ITMI20130992A1 - Ialuronidasi batterica e metodo per la sua produzione - Google Patents

Description

TITOLO: IALURONIDASI BATTERICA E METODO PER LA SUA PRODUZIONE

DESCRIZIONE

Il presente trovato riguarda una ialuronidasi derivante da S. koganeiensis, le sue applicazioni ed un metodo per la sua produzione.

Attualmente, la ialuronidasi utilizzata in campo clinico à ̈ di derivazione animale. Questo prodotto, nonostante sia opportunamente purificato, contiene numerosi contaminanti capaci di indurre risposte immunogene o allergiche.

L’acido ialuronico à ̈ un essenziale componente della matrice extracellulare ed un costituente quantitativamente significativo della barriera interstiziale. La ialuronidasi à ̈ un enzima idrolitico che scinde l’acido ialuronico in acido D-glucuronico ed N-acetil glucosammina, aumentando la permeabilità della matrice interstiziale. In maniera variabile, à ̈ anche capace di degradare altri mucopolisaccaridi acidi del tessuto connettivo. Alte concentrazioni di ialuronidasi si trovano, ad esempio, nell’apparato boccale delle sanguisughe, nei veleni dei serpenti, delle api, degli scorpioni e nel surnatante di coltura di batteri patogeni come pneumococchi, streptococchi β-emolitici e Staphylococcus aureus. Nell’organismo umano la ialuronidasi si trova nella cornea, nel corpo ciliare, nella milza, nella pelle e nei testicoli. Elevate quantità di ialuronidasi si trovano anche negli spermatozoi, ai quali l’enzima permette di superare la barriera di acido ialuronico che protegge l’ovulo.

La ialuronidasi viene utilizzata in medicina nella cura di edemi, stati infiammatori locali, emorroidi e geloni. Inoltre, viene utilizzata in campo farmaceutico per facilitare il trasporto e incrementare la dispersione e diffusione di alcuni principi attivi ad alto peso molecolare (anticorpi, nanoparticelle trasportatori di farmaci, DNA per terapia genica, proteine ricombinanti) somministrati localmente per via sottocutanea, aumentandone la biodisponibilità in quantità paragonabili ad una somministrazione per via intravenosa [1]. Studi precedenti hanno dimostrato che nanoparticelle del diametro fino a 200nm possono subire un forte incremento del loro trasporto attraverso lo spazio interstiziale se somministrate in concomitanza o in sequenza con l’enzima ialuronidasi [1]. Gli studi finora presi in considerazione mostrano come le nanoparticelle siano in grado di esprimere, in vitro, le loro funzioni, lasciando dunque trasparire delle ottime potenzialità in campo terapeutico e diagnostico. Tuttavia, bisogna considerare, in vivo, la capacità delle nanoparticelle di superare le barriere dovute al tipo di somministrazione per essere utilizzati nella pratica clinica (somministrazione subcutanea o gastrointestinale o tossicità per somministrazione endovena), il loro volume di distribuzione e la loro tossicità. L’utilizzo di formulazioni di nanoparticelle e ialuronidasi potrebbe dunque rappresentare un ottimo ed innovativo punto di partenza per il futuro terapeutico e diagnostico con la prospettiva che le nanoparticelle trasportatrici di farmaci finalmente possano essere utilizzate nella comune pratica clinica mediante somministrazione locale per via sottocutanea, per la cura, ad esempio, in oncologia, oftalmologia e osteoartrite.

Alcuni tipi di cancro, compresi quelli del pancreas, della mammella, del colon e della prostata, hanno dimostrato di accumulare livelli elevati di acido ialuronico (HA). Questo accumulo di HA in modo anormale genera una rete di protezione che circonda alcuni tipi di tumori e li sostiene. Questo accumulo patologico di HA con altri componenti della matrice aumenta anche la pressione del fluido interstiziale del tumore, costrizione dei vasi tumorali e crea un microambiente unico che favorisce la crescita delle cellule tumorali rispetto alle cellule normali. Questi meccanismi, generano ostacoli alla somministrazione di farmaci inibendo la potenziale efficacia di molti agenti anticancro. Smantellando la componente HA che determina l'architettura del tumore, la ialuronidasi, distrugge questo microambiente tumorale aprendo i vasi precedentemente ristretti che aumentano il flusso di sangue verso il tumore. Questo può consentire ai terapeutici anticancro di essere trasportati in modo più efficiente verso il target tumorale, aumentando la loro efficacia terapeutica.

La ialuronidasi viene anche utilizzata in cosmesi per il trattamento di reazioni granulomatose o di collocazioni errate, cioà ̈ non volute, di acido ialuronico, provocati da filler, e per migliorare decisamente lo stato di fibrosi presente nella cellulite.

La ialuronidasi, segmentando la componente fibrotica della cellulite, la rende più morbida con riduzione dell’effetto a buccia d’arancia, donando così un aspetto più naturale e piacevole alla porzione di pelle sottoposta al trattamento. La ialuronidasi à ̈, ad oggi, l’unico vero trattamento, con finalità terapeutiche o non terapeutiche, in grado di combattere la cellulite con soddisfacenti risultati.

Studi precedenti hanno mostrato l’efficacia della ialuronidasi nel trattamento di malattie cardiovascolari quali arteriosclerosi [2], ma era finora sconosciuta la potenzialità che la ialuronidasi può avere sulla pressione arteriosa [3].

Studi clinici hanno dimostrato con prove elettrocardiografiche che queste applicazioni hanno supporto scientifico, spingendo ad studiare gli effetti che ha il siero umano sull'attività di Wydase, una ialuronidasi bovina testicolare che à ̈ stata ampiamente utilizzata in molti studi clinici.

Da questi studi clinici sono emerse le seguenti conclusioni:

- Solo l’utilizzo di una ialuronidasi altamente purificata assume un elevato valore clinico per la riduzione delle dimensioni dell'infarto miocardico [4].

- Molti gruppi hanno dimostrato che il sangue umano contiene un inibitore termolabile della ialuronidasi bovina [5,6].

Queste conclusioni, nonostante gli studi clinici abbiano dimostrato l’efficacia della ialuronidasi, non hanno portato fino ad ora allo sviluppo di una ialuronidasi e/o nuovi terapeutici a base di ialuronidasi capaci di garantire una somministrazione per via endovenosa per la gestione di malattie cardio-cerebro vascolari, limitando l’uso per alcune terapie cardiovascolari, a causa dell’alto valore di impurezze, con quelle già disponibili sul mercato.

In campo veterinario, ialuronidasi à ̈ utilizzata in soluzioni comprendenti sostanze antibiotiche per il trattamento di malattie animali, come la mastite bovina. Fino ad ora, la produzione di ialuronidasi batterica o animale su scala industriale à ̈ risultata difficoltosa, sia per la bassa produzione sia per il fatto che l’enzima diventa instabile in soluzione acquosa e perde attività a seguito della purificazione.

Inoltre, molte delle ialuronidasi prodotte industrialmente provengono da estratti animali (da testicoli bovini e ovini) con un forte rischio di trasmissione di encefalopatia spongiforme animale (cosiddetto “Morbo della mucca pazza†). Altre produzioni industriali hanno prodotto la ialuronidasi (PH20 umana) in forma ricombinante solubile partendo da cellule di mammifero, migliorandone la purezza e limitando il rischio di infezioni virali [7].Scopo della presente invenzione à ̈ quello di fornire una ialuronidasi ricombinante batterica di alta purezza per applicazioni farmaceutiche e/o cosmetiche.

Un compito della presente invenzione à ̈ quello di fornire un enzima che sia stabile in soluzione acquosa anche per tempi prolungati e in presenza di enzimi proteolitici, che sia completamente priva del rischio di trasmissione di encefalopatia spongiforme animale e che abbia un’alta attività di tipo ialuronidasica anche nel circolo sanguigno senza possibilità di inibizione o di contaminazioni virali o batteriche, in modo da permetterne l’utilizzo anche per via intravenosa.

Altro compito della presente invenzione à ̈ quello di fornire un metodo per la preparazione di ialuronidasi che sia efficiente, con alta resa e sia applicabile senza difficoltà su scala industriale.

In accordo con il presente trovato, questi scopi, ed altri che saranno meglio evidenti di seguito, vengono conseguiti tramite un metodo per la produzione di ialuronidasi isolata da Streptomyces koganeiensis ATCC 31394 comprendente la sequenza amminoacidica mostrata in SEQ. ID. No. 21 comprendente le seguenti fasi:

a) inoculare un terreno di coltura batterica in un bioreattore con un inoculo di cellule ricombinanti che contengano almeno un vettore comprendente la sequenza mostrata come SEQ ID N. 41;

b) sottoporre a fermentazione il contenuto del bireattore del passaggio a) ad un pH compreso tra 6,7 e 7,1 in presenza di una soluzione di nutrimento;

c) aggiungere alla miscela del passaggio b) un induttore dei geni lac;

d) sottoporre la miscela del passaggio b) ad un periodo di induzione tra 8 e 24 ore;

e) centrifugare le cellule batteriche ottenute nel passaggio d);

f) risospendere i pellet ottenuti nel passaggio e) e sottoporre la sospensione così ottenuta a shock osmotico; g) estrarre le proteine periplasmatiche tramite centrifugazione della sospensione del passaggio f);

h) purificare la frazione proteica ad attività enzimatica ialuronidasica ottenuta nel passaggio g) tramite una sequenza di:

i. cromatografia a scambio ionico forte ed isolamento della frazione ad attività enzimatica ialuronidasica; ii. cromatografia a scambio cationico debole ed isolamento della frazione ad attività enzimatica ialuronidasica; e

iii. cromatografia a interazione idrofobica aromatica ed isolamento della frazione ad attività enzimatica ialuronidasica.

Gli scopi dell’invenzione sono stati inoltre conseguiti tramite una ialuronidasi da Streptomyces koganeiensis ATCC 31394 in forma purificata e comprendente la sequenza amminoacidica mostrata in SEQ. ID. No. 21.

Gli scopi dell’invenzione sono stati inoltre conseguiti tramite un polinucleotide comprendente la sequenza nucleotidica mostrata in SEQ. ID. No. 17 che codifica per detta ialuronidasi batterica.

Gli scopi dell’invenzione sono stati inoltre raggiunti tramite un vettore ricombinante geneticamente ingegnerizzato comprendente detto polnucleotide.

Gli scopi dell’invenzione sono stati conseguiti tramite una cellula ospite comprendente detto vettore ricombinante geneticamente ingegnerizzato.

Gli scopi dell’invenzione sono inoltre conseguiti tramite una composizione adatta all’uso farmaceutico o cosmetico comprendente detta ialuronidasi da Streptomyces koganeiensis ATCC 31394 in forma purificata e comprendente la sequenza amminoacidica N-terminale mostrata in SEQ. ID. No. 21, detta ialuronidasi per uso nel trattamento e/o nella prevenzione di un disturbo o patologia, opzionalmente in associazione con almeno un altro principio attivo, ed il suo uso non terapeutico per applicazioni cosmetiche e/o di miglioramento dell’aspetto estetico.

Nell’ambito della presente invenzione, per “composizione adatta all’uso farmaceutico o cosmetico†si intende una preparazione in forma solida, semisolida o liquida, come sospensione o soluzione, comprendente almeno un principio attivo ed almeno un eccipiente come noto all’esperto del ramo.

