ITUB20159209A1 - Nanosistemi per il trasporto controllato di molecole attive a fini diagnostici, prognostici e terapeutici - Google Patents

Nanosistemi per il trasporto controllato di molecole attive a fini diagnostici, prognostici e terapeutici Download PDF

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ITUB20159209A1
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IT
Italy
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nanoparticles
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carbon chain
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synthetic
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ITUB2015A009209A
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English (en)
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Martin Rosario Maria Sanchez
Salvatore Pernagallo
Broceta Juan Diego Unciti
Luciano Messina
Susanna Vaccaro
Laura Pilotto
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Fidia Farm Spa
Nanogetic S L
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Description

“NANOSISTEMI PER IL TRASPORTO CONTROLLATO DI MOLECOLE ATTIVE A LINI DIAGNOSTICI, PROGNOSTICI E TERAPEUTICI”
L'invenzione riguarda un sistema nanoparticellare costituito da un supporto o substrato polimerico in forma di nanoparticelle alle quali sono legati covalentemente un enzima idrolasi capace di degradare l'acido ialuronico e una o più molecole biologicamente e/o farmacologicamente attive, il suo processo di preparazione ed i suoi usi in ambito diagnostico, prognostico e terapeutico.
Stato della tecnica
L’impiego di nanoparticelle per la veicolazione di farmaci tramite il sistema circolatorio è una tecnica nota, che sta diventando sempre più diffusa anche grazie agli importanti progressi tecnologici nel settore. Essa offre infatti notevoli vantaggi se confrontata con le tradizionali modalità di somministrazione; le nanoparticelle iniettate all’ interno del canale sanguigno, sospinte da azioni emodinamiche, raggiungono la zona sede del processo patologico e, in seguito alla loro adesione alle pareti della cellula “malata,” rilasciano il farmaco localmente e nella dose richiesta; hanno dunque un’azione estremamente selettiva. Le nanoparticelle sono, per l’appunto, particelle di dimensioni dell’ordine dei nanometri e generalmente sono costituite da una struttura portante che accoglie il farmaco o, in senso più generale, una molecola attiva; le nanoparticelle vanno progettate in modo che, indipendentemente dalla via di somministrazione prescelta, il rilascio del farmaco ad esse associato sia calibrato sia in termini qualitativi che quantitativi così da avere:
a) elevata selettività, riconoscendo ed agendo esclusivamente sulle cellule malate o, in generale, nel sito di interesse;
b) elevata efficacia, in modo da impiegare la minima quantità efficace di molecola attiva;
c) bassa tossicità, come diretta conseguenza del punto b).
Gli studi finora fatti per la valutazione di sistemi nanoparticellari hanno dimostrato che essi rappresentano, in vitro, un’efficace via di somministrazione dei farmaci e/o molecole attive; tuttavia bisogna considerare, in vivo , la capacità delle nanoparticelle di superare le barriere che ciascuna via di somministrazione presenta, senza dimenticare il volume di distribuzione necessario a raggiungere l’effetto terapeutico e soprattutto la tossicità che ne potrebbe derivare; pertanto le dimensioni, il tipo e la composizione di queste particelle vanno esattamente tarate in relazione alle applicazioni previste. Per le vie di somministrazione più comuni (orale, iniettiva) le criticità più forti sono legate al fatto che le nanoparticelle possono liberare troppo o troppo poco principio attivo, diventando tossiche nel primo caso ed inutili nel secondo; dopo somministrazione per os c’è inoltre l’effetto di primo passaggio epatico, che può incidere fortemente sul valore della concentrazione ematica necessaria all’attività farmacologica.
La necessità di controllare in modo più diretto e ottimizzare la concentrazione del farmaco nel sangue ha portato allo sviluppo di sistemi di somministrazione alternativi attraverso la cute (via transdermica) o le mucose (via transmucosale, che comprende le vie sottolinguale/buccale, nasale, tracheale, rettale). I sistemi citati permettono di introdurre il farmaco rapidamente nel circolo sanguigno superando i rischi e le difficoltà sopra descritti dato che sia la cute che le mucose hanno elevata densità di vasi sanguigni i quali consentono una rapida diffusione del farmaco a livello sistemico. Anche in questi casi va comunque considerata la naturale barriera che le nanoparticelle devono superare; per esempio, la via transcutanea prevede che le nanoparticelle penetrino la cute e tale problema è stato fino ad oggi affrontato ipotizzando una co-somministrazione del farmaco con enzimi capaci di favorire tale passaggio, quali, ad esempio la ialuronidasi. Quest’ultima è in grado di idrolizzare l’acido ialuronico presente nei tessuti, depolimerizzando la struttura viscoelastica della matrice interstiziale sottocutanea ed aumentando cosi la dispersione delle nanoparticelle iniettate localmente (Bookbinder et al., J Contr Rei 2006,28, 230-241). Sono già note alcune soluzioni tecniche che associano un principio attivo alla ialuronidasi e a polimeri liberi o organizzati in micro- o nano particelle; tali soluzioni sono tuttavia caratterizzate dal fatto che i vari componenti sono miscelati tra loro o al più le nanoparticelle inglobano i principi attivi e/o l’enzima ialuronidasi, che vengono inseriti nelle particelle durante il processo di formazione (WO201 3151774; US2013302400; Rajan et al., Ini J Pharmac, 2013, 453, 514-522). È evidente che in questo modo non si può dosare esattamente l’insieme degli ingredienti per ottenere un rilascio del principio attivo in modo costante, continuo, alle massime dosi terapeutiche e con la minima tossicità. In ogni caso, si tratta di soluzioni che non assicurano che farmaco e particella rimangano legati fino al raggiungimento della loro sede d’azione.
Descrizione dell'invenzione
La presente invenzione supera le problematiche ad oggi esistenti mediante Γ impiego di nanoparticelle già strutturate alle quali vengono legati con legame covalente una o più sostanze attive, in quantità calcolate ai fini dell’espletamento della funzione desiderata, e l’enzima ialuronidasi, che ha la funzione di favorirne la penetrazione.
