 (1982)).

[00336] Em uma modalidade específica, o ácido nucléico a ser introduzido para os propósitos da terapia genética inclui um promotor que se pode induzir operavelmente ligado à região de codificação, tal que a expressão do ácido nucléico é controlável mediante o controle da presença ou au-sência do indutor apropriado de transcrição.

[00337] 3. Pró-drogas - Um método para o tratamento de tumores é fornecido. O método é praticado pela administração de um pró-droga que é clivada em um sítio específico por uma HASEGP para liberar uma droga atiao ou precursor que pode ser convertido na droga ativa in vivo. Após contato com uma célula que expressa a atividade sHASEGP, a pró-droga é convertida em uma droga ativa. A pró-droga pode ser um conjugado que contém o agente ativo, tal como uma droga antitumor, tal como um agente citotóxico, ou outro agente terapêutico (TA), ligado a um substrato para a sHASEGP direcionada, tal que o droga ou agente é inativo ou incapaz de entrar em uma célula, no conjugado, mas é ativado após clivagem. A pró-droga, por exemplo, pode conter uma molécula de sulfato de condroitina, tipicamente uma relativamente curta, menor do que cerca de 20 unidades de dissacarídeo, que é cataliticamente clivada pela sHASEGP direcionada. Os agentes citotóxicos, incluem, mas não são limitados a, agentes de alquilação, agentes antiprolife- rativos e agentes de ligação da tubulina. Outros incluem, drogas vinca, mito- micinas, bleomicinas e taxanos.

J. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E MODOS DE ADMINISTRAÇÃO. Componentes das composições.

[00338] São fornecidas aqui composições farmacêuticas contendo uma sHASEGP ativa. Tão também fornecidas combinações de compostos que modulam a atividade de um polipeptídeo de sHASEGP et al tratamento ou composto para tratamento de um distúrbio de hialuronidase, tal como um composto de anticorpo.

[00339] O polipeptídeo de sHASEGP e um segundo agente pode ser embalado como composições separadas para administração juntas ou seqüencialmente ou intermitentemente. Alternativamente, elas podem ser fornecidas como uma única composição para administração ou como duas composições para administração como uma única composição. As combinações podem ser embaladas como kits.

2. Formulações e Rotina de Administração

[00340] Os polipeptídeos de sHASEGP e domínio de hialuroni- dade humana solúvel deses aqui fornecidos podem ser formulados como composições farmacêuticas, tipicamente para administração de dosagem única. As concentrações dos polipeptídeos nas formulações são eficazes para liberação de uma quantidade, em administração, que é eficaz para o tratamento pretendido. Tipicamente, as composições são formuladas para administração de dosagem única. Para formular uma composição, a fração de peso de um polipeptídeo de sHASEGP, domínios de hialuronidase humana solúvel deste ou mistura destes é dissolvida, suspensa, dispersa ou det al modo misturada em um veículo selecionado em uma concentração eficaz tal que a condição tratada tal que a condição tratada é aliviada ou melhorada.

[00341] Carreadores e veículos farmacêuticos adequados para administração da sHASEGP ou domínios de hialuronidase humana solúvel destes fornecidos aqui incluem quaisquer tais carreadores conhecidos por aqueles versados na técnica serem adequados para o modo particular de ad-ministração.

[00342] Além disso, os polipeptídeos podem ser formulados como o único ingrediente farmaceuticamente ativo na composição ou podem ser combinados com outros ingredientes ativos. Suspensões lipossômicas, incluindo lipossomas alvejados por tecido, podem também ser adequadas como veículos farmaceuticamente aceitáveis. Estes podem ser preparados de acordo com métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, formulações de lipossoma podem ser preparadas como descrito na Patente U.S. n° 4.522.811.

[00343] A sHASEGP ativa ou domínio de hialuronidase humana solúvel deste é incluído no veículo farmaceuticamente aceitável em uma quantidade suficiente para exercer um efeito terapeuticamente útil na ausência de efeitos colaterais indesejáveis sobre o paciente tratado. A concentração terapeuticamente eficaz pode ser determinada empiricamente testando-se os polipeptídeos em sistemas in vitro e in vivo conhecidos tais como empregando-se os ensaios aqui fornecidos ou veja, por exemplo, Taliani et al. (1996) Anal. Biochem. 240: 60-67, Filocamo et al (1997) J. Virology 71: 1417-1427, Sudo et al. (1996) Antiviral Res. 32: 9-18, Buffard et al (1995) Virology 209: 52-59, Bianchi et al. (1996) Anal. Biochem. 237: 239-244, Hamatake et al. (1996) Intervirology 39:249-258, Steinkühler et al (1998) Biochem. 37:88998905, D'Souza et al. (1995) J. Gen. Virol. 76:1729-1736, Takeshita et al. (1997) Anal. Biochem. 247: 242-246; veja também, por exemplo, Shimizu et al (1994) J. Virol. 68: 8406-8408; Mizutani et al. (1996) J. Virol. 70: 7219-7223, Mizutani et al. (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun. 227: 822-826, Lu et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 93: 1412-1417, Hahm et al. (1996) Virology 226: 318-326, Ito et al. (1996) J. Gen. Virol. 77: 1043-1054, Mizutani et al. (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun. 212: 906-911, Cho et al. (1997) J. Virol. Meth. 65:201-207 e então extrapolada desta para dosagens para seres humanos.

[00344] Tipicamente uma dosagem terapeuticamente eficaz é contemplada. As quantidades administradas podem ser na ordem de 0,001 a 1 mg/ml, incluindo cerca de 0,005 a 0,05 mg/ml e cerca de 0,01 mg/ml, de volume de sangue. As formas de unidade de dosagem farmacêutica são preparadas para fornecer de cerca de 1 mg a cerca de 1000 mg, incluindo de cerca de 10 a cerca de 500 mg, e incluindo de cerca de 25 a 75 mg do ingrediente ativo essencial ou uma combinação de ingredientes essenciais por forma de unidade de dosagem. A dosagem precisa pode ser empiricamente determinada.

[00345] Em alguns casos, uma dose Unitária elevada de sHASEGP humana é preferível. Por exemplo, com administração intravenosa de sHASEGP, concentrações de sHASEGP de 500 a 100.000 Unidades por ml são preferíveis. As formulações liofilizadas de sHASEGP são também ideais para estocagem de grandes doses de Unidade de sHASEGP. Frascos lio- filizados de 200.000 Unidades de sHASEGP são contemplados para liberação intravenosa.

[00346] Doses de concentração elevada são também contempladas para a liberação de volumes pequenos de sHASEGP. A administração de 10 a 100ul de 5000 Unidades/ml de sHASEGP é contemplada para injeção na câmara anterior para dissolver substâncias viscoelásticas pré-administra- das durante cirurgias de implante de lente intra-ocular de catarata e fácica. Injeções de pequeno volume de doses de 50 a 200 U/ml são também contempladas para procedimentos intravítreos tais como o tratamento de hemorragia vítrea ou ou desprendimento vitro-retinal em retinopatia diabética.

[00347] O ingrediente ativo pode ser administrado de uma só vez, ou pode ser dividido em diversas pequenas doses a serem administradas em intervalos de tempo. Entende-se que a dosagem precisa e duração de tratamento é uma função da doença que está sendo tratada e pode ser deter-minada empiricamente empregando-se protocolos de teste conhecidos ou por extrapolação de dados de teste in vivo ou in vitro. Deve ser observado que concentrações e valores de dosagem podem também variar com a gravidade da condição a ser aliviada. Deve ser também entendido que para qualquer objetivo particular, regimes de dosagem específica devem ser ajustados em tempo prolongado de acordo com a necessidade individual e o diagnóstico professional da pessoa que está administrando ou supervisionando a administração das composições, e que as faixas de concentração aqui menciona-das são exemplares apenas e não se destinam a limitar o escopo ou uso das composições e combinações reivindicadas contendo-as.

[00348] Os derivados farmaceuticamente aceitáveis incluem ácidos, sais, ésteres, hidratos, solvatos e formas de pró-droga. O derivado é tipicamente selecionado tal que suas propriedades farmacocinéticas sejam superiores à sHASEGP neutra correspondente ou domínio de hialuronidase hu-mana solúvel deste.

[00349] Desse modo, as quantidades ou concentrações eficazes de um ou mis dos polipeptídeos inclusos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis destes são misturados com um veículo ou veículo farmacêutico adequado para administração sistêmica, tópica ou local para formar composições farmacêuticas. Os polipeptídeos de sHASEGP ou domínios de hialuro- nidase humana solúvel destes são incluídos em uma quantidade eficaz para melhorar ou tratar o distúrbio para qual o tratamento é contemplado. A concentração de polipeptídeo ativo na composição depende das taxas de absorção, inativação, excreção do polipeptídeo ativo, a escala de dosagem, a quantidade administrada, formulação particular bem como outros fatores conhecidos por aqueles versados na técnica.

[00350] Os agentes terapêuticos para uso nos métodos podem ser administrados por qualquer rotina conhecida por aqueles versados na técnica, tal como, porém não limitados a, topicalmente, intra-articularmente, in- tracisternalmente, intra-ocularmente, intraventricularmente, intratecalmente, intravenosamente, intramuscularmente, intraperitonealmente, intra-dermica- mente, intratraquealmente, bem como por qualquer combinação de quaisquer dois ou mais destes. As formulações pulmonares de pó seco podem ser consideradas também.

[00351] A rotina mais adequada para administração variará dependendo do uso proposto, tal como, por exemplo, uso como um agente de liberação para facilitar a liberação subcutânea de fluídos, uso para reduzir a pressão intra-ocular nos olhos de pacientes de glaucoma recebendo viscoe- lásticos ou uso como um "agente de dispersão" para realçar a atividade de quimioterapêuticos, e a localização de interesse, tal como um órgão interno particular, um crescimento de tumor, cavidade intra-ocular e a epiderme. Os modos de administração incluem, porém não estão limitados a, topicamente, localmente, intra-articularmente, intracisternalmente, intra-ocularmente, intra- ventricularmente, intratecalmente, intravenosamente, intramuscularmente, in- tratraquealmente, intraperitonealmente, intradermicamente, e por uma combinação de quaisquer dois ou mais destes. Por exemplo, para tratamento de vários cânceres, tais como carcinoma de célula escamosa, câncer de mama, câncer de bexiga urinária e câncer gastrointestinal, administração local, incluindo administração ao sítio do crescimento de tumor (por exemplo, intra- tecalmente, intraventricularmente, ou intracisternalmente) fornece a vantagem de que o agente terapêutico pode ser administrado em uma concentração elevada sem risco das complicações que podem acompanhar a administração sistêmica de um agente terapêutico.

[00352] Os veículos ou veículos farmacêuticos e cosméticos adequados para administração dos polipeptídeos de sHASEGP ou domínio de hialuronidase humana solúvel destes fornecidos aqui incluem quaisquer tais veículos conhecidos por aqueles versados na técnica serem adequados para o modo particular de administração. Além disso, os polipeptídeos podem ser formulados como o único ingrediente farmaceuticamente ativo na composição ou podem ser combinados com outros ingredientes ativos que não prejudicam a ação desejada, ou com materiais que suplementam a ação desejada conhecida por aqueles versados na técnica. Por exemplo, os polipeptí- deos de sHASEGP aqui fornecidos podem ser empregados como um agente de liberação ou "dispersão" em combinação com um segundo composto ativo, tal como um agente terapeuticamente eficaz, incluindo, porém não limitado a uma droga ou uma pró-droga, para facilitar a liberação de ou realçar a atividade do segundo ingrediente ativo. Em uma modalidade particular, um poli- peptídeo de sHASEGP ou um domínio de hialuronidase humana solúvel desta pode ser co-formulado com um agente anestésico, tal como Lignocaína, Bu- pivicaína ou uma mistura dos dois, e, opcionalmente, um agente hormonal, tal como epinefrina, para diminuir ou interromper a absorção de sangue durante cirurgia oftálmica. Um polipeptídeo de sHASEGP ou um domínio de hialuroni- dase humana solúvel deste pode também ser co-formulado com vários quimi- oterapêuticos, tais como uma toxina e um fator de necrose, para realçar a atividade do quimioterapêutico e/ou a acessibilidade dos tumores alvo à qui- mioterapêutica. O composto ativo é incluído no veículo em uma quantidade suficiente para exercer um efeito terapeuticamente útil na ausência de sérios efeitos tóxicos sobre o paciente tratado. A concentração eficaz pode ser determinada empiricamente testando-se os compostos empregando-se sistemas in vitro e in vivo, incluindo os modelos de animal aqui descritos.

[00353] Soluções ou suspensões empregadas para aplicação parenteral, intradérmica, subcutânea, ou tópica podem incluir quaisquer dos seguintes componentes: um diluente estéril, tal como água para injeção, solução salina, óleo fixo, polietileno glicol, glicerina, propileno glicol ou outro solvente sintético; agentes antimicrobianos, tal como álcool benzílico e metil parabeno; antioxidantes, tais como ácido ascórbico e bissulfito de sódio; agentes de quelação, tais como ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA); tampões, tais como acetatos, citratos e fosfatos; e agentes para o ajuste de tonicidade, incluindo, porém não limitados a cloreto de sódio, cloreto de cálcio, cloreto de magnésio, dextrose, glicerol ou ácido bórico. Preparações parenterais podem ser fechadas em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de doses únicas ou múltiplas feitos de material de vidro, plástico ou outro adequado.

[00354] Os polipeptídeos de sHASEGP ou domínios de hialuro- nidase humana solúvel destes podem ser suspensos em forma micronizada ou outra adequada ou podem ser derivatizados para produzir um produto ativo mais solúvel ou para produzir uma pró-droga. A forma da mistura resultante depende de diversos fatores, incluindo o modo pretendido de administração e a solubilidade do polipeptídeo no veículo ou veículo selecionado. A concentração eficaz é suficiente para melhorar a condição alvejada e pode ser empiricamente determinada empregando-se métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Para formular a composição, a fração de peso de polipeptí- deo é dissolvida, suspensa, dispersa, ou de tal modo misturada em um veículo selecionado em uma concentração eficaz tal que a condição alvejada seja mitigada ou melhorada.

[00355] Em casos em que os polipeptídeos de sHASEGP ou domínio de hialuronidase humana solúvel destes exibem solubilidade insuficiente, métodos para solubilizar polipeptídeos podem ser empregados. Tais métodos são conhecidos por aqueles versados na técnica, e incluem, porém não estão limitados a, empregando co-solventes, tais como dimetilsulfóxido (DMSO), empregando-se tensoativos, tais como TWEEN® Pluronic® F68; ou dissolução em bicarbonato de sódio aquoso. Derivados dos polipeptídeos, tais como pró-drogas dos polipeptídeos podem também ser empregados em formulação de composições farmacêuticas eficazes. Para indicações oftálmicas, as composições são formuladas em um veículo oftalmicamente aceitável. Para os usos oftálmicos inclusos, administração local, ou por administração tópica ou por injeção, é contemplada. Formulações de liberação com o tempo são também desejáveis. Tipicamente, as composições são formuladas para administração de dosagem única, de modo que uma dose única administra uma quantidade eficaz.

[00356] Em mistura ou adição do polipeptídeo com o veículo, a mistura resultante pode ser uma solução, suspensão, emulsão ou outra composição e pode ser formulada como uma mistura aquosa, um creme, géis, ungüentos, emulsões, soluções, elixires, loções, suspensões, tinturas, pastas, espumas, aerossóis, irrigações, sprays, supositórios, bandagens, ou qualquer outra formulação adequada para administração sistêmica, tópica ou local.

[00357] A forma da mistura resultante depende de um número de fatores, incluindo o modo pretendido de administração e a solubilidade do composto no veículo ou veículo selecionado. Se necessário, os sais farma- ceuticamente aceitáveis ou outros derivados dos compostos são preparados. Para administração interna local, tal como, administração intramuscular, parenteral ou intra-articular, os compostos são preferivelmente formulados como uma suspensão solução em um meio de base aquosa, tal como solução salina isotonicamente tamponada ou são combinados com um suporte biocompatí- vel ou bioadesivo destinado para administração interna.

[00358] O polipeptídeo de sHASEGP ou o domínio de hialuroni- dase humana solúvel deste é incluído no veículo farmaceuticamente aceitável em uma quantidade suficiente para exercer um efeito terapeuticamente útil na ausência de efeitos colaterais indesejáveis sobre o paciente tratado. Entende- se que o número e grau dos efeitos colaterais depende da condição para a qual os compostos são administrados. Por exemplo, certos efeitos colaterais tóxicos e indesejáveis são tolerados quando tratando-se doenças desafiadoras da vida que não seriam toleradas quando tratando-se distúrbios de menor conseqüência. Quantidades eficazes para uso terapêutico dependerão, de fato, da gravidade da doença e o peso e estado geral do paciente, bem como a rotina de administração. A administração local do agente terapêutico tipicamente requere uma menor dosagem do que qualquer modo de administração sistêmica, embora a concentração local do agente terapêutico possa, em alguns casos, ser maior seguindo a administração local do que pode ser obtida com segurança em administração sistêmica.

[00359] Visto que pacientes individuais podem apresentar uma ampla variação em gravidade de sintomas e cada agente terapêutico tem sua única característica terapêutica, está dentro da capacidade do técnico determinar a resposta de um paciente ao tratamento e variar as dosagens conse-quentemente. As dosagens empregadas in vitro podem fornecer orientação útil nas quantidades úteis para administração in situ da composição farmacêutica, e modelos de animais podem em alguns casos ser empregados para determinar dosagens eficazes para o tratamento de distúrbios particulares. Em geral, entretanto, para administração local, é contemplado que uma quantidade eficaz do agente terapêutico será uma quantidade dentro da faixa de cerca de 0,1 picogramas (pg) até cerca 1 ng por kg de peso corporal. Várias considerações em alcançar uma quantidade eficaz são conhecidas por aqueles versados na técnica e são descritas (veja, por exemplo, Goodman e Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8a edição, Pergamon Press, 1990; Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a edição, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990; and Mantyh et al, (Science, 278: 275-79, 1997) envolvendo a injeção intratecal de uma toxina de ligando específica neuronal, cada das quais é aqui incorporada por referência em sua totalidade).

[00360] As formulações dos polipeptídeos de sHASEGP ou domínios de hialuronidase humana solúvel destes para uso aqui incluem aquelas adequadas para administração oral, retal, tópica, inalacional, bucal (por exemplo, sublingual), parenteral (por exemplo, subcutânea, intramuscular, intradér- mica ou intravenosa), a administração transdérmica ou qualquer rotina. A rotina mais adequada em qualquer caso mencionado depende da natureza e gravidade da condição que está sendo tratada e da natureza do composto ativo particular que está sendo empregado. As formulações são fornecidas para administração a seres humanos e animais em formas de dosagem unitária, tal como comprimidos, cápsulas, pílulas, pós, grânulos, suspensões ou soluções parenterais estéreis, e suspensões ou soluções orais, e emulsões de óleo-água contendo quantidades adequadas dos polipeptídeos e/ou outros agentes ou derivados farmaceuticamene aceitáveis destes. Os polipeptídeos terapeuticamente ativos farmacêuticos e/ou outros agentes e derivados destes são tipicamente formulados e administrados em formas de dosagem unitária ou formas de dosagens múltiplas. A forma de dose unitária como aqui empregada refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas para paci-entes humanos e animais e embaladas individualmente como é conhecido na técnica.

[00361] As composições farmacêuticas são fornecidas para administração a seres humanos e animais em formas de dosagem unitária, tais como comprimidos, cápsulas, pílulas, pós, grânulos, suspensões ou soluções parenterais estéreis, e suspensões ou soluções orais, e emulsões de óleo- água contendo quantidades adequadas do polipeptídeo de sHASEGP ou domínio de hialuronidase humana solúvel desta e, opcionalmente, outro agente ou derivados farmaceuticamente aceitáveis deste. Os compostos farmaceuti- camente terapeuticamente ativos e derivados destes são tipicamente formu-lados e administrados em formas de dosagem unitária ou formas de dosagens múltiplas. Uma forma de dose unitária como aqui empregada refere-se à unidades fisicamente discretas adequadas para pacientes humanos e animais e individualmente embaladas como é conhecido na técnica. Cada dose unitária contém uma quantidade predeterminada do composto terapeuticamente ativo suficiente para produzir o efeito terapêutico desejado, em associação com o veículo, veículo ou diluente farmacêutico requerido. Exemplos de formas de dose unitária incluem, porém não estão limitados a, ampolas, seringas e com-primidos ou cápsulas individualmente embaladas. Por exemplo, uma formulação de pequeno volume contendo uma solução estabilizada com 1 a 5000 Unidades de sHASEGP em um pequeno volume, tal como 5 a 50 μl, pode ser pré-empacotada em uma seringa para uso, tal como após injeção viscoelás- tica. As formas de dose unitária podem ser administradas em frações ou múltiplos desta. Uma forma de dose múltipla é uma pluralidade de formas de dosagem unitária idênticas embaladas em um recipiente único a serem administradas em forma de dose unitária segregada. Exemplos de formas de doses múltiplas incluem frascos, garrafas de comprimidos ou cápsulas ou garrafas de quartilhos ou galões. Portanto, a forma de doses múltiplas é um múltiplo de doses unitárias que não são segregadas em embalagens.

[00362] A composição pode conter juntamente com o ingrediente ativo, tal como um polipeptídeo de sHASEGP: um diluente, tal como lactose, sacarose, fosfato de dicálcio, ou carboximetilcelulose; um lubrificante, tal como estearato de magnésio, estearato de cálcio e talco; e um aglutinante tal como amido, gomas naturais, tal como gelatina de goma acácia, glicose, melaços, polvinilpirrolidina, celuloses e derivados destes, povidona, crospovido- nas et al. tais aglutinantes conhecidos por aqueles versados na técnica. As composições líquidas farmaceuticamente administráveis podem, por exemplo, ser preparadas dissolvendo-se, dispersando-se, ou det al modo misturando-se um composto ativo como acima definido e adjuvantes farmacêuticos opcionais em um veículo, tal como, por exemplo, água, solução salina, dextrose aquosa, glicerol, glicóis, etanol, e similares, para desse modo formar uma solução ou suspensão. Se desejado, a composição farmacêutica a ser administrada pode conter quantidades menores de substâncias auxiliares não tóxicas tais como agentes umectantes, agenes emulsificantes, ou agentes de solubilização, agentes tamponantes de pH e similares, por exemplo, acetato, citrato de sódio, derivados de ciclodextrina, monolaurato de sorbitano, acetato de sódio de trietanolamina, oleato de trietanolamina, et al. tais agentes. Métodos de preparar tais formas de dosagem são conhecidos, ou serão evidentes, para aqueles versados nesta técnica (veja por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 15a Edição, 1975). A composição ou formulação a ser administrada contém uma quantidade do composto ativo em uma quantidade suficiente para aliviar os sintomas do paciente tratado. Por exemplo, uma formulação estabilizada padrão de sHASEGP ou um domínio de hialuronidase humana solúvel deste como aqui fornecido inclui 150 Unidades/ml da glicoproteína solúvel formulada em EDTA, NaCl e CaCl2. Adicionalmente, um agente antibacteriano ou agente antifúngico, incluindo, porém não limitado ao timerosal, pode estar presente na formulação. Outra formulação aqui fornecida é uma solução estabilizada ou forma liofilizada de sHASEGP ou um domínio de hialuronidase humana solúvel deste em EDTA, NaCl e CaCl2, contendo uma quantidade ativa eficaz da glicoproteína solúvel, tal como 150 Unidades/ml, com as adição de lactose, tal como 13 mg/ml. É também fornecida aqui um formulação contendo uma solução estabilizada ou forma liofilizada de sHASEGP ou um domínio de hia- luronidase humana solúvel deste em EDTA, NaCl e CaCl2 contendo uma quantidade ativa eficaz da glicoproteína solúvel, tal como 150 Unidades/ml, com a adição de lactose, tal como 13 mg/ml, e Albumina, Pluronic® F68, TWEEN® e/ou outro detergente. Outra formulação aqui fornecida, ou liofilizada ou como uma solução estabilizada, contém uma quantidade de efeito de sHASEGP ou um domínio de hialuronidase humana solúvel deste, tal como 1 a 300 Unidades/ml, em EDTA, NaCl e CaCl2.