Nell’ambito della presente invenzione, la definizione di “sequenza polipeptidica†o “sequenza polinucleotidica†comprende anche le sequenze con alto grado di omologia con la sequenza indicata. Come esempi non limitativi, sono inclusi nell’ambito dell’invenzione polipeptidi che hanno almeno il 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o più di identità della sequenza mostrata in SEQ. ID. NO: 21, polinucleotidi che hanno almeno il 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o più di identità della sequenza mostrata in SEQ. ID. NO: 17, e polinucleotidi che hanno almeno il 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o più di identità della sequenza mostrata in SEQ. ID. NO: 41

Se non altrimenti specificato, nel’ambito della presente invenzione le percentuali si intendono riferite al peso di un componente su peso totale della composizione.

Le seguenti figure sono fornite per illustrare meglio l’invenzione, senza intenzione di limitarne lo scopo.

FIG. 1: curva di produzione della ialuronidasi da surnatante di coltura di Streptomyces koganeiensis relativi all’intervallo di tempo (T). Analisi in gel di agarosio 1% del profilo di RNA totale e DNA estratto dalle cellule di S.koganeiensis durante la fase di produzione.

FIG. 2: sequenza dell’amplificato di circa 550bp, ottenuto con i primers interni MesFor2 e MesRev2 e traduzione in silico della sequenza nucleotidica ottenuta, in sequenza proteica.

FIG. 3: schema del metodo Inverse Polimerase Chain Reaction (IPCR) utilizzato per identificare le sequenze fiancheggianti in 5’ e 3’ la regione interna del gene di S.koganeiensis codificante per la ialuronidasi.

FIG. 4: completa identificazione dell’intera sequenza nucleotidica del gene, codificante per la porzione CDS ialuronidasi di S.koganeiensis.

FIG. 5: sequenza dell’intero gene codificante per la porzione CDS ialuronidasi di S.koganeiensis come clonata nel vettore pCR-BluntII-TOPO (invitrogen).

FIG. 6: (a)analisi in BLAST per le omologie di sequenza tra la sequenza aminoacidica determinata della ialuronidasi da S.koganeiensis ATCC 31394 e le sequenze aminoacidiche riportate in banca dati sul web. Le sequenze evidenziate dal rettangolo descrivono in dominio funzionale della famiglia della ialuronidasi batterica. (b)analisi in BLAST per le omologie di sequenza tra la sequenza nucleotidica determinata della ialuronidasi da S.koganeiensis ATCC 31394 e le sequenze nucleotidiche riportate in banca dati sul web.

FIG. 7: (a)caratterizzazione funzionale sulla sequenza proteica della ialuronidasi da S.koganeiensis. (b) caratterizzazione funzionale sulla sequenza proteica delle ialuronidasi da Actinoplanes sp. SE 50/110, Streptomyces pristinaespiralis ATCC 25486, Streptomyces tsukubaensis NRRL18488.

FIG. 8: il frammeto di DNA codificante per la ialuronidasi e i plasmidi di espressione utilizzati per il clonaggio, sono stati tagliati entrambi con stabiliti enzimi di restrizione. I frammenti ottenuti sono stati analizzati in gel di agarosio all’1% e colorati con bromuro di etidio. Dopo colorazione, il gel à ̈ stato acquisito mediante un acquisitore d’immagine da laboratorio ImageQuant 300 TL (GE Healthcare), mentre le analisi (quantitative e qualitative) sono state effettuate impiegando il software di analisi dell’immagine ImageQuant TL (GE Healthcare).

FIG. 9: screening, mediante PCR e digestione con enzimi di restrizione, del frammento di DNA codificante per la ialuronidasi clonata in plasmidi di espressione. I frammenti ottenuti sono stati analizzati in gel di agarosio all’1% con il software di analisi dell’immagine ImageQuant TL (GE Healthcare)dopo colorazione con bromuro di etidio e acquisizione.

FIG. 10: la figura riporta la mappa del plasmide pHTsk_HYAL: promotore Pgrac, il gene lacI (repressore lacI), Amp<R>gene per la resistenza all’ampicillina, Cm<R>gene per la resistenza al cloramfenicolo, ColE1 origine di replicazione di E.coli, SamyQ peptide segnale di amyQ e ialuronidasi gene codificante per la ialuronidasi di S.koganeiensis, BamHI e XbaI siti di restrizione unici utilizzati per il clonaggio della ialuronidasi.

FIG. 11: la figura riporta la mappa del plasmide pHyal_sk: ori origine di replicazione di E.coli, Ap gene per la resistenza all’ampicillina, promotore T7, il gene lacI (repressore lacI), pelB peptide segnale, ialuronidasi gene codificante per la ialuronidasi di S.koganeiensis, NcoI e EcoRI siti di restrizione unici utilizzati per il clonaggio della ialuronidasi.

FIG. 12: la figura riporta la mappa del plasmide pHyal_sk_SL: ori origine di replicazione di E.coli, Ap gene per la resistenza all’ampicillina, promotore T7, il gene lacI (repressore lacI), ialuronidasi gene codificante per la ialuronidasi di S.koganeiensis, NdeI e EcoRI siti di restrizione unici utilizzati per il clonaggio della ialuronidasi.

FIG. 13: (a) la figura mostra la sequenza nucleotidica dell’Open Reading Frame (ORF) codificante per la proteina ialuronidasi di S.koganeiensis clonata nel vettore pHT43 (MoBiTec). (b) La figura mostra la sequenza nucleotidica dell’ORF codificante per la proteina ialuronidasi di S.koganeiensis clonata nel vettore pET22b(+) (Novagen). (c) La figura mostra la sequenza nucleotidica dell’ORF codificante per la proteina ialuronidasi di S.koganeiensis clonata nel vettore pET21b(+) (Novagen). FIG. 14: valutazione in SDS-PAGE al 12% dell’espressione della ricombinante ialuronidasi (E.coli,BL21(DE3) contenente il plasmide pHyal_sk)dopo induzione con IPTG 1mM rispetto al profilo proteico del campione preindotto.

FIG. 15: valutazione in SDS-PAGE al 12% dell’espressione della ricombinante ialuronidasi (E.coli, BL21(DE3) contenente il plasmide pHyal_sk_SL)dopo induzione con IPTG 1mM rispetto al profilo proteico del campione preindotto.

FIG. 16: profilo proteico in SDS-PAGE al 12% delle frazioni ottenute al termine di ogni passaggio di purificazione secondo l’invenzione.

FIG. 17: (a) paragone degli spettri al dicroismo circolare della ialuronidasi autologa e ricombinante. (b) sono riportati i rispettivi spettri UV per la ricombinante purificata. Gli spettri UV sono stati analizzati prima (linea superiore) e dopo (linea inferiore) centrifugazione al fine di eliminare gli aggregati eventualmente presenti.

FIG. 18: determinazione del peso molecolare mediante spettrometria di massa della ialuronidasi ricombinante ottenuta secondo invenzione.

FIG. 19: determinazione del punto isoelettrico della ialuronidasi ricombinante ottenuta secondo l’invenzione. FIG. 20: elettroferogramma all’elettroforesi capillare del campione di ialuronidasi ricombinante purificato secondo l’invenzione. La concentrazione calcolata à ̈ risultata circa 1 mg/ml con il 100% di purezza.

FIG. 21: analisi della purezza della ialuronidasi ricombinante purificata secondo l’invenzione mediante (a) HPLC su colonna a gel filtrazione Bio-Sil SEC, (b) RP-HPLC su colonna a fase idrofobica (reversed).

FIG. 22: SDS-PAGE 12% - la ialuronidasi ricombinante prodotta e purificata secondo invenzione à ̈ stata caricata con 1000, 500, 250, 100 e 50 unità per lane e comparata con 50, 25 e 10 unità per lane della ialuronidasi da testicoli bovino. Analisi al western blot sulla preparazione di 25 unità della ialuronidasi bovina utilizzando l’anticorpo policlonale anti-ialuronidasi (Abnova) che rivelava una singola banda ialuronidasi immunoreattiva.

FIG. 23: elettroforesi in gel di agarosio 1% mostra la depolimerizzazione dell’acido ialuronico purificato con 1 unità di ialuronidasi ricombinante prodotta secondo l’invenzione a indicati tempi che vanno da 5 minuti a 24 ore.

FIG. 24: Stabilità, della ialuronidasi ricombinante prodotta secondo l’invenzione e della ialuronidasi da testicoli bovino, contro gli enzimi proteolitici.

FIG. 25: valutazione in vitro dell’effetto di inibizione che ha il siero animale e umano sull’attività enzimatica delle ialuronidasi (ricombinante prodotta secondo questa invenzione e ialuronidasi bovina).

In una forma di realizzazione, la presente invenzione riguarda un metodo per la produzione di ialuronidasi isolata da Streptomyces koganeiensis ATCC 31394 comprendente la sequenza amminoacidica mostrata in SEQ. ID. No. 21 comprendente le seguenti fasi:

a) inoculare un terreno di coltura batterica in un bioreattore con un inoculo di cellule ricombinanti che contengano almeno un vettore comprendente la sequenza mostrata come SEQ ID N. 41;

b) sottoporre a fermentazione il contenuto del bireattore del passaggio a) ad un pH compreso tra 6,7 e 7,1 in presenza di una soluzione di nutrimento;

c) aggiungere alla miscela del passaggio b) un induttore dei geni lac;

d) sottoporre la miscela del passaggio b) ad un periodo di induzione tra 8 e 24 ore;

e) centrifugare le cellule batteriche ottenute nel passaggio d);

f) risospendere i pellet ottenuti nel passaggio e) e sottoporre la sospensione così ottenuta a shock osmotico; g) estrarre le proteine periplasmatiche tramite centrifugazione della sospensione del passaggio f);

h) purificare la frazione proteica ad attività enzimatica ialuronidasica ottenuta nel passaggio g) tramite una sequenza di:

i. cromatografia a scambio ionico forte ed isolamento della frazione ad attività enzimatica ialuronidasica;

ii. cromatografia a scambio cationico debole ed isolamento della frazione ad attività enzimatica ialuronidasica; e

iii. cromatografia a interazione idrofobica aromatica ed isolamento della frazione ad attività enzimatica ialuronidasica.

Per eliminare completamente il rischio di tramissione di encefalopatia spongiforme animale, e poiché sono disponibili limitate fonti di ialuronidasi di origine microbica, in studi precedenti à ̈ stato selezionato e isolato un ceppo batterico capace di produrre un’alta attività enzimatica ialuronidasica [8].

Al fine di garantire una miglior sicurezza circa l’uso di questo enzima batterico in applicazioni farmaceutiche, la ialuronidasi isolata e caratterizzata dal ceppo batterico originario [9] à ̈ stata prodotta in forma ricombinante utilizzando come ospite cellulare un ceppo batterico non patogeno definito come Generally Regarded as Safe (GRAS). La produzione della ricombinante batterica dal microorganismo “GRAS†, mantiene un’efficacia paragonabile a quella della ialuronidasi autologa, ma con una più alta quantità di produzione per litro e con un considerevole miglior profilo di purezza e sicurezza, includendo la completa assenza del rischio di trasmissione virale.