Descrizione delle figure
Figura 1. Struttura schematica del nanosistema dell'invenzione costituito da un core polimerico (nanoparticella) legato a una catena carboniosa ramificata contenente uno o più gruppi adatti per il legame covalente di molecole attive.
Figura 2. Schema esemplificativo per l’attacco covalente della rHyal_sk alle nanoparticelle polistireniche da 200 nm.
Figura 3. Grafico raffigurante i risultati dell’attività enzimatica della rHyal_sk legata covalentemente alle nanoparticelle (saggio turbidimetrico). Il grafico permette di conoscere le unità di HYAL accoppiati alle nano particelle.
Figura 4. Schema raffigurante la bi-funzionalizzazione covalente delle nanoparticelle con rHyal_Sk e fluoroforo o farmaco.
Figura 5. Schema raffigurante la bi-funzionalizzazione covalente delle nano particelle con rHyal_Sk e anticorpo (Ab).
Figura 6. Validazione dei nanosistemi marcati con Cy 5 e Cy7. a) Struttura chimica generale; b) microscopia fluorescente dei nano sistemi marcati rispettivamente con Cy5 e Cy7 ; c) dati di citofluorimetria a flusso delle dei nanosistemi marcati con Cy5 e Cy7.
Figura 7. Grafico raffigurante i risultati dell’attività enzimatica dei nanosistemi bi-funzionalizzazione con rHyal_Sk e fluorofori (Cy5 e Cy7) (saggio turbidimetrico).
Descrizione dettagliata dell’invenzione
Il sistema nanoparticellare dell'invenzione è costituito da un supporto o substrato polimerico in forma di nanoparti celle alle quali sono legati covalentemente un enzima idrolasi capace di degradare l'acido ialuronico (ialuronidasi) ed una o più molecole biologicamente e/o farmacologicamente attive, il suo processo di preparazione ed i suoi usi in ambito diagnostico, prognostico e terapeutico.
Le nanoparticelle oggetto dell’invenzione, in virtù del tipo di legame con cui sono ad esse ancorate le molecole di interesse, rappresentano un innovativo sistema per il trasporto ed il rilascio controllato e calibrato di principi attivi, che garantisce simultaneamente elevata selettività, alta efficacia e bassa tossicità.
A differenza di quanto ad oggi noto, tutte le componenti del sistema nanoparticellare secondo l'invenzione sono combinate attraverso legami covalenti stabili a formare un unico nano sistema con attività ialuronidasica capace di legare e trasportare altre molecole funzionalmente attive; esse perciò non sono più fra loro meccanicamente separabili e funzionano come un tutto unico. Il nanosistema qui descritto è costituito da un core polimerico (nanoparticella) legato ad una catena eterocarboniosa ramificata contenente uno o più gruppi adatti a legare i componenti attivi di interesse, al fine di formare un’unica entità molecolare attiva, la cui struttura è schematizzata in Figura 1.
Core polimerico
Il core polimerico in forma di nanosfera è costituito da polimeri o copolimeri naturali o sintetici comprendenti gruppi funzionali in grado di reagire con gruppi funzionali della catena etero carboniosa. Esempi di polimeri comprendono polistirene (PS) funzionalizzato con gruppi amminici, acido polilattico (PLA), acido polilattico co-glicolico (PLGA), poli(N-vinilpirrolidone) (PVP), polietilen glicol (PEG), policaprolattone, acido poliacrilico (PAA), poli metil metacrilato, poliacrilammide. Esempi di polimeri naturali impiegabili nella preparazione delle nano particelle comprendono chitosano, gelatina, sodio alginato e albumina. Particolarmente adatto agli scopi delfinvenzione è il polistirene funzionalizzato con gruppi amminici, ottenibili ad esempio secondo un processo di polimerizzazione in dispersione (Sanchez-Martin et al, 2005, ChemBioChem, 6,1341-1345) fra soluzioni acquose di: a) stirene come monomero principale; b) divinilbenzene (DVB), un agente reticolante contenente due gruppi vinilici; c) vinilbenzilammina cloridrato (VBAH) come secondo monomero contenente un gruppo aminico. La reazione è condotta a 80°C in atmosfera inerte e di solfato di magnesio come agente stabilizzante. Dopo 30 minuti dall’inizio della reazione, viene aggiunto un iniziatore radicalico idrosolubile, il 2-diidrocloruro-2'-azobis-(2-metilpropionamide) (V-50). La reazione è proseguita per altre 2 ore sotto agitazione. Si ottengono in tal modo nanoparticelle di dimensioni variabili tra 50 e 2000 nanometri. Sono preferite nanoparticelle polistireniche di dimensioni comprese tra 100 e 500 nm ed in particolare pari a 200 nm. La sintesi descritta è stata ottimizzata per ottenere nanoparticelle di 200 nm funzionalizzate con gruppi amminici. Il controllo delle dimensioni e la dispersione delle nanoparticelle sono state condotte mediante diffrattometria laser [Dynamic Light Scattering (DLS) Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments] e microscopio elettronico a scansione (SEM, Hitachi, S-510).
Catena eterocarboniosa
La catena eterocarboniosa ramificata, per semplicità detta “catena carboni osa”, contiene uno o più gruppi adatti a formare un legame covalente con molecole attive e contemporaneamente genera uno spazio tra la nanoparticella e dette molecole. Si tratta di catene a lunghezza variabile aventi gruppi in grado di formare legami covalenti, in particolare gruppi ortogonali tra loro, cioè che si deproteggono con procedure diverse durante la sintesi. La loro presenza migliora la biocompatibilità e diminuisce le interazioni tra la nanoparticella e le molecole attive aumentando la stabilità e la funzionalità di queste ultime. Esempi di dette catene comprendono catene sature con un numero di carboni tra 6 e 24; catene di glicoli metossipolietilenici; catena di dimetil suberimidato; catene di glicoli polialchilici, in particolare polietilenglicoli, tra i quali particolarmente preferita è la catena N-Fmoc-N-succinil-4,7,10-triossa-l,13-tridecanediammina (PEG spacer). La lunghezza della catena può inoltre essere modificata in base alle esigenze (ingombro sterico delle molecole che si andranno a legare, condizioni di reazione, etc) tramite l'aggiunta di distanziatori; in generale si impiegano a questo scopo catene di polietilenglicole (PEG).