[00363] As formas de dosagem ou composições contendo ingrediente ativo na faixa de 0,005% a 100% com o equilíbrio feito de veículo não- tóxico podem ser preparadas. Para administração oral, as composições farmacêuticas podem tomar a forma, por exemplo, de comprimidos ou cápsulas preparados por métodos convencionais com excipientes farmaceuticamente aceitáveis tais como agentes de ligação (por exemplo, amido de milho pré- gelatinizado, polivinil pirrolidona ou hidroxipropil metilcelulose); cargas (por exemplo, lactose, celulose microcristalina ou hidrogeno fosfato de cálcio); lubrificantes (por exemplo, estearato de magnésio, talco ou sílica); desintegran- tes (por exemplo, amido de batata ou glicolato de amido de sódio); ou agentes umectantes (por exemplo, lauril sulfato de de sódio). Os comprimidos podem ser revestidos por métodos bem-conhecidos na técnica.

[00364] As sHASEGPs ou um domínio de hialuronidase humana solúvel destas ou derivados farmaceuticamente aceitáveis podem ser preparados com veículos que protegem a glicoproteína solúvel contra a rápida eliminação do corpo, tal como as formulações de liberação com o tempo ou revestimentos. As composições podem incluir outros agentes farmaceutica- mente eficazes conhecidos na técnica geral a ser de valor no tratamento de uma ou mais das doenças ou condições médicas, incluindo, porém não limitadas a um agente quimioterapêutico, um agente analgésico, um agente anti- inflamatório, um agente antimicrobiano, um agente amebicida, um agente tri- comonocida, um agente anti-parkinson, um agente anti-malárico, um agente anticonvulsivo, um agente antidepressivo, um agente antiarrítmico, um agente antifúngico, um agente anti-hipertensivo, agente antipirético, um agente anti- parasita, um agente anti-histamina, um agente alfa-adrenérgico, um agente alfa bloqueador, um agente anestésico, um agente broncodilatador, um agente biocida, um agente bactericida, um agente bacteriostático, um agente bloqueador betadrenérgico, um agente bloqueador de canal de cálcio, um agente de droga cardiovascular, um agente contraceptivo, um agente descongestionante, um agente diurético, um agente depressivo, um agente diagnóstico, um agente eletrólito, um agente hipnótico, um agente de hormônio, um agente hiperglicêmico, um relaxante muscular, um agente de contração muscular, um agente oftálmico, um agente parassimpáticomimético, um agente energizante psíquico, agente oftálmico, um agente parasimpatomimético, um agente energizante psíquico, um agente sedativo, um agente simpaticomimé- tico, um agente tranquilizante, um agente urinário, um agente vaginal, um agente virucida, um agente de vitamina, um agente antiinflamatório não-este- roidal, um agente inibidor de enzima de conversão de angiotensina, um poli- peptídeo, uma proteína, um ácido nucléico, uma droga, uma pró-droga, uma molécula orgânica e um indutor do sono, para obter combinações desejadas de propriedades. Deve-se entender que tal terapia de combinação constitui um outro aspecto das composições e métodos de tratamento aqui fornecidos.

1. COMPOSIÇÕES PARA ADMINISTRAÇÃO ORAL

[00365] As formas de dosagem farmacêuticas orais são sólidas, gel ou líquidas. As formas de dosagem sólidas são comprimidos, cápsulas, grânulos, e pós de volume. Tipos de comprimidos orais incluem comprimidos e pastilhas mastigáveis, comprimidos, que podem ser revestidos entéricos, revestidos de açúcar ou revestidos de película. As cápsulas podem ser cápsulas de gelatina duras ou macias, enquanto os grânulos ou pós podem ser fornecidos em forma não-efervescente ou efervescente com a combinação det al. ingredientes conhecidos por aqueles versados na técnica.

[00366] As composições farmacêuticas contendo uma sHASEGP ou um domínio de hialuronidase humana solúvel desta podem ser em forma líquida, por exemplo, soluções, xaropes ou suspensões, ou podem ser apresentada como um produto de droga para reconstituição com água ou outro veículo adequado antes do uso. Tais preparações líquidas podem ser preparadas por métodos convencionais com aditivos farmaceuticamente aceitáveis tais como agentes de suspensão (por exemplo, xarope sorbitol, derivados de celulose ou gorduras comestíveis hidrogenadas); agentes emulsifican- tes (por exemplo, lecitina ou acácia); veículos não-aquosos (por exemplo, óleo de amêndoa, ésteres oleosos, ou óleos vegetais fracionados); e conservantes (por exemplo, metil or propil-p-hidroxibenzoatos ou ácido sórbico).

[00367] Em certas modalidades, as formulações são formas de dosagem sólida, preferivelmente cápsulas ou comprimidos. Os comprimidos, pílulas, cápsulas, trociscos e similares podem conter quaisquer dos seguintes ingredientes, ou compostos de uma natureza similar: um aglutinante; um dilu- ente; um agente de desintegração; um lubrificante; um deslizante; um agente adoçante; e um agente aromatizante.

[00368] Exemplos de aglutinantes incluem celulose microcrista- lina, goma de tragacanto, solução de glicose, mucilagem de acácia, solução de gelatina, sacarose e pasta de amido. Lubrificantes incluem talco, amido, estearato de magnésio ou cálcio, licopódio e ácido esteárico. Diluentes incluem, por exemplo, lactose, sacarose, amido, caulim, sal, manitol e fosfato de dicálcio. Os deslizantes incluem, porém não estão limitados ao dióxido de silício coloidal. Os agentes de desintegração incluem croscarmelose sódica, amido glicolato de amido de sódio, ácido algínico, amido de milho, amido de batata, bentonita, metilcelulose, ágar e carboximetilcelulose. Os agentes de coloração incluem, por exemplo, quaisquer das tintas FD e C solúveis em água certificadas aprovadas, misturas destas; e tintas FD e C insolúveis em água suspensas em hidrato de alumina. Agentes adoçantes incluem sacarose, lactose, manitol e agentes adoçantes artificiais tais como sacarina, e qualquer número de sabores secos por atomização. Agentes aromatizantes incluem sabores naturais extraídos de plantas tais como frutas e misturas sintéticas de compostos que produzem uma sensação agradável, tal como, porém não limitados à hortelã e salicilato de metila. Agentes umectantes incluem monoestearato de propileno glicol, monooleato de sorbitano, monolaurato de dietileno glicol e éter de laural de polioxietileno. Revestimentos eméticos incluem ácidos graxos, gorduras, ceras, goma-laca, goma-laca amoniada e fta- latos de acetato de celulose. Revestimentos de película incluem hidroxietilce- lulose, carboximetilcelulose sódica, polietileno glicol 4000 e ftalato de acetato de celulose.

[00369] Se a administração oral for desejada, a sHASEGP ou domínio de hialuronidase humana solúvel desta pode ser fornecido em uma composição que o protege do ambiente acídico do estômago. Por exemplo, a composição pode ser formulada em um revestimento entérico que mantém sua integridade no estômago e libera o composto ativo no intestino. A composição pode também ser formulada em combinação com um antiácido ou outro tal ingrediente.

[00370] Quando a forma unitária de dosagem é uma cápsula, ela pode conter, em adição ao material do tipo acima, um veículo líquido tal como um óleo graxo. Além disso, as formas unitárias de dosagem podem conter vários outros materiais que modificam a forma física da unidade de dosagem, por exemplo, revestimentos de açúcar et al. agentes entéricos. Os compostos podem também ser administrados como um componente de um elixir, suspensão, xarope, pastilha, polvilhos, goma de mastigação ou similares. Um xarope pode conter, em adição aos compostos ativos, sacarose como um agente adoçante e certos conservantes, tinturas e colorantes e aromatizantes.

[00371] A sHASEGP ou um domínio de hialuronidase humana solúvel desta pode também ser misturado com outros materiais ativos que não prejudicam a ação desejada, ou com materiais que suplementam a ação desejada, tais como antiácidos, bloqueadores de H2, e diuréticos. O ingrediente ativo é um composto ou derivado farmaceuticamente aceitável deste como aqui descrito. Concentrações mais elevadas, até cerca de 98% em peso do ingrediente ativo podem ser incluídas.

[00372] Veículos farmaceuticamente aceitáveis incluídos em comprimidos são agentes aglutinantes, lubrificantes, diluentes, desintegran- tes, agentes colorantes, agentes aromatizantes, e agentes umectantes. Os comprimidos revestidos por entérico, por causa do revestimento entérico, re-sistem à ação de ácido do estômago e dissolvem ou desintegram-se nos intestinos neutros ou alcalinos. Os comprimidos revestidos por açúcar são comprimidos prensados aos quais diferentes camadas de substâncias farmaceu- ticamente aceitáveis são aplicadas. Os comprimidos revestidos por película são comprimidos prensados que foram revestidos com um polímero ou outro revestimento adequado. Os comprimidos prensados múltiplos são comprimidos prensados feitos por mais do que um ciclo de compressão utilizando as substâncias farmaceuticamente aceitáveis previamente mencionadas. Agentes colorantes podem também ser empregados nas formas de dosagem acima. Os agentes aromatizantes e adoçantes são empregados em comprimidos prensados, revestidos por açúcar, comprimidos mastigáveis e prensados múltiplos. Agentes aromatizantes e adoçantes são especialmente úteis na formação de comprimidos mastigáveis e losangos.

[00373] As formas de dosagem oral líquida incluem soluções aquosas, emulsões, suspensões, soluções e/ou suspensões reconstituídas de grânulos não-efervescentes e preparações efervescentes reconstituídas de grânulos efervescentes. As soluções aquosas incluem, por exemplo, elixi-res e xaropes. Emulsões são ou óleo-em-água ou água-em-óleo.

[00374] Elixires são preparações hidroalcoólicas adoçadas, transparentes. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis empregados em elixires incluem solventes. Xaropes são soluções aquosas concentradas de um açúcar, por exemplo, sacarose, e podem conter um conservante. Uma emulsão é um sistema de duas fases no qual um líquido é disperso na forma de pequenos glóbulos através det al líquido. Veículos farmaceuticamente aceitáveis empregados em emulsões são agentes emulsificanes líquidos não-aquosos, e conservantes. Suspensões empregam agentes de suspensão farma- ceuticamente aceitáveis e conservantes. Substâncias farmaceuticamente aceitáveis empregadas em grânulos não efervescentes, a serem reconstituídas em uma forma de dosagem oral líquida, incluem agentes dilu- entes, adoçantes e umectantes. Substâncias farmaceuticamente aceitáveis empregadas em grânulos efervescentes, a serem reconstituídas em uma forma de dosagem oral líquida, incluem ácidos orgânicos e uma fonte de dióxido de carbono. Agentes colorantes e aromatizantes são empregados em todas as formas de dosagem acima.

[00375] Os solventes incluem glicerina, sorbitol, álcool etílico e xarope. Exemplos de conservantes incluem glicerina, metila e propilparabeno, ácido benzóico, benzoato de sódio e álcool. Exemplos de líquidos não-aquosos utilizados em emulsões incluem óleo mineral e óleo de semente de algodão. Exemplos de agentes emulsificantes incluem gelatina, acácia, traga- canto, bentonita, e tensoativos tais como monooleato de polioxietileno sorbi- tano. Agentes de suspensão incluem carboximetilcelulose, pectina, traga- canto, Veegum e acácia. Diluentes incluem lactose e sacarose. Agentes adoçantes incluem sacarose, xaropes, glicerina e agentes adoçantes artificiais tais como sacarina. Agentes umectantes incluem monoestearato de propileno glicol, monooleato de sorbitano, monolaurato de dietileno glicol e éter de lau- rila de polioxietileno. Aditivos orgânicos incluem ácido cítrico e tartárico. Fontes de dióxido de carbono incluem bicarbonato de sódio e carbonato de sódio. Agentes colorantes incluem quaisquer das tinturas FD e C solúveis em água certificadas aprovadas, e misturas destas. Agentes aromatizantes incluem sabores naturais extraídos de plantas tais como frutas, e misturas sintéticas de compostos que produzem uma sensação de sabor agradável.

[00376] Para a forma de dosagem sólida, a solução ou suspensão, por exemplo em carbonato de propileno, óleos vegetais ou triglicerídeos, e encapsulada em uma cápsula de gelatina. Tais soluções, e a preparação e encapsulação destas, são descritas nas Patentes U.S. nos 4.328.245, 4.409.239, and 4.410.545. Para uma forma de dosagem líquida, a solução, por exemplo, em um polietileno glicol, pode ser diluída com uma quantidade suficiente de um veículo líquido farmaceuticamente aceitável, por exemplo, água, a ser facilmente medida por administração.

[00377] Alternativamente, formulações orais líquidas ou semi- sólidas podem ser preparadas dissolvendo-se ou dispersando-se a sHASEGP ou um domínio de hialuronidade humana solúvel desta em óleos vegetais, glicóis, triglicerídeos, ésteres de propileno glicol (por exemplo, carbonato de propileno) et al. tais veículos, e encapsulando-se estas soluções ou suspensões em cascas de cápsula de gelatina dura ou macia. Outras formulações úteis incluem aquelas mencionadas nas Patentes U.S. nos 28.819 e 4.358.603.

[00378] Formulações adequadas para administração bucal (sublingual) incluem, por exemplo, losangos contendo a sHASEGP ou um domínio de hialuronidase humana solúvel deste em uma base aromatizada, usualmente sacarose e acácia ou tragacanto; e pastilhas contendo o composto em uma base inerte tal como gelatina e glicerina ou sacarose e acácia.

[00379] Em todas as modalidades, formulações de comprimidos e cápsulas podem ser revestidas como conhecido por aqueles versados na técnica a fim de modificar ou ou manter a dissolução do ingrediente ativo. Desse modo, por exemplo, elas podem ser revestidas com um revestimento entericamente digestível convencional, tal como fenilsalicilato, ceras e ftalato de acetato de celulose.

2. Injetáveis, Soluções e Emulsões

[00380] A administração parenteral da sHASEGP ou um domínio de hialuronidase humana solúvel desta, geralmente caracterizada por injeção, ou subcutaneamente, intramuscularmente ou intravenosamente é também contemplada aqui. Injetáveis podem ser preparados em formas convencionais, ou como suspensões ou soluções líquidas; formas sólidas adequadas para solução ou suspensão em líquido antes da injeção, ou como emulsões. Excipientes adequados são, por exemplo, água, solução salina, dextrose, gli- cerol ou etanol. Além disso, se desejado, as composições farmacêuticas a serem administradas podem também conter quantidades menores de substâncias auxiliares não-tóxicas tais como agentes umectantes ou emulsifican- tes, agentes tamponantes de pH, estabilizantes, realçadores de solubilidade, et al. tais agentes, tais como, por exemplo, acetato de sódio, monolaurato de sorbitan, oleato de trietanolamina e ciclodextrinas. Implante de um sistema de liberação lenta ou liberação prolongada, tal que um nível constante de dosagem é mantido (veja, por exemplo, a Patente U.S. n° 3.710.795) é também contemplado aqui. A percentagem da sHASEGP ou um domínio de hia- luronidase humana solúvel desta contido em tais composições parenterais é dependente da natureza específica deste, bem como a atividade do composto e a necessidade do paciente.

[00381] A administração parenteral das composições incluem administrações intravenosas, subcutâneas e intramusculares. Preparações para administração parenteral incluem soluções estéreis prontas para injeção, produtos solúveis secos estéreis, tais como pós liofilizados, prontas para serem combinadas com um solvente ou solução estéril imediatamente antes do uso, incluindo comprimidos hipodérmicos, suspensões estéreis prontas para injeção, produtos insolúveis secos estéreis prontos para serem combinados com um veículo imediatamente antes do uso e emulsões estéreis. As soluções podem ser ou aquosas ou não aquosas.

[00382] Se administrados intravenosamente, veículos adequados incluem solução salina fisiológica ou solução salina tamponada por fosfato (PBS), e soluções contendo agentes espessantes e solubilizantes, tais como glicose, polietileno glicol, e polipropileno glicol e misturas destes.

[00383] Veículos farmaceuticamente aceitáveis empregados em preparações parenterais incluem veículos aquosos, veículos não-aquosos, agentes antimicrobianos, agentes isotônicos, tampões, antioxidantes, anestésicos locais, agentes de suspensão e de dispersão, agentes emulsificantes, agentes seqüestrantes ou quelantes e outras substâncias farmaceuticamente aceitáveis.

[00384] Exemplos de veículos aquosos incluem Injeção de Cloreto de Sódio, Injeção Ringers, Injeção de Dextrose Isotônica, Injeção de Água Estéril, Injeção de Dextrose e Ringers Lactada. Veículos parenterais não- aquosos incluem óleos fixos de origem vegetal, óleo de semente de algodão, óleo de milho, óleo de gergelim e óleo de amendoim. Agentes antimicrobianos em concentrações bacteriostática ou fungistática dever ser adicionadas às preparações parenterais embaladas em recipientes de múltiplas doses que incluem fenóis ou cresóis, mercuriais, álcool benzílico, clorobutanol, ésteres de ácido metil e propil p-hidroxibenzóico, tiomersal, cloreto de benzalcônio e cloreto de benzetônio. Agentes isotônicos incluem cloreto de sódio e dextrose. Tampões incluem fosfato e citrato. Antioxidantes incluem bissulfato de sódio. Os anestésicos locais incluem cloridrato de procaína. Agentes de suspensão e dispersão incluem carboximetilcelulose de sódio, hidroxipropil metilcelulose e polivinilpirrolidona. Agentes emulsificantes incluem Polissorbato 80 (TWEEN® 80). Um agente seqüestrante ou quelante de íons de metal incluem EDTA. Veículos farmacêuticos também incluem álcool etílico, polietileno glicol e propileno glicol para veículos miscíveis em água e hidróxido de sódio, ácido clorídrico, ácido cítrico ou ácido lático para ajuste de pH .

[00385] A concentração do composto farmaceuticamente ativo é ajustada de modo que uma injeção forneça uma quantidade eficaz para produzir o efeito farmacológico desejado. A dose exata depende da idade, peso e condição do paciente ou animal como é conhecido na técnica.

[00386] As preparações parenterais de dose única são embaladas em uma ampola, um frasco ou uma seringa com uma agulha. Todas as preparações para administração parenteral devem ser estéreis, como é conhecido e praticado na técnica.

[00387] Ilustrativamente, infusão intravenosa ou infusão intra-arterial de uma solução aquosa estéril contendo um composto ativo é um modo eficaz de administração. Outra modalidade é uma suspensão ou solução oleosa ou aquosa estéril contendo um material ativo injetado quando necessário para produzir o efeito farmacológico desejado.

[00388] Injetáveis são designados para administração local e sistêmica. Tipicamente uma dosagem terapeuticamente eficaz é formulada para conter uma concentração de pelo menos cerca de 0,1% peso/peso até cerca de 90% peso/peso ou mais, preferivelmente mais do que 1% peso/peso do composto ativo para o(s) tecido(s) tratado(s). O ingrediente ativo, tal como uma sHASEGP ou um domínio de hialuronidase humana solúvel desta, pode ser administrado de uma só vez, ou pode ser dividido em diversas doses menores a serem administradas em intervalos de tempo. É entendido que a dosagem precisa e duração de tratamento é uma função do tecido que está sendo tratado e pode ser determinada empiricamente empregando-se os protocolos de teste conhecidos ou por extrapolação de dados de teste in vivo ou in vitro. Deve-se observar que as concentrações e valores de dosagem podem tamém variar com a idade do indivíduo tratado. Deve-se entender também que para qualquer paciente particular, regimes de dosagem específicos devem ser ajustados em tempo prolongado de acordo com a necessidade individual e o diagnóstico profissional da pessoa que está administrando ou supervisionando a administração das formulações, e que as faixas de concentração mencionadas aqui são exemplares apenas e não se destinam a limitar o escopo ou prática das formulações reivindicadas.

[00389] Os compostos aqui fornecidos podem ser formulados para administração parenteral por injeção, por exemplo, por injeção de bólus ou infusão contínua. Formulações para injeção podem ser apresentadas em forma de dosagem unitária, por exemplo, em ampolas ou em recipientes de múltiplas doses, com um conservante adicionado. As composições podem ser suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, e podem conter agentes formuladores tais como agentes de suspensão, estabilização, e/ou dispersão. Alternativamente, o ingrediente ativo pode ser em forma de pó para reconstituição com um veículo adequado, por exemplo, água livre de pirogênio estéril ou outros solventes, antes do uso. Por exemplo, são fornecidas aqui formulações parenterais contendo uma quantidade eficaz de sHASEGP ou um domínio de hialuronidase solúvel desta, tal como 500 a 500.000 Unidades, em uma solução estabilizada ou uma forma liofilizada .

[00390] O composto pode ser suspenso em forma micronizada ou outra adequada ou pode ser derivatizado para produzir um produto ativo mais solúvel ou para produzir uma pró-droga. A forma da mistura resultante depende de diveros fatores, incluindo o modo pretendido de administração e a solubilidade do composto no veículo ou veículo selecionado. A concentração eficaz é suficiente para melhorar os sintomas da condição e pode ser empiricamente determinada.

3. Pós Liofilizados

[00391] São também fornecidos aqui pós liofilizados contendo sHASEGP ou um domínio de hialuronidase humana solúvel desta, que podem ser reconstituídos para administração como soluções, emulsões e outras misturas. Estas formulações podem também ser reconstituídas e formuladas como sólidos ou géis.