Il metodo della presente invenzione permette di ottenere una ialuronidasi batterica ricombinante ad alta qualità per applicazioni farmaceutiche. L’alta produzione di ialuronidasi ricombinante in microorganismi non-patogeni vanta la stessa efficacia della ialuronidasi tradizionale, ma con una sicurezza e un profilo notevolmente migliore, compresa la completa assenza del rischio di trasmissione di encefalopatia spongiforme animale.

La presente invenzione descrive l'isolamento dell’intero gene codificante per la ialuronidasi proveniente dal batterio gram-positivo Streptomyces koganeiensis, con il conseguente clonaggio ed espressione del frammento CDS (sequenza codificante, SEQ ID NO: 22). Inoltre, la presente invenzione fornisce un metodo per la preparazione in fermentatore, la purificazione e caratterizzazione della ialuronidasi ricombinante codificata e secreta nella porzione periplasmatica cellulare in forma solubile.

La proteina ricombinante così ottenuta ha un’elevata attività ialuronidasica e presenta un’alta stabilità agli enzimi proteolitici, à ̈ in grado di svolgere con la sua massima biodisponibilità la totale attività anche nel circolo sanguigno senza possibilità di inibizione e di contaminazioni batteriche e virali. Nella sua forma ricombinante solubile, dimostra essere efficace per l’utilizzo in applicazioni non solo per la preparazione di composizioni farmaceutiche nel facilitare la somministrazione sottocutanea di principi attivi o fluidi iniettabili ma anche in applicazioni terapeutiche, per esempio, nel trattamento di patologie come l’ipertensione arteriosa, infarto al miocardio, eventi trombotici, incidenti cardio-cerebro vascolari e di tumori, perché unica con le caratteristiche descritte dall’invenzione rispetto a tutte le altre ialuronidasi fino ad ora disponibili.

Le produzioni di ialuronidasi note provengono da sorgenti animali presentando un forte rischio di trasmissione di encefalopatite spongiforme animale; a causa di questo rischio, e dall’alta instabilità delle ialuronidasi di derivazione animale, à ̈ ricercato, selezionato e isolato uno ceppo batterico capace di produrre una ialuronidasi con alta attività enzimatica.

In un aspetto, la presente invenzione riguarda l'isolamento dell’intero gene codificante per la ialuronidasi batterica (SEQ ID NO: 17) avente sequenza aminoacidica SEQ ID NO: 21, proveniente dal batterio gram-positivo S.koganeiensis, il conseguente clonaggio ed espressione della sequenza nucleotidica SEQ ID NO: 22 codificante per la proteina matura avente sequenza SEQ ID NO: 21 in uno specifico ospite batterico (e.g. E.coli), riconosciuto per essere un organismo scelto per l’espressione di proteine ricombinanti utilizzate in applicazioni terapeutiche, diagnostiche e industriali. L’invenzione descrive la produzione della proteina utilizzando il metodo fed-batch per l’ottenimento, in fermentatore, di un’alta quantità di ialuronidasi ricombinante secreta nella porzione periplasmatica cellulare in forma solubile. La ialuronidasi ricombinante così prodotta à ̈ sottoposta a purificazione utilizzando tre passaggi cromatografici riproducibili (due a scambio ionico e uno a scambio idrofobico). L’enzima opportunamente purificato à ̈ un innovativo enzima batterico ricombinante solubile ad alta attività ialuronidasica, prodotto dalla fermentazione di batteri sicuri, senza l’utilizzo di cellule e materiale primo di derivazione animale. Inoltre, l’enzima secondo questa invenzione à ̈ caratterizzato da una sequenza di 217 aminoacidi, da un punto isolettrico (pI) di 5,2±0,5, da un’alta stabilità agli enzimi proteolitici, da stabilità in vitro verso sangue animale e umano, da un alto grado di purezza e sicurezza, e dalla completa assenza della possibilità di dare contaminazioni virali.

La ialuronidasi secondo l’invenzione può essere così ottenuta: inizialmente, il ceppo di S.koganeiensis à ̈ stato sottoposto a fermentazione, e il materiale extracellulare à ̈ stato ottenuto da cellule del batterio come descritto precedentemente[9]. Durante il processo fermentativo, frazioni cellulari sono prelevati ogni 3-4 ore, per valutare i livelli di RNA prodotto e DNA mediante metodi standard (Fig.1), mentre l’altra parte della frazione à ̈ conservata a -80°C in RNAprotectâ„¢ Bacteria Reagent (Qiagen), dopo essere stata analizzata. Al termine della fermentazione, il surnatante contenente la ialuronidasi à ̈ stato chiarificato, concentrato, dializzato, purificato e quindi arricchito della sola componente ialuronidasi come descritto precedentemente[9].

La ialuronidasi da S.koganeiensis così isolata à ̈ stata digerita con enzimi proteolitici (tripsina, chimotripsina, Glu-C) e i frammenti ottenuti dopo digestione sono stati separati in HPLC. In questo modo le informazioni riguardanti la struttura primaria della ialuronidasi isolata sono state ottenute sequenziando la porzione N-terminale dei frammenti ottenuti dopo digestione enzimatica.

Dai sequenziamenti N-terminali effettuati sono state ottenute le seguenti sequenze aminoacidiche:

- AGENGATTTFDGPVA (SEQ ID NO:1)

- RFSADTTIEAAFIKTTSETIHAATIYK (SEQ ID NO:2)

- GYADGSDKDAAALSLDLR (SEQ ID NO:3)

- AQVHIVQR (SEQ ID NO:4)

- IGNAATVPTSVDSSGGG (SEQ ID NO:5)

Dalla ricerca fatta in una banca dati, à ̈ stata identificata l’omologia della ialuronidasi di S.koganeiensis ATCC 31394 con una proteina predetta (protein_id= ZP_06911952.1) di Streptomyces pristinaespiralis ATCC 25486. Sulla base della sequenza N-terminale dei peptidi ottenuti della proteina isolata secondo questa invenzione, à ̈ stato possibile sintetizzare i corrispondenti oligonucleotidi, che sono serviti per isolare il gene codificante la ialuronidasi dal genoma di S.koganeiensis.

I pellets delle cellule batteriche provenienti dalla fermentazione [9] nel periodo di produzione esponenziale di ialuronidasi (Fig. 1), sono stati trattati per l’estrazione e purificazione del DNA e RNA. I prodotti così ottenuti sono analizzati quantitativamente mediante spettrofotometro e qualitativamente mediante elettroforesi in gel di agarosio [12].

Le regioni aminoacidiche individuate e identiche tra S.koganeiensis e S.pristinaespiralis sono serviti per disegnare gli oligonucleotidi utilizzati per isolare una porzione interna del gene codificante la ialuronidasi a partire dal DNA genomico utilizzato come templato, ottenendo un prodotto di PCR con una sola banda specifica di circa 550 bp. Il sequenziamento nucleotidico del frammento ha fornito la sequenza (SEQ ID NO:8) mostrata in Fig. 2.

Per individuare le regioni nucleotidiche fiancheggianti la sequenza genica così identificata à ̈ stata messa a punto ed eseguita la tecnica di PCR inversa (IPCR)(fig.3). Il metodo della IPCR utilizzando la coppia di primers SEQ ID NO:11 e SEQ ID NO:12 ha permesso di ottenere dei prodotti di PCR, rispettivamente di 700 e 1400 bp circa, che sequenziati hanno fornito le informazioni precise sull’intero gene codificante la ialuronidasi di S. koganeiensis. Con questo step à ̈ stata completata l’identificazione della sequenza nucleotidica d’interesse (SEQ ID NO:13), riportata in (fig.4).

Una coppia di primers disegnati sulle sequenze non codificanti(SEQ ID NO:14 e SEQ ID NO:15) e fiancheggianti l’intero gene codificante la ialuronidasi sono utilizzati per l’amplificazione dell’intero gene (SEQ ID NO:16) e il prodotto PCR (fig.5) à ̈ stato clonato direttamente all’interno del vettore pCR®-BluntII-TOPO®(Invitrogen) in cellule di E.coli.

Dai risultati ottenuti dall’analisi bioinformatica à ̈ stato osservato che l’intera lunghezza del gene codificante per la ialuronidasi da S.koganeiensis era di 744 bp (SEQ ID NO:17) e che la lunghezza della sequenza del peptide à ̈ stata stimata in 247 aminoacidi (SEQ ID NO:18). Il gene contiene un dominio putativo (SEQ ID NO:19) di proteine appartenenti alla famiglia delle ialuronidasi (Hyaluronidase_1), come evidenziato dalla ricerca delle omologie su di un database. Inoltre, l’analisi della sequenza (SEQ ID NO:18), utilizzando un tool specifico indicava la presenza di una sequenza segnale (signal peptide) di 30 aminoacidi (aminoacidi da 1 a 30 (SEQ ID NO:47), con sito di taglio tra l’aminoacido 30 e 31). La proteina matura (SEQ ID NO:21) quindi à ̈ lunga 217 aminoacidi (corrispondente sequenza nucleotidica 651bp (SEQ ID NO : 22)) e il suo peso molecolare predetto (http://web.expasy.org/compute_pi/) à ̈ di 21679.96Da.

Infine, l’analisi in BLAST per le omologie di sequenza mostra una parziale omologia tra la sequenza aminoacidica determinata della ialuronidasi da S.koganeiensis ATCC 31394 (SEQ ID NO:18) con alcune delle sequenze aminoacidiche di ipotetiche proteine appartenenti al phylum degli Actinobatteri riportate in banca dati sul web.

È presente un’omologia di sequenza tra una regione della sequenza (SEQ ID NO:27 e SEQ ID NO: 52) della ialuronidasi da S.koganeiensis (secondo l’invenzione) e uno dei moduli presenti nel dominio aminoacidico del Cd44 murino che lega l’acido ialuronico (Fig.7(a)).

Il cDNA codificante per la ialuronidasi da S.koganeiensis secondo l’invenzione (SEQ ID NO: 41) à ̈ stato amplificato mediante PCR partendo dal plasmide pCR-BluntII-TOPO[sk_HYAL] e ligato, dopo essere stato digerito con enzimi di restrizione, nei diversi plasmidi utilizzati secondo questa invenzione, esempio:

Vettore Primers utilizzati Enzimi di Lunghezza Plasmide

restrizione nucleotide ottenuto clonato

da(SEQ ID NO:

41)

pHT43 SEQ ID NO:28 BamHI 672bp pHTsk_HYAL 5'-gtaGGATCCGCCGGG (Fig. 13a) GAAACGGCGCGACGACGA–3’

SEQ ID NO:29 XbaI

5’-gacTCTAGATCACGCC

GGTGCGATCGTCGTGACC-3’

pET22b( SEQ ID NO:32 NcoI 671bp pHyal_sk ) 5'-tggCCATGGCCGGGG (Fig.13,b)

AGAACGGCGCGACGACGA+3’

SEQ ID NO:33 EcoRI

5’-ctcGAATTCtcaCGCC

GGTGCGATCGTCGTGACC-3’

pET21b( (SEQ ID NO:36) NdeI 672bp pHyal_sk_ ) 5'-ataCATATGGCCGGGGA SL GAACGGCGCGACGACGA-3’ (Fig.13,c) (SEQ ID NO:37) EcoRI

5’-ctcGAATTCtcaCGCCGG

TGCGATCGTCGTGACC-3’

pET24b( (SEQ ID NO:36) NdeI 672bp pRH_sk ) 5'-ataCATATGGCCGGGGA

GAACGGCGCGACGACGA-3’

(SEQ ID NO:37) EcoRI

5’-ctcGAATTCtcaCGCCGG

TGCGATCGTCGTGACC-3’

Dopo clonaggio e amplificazione in cellule di E.coli strain DH5a, i vettori geneticamente ingegnerizzati sono stati estratti e purificati per essere separatamente trasformati in cellule batteriche di espressione. Il vettore pHTsk_HYAL à ̈ trasformato in cellule, rese competenti, di Bacillus subtilis (WB800N-MoBiTec) mentre i vettori pHyal_sk,pHyal_sk_SL e pRH_sk sono trasformati in cellule, rese competenti, di E. coli, strain BL21(DE3)e/o MG1655. Tutte le trasformazioni sono state eseguite mediante trasformazione chimica [13]. I cloni, sia di B.subtilis sia di E.coli, risultati positivi per la presenza dei vettori contenenti il frammento nucleotidico della ialuronidasi risultato con la sequenza clonata geneticamente corretta (SEQ ID NO: 41), sono testati per la capacità di esprimere la ialuronidasi ricombinante in colture da 500 ml (esempio:10,11).