Sostituenti: Gruppo X
Il gruppo X (Figura 1) rappresenta la componente enzimatica (ialuronidasi), che può essere di derivazione umana o animale, da vertebrati, batterica o ottenuta in forma ricombinante. E’ preferita la ialuronidasi ottenuta per fermentazione batterica o per via ricombinante, ad esempio la ialuronidasi da Streptomyces koganeiensis ATCC 31394, nella sua forma ricombinante prodotta secondo WO2014203133 (rHyal_3⁄4). Questa ialuronidasi è molto stabile ed adeguata ai processi necessari per la coniugazione covalente alle nanoparticelle. La presenza della ialuronidasi nel gruppo X conferisce al sistema una capacità idrolitica specifica per l'acido ialuronico.
Sostituenti: Gruppi Y e Z
Essi rappresentano la parte variabile del sistema; sono infatti diversi a seconda delle applicazioni previste per il sistema nanoparticellare. In accordo con l'invenzione, per “molecole attive” si intendono sia piccole molecole sia strutture molecolari complesse (vaccini, anticorpi, etc). In generale, il gruppo Y rappresenta le molecole attive, che possono essere farmaci veri e propri di derivazione naturale (quali ad esempio alcuni antitumorali 5-fluorouracile, gemcitabina, doxorubicina, etc), semisintetici, sintetici, ricombinanti, agenti diagnostici, agenti radioattivi, anticorpi, nano-anticorpi di cammelli, sostanze biologicamente attive quali enzimi (per esempio, superossido dismutasi umana, collagenasi batterica nativa e/o modificata), proteine, peptidi, ormoni, fattori di crescita, fattori della coagulazione, citochine, coloranti, fluorofori (per esempio, Cy3, Cy5, Cy7, fluoresceina, rodamina, naftofluoresceina,etc) ed in generale qualsiasi sostanza attiva che possa subire una coniugazione con legame covalente. Il gruppo Z può essere idrogeno (-H), una catena alchilica, una catena di polietilenglicole, gruppi solfonici, molecole direzionali (anticorpi, catene peptidiche, acidi nucleici, polinucleotidi, oligonucleotidi senso e antisenso, coniugati molecolari contenenti RNA o DNA, RNA solubile in acqua, vettori di DNA, vaccini naturali, sintetici o ricombinanti) e altri ligandi specifici (definiti anche in questo caso “molecole attive”) per conferire proprietà selettive al nanosistema.
I gruppi Y e Z sono variamente combinabili tra loro, in relazione all’ effetto che si vuole conferire al sistema nano particellare, alla sua destinazione ed al suo impiego.
Per le coniugazioni covalenti possono essere usati diversi gruppi funzionali e metodiche note, quali per esempio legami mediati da molecole di glutaraldeide, esteri attivi, legami via maleimide, gruppi disolfurici e acido squarico. Per il legame con la ialuronidasi è particolarmente preferito il legame via dietilsquarato.
Schematicamente, il processo di preparazione del sistema nano particellare dell'invenzione comprende:
1. funzionalizzazione delle nanoparticelle, preferibilmente di polistirene, con gruppi funzionali adatti, in modo particolare gruppi amminici (-NH2) primari o terziari, gruppi carbossilici, gruppi epossidici, preferibilmente gruppi amminici;
2. funzionalizzazione delle particelle cosi ottenute con la catena eterocarboniosa opportunamente scelta, che grazie ai gruppi ortogonali di cui è dotata permette le funzionalizzazioni successive in modo preciso e selettivo; in questo modo infatti le nanoparticelle vengono dotate di due bracci temporaneamente protetti, pronti, dopo la deprotezione selettiva, ad accogliere le molecole attive;
3. funzionalizzazione della nanoparticella con ialuronidasi, preferibilmente di tipo ricombinante rHyal_3⁄4 (gruppo X), in un ambiente di reazione con valori di pH compresi tra 7 e 11, ed in modo particolare a pH=10, ed attraverso un legame covalente preferibilmente via dietilsquarato, A tale valore di pH si hanno infatti rese significative ai fini di uno scale up industriale (Figura 3).
4. funzionalizzazione della nanoparticella con una o due molecole attive opportunamente scelte, sino ad ottenere il sistema dell'invenzione.
I punti 3. e 4. del processo così schematizzato possono essere invertiti, in relazione alle dimensioni, alla natura delle molecole ed alla loro stabilità alle condizioni del processo stesso.
Un ulteriore oggetto deH'invenzione è costituito da composizioni farmaceutiche comprendenti i sistemi nanoparticellari così ottenuti in miscela con eccipienti farmaceuticamente accettabili. Le composizioni dell’ invenzione sono tipicamente in forma liofilizzata per la ricostituzione, di sospensione acquosa o di gel e possono essere somministrate per via sottocutanea, intradermica, intratecale, intramuscolare, intraperitoneale, endovenosa, intraarteriosa, transdermica, transcutanea, transmucosale e inalatoria.
L'invenzione è descritta in dettaglio nei seguenti esempi.
ESEMPIO 1 - Funzionalizzazione delle nanoparticelle con ialuronidasi rHyal_Sk,
1. 1 mL di nanoparticelle ammino funzionalizzate (contenuto solido 2% in acqua) sono state centrifugate a 13400 rpm per 6 minuti, il surnatante è stato rimosso e le nanoparticelle risospese per sonicazione in 1 mL di Ν,Ν-dimetilformammide (DMF peptide grade, Scharlab).
2. N-Fmoc-N"-succinil-4,7,10-triossa-l,13-tridecane-diammina (PEG spacer, Sigma Aldrich) (75 equivalenti) in DMF è stato miscelato insieme a 75 equivalenti di ossime (VWR) per 4 minuti a temperatura ambiente con agitazione continua (1400 rpm). Successivamente, sono stati aggiunti 75 equivalenti di Ν,Ν'-diisopropilcarbodiimmide (DIC, Fluorochem) e il tutto è stato posto sotto agitazione (1400 rpm) per 2 minuti a temperatura ambiente.