[00392] O pó liofilizado, estéril, é preparado dissolvendo-se uma porção sólida de, ou misturando-se uma alíquota de uma solução contendo uma sHASEGP ou um domínio de hialuronidase humana solúvel desta em um solvente adequado. O solvente pode conter um excipiente que melhora a estabilidade ou outro componente farmacológico do pó ou solução reconstituída, preparada do pó. Excipientes que podem ser empregados incluem, porém não estão limitados a, dextrose, sorbitol, frutose, xarope de milho, xilitol, glicerina, glicose, sacarose, lactose ou outro agente adequado. O solvente pode conter um tampão, tal como citrato, fosfato de potássio ou sódio ou outro tal tampão conhecido por aqueles versados na técnica, tipicamente, em torno de pH neutro. A filtração estéril subseqüente da solução seguida por liofilização sob condições padrão conhecidas por aqueles versados na técnica fornece a formulação liofilizada. Geralmente, a solução resultante da filtração estéril é dividida em frascos para liofilização. Cada frasco pode conter uma dosagem única, tal como 10 a 1000 mg ou 100 a 500 mg, ou dosagens múltiplas do composto.

[00393] Em síntese, o pó liofilizado é preparado dissolvendo-se dextrose, sorbitol, frutose, xarope de milho, xilitol, glicerina, glicose, sacarose, lactose ou outro agente adequado, em torno de 1 a 20%, em um tampão adequado, tal como citrato, fosfato de potássio ou sódio ou outro tal tampão conhecido daqueles versados na técnica em torno de pH neutro. Em seguida, um sal selecionado, tal como, por exemplo, o sal de sódio da sHASEGP (cerca de 1 gm do sal por 10 a 100 gms da solução de tampão, tipicamente cerca de 1 gm/30 gms), é adicionado à mistura resultante acima da temperatura ambiente, tal como cerca de 30 a 35oC, e agitado até ele se dissolver. A mistura resultante édiluída adicionando-se mais tampão, para diminuir a concentração resultante do sal em torno de 10 a 50%, tipicamente em torno de 15 a 25%). A mistura resultante é filtrada estéril ou tratada para remover particulados e para assegurar a esterilidade, e dividido em frascos para liofilização. O pó liofilizado pode ser armazenado sob condições apropriadas, tal como em torno de 4°C e temperatura ambiente.

[00394] Reconstituição deste pó liofilizado com água para injeção fornece uma formulação para uso em administração parenteral. Para reconstituição, uma quantidade terapeuticamente eficaz do pó liofilizado contendo uma sHASEGP ou um domínio de hialuronidase humana solúvel desta é adicionado por mililitro de água estéril ou outro veículo adequado. A quantidade precisa depende do composto selecionado e pode ser empiricamente determinada por métodos conhecidos por aqueles versados na técnica.

4. Administração tópica

[00395] As misturas tópicas são preparadas como descrito para a administração local e sistêmica. A mistura resultante pode ser uma solução, suspensão, emulsões ou similares e são formuladas como cremes, géis, un- güentos, emulsões, soluções, elixires, loções, suspensões, tinturas, pastas, espumas, aerossóis, irrigações, sprays, supositórios, bandagens, emplastros dérmicos ou quaisquer outras formulações adequadas para administração tópica.

[00396] As composições de sHASEGP ou um domínio de hialu- ronidase humana solúvel desta ou derivados farmaceuticamente aceitáveis deste podem ser formulados como aerossóis para aplicação tópica, tal como inalação (veja, por exemplo, Patentes U.S. nos 4.044.126, 4.414.209, e 4.364.923, que descrevem aerossóis para liberação de um esteróide útil para tratamento de doenças inflamatórias, particularmente asma). Estas formulações para administração ao trato respiratório podem ser na forma de um aerossol ou solução para um nebulizador, ou como um pó microfino para insuflação, sozinho ou em combinação com um veículo inerte tal como lactose. Em um tal caso, as partículas da formulação tipicamente terão diâmetros menores do 50 mícrons, tal como menores do que 10 mícrons.

[00397] Para administração por inalação as composições para uso aqui podem ser liberadas na forma de uma apresentação de spray aerossol de embalagens pressurizadas ou um nebulizador, com o uso de um pro- pelente adequado, incluindo, porém não limitado a, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono et al. gases adequados. No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada fornecendo uma válvula para liberar uma quantidade medida. Cápsulas e cartuchos de, por exemplo, gelatina, para uso em um inalador ou insuflador podem ser formuladas contendo uma mistura de pó do composto e uma base de pó adequadas tal como lactose ou amido.

[00398] As composições podem ser formuladas para aplicação local ou tópica, tal como para aplicação tópica à pele e membranas mucosas, tal como no olho, na forma de géis, cremes, e loções e para aplicação ao olho ou para aplicação intracistérmica ou intra espinhal. A administração tópica é contemplada para liberação transdérmica e também para administração aos olhos ou mucosa, ou para terapias de inalação. As soluções nasais do composto ativo sozinho ou em combinação com outros excipientes farmaceutica- mente aceitáveis podem também ser administradas.

[00399] Por exemplo, formulações adequadas para aplicação tópica à pele ou ao olho geralmente são formuladas como um ungüento, creme, loção, pasta, gel, spray, aerossol e óleo. Veículos que podem ser empregados incluem vaselina, lanolina, polietileno glicóis, álcoois, e combinações de dois ou mais destes. As formulações tópicas podem também vantajosamente conter 0,05 a 15 por cento em peso de espessantes, incluindo, porém não limitados a hidroxipropilmetilcelulose, metilcelulose, polivinilpirrolidona, álcool poli- vinílico, poli(alquileno glicóis), poli/hidroxialquila, (met)acrilatos ou poli(met)acrilamidas. Uma formulação tópica é freqüentemente aplicada por instilação ou como um ungüento dentro do saco conjuntivo. Ela também pode ser empregada para irrigação ou lubrificação do olho, seios faciais, e meatos auditórios externos. As formulações tópicas no estado líquido podem estar também presente em uma matriz de polímero tridimensional hidrofílico na forma de uma faixa, lentes de contato, e similares do qual os componentes ativos são liberados. Ela pode também ser injetada na câmara do olho anterior et al. locais. Por exemplo, é fornecida aqui uma formulação para uso intra-ocular após injeção viscoelástica contendo uma solução estabilizada de uma quantidade eficaz de uma sHASEGP ou um domínio de hialuronidase humana solúvel desta, tal como 1 a 5000 Unidades da glicoproteína solúvel com 30 a 150.000 Unidades/mg de atividade específica, em um pequeno volume, tal como 5 a 50 μl.

[00400] Estas soluções, particularmente aquelas destinadas para uso oftálmico, podem ser formuladas como soluções isotônicas a 0,01% a 10%, pH de cerca de 5 a 7, com sais apropriados.

5. Composições para Outras Rotinas de Administração.

[00401] Outras rotinas de administração, tais como aplicação tópica, emplastros transdérmicos, e administração retal são também contempladas aqui.

[00402] Por exemplo, formas de dosagem farmacêuticas para administração retal são supositórios retais, cápsulas e comprimidos para efeito sistêmico. Supositórios retais que são empregados aqui significam corpos sólidos para inserção no reto que derretem ou amolecem em temperatura corporal liberando um ou mais ingredientes farmacologicamente ou terapeuti- camente ativos. As substâncias farmaceuticamente aceitáveis utilizadas em supositórios retais são bases ou veículos e agentes para elevar o ponto de fusão. Exemplos de bases incluem manteiga de cacau (óleo de teobroma), glicerina-gelatina, carbowax (polioxietileno glicol) e misturas apropriadas de mono-, di- e triglicerídeos de ácidos graxos. Combinações das várias bases podem ser empregadas. Agentes para elevar o ponto de fusão de supositórios incluem espermacete e cera. Supositórios retais podem ser preparados ou pelo método comprimido ou por moldagem. O peso típico de um supositório retal é em torno de 2 a 3 gm.

[00403] Comprimidos e cápsulas para administração retal são fabricados empregando-se a mesma substância farmaceuticamente aceitável e pelos mesmos métodos como para formulações para administração oral.

[00404] Formulações adequadas para administração transdér- mica podem ser apresentadas como emplastros discretos adaptados para permanecer em contato íntimo com a epiderme do receptor durante um período de tempo prolongado. Tais emplastros adequadamente contêm o composto ativo como uma solução aquosa opcionalmente tamponada, por exemplo, por 0,1 a 0,2 M de concentração com respeito ao composto ativo. Formulações adequadas para administração transdérmica podem também ser liberadas por iontoforese (veja por exemplo, Pharmaceutical Research 3 (6): 318 (1986)) e tipicamente tomam a forma de uma solução aquosa opcionalmente tamponada do composto ativo.

[00405] As composições farmacêuticas podem também ser administradas por métodos de liberação controlada e/ou dispositivos de liberação (veja por exemplo, nas Patentes U.S. nos 3.536.809, 3.598.123, 3.630.200, 3.845.770, 3.847.770, 3.916.899, 4.008.719, 4.687.610, 4.769.027; 5.059.595; 5.073.543; 5.120.548; 5.354.566, 5.591.767, 5.639.476, 5.674.533 e 5.733.566). Os compostos ativos ou derivados farma- ceuticamente aceitáveis podem ser preparados com veículos que protegem o composto contra eliminação rápida do corpo, tal como revestimentos ou formulações de liberação com o tempo.

[00406] Em uma modalidade das composições e métodos aqui fornecidos, o agente terapêutico é administrado localmente em um veículo de liberação lenta, por exemplo, encapsulado em um sistema de dispersão coloi- dal ou em cristais estabilizados de polímero. Os sistemas de dispersão coloi- dal úteis incluem nanocápsulas, microesferas, contas, e sistemas com base em lipídeo, incluindo emulsões de óleo-em-água, micelas, micelas mistas, e lipossomas. Por exemplo, o sistema de dispersão coloidal pode ser um lipos- soma ou microesfera. Os lipossomas são vesículas de membrana artificial que são úteis como veículos de liberação lenta quando injetadas ou implantadas. Alguns exemplos de conjugados de lipídeo-polímero e lipossomas são descritos na Patente U.S. n° 5.631.018, que são incorporados aqui por referência em sua totalidade. Outros exemplos de veículos de liberação lenta são matrizes de hidrogel biodegradáveis (Patente U.S. n° 5.041.292), conjugados de polímero dendrítico (Patente U.S. n° 5.714.166), e lipossomas multivesicula- res (Depofoam®’ Depotech, San Diego, CA) (Patentes U.S. nos 5.723.147 e 5.766.627). Um tipo de microesferas adequado para encapsular agentes terapêuticos para injeção local (por exemplo, em tecido subdérmico) são microes- feras de poli(D,L)lactídeo, como descrito em D. Fletcher, Anesth. Analg. 84:90-94, (1997). Por exemplo, uma formulação de liberação lenta contendo uma quantidade eficaz de sHASEGP ou um domínio de hialuronidase humana solúvel desta, tal como 1 a 5000 Unidades/ml, pode ser empregada para vários usos ou para tratar várias condições, incluindo, porém não-limitados a formulações cosméticas e tratamento de lesões da coluna espinhal.

[00407] Os níveis sangüíneos desejáveis podem ser mantidos por uma infusão contínua do agente ativo como verificado por níveis de plasma. Deve-se observar que o médico atendente saberá como e quando terminar, interromper ou ajustar a terapia à dosagem menor devido à toxicidade, ou disfunções da medula óssea, fígado ou rins. A contrário, o médico atendente saberá também como e quando ajustar o tratamento em níveis mais elevados se a resposta clínica não for adequada (impedindo os efeitos colaterais tóxicos).

[00408] A eficácia e/ou toxicidade do polipeptídeo de sHASEGP e/ou seu(s) inibidor(es), sozinhos ou em combinação com outros agentes, tal como agentes terapeuticamente eficazes, também podem ser avaliados pelos métodos conhecidos na técnica (veja, por exemplo, O & Apos; Reilly, Investigational New Drugs 15: 5-13 (1997)).

6. Artigos de fabricação

[00409] Os polipeptídeos de sHASEGP ou domínios de hialuro- nidase humana solúvel deste ou composições contendo quaisquer dos agentes precedentes podem ser embalados como artigos de fabricação contendo material de empacotamento, um composto ou derivado adequado deste aqui fornecido, que é eficaz para o tratamento de uma doença ou distúrbios contemplados aqui, dentro do material de empacotamento, e um rótulo que indica que o composto ou um derivado adequado deste é para tratar as doenças ou distúrbios contemplados aqui. O rótulo pode opcionalmente incluir os distúrbios para os quais a terapia é permitida.

[00410] Os artigos de fabricação aqui fornecidos contêm materiais de empacotamento. Os materiais de empacotamento para uso em empacotamento de produtos farmacêuticos são bem-conhecidos por aqueles versados na técnica (veja, por exemplo, as Patentes U.S. nos 5.323.907, 5.052.558 e 5.033.352). Exemplos de materiais de empacotamento farmacêuticos incluem, porém não estão limitados a, embalagens beistes, tubos, inaladores, bombas, sacos, frascos, recipientes, seringas, e qualquer material de empacotamento adequado para uma formulação selecionada e modo pretendido de administração e tratamento. Uma ampla disposição de formulações dos compostos e composições aqui fornecidos é contemplada, como sendo variedade de tratamentos para qualquer distúrbio em que a infecção de HCV está implicada como um mediador ou contribuidor para os sintomas ou causa.

[00411] Kits contendo as composições e/ou combinações com instruções para administração destas são também fornecidos aqui. O kit pode também incluir uma agulha ou seringa, tipicamente empacotada em forma estéril, para injetar o complexo, e/ou um chumaço de álcool empacotada. Instruções são opcionalmente incluídas para administração do agente ativo por um clínico ou pelo paciente. Por exemplo, é fornecido aqui um kit contendo uma seringa de pequeno volume com uma quantidade eficaz de sHASEGP ou um domínio de hialuronidase humana solúvel desta, tal como 1 a 5000 Unidades da glicoproteína solúvel, em um volume de 5 a 50 μl, opcionalmente contendo uma segunda seringa contendo um viscoelástico. É também fornecido aqui um kit contendo uma seringa de pequeno volume contendo uma quantidade eficaz de sHASEGP ou um domínio de hialuronidase humana solúvel desta, tal como 1 a 500 Unidades da glicoproteína, e a quantidade terapêutica de um segundo ingrediente ativo, tal como uma droga, uma pequena molécula, uma proteína ou um ácido nucléico.

K. MODELOS DE ANIMAIS

[00412] Os animais e modelos de animal transgênicos, tal como roedores, incluindo camundongos e ratos, vacas, frangos, porcos, cabras, ovelhas, macacos, incluindo gorilas, et al. primatas, são fornecidos aqui. Em particular, animais não-humanos transgênicos que contêm ácido nucléico he- terólogo codificando um polipeptídeo de sHASEGP ou um animal transgênico no qual a expressão do polipeptídeo foi alterada, tal como substituindo ou modificando a região promotora ou outra região reguladora do gene endógeno são fornecidos. Um tal animal pode ser produzido promovendo recombinação entre ácido nucléico endógeno e um gene de sHASEGP exógeno que pode ser superexpresso ou mal-expresso, tal como por expressão sob um forte promotor, por meio de evento de recombinação homólogo ou outro.

[00413] Os animais transgênicos podem ser produzidos introduzindo-se o ácido nucléico empregando-se qualquer método conhecido de liberação, incluindo, porém não limitado à microinjeção, lipofecção et al. modos de liberação de gene em uma célula de linhagem germinativa ou células somáticas, tais como uma célula-tronco embriônica. Tipicamente o ácido nu- cléico é introduzido em uma célula, tal como uma célula-tronco embriônica (ES), seguido injetando-se as células ES em um blastocisto, e implantando- se o blastocisto em uma mãe adotiva, que é seguido pelo nascimento de um animal transgênico. Geralmente a introdução de uma molécula de ácido nu- cléico heteróloga em um cromossoma do animal ocorre por um recombinação entre o ácido nucléico codificando sHASEGP heterólogo e ácido nucléico endógeno. O ácido nucléico heterólogo pode ser alvejado em um cromossoma específico. Em alguns casos, animais abatidos podem ser produzidos. Um tal animal pode ser inicialmente produzido promovendo-se recombinação homóloga entre um gene de polipeptídeo de sHASEGP em seu cromossoma e um gene de polipeptídeo de sHASEGP exógena que foi tornado biologicamente inativo (tipicamente por inserção de uma seqüência heteróloga, por exemplo, um gene de resistência antibiótica). Em uma modalidade, esta recombinação homóloga é realizada transformando-se células-tronco derivadas de embrião (ES) com um vetor contendo o gene de polipeptídeo de sHASEGP insercio- nalmente inativada, tal que a recombinação homóloga ocorra, seguido por injeção das células ES em um blastocisto, e implantando-se o blastocisto em uma mãe adotiva, seguido pelo nascimento do animal quimérico ("animal abatido") no qual o gene de polipeptídeo de sHASEGP foi inativado (veja Capec- chi, Science 244: 1288-1292 (1989)). O animal quimérico pode ser desenvolvido para produzir animais abatidos homozigotos, que podem então ser empregados para produzir animais abatidos adicionais. Animais abatidos incluem, porém não estão limitados a camundongos, hamsters, ovelhas, porcos, gado vacum, et al. mamíferos não-humanos. Por exemplo, um camundongo abatido é produzido. Os animais resultantes podem servir como modelos de doenças específicas, tais como cânceres, que exibem subexpressão de um polipeptídeo de sHASEGP. Tais animais abatidos podem ser empregados como modelos de animal de tais doenças, por exemplo, para analisar ou testar moléculas quanto à capacidade de tratar ou prevenir tais doenças ou distúrbios.

[00414] Outros tipos de animais transgênicos podem também ser produzidos, incluindo aqueles que superexpressam o polipeptídeo de sHASEGP. Tais animais incluem animais "knock-in" que são animais nos quais o gene normal é substituído por uma variante, tal como um mutante, uma forma superexpressa, ou outra forma. Por exemplo, um gene endógeno de uma espécie, tal como de um roedor, pode ser substituído pelo gene de outra espécie, tal como de um ser humano. Animais também podem ser produzidos por recombinação não-homóloga dentro det al. sítios em um cromossoma; incluindo animais que têm diversos eventos de integração.

[00415] Após a produção do animal transgênico de primeira geração, um animal quimérico pode ser desenvolvido para produzir animais adicionais com polipeptídeos de sHASEGP superexpressos ou mal-expressos. Tais animais incluem, porém não estão limitados a, camundongos, hamsters, ovelhas, porcos, gado vacum et al. animais não-humanos. Os animais resultantes podem servir como modelos de doenças específicas, tais como cânceres, que exibem superexpressão ou má-expressão de um polipeptídeo de sHASEGP. Tais animais podem ser empregados como modelos de animal de tais doenças, por exemplo, para analisar ou testar moléculas quanto à capacidade de tratar ou prevenir tais doenças ou distúrbios. Em uma modalidade específica, um camundongo com polipeptídeo de sHASEGP superexpresso ou mal-expresso é produzido.

[00416] Os seguintes exemplos são incluídos para propósitos ilustrativos apenas e não se destinam a limitar o escopo da invenção.

L. USOS TERAPÊUTICOS DE sHASEGP

[00417] As enzimas de hialuronidase de ocorrência natural de matadouros foram a fonte principal de preparações de enzima clínicas durante mais de quarenta anos. Os testículos Bovinos e Ovinos são a principal fonte deste material. As preparações de enzima clínicas entretanto são muito grosseiras, vendidas em preparações variando de 0,5 a 5% de pureza com base em atividades específicas conhecidas entre 30 a 100.000 Unidades/mg. Desse modo sua ausência de pureza combinada com sua origem de matadouro, as deixam tanto como imunogênicas quanto humanas e como fonte potencial de doença de Jacob Creutzfeld et al. patógenos bovino e ovino. As reações anafiláticas às preparações de hialuronidase bovina e ovina são sabidas ocorrerem.

[00418] A hialuronidade de gado vacum ou bacterialmente derivadas foram empregadas no tratamento de doenças associadas com excesso de ácido hialurônico e para realçar a circulação de fluídos fisiológicos e/ou agentes terapêuticos. Por exemplo, a hialuronidase bovina pode ser co-inje- tada com anestesia em blocos peribulbar, retrobulbar e de sub-Tenon para procedimentos cirúrgicos oftálmicos. Além disso, complicações cirúrgicas aumentadas ocorrem em sua ausência (Brown SM et al, J Cataract Refract Surg., setembro de 1999; 25(9): 1245-9.). A hialuronidase bovina é também empregada como um antídoto à necrose local de injeção paravenosa de substâncias necróticas tal como vinca alcalóides (Few, B.J. (1987) Amer. J. Ma- tern. Child Nurs. 12, 23-26). A hialuronidase de testículos bovinos é também útil para o tratamento de cistos de gânglio (Paul et al, J Hand Surg, abril de 1997; 22 (2): 219-21). A hialuronidase pode também ser empregada para facilitar a liberação subcutânea de fluídos em hipodermóclise (Berger EY, Am Geriatr Soc, março de 1984; 32(3):199-203). A hialuronidase tem sido também utilizada para reduzir a pressão intra-ocular nos olhos de pacientes de glaucoma e pacientes de catarata recebendo viscoelásticos (Patente U.S. n° 4.820.516 emitida em 11 de abril de 1989).

[00419] As hialuronidases de gado vacum ou bacterialmente derivadas têm sido também empregadas como um "agente de dispersão" para realçar a atividade de quimioterapêuticos e/ou a acessibilidade de tumores aos quimioterapêuticos (Schuller et al., 1991, Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 32:173, resumo n° 1034; Czejka et al., 1990, Pharmazie 45:H.9). A quimioterapia de combinação com hialuronidase é eficaz no tratamento de diversos cânceres incluindo câncer de bexiga urinária (Horn et al, 1985, J. Surg. Oncol. 28: 304-307), carcinoma de célula escamosa (Kohno et al, 94, J. Cancer Res. Oncol. 120:293-297), câncer de mama (Beckenlehner et al, 1992, J. Cancer Res. Oncol. 118: 591-596), e câncer gastrointestinal (Scheithauer et al, 1988, Anticancer Res. 8: 391-396). A hialuronidase é eficaz como o único agente terapêutico no tratamento de câncer do cérebro (gliomas) (Pedido de patente publicado PCT n° WO 88/02261, publicado em 7 de abril de 1988). A administração de hialuronidase também induz a sensibilidade de tumores do pâncreas, estômago, cólon, ovários e mama, resistentes à quimioterapia anteriormente (Baumgartner et al, 1988, Reg. Cancer Treat. 1:55-58; Zanker et al, 1986, Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 27:390). Infelizmente, os contami- nantes e a natureza não-humana de tal hialuronidases resultam em reações anafiláticas.