Preferibilmente, nel metodo secondo la presente invenzione la cellula ricombinante del passaggio a) Ã ̈ selezionata tra una cellula di Escherichia coli e una di Bacillus subtilis.

Sui ceppi ricombinanti produttori, Ã ̈ stata sviluppata la Master Cell Bank e Working Cell Bank e le aliquote di questi cloni da 2ml con glicerolo al 15% sono introdotte in fiale criogeniche che sono immediatamente conservate a -80°C.

La ialuronidasi secondo l’invenzione può essere prodotta in grandi quantità partendo da piccoli fermentatori utilizzando metodi di coltura sia in Batch (esempio 13) sia in Fed-batch (esempio 14) come descritto in questa invenzione (tabella 1). Tuttavia i migliori risultati, in termini di produzione, stabilità e di ripetibilità, sono stati trovati utilizzando fermentazioni con il metodo fed-batch. Come antibiotico à ̈ possibile utilizzare ampicillina, neomicina, cloramfenicolo o kanamicina, in base alle caratteristiche degli specifici vettori.

Ad esempio, il clone di E.coli †BL21(DE3)- pHyal_sk_SL†à ̈ stato inoculato a partire da una fiala (proveniente dalla working cell bank conservata a -80°C) in terreno fresco di LB Miller (rapporto 1/20 rispetto al volume di fermentazione), contenente 50µg/ml di ampicillina ed incubato a 37°C a 150 rpm per 16-18 ore. Il clone proveniente dall’inoculo à ̈ stato fatto crescere in fermentatore su un terreno di coltura minimo a pH di 6.8. Come feed à ̈ stata data preferibilmente una soluzione di glicerolo. E.coli durante i processi fermentativi genera acido acetico (acetato) come un sottoprodotto indesiderabile che ha numerosi effetti negativi sulla produzione delle proteine ricombinanti. La quantità di acetato che si forma durante la fase fermentativa à ̈ direttamente correlata alla quantità di glucosio consumato da parte delle cellule di E.coli in crescita [15]. Nella presente invenzione, si à ̈ trovato che utilizzando come fonte di carbonio il glicerolo (fonte di carbonio non fermentabile a basso costo) al posto del glucosio si ottiene un incremento del processo di produzione fed-batch per la produzione della ialuronidasi ricombinante di circa 3 volte.

Ad esempio non limitativo, il feed può essere fornito dopo 6 ore dall’inoculo fino alla diciannovesima ora (tempo di induzione) con un rapporto di aggiunta esponenziale. Dopo induzione con Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG), soluzione finale 1mM, il feed può essere somministrato alla coltura ogni ora e alla stessa quantità dell’ultima aggiunta per 5 ore. L’induzione avviene dopo 24 ore dall’inoculo e prosegue per 8-24 ore, tipicamente 12 ore. Le cellule batteriche sono raccolte dopo il periodo di induzione, mediante centrifugazione, e conservate a –80°C. Le cellule di E.coli BL21(DE3) trasformate con il vettore pHyal_sk_SL producono la forma ricombinante nel periplasma cellulare con una concentrazione massima raggiunta di circa 2 g per litro di coltura e un’attività enzimatica maggiore di 87000 U/ml di coltura (7,5x10<7>- 8,7x10<7>I.U./l di coltura) ottenuta dopo 12 ore di induzione con 1mM IPTG a 37°C (Tabella 2). La ialuronidasi prodotta secondo questa invenzione era di circa 670-750 volte più alta rispetto alla ialuronidasi autologa prodotta in fermentatore come descritto nel precedentemente brevetto[9].

La proteina ricombinante espressa da E.coli, nei diversi parametri di fermentazione, à ̈ analizzata mediante corsa elettroforetica in SDS-PAGE (12%) dopo colorazione con Comassie Brilliant Blue G-250 (BIO-RAD, 161-0406) presentando un peso molecolare di 24kDa, mentre l’attività enzimatica avà ̈ mediante saggio turbidimetrico [16].

La ialuronidasi ricombinante prodotta in fermentatore mediante metodo fed-batch può essere purificata con un procedimento comprendente almeno tre passaggi cromatografici.

In preparazione alla prima purificazione, si pone il pellet conservato a -80°C (proveniente dalla fermentazione fed-batch di E.coli BL21(DE3) trasformate con il vettore pHyal_sk_SL) in una quantità equivalente a 0,6 litri di prodotto di fermentazione (approssimativamente equivalente al range di 80-90g di pellet cellulare riflettendo approssimativamente una produzione di 1-1,2 g/L di ialuronidasi ricombinante) ad equilibrare per 45 minuti a temperatura ambiente.

Una volta equilibrato, il pellet à ̈ stato trattato con una soluzione fresca (5°C) per la dispersione del pellet. Il pellet risospeso à ̈ trattato con una soluzione per lo shock osmotico per favorire l’estrazione delle proteine periplasmatiche. Dopo la fase di shock osmotico, il prodotto ottenuto à ̈ centrifugato e il surnatante prodotto una volta omogenato à ̈ portato a pH 8 e filtrato per gravità con filtri 0,65µm. La concentrazione della ialuronidasi estratta à ̈ valutata in SDS-PAGE risultando essere circa 750-900mg/totali(16-22% delle totali proteine periplasmatiche). L’attività della ialuronidasi ricombinante estratta invece à ̈ valutata mediante metodo turbidimetrico di Dorfman.

La frazione proteica ad attività enzimatica ialuronidasica così ottenuta à ̈ sottoposta a cromatografia a scambio anionico forte (esempio: Q sepharose XL).

La frazione proteica con attività enzimatica ialuronidasica così ottenuta à ̈ concentrata fino a 100ml utilizzando filtri in Polyethersulfone(PES) con cut-off 5kDa e diluita 10 volte con tampone acetato di sodio 50 mM a pH 4.

La frazione proteica ad attività enzimatica ialuronidasica così ottenuta à ̈ sottoposta a cromatografia a scambio cationico debole (esempio: CM-Sepharose® Fast Flow).

La frazione proteica con attività enzimatica ialuronidasica così ottenuta à ̈ concentrata fino a 100ml utilizzando filtri in Polyethersulfone(PES) con cut-off 5kDa e diluita 10 volte con tampone 50mM sodio fosfato con 1,5M ammonio solfato, pH 7.

La frazione proteica ad attività enzimatica ialuronidasica così ottenuta à ̈ sottoposta a cromatografia a interazione idrofobica aromatica (esempio: Phenyl-Sepharose HP) e le proteine eluite da quest’ultimo passaggio cromatografico sono state raccolte in un’unica frazione avente volume di circa 730 ml e sottoposte a saggio di attività ialuronidasica. Dopo l’analisi dell’attività enzimatica la frazione eluita à ̈ stata sottoposta ad ultrafiltrazione e a dialisi con 10 volumi di PBS 1x (SIGMA-P4417) portata alla concentrazione di circa 1mg/ml e filtrata con filtri di 0,2µm, la concentrazione proteica à ̈ determinata mediante BCA Protein Assay Reagent Kit (PIERCE).

Alla fine del processo di purificazione applicato su circa 1L di prodotto di fermentazione si ottengono circa 600-650 mg di ialuronidasi ricombinante e un’attività enzimatica maggiore di 2,6x10<7>U per litro di prodotto proveniente da fermentazione purificato (Tabella 3).

In tutte le frazioni con l’attività ialuronidasica era presente una banda proteica marcata a circa 24 kDa (Fig.16), la banda stata sottoposta ad elettroforesi SDS-PAGE su gel al 12% e quindi a blotting su membrana di poliviniliden difluoruro (BIO-RAD) e colorata secondo le istruzioni fornite dal fornitore. La banda relativa alla ialuronidasi à ̈ stata scissa con un bisturi e caricata nella camera di reazione del sequenziatore.

Il sequenziamento dell’estremità N-terminale, condotto ha permesso di stabilire che la ialuronidasi ricombinante prodotta secondo l’invenzione dal campione di E.coli trasformato con il vettore pHyal_sk_SL secondo l’invenzione ha fornito cromatogrammi nei quali à ̈ risultata presente in modo significativo una sola sequenza amminoacidica N-terminale, consentendo di ricostruire la sequenza sperimentale di seguito riportata: AGENGA (SEQ ID NO: 42).

Il potenziale enzimatico della ialuronidasi prodotta secondo l’invenzione (E.coli trasformato con il vettore pHyal_sk_SL) à ̈ stato valutato mediante confronto con l’attività enzimatica della ialuronidasi autologa [9], utilizzando il saggio enzimatico descritto [9] ed il valore di attività à ̈ stato riportato per essere in entrambi i casi maggiore di 4x10<4>U.I./mg di proteina. Inoltre, nelle analisi svolte al Dicroismo circolare (CD) i file di overlay linea nera (ialuronidasi autologa [9]) e grigia (ialuronidasi eterologa secondo l’invenzione), presentano un profilo sovrapponibile, confermando la stessa struttura proteica per entrambi i campioni (Fig. 17-a).

Rispetto all’arte nota [9], il metodo secondo la presente invenzione permette di ottenere ialuronidasi di origine batterica da un ceppo di E.coli ben caratterizzato come sicuro, anziché da Streptomyces koganeiensis, tramite tecnologia ricombinante (anziché estrattiva) adatta alla produzione su scala industriale, con produzione in periplasma (invece di matrice extracellulare). Inoltre, l’attività massima ialuronidasica ottenibile tramite il metodo della presente invenzione à ̈ > 80000 U per millilitro di coltura (contro 130 U per millilitro di surnatante di coltura nel metodo di [9]). Il metodo della presente invenzione permette inoltre di ottenere ialuronidasi ad elevatissima purezza (>99%) con soli 3 passaggi cromatografici (anziché 5 nel metodo di [9]) con notevoli vantaggi economici e minori tempi di operazione. In un aspetto, la presente invenzione riguarda una ialuronidasi da Streptomyces koganeiensis ATCC 31394 in forma purificata e comprendente la sequenza amminoacidica mostrata in SEQ. ID. No. 21.

La proteina della presente invenzione può essere isolata da prodotta da Streptomyces koganeiensis o prodotta per via ricombinante, ad esempio da colture di E. coli o di Bacillus subtilis.