3. Quest’ ultima soluzione (punto 2) è stata aggiunta alle nanoparticelle (punto 1) e il tutto è stato lasciato reagire mediante sonicazione e agitazione (1400 rpm) a 60°C per 2 ore [Figura 2 (i)].
4. le nanoparticelle sono state quindi centrifugate, il surnatante rimosso e lavate con DMF (1 mL x 2). Dopo i lavaggi il gruppo Fmoc è stato rimosso utilizzando una soluzione al 20% di piperidina (Sigma Aldrich) in DMF (peptide grade, Scharlab) (1 mL x 2)[Figura 2 (ii)].
5. A seguito della deprotezione, le nanoparticelle sono state centrifugate a 13400 rpm per 6 minuti, il surnatante è stato rimosso e le nanoparticelle sono state risospese mediante sonicazione in 1 mL di una soluzione al 1% di N, N -diisopropiletilamina (DIPEA, Sigma Aldrich) in etanolo assoluto (Scharlab), acqua (1:1) (V / V). Quindi, sono stati aggiunti 75 equivalenti di 3,4-dietossi-3-ciclobutene-l,2-dione (dietilsquarato, Sigma Aldrich) e lasciati reagire sotto agitazione (1400 rpm) a 25°C per 15 ore [Figura 2 (iii)].
6. Le nano particelle ottenute sono state quindi centrifugate, e lavate con acqua deionizzata dopo rimozione del surnatante (1 mL x 2).
Successivamente, le nanoparticelle (punto 6) sono state nuovamente centrifugate, il surnatante è stato rimosso e le nanoparticelle sono state risospese in una soluzione 50 mM di borato di sodio (1 mL) contenente 100 pg di rHyal_Sk [Figura 2 (iv)]. Le nanoparticelle sono state disperse attraverso sonificazione e aggiunte di una soluzione IN di NaOH per mantenere un ambiente a pH 10.
La sospensione finale è lasciata reagire sotto agitazione (1400 rpm) a 25 °C per ulteriori 15 ore. Le nanoparticelle sono state quindi centrifugate, il surnatante rimosso e le nanoparticelle sono state lavate con: (1) un buffer PBS 1 X a pH 7,4 (1 mL) e quindi (2) una soluzione al 1% di albumina sierica bovina (BSA, Sigma) e 40 mM etanolamina (Sigma) in buffer PBS (1 mL). Le nanoparticelle sono state conservate in un buffer PBS 1 X a pH 7, a 4°C (1 mL).
ESEMPIO 2 - Bifunzionalizzazione di nanoparticelle con ialuronidasi (rHyal_Sk) e un fluoroforo (Cy5).
Aggiunta alle nanoparticelle della catena carboniosa N-Fmoc-N"-succinil-4,7,10-triossa-l,13-tridecane-diammina
1. 1 mL di nano particelle ammino funzionalizzate (contenuto solido 2% in acqua), preparate come precedentemente descritto, sono state centrifugate a 13400 rpm per 6 minuti, il surnatante è stato rimosso e le nano particelle risospese per sonicazione in 1 mL di N,N-dimetilformammide (DMF peptide grade, Scharlab).
2. N-Fmoc-N"-succinil-4,7,10-triossa-l,13-tridecan-diammina (PEG spacer, Sigma Aldrich) (75 equivalenti) in DMF è stato miscelato insieme a 75 equivalenti di ossime (VWR) per 4 minuti a temperatura ambiente con agitazione continua (1400rpm). Successivamente, sono stati aggiunti 75 equivalenti di Ν,Ν'-diisopropilcarbodiimmide (DIC, Fluorochem), e il tutto è stato posto sotto agitazione (1400 rpm) per 2 minuti a temperatura ambiente.
3. La soluzione di cui al punto 2 è stata cosi aggiunta alle nanoparticelle (punto 1) e il tutto è stato lasciato reagire mediante sonicazione e agitazione (1400 rpm) a 60°C per 2 ore [Figura 4 (i)].
4. le nanoparticelle sono state QUINDI centrifugate e, rimosso il surnatante, lavate con DMF (1 mL x 2). Dopo i lavaggi si è proceduto alla deprotezione del gruppo Fmoc utilizzando una soluzione al 20% di piperidina (Sigma Aldrich) in DMF (peptide grade, Scharlab) (1 mL x 2) [Figura 4 (ii)].
5. A seguito della deprotezione, le nanoparticelle sono state centrifugate, il surnatante è stato rimosso e le nanoparticelle sono state lavate con DMF (1 mL x 2), metanolo (synthesis grade, Scharlab) (1 mL x 2), Le nanoparticelle sono state conservate in acqua deionizzata (1 mL) a 4°C.
Bi-funzionalizzazione con i gruppi Fmoc e Dde
6. 1 mL di nanoparticelle con PEG spacer(contenuto solido 2% in acqua)(punto 5) sono state centrifugate a 13400 rpm per 6 minuti, il surnatante è stato rimosso e le nanoparticelle sono state risospese per sonicazione in 1 mL di DMF.
7. Fmoc-Lys (Dde)-GH (GLBiochem) (75 equivalenti) in DMF sono stati miscelati insieme a 75 equivalenti di ossime (VWR) per 4 minuti a temperatura ambiente con agitazione continua (1400 rpm). Successivamente, sono stati aggiunti 75 equivalenti di DIC (Fluorochem) e il tutto è stato posto in agitazione (1400 rpm) per 2 minuti a temperatura ambiente.
8. Quest’ ultima soluzione (punto 7) è stata aggiunta alle nanoparticelle (punto 5) e lasciata reagire mediante sonicazione e agitazione (1400 rpm) a 60°C per 2 ore [Figura 4 (iii)].