[00420] Além de seus efeitos anticânceres indiretos, a hialuroni- dase derivada de gado vacum tem efeitos anticarcinogênicos diretos. A hialu- ronidase impede o crescimento de tumores transplantados em camundongos (De Mayer et al., 1992, Int. J. Cancer 51:657-660) e inibe a formação de tumor sob exposição a carcinógenos (Pawlowski et al., 1979, Int. J. Cancer 23: 105109; Haberman et al., 1981, Proceedings of the 17th Annual Meeting of the American Societey of Clinical Oncology Washington, D. C., 22: 105, resumo no. 415).

[00421] Dado o valor da hialuronidase derivada de gado vacum como um terapêutico, particularmente em quimioterapia em conjunto com qui- mioterapêuticos convencionais ou como um quimioterapêutico em e de si próprio, há uma necessidade no campo de preparações substancialmente puras de hialuronidase de origem humana. Há também uma necessidade de métodos eficientes, de custo eficaz para a preparação de hialuronidase para fornecer quantidades comercialmente significantes da enzima. A presente invenção volta-se para esses problemas.

[00422] O ácido hialurônico é um componente essencial da matriz extracelular. O ácido hialurônico é encontrado no tecido conjuntivo dos mamíferos e é o principal constituinte dos vítreos dos olhos. No tecido conjuntivo, a água de hidratação associada com o ácido hialurônico cria espaço entre os tecidos, desse modo criando um ambiente conducente para o movimento e proliferação da célula . O ácido hialurônico desempenha uma função importante no fenômeno biológico associado com a motilidade da célula incluindo desenvolvimento rápido, regeneração, reparo, embriogênese, desenvolvimento embriológico, cicatrização de ferida, angiogênese e tumorigênese (Toole, 1991, Cell Biol. Extracell. Matrix, Hay (ed), Plenum Press, New York, 1384-1386; Bertrand et al., 1992, Int. J. Cancer 52:1-6; Knudson et al., 1993, FASEB J. 7: 1233-1241). Além disso, os níveis de ácido hialurônico se correlacionam com a agressividade do tumor (Ozello et al., 1960, Cancer Res. 20: 600-604; Takeuchi et al., 1976. Cancer Res. 36:2133-2139; Kimata et al., 1983, Cancer Res. 43:1347-1354).

[00423] Após a lesão da medula espinhal, as cicatrizes gliais são produzidas pelos astrócitos e contêm proteoglicanos de sulfato de condroitina (CSPGs). Os CSPGs desempenham uma função crucial na inibição do crescimento de axônio (Levine, 1994; Powell et al. 1997). Por exemplo, durante o desenvolvimento fetal, os CSPGs repelem os axônicos e inibem a adesão da célula neural. Os CSPG’s também desempenham uma importante função na formação de limites (Snow et al., 1990, 1992; Powel e Geller, 1999). Além disso, a expressão de CSPG aumenta após a lesão de SNC (Mckeon et al., 1991; Davies et al., 1997).

[00424] Os estudos indicam que os efeitos inibidores de CSPGs são principalmente devido à cadeia de açúcar de glicosaminoglicano (GAG) de sulfato de condroitina (CS) (Snow et al, 1990; Cole e McCable, 1991; Gei- sert e Bidanset, 1993). Isto é suportado pela descoberta que a administração de condroitinase bacteriana de fato promove a regeneração de axônico quando administrada intratecalmente. Entretanto, as experiências eletrofisio- lógicas determinaram que os axônicos CST regenerados estabeleceram conexões funcionais (Bradbury, et al. 2002). Além de seus efeitos inibidores diretos, os CSPGs puderam também interagir com as moléculas de adesão de célula ou fatores neurotróficos para influenciar o crescimento de neurito (Roberts et al., 1988; Ruoslahti e Yamaguchi, 1991; Milev et al., 1994). As hialuronidases de mamífero recombinante são desse modo úteis para reverter a inibição de CSPG’s nas cicatrizes gliais e para promover a regeneração de axônico após a lesão.

[00425] A quantidade de sHASEGP requerida para suficientemente degradar os CSPG’s na cicatriz glial variará. Em alguns casos a administração repetida de 10-500 Unidades de sHASEGP por liberação intratecal será requerida para remover os CSPG’s na cicatriz. Em outros casos, a liberação controlada da sHASEGP através do uso de uma formulação de liberação lenta pode ser preferida. Alternativamente, a administração de vetores de terapia de gene codificando sHASEGP pode ser eficaz para realçar a separação de CSPG’s.

[00426] As sHASEGPs podem também ser utilizadas para o tratamento de discos herniados em um processo conhecido como quimionucleó- lise. A condroitinase ABC, e os substratos similares de clivagem de enzima como sHASEGP podem induzir a redução da pressão intradiscal na espinha lombar. (Sasaki et al., 2001, Ishikawa et al., 1999). Existem três tipos de lesões do disco. Um disco protruso é um que está intacto porém inchado. Em um disco extrudado, o envoltório fibroso se rompeu e o NP escorreu, porém está ainda conectado ao disco. Em um disco seqüestrado, um fragmento do NP se solta do disco e fica livre no canal espinhal. A quimionucleólise é eficaz em discos extrudados e protruso, porém não em lesões de disco seqüestrado. Nos Estados Unidos, a quimionucleólise é aprovada somente para uso na espinha lombar (inferior). Em outros países, também tem sido empregada com sucesso para tratar hérnias cervicais (espinha superior). A quimionucleólise é desse modo uma alternativa conservativa para cirurgia de disco quando é preferível reduzir a pressão do disco.

[00427] A estrutura e composição exata da cadeia(s) de carboidrato em uma glicoproteína podem diretamente influenciar sua duração da vida do soro, uma vez que as células no fígado e sistema retículo-endotelial podem se ligar e internalizar a circulação das glicoproteínas com carboidratos específicos. Os hepatócitos têm receptores em suas superfícies que reconhecem as cadeias de oligossacarídeos com resíduos Gal terminais (isto é, na extremidade(s) externa(s) de glicanos relativa(s) ao polipeptídeo), os macrófagos contêm receptores para resíduos Man ou GlcNAc terminais, e os hepatócitos e linfócitos têm receptores para resíduos de fucose expostos. Ne-nhum receptor específico de ácido siálico foi constatado, portanto. Embora um pouco dependente da disposição espacial dos oligossacarídeos, como uma regra geral, quanto maior o número de resíduos de açúcar expostos reconhecidos pelos receptores de superfície de célula no fígado e sistema retículo- endotelial, mais rapidamente uma glicoproteína será limpada do soro. Por causa da ausência de receptores específicos de ácido siálico, portanto, os oligossacarídeos com todas ramificações terminadas, ou "cobertas", com ácido siálico não promoverão a separação da proteína a qual eles estão ligados.

[00428] A presença e natureza da(s) cadeia(s) de oligossacarí- deo em uma glicoproteína pode também afetar importantes propriedades bioquímicas além do seu reconhecimento pelos receptores específicos de açúcar nas células do fígado e retículo-endoteliais. A remoção do carboidrato de uma glicoproteína freqüentemente diminuirá sua solubilidade, e pode também aumentar sua susceptibilidade à degradação proteolítica por desestabilização do padrão flexível do polipeptídeo correto e/ou por desmascaramento dos sítios sensíveis a protease. Por razões similares, o estado de glicosilação de uma proteína pode afetar seu reconhecimento pelo sistema imune.

[00429] As sHASEGPs podem ser empregadas para remover o cúmulo de células ao redor de um ovo antes da criopreservação e outra técnica de fertilização in vitro tal como injeção de esperma intracitoplásmica (ICSI). A hialuronidase pode ser adicionada aos oócitos colhidos entre 10-200 U/ml em soluções de sal tamponadas. Os oócitos são separados dos cúmulos de células através da aspiração e lavados através de várias lavagens com meios desprovidos de hialuronidase. Os ovos podem então ser processados para técnicas de IVF ou criopreservação.

[00430] As sHASEGPs são também úteis para a penetração mais eficaz de agentes quimioterapêuticos em tumores sólidos. As sHASEGPs podem ser injetadas intratumoralmente com agentes anticâncer ou intravenosamente para cânceres disseminados ou difíceis de abranger tumores. O agente anticâncer pode ser um quimioterapêutico, um anticorpo, um peptídeo, ou um vetor de terapia de gene, vírus ou DNA. Adicionalmente, as sHASEGP’s podem ser empregadas para recrutar as células de tumor no agrupamento de ciclização para sensibilização nos tumores previamente qui- miorefratários que tenham adquirido resistência à droga multicultural (St Croix et al. Cancer Lett 11 de setembro de 1998; 131(1): 35-44). As sHASEGPs são também úteis para realçar a liberação de biológicos tal como anticorpos mo- noclonais, citocinas e outras drogas para tumores que acumulam os glicosa- minoglicanos. Muitos tumores deletam genes envolvidos com o catabolismo de glicosaminoglicanos tal que o acúmulo localizado possa impedir os agentes anti-neoplásticos e o sistema imune de alcançar a massa de tumor.

[00431] As sHASEGPs podem ser empregadas para aumentar a sensibilidade dos tumores que são resistentes à quimioterapia convencional. Em uma modalidade, a sHASEGP é administrada a um paciente tendo um tumor associado com um defeito LuCa-1 em uma quantidade eficaz para aumentar a difusão ao redor do sítio do tumor, (por exemplo, para aumentar a circulação dos fatores quimioterapêuticos (por exemplo, para facilitar a circulação e/ou concentrações de agentes quimioterapêuticos em e ao redor do sítio de tumor), inibir a motilidade da célula de tumor (por exemplo, por degradação de HA) e/ou reduzir o limiar da célula(s) de tumor de apoptose (isto é, levar a célula(s) de tumor para um estado de anoiquis), um estado que torna a(s) célula(s) de tumor mais susceptível(is) à ação dos agentes quimiotera- pêuticos ou outros agentes que possam facilitar a morte da célula, preferivelmente preferencialmente facilitar a morte de célula programada de células em anoiquis. Os agentes quimioterapêuticos como empregados aqui é pretendido abranger todas as moléculas, sintéticas (por exemplo, cisplatina) bem como de ocorrência natural (por exemplo, fator de necrose de tumor IF)), que facilite a inibição do crescimento da célula de tumor, e preferivelmente facilite, mais preferivelmente preferencialmente facilite a morte da célula de tumor.

[00432] De interesse particular é o uso de sHASEGP para o tratamento de cânceres metastáticos e não-metastáticos, particularmente cânceres metastáticos tendo a atividade de hialuronidase diminuída para não- detectável relativo às células não cancerosas (normais). A sHASEGP pode ser empregada como um agente quimioterapêutico (sozinha ou em combinação com outros quimioterapêuticos) no tratamento de qualquer de uma variedade de cânceres, particularmente tumores invasivos. Por exemplo, a sHASEGP pode ser empregada no tratamento de carcinoma microcelular do pulmão, carcinoma de células escamosas do pulmão, bem como cânceres da mama, ovários, cabeça e pescoço, ou qualquer outro câncer associado com os níveis depreciados de hialuronidase ou com um gene LuCa-1 defectivo (hpHAse) (por exemplo um gene LuCa-1 que não provê a subsistência da expressão de níveis adequados de hpHAse ou codifica um hpHAse defectivo que não provê a subsistência de um nível adequado de atividade de hialuro- nidase) ou outro defeito associado com o catabolismo de hialuronan diminuído. A sHASEGP é preferível para o tratamento de malignidades associadas com o catabolismo de HA deficiente quando ele não requer participação celu-lar para que a degradação ocorra.

[00433] A dosagem específica apropriada para a administração pode ser facilmente determinada por alguém versado na técnica de acordo com os fatores discutidos acima (observe, por exemplo, Harrison’s Principles of Internal Medicine, 11a Edição, 1987). Além disso, as estimativas para dosagens apropriadas em seres humanos podem ser extrapoladas de determinações do nível da atividade enzimática de sHASEGP in vitro e/ou dosagens eficazes em estudos com animais. Por exemplo, 70-300 TRU de hialuronidase é eficaz na redução da carga do tumor em um camundongo scid. Dada esta informação, as dosagens correspondentes no ser humano de 70 kg em média variariam de cerca de 250.000-1.200.000 TRU de hialuronidase. A quantidade de sHASEGP administrada a um paciente humano é geralmente na faixa de 1 TRU a 5.000.000 TRU de atividade enzimática, preferivelmente entre cerca de 1.000 TRU a 2.500.000 TRU, mais preferivelmente entre cerca de 100.000 TRU a 1.500.000 TRU, normalmente entre cerca de 250.000 TRU e 1.200.000 TRU, com cerca de 725.000 TRU representando as doses médias prescritas.

[00434] Em uma modalidade, uma sHASEGP é formulada em uma solução salina de 0,15 M contendo sHASEGP em uma concentração de cerca de 150.000 TRU/cm3. A formulação é então injetada intravenosamente em 15.000 TRU/kg de peso corporal do paciente. Alternativamente, a formu-lação da enzima pode também ser injetada subcutaneamente para permitir que a hialuronidase perfunda ao redor do sítio do tumor. Em uma modalidade preferida, a sHASEGP é injetada peritumoralmente ou dentro da massa do tumor. Em outra modalidade preferida, a sHASEGP é formulada como um li- possoma e é liberada por injeção ou intravenosamente ou no ou próximo ao sítio de células cancerosas associadas com um defeito no gene LuCa-1 (hpHAse). A injeção de sHASEGP intravenosamente resulta em sHASEGP no sítio do tumor. Além disso, a sHASEGP Supersialada é preferivelmente para administração parenteral pelo fato de que os ácidos siálicos terminais em sHASEGP impedem a separação da enzima de circulação pelo sistema reti- culoendotelial. As comparações de sHASEGP supersilada com hialuronidase ovina e bovina não-sialada revelam que os farmacocinéticos substancialmente mais favoráveis são obtidos.

Facilitação da Terapia do Gene

[00435] A eficácia da maioria dos veículos de liberação de gene in vivo não corresponde à eficácia constatada in vitro. Os glicosaminoglicanos podem impedir a transferência e difusão de DNA e vetores virais em muitos tipos de células. Os níveis de tal material de matriz extracelular podem impedir o processo consideravelmente. Dubensky et al. (Proc Natl Acad Sci USA de-zembro de 1984; 81 (23): 7529-33) demonstraram que a hialuronidase quando combinada com colagenase pôde facilitar a transdução de DNA in vivo. Tem sido demonstrado que o vírus adenoassociado ao adeno é também sensível à terapia de gene mediada por hialuronidase, Favre et al. (Gene Ther agosto de 2000; 7(16); 1417-20).

[00436] Foi determinado aqui que os canais de tamanho definido na matriz extracelular são abertos com sHASEGP. Esses poros não realçam a difusão de substâncias maiores do que cerca de 200-500 nm em diâmetro. Entretanto, as moléculas menores tal como os retrovírus, adenovírus, vírus adenoassociados e complexos de DNA são sensíveis à difusão mediada por sHASEGP.

[00437] Alternativamente, os vírus podem ser armados com o gene de sHASEGP para facilitar sua replicação e expansão em um tecido alvo, por exemplo. O tecido alvo pode ser um tecido canceroso por meio do qual o vírus é capaz de replicação seletiva no tumor. O vírus pode também ser um vírus não-lítico onde o vírus seletivamente se replica sob um promotor específico de tecido. Quando os vírus se replicam, a coexpressão de sHASEGP com genes virais facilitará a expansão do vírus in vivo.

[00438] Alternativamente, o ácido nucléico de interesse e uma sHASEGP, podem ser empregados simultaneamente ou consecutivamente ou a fim de serem desconcentrados por um tempo prolongado. Simultaneamente refere-se a uma co-administração. Neste caso, esses dois componentes essenciais podem ser misturados para formarem uma composição antes de serem administrados, ou podem ser administrados ao mesmo tempo com a célula ou com o organismo hospedeiro. É também possível administrá-los consecutivamente, isto é, um após o outro, independente de qual componente do produto de combinação de acordo com a invenção é administrado primeiro. Finalmente, é possível usar um modo de administração que seja desconcentrada por um tempo prolongado ou que seja intermitente e que pare e reinicie em intervalos que possam ou não possam ser regulares. É mostrado que as rotinas e sítios de administração dos dois componentes podem ser diferentes. De acordo com uma modalidade particularmente preferida, a sHASEGP é administrada antes do ácido nucléico, com a rotina de administração dos dois componentes preferivelmente sendo similar. O intervalo de tempo entre as injeções não é crítico e pode ser definido pela pessoa versada. É possível recomendar um intervalo de 10 minutos a 72 horas, vantajosamente de 30 minutos a 48 horas, preferivelmente de 1 a 24 horas e, muito preferivelmente, de 1 a 6 horas.

[00439] Além disso, o produto de combinação de acordo com a invenção pode também ser combinado com uma ou mais moléculas que é/são pretendidas para melhorar a administração do ácido nucléico. As moléculas podem ser moléculas que têm um efeito protetor no ácido nucléico (proteção com respeito à degradação na célula), que melhora sua penetração ou sua expressão na célula hospedeira (peptídeo fusogênico, sinal de localização nuclear, etc), que possibilita um tipo de célula particular ser alvejado (ligando ou anticorpo que reconhece uma proteína de superfície de célula, etc), ou que prolonga o efeito terapêutico (agente imunossupressivo, etc). O produto de combinação pode também ser combinado com agentes que facilitam a trans- fecção (proteínas, etc.).

[00440] O produto de combinação de acordo com a invenção pode ser preparado com vista à administração local ou parenteral ou à administração pela rotina digestiva. As rotinas que podem em particular ser mencionadas são rotinas intragástricas, subcutâneas, intracardíacas, intravenosas, intraperitoneais, intrasinovial, intratumor, intrapulmonar, intranasal e in- tratraqueal, e, muito particularmente, a rotina intramuscular. A administração pode ser efetuada através de qualquer técnica da técnica (injeção, rotina oral, aerossol, instilação, etc.), como uma dose única ou como uma dose que seja repetida uma vez ou várias vezes após um intervalo de tempo particular. A rotina de administração pode ser ajustada para se adaptar ao gene de interesse a ser transferido e à doença a ser tratada. A formulação pode incluir veículos farmaceuticamente aceitáveis (excipientes, adjuvantes, etc.). A subs-tância, levando a desorganização da matriz extracelular, e o ácido nucléico de interesse são preferivelmente dissolvidos em um tampão que é adequado para uso farmacêutico e que pode ser hipertônico ou isotônico. Vários tampões podem ser considerados. Aqueles que podem ser mencionados através de ilustração são, uma solução salina fisiológica (0,9% de NaCl), uma solução salina não fisiológica (1,8% NaCl), uma solução de Hepes-Ringer, uma solução de Lactato-Ringer, um tampão que é com base em Tris-HCl (10 mM de Tris-HCl, pH 7,5 a 8, 1 mM de EDTA; 10 mM de Tris-HCl, pH 7,5 a 8, 1 mM de MgCl.sub.2), um tampão de fosfato (tampão de fosfato Krebs H.sub.2 O), uma solução de açúcar (glicose, sacarose, trealose, etc.), ou simplesmente água.

Hipodermóclise

[00441] A hipodermóclise, a infusão subcutânea de fluidos, é uma técnica de hidratação útil e fácil adequada para pacientes adultos de suavemente a moderadamente desidratados, especialmente os idosos. O método é considerado seguro e não propõe qualquer complicação séria. O efeito adverso mais freqüente é o edema subcutâneo suave que pode ser tratado por massagem local ou diuréticos sistêmicos. Aproximadamente 3 L podem ser dados em um período de 24 horas em dois sítios separados. Os sítios de infusão comuns são tórax, abdômen, coxa e membros superiores. A solução preferida é a solução salina normal, porém outras soluções, tal como solução salina meio-normal, glicose com solução salina ou 5 por cento de glicose, podem também ser empregadas. O cloreto de sódio pode ser adicionado à bolsa da solução se necessário. Adicionalmente, outras drogas podem ser liberadas através de rotinas similares. A sHASEGP humana pode ser adicionada para realçar a absorção do fluído e aumentar a taxa total de administração. A sHASEGP humana é preferível para hipodermóclise repetida sobre enzimas derivadas de matadouros pelo fato dele provavelmente não ser imunogênico como a enzima bovina é conhecida ser. Ele pode ser administrado em casa pelos membros da família ou por uma enfermeira; a técnica deve ser familiar a todos os médicos da família.

[00442] Em pacientes de ambulatório, os sítios da hipodermó- clise incluem o abdômen, tórax superior, acima do peito, em um espaço intercostal e a área escapular. Em pacientes acamados, os sítios preferidos são as coxas, o abdômen e o aspecto externo do membro superior. Após um a quatro dias, a agulha e tubagens devem ser trocadas, embora conjuntos de infusão tenham sido deixados no lugar durante períodos muito mais prolongados sem complicações. A administração de 500-mL de bólus durante uma ou duas horas três vezes por dia pode também ser determinada, com 150 U de sHASEGP dadas no sítio subcutâneo antes da primeira infusão matinal.

Facilitação de Injeções Terapêuticas

[00443] Muitas moléculas injetadas percutaneamente alcançam a circulação lentamente ou com eficiência muito baixa. Vários fatores regulam os farmacocinéticos e farmacodinâmicos de moléculas injetadas subcutaneamente (SC) ou intramuscularmente (IM). Geralmente, as moléculas maiores alcançam a circulação mais lentamente e menos eficientemente sem transporte ativo na circulação. A biodisponibilidade subcutânea é determinada calculando-se a relação da área sob as curvas para administração SC versus intravenosa (AUCSC/AUCintravenosa). Um segundo fator é a carga e afini-dade para moléculas de matriz que podem desempenhar uma função no sequestro de moléculas subcutaneamente. Se esses materiais são degradados localmente eles podem nunca alcançar seus alvos desejados e desse modo demonstram uma biodisponibilidade sistêmica total diminuída para os órgãos alvo.

[00444] As proteínas grandes são normalmente dadas intravenosamente de modo que o medicamento fique disponível diretamente na corrente sangüínea. Entretanto seria vantajoso se uma medicamento pudesse ser dado subcutaneamente, intramuscularmente ou intradermicamente uma vez que essas formas de administração são muito mais fáceis de serem manipuladas pelo paciente. Especialmente, se o medicamento tiver que ser tomado regularmente durante a vida inteira e se o tratamento for de início imediato, ainda quando o paciente for uma criança. Entretanto, uma medicamento com uma molécula lábil e muito grande, tal como o fator de coagulação VIII de 170 a 300 kDa, tem normalmente uma biodisponibilidade muito baixa se dado subcutaneamente, intramuscularmente ou intradermicamente, uma vez que a absorção não é suficiente e a degradação é severa.