Si à ̈ soprendentemente trovato che, rispetto alla proteina da Streptomyces koganeiensis nota [9], l’enzima della presente invenzione presenta più elevato livello di purezza (99% contro 98%), un minore livello di endotossine (Endotossine <0,5 U/mg anziché >0,5 U/mg), la presenza dell’intera sequenza peptidica (e della corrispondente sequenza nucleotidica) che non presenta cisteina (riducendo la possibilità di dare aggregati), una maggiore stabilità in soluzione a 5°C (100% di stabilità a 24 mesi contro 94% a 24 mesi della proteina di [9]), e ottime stabilità a 20°C (100% a 24 mesi), al pH 3-11,5 (testata fin a 24 ore). Inoltre, la ialuronidasi secondo la presente invenzione presenta il massimo di attività a pH fisiologico (intorno a 7) e temperatura corporea (circa 37°C) ed ha stabilità nel sangue > 90%.

La ialuronidasi secondo la presente invenzione à ̈ un prodotto derivato dall’ingegneria genetica, dove una delle maggiori difficoltà à ̈ stata nell’isolare l’intero gene codificante l’enzima, non avendo a supporto nel web una banca genomica o proteica del ceppo S.koganeiensis.

Per cui solo con il metodo sviluppato dagli inventori e descritto qui si à ̈ riusciti ad identificare ed isolare la sequenza nucleotidica codificante per la proteina. Infatti, questo frammento nucleotidico rappresenta la prima sequenza di DNA, in assoluto, isolata e documentata da questo ceppo batterico. A livello industriale la possibilità di poter avere l’intera sequenza del gene codificante per questa ialuronidasi (ad alta attività enzimatica) permette il suo utilizzo in differenti sistemi come: vettori, sistemi di integrazione genomica e in cellule, vantaggiosi per la produzione e l’utilizzo nell’industria farmaceutica dell’enzima.

Un’altra difficoltà da superare à ̈ stata quella di ottenere un’alta quantità di prodotto con un’alta attività e solubilità. In questa fase, dopo un vasto screening con diversi vettori di espressione, diversi tipi di inserzione del frammento nucleotidico codificante la proteina nel vettore di espressione (cioà ̈ l’inserimento del frammento con alcuni siti di restrizione rispetto ad altri) e lo screening della produzione in diverse linee cellulari, sono stati trovati il tipo di clonaggio, il tipo di vettore e le cellule di espressione più idonei per l’ottenimento della migliore produzione. Infine, il modello di espressione e produzione per questa ricombinante forniti qui, permettono di ottenere, alla fine del processo di purificazione, una proteina pura con un livello di endotossine < 0,5 U/mg di proteina, utilizzando solamente 3 steps cromatografici anziché 5 come avà ̈ nel procedimento noto (endotossine > 0,5 U/mg proteina) [9]. L’enzima opportunamente purificato à ̈ caratterizzato dalle analisi di cui i risultati sono elencati in tabella 4. La ialuronidasi secondo la presente invenzione mostra di avere quelle caratteristiche di attività e di alta purezza che sono necessarie per il suo utilizzo in applicazioni industriali, diagnostiche e terapeutiche. Inoltre, rispetto ad altre ialuronidasi finora note, la ialuronidasi prodotta secondo la presente invenzione ha mostrato essere un enzima che à ̈ in grado di idrolizzare l’acido ialuronico presente nella matrice interstiziale aumentando la permeabilità del tessuto connettivo e favorendo la diffusione e dispersione del farmaco, somministrato localmente sottocute, nei tessuti circostanti con estrema stabilità senza la possibilità di essere digerita da enzimi proteolitici presenti nel tessuto connettivo, che potrebbero facilmente degradarla una volta iniettata, inibendo la sua azione (figura 24). In questa invenzione, grazie alla messa a punto di un modello sperimentale in vitro utilizzando il metodo turbidimetrico, si à ̈ confermato quello che già era emerso dagli studi clinici precedenti, cioà ̈ che l’attività enzimatica della ialuronidasi bovina (PH20 bovine) viene inibita da sangue umano e/o animale ma si à ̈ trovato, invece, che il sangue umano e/o animale non inibisce la ialuronidasi da S.koganeiensis ricombinante (Fig. 25). Quindi, dagli studi qui presentati si à ̈ trovato che la ialuronidasi ricombinante dell’invenzione (prodotto secondo il metodo sopra riportata o da S.koganeiensis) ha un’elevata attività ialuronidasica, presenta un’alta stabilità agli enzimi proteolitici e à ̈ in grado di svolgere con la sua massima biodisponibilità la totale attività nel circolo sanguigno senza possibilità di riscontrare infezioni batteriche e virali. Pertanto, essa può trovare impiego, da sola o in associazione con altri principi attivi, nella preparazione di composizioni farmaceutiche o veterinarie destinate al trattamento di patologie in cui sia necessario o vantaggioso degradare l’acido ialuronico presente nell’organo o tessuto affetto dalla patologia.

Grazie all’elevata stabilità in soluzione acquosa, la ialuronidasi dell’invenzione può essere formulata anche in forma di composizioni a base acquosa, come soluzioni, creme idrofile, idrogel, oltre che in forma di prodotti lipofili come unguenti o creme oleose.

In un aspetto, la presente invenzione riguarda un polinucleotide comprendente la sequenza nucleotidica mostrata in SEQ. ID. No. 17 che codifica per la ialuronidasi batterica da Streptomyces koganeiensis ATCC 31394 in forma purificata e comprendente la sequenza amminoacidica mostrata in SEQ. ID. No. 21.

In un'altra forma di realizzazione, la presente invenzione riguarda un vettore ricombinante geneticamente ingegnerizzato comprendente detto polinucleotide comprendente la sequenza nucleotidica mostrata in SEQ. ID. No. 17.

Preferibilmente, detto vettore à ̈ un plasmide.

In un'altra forma di realizzazione, la presente invenzione fornisce una cellula ospite comprendente detto vettore.

In un altro aspetto, la presente invenzione riguarda una composizione adatta all’uso farmaceutico o cosmetico comprendente la ialuronidasi da Streptomyces koganeiensis ATCC 31394 in forma purificata e comprendente la sequenza amminoacidica mostrata in SEQ. ID. No. 21, ottenibile dal metodo sopra riportato o per estrazione da Streptomyces koganeiensis.

In un’ulteriore forma di realizzazione, la presente invenzione riguarda la ialuronidasi da Streptomyces koganeiensis ATCC 31394 in forma purificata e comprendente la sequenza amminoacidica mostrata in SEQ. ID. No. 21, ottenibile dal metodo sopra riportato o per estrazione da Streptomyces koganeiensis, per uso nel trattamento e/o nella prevenzione di un disturbo o patologia, opzionalmente in associazione con almeno un altro principio attivo.

La ialuronidasi della presente invenzione può essere applicata sia in campo medico sia in campo veterinario. Preferibilmente, la ialuronidasi secondo l’invenzione à ̈ per uso nel trattamento e/o prevenzione di almeno uno tra edemi, stati infiammatori, geloni, tumori solidi, forme allergiche mediate da IgE, patologie del cavo orale, emorragie vitreali spontanee, arteriosclerosi, disturbi della pressione arteriosa, disturbi cardio-cerebro vascolari come stenosi delle arterie affluenti al cervello o ictus, o mastite bovina.

Per quanto riguarda l’uso umano, senza intendere limitarsi ad esso, la ialuronidasi dell’invenzione può essere utilizzata per la preparazione di composizioni farmaceutiche destinate al trattamento di edemi, in particolare di edemi su base traumatica, o di stati infiammatori, come la sindrome emorroidaria; inoltre, può essere utilizzata per la preparazione di composizioni destinate al trattamento di geloni. La ialuronidasi dell’invenzione può essere utilizzata anche in associazione con altri farmaci dei quali sia necessario o vantaggioso aumentare la biodisponibilità.

Ad esempio, per il trattamento di edemi su base traumatica, sono particolarmente vantaggiose associazioni della ialuronidasi secondo l’invenzione con agenti anticoagulanti e/o fibrinolitici. Tali associazioni potranno inoltre contenere eventualmente uno o più agenti antinfiammatori steroidei o non steroidei. Inoltre, a queste composizioni potrà essere vantaggiosamente associato acido ialuronico solfatato, che à ̈ noto possedere, oltre a proprietà antinfiammatorie, anche proprietà antitrombotiche ed anticoagulanti. Associazioni della ialuronidasi secondo l’invenzione con altri principi attivi sono vantaggiose anche nel caso di preparazioni iniettabili contenenti principi attivi a peso molecolare particolarmente elevato, ad esempio anticorpi monoclonali, citochine, enzimi, DNA e nanoparticelle trasportatori di farmaci che sono solitamente somministrati per via endovenosa; la ialuronidasi permette la somministrazione degli stessi per via sottocutanea, secondo la cosiddetta procedura EASI (Enzymatically-Augmented Subcutaneous Infusion), che viene impiegata soprattutto per il ricambio di fluidi in pazienti terminali, in modo tale da limitare o evitare l’assistenza infermieristica. La ialuronidasi secondo l’invenzione può anche essere impiegata per la preparazione di composizioni farmaceutiche destinate al trattamento di tumori solidi resistenti. Essa, infatti, degradando l’acido ialuronico, abbassa la pressione dei fluidi interstiziali nella massa tumorale, incrementando il flusso sanguigno verso il tumore e quindi aumentando l’efficienza di trasporto di terapeutici verso il loro target che rallentano o inibiscono la crescita del tumore in modo più efficace. Per lo stesso motivo, essa aumenta anche l’efficacia di principi attivi antitumorali ad essa eventualmente associati. Pertanto, un ulteriore aspetto dell’invenzione riguarda composizioni farmaceutiche contenenti ialuronidasi in associazione con uno o più principi attivi antitumorali, come alcaloidi della Vinca (Vinblastina, Vincristina, Vinorelbina) e tassani (Paclitaxel).

Un ulteriore impiego terapeutico della ialuronidasi secondo l’invenzione riguarda l’uso nel trattamento di forme allergiche mediate da IgE tramite desensibilizzazione con enzima potenziato (EPD = Enzyme Potentiated Desensitization), che consiste nella somministrazione di dosi estremamente basse di allergeni per desensibilizzare soggetti ad essi sensibili. Associando la ialuronidasi ad un allergene à ̈ possibile aumentare l’efficacia del trattamento, poiché l’allergene raggiunge più facilmente il sito d’azione. Pertanto, un ulteriore oggetto dell’invenzione consiste in composizioni farmaceutiche contenenti ialuronidasi in associazione con uno o più allergeni che inducono reazioni allergiche mediate da IgE. La ialuronidasi trova inoltre impiego come fattore di diffusione di farmaci per uso odontoiatrico nel trattamento di patologie del cavo orale, ad esempio anestetici locali ed antibiotici; pertanto, secondo un ulteriore aspetto, l’invenzione riguarda composizioni farmaceutiche contenenti la ialuronidasi secondo l’invenzione in associazione con uno o più anestetici locali o antibiotici.

In oftalmologia, la ialuronidasi permette di accelerare notevolmente il trattamento di emorragie vitreali spontanee e può essere utilizzata, da sola o in associazione con altri principi attivi, nella preparazione di forme farmaceutiche per uso oftalmico, quali soluzioni, sospensioni, gel, creme e unguenti, destinate al trattamento di dette emorragie.