9. Successivamente, le nanoparticelle sono state centrifugate e, rimosso il surnatante, lavate con DMF (1 mL x 2). Dopo i lavaggi il gruppo Fmoc è stato rimosso con una soluzione al 20% di piperidina in DMF anidro (1 mL x 2),
10. Successivamente, si è proceduto all’aggiunta di un PEG spacer sulla posizione precedentemente protetta dal gruppo Fmoc ripetendo i passaggi descritti nei punti 1-4 [Figura 4 (iv-v)].
Coniugazione del fluoroforo Cv5 alle nano particelle
11. 1 mF di nanoparticelle bi-funzionalizzate con Fmoc e Dde preparate come descritto nei punti 1-10 (contenuto solido 2% in acqua) sono state centrifugate a 13400 rpm per 6 minuti, il surnatante è stato rimosso e le nanoparticelle sono state risospese per sonicazione in 1 mF di DMF. Il gruppo Dde è stato poi deprotetto selettivamente mediante trattamento con idrossilammina cloridrato (1,80 mmol) (Acros)/imidazolo (1,35 mmoli) (Acros) in NMP:DMF (5:1) e agitazione (1400 rpm) a 25°C per 1 ora. Quindi, sono stati aggiunti 75 equivalenti di solfo-NHS estere Cy5 (Fumiprobe) e lasciati a reagire sotto agitazione (1400 rpm) a 25°C per 15 ore al buio [Figura 4 (vi-vii)].
12. Dopo 15 ore di reazione, le nanoparticelle sono state centrifugate, il surnatante rimosso e le nanoparticelle sono state lavate con DMF (1 mi x 2). Infine le nanoparticelle sono state conservate in acqua deionizzata (1 mF) a 4°C.
Coniugazione di rHval Sk alle nano particelle
13. Una volta coniugate le nanoparticelle con Cy5, si è proceduto alla deprotezione del gruppo Fmoc. Fe nanoparticelle, sono state centrifugate, il surnatante rimosso e lavate con DMF (1 mi x 2). Dopo i lavaggi il gruppo Fmoc è stato rimosso utilizzando una soluzione al 20% di piperidina in DMF (1 mi x 2) [Figura 4 (viii)].
14. A seguito della deprotezione, le nanoparticelle sono state centrifugate a 13400 rpm per 6 minuti, il surnatante è stato rimosso e le nanoparticelle sono state risospese mediante sonicazione in 1 mL di una soluzione al 1% di N, N -diisopropiletilamina (DIPEA, Sigma Aldrich) in etanolo assoluto (Scharlab), acqua (1:1) (V/V). Quindi, sono stati aggiunti 75 equivalenti di 3,4-dietossi-3-ciclobutene-l,2-dione (dietilsquarato, Sigma Aldrich) e lasciati reagire sotto agitazione (1400 rpm) a 25°C per 15 ore al buio [Figura 4 (ix)].
15. Dopo le 15 ore di reazione, le nanoparticelle sono state centrifugate e lavate con acqua deionizzata dopo rimozione del surnatante (1 mL).
Successivamente, le nanoparticelle (punto 15) sono state nuovamente centrifugate, il surnatante è stato rimosso e le nanoparticelle sono state risospese in una soluzione 50 mM di borato di sodio (1 mL) contenente 100 pg di rHyal_Sk [Figura 4 (x)]. Le nano particelle sono state disperse attraverso sonificazione e aggiunte di una soluzione IN di NaOH per mantenere un ambiente a pH=10. La sospensione finale è lasciata reagire sotto agitazione (1400 rpm) a 25 °C per ulteriori 15 ore al buio. Dopo le 15 ore di reazione, le nanoparticelle sono state centrifugate, il surnatante rimosso e le nanoparticelle sono state lavate con: (1) un buffer PBS 1 X a pH 7,4 (1 mL) e a seguire (2) una soluzione al 1% di albumina sierica bovina (BSA, Sigma) e 40 mM etanolamina (Sigma) in buffer PBS (1 mL). Per finire le nanoparticelle sono state conservate in un buffer PBS 1 X a pH 7, a 4°C (1 mL).
Mediante le identiche modalità descritte è possibile legare il fuoroforo Cy7, ottenendo analogo risultato.
ESEMPIO 3 - Bifunzionalizzazione di nanoparticelle con rHyal_Sk e Capecitabina.
Aggiunta della catena carboniosa N-Fmoc-N''-succinyl-4,7,10-trioxa-1, 13-tridecane-diamine alle nanoparticelle
Vedi: Esempio 2, punti 1-5
Bi-funzionalizzazione con i gruppi Fmoc e Dde
Vedi: Esempio 2, punti 6-10
Coniugazione di capecitabina alle nanoparticelle
11. 1 mL di nanoparticelle bi-funzionalizzate (con Fmoc e Dde) preparate come descritto nei punti 1-10 (contenuto solido 2% in acqua) sono state centrifugate a 13400 rpm per 6 minuti, il surnatante è stato rimosso e le nanoparticelle sono state risospese per sonicazione in 1 in E di DMF. Il gruppo Dde è stato quindi deprotetto selettivamente mediante trattamento con idrossilammina cloridrato (1,80 mmol)/ imidazolo (1,35 mmoli) in NMP:DMF (5:1) e agitazione (1400 rpm) a 25°C per 1 ora [Figura 4 (vi)]. Si è quindi aggiunta una soluzione equimolare di anidride succinica (75 equivalenti) e DIPEA (75 equivalenti) e dispersa mediante sonicazione e agitazione (1400 rpm) a 60°C per 2 h. Infine, le nano particelle sono state lavate con DMF (1 mL x 2).
12. Le nanoparticelle così ottenute (succinico-NP) sono state attivate attraverso l’incubazione con 200 pL di una soluzione equimolare di ossima (50 equivalenti) e DIC (50 equivalenti) per 4 ore, a temperatura ambiente e agitando a 1400 rpm. Si è quindi aggiunta capecitabina (Sigma Aldrich) (1 equivalente, 1 mg/100 L DMF) e DMAP (Sigma) (0,5 mL), il tutto sotto agitazione (1400 rpm) a temperatura ambiente per 12 ore [Figura 4 (vii). Dopo la reazione, le nanoparticelle sono state centrifugate e lavate con DMF (1 mL x 2), metanolo (1 mL x 2) dopo rimozione del surnatante. Le nanoparticelle sono state conservate in acqua deionizzata (1 mL) a 4°C.