[00445] Além da necessidade de aumentar a biodisponibilidade de muitos biológicos administrados subcutâneamente, os farmacocinéticos mais rápidos são também criticamente importantes em casos de medicina de emergência. O tempo requerido para alcançar o acesso intravenoso em muitos pacientes pode det al modo impedir uma droga de ação rápida quando administrada sistemicamente de ser utilizada. Em alguns casos a falha ao alcançar o acesso intravenoso é então seguida pela injeção subcutânea, que leva a demora adicional no alcance dos órgãos alvo. Desse modo, a biodis- ponibilidade mais rápida de drogas subcutâneas seria benéfica como uma primeira linha de tratamento exceto pelo risco do tempo requerido para alcançar o acesso intravenoso. Os exemplos de moléculas que podem ser liberadas subcutaneamente bem como intravenosamente incluem epinefrina, atropina, narcan, lignocaína, e dextrose.

[00446] Muitas moléculas injetadas percutaneamente alcançam a circulação vagarosamente ou com eficiência muito baixa. Vários fatores regulam os farmacocinéticos e farmacodinâmicos de moléculas injetadas subcutâneamente (SC) ou intramuscularmente (IM). Geralmente, as moléculas maiores alcançam a circulação mais lentamente e menos eficientemente sem transporte ativo na circulação. A biodisponibilidade subcutânea é determinada calculando-se a relação da área sob as curvas para administração SC versus intravenosa (AUCSC/AUCintravenosa). Um segundo fator é a carga e afinidade para as moléculas de matriz que podem desempenhar uma função no seqües- tro de moléculas subcutaneamente. Se esses materiais são degradados localmente eles podem nunca alcançar seus alvos desejados e desse modo demonstram uma biodisponibilidade sistêmica total diminuída para os órgãos alvos.

[00447] As proteínas grandes são normalmente dadas intravenosamente de modo que o medicamento fique disponível diretamente na corrente sangüínea. Entretanto seria vantajoso se uma medicamento pudesse ser dado subcutaneamente, intramuscularmente ou intradermicamente uma vez que essas formas de administração são muito mais fáceis de serem manipuladas pelo paciente. Especialmente, se o medicamento tiver que ser tomado regularmente durante a vida inteira e se o tratamento for de início imediato, ainda quando o paciente for uma criança. Entretanto, uma medicamento com uma molécula lábil e muito grande, tal como o fator de coagulação VIII de 170 a 300 kDa, tem normalmente uma biodisponibilidade muito baixa se dado subcutaneamente, intramuscularmente ou intradermicamente, uma vez que a absorção não é suficiente e a degradação é severa.

[00448] Além da necessidade de aumentar a biodisponibilidade de muitos biológicos administrados subcutaneamente, os farmacocinéticos mais rápidos são também criticamente importantes em casos de medicina de emergência. O tempo requerido para alcançar o acesso intravenoso em muitos pacientes pode det al modo impedir uma droga de ação rápida quando administrada sistemicamente de ser utilizada. Em alguns casos a falha ao alcançar o acesso intravenoso é então seguida pela injeção subcutânea, que leva a demora adicional no alcance dos órgãos alvo. Desse modo, a biodis- ponibilidade mais rápida de drogas subcutâneas seria benéfica como uma primeira linha de tratamento exceto pelo risco do tempo requerido para alcançar o acesso intravenoso. Os exemplos de moléculas que podem ser liberadas subcutaneamente bem como intravenosamente incluem epinefrina, atropina, narcan, lignocaína, e dextrose.

[00449] Um benefício adicional da invenção consiste na capacidade de liberar volumes maiores ou equivalentes de soluções SC ou IM sem a dor e morbidez associada com a pressão e volume da solução no sítio da injeção.

Hemorragia Vítrea

[00450] Em um esforço para minimizar o potencial para causar outros desligamentos ou rompimentos da retina durante o desempenho da vitrectomia, foi previamente proposto na Patente U.S. No 5.292.509 (Hageman), injetar certas enzimas glicosaminoglicanase livres de protease no corpo vítreo, para fazer com que o corpo vítreo se torne não acoplado ou "desinse- rido" da retina, antes da remoção do corpo vítreo. Tal desinserção ou não acoplamento do corpo vítreo é pretendido para minimizar a probabilidade de quet al. rompimentos ou desligamentos da retina ocorram uma vez que o corpo vítreo é removido. Os exemplos de enzimas de glicosaminoglicanase livres de protease específicas que podem ser empregadas para realizar esta desinserção vítrea pretendidamente incluem: condroitinase ABC, condroiti- nase AC, condroitinase B, condroitina 4-sulfatase, condroitina 6-sulfatase, hi- aluronidase e beta-glicuronidase.

[00451] Embora a enzima hialuronidase tenha sido conhecida por ser utilizável para várias aplicações oftálmicas, incluindo a aplicação adjunta de vitrectomia descrita na Patente U.S. No 5.292.509 (Hageman), os estudos publicados têm indicado que a enzima hialuronidase pode por si mesmo ser tóxica para a retina e/ou outras estruturas anatômicas do olho. Observe, The Safety of Intravitreal Hialuronidase; Gottleib, J. L.; Antoszyk, A. N., Hatch- ell, D. L. e Soloupis, P., Invest Ophtalmol Vis Sci 31:11, 2345-52 (1990). Entretanto, o uso de preparações de matadouros impuras de hialuronidase pode causar uveíte ou inflamação do olho. O uso de sHASEGP humana é desse modo preferível igualmente em sua potência aumentada, pureza e falta de origem animal que pode dar origem a reações imunogênicas e a neutralização mediada pelo anticorpo seguindo a administração repetida. Em outra modalidade, uma forma pegilada de uma sHASEGP pode ser injetada no olho. Uma tal sHASEGP pegilada não é limpa do vítreo de um tal modo rápido e mantém sua atividade no vítreo durante um período prolongado de tempo.

[00452] A toxicidade oftálmica de algumas preparações de hia- luronidase tem sido confirmada por outros investigadores, os quais têm proposto que tais preparações de hialuronidase sejam empregadas como um irritante tóxico para causar a neovascularização experimentalmente induzida do olho, em modelos de toxidade animal, (observe, An Experimental Model of Preretinal Neovascularization in the Rabbit; Antoszyk, A. N., Gottleib, J. L., Casey, R. C., Hatchell, D. L. e Machemer, R., Invest Ophthalmol Vis Sc 32:1, 46-51 (1991). O uso de uma sHASEGP altamente purificada destituída de contaminantes com base em mercúrio e bacterialmente derivados ou derivados de gado vacum é preferível para procedimentos intra-oculares. Entretanto, uma sHASEGP humana é preferível em preparações derivadas de matadouro em ambas falta de pureza de patógenos bovinos e risco reduzido de imunogenicidade. Mais preferivelmente, uma sHASEGP pegilada é considerada.

[00453] Um método enzimático empregando uma sHASEGP humana é desse modo fornecido para tratar distúrbios oftálmicos do olho de mamífero. Em uma modalidade da invenção, a referida sHASEGP é PEGilada para prolongar sua residência no vítreo e prevenir a absorção localizada. A prevenção da neovascularização, e a taxa aumentada de separação do vítreo de materiais tóxicos a retina, são concluídos administrando-se uma quantidade de hialuronidase eficaz para liquefazer o humor vítreo do olho tratado sem causar dano tóxico ao olho. A liquefação do humor vítreo aumenta a taxa de permuta de líquido da câmara vitral. Este aumento na permuta remove aqueles materiais e condições cuja presença causa danos oftalmológicos e retinais.

Uso Cosmético de sHASEGP

[00454] Sabe-se que a hialuronidase tem o efeito de despolime- rizar as cadeias de mucopolissacarídeo longas da substância fundamental, responsável pela retenção de água limite e da lentidão, por compressão capilar, da difusão de líquidos orgânicos, que eliminam as excreções metabólicas. Tal retenção de água e excreções associada com o sobrecarregamento de gordura dos lipócitos, constitui o edema de "pele de porco" clássico ou edema de "casca de laranja". Esta despolimerização portanto cortará as cadeias longas de mucopolissacarídeos em cadeias mais curtas, por isso a eliminação da água limite, de excreções, restauração da circulação linfática e venosa e desaparecimento do edema local.

[00455] O uso de sHASEGP através da administração subcutânea é desse modo preferido para a remoção de glicosaminoglicanos envolvidos no acúmulo da então chamada celulite e para promover o fluxo linfático. A sHASEGP humana é preferida para o tratamento de celulite pelo fato de ser capaz de remover os referidos glicosaminoglicanos sem os componentes inflamatórios das proteínas derivadas de matadouros e é de alta pureza e não é provável ser imunogênica. A sHASEGP pode ser administrada através de injeções subcutâneas repetidas, através de liberação transdérmica na forma de ungüentos ou cremes ou através do uso de formulações de liberação lenta injetáveis para promover a degradação contínua de glicosaminoglicanos e impedir seu retorno.

Transplantação de Órgãos

[00456] O hialuronan tem vários efeitos biológicos, que estão em parte relacionados com seu tamanho molecular (West, D. C., Kumar, S., Exp. Cell. Res. 183, 179-196, 1989). O conteúdo de hialuronan em um órgão aumenta em condições diferentes de inflamação daquele órgão. Desse modo, uma concentração aumentada de hialuronan tem sido mostrada no tecido de órgãos diferentes caracterizado pela lesão inflamatória-imunológica tal como alveolite (Nettelbalt et al., Am Rev Resp Dis 1989; 139: 759-762) e infarto mi- ocárdico (Waldenstrom et al., J Clin Invest 1991; 88(5): 1622-1628). Outros exemplos são a rejeição do aloenxerto após um transplante renal (Ha’llgren et al., J. Exp Méd 1990a; 171:2063-2076; Wells et al., Transplantation 1990; 50: 240-243), do intestino delgado (Wallander et al., Transplant Int. 1993; 6: 133137) ou cardíaco (Hallgren et al., J. Clin Invest 1990b; 85: 668-673); ou uma inflamação miocárdica de origem viral (Waldenstrdm et al., Eur J Clin Invest 1993; 23: 277-282).

[00457] A ocorrência de edemas intersticiais com relação ao enxerto de um órgão constitui um grave problema no campo de cirurgia de transplante. Tanto quanto 25% dos enxertos, incharão a um tal grau que a função temporariamente será perdida. Entretanto, em 2-3% dos casos, o inchaço causa o rompimento do rim, resultando em uma hemorragia massiva.

[00458] A sHASEGP pode ser empregada para degradar os gli- cosaminoglicanos acumulados em um transplante de órgão. A remoção de tais glicosaminoglicanos promove a remoção de água do enxerto e desse modo da função do órgão. A dose variando de 500-10.000 Unidades/kg pode ser administrada para reduzir a pressão intersticial como tal.

Acúmulos Patológicos de Glicosaminoglicanos no Cérebro.

[00459] Os níveis de hialuronan são elevados em várias condições patológicas cerebroespinhais. Os níveis de hialuronan cerebroespinhal são normalmente menores do que 200 ug/L em adultos (Laurent et al., Acta Neurol Scand setembro de 1996; 94(3): 194-206). Esses níveis podem elevar para mais do que 8.000 ug/L em doenças tal como meningite, estenose espinhal, lesão da cabeça e infarto cerebral. Desse modo, a administração de sHASEGP ou por liberação intratecal ou injeção sistêmica de sHASEGP su- persialado pode ser utilizada para degradar os níveis criticamente elevados de substrato.

[00460] A falta de linfáticos eficazes no cérebro pode também levar ao edema ameaçador a vida após o trauma da cabeça. O acúmulo de hialuronan é um resultado da síntese aumentada por HA sintase, e degradação diminuída. O acúmulo de hialuronan serve para propósitos de aumentar o conteúdo de água no tecido danificado para facilitar o extravasamento do leucócito porém pode ser letal. A administração de sHASEGP humana a um paciente sofrendo de trauma da cabeça pode desse modo remover o acúmulo de hialuronan do tecido e a água associada com ele. A sHASEGP humana pode ser administrada intratecalmente através de um desvio ou alternativamente, a sHASEGP Supersialada pode ser administrada intravenosamente para alcançar o tecido do cérebro.

[00461] O acompanhante e isquêmicos do cérebro como ocorrem em acidentes vasculares cerebrais, o conteúdo de hialuronan aumenta dramaticamente devido à expressão aumentada de HA sintase e catabolismo reduzido. A falha de bombas de íons e vazamento de plasma dentro do interstício resulta na retenção de fluído que se não apropriadamente limpo pelos linfáticos, resulta na necrose do tecido. Alguns grupos têm tentado prevenir o acúmulo de fluído intersticial após a reperfusão da isquemia bloqueando-se a permeabilidade vascular. Entretanto, uma vez que o fluído tenha extravasado, a prevenção da permeabilidade vascular pode prevenir a resolução do edema e condições exacerbadas.

[00462] A sHASEGP humana pode também ser empregada no tratamento de edema associado com os tumores cerebrais, particularmente aquele associado com a multiforma de glioblastoma. O edema associado com os tumores do cérebro resulta do acúmulo de hialuronan nas porções não cancerosas do cérebro adjacentes ao tumor. A administração de hialuronidase aos sítios de acúmulo de hialuronan (por exemplo, por injeção intravenosa ou através de um desvio) pode aliviar o edema associado com tais malignidades degradando-se o excesso de hialuronan nesses sítios. Desse modo, a hialu- ronidase é bem-sucedida no tratamento de tumores do cérebro não somente na redução da massa de tumor e inibição do crescimento de tumor e/ou me- tástase, porém também é útil no alívio do edema associado com a malignidade. A sHASEGP humana pode ser administrada para tratamento de edema de um modo similar àquele para administração de hialuronidase testicular para tratar edema (observe, por exemplo, Sa Earp Arq. Braz. Med. 44: 21720).

Tratamento do Acúmulo de Glicosaminoglicano em Doença Cardiovascular

[00463] Tem sido mostrado que a administração de hialuroni- dase em modelos de animais seguinte ao infarto miocárdico experimental pode reduzir o tamanho do infarto (Maclean, et al., Science 8 de outubro de 1976; 194(4261):199-200). O mecanismo proposto pelo qual a hialuronidase bovina reduz o tamanho do infarto em animais é reduzindo-se o acúmulo de hialuronan que ocorre após a reperfusão de isquemia. A redução do tamanho do infarto é acreditada ocorrer da drenagem do linfo aumentada e oxigenação de tecido aumentada e redução de conteúdo de água miocárdica. Ao mesmo tempo em que o tamanho do infarto reduzido pode ser obtido em modelos de animais, os benefícios não foram realizados em estudos clínicos maiores em seres humanos. A hialuronidase de teste bovino possui uma meia-vida de soro acentuadamente curta de aproximadamente 3 minutos em animais e homem Wolf, et al., J Pharmacol Exp Ther agosto de 1982; 222(2): 331-7. Esta meia- vida curta é devido aos resíduos de manose terminal que são facilmente reconhecidos pelos receptores seqüestrantes do sistema reticuloendotelial. Ao mesmo tempo em que os animais podem se beneficiar da hialuronidase, devido a um leito vascular menor, uma enzima com meia-vida aumentada é necessária. A sHASEGP supersialada possui farmacocinéticos mais favoráveis devido a sialação para que não haja nenhum receptor seqüestrante. A sHASEGP supersialada em doses variando de 100-200.000 Unidades/kg podem ser utilizadas para facilitar a resolução de hialuronan em excesso após a reperfusão da isquemia e para reduzir o tamanho do infarto.

[00464] A sHASEGP supersialada pode também ser útil para limitar as placas coronárias de arteriosclerose. Tais placas acumulam os glico- saminoglicanos e medeiam a adesão de célula espumosa e macrófago Kolo- dgie et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1 de outubro de 2002; 22(10): 16428. A administração de sHASEGP supersialada pode ser empregada para reduzir a formação de plaqueta. Como a administração repetida de hialuroni- dase é contemplada em doses de 100-100.000 U/kg, a necessidade de utilizar uma proteína recombinante humana com baixo risco de imunogenicidade e meia-vida aumentada resultará na redução superior das placas.

Tratamento da Necrose dos Tecidos Periféricos

[00465] A necrose do tecido ocorre em muitas doenças devido à insuficiência venosa. A falta de oxigenação suficiente é um dos principais obstáculos para o re-crescimento do tecido. Tem sido demonstrado que o tratamento de hialuronidase arterial significantemente melhora a descrição clínica em pacientes com doença oclusiva arterial periférica (Elder et al., Lancet (1980) 648-649). A sHASEGP pode ser injetada intra-arterialmente 3-5 vezes durante a semana em doses de 10-200.000 Unidades.

INTENSIFICAÇÃO DA ANESTESIA

[00466] Hialuronidase derivada de matadouro é geralmente empregada para bloqueio peribulbar na anestesia local antes da cirurgia oftálmica. A presença da enzima previne a necessidade quanto a bloqueios adicionais e acelera o tempo para o começo de acinesia (perda de movimento do olho). Bloqueios peribulbar e sub-Tenon’s são as aplicações mais comuns de hialuronidase para procedimentos oftálmicos. Visto que a descontinuação de Wydase®, relatos de diplopia e ptose aumentadas foram relatados com bloqueio peribulbar (Brown et al. J Cataract Refract Surg 1999; 25: 1245 - 9).

[00467] Com a descontinuação da Wyeth de Wydase®, material de hialuronidase derivado de testes em bovinos é agora fornecido por farmácias de manipulação. Entretanto, há várias preocupações em usar um produto estéril extemporaneamente composto.

[00468] http://www.ashp.org/shortage/hialuroni- dase.cfm?cfid= 11944667&CFToken=9426953 - refn°ref Preparações compostas não são produtos aprovados pela FDA. Como tal, a FDA não tem nenhum controle sobre a qualidade ou consistência do processo de fabricação.

[00469] SHASEGP de 10 - 500 Unidades pode ser misturada diretamente com 5ml de lidocaína a 2% (Xylocaine), 5 ml de bupivacaína a 0,5% (Marcaine) e opcionalmente com epinefrina 1:200.000. sHASEGP pode ser empregada para aumentar o começo da acinesia e remover a necessidade quanto a bloqueios adicionais. sHASEGP é da mesma forma ideal para aci- nesia para cirurgia estética em blefaroplastias e operações plásticas. sHASEGP podem da mesma forma ser utilizadas seguindo tais procedimentos cirúrgicos para difundir antiinflamatórios e reduzir a inchação do tecido.

[00470] SHASEGP pode ser misturada da mesma forma com uma solução de tamponamento tal como bicarbonato para prevenir o desconforto durante o procedimento de injeção. SHASEGP pode ser misturada da mesma forma com anestesia para lacerações tanto para reduzir o volume total do material requerido para injeção quanto para reduzir dor da inchação do tecido.

REDUÇÃO DA PRESSÃO INTRA-OCULAR

[00471] Um efeito colateral comum que ocorre em pacientes com catarata pós-operatórios é um aumento significante, precoce e ocasionalmente prolongado na pressão intra-ocular. Uma tal condição é às vezes séria, especialmente em pacientes com mudanças de disco ótico glaucoma- tosas. Embora o aumento de pressão tende a ser mais severo quando os agentes viscoelásticos tal como ácido hialurônico são injetados no olho durante cirurgia, a pressão intra-ocular pode tornar-se elevada pós-operatoria- mente mesmo quando tais agentes não são utilizados. Além disso, um tal aumento de pressão pode ocorre até mesmo quando nenhuma droga é usado durante o procedimento cirúrgico. Em alguns casos, é vantajoso deixar um agente viscoelástico no olho, que freqüentemente necessita administrar aos pacientes doses grandes de inibidores de anidrase carbônicos. Estes inibidores diminuem a pressão intra-ocular diminuindo-se a formação de humor aquoso, um fluido que normalmente é segregado no olho, pelo corpo ciliar. Métodos atuais para aliviar aumentos de pressão pós-operatórios no olho incluem vários tipos de colírios tal como agentes bloqueadores beta-adrenérgi- cos, agentes simpatomiméticos, mióticos, agentes seletivos alfa II, inibidores de anidrase carbônica e agentes de prostaglandina.

[00472] Um método preferido de remover o viscoelástico tal como ácido hialurônico é por injeção de sHASEGP durante ou imediatamente seguindo os procedimentos cirúrgicos de segmento anterior ou segmento posterior, embora outros métodos de administração conhecidos na técnica são possíveis também. É preferido se o ácido hialurônico e a sHASEGP são administrados através de injeção na câmara anterior durante os procedimentos cirúrgicos oculares de segmento anterior para permitir o ácido hialurônico agir como um espaçador durante o começo do procedimento cirúrgico. Em alguns casos de transplante córneo, a combinação de ácido hialurônico e sHASEGP pode ser colocada sobre a superfície das estruturas intra-oculares antes de suturar o transplante córneo no lugar. Esta combinação pode da mesma forma ser empregada na cirurgia de segmento posterior, tal como cirurgia vítrea ou retina.

[00473] Em alguns casos, pode ser aconselhável deixar um agente viscoelástico tal como Healon.TM., Viscoat.TM., ou outras substâncias ocupadoras de espaço na câmara anterior do olho na conclusão da cirurgia. Isto é especialmente verdadeiro no aumento de pressão positiva quando os teores intra-oculares tendem a avançar e comprimir contra a superfície posterior da córnea. Isto ocorre em um olho com uma lente intra-ocular sintética no lugar, a pressão no endotélio córneo pode causar dano significante às células e inchação córnea subseqüente e opacificação podem ocorrer, as quais estão associadas com visão diminuída. Tipicamente, se uma pressão intra-ocular do paciente for significativamente elevada na conclusão do procedimento operatório, é necessário administrar a um tal paciente doses grandes de inibidores de anidrase carbônicos, bem como colírios tópicos tal como beta-bloqueado- res e agonistas de alfa II a fim de diminuir a formação aquosa e/ou aumentar o fluxo aquoso. Todos estes agentes têm efeitos colaterais significantes e, em alguns exemplos, é contra-indicado em pacientes com vários tipos de condições médicas tais como problemas respiratórios, cardiopatia ou pressão san- güínea alta. Entretanto, o uso de sHASEGP nestas situações eliminará a necessidade de administrar aos pacientes doses grandes de tais drogas.

[00474] Além disso, há uma quantidade significante de ácido hi- alurônico na rede trabecular. A sHASEGP destruirá isto e portanto melhorará o fluxo do aquoso através da rede trabecular. A pressão intra-ocular do paciente portanto diminuirá. A combinação de sHASEGP com outros agentes de câmara anteriores, tal como metilcelulose (Ocucoat.RTM. por exemplo, comercialmente disponível de Storz Instrument Co.), empregada como espaçadores e/ou agentes protetores na cirurgia de catarata, da mesma forma será eficaz prevenindo-se aumentos de pressão significantes porque no efeito abrirá a rede trabecular e permitirá drenagem de humor mais aquoso destruindo-se uma quantidade significante do ácido hialurônico presente na rede trabecular.