Studi precedenti hanno mostrato l’efficacia della ialuronidasi nel trattamento di malattie cardiovascolari quali arteriosclerosi [2] e nel management della pressione arteriosa [3]. Inoltre, grazie alla capacità che ha la ialuronidasi prodotta secondo questa invenzione di svolgere la totale attività nel circolo sanguigno, senza possibilità di essere inibita, permette di essere utilizzata anche per le terapie cardio-cerebro vascolari. Per quanto riguarda invece l’uso veterinario, una patologia che può essere efficacemente trattata con la ialuronidasi dell’invenzione à ̈ la mastite bovina; in tal caso, la ialuronidasi potrà essere somministrata in associazione con antibiotici, come Penicillina G, cefalosporine di I-IV generazione ed amminopenicilline potenziate.

Grazie alla sua stabilità in soluzione acquosa, la ialuronidasi secondo l’invenzione può essere formulata in prodotti a base acquosa; la scelta fra una formulazione a base acquosa ed una formulazione a base oleosa potrà essere effettuata da un tecnico esperto sulla base delle conoscenze comuni nel settore della tecnologia farmaceutica, in base agli altri ingredienti presenti nella composizione.

In una forma di realizzazione, la presente invenzione riguarda l’uso non terapeutico della ialuronidasi in forma purificata e comprendente la sequenza amminoacidica mostrata in SEQ. ID. No. 21 o ottenibile da Streptomyces koganeiensis ATCC 31394 o dal metodo sopra riportato, per applicazioni cosmetiche e/o di miglioramento dell’aspetto estetico.

La ialuronidasi viene anche utilizzata in cosmesi per il trattamento di reazioni granulomatose o di collocazioni errate, non volute di acido ialuronico, provocati da filler.

Inoltre, oggi, dopo studi e approfondimenti, à ̈ stato messo a punto un prodotto iniettivo a base di ialuronidasi, in grado di migliorare decisamente lo stato di fibrosi presente nella cellulite. La ialuronidasi, segmentando la componente fibrotica della cellulite, la rende più morbida con riduzione dell’effetto a buccia d’arancia, donando così un aspetto più naturale e piacevole alla porzione di pelle trattata. In questo caso, la ialuronidasi à ̈ indicata a tutte quelle persone che soffrono di cellulite con o poca presenza di massa grassa. Ed à ̈ ad oggi l’unica vera terapia in grado di combattere la cellulite con soddisfacenti risultati dal punto di vista estetico e/o terapeutico.

La presente invenzione comprende la ialuronidasi come sopra descritta per trattamento e/o prevenzione di cellulite sia con finalità terapeutiche sia con finalità non terapeutiche.

Infine, la ialuronidasi secondo l’invenzione può essere utilizzata come reagente in saggi biochimici per la determinazione quali/quantitativa dell’acido ialuronico. Una forma di realizzazione della presente invenzione à ̈ di seguito descritta in un esempio a titolo illustrativo e non limitativo.

Esempio 1: Ceppo batterico e condizioni di coltura

Il ceppo di S. koganeiensis à ̈ stato ottenuto da American Type Culture Collection (ATCC 31394). Il materiale extracellulare à ̈ stato ottenuto da cellule del batterio come descritto precedentemente [9]. Brevemente, una colonia del microorganismo à ̈ stata trasferita dalle piastre di ISP Medium 2 agar e fatto crescere in seguito in 500 ml di terreno di coltura [(20 g/l di estratto di lievito (Organotechnie) e 5 g/l di peptone di soia (Solabia), a pH 6.9)] a 30°C, agitando a 150 rpm per circa 16 ore. Dopo la crescita, la coltura à ̈ stata utilizzata per inoculare un fermentatore da 20 litri (Biostat U, B.BRAUN) contenente 10 litri di apposito terreno [(10 g/l di estratto di lievito (Organotechnie), 5 g/l di peptone di soia (Solabia), 3 g/l di estratto di malto (Costantino), 3 g/l di destrina tipo I (Sigma), 0,2 g/l di antischiuma (Sigma)]. Prima di effettuare l’inoculo, il pH à ̈ stato portato a 7,0 con NaOH; durante la fermentazione il pH à ̈ stato monitorato, ma non controllato, e la temperatura à ̈ stata mantenuta a 30°C durante tutta la fermentazione, mentre l’agitazione à ̈ stata mantenuta a 300 rpm, con un’aerazione di 1,6 VVM (litri aria/ litri terreno di fermentazione/min). La fermentazione ha avuto una durata di 48 h, tempo che coincideva con la massima produzione di attività enzimatica ialuronidasica nel surnatante di coltura. La coltura à ̈ stata campionata giornalmente per valutare la crescita, la vitalità e la concentrazione di ialuronidasi prodotta nel surnatante di coltura mediante determinazione dell’attività enzimatica con il metodo Dorfman [10]. A vari steps la densità cellulare à ̈ stata determinata mediante conteggio al microscopio, misurando la densità ottica a 600 nm e mediante conteggio delle colonie su piastre di ISP Medium 2 agar (Difco).

Frazioni cellulari sono prelevati ogni 3-4 ore, dove una parte à ̈ utilizzata per valutare i livelli di RNA e DNA (Fig. 1) mediante metodi standard, utilizzando lo spettrofotometro T60 UV-Vis (PG Instruments), l’altra parte della frazione à ̈ conservata a -80°C in RNAprotect Bacteria Reagent(Qiagen). Al termine della fermentazione la coltura à ̈ stata centrifugata a 5000rpm per 30 minuti a 4°C (SORVALL Evolution RC) e filtrata con filtri a flusso tangenziale in polietersulfone di 0.2µm, in modo tale da eliminare la biomassa di Streptomyces koganeiensis (che si presentava sotto forma di aggregati ifali rotondeggianti di 1-4 mm di diametro) ed ottenere un surnatante chiarificato contenente ialuronidasi. In seguito il surnatante à ̈ stato concentrato e dializzato per filtrazione tangenziale come precedentemente descritto [9].

Esempio 2: Isolamento in FPLC della Ialuronidasi autologa Il surnatante concentrato e dializzato à ̈ stato purificato ed arricchito della sola componente ialuronidasi come descritto precedentemente[9]. Brevemente, l’isolamento e la caratterizzazione della proteina sono avvenuti mediante un approccio di proteomica supportato da un processo basato sull’utilizzo di una combinazione di colonne cromatografiche a scambio ionico(GE Healthcare), in sequenza: CM-Sepharose FF, HiTrap Q XL e HiTrap SP FF, Resource Q. Le singole frazioni eluite dalle colonne cromatografiche sono state testate per la loro più alta attività ialuronidasica mediante un dosaggio enzimatico e analizzate in parallelo per il loro contenuto proteico mediante SDS-PAGE.

Determinazione dell’attività ialuronidasica. L’attività ialuronidasica à ̈ stata misurata con il metodo Dorfman [10] modificato. Brevemente, il prodotto ottenuto dal processo cromatografico à ̈ stato diluito in tampone fosfato 0,03 M, NaCl 0,82%, pH 6.3 e 1 ml della soluzione così ottenuta à ̈ stato miscelato con 1 ml di tampone substrato (tampone fosfato 0,03 M, NaC l0,82%, pH 6,3) contenente 0,5 mg di acido ialuronico. La digestione enzimatica à ̈ stata effettuata a 37°C per 30 minuti e alla fine del processo di incubazione à ̈ stata generata torbidità aggiungendo 4 ml di soluzione acida a base di siero di cavallo (SIGMA). La densità ottica a 640 nm à ̈ stata misurata esattamente 30 minuti dopo l’aggiunta della soluzione acida a base di siero di cavallo. Uno standard di ialuronidasi da testicolo di mammifero (EDQM, FIP Ialuronidasi, H1115000) contenente 328 U.I./mg à ̈ stato utilizzato per costruire una curva standard e l’attività (in unità) dei campioni à ̈ stata calcolata utilizzando questa curva.

Elettroforesi e analisi in SDS-PAGE.

Le analisi elettroforetiche su gel di poliacrilammide in presenza di sodio dodecil solfato (SDS-PAGE) sono state effettuate utilizzando il metodo di Laemmli [11] su gel di poliacrilammide al 12%, utilizzando un Mini-PROTEAN 3 (BIO-RAD) secondo le istruzioni del fornitore. Il peso molecolare della proteina purificata à ̈ stato stimato mediante confronto con le proteine standard a basso peso molecolare (BIO-RAD). I gel di poliacrilammide opportunamente colorati con Silver Stain Plus(BIO-RAD) o Coomassie(BIO-RAD) dopo la corsa elettroforetica, sono stati acquisiti con un acquisitore di immagine da laboratorio ImageQuant 300 TL (GE Healthcare), mentre le analisi (quantitative e qualitative) sono state effettuate impiegando il software di analisi dell’immagine ImageQuant TL (GE Healthcare).

Esempio 3: Sequenziamento N-terminale di frammenti proteici interni

Il sequenziamento amminoacidico N-terminale à ̈ stato effettuato secondo il metodo degradazione di Edman utilizzando un sequenziatore automatico di proteine in fase liquida pulsata (ABI-Perkin Elmer Mod. 477A). Le ricerche di omologia sono state effettuate utilizzando il software BLAST (National Center for Biotechnology Information at the National Library of Medicine (Bethesda, MD) [28], il server di ricerca Broad Institute (http://www.broadinstitute.org/) e il software ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/). Il signalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/) e Interproscan (http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/) sono stati utilizzati rispettivamente per condurre l'analisi del sito di taglio del peptide segnale e per le analisi del dominio proteico.

Le informazioni riguardanti la struttura primaria della ialuronidasi isolata sono state determinate sequenziando la porzione N-terminale dell’intera proteina e dei frammenti ottenuti dopo digestione con tripsina, chimotripsina, Glu-C e separazione dei frammenti prodotti mediante HPLC.

Dai sequenziamenti N-terminali effettuati sono state individuate la sequenza aminoacidica N-terminale e la sequenza aminoacidica di alcuni frammenti interni riportate, in ordine, di seguito:

- AGENGATTTFDGPVA (SEQ ID NO:1)

- RFSADTTIEAAFIKTTSETIHAATIYK (SEQ ID NO:2)

- GYADGSDKDAAALSLDLR (SEQ ID NO:3)

- AQVHIVQR (SEQ ID NO:4)

- IGNAATVPTSVDSSGGG (SEQ ID NO:5)

E’ stata eseguita una ricerca in banca dati con le sequenze individuate ed à ̈ stata identificata l’omologia della ialuronidasi di S. koganeiensis ATCC 31394 con una proteina predetta (protein_id= ZP_06911952.1)di Streptomyces pristinaespiralis ATCC 25486. Sulla base della sequenza N-terminale dei peptidi ottenuti della proteina isolata secondo questa invenzione, é stato possibile sintetizzare i corrispondenti oligonucleotidi che sono serviti per isolare il gene codificante la ialuronidasi dal genoma di S.koganeiensis.