Coniugazione di rHval Sk alle nanoparticelle
13. Una volta coniugate le nanoparticelle con la capecitabina, si procede alla deprotezione del gruppo Fmoc. Le nanoparticelle sono state centrifugate e lavate con DMF (1 mL x 2), dopo rimozione del surnatante. Dopo i lavaggi il gruppo Fmoc è stato rimosso utilizzando una soluzione al 20% di piperidina in DMF anidro (1 mL x 2) [Figura 4 (viii)] .
14. A seguito della deprotezione, le nanoparticelle sono state centrifugate a 13400 rpm per 6 minuti, il surnatante è stato così rimosso e le nanoparticelle sono state risospese mediante sonicazione in 1 mL di una soluzione al 1% di N, N-diisopropiletilamina in DIPEA in etanolo: acqua (1:1) (V/V). Quindi, sono stati aggiunti 75 equivalenti di 3,4-dietossi-3-ciclobutene-1,2-dione (dietilsquarato, Sigma Aldrich) e il tutto è stato lasciato a reagire sotto agitazione (1400 rpm) a 25°C per 15 ore [Figura 4 (ix)].
15. Dopo 15 ore di reazione, le nanoparticelle sono state centrifugate, il surnatante rimosso e le nanoparticelle sono state lavate con acqua deionizzata (1 mL).
16. Successivamente, le nanoparticelle (punto 15) sono state nuovamente centrifugate, il surnatante rimosso e risospese in una soluzione 50 mM di borato di sodio (1 mL) contenente 100 pg di rHyal_Sk. Le nanoparticelle sono state disperse attraverso sonificazione e aggiunte di una soluzione IN di NaOH per mantenere un ambiente a pH=10. Così, la sospensione finale è stata lasciata reagire sotto agitazione (1400 rpm) a 25°C per ulteriori 15 ore al buio [Figura 4 (x)]. Dopo le 15 ore di reazione, le nano particelle, sono state centrifugate, il surnatante rimosso e lavate con: un buffer PBS 1 X a pH 7,4 (1 mL) e quindi con una soluzione al 1% di albumina sierica bovina (BSA) e 40 mM etanolamina in buffer PBS (1 mL). Le nanoparticelle sono state conservate in un buffer PBS 1 X a pH 7, a 4°C (1 mL).
ESEMPIO 4 - Bifunzionalizzazione di nanoparticelle con rHyal_Sk e un anticorpo a nti-EGF Receptor.
Aggiunta della catena carboniosa N-Fmoe-N-succinil-4,7,10-triossa-L 13-tridecan-diammina alle nanoparticelle
Vedi: Esempio 2, punti 1-5
Bi-funzionalizzazione con i gruppi Fmoc e Dde
Vedi: Esempio 2, punti 6-10
Coniugazione di rHyal Sk alle nano particelle
11. 1 mL di nanoparticelle bi-funzionalizzate(con Fmoc e Dde) preparati come descritto nei punti 1-9 (contenuto solido 2% in acqua) sono state centrifugate a 13400 rpm per 6 minuti, il surnatante è stato rimosso e le nanoparticelle risospese per sonicazione in 1 mL di DMF. Il gruppo Dde è stato quindi selettivamente deprotetto mediante trattamento con idrossilammina cloridrato (1,80 mmol)/Imidazolo (1,35 mmoli) in NMP:DMF (5: 1) e agitazione (1400 rpm) a 25 °C per 1 ora [Figura 5 (vi)]. Le nano particelle sono state quindi centrifugate a 13400 rpm per 6 minuti, il surnatante è stato rimosso e le nanoparticelle risospese mediante sonicazione in 1 mL di una soluzione al 1% di Ν,Ν-diisopropiletilamina (DIPEA) in etanolo: acqua (1:1)(V/V). Quindi, sono stati aggiunti 75 equivalenti di 3,4-dietossi-3-ciclobutene-l,2-dione (dietilsquarato, Sigma Aldrich) e lasciati reagire sotto agitazione (1400 rpm) a 25 °C per 15 ore [Figura 5 (vii)].
12. Dopo le 15 ore di reazione, le nanoparticelle sono state centrifugate, lavate con acqua (1 mL) dopo rimozione del sur natante.
13. Successivamente, le nanoparticelle (punto 12) sono state centrifugate, il surnatante rimosso e le nanoparticelle sono state risospese in una soluzione 50 mM di borato di sodio (1 mL) contenente 100 pg di rHyal_Sk [Figura 5 (viii)]. Le nanoparticelle sono state disperse attraverso sonificazione e aggiunte di una soluzione IN di NaOH per mantenere un ambiente a pH=10. Così, la sospensione finale è lasciata reagire sotto agitazione (1400 rpm) a 25°C per ulteriori 15 ore al buio.
14. Dopo le 15 ore di reazione, le nanoparticelle sono state centrifugate, il surnatante rimosso e lavate con un buffer PBS 1 X a pH 7,4 (1 mL) e poi con una soluzione al 1% di albumina sierica bovina (BSA) e 40 mM etanolamina in buffer PBS (1 mL). Le nanoparticelle sono state infine conservate in un buffer PBS 1 X a pH 7, a 4°C (1 mL).
Coniugazione alle nanoparticelle di anticorpo anti-EGF Receptor 15. Una volta coniugate le nanoparticelle con la rHyal_Sk, si procede alla deprotezione del gruppo Fmoc. Le nanoparticelle sono state centrifugate e lavate con DMF (1 mL x 2)dopo rimozione del surnatante. Dopo i lavaggi il gruppo Fmoc è stato rimosso utilizzando una soluzione al 20% di piperidina in DMF (1 mL x 2).