[00475] A remoção de glicosaminoglicanos da rede trabecular é da mesma forma útil para a redução de pressão intra-ocular em indivíduos sofrendo de glaucoma de ângulo aberto. HASEGP humano pode ser administrado por injeção subconjuntival ou injeção diretamente na câmara anterior.

CISTOS DE GÂNGLIO

[00476] O cisto de gânglio (da mesma forma conhecido como um cisto de pulso, cisto Bible, ou cisto de tendão dorsal) é a massa de tecido macia mais comum da mão. É uma bolsa cheia de fluído que pode ser sentida debaixo da pele. Normalmente é ligada a uma bainha do tendão (revestimento que lubrifica o tendão) na mão ou pulso ou conectada com uma articulação subjacente, entretanto, algumas não têm conexão óbvia a quaisquer estruturas. Estes podem da mesma forma ocorrer no pé. Ocorre freqüentemente quando houver um dilaceramento nos ligamentos cobrindo o revestimento dos tendões ou articulações e os herniados de revestimento fora do defeito liga- mentoso causando um inchaço sob a pele. Porque há freqüentemente a inflamação associada, o tecido inflamado produz um fluido tipo geléia que enche a bolsa em protusão. Eles podem ser rocha dura devido a uma pressão alta do fluido tipo mucoso contido dentro do cisto, e são freqüentemente confundidos por uma proeminência óssea.

[00477] sHASEGP pode ser empregada para melhorar os cistos de gânglio. Injeção intralesional de sHASEGP de 5 - 1000 Unidades seguidas por aspiração de agulha fina removerá o cisto sem a necessidade de cirurgia. Corticosteróides podem ser opcionalmente injetados também com a sHASEGP. Injeção adicional pode ser requerida para alguns pacientes. MIXEDEMA

[00478] Infiltração de glicosaminoglicano (GAG) da pele é uma característica de hipertireoidismo, hipotireoidismo, mixedema pré-tibial, escleromixedema, e escleredema. Ácido hialurônico é a GAG principal em todas as condições e na pele normal. Há variabilidade histológica mínima de distribuição dérmica de GAG. Mucinoses cutâneas adquiridas exibem distribuição de GAG de pele similar e composição bioquímica. As diferenças mor-fológicas em atividade fibroblástica sugerem que as mucinoses de escleredema e escleromixedema representem um processo local, considerando que a infiltração de GAG de doenças de tiróide pode ter uma origem sistêmica. Estes distúrbios podem ser melhorados com um sHASEGP igualmente de uma rotina local e sistêmica de administração. Para terapia crônica, uma sHASEGP PEGilada pode ser considerada.

USOS PULMONARES DE sHASEGP

[00479] Níveis de Hialuronan em lavagens bronquioalveolares (BAL) de indivíduos normais estão geralmente abaixo de 15 ng/ml. Entretanto, níveis de BAL aumentam dramaticamente em condições de angústia respiratória (Bjermer Br Med J (Clin Res Ed) 3 de outubro de 1987; 295 (6602):803 - 6). Em ARDS por exemplo, níveis de hialuronan podem aumentar para 500 ng/ml considerando que em pulmão de fazendeiros, níveis de BAL podem ultrapassar 1000 ng/ml (Hallgren et al. Am Rev Respir Dis. março de 1989 139 (3):682 - 7), (Larrson et al. Chest. janeiro de 1992; 101(1):109 - 14). O hialu- ronan aumentado no pulmão pode prevenir a difusão de oxigênio e permuta de gás bem como ativando as respostas de neutrófilo e macrófago.

[00480] Preparações bovinas de hialuronidase não são preferíveis para o tratamento de tais condições por várias razões. Primeiro, preparações derivadas de testes de matadouro de hialuronidase são conhecidas ser contaminadas com serina protease tal como acrosina. Segundo, a natureza estranha das enzimas bovinas aumenta a probabilidade de uma reação ana- filática, que poderia resultar na morte do paciente. Desse modo, uma preparação altamente purificada de sHASEGP humana recombinante pode ser liberada por liberação intravenosa ou pulmonar. sHASEGP humana pode da mesma forma ser administrada em pacientes que sofrem de outras complicações pulmonares que estão associadas com glicosaminoglicanos elevados ou para intensificar a liberação de outras moléculas co-liberadas ao pulmão.

[00481] A invenção será descrita agora em maiores detalhes por referência aos seguintes exemplos não-limitantes

EXEMPLO 1 ENSAIOS DE HIALURONIDASE COM BASE EM MICROTÍTULO

[00482] O exemplo seguinte fornece um ensaio rápido para medida da atividade de hialuronidase de sHASEGP. Este ensaio pode ser relacionado a TRU, IU ou NFU através do uso de uma preparação padrão W.H.O. de hialuronidase.

ENSAIO DE MICROTÍTULO DE HIALURONAN BIOTINILADO

[00483] Os grupos carboxila livre em resíduos de ácido glicurô- nicos de Hialuronan são biotinilados em uma reação de uma etapa um empregando biotina-hidrazida (Pierce), Sulfo NHS (Pierce) e 1-etildimetilamino- propil-carbodiimida de 1-etila (Sigma). Este substrato de HA biotinilado é co- valentemente acoplado a uma placa de microtítulo de 96 cavidades em uma segunda reação. Na conclusão da reação de enzima, o substrato residual é detectado com uma reação de avidina-peroxidase que pode ser lida em uma leitora de placa ELISA padrão. Como o substrato é covalentemente ligado à placa de microtítulo, artefatos tais como deslocamento dependente de pH do substrato biotinilado não ocorrem. A sensibilidade permite a medida rápida de atividade de Hialuronidase de células cultivadas e amostras biológicas com uma variação de interensaio não menor do que 10%.

a. Protocolo PREPARAÇÃO DE SUBSTRATO HA BIOTINILADO

[00484] Cem mg de HA (Sigma Chemicals) foram dissolvidos em 0,1 M de MES, pH 5,0, em uma concentração final de 1 mg/ml e permitidos dissolver durante pelo menos 24h a 4°C antes do acoplamento de biotina. Sulfo-NHS (Pierce; Rockford IL) foi adicionado à solução de MES CS04 em uma concentração final de 0,184 mg/ml. Hidrazida de biotina (Pierce) foi dissolvida em DMSO como uma solução estoque de 100 mM e adicionada à solução CS04 em uma concentração final de 1 mM. Uma solução estoque de 1- etil -3-(3-dimetilaminopropil) carbidodiimide (EDAC) foi preparada como uma solução estoque de 100 mM em água destilada e adicionada à solução de biotina HA em uma concentração final de 30 mM. Esta solução foi deixada agitar durante a noite a 4°C. EDAC e biotina diferente foram removidos por diálise contra água com 3 mudanças de volume de 1000x de água. HA bioti- nilado dialisado (bHA) foi aliquotado e armazenado a 20°C durante até vários meses.

[00485] Sulfo-NHS foi diluído em 0,184 mg/ml em água com o bHA em uma concentração de 0,2 mg/ml e pipetado em placas COVALINK- NH de 96 cavidades (NUNC; Placerville NJ) em 50 μl por cavidade. EDAC foi diluído em 0,123 mg/ml em água e pipetado nas placas COVALINK-NH com a solução de bHA resultando em uma concentração final de 10 μg/cavidade de bHA e 6,15 μg/cavidade de EDAC. As placas foram incubadas durante a noite a 4°C ou durante 2 horas a 23°C, que produziram resultados comparáveis. Depois da imobilização covalente de bCS04 sobre as placas de microtí- tulo, a solução de acoplamento foi removida agitando-se e as placas foram lavadas 3 vezes em PBS contendo 2M de NaCl e 50 mM de MgSO4 (Tampão A). As placas podem ser armazenadas a 4°C durante até uma semana.

[00486] As placas COVALINK-NH com bHA imobilizado foram equilibradas com tampão de ensaio de 100 μl/cavidade - ou 0,1 M de formiato, pH 3,7, 0,1 M de NaCl, detergente TRITON X-100 1%, 5 mM de sacarolactona para Hialuronidase lipossômica; ou 10 mM de Hepes PH 7,4 com 1 mM de CaCl2 e 1 mg/ml de Albumina se soro Humana (ICN) para enzimas ativas neutras. Um grupo de padrões para a calibração da atividade de enzima contra "Unidades de Redução de Turbidez relativas" (rTRU’s) foi gerado diluindo-se hialuronidase testicular bovina (Sigma Type VI-S) em tampão de enzima neutro de 1,0 a 1x106 de rTRU/cavidade e ensaiando-se 100 μl/cavidade em tri- plicata. As amostras de Hialuronidase ativa de ácido foram diluídas em tampão de ensaio lipossômico de 1:10 a 1:130.000 foram pipetadas em triplicata em 100 μl/cavidade. Para a maioria dos ensaios de extratos de tecido e plasma humano, uma incubação de 30 minutos a 37°C foi suficiente. Cavidades de controle positivo e negativo (nenhuma enzima ou nenhum ABC (veja abaixo), respectivamente) foram incluídas em triplicata.

[00487] A reação foi terminada pela adição de 200 μl/cavidade de 6M de HCl de Guanidina seguido por três lavagens de 300 μl/cavidade com PBS, 2 M de NaCl, 50 mM de MgSO4, 0,05% de detergente TWEEN 20 (Tampão B). Um kit de complexo de avidina biotina (ABC) (Vector Labs; Burlingame CA) foi preparado em 10 ml de PBS que contém 0,1% de detergente TWEEN 20, que foi pré-incubado durante 30 minutos em temperatura ambiente durante a incubação. A solução de ABC foi adicionada (100 μl/cavidade) e incubada durante 30 minutos em temperatura ambiente. A placa foi lavada cinco vezes com Tampão B, em seguida um substrato de o-fenilenodiamina (OPD) foi adicionado em 100 μl/cavidade dissolvendo-se um comprimido de 10 mg de OPD em 10 ml de tampão de citrato-PO4 de 0,1 M, pH 5,3 e adicionando 7,5 μl de H2O2 a 30%. A placa foi incubada no escuro durante 10 - 15 minutos, em seguida lida empregando um filtro de 492 nm em uma leitora de placa ELISA (Titertek Multiskan PLUS; INC) monitorada empregando-se o software de leitora de placa Delta Soft II de computador de Biometallics (Princeton NJ). Uma curva padrão empregando hialuronidase testicular bovina foi gerada por um ajuste de curva de quatro parâmetros da preparação de hialuronidase comercial e amostras desconhecidas foram interpoladas através de sua absor- vência em 492 nm.

[00488] Para analisar a dependência de pH de Hialuronidases, sHASEGP recombinante purificada e hialuronidase testicular bovina são empregados. A dependência de pH de atividade de enzima é medida diluindo-se sHASEGP purificada ou hialuronidase testicular bovina parcialmente purificada em 0,1 rTRU nos seguintes tampões: 50 mM de formiato, pH 3 - 4,5; 50 mM de acetato, pH 5 - 6; 50 mM de MES, pH 6 - 7 ou 50 mM de HEPES, pH 7 - 8. Amostras são ensaiadas durante 30 minutos a 37oC e atividade foi expressa como um percentual de atividade máxima. NaCl não foi empregado em tampões, como visto que ele pode alterar o pH ideal de preparações de hialuronidase testicular (Gold, Biochem. J. 205:69 - 74, 1982; Gacesa et al. Biochem. Soc. Trans. 7:1287 - 1289, 1979); concentrações de sal fisiológicas (0,15 M) diminuíram o pH ideal evidente, um efeito que foi mais pronunciado em preparações purificadas da enzima testicular do que na amostra bruta original.

b. Resultados

[00489] Hialuronan foi biotinilado em uma reação de uma etapa empregando hidrazida de biotina e EDAC. Limitando-se EDAC que acopla os grupos carboxila livres em HA com hidrazida de biotina, somente uma fração pequena dos resíduos de ácido glucurônico totais em HA foi rotulada. Esta quantidade de EDAC (3 x 10-5 M) adicionada a HA (2,8 x 10-3 M) resulta em um máximo de uma molécula de hidrazida de biotina acoplada por 93 unidades de dissacarídeo de HA.

[00490] Um ajuste de curva de quatro parâmetros de reações padrão de hialuronidase testicular bovina medidas em pH 3,7, e diluídas de 1,0 a 1x10-6 TRU/ cavidade, foi preparado. Ajustes de curva de quatro parâmetros foram estabelecidos a partir da equação y=((A-D)/(1+ (conc/C)AB)) + D) onde logit y = ln (y’/1-y’), y’ = (y-D)/(A-D), B= -b/ln 10 e C=EXP (a/B). Os quatro parâmetros (A, B, C, D) foram calculados com um programa de software que utilizou o algorítimo 2+2 com regressão linear (Rodbard et al., Clin. Chem. 22:350, 1976). Este ajuste de curva incorpora os aspectos sigmoidais à curva padrão. A precisão ideal para medição de uma amostra ocorre tipicamente de 0,001 a 0,01 TRU/cavidade durante uma incubação de 30 minutos. Durante uma incubação de 60 minutos, 1/1000 de uma TRU é detectável. Uma curva logarítmica padrão da mesma forma pode ser utilizada sobre uma faixa mais curta de valores para estabelecer um ajuste de curva padrão. Embora a invenção tenha sido descrita em conexão com modalidades preferidas específicas, deveria ser entendido que a invenção como reivindicada não deveria ser indevidamente limitada a tais modalidades específicas.

EXEMPLO 2 CLONAGEM DE cDNA de sHASEGP

[00491] Ácido nucléico codificando sHASEGP Humana pode ser obtido por alguém versado na técnica através de vários procedimentos incluindo, porém não limitados a, síntese de gene artificial, RT-PCR, e hibridização de biblioteca de cDNA (por exemplo veja, Gmachl et al. FEBS 336(3) 1993, Kimmel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 1993 10071 - 10075). Alternativamente, os clones codificando sHASEGP humana podem ser obtidos de IMAGE, ou outros fornecedores de seqüências de gene humanas (Invitrogen Clone ID IOH10647).

[00492] O cDNA de PH20 humano de comprimento total foi calculado ser de 2009 nucleotídeos no comprimento e continha um quadro de leitura aberto de 1530 nucleotídeos. A 5’ UTR é extraordinariamente grande, que pode indicar um íntron retido e pode inibir a tradução prevenindo-se o ribossoma de ligar ao códon de metionina de iniciação correto devido aos 9 códons de partida de não-codificação na 5’ UTR. A proteína (número de Acesso Genbank NP_003108) é predita para compreender SEQ ID No. 1 de 509 aminoácidos com uma massa molecular calculada de 58kDa.

[00493] Para o seqüenciamento de clones, faixas amplificadas de PCR foram cortadas, e eluídas com o Kit de Extração de Gel (Qiagen) e clonadas nos vetores apropriados com extremidades compatíveis depois da digestão de restrição. Todas as reações de seqüenciamento foram executadas em DNA de filamento duplo com o kit de seqüenciamento de ciclo termi- nador de desóxi de tintura Taq (Applied Biosystems) de acordo com as instruções do fabricante, e funcionam em um seqüenciador automático ABI Prism® (Applied Biosystems).

[00494] O quadro de leitura aberto de PH-20 humana foi obtido amplificando-se uma biblioteca de cDNA de testículo humano (Clontech, Palo Alto CA) por Reação de Cadeia de Polimerase empregando iniciadores SEQ ID NO 14 e SEQ ID NO 47. Produtos de PCR foram digeridos com NheI e BamHI e clonados nos sítios NheI e BamHI do vetor IRESpuro2 (Clontech).

EXEMPLO 4 ISOLAMENTO DE SHASEGP DE cDNA de PH20 HUMANO

[00495] Um vetor de expressão de sHASEGP humana recombi- nante segregado cataliticamente ativo capaz de glicosilação eficaz em células de mamíferos foi gerado como descrito abaixo. Outros constructos de expressão com os promotores e genes de seleção para espécies diferentes tal como levedura e células de inseto que são da mesma forma capazes de gerar sHASEGP são considerados. Genes de seleção positiva tal como Glutamina Sintase ou Diidrofolato Reductase (DHFR) podem da mesma forma ser empregados. Os exemplos dados abaixo não são destinados a restringir porém são de preferência fornecidos como um exemplo de vários sistemas de expressão de plasmídeo que podem ser empregados.

[00496] A fim de construir formas segregadas de sHASEGP, mu- tantes de truncação que necessitam da extremidade de terminal C hidrofóbica foram construídos. Empregando um programa de predição de clivagem GPI, o sítio de clivagem de âncora de GPI foi localizado ao redor da posição de aminoácido N 483 na proteína ancorada de GPI de tamanho natural. Um grupo de sete iniciadores 3’ aninhados foram empregados para construir um grupo de sete mutantes de deleção truncados necessitando de âncora de GPI começando na posição Y 482 e deletado progressivamente por um aminoácido. Estes iniciadores foram designados ter sítios Nhe1 (5’) e BamH1 (3’) compatíveis para clonar os mutantes de truncação no vetor Irespuro2 rotulado com um códon de interrupção no iniciador 3’, ou como uma proteína rotulada por His de terminal C para facilidade de purificação e detecção. Por exemplo, iniciadores reversos SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, e SEQ ID No. 10 foram empregados para gerar mutantes de deleção terminando na posição Y 482, F 481 e I 480 sem um rótulo 6 His. Outros iniciadores de mutante foram gerados com o mesmo projeto de base com as modificações apropriadas para incluir e excluir os aminoácidos particulares. Para gerar variantes rotuladas por His, o mesmo grupo de iniciadores é empregado como para variantes não-rotula- das exceto que iniciadores necessitam do códon de interrupção nos iniciadores reversos respectivos, o iniciador dianteiro permanecendo o mesmo (para construção rotulada por His refere-se a iniciadores com SEQ ID No 19, 20, 21, 22, 23, 24 e 25 que são os iniciadores reversos sem códon de interrupção correspondente aos iniciadores reversos não-rotulados para seus constructos respectivos). Iniciadores de sobreposição foram empregados para construir um espaçador de seis aminoácidos seguido por hexahistidina dentro de sítios BamH1 e Not1 em vetor Irespuro2 tal que mutantes rotulados por His foram gerados por ligação do PCR amplificada e produtos digeridos de restrição dentro dos sítios Nhe1 e BamH1 no rótulo his contendo vetor Irespuro2.

[00497] Para identificar se sHASEGP humana pode ser modificado em seu terminal carbóxi para gerar uma enzima ativa neutra e segregada, uma série de truncações foram feitas a partir do sítio de ligação de âncora de GPI ao "domínio catalítico" predito com base na homologia com a enzima de veneno de abelha.

[00498] DNA codificando o clone ancorado de GPI de comprimento total de sHASEGP humana em IRESPuro2 foi empregado como um padrão para gerar os vários mutantes de deleção truncados. Programas de modelagem de software produziram vários sítios de clivagem preditos para o polipeptídio de tamanho natural. Um dos tais sítios preditos esteve na posição de aminoácido N 483 (SEQ ID No. 1). Iniciadores de PCR foram destinados para sucessivamente truncar a proteína de N483 gerar seis mutantes de de- leção começando em Y 482 (necessitando de N) e terminando em E 477 (necessitando de P).

a. Protocolo

[00499] Gerando mutante de truncação necessitando de N483:

[00500] O clone de sHASEGP ancorado de GPI de tamanho natural entre sítio Nhe1 e BanH1 em pIRESPuro2 foi empregado como um padrão. Este padrão foi amplificado com iniciador 5’ contendo sítio NheI que começa na Metionina de partida do peptídeo de sinal nativo em M 1(SEQ ID No. 14), e um iniciador 3’ contendo sítio BamHI que termina em Y 482 (SEQ ID No. 8). O produto de PCR foi executado em um gel de agarose a 1% para resolver e confirmar a faixa amplificada de tamanho correto, purificado por gel, digerido com restrição com NheI e BamHI e clonado em vetor pIRESPuro2 (Clontech) entre sítios de NheI e BamHI gerando um vetor de expressão para expressar este mutante de truncação de SHASEGP terminando na posição de aminoácido N482 e necessitando da âncora de GPI com seqüência de aminoácido (SEQ ID No. 5) para a seqüência do polipeptídio resultante de sHASEGP até Y 482) e seqüência de nucleotídeo (SEQ ID No. 48 - nucleotí- deos de codificação para polipeptídeo em SEQ ID No. 5) como indicado.

[00501] Geração dos outros mutantes de truncação necessitando de Y 482, F 481, I 480, Q 479, e P 478 respectivamente.

[00502] A mesma estratégia foi empregada apenas com a diferença existente empregando o iniciador 3’ apropriado para cada mutante. Os respectivos iniciadores 3’ são como segue:

[00503] Iniciador 3’ para mutante de sHASEGP que necessita de Y 482

[00504] SEQ ID No. 9

[00505] Iniciador 3’ para mutante que necessita de F 481- SEQ ID No. 10

[00506] Iniciador 3’ para mutante que necessita de I 480 -SEQ ID No. 11

[00507] Iniciador 3’ para mutante que necessita de Q 479-SEQ ID No. 12

[00508] Iniciador 3’ para mutante que necessita de P 478 -SEQ ID No. 13.

[00509] Gerar outros mutantes de deleção para determinar o domínio minimamente ativo de sHASEGP:

[00510] Outras deleções, em blocos de dez a vinte aminoácidos foram feitas da extremidade 3’ de mutante de truncação ativo de pH neutro íntimo de sHASEGP, que é sHASEGP até E 477. O iniciador dianteiro de NheI SEQ ID No. 14) foi empregado com um iniciador 3’ apropriadamente posicionado em PCR para amplificar um mutante de deleção de sHASEGP do tamanho desejado da extremidade de terminal carbóxi. Por exemplo, PCR com iniciadores descritos em SEQ ID No. 14 e SEQ ID No. 26 como os iniciadores 5’ e 3’ respectivamente foi empregado para gerar o polipeptídio em SEQ ID No. 49 quando expresso de um constructo de expressão em vetor IresPuro2. Similarmente, PCR com iniciadores 3’ reversos descritos em SEQ ID N° 27, 28, 29, 30, 31 e 32 foi empregada para gerar mutantes de deleção terminando nas posições de aminoácido A 447, S 430, G 413, S 394, A 372, e S 347 respectivamente da sHASEGP madura. Os produtos de PCR em cada caso foram digeridos com enzimas NheI e BamHI e o produto digerido clonado no vetor pIresPuro2 entre os sítios NheI e BamHI. Alguns clones independentes no constructo de expressão final de cada grupo foram testados quanto a atividade de sHASEGP ativa neutra segregada por transfecção transitória em células de CHO em meios livres de soro de CD-CHO (Invitrogen, CA) e amostras tiradas em pontos de tempo indicados para ensaio. DNA Miniprep preparado de culturas durante a noite foi transfectado com reagente de transfecção Genejuice (Novagen, CA) seguindo os protocolos recomendados pelo fabricante. Atividade de hialuronidase foi medida por ensaio de microtítulo como descrito anteriormente.

b. Resultados

[00511] Atividade de hialuronidase foi medida em mutantes de truncação de sHASEGP para identificar o domínio minimamente ativo para atividade de hialuronidase ativa neutra segregada.