Esempio 4: Identificazione del nuovo gene Ialuronidasi Il gene che codifica per la ialuronidasi à ̈ stato isolato dal DNA proveniente da cellule batteriche di Streptomyces koganeiensis. Brevemente, i pellets delle cellule batteriche provenienti dalla fermentazione nel periodo di produzione esponenziale di ialuronidasi (Fig. 1), sono trattati per l’estrazione e purificazione del DNA genomico utilizzando DNeasy Tissue Kit (Qiagen), mentre l’RNA à ̈ stato estratto con RNeasy Mini Kit (Qiagen). Una libreria di cDNA à ̈ stata ottenuta partendo dall’RNA totale utilizzando MICROBExpress kit e Poly(A) Tailing kit (Applied Biosystems) per isolare mRNA (RNA messaggero) dall’RNA totale e SMART RACE cDNA Amplification Kit (Clontech) secondo le raccomandazioni del produttore. I prodotti così ottenuti sono analizzati quantitativamente mediante spettrofotometro T60 UV-Vis (PG Instruments) e qualitativamente mediante elettroforesi in gel di agarosio [12].

Come descritto nel precedente paragrafo, sono state individuate le regioni aminoacidiche identiche tra S.koganeiensis e S.pristinaespiralis; sulle regioni nucleotidiche codificanti per questi residui aminoacidici identici, mediante l’uso di tool on-line e un generico codone usage batterico, sono stati disegnati i seguenti oligonucleotidi: MesFor2 (5’-GGAGAACGGGGCGACGACGACGTTCG-3’(SEQ ID NO:6)) corrispondente al peptide presente nella zona N-terminale(ENGATTTF), l’antisenso MesRev2(5’-GTCGGCACCGTCGCCGCGTTCCCGAT-3’(SEQ ID NO:7)) corrispondente al peptide presente nella zona C-terminale (IGNAATVP).

Con questi due oligonucleotidi e sul solo DNA genomico come templato, sono state effettuate diverse reazioni di PCR con la polimerasi KOD (Toyobo), sperimentando diverse condizioni di temperatura e utilizzando o meno DMSO al 4%.

Alla fine dai diversi steps di lavorazione à ̈ stato ottenuto un prodotto di PCR specifico (condizioni: denaturazione iniziale 95°C 5 min, 96°C 40 sec, 55°C 30 sec annealing, 72°C 1 min estensione, per 40 cicli e 72°C 10 min), infatti la PCR amplifica una sola banda specifica di circa 550 bp. Il contiguo dei due sequenziamenti ha fornito la sequenza (SEQ ID NO:8) mostrata in Fig. 2. I prodotti PCR sono stati analizzati mediante elettroforesi in gel di agarosio. Vista l’omologia tra le sequenze nucleotidiche di S.koganeiensis e S.pristinaespiralis, à ̈ stata posta l’attenzione sulle regioni non-codificanti fiancheggianti il gene in analisi.

Dalla fonte on-line http://www.broadinstitute.org/ annotation/genome/streptomyces_group/GenomeDescriptions.h tml, sono state individuate le regioni fiancheggianti il gene di S.pristinaespiralis sulle quali sono state disegnate due oligonucleotidi (MesExrF: 5’-cgggagaagggtgaacgc-3’(SEQ ID NO:9) e MesExtR: 5’-ctccgcgaccagttcttcg-3’ (SEQ ID NO:10)) da utilizzare in PCR sul templato di DNA genomico di S. koganeiensis. Le condizioni di PCR sono state definite dallo step precedente, mantenendo una temperatura di denaturazione superiore (96°C) visto l’alto contenuto di GC del genoma batterico.

Visti i risultati aspecifici, si à ̈ deciso di provare ad utilizzare questi oligonucleotidi in combinazione con MesFor2 (SEQ ID NO:6) e MesRev2 (SEQ ID NO:7) utilizzati in precedenza e che hanno dato il prodotto di PCR atteso. Si à ̈ trovato che solo l’amplificazione con gli oligo MesFor2 e MesExtR ha dato un prodotto chiaro e delle dimensioni attese; sequenziandolo con i due primer usati nell’amplificazione si à ̈ individuata la regione 3’ del gene in analisi. Per individuare le regioni nucleotidiche a monte della sequenza genica fino ad ora individuata à ̈ stata messa a punto ed eseguita la tecnica di PCR inversa (IPCR)(fig.3). Il metodo della IPCR à ̈ stato svolto dalle seguenti fasi di lavorazione:

a) Digestione del DNA genomico con enzimi di restrizione.

Sono state allestite tre diverse reazioni di digestione enzimatica con gli enzimi KpnI, NarI e NotI, di circa 100 ng di DNA genomico di S.koganeiensis.

b) Ligazione del DNA digerito.

c) Amplificazione per PCR utilizzando come templato le reazioni di ligazione, con oligonucleotidi che si appaiano all’interno della regione finora nota codificante per la ialuronidasi di S. koganeiensis.

Gli oligonucleotidi utilizzati sono i seguenti:

MesINTf (5’-GGCATCTACGTCACGGCGACGAAC-3’ (SEQ ID NO:11)) e l’antisenso MesINTr(5’-CGTACCCGCGGTGGGTGATCTTCAG-3’ (SEQ ID NO:12)).

Dai preparati digeriti con KpnI e NarI sono risultati dei prodotti di PCR, rispettivamente di 700 e 1400 bp circa, che sequenziati hanno fornito informazioni precise sulla regione 5’ fiancheggiante il gene della ialuronidasi di S. koganeiensis. Con questo step à ̈ stata completata l’identificazione della sequenza nucleotidica d’interesse (SEQ ID NO:13), riportata in (fig.4).

Una coppia di primers disegnati sulle sequenze non codificanti (forward:5’-accattcggagttgatcgttg-3’(SEQ ID NO:14); Reverse:5’-gtcaactgcactgttctctcc-3’ (SEQ ID NO:15)) e fiancheggianti l’intero gene codificante la ialuronidasi sono utilizzati per l’amplificazione dell’intero gene. Il prodotto PCR ottenuto di cui sequenza dopo sequenziamento (SEQ ID NO:16) à ̈ rappresentata in (fig.5), à ̈ scisso dal gel dopo corsa elettroforetica, purificato utilizzando il Wizard SV Gel and PCR Clean-UP System(Promega) e clonato direttamente all’interno del vettore pCR®-BluntII-TOPO®(Invitrogen) in cellule di E.coli. Successivamente, i cloni che risultavano essere positivi (pCR-BluntII-TOPO[sk_HYAL]) alla PCR per la presenza del plasmide contenente il gene ialuronidasi, sono stati analizzati mediante sequenziamento.

Analisi della sequenza proteica dedotta.

Il software BLAST à ̈ stato utilizzato per condurre le ricerche di omologia sul database GenBank. Mentre il software Expasy Translate Tool, disponibile sul web, à ̈ stato utilizzato per permettere la traduzione in silico della sequenza nucleotidica del gene isolato e codificante per la ialuronidasi da S.koganeiensis in sequenza proteica. Infine, il dominio conservato per l’attività ialuronidasica à ̈ stato verificato mediante il software InterProScan disponibile sul sito web (http://www.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan/) (Fig.7(a)). Dai risultati ottenuti à ̈ stato osservato che l’intera lunghezza del gene codificante per la ialuronidasi da S.koganeiensis era di 744 bp (SEQ ID NO:17), e la lunghezza della sequenza del peptide à ̈ stata stimata in 247 aminoacidi (SEQ ID NO:18). Il gene contiene un putativo dominio (SEQ ID NO:19) di proteine appartenenti alla famiglia delle ialuronidasi (Hyaluronidase_1), come evidenziato dalla ricerca delle omologie nel database di Pfam. Inoltre, l’analisi della sequenza (SEQ ID NO:18), utilizzando il tool http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-1.1/, indicava una sequenza segnale (signal peptide) di 30 aminoacidi (aminoacidi da 1 a 30 (SEQ ID NO:47), con sito di taglio tra l’aminoacido 30 e 31). La proteina matura (SEQ ID NO:21) quindi à ̈ lunga 217 aminoacidi (corrispondente sequenza nucleotidica 651bp (SEQ ID NO:22)) e il suo peso molecolare predetto (tramite il tool disponibile sul sito http://web.expasy.org/compute_pi/) à ̈ di 21679.96 Da. Infine, l’analisi in BLAST per le omologie di sequenza mostra un’omologia tra la sequenza aminoacidica determinata della ialuronidasi da S.koganeiensis ATCC 31394 (SEQ ID NO:18) e le sequenze aminoacidiche riportate in banca dati sul web: un’omologia con la sequenza aminoacidica della proteina Hyaluronoglucosaminidase (predetta dall’analisi dell’open reading frames a partire dal locus genomico descritto nel web con il codice YP_006266806.1) di Actinoplanes sp. mostrando il 68% identità/ 78% similarità, un’omologia con la sequenza aminoacidica della proteina predetta ZP_06911952.1 (predetta dall’analisi dell’open reading frames a partire dal locus genomico descritto nel web con codice ZP_06911952.1) di Streptomyces pristinaespiralis ATCC 25486 con il 66% identità/ 77% similarità (SEQ ID NO:23 e SEQ ID NO : 48) e un’omologia con la sequenza aminoacidica della ipotetica proteina STSU_30255 (predetta dall’analisi dell’open reading frames a partire dal locus genomico descritto nel web con codice ZP_10072726.1) di Streptomyces tsukubaensis NRRL18488 (SEQ ID NO:24 e SEQ ID NO:49) con il 66% identità/ 80% similarità (Fig. 6 a,b). Data la significativa similarità del dominio funzionale (SEQ ID NO:25 e SEQ ID NO:50; SEQ ID NO:26 e SEQ ID NO:51) riscontrata con la ialuronidasi descritta da questa invenzione (SEQ ID NO:19), si à ̈ isolata dal locus genomico di appartenenza e caratterizzata l’intera sequenza nucleotidica CDS codificante per queste proteine, definite sul web con la terminologia di “ipotetiche o “predette†, potendo identificarle, per la prima volta, in questa invenzione come ialuronidasi (Fig.7(b)). Tuttavia, nessuna di queste analisi ha trovato riportata in letteratura l’intera esatta sequenza nucleotidica e quella aminoacidica della ialuronidasi isolata secondo brevetto.

Un’omologia di sequenza era presente tra una regione della sequenza (SEQ ID NO:27 e SEQ ID NO:52) della ialuronidasi da S.koganeiensis secondo l’invenzione e uno dei moduli presenti nel dominio aminoacidico del Cd44 murino che lega l’acido ialuronico (Fig.7(a)).

Esempio 5: Clonaggio del gene codificante la Ialuronidasi in pHT43(+)

Il cDNA codificante per la Ialuronidasi da S.koganeiensis (SEQ ID NO: 41) à ̈ stato amplificato mediante PCR partendo dal plasmide pCR-BluntII-TOPO[sk_HYAL] estratto e purificato da cellule di E.coli con DNA Purification System Wizard Plus SV Minipreps e utilizzando i seguenti primers: senso(5'-gtaGGATCCGCCGGGGAGAACGGCGCGACGACGA–3’ SEQ ID NO:28); antisenso(5’-gacTCTAGATCACGCCGGTGCGATCGTCGTGACC-3’ SEQ ID NO:29). I cicli di PCR eseguiti per l’amplificazione sono stati: denaturazione iniziale 96°C per 5 minuti; 30 cicli di annealing 55°C per 30 secondi, estensione a 72°C per 1 minuto e seguente denaturazione 96°C per 40 secondi. La Taq DNA polymerase utilizzata per l’amplificazione à ̈ stata DyNAzyme II DNA Polymerase (FINNZYMES) (Fig. 8). Il prodotto amplificato (672bp) à ̈ stato purificato mediante kit Wizard SV Gel and PCR Clean-UP System (Promega), digerito con BamHI(BioLabs) e XbaI(BioLabs), e ligato mediante ligasi T4 (Ambion) con il vettore pHT43(+) digerito precedentemente con BamHI e XbaI (Fig. 8).