16. 1 mL di nanoparticelle (contenuto solido 2% in acqua) sono state centrifugate a 13400 rpm per 6 minuti, il surnatante è stato rimosso e le nanoparticelle risospese per sonicazione in 1 mL di DMF. Sono state quindi aggiunte le seguenti soluzioni: a) LC-SPDP (Thermo Scientific) 1 mg/mL in DMF (dispersa mediante sonicazione), e poi (b) 20 equivalenti di DIPEA. Il tutto è stato lasciato sotto agitazione (1400 rpm) a 25°C per 12 ore. Dopo 12 ore, è stata aggiunta una soluzione 1M di DTT e il tutto ulteriormente incubato per 3 ore a 25°C sotto agitazione (1400 rpm).
17. Dopo 3 ore di reazione, le nanoparticelle sono state centrifugate, lavate con acqua dopo rimozione del surnatante (1 mL x 2).
18. Si è quindi aggiunto un SMCC anticorpo attivato (Monoclonal Anti-EGF Receptor antibody, Sigma Aldrich) ad una concentrazione di (1,5 mg/mL) e incubato per 3 ore, sotto agitazione (1400 rpm) a 25°C [Figura 5 (ix)].
19. A seguito della reazione con Γ anticorpo, le nanoparticelle sono state centrifugate, il surnatante è stato rimosso e le nanoparticelle sono state lavate con acqua (1 mF x 2). Fe nano particelle sono state conservate in acqua deionizzata (1 mF) a 4°C.
I nanosistemi ottenuti sono stati caratterizzati per la loro fluorescenza mediante microscopia fluorescente e citofluorimetria a flusso (quando portanti un fluoroforo), e per Fattività ialuronidasica, misurata mediante saggio turbidi metrico in modo da poter rilevare eventuali variazioni delle loro proprietà intrinseche, secondo i seguenti esempi.
ESEMPIO 5 - Valutazione dell’attività enzimatica di rHyaI_Sk dopo funzionalizzazione con nanoparticelle da Esempio 1.
F’ attività enzimatica del nanosistema è stata misurata mediante determinazione turbidimetrica effettuata nel surnatante in eccesso recuperato dalle fasi di preparazione di Esempio 1, secondo il seguente protocollo.
Preparazione dei buffer di reazione
1. Buffer di substrato (soluzione di acido ialuronico allo 0,05% (w/v).
Preparare una soluzione di acido ialuronico allo 0,5 mg/mL in 300 mM di buffer fosfato (pH 5.35). Riscaldare la soluzione a 95°C con agitazione a 500 rpm per 30 minuti (tempo richiesto per la solubilizzazione dell’acido ialuronico). Quindi raffreddare la soluzione fino a 37°C e successivamente mantenerla a 37°C (fino all’uso).
Buffer di diluizione (enzima).
Buffer fosfato (30 mM) allo 0,82% di Cloruro di Sodico (pH 7.0, 37° C) 2. Soluzione di Siero di Cavallo.
24 mM di Acetato Sodico, 79 mM di Acido Acetico al 30% (v/v) di Siero di Cavallo (pH 3.75, 25°C).
A. Preparazione della curva standard.
Il bianco utilizzato è preparato attraverso una miscela di 100 mL del buffer di substrato e 100 pL del buffer di diluizione di enzima (vedi punto 1 e 2 sopra).
La soluzione madre si prepara aggiungendo 4 pL di ialuronidasi bovina standard (1 unità per mL) a 196 pL di buffer di diluizione di enzima. Per la preparazione della curva si procede a sei diluizioni seriali di l: l(v/v).
B. Preparazione della sospensione di nanosistemi (nanoparticelle coniugate covalentemente all’enzima rHyal_sk). 10 uL di sospensione sono mischiate con 90 pi di buffer di diluizione di enzima e 100 mi di buffer di substrato.
C. Incubare 30 minuti a 37°C agitando a 500 rpm.
D. Aggiungere 400 pL di soluzione di siero di cavallo (punto 3). E. Incubare 30 minuti a 37°C agitando a 500 rpm.
Misurare la densità ottica a 640 nm.
I risultati dell’analisi turbi dime tric a evidenziano che l’enzima conserva un’attività ialuronidasica intorno al 97%. Ciò conferma l’efficienza del sistema e dimostra l’elevata stabilità di rHyal_Sk anche a seguito del processo di coupling alle nanoparticelle.
ESEMPIO 6 - Valutazione dell’attività del nanosistema ottenuto da Esempio 2 (rHyal_Sk e fluoroforo Cy5).
Sono state valutate la fluorescenza e l’attività ialuronidasica del nanosistema dell’Esempio 2.
1 mL di sospensione di nanosistemi è stata diluita in 100 pL di acqua. La citometria di flusso è stata eseguita attraverso un citometro di flusso FACSCanto II (Becton Dickinson & Co., NJ, USA), impiegando un laser di eccitazione a 633 nm. Come controllo negativo sono state utilizzate delle nanoparticelle non coniugate. Per l’analisi al microscopio confocale è stato usato un A1R+/ A1+ confocal laser microscope System, Nikon. Come controllo negativo sono state utilizzate nanoparticelle non coniugate.
I dati di microscopia e citofluorimetria ne mostrano l’elevata fluorescenza (Figura 6 B, C). Allo stesso tempo i dati di turbidimetria indicano un’elevata attività ialuronidasica dei nano sistemi marcati (Figura 7). Da entrambi i dati si conclude che le due componenti legate covalentemente alla stessa nanoparticella mantengono intatte le rispettive attività di fluorescenza e attività enzimatica. Analoghe evidenze si hanno col nanosistema portante rHyal_Sk e fluoroforo Cy7.