[00512] Os resultados mostraram que todos os seis mutantes de deleção de um aminoácido terminando em aminoácidos indicados de Y 482 a E 477 produziram atividade segregada mais alta do que sHASEGP ancorada de GPI.

[00513] Os resultados da mesma forma mostraram que as dele- ções além de A 467 eliminaram qualquer atividade segregada. Atividade neutra segregada dos clones A 467 diminuiu para aproximadamente 10% daqueles clones P478 ou N 483 encontrados. Foi concluído portanto que mais domínio de terminal carbóxi de sHASEGP humana foi requerido para criar o domínio de hialuronidase ativo neutro do que previamente assumido da en-zima de veneno de abelha. As cisteínas no domínio de terminal carbóxi são dessa maneira necessárias para atividade neutra. Uma faixa muito estreita abrangendo aproximadamente 10 aminoácidos antes do sítio de clivagem de GPI em N 483 dessa maneira definiu o domínio minimamente ativo.

EXEMPLO 5-EFEITOS DE MODIFICAÇÃO DE PEPTÍDEO DE SINAL SOBRE ATIVIDADE SECREGADORA DE SHASEGP

[00514] sHASEGP humana possui um peptídeo líder nativo predito extraordinariamente longo. Adicionalmente, a existência de dois resíduos de cisteína adjacentes no peptídeo líder pode levar a agregação de multíme- ros de polipeptídio dentro do retículo endoplasmático durante a expressão de alto nível e portanto prevenir a expressão de alto nível de uma sHASEGP. Uma série de peptídeos líder secretários mais eficientes foi portanto testada para examinar quanto a sua capacidade de intensificador o alvejamento de sHASEGP para secreção.

a. Protocolo

[00515] O peptídeo líder de Kappa foi construído recozendo-se o iniciador de sobreposição e PCR de extração com iniciadores correspondentes as seqüências em SEQ ID No 37, 38, 39 e 40. A seqüência de kappa amplificada de PCR resultante foi amplificada com iniciadores de flanquea- mento contendo sítio NheI na(s) extremidade 5’ (como descrito em SEQ ID No. 41) e sítio EcoR1 na extremidade 3’ (como descrito em SEQ ID No. 42). Isto permitiu clonar o peptídeo líder de Kappa (a seqüência de polipeptídio é como descrita em SEQ ID No. 43) no vetor Litmus 39 (NEB) entre os sítios NheI e EcoRI. sHASEGP tem um sítio EcoRI interno; portanto este constructo de kappa entre o sítio NheI e o sítio EcoRI foi também amplificado com um iniciador SpeI 5’ (como descrito em SEQ ID No. 44) e um iniciador MluI 3’ (como descrito em SEQ ID No. 45). sHASEGP sem âncora de GPI terminando em P 478 foi cortado do pIresPuro2 com NheI e BamHI e clonado em um vetor Litmus 39(NEB) dentro dos sítios NheI e BamHI de vetor Litmus39. Este vetor Litmus contendo sHASEGP resultante foi digerido com enzimas de restrição SpeI e MluI e o constructo líder de kappa amplificada com SpeI e MluI foi clonado nele. Mutagênese direcionada ao sítio foi realizada neste vetor Litmus 39 contendo igualmente seqüências de sHASEGP e Kappa para gerar a fusão na estrutura da seqüência líder de kappa ao polipeptídeo maduro de sHASEGP. Os pares de iniciador correspondentes a SEQ ID NO. 34 e 35 foram empregados para gerar líder de kappa com Asp nativa como o aminoá- cido terminal fundido ao F 38 de SHASEGP (até P 478) (como descrito em SEQ ID No. 46 para a seqüência de polipeptídeo da proteína de fusão). Outras combinações de par de iniciador tais como incorporadas por SEQ ID No. 33 com SEQ ID No. 35 foram empregadas para gerar a líder de Kappa terminando no Asp terminal (D) fundida em L 36 de SHASEGP. SEQ ID No. 33 com SEQ ID No. 36 foram empregadas para gerar líder de Kappa terminando na Gly (G) (antes do Asp terminal (D)) fundida em L 36 de SHASEGP, e SEQ ID No. 34 com SEQ ID No. 36 foram empregadas para gerar Kappa terminando na Gly (G) (antes do Asp terminal (D)) fundida em F 38 de SHASEGP. As fusões de sHASEGP de Kappa obtidas por mutagênese direcionada ao sítio foram purificadas por gel, digeridas com enzima DpnI para digerir qualquer DNA de origem remanescente, e em seguida digeridas com NheI e Bam HI e clonadas na cadeia principal de HisIresPuro2 digeridas com NheI/BamHI que tem o rótulo his (espaçador de seis aminoácidos seguido por seis histidinas) clonado entre os sítios BamH1 e Not1 no vetor pIRESPuro2. Portanto, na ligação obteve-se um constructo que é NheI- kappa-SHASEGP-BamHI-His em pIresPuro2. Quatro grupos de tal constructo foram obtidos os quais corresponderiam às combinações de G ou D na extremidade líder de Kappa e L 36 ou F 38 no começo de sHASEGP madura. Alguns clones independentes de cada tipo de constructo foram transfectados em células de CHO em meio CD- CHO (Invitrogen, CA) para testar se a presença de líder de secreção de kappa promoveria níveis aumentados de proteína secretada quando comparados a líder de secreção nativa. DNA Miniprep preparado de culturas durante a noite foi transfectado com reagente de transfecção Genejuice (Novagen, CA) seguindo os protocolos recomendados pelo fabricante e amostras foram tiradas para testar por ensaio de microtítulo em pontos de tempo indicados. Atividade de Hialuronidase foi medida por ensaio de microtítulo como descrito anteriormente.

[00516] Constructos de fusão de sHASEGP de peptídeo líder de cadeia de Kappa de IgG de camundongo foram testadas para testar quanto aos níveis superiores de atividade de sHASEGP ativa neutra secretada.b. Resultados

[00517] Os resultados de ensaio de enzima indicaram que líderde Kappa de IgG foi capaz de intensificar a secreção sHASEGP aproximadamente 7 a 8 vezes mais alta do que líder de secreção nativa quando comparada com clones P478, Y 482 ou N 483 que necessitou de um tal líder. Outros constructos líderes de kappa com variações do sítio de fusão líder de Asp ou de Gly de líder de Kappa para L36 ou F38 de sHASEGP produziram níveis aumentados de atividade de hialuronidase ativo neutro secretados também. Estes exemplos são destinados a expandir em vez de limitar o escopo da invenção, visto que outras seqüências líderes secretórias eficientes podem ser utilizadas com a mesma tecnologia.

EXEMPLO 6 GERAÇÃO DE UM VETOR DE EXPRESSÃO DE sHASEGP HUMANA

[00518] Uma sHASEGP sem um rótulo de epítopo foi gerado clo- nando-se um cassete de expressão bicistrônico, HZ24 (SEQ ID NO 47). O vetor de plasmídeo HZ24 para expressão de sHASEGP compreende uma cadeia principal de vetor de pCI (Promega), seqüência de DNA codificando ami- noácidos 1- 482 de hialuronidase PH20 humana, um sítio de entrada ribossô- mico interno (IRES) do vírus de ECMV (Clontech), e o gene de diidrofolato reductase de camundongo (DHFR). A cadeia principal de vetor de pCI da mesma forma inclui DNA codificando o gene de resistência a Beta-lactamase (AmpR), uma origem de fl de replicação, uma região de intensificador/promo- tor precoce imediato de Citomegalovírus (CMV), um íntron quimérico, e um sinal de poliadenilação tardio de SV40 (SV40). O DNA codificando o cons- tructo de sHASEGP continha uma seqüência de consenso Kozak na Metio- nina do líder de sinal nativo e um códon de interrupção em Tirosina 482. O constructo resultante pCI-PH20-IRES-DHFR-SV40pa (HZ-24) resulta em uma única espécie de mRNA direcionada pelo promotor de CMV que codifica ami- noácidos 1- 482 de PH20 e aminoácidos 1-187 de diidrofolato reductase separados pelo sítio de entrada ribossômico interno.

[00519] O quadro de leitura aberto de PH20 humano foi ampliado a partir de um clone ORF Invitrogen (IOH10647, Invitrogen, Carlsbad CA) com um Iniciador 5’ que introduziu um sítio NheI e seqüência de consenso Kozack antes da Metionina de PH20 e um iniciador reverso que introduziu um códon de interrupção seguindo Tirosina 482 e introduziu um sítio de restrição BamH1. O produto de PCR resultante foi ligado no plasmídeo pIRESpuro2 (Clontech, Palo Alto, CA) seguindo digestão do fragmento de PCR de PH20 com NheI e BamH1.

EXEMPLO 7 GERAÇÃO DE UMA LINHAGEM DE CÉLULA DE EXPRESSÃO DE sHASEGP

[00520] Células de CHO DG44 não-transfectadas crescendo em meios de CD-CHO Modificado de GIBCO para células DHFR (-), suplementadas com 4mM de Glutamina e 18 ml de Plurionic F68/L (Gibco), foram semeadas em 0,5 x 106 de células/mL em um frasco agitador na preparação para transfecção. As células foram crescidas à 37oC em incubador umedecido com CO2a 5% com 120 rpm para agitação. Células de CHO DG44 não transfecta- das crescendo exponencialmente foram testadas quanto a viabilidade antes da transfecção.

[00521] 60.000.000 de células viáveis da cultura de célula de CHO DG44 não-transfectadas foram peletizadas e ressuspensas em uma densidade de 20.000.000 células em 0,7 mL de tampão de transfecção 2x (2X HeBS = 40 mM de Hepes, pH 7,0, 274 mM de NaCl, 10 mM de KCl, 1,4 mM de Na2HPO4, 12 mM de dextrose). Para cada alíquota de células ressuspen- sas, 0,09 mL do plasmídeo de HZ24 linear (250 ug) foi adicionado, e as soluções de célula/DNA foram transferidas em cubetas de eletroporação BTX (Gentronics) com 0,4 cm de abertura em temperatura ambiente. Uma eletro- poração de controle negativo foi realizada sem DNA de plasmídeo misturado com as células. As misturas de célula/plasmídeo foram eletroporadas com uma descarga de condensador de 330 V e 960 uF ou em 350 V e 960 uF.

[00522] As células foram removidas das cubetas depois da ele- troporação e transferidas em 5 mL de meios de CD-CHO Modificado para células DHFR(-), suplementadas com 4mM de Glutamina e 18 ml de Plurionic F68/L (Gibco), e permitidas crescerem em uma cavidade de uma placa de cultura de tecido de 6 cavidades sem seleção durante 2 dias a 37oC em incubador umedecido com CO2a 5%.

[00523] Dois dias após eletroporação, 0,5 mL de meios de cultura de tecido foi removido de cada cavidade e testado quanto à presença de atividade de hialuronidase.Atividade de Hialuronidase Inicial de Células de CHO DG44 Transfectadas com HZ24 em 40 Horas Após Transfecção

[00524] As células de transfecção 2 (350V), foram coletadas a partir da cavidade de cultura de tecido, contadas e diluídas em 10.000 a 20.000 células viáveis por mL. Uma alíquota de 0,1 da suspensão de célula foi transferida para cada cavidade de cinco placas de cultura de tecido de base redonda de 96 cavidades. 0,1 mL de meios de CD-CHO (GIBCO) contendo 4 mM de Glutamax-1, e sem hipoxantina e suplementos com timidina foi adicionado às cavidades contendo células (volume final 0,2 mL).

[00525] Dez clones foram identificados das 5 placas crescidas sem metotrexato.

[00526] Seis clones de HZ24 foram expandidos em cultura e transferidos em frascos agitadores como suspensões de célula simples. Os clones 3D3, 3E5, 2G8, 2D9, 1E11 e 4D10 foram semeados em placas de cultura de tecido de base redonda de 96 cavidades empregando uma estratégia de diluição infinita bidimensional. Os clones diluídos foram crescidos em uma base de 500 células de CHO DG44 não transfectadas, para fornecer os fatores de crescimento necessários para os dias iniciais em cultura. Dez placas foram feitas por subclone.

[00527] O clone 3D3 produziu 24 subclones visuais. Atividade de hialuronidase significante foi medida nos sobrenadantes de 8 dos 24 subclones (> 50 Unidades/mL), e estes 8 subclones foram expandidos em frascos de cultura de tecido T-25 na presença de 50 nM de metotrexato. O clone 3D3 50 nM foi também expandido em 500nM de metotrexato dando origem a clo-nes que produzem mais de 1.000 Unidades/ml em frascos agitadores (clone 3D3 5M).

EXEMPLO 8 PRODUÇÃO DE sHASEGP

[00528] Um vaso de 3D3 5M foi descongelado e expandido de frascos T através de frascos giratórios de 1L em CHO CDM (Invitrogen, Carslbad CA) suplementado com 100nM de Metotrexato e Glutamax (Invitrogen). As células foram transferidas dos frascos giratórios para um biorreator de 5L (Braun) a uma densidade de inoculação de 4,0 x 10E5 de células viáveis por ml. Os parâmatros foram o ponto de fixação da temperatura, 37oC, pH 7,2 (iniciando o ponto de fixação), com 25% de ponto de fixação de Oxigênio Dissolvido e um revestimento de ar de 0 -100 cm3/minuto. Em 168 h, 250ml de Meio de Alimentação n°1 (CD CHO + 50g/L de Glicose) foram adicionados. Em 216 horas, 250ml de Meio de alimentação n°2 (CD CHO + 50g/L de Glicose + 10mM de Butirato de sódio) foram adicionados, e em 264 horas, 250 ml de Meio de alimentação n° 2 foram adicionados. Este processo resultou em uma produtividade final de 1600 Unidades por ml com uma densidade de célula máxima de 6 milhões de células/ml. A adição de butirato de sódio foi constatada realçar dramaticamente a produção de sHASEGP nos estágios finais de produção.Crescimento de 3D3-5M & Produção de sHASEGP, Biorreactor de 5L

EXEMPLO 9 PURIFICAÇÃO DE sHASEGP

[00529] Meios condicionados do clone 3D3 foram clarificados por filtração de profundidade e diafiltração de fluxo tangencial em 10mM de Hepes pH 7,0. HASEGP solúvel foi em seguida purificado por cromatografia seqüencial em permuta de íon de Q Sefarose (Pharmacia). Cromatografia de interação hidrofóbica de Sefarose de Fenila (Pharmacia) , boronato de fenila (Prometics) e Cromatografia de Hidroxapatita (Biorad, Richmond, CA).

[00530] SHASEGP ligou-se a Q Sefarose e eluiu-se em 400 mM de NaCl no mesmo tampão. O eluato foi diluído com 2M de sulfato de Amônio a uma concentração final de 500 mM de ASO4 e passado através de uma coluna de Sefarose de Fenila (baixo sub), seguido ligando-se sob as mesmas condições para uma resina de boronato de fenila. A sHASEGP foi eluída a partir da resina de sefarose de fenila resine em Hepes pH 6,9 depois de lavar em pH 9,0 entre 50 mM de bicina sem AS04. O eluato foi carregado sobre uma resina de hidroxiapatita de cerâmica em pH 6,9 em 5 mM de PO4, 1 mM de CaCl2 e eluído com 80 mM de PO4 pH 7,4 com 0,1mM de CaCl2.

[00531] A sHASEGP purificada resultante possuiu uma atividade específica em excesso de 65.000 USP Unidades/mg de proteína por meio do ensaio de microturbidez empregando o padrão de referência de USP. SHASEGP purificada eluída como um único pico de 24 a 26 minutos de uma coluna de divinilbenzeno de estireno de Pharmacia 5RPC com um gradiente entre 0,1% de TFA/H2O e 0,1% de TFA/90% de acetonitrila/10% de H2O e resolvido como uma única faixa de 61 kDa ampla por eletroforese de SDS que reduziu para uma faixa de 51kDa aguda no tratamento com PNGASE-F. O seqüenciamento de aminoácido de N-terminal revelou que o peptídeo líder foi eficientemente removido.sHASEGP bioquimicamente purificada de Seqüência deAminoácido de N-terminal.

EXEMPLO 10 ANÁLISE DE GLICOSILAÇÃO DE sHASEGP DERIVADA DE DG44 CHO

[00532] Dados contraditórios existem sobre se sHASEGP’s de espécies diferentes relatado que hialuronidase de veneno de abelha enzima- ticamente ativo pode ser sintetizada em células que necessitam de maquinaria de glicosilação, isto é, tal como E. coli. Além disso, o tratamento de hialuroni- dase de testes bovino purificada com PNGase não inativou a atividade de enzima (Yamagata et al. 1997). Outros estudos relatam a perda de atividade seguindo a desglicosilação e que as ligações de dissulfeto são adicionalmente requeridas.

[00533] Visto que todos os tais testes prévios foram feitos empregando preparações brutas ou parcialmente purificadas, entretanto, não foi evidente se a perda da atividade foi um resultado da exposição de enzima de desglicosilação para proteases contaminantes nas preparações não brutas ou uma ligação funcional direta entre glicosilação e atividade catalítica.

a. Protocolo

[00534] Para determinar se a glicosilação ligada por N funcional pode ser introduzida em sHASEGP humana empregando um sistema de expressão com base em CHO sob condições livres de proteína, um cDNA codificando sHASEGP-HIS6 foi expresso em células de CHO empregando um cassete bicistrônico IRESpuro em meios quimicamente definidos. As células foram crescidas durante 72 horas em CHO CDM (Invitrogen / Gibco) seguido por concentração e diafiltração de fluxo tangencial em uma unidade Pellicon TFF (Millipore) com 30kDa de membranas de interrupção. O concentrado foi permutado com 10mM de Hepes PH 7,4 50 mM de NaCl. O diafiltrado foi em seguida carregado sobre uma resina de sefarose aerodinâmica de DEAE e eluído com um gradiente de NaCl de 0-1M de NaCl em uma resina de FPLC Pharmacia sHASEGP humana eluir entre 10 - 30% de Nacl. Níveis de sHASEGP em frações de coluna determinaram que a maioria das enzimas foram recuperadas no gradiente de NaCl de 10 - 30%. A enzima do gradiente de NaCl de 10 - 30% foi em seguida purificada por meio de cromatografia de afinidade em uma resina IMAC carregada com Ni. sHASEGP humana foi elu- ída a partir da resina IMAC depois de lavar com 10mM de Imidizol com 50 mM de Acetato PH 5,0. A proteína foi concentrada e dialisada contra 10 mM de Hepes PH 7,4. A enzima altamente purificada foi determinada possuir uma atividade específica de 97.000 Unidades/mg de proteína na presença de 1 mM de Cálcio e 1mg/ml de HSA no ensaio de microtítulo de substrato biotini- lado com base em ELISA.

[00535] Para detectar mudanças na massa molecular relativa de proteína, sHASEGP humana purificado foi tratado com PNGASE ou Neuraminidase durante a noite seguido por eletroforese em gel, eletrotransferência e análise Western blot com um anticorpo monoclonal anti His6 ligado a HRP (Qiagen) e detecção de ECL.

b. Resultados

[00536] A análise de Western blot determinou que a sHASEGP humana produzido em células CHO foi sensível ao tratamento com PNGASE. A massa molecular relativa de sHASEGP humana revelou que a proteína foi altamente glicosilada. Na digestão completa durante a noite com PNGASE, sHASEGP humana reduziu-se a uma única espécie confirmando que a heterogeneidade moderada da faixa não-digerida pode ser atribuídas aos resíduos de açúcar ligados a N. A digestão parcial de PNGaseF mostrou uma série de intermediários alterando de mudança não-tratada e progressiva com tratamento mais longo. Embora as faixas tenham sido um pouco difundidas em um Gel a 7%, pelo menos 6 isoformas de intermediário diferentes podem ser visualizadas.

[00537] Tratamento de sHASEGP com Neuraminidase revelou que as células CHO foram na realidade capazes de sintetizar sHASEGP humana sialada. No tratamento com neuraminidase e análise de Western blot de sHASEGP em Géis a 7%. sHASEGP recombinante Humana derivada de CHO revelou uma mudança de aproximadamente 1-3 kDa na mobilidade comparada à sHASEGP não-tratada. Este é assim o primeiro relatório da geração de um sHASEGP humano substancialmente sialado. Isto é muito valioso igualmente para estabilidade e realçar a meia-vida do soro de um sHASEGP humano quando sHASEGP de esperma nativo de muitas espécies necesitam de sialação e não reage com lectinas específicas de ácido siálico.

Análise de FACE de sHASEGP

[00538] A análise de oligossacarídeos de sHASEGP ativo por análise de FACE permite rápida determinação de perfis de sHASEGPs cata- liticamente ativas.

Protocolo

[00539] Hialuronidase purificada do clone 3D3 5M foi avaliada empregando-se Perfil de Oligossacarídeo Ligado a N FACE® (Prozyme). Os oligossacarídeos foram clivados a partir de 128,7 μg de glicoproteínas por digestão enzimática com N-Glicanase (a.k.a PNGase), rotulados empregando- se fluróforo ANTS e separados por eletroforese. As posições relativas das faixas de oligossacarídeo foram determinadas por supuração da amostra e diluições da amostra ao lado de uma variação crescente de oligossacarídeo que designou a distância de migração em unidades de Grau de Polimerização (DP).

Resultados

[00540] O perfil de N para a amostra de Hialuronidase consiste em dez faixas das quais seis (supuração concomitante com as faixas padrão de oligossacarídeo G5 - G12) tiveram intensidades maiores do que 9%. Além disso, a supuração da faixa ao lado da G9 padrão foi o mais intenso com intensidades de 35% - 46%.sHAS Análise de oligossacarídeo de EGP

EXEMPLO 11 DEPENDÊNCIA DE GLICOSILAÇÃO LIGADA POR N DE SHASEGP PARA A ATIVIDADE DE ENZIMA a. Protocolo

[00541] As amostras de sHASEGP de HIS6 purificado foram misturadas com tampão contendo Neuraminidase and PNGASE com e sem 50 mm de Octilglicosídeo durante a noite a 37oC. Os oligossacarídeos foram verificados terem sido removidos por mudança em gel de análise de Western blot.b. Resultados

EXEMPLO-12 ATIVIDADE DE SHASEGP COM RESPEITO A GLICOSAMINOGLICANOS SULFATADOS E NÃO SULFATADOS

[00542] Além do ensaio com base em microtítulo empregando- se HA, a especificidade do substrato de sHASEGP com respeito a outros gli- cosaminoglicanos ou proteoglicanos, pode ser testada empregando-se um ensaio de mudança em gel com substratos purificados para determinar a atividade de sHASEGP com respeito a outros glicosaminoglicanos. Muitos ensaios de Hialuronidase foram baseados na medida da geração de novos grupos de N-acetilamino de redução (Bonner e Cantey, Clin. Chim. Acta 13:746 - 752, 1966), ou perda de viscosidade (De Salegui et al., Arch. Biochem.Biophys. 121:548 - 554, 1967) ou turbidez (Dorfman e Ott, J. Biol. Chem. 172:367, 1948). Com substratos purificados, todos estes métodos bastam para a determinação da presença ou ausência de atividade endoglicosamí- dica.

a. Protocolo.

[00543] ENSAIO DE MUDANÇA EM GEL - Substratos purificados são misturados com sHASEGP recombinante para testar quanto à atividade de endoglicosidase que dão origem à mobilidade aumentada no substrato dentro do gel. Sulfato de condroitina A, Agrecano e D foram de Calbio- chem. Sulfato de Condroitina C de Hialuronan (Cordão umbilical Humano) sulfato de Dermatan e sulfato de Heparano de Calbiochem. Hialuronan de cordão umbilical humano foi obtido de ICN. Cada substrato de teste é diluído em 0,1 mg/ml. Amostras de 10 ul de sHASEGP purificada ou meios condicionados de células de expressão de sHASEGP bem como são misturadas com 90 ul de substrato de teste em tampão desejado e incubadas durante 3 horas a 37oC. As amostras de incubação seguintes são neutralizadas com tampão de amostra (Tris EDTA PH 8,0, Azul de Bromofenol e glicerol) seguido por eletroforese em 15% de géis de poliacrilamida. Glicosaminoglicanos são detectados man-chando-se os géis durante a noite em 0,5% de Azul Alcião em 3% de Ácido acético Glacial durante a noite seguido por desmanchamento em 7% de Ácido acético Glacial. A degradação é determinada por comparação da mobilidade de substrato na presença e ausência de enzima.

b. Resultados

[00544] 100 Unidades de sHASEGPHIS6 em 10 ul foram incubadas com 90 ul de 10mM de Tampão Hepes com 50 ug/ml de Albumina de Soro Humana durante 2 horas a 37oC contendo 10 ug de vários glicosaminoglica- nos e proteoglicanos. A análise eletroforética seguida por manchamento com azul Alcião revelou mudanças de mobilidade aumentadas em uma única espécie em Sulfato de Condroitina A, C e D, Agrecano e Hialuronan porém não Sulfato de Heparano nem Sulfato de Condroitina B. Visto que os glicosamino- glicanos não-digeridos funcionam como um esfregaço no meio do gel, os produtos digeridos mostraram a maioria das manchas de azul alcião funcionando na tintura frontal com uma pequena quantidade de material funcionando como uma variação crescente incremental.

EXEMPLO 13 EFEITOS DE ÍONS DE METAL EM ATIVAÇÃO DE sHASEGP

[00545] Além da exigência de glicosilação para atividade de enzima ideal, sHASEGP humana foi constatado ser ativada com cátions para atividade de enzima ideal. No processo de purificação, sHASEGP foi constatado ter uma baixa atividade específica seguindo etapas de cromatografia sucessivas. A sHASEGP rotulada por HIS6 foi constatado ter uma atividade específica muito baixa quando purificado para homogeneidade de DEAE seguido por purificações de Ni-IMAC sucessivas. Visto que as resinas IMAC podem quelar íons de metal, vários metais foram adicionados novamente em sHASEGP para determinar a atividade de enzima relativa.

a. Protocolo

[00546] sHASEGP purificada foi testada seguindo a incubação com 0,1 mM de níquel (Ni), Cobalto (Co) Zinco (Zn), Calcium (Ca) e Magnésio (Mg) por 2 horas em temperatura ambiente seguido por determinação de atividade de hialuronidase em ensaio com base em microtítulo.b. Resultados

[00547] Um aumento significante na atividade de hialuronidase foi constatado seguindo a incubação de sHASEGP com 0,1 mM de Cálcio ou 0,1 mM de Magnésio. Nenhuma ativação foi constatada seguindo a incubação com outros metais. A adição de Cálcio em sHASEGP aumentou a atividade específica da enzima em aproximadamente 97.000 unidades por mg de proteína com base na medida de A280. Uma curva de resposta a dose de metais de Cálcio e Magnésio foi em seguida testada para determinar a concentração ideal de íons de metal na enzima.

[00548] A ativação de sHASEGP foi constatada ocorrer na faixa micromolar. As concentrações acima de 10mM foram inibidoras igualmente para Cálcio e Magnésio. Para excluir a ativação não-específica de substrato em vez da enzima, Cloreto de Cálcio em 10 mM de tampão de Hepes foi incubado com o substrato biotinilado imobilizado na placa de microtítulo seguido por lavagem. Nenhuma ativação foi constatada quando a enzima foi adicionada à placa pré-incubada de Cálcio que foi lavada. A ativação foi da mesma forma testada em fosfolipase C libertou sHASEGP nativa que revelou uma ativação similar com Cálcio que rege fora um artefato da etiqueta de epítopo H156 do terminal carbóxi.

EXEMPLO 14 EFEITOS DE ALBUMINA SOBRE A ATIVIDADE DE sHASEGP

[00549] Constatou-se que a diluição de rHUPH20 de recombi- nante e outras preparações de hialuronidases derivadas de testes de matadouro requereram albumina além de Cálcio para atividade ideal.

a. Protocolo

[00550] A Albumina de Soro Humana (ICN) foi diluída em 10mM de tampão Hepes com Cálcio para determinar os efeitos de proteína de albumina sobre a atividade de enzima. Os ensaios de enzima com sHASEGP e preparações comerciais foram examinados empregando-se tanto 1mM de CaCl2 quanto e 1 mg/ml de Albumina de Soro Humana.

b. Resultados

[00551] A ativação da atividade de hialuronidase foi encontrada em diluições elevadas na presença de albumina. Não ficou claro se esta ativação foi um resultado de prevenção da desnaturação ou se a albumina afetou a disponibilidade do substrato. Um formulação preferível de sHASEGP humana pode portanto incluir Albumina e um sal de metal consistindo em ou Cálcio ou Magnésio.

EXEMPLO-15 ATIVIDADE DE DISPERSÃO DE sHASEGP PURIFICADA IN VIVO a. Protocolo

[00552] sHASEGP purificada em 10mM de Hepes PH 7,4, 150 mM de NaCl a 0,1% Pluronic foi diluído para 0,5 U/ul em água sem pirogênio com 0,15M de NaCl. Uma série de diluições em 20 ul final de solução Salina foi feita para fornecer um total de 0,01, 0,05, 0,1 Unidade por injeção. 20 ul de solução de Azul Tripano foram adicionados para um volume final de 40 ul e injetados subcutaneamente na pele lateral sobre cada lado dos camundongos balbNu/Nu que foram previamente anestesiados i.p previamente por administração de cetamina/xilazina. Áreas de tintura foram medidas em 2 dimensões com um microcaliper de t = 0 a t = 45 min. A área foi representada como mm2. Como um controle a HYAL1 Humana recombinante que não tem atividade neutra, porém é secretada, foi incluída.b. Resultados

EXEMPLO-16 CINÉTICOS DE ATIVIDADE de DIFUSÃO DE sHASEGP a. Protocolo

[00553] sHASEGPHis6 purificada recombinante foi separada em 2 alíquotas. Uma foi aquecida a 95°C durante 15 minutos em um termocicli- zador com uma tampa aquecida. A outra permaneceu em temperatura ambiente. Inativação térmica de atividade de enzima foi verificada no ensaio de enzima com base no microtítulo. Para análise cinética material inativado por aquecimento versus nativo foi testado. 4 Unidades de sHASEGP purificada ou material inativado por aquecimento foram injetadas subcutaneamente com tinta azul tripano. As áreas foram testadas em vários pontos do tempo até 15 minutos.b. Resultados

EXEMPLO-17 RESTAURAÇÃO DA BARREIRA DÉRMICA ROMPIDA POR sHASEGP a. Protocolo

[00554] Para estabelecer o tempo de regeneração dos poros abertos com sHASEGP seguindo administração subcutânea, 2 Unidades de sHASEGP purificada ou controle de solução salina foram injetados em dois sítios laterais opostos subcutaneamente em animais a t = 0 seguido por injeção com azul tripano no mesmo sítio a 30 minutos, 60 minutos e 24 horas. A área da difusão de tinta em t = 15 após injeção foi registrada para cada ponto de tempo comparado ao controle.b. Resultados

[00555] Os resultados demonstram que a barreira dérmica reconstitui-se em 24 horas de administração de 2 Unidades de enzima.

EXEMPLO-18 DETERMINAÇÃO DO TAMANHO DE CANAIS ABERTOS POR sHASEGP

[00556] Foi mostrado que a sHASEGP humana abriu canais no espaço intersticial suficienteS para permitir a difusão de uma pequena molécula, isto é, tinta azul tripano. Entretanto, ficou desconhecido quais os limites superiores ficaram sobre o tamanho de partículas que pode difundir-se na presença de sHASEGP.

a. Protocolo

[00557] Moléculas fluorescentes de tamanhos variáveis foram empregadas para determinar o tamanho de canais abertos por sHASEGP humana, DextranOs FluoresceinadOs de 4.400 e 2 milhões Da de Peso Molecular Médio (Sigma) bem como contas rotuladas por fluoresceína de diâmetros definidos de 20 nanômetros a 500 nanômetros (Molecular Probes), foram administradas subcutaneamente em um volume de 40 ul com a seguinte injeção de sHASEGP ou controle de solução salina nos mesmos sítios. A área da tintura frontal foi então medidas em duas dimensões em 15 minutos após a injeção.b. Resultados

[00558] Os resultados demonstraram que as moléculas de apro-ximadamente 1 kDa (Azul Tripano) a 50 nm de diâmetro (Contas de Látex) mostraram difusão realçada seguindo a administração de sHASEGP. Ao mesmo tempo que a albumina de soro bovino (66 kDA) mostrou cinéticos similares de difusão para azul tripano, as contas de látex de 50 nm requereram significativamente mais tempo para difundirem-se. Contas de 500 nm não mostraram nenhuma difusão até 480 minutos.

EXEMPLO-19 PERFIS DE FARMACOCINÉTICOS DE SORO DE ANTICORPOS BIOTINILADOS SEGUINDO CO-INJEÇÃO SUBCUTÂNEA DE sHASEGP HUMANA. a. Protocolo

[00559] Camundongos Balb/c fêmea foram anestesiados com uma mistura de cetamina/xilazina. Os camundongos foram então injetados subcutaneamente com 20 ul de solução de 0,5 mg/ml IgG de camundongo biotinilado misturados com 20 ul de solução salina ou 20 ul de sHASEGP contendo 4 Unidades de atividade.b. Resultados

[00560] Os resultados demonstram que a sHASEGP aumenta os cinéticos de distribuição de soro de moléculas grandes em circulação. Onde nenhum IgG biotinilado pôde ser detectado no grupo de controle em 2 horas, 360 ng/ml foram evidentes em 2 horas no grupo de sHASEGP.

EXEMPLO-20 ATIVIDADE DE DISPERSÃO DE MOLÉCULAS SUBCUTANE- AMENTE INJETADAS SEGUINDO INJEÇÃO INTRAVENOSA DE sHASEGP HUMANA. a. Protocolo

[00561] Quatro sítios para injeção de tintura foram utilizados por dose de cada Artigo de Teste e controle de veículo. A injeção de tintura foi de 45 minutos após a injeção i.v.. Cada dose de teste ou artigo de controle foi injetado i.v em 2 animais. Medição da área frontal de tintura após 45 minutos de administração de enzima foi calculada em 2,5, 5, 10 e 15 minutos para cada dose ou controle de veículo.

b. Resultados

[00562] Os resultados demonstraram que sHASEGP altamente purificada estava sistemicamente disponível para tecidos distais em administração intravenosa. A atividade de dispersão de sHASEGP sistemicamente administrada foi dependente da dose, com uma injeção de 10 unidades sendo indistinguíveis de controle de veículo.

Claims (43)

1. Polipeptídeo de hialuronidase solúvel purificado caracterizado pelo fato de que: o polipeptídeo contém pelo menos uma porção de açúcar que é covalentemente ligada a um resíduo de asparagina (N) do polipeptídeo; o polipeptídeo é neutro ativo; o polipeptídeo é um polipeptídeo PH20 solúvel; e o polipeptídeo consiste na sequência de aminoácidos apresentada como aminoácidos 36-477, 36-478, 36-479, 36-480, 36-481, 36-482 ou 36-483 da SEQ ID NO: 1; e o polipeptídeo é modificado por ser covalentemente ligado a um polímero.

2. Polipeptídeo de hialuronidase purificado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polímero é PEG ou dextrano.

3. Método para a produção de um polipeptídeo de hialuronidase solúvel purificado caracterizado por: introduzir uma molécula de ácido nucleico que codifica um poli- peptídeo, conforme definido na reivindicação 2, operacionalmente ligado a um promotor adequado, em uma célula capaz de incorporar frações de açúcar ligadas a N no polipeptídeo; cultivar a célula em condições em que o polipeptídeo codificado seja expresso pela célula e secretado; e recuperar o polipeptídeo expresso, em que: a molécula de ácido nucleico possui a sequência de nucleotídeos 106-1431, 106-1434, 106-1437, 106-1440, 106-1443, 106-1446, ou 1061449 da SEQ ID NO: 6, e suas sequências degeneradas, que codificam a sequência de aminoácidos apresentada como 36-477, 36-478, 36-479, 36480, 36-481, 36-482 ou 36-483 da SEQ ID NO: 1, respectivamente; o polipeptídeo contém pelo menos uma porção de açúcar que é covalentemente ligada a um resíduo de asparagina (N) do polipeptídeo; o polipeptídeo é neutro ativo; o polipeptídeo é um polipeptídeo PH20 solúvel; e o polipeptídeo consiste na sequência de aminoácidos apresentada como aminoácidos 36-477, 36-478, 36-479, 36-480, 36-481, 36-482 ou 36-483 da SEQ ID NO: 1.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por ainda purificar o polipeptídeo.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 e 4, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico consiste na sequência de nucleotídeos 106-1446 da SEQ ID NO: 6, e suas sequências degeneradas que codificam a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 36-482 da SEG ID NO: 1.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula eucariótica.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a célula eucariótica é selecionada a partir de uma célula de mamífero, uma célula de inseto ou uma célula de levedura.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 7, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula de ovário de hamster chinês (CHO).

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 8, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico está ligada ao ácido nucleico que codifica um sinal de secreção para a secreção do poli- peptídeo codificado.

10. Composição farmacêutica caracterizada por compreender um veículo farmaceuticamente aceitável e um polipeptídeo de hialuronidase PH20 solúvel purificado, em que: o polipeptídeo contém pelo menos uma porção de açúcar que é covalentemente ligada a um resíduo de asparagina (N) do polipeptídeo; o polipeptídeo é neutro ativo; o polipeptídeo é um polipeptídeo PH20 solúvel; o polipeptídeo consiste na sequência de aminoácidos apresentada como aminoácidos 36-477, 36-478, 36-479, 36-480, 36-481, 36-482 ou 36-483 da SEQ ID NO: 1; e o veículo farmacêutico é selecionado do grupo que consiste em solução salina, dextrose aquosa, glicerol, glicóis, etanol, óleos graxos, aglutinantes, lubrificantes, diluentes, agentes desintegrantes, agentes corantes, agentes aromatizantes, agentes umectantes ou emulsificantes, solventes, líquidos não-aquosos, agentes emulsificantes, conservantes, veículos para soluções injetáveis, agentes tamponantes de pH, estabilizadores, vaselina, lanolina, polietilenoglicóis, álcoois, sais metálicos de cálcio e magnésio, albumina e suas combinações.

11. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo consiste nos aminoácidos 36482 da SEQ ID NO: 1.

12. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um agente farmaceutica- mente ativo, em que o agente farmaceuticamente ativo é selecionado dentre um agente quimioterápico, um agente analgésico, um agente anti- inflamatório, um agente antimicrobiano, um agente amebicida, um agente tricomonocida, um agente antiparkinsoniano, um agente antimalárico, um agente anticonvulsivante, um agente antidepressivo, um agente antiartrítico, um agente antifúngico, um agente anti-hipertensivo, um agente antipirético, um agente antiparasitário, um agente anti-histamínico, um agente agonista alfa-adrenérgico, um agente bloqueador alfa, um agente anestésico, um agente brônquio dilatador, um agente biocida, um agente bactericida, um agente bacteriostático, um agente bloqueador beta adrenérgico, um agente bloqueador do canal de cálcio, um agente medicamentoso cardiovascular, um agente contraceptivo, um agente descongestionante, um agente diurético, um agente depressor, um agente de diagnóstico, um agente eletrolítico, um agente hipnótico, um agente hormonal, um agente hiperglicêmico, um relaxante muscular, um agente contratante muscular, um agente oftálmico, um agente parassimpaticomimético, um agente energizador psíquico, um agente sedativo, um agente simpaticomimético, um agente tranquilizante, um agente urinário, um agente vaginal, um agente viricida, um agente vita- mínico, um agente anti-inflamatório não-esteroidal, um agente inibidor da enzima de conversão da angiotensina, um polipeptídeo, uma proteína, um ácido nucleico, um medicamento, uma molécula orgânica e um indutor do sono.

13. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por compreender ainda um agente farmaceuticamente ativo, em que o agente farmaceuticamente ativo é um agente anticâncer selecionado dentre um quimioterápico, um anticorpo, um peptídeo, um vetor de terapia gênica, um vírus ou uma molécula de DNA.

14. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o agente anticâncer é um anticorpo.

15. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

16. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 e 11, caracterizada por ser para uso na administração de uma molécula terapêutica.

17. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 e 11, caracterizada por ser para uso na remoção de um excesso de glicosaminoglicanos ou glicosaminoglicanos acumulados para o tratamento de uma doença ou distúrbio.

18. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o excesso de glicosaminoglicanos ocorre após reperfusão de isquemia, inflamação, arteriosclerose, edema, câncer, lesão medular ou cicatriz.

19. Composição farmacêutica caracterizada por compreender o polipeptídeo de hialuronidase solúvel purificado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 e 2, e ser para uso na administração de uma molécula terapêutica.

20. Composição farmacêutica caracterizada por compreender o polipeptídeo de hialuronidase solúvel purificado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 e 2, e ser para uso na remoção de um excesso de glicosaminoglicanos ou glicosaminoglicanos acumulados para o tratamento de uma doença ou distúrbio.

21. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que o excesso de glicosaminoglicanos ocorre após reperfusão de isquemia, inflamação, arteriosclerose, edema, câncer, lesão medular ou cicatriz.

22. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por ser para utilização no tratamento de um tumor, em que a composição compreende ainda um agente anticâncer selecionado dentre um quimioterápico, um anticorpo, um peptídeo, um vetor de terapia gênica, um vírus ou uma molécula de DNA.

23. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que o agente anticâncer é um anticorpo.

24. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

25. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 e 24, caracterizada pelo fato de que o tumor é um câncer de mama.

26. Molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de hialuronidase PH20 solúvel, caracterizada pelo fato de que possui a sequência de nucleotídeos 106-1431, 106-1434, 106-1437, 106-1440, 1061443, 106-1446, ou 106-1449 da SEQ ID NO: 6, e suas sequências degene-radas, que codificam a sequência de aminoácidos apresentada como ami- noácidos 36-477, 36-478, 36-479, 36-480, 36-481, 36-482 ou 36-483 da SEQ ID NO: 1, respectivamente.

27. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo é produzido pela expressão da molécula de ácido nucleico em um sistema de expressão de mamífero.

28. Molécula de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 e 27, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo é produzido pela expressão da molécula de ácido nucleico a partir de uma célula CHO.

29. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que possui a sequência de nucleotídeos apresen- tada como nucleotídeos 106-1446 da SEQ ID NO: 6.

30. Molécula de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 29, caracterizada pelo fato de que inclui uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de sinal para secreção do poli- peptídeo codificado, em que a sequência de sinal é um peptídeo líder da cadeia kappa de IgG, que possui a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 43.

31. Vetor caracterizado por compreender uma molécula de ácido nucleico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 26 a 30, em que o vetor codifica o polipeptídeo PH20 solúvel.

32. Vetor, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pela sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 51.

33. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 e 32, caracterizado por ser um vetor de expressão.

34. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 33, caracterizado por ser um vetor eucariótico.

35. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 33, caracterizado por ser um vetor de E. coli ou um vetor viral.

36. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 33, caracterizado por ser um vetor de Pichia, um vetor de E. coli ou um vetor viral.

37. Célula isolada caracterizada por compreender um vetor, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 31 a 33 e 35, em que a célula é uma célula procariótica.

38. Célula, de acordo com a reivindicação 37, caracterizada por ser uma célula bacteriana.

39. Método para produzir um polipeptídeo de hialuronidase solúvel purificado, caracterizado por: introduzir uma molécula de ácido nucleico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 26 a 30, operacionalmente ligada a um promotor ou um vetor, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 31 a 36, em uma célula que incorpora frações de açúcar ligadas a N no polipeptídeo; e cultivar a célula em condições em que um polipeptídeo codificado seja expresso e secretado pela célula; e recuperar o(s) polipeptídeo(s) expresso(s).

40. Método, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que a célula é selecionada a partir de uma célula de mamífero, uma célula de inseto, uma célula de levedura e uma célula vegetal.

41. Método, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula de ovário de hamster chinês (CHO).

42. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 39 a 41, caracterizado pelo fato de que as células são cultivadas na presença de 0,1-1 mM de butirato de sódio sob condições adequadas para a produção do polipeptídeo.

43. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 39 a 42, caracterizado pelo fato de que a etapa de recuperação do(s) polipeptí- deo(s) expresso(s) compreende: colocar o meio contendo o(s) polipeptídeo(s) expresso(s) em contato, sob baixa força iônica, com uma resina de troca aniônica em pH neutro; eluir o polipeptídeo com cerca de 400 mM de sal; colocar o polipeptídeo em contato com uma resina de cromatogra- fia de interação hidrofóbica, na presença de cerca de 0,5 M de sulfato de amônio; colocar o polipeptídeo em sulfato de amônio em contato com uma resina de boronato de fenila; eluir o polipeptídeo em baixo teor de sal a pH neutro; colocar o polipeptídeo em contato com uma resina de hidroxiapati- ta; e eluir o polipeptídeo com cerca de 100 mM de fosfato de sódio, resultando assim em um polipeptídeo que é purificado.

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