Esempi di possibili campi di applicazione dell’invenzione comprendono: a) Immunostaining (in vitro): i nanosistemi sono coniugati con fluorofori e specifici anticorpi direzionali e con ialuronidasi che ne aumenta la permeabilizzazione quando aggiunti colture cellulari. Gli anticorpi guidano i nanosistemi al riconoscimento molecolare, legandosi aH’antigene o a regioni “target” contenenti antigene. In tal modo queste regioni vengono messe in evidenza dai fluorofori;
b) Single particle-tracking (in vivo): nanosistemi coniugati con fluorofori e leganti specifici per recettori di membrana (anti corpi), si legano ad essi all’ esterno della cellula e li rendono visibili. La ialuronidasi ne permette l'entrata nel circolo sanguigno attraverso una somministrazione per via sottocutanea. È possibile seguire i movimenti e le traiettorie del recettore visualizzando i nano sistemi marcati.
c) Terapia farmacologica mirata e, nello specifico, terapia antitumorale: in questo caso il nanosistema trasporta un farmaco antitumorale. Se il riconoscimento delle cellule tumorali avviene attraverso recettori di membrana, mediante anticorpi si può fare in modo che il nanosistema si diriga preferenzialmente sulle cellule malate dove vi è una sovra-espressione dei recettori. I sistemi dell'invenzione sono particolarmente adatti per neoplasie caratterizzate da un accumulo di acido ialuronico nei tessuti. Tumori che producono un accumulo anomalo di acido ialuronico che, comprimendo i vasi circostanti, impedisce o almeno rallenta l’afflusso in loco dei farmaci somministrati colpiscono in particolare organi quali mammella, pancreas, colon, prostata. L’acido ialuronico accumulato in eccesso fornisce inoltre al tumore un ottimo substrato per la crescita. In queste situazioni è fondamentale poter disporre di un sistema che fornisce il farmaco e contemporaneamente gli permette di agire in modo completo, annullando un importante ostacolo di tipo meccanico e biologico. Quando infatti le cellule tumorali sono riconosciute, la ialuronidasi ne aumenta la permeabilizzazione distruggendo gli strati di acido ialuronico che proteggono l’ambiente tumorale. Una volta superato il rivestimento di acido ialuronico, i nanosistemi liberano il farmaco antitumorale che così agisce con maggior efficacia. In questo tipo di applicazioni, il nanosistema serve da veicolo direzionale conferendo azione selettive al farmaco antitumorale. Inoltre, la presenza della ialuronidasi può consentire una somministrazione per via sottocutanea.
I nanosistemi qui descritti pertanto presentano i vantaggi di essere inerti, biocompatibili, facilmente sintetizzabili e funzionalizzabili con qualsiasi tipo di molecola. Essi conservano inoltre intatte le caratteristiche delle molecole ad essi legate e, per alcune molecole, permettono vie di somministrazione alternative a quelle classicamente note.
I nanosistemi dell'invenzione rappresentano pertanto sistemi multipotenti, flessibili, riproducibili e facilmente scalabili, da impiegare come trasportatori molecolari a scopo diagnostico, prognostico e terapeutico.

Claims (12)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Sistema nanoparticellare comprendente nanoparticelle polimeriche costituite da un polimero o copolimero naturale, sintetico o semisintetico legate a una catena etero carboniosa tramite legami covalenti tra gruppi funzionali presenti sul polimero o copolimero e gruppi funzionali presenti su detta catena etero carboniosa, una ialuronidasi e una o più molecole attive legate covalentemente a detta catena etero carboniosa.
  2. 2. Sistema nanoparticellare secondo la rivendicazione 1 in cui i gruppi funzionali presenti sul polimero sono scelti fra ammine primarie o terziarie, epossidi, carbossili, preferibilmente ammine primarie o terziarie.
  3. 3. Sistema nanoparticellare secondo la rivendicazione 1 o 2 in cui le nanoparticelle hanno una dimensione compresa tra 50 nm e 2000 nm, preferibilmente tra 100 e 500 nm, ed ancor più preferibilmente pari a 200 nm.
  4. 4. Sistema nanoparticellare secondo la rivendicazione 1 in cui Γ enzima ialuronidasi è di origine umana, animale, da vertebrati, batterica o ricombinante, preferibilmente ricombinante.
  5. 5. Sistema nanoparticellare secondo la rivendicazione 1 in cui la catena etero carboniosa è scelta tra catene carboniose sature con un numero di carboni tra 6 e 24, catene di glicoli metossipolietilenici, catene di dimetilsuberimidato, catene di polietilenglicoli, preferibilmente N-Fmoc-M-succinil-4,7,10-triossa-1,13-tridecanediammina (PEG spacer).
  6. 6. Sistema nanoparticellare secondo la rivendicazione 1 in cui i gruppi funzionali della catena etero carboniosa sono scelti tra glutaraldeide, maleimide, esteri attivi, gruppi disolfurici, acido squarico e suoi derivati.
  7. 7. Sistema nanoparticellare secondo la rivendicazione 1, in cui le molecole attive sono di origine naturale, semisintetica, sintetica o ricombinante.
  8. 8. Sistema nanoparticellare secondo la rivendicazione 7 in cui le molecole attive sono scelte tra farmaci, agenti diagnostici, agenti radioattivi, anticorpi, enzimi, proteine, peptidi, ormoni, fattori di crescita, fattori della coagulazione, citochine, coloranti, fluorofori, anticorpi, acidi nucleici, polinucleotidi, oligonucleotidi senso e antisenso, coniugati molecolari contenenti RNA o DNA, RNA solubile, vettori di DNA, vaccini naturali, sintetici o ricombinanti.
  9. 9. Sistema nanoparticellare secondo la rivendicazione 8 in cui gli enzimi sono scelti tra superossido dismutasi umana (hMnSGD) e collagenasi batterica nativa e/o modificata.
  10. 10. Composizioni farmaceutiche comprendenti i sistemi nanoparticellari delle rivendicazioni precedenti in miscela con eccipienti farmaceuticamente accettabili.
  11. 11. Composizioni farmaceutiche secondo la rivendicazione 10 in forma liofilizzata per la ricostituzione, di sospensione acquosa o di gel.
  12. 12. Composizioni farmaceutiche secondo la rivendicazione 11 per somministrazione per via sottocutanea, intradermica, intratecale, intramuscolare, intraperitoneale, endovenosa, intra- arteriosa, transdermica, transcutanea, transmucosale e inalatoria. Milano, 21 dicembre 2015
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