Avvenuta la ligasi il vettore à ̈ stato trasformato all’interno di cellule E. coli strain DH5a (Invitrogen codice 12297-016), mediante trasformazione chimica. Le cellule dopo trasformazione sono piastrate in LB agar contenente ampicillina (50µg/ml) à ̈ messi ad incubare a 37°C per 16h. Le colonie ottenute sono state analizzate per verificare l’avvenuta corretta ligasi tra il frammento del gene ialuronidasi e il vettore, mediante PCR (denaturazione iniziale 94°C per 5 minuti; per 30 cicli: annealing 55°C per 30 secondi, estensione a 72°C per 60 secondi e seguente denaturazione 94°C per 1 minuto), grazie all’ausilio di primers vettore-specifici (Forward:5’- TGTGGAATTGTGAGCGGATA -3’ (SEQ ID NO:30), Reverse: 5’- TTTCAACCATTTGTTCCAGGT -3’(SEQ ID NO:31)). Il prodotto PCR ottenuto (927bp) insieme ai prodotti ottenuti mediante digestione del vettore pHTsk_HYAL [vettore con l’inserto](Fig. 10) con enzimi di restrizione (BamHI, XbaI), à ̈ stato analizzato mediante corsa elettroforetica in gel di agarosio 1% (Fig. 9), utilizzando degli standards di riferimento per il peso molecolare (ΦX174 DNA e λDNA /HindIII della Fermentas). Per l’analisi del corretto frame del gene codificante per la ialuronidasi dopo essere stato ligato con il vettore, la sequenza del prodotto PCR à ̈ sequenziata. La sequenza nucleotidica ottenuta (SEQ ID NO:38) dopo sequenziamento (Fig.13,a) à ̈ analizzata usando i tool bioinformatici quali ClustalW, Traslate (ExPASy) e Chromas life.

Esempio 6: Clonaggio del gene codificante la Ialuronidasi in pET22b(+)

Il cDNA codificante per la Ialuronidasi da S.koganeiensis (SEQ ID NO: 41) à ̈ stato amplificato mediante PCR partendo dal plasmide pCR-BluntII-TOPO[sk_HYAL] estratto e purificato da cellule di E.coli con DNA Purification System Wizard Plus SV Minipreps e utilizzando i seguenti primers: senso (5'- tggCCATGGCCGGGGAGAACGGCGCGACGACGA– 3’(SEQ ID NO : 32)); antisenso (5’-ctcGAATTCtcaCGCCGGTGCGATCGTCGTGACC-3’(SEQ ID NO : 33)). I cicli di PCR eseguiti per l’amplificazione sono stati: denaturazione iniziale 96°C per 5 minuti; 30 cicli di annealing 55°C per 30 secondi, estensione a 72°C per 1 minuto e seguente denaturazione 96°C per 40 secondi. La Taq DNA polymerase utilizzata per l’amplificazione à ̈ stata DyNAzyme II DNA Polymerase (FINNZYMES) (Fig. 8). Il prodotto amplificato (671bp) à ̈ stato purificato mediante kit Wizard SV Gel and PCR Clean-UP System (Promega), digerito con NcoI(BioLabs) e EcoRI(BioLabs), e ligato mediante ligasi T4 (Ambion) con il vettore pET22b(+) digerito precedentemente con NcoI e EcoRI (Fig. 8). Avvenuta la ligasi il vettore à ̈ stato trasformato all’interno di cellule E. coli strain DH5a (Invitrogen codice 12297-016), mediante trasformazione chimica. Le cellule dopo trasformazione sono piastrate in LB agar contenente ampicillina (50µg/ml) à ̈ messi ad incubare a 37°C per 16h. Le colonie ottenute sono state analizzate per verificare l’avvenuta corretta ligasi tra il frammento del gene ialuronidasi e il vettore, mediante PCR (denaturazione iniziale 94°C per 5 minuti; per 30 cicli: annealing 55°C per 30 secondi, estensione a 72°C per 60 secondi e seguente denaturazione 94°C per 1 minuto), grazie all’ausilio di primers vettore-specifici (T7-promoter: 5’- TAATACGACTCACTATAGGG-3’(SEQ ID NO : 34), T7-terminator: 5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’(SEQ ID NO : 35)). Il prodotto PCR ottenuto (940bp) insieme ai prodotti ottenuti mediante digestione del vettore pHyal_sk [vettore con inserto] (Fig. 11) con enzimi di restrizione (NcoI, EcoRI) à ̈ stato analizzato mediante corsa elettroforetica in gel di agarosio 1% (Fig. 9), utilizzando degli standards di riferimento per il peso molecolare (ΦX174 DNA e λDNA /HindIII della Fermentas). Per l’analisi del corretto frame del gene codificante per la ialuronidasi dopo essere stato ligato con il vettore, la sequenza del prodotto PCR à ̈ sequenziata. La sequenza nucleotidica ottenuta (SEQ ID NO : 39) dopo sequenziamento (Fig.13,b) à ̈ analizzata usando i tool bioinformatici quali ClustalW, Traslate (ExPASy) e Chromas life.

Esempio 7: Clonaggio del gene codificante la Ialuronidasi in pET21b+

Il cDNA codificante per la Ialuronidasi da S.koageneins (SEQ ID NO: 41) à ̈ stato amplificato mediante PCR partendo dal plasmide pCR-BluntII-TOPO[sk_HYAL] estratto e purificato da cellule di E.coli con DNA Purification System Wizard Plus SV Minipreps e utilizzando i seguenti primers: senso (5'-ataCATATGGCCGGGGAGAACGGCGCGACGACGA– 3’(SEQ ID NO:36)); antisenso(5’-ctcGAATTCtcaCGCCGGTGCGATCGTCGTGACC-3’(SEQ ID NO : 37)). I cicli di PCR eseguiti per l’amplificazione sono stati: denaturazione iniziale 96°C per 5 minuti; 30 cicli di annealing 55°C per 30 secondi, estensione a 72°C per 1 minuto e seguente denaturazione 96°C per 40 secondi. La Taq DNA polymerase utilizzata per l’amplificazione à ̈ stata DyNAzymeâ„¢ II DNA Polymerase (FINNZYME) (Fig. 8). Il prodotto amplificato (672bp) à ̈ stato purificato mediante kit Wizard SV Gel and PCR Clean-UP System (Promega), digerito con NdeI(BioLabs) e EcoRI(BioLabs), e ligato mediante ligasi T4 (Ambion) con il vettore pET21b(+)((Novagen) digerito precedentemente con NdeI e EcoRI (Fig. 8). Avvenuta la ligasi il vettore à ̈ stato trasformato all’interno di cellule E. coli strain DH5a (Invitrogen codice 12297-016), mediante trasformazione chimica. Le cellule dopo trasformazione sono piastrate in LB agar contenente ampicillina (50µg/ml) à ̈ messi ad incubare a 37°C per 16h. Le colonie ottenute sono state analizzate per verificare l’avvenuta corretta ligasi tra il frammento del gene ialuronidasi e il vettore, mediante PCR (denaturazione iniziale 94°C per 5 minuti; per 30 cicli: annealing 55°C per 30 secondi, estensione a 72°C per 60 secondi e seguente denaturazione 94°C per 1 minuto), grazie all’ausilio di primers vettore-specifici (T7-promoter: 5’- TAATACGACTCACTATAGGG-3’(SEQ ID NO:34), T7-terminator: 5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’(SEQ ID NO:35)). Il prodotto PCR ottenuto (874bp) insieme ai prodotti ottenuti mediante digestione del vettore pHyal_sk_SL [vettore con inserto] (Fig. 12) con enzimi di restrizione (NdeI, EcoRI), à ̈ stato analizzato mediante corsa elettroforetica in gel di agarosio 1% (Fig. 9), utilizzando degli standards di riferimento per il peso molecolare (ΦX174 DNA e λDNA /HindIII della Fermentas). Per l’analisi del corretto frame del gene codificante per la ialuronidasi dopo essere stato ligato con il vettore, la sequenza del prodotto PCR à ̈ sequenziata. La sequenza nucleotidica ottenuta (SEQ ID NO: 40) dopo sequenziamento (Fig.13,c) à ̈ analizzata usando i tool bioinformatici quali ClustalW, Traslate (ExPASy) e Chromas life.

Esempio 8: Ceppi batterici ospiti utilizzati per il clonaggio e l’espressione del gene ialuronidasi di S.koganeiensis.

Escherichia coli strain DH5α (Invitrogen, Genotipo: F-φ80lacZ∆M15 ∆(lacZYA-argF)U169 recA1 endA1 hsdR17(rk-, mk+) phoA supE44 thi-1 gyrA96 relA1 tonA (confers resistance to phage T1) [22], à ̈ stato utilizzato come ospite per l’amplificazione plasmidica del sistema di clonaggio. Questo ceppo à ̈ fornito da Invitrogen (One Shot Max Efficiency DH5α-T1R chemically competent E.coli, 12297-016). Le cellule sono state scongelate e messe in coltura in terreno solido LB agar (10g/l peptone da caseina, 5g/l estratto di lievito, 10g/l NaCl, 15g/l agar batteriologico) contenente 10mM di MgSO4 e fatti crescere per 18h a 37°C. Dalla coltura ottenuta, una singola colonia à ̈ presa e fatta crescere in TYM broth (Tryptone 20g/l, Yeast Extract 5g/l, 20ml NaCl 5M, MgSO4 1mM) a 37°C. Dalla coltura le cellule ottenute sono trattate per ottenere cellule chimicamente competenti. Le cellule ottenute sono divise in aliquote e conservate a -80°C in un opportuno tampone di conservazione contenente glicerolo al 15%. Le trasformazioni sono svolte su questo stock di aliquote.

B.subtilis WB800N (Genotipo: nprE aprE epr bpr mpr :: ble nprB :: bsr .vpr wprA :: hyg cm :: neo; NeoR [23]) , fornito dalla MoBiTec, à ̈ un ceppo batterico gram positivo caratterizzato dal fatto di essere deficitario di otto proteasi, di conseguenza à ̈ un ceppo batterico che viene utilizzato per la produzione di proteine eterologhe secrete. In questo ceppo inoltre à ̈ stato inserito il gene per la resistenza alla neomicina, prendendo la nomenclatura di WB800N. Le cellule di questo ceppo batterico dopo un opportuna produzione sono state rese competenti, aliquotate e conservate a -80°C in un opportuno tampone di conservazione contenente glicerolo al 15%. Le trasformazioni sono svolte su questo stock di aliquote.

Escherichia coli strain MG1655 (Numero ATCC : 12297-016, Genotipo: F- lambda- [24,25]), à ̈ stato utilizzato come ospite nel sistema di espressione del gene della ialuronidasi da S.koganeiensis. Il ceppo batterico à ̈ fornito da American Type Culture Colletion (ATCC). Le cellule arrivate liofilizzate sono state messe in coltura prima in pochi ml di terreno liquido e poi in terreno solido LB agar (10g/l peptone da caseina, 5g/l estratto di lievito, 10g/l NaCl) contenente 10mM di MgSO4 e fatti crescere per 18h a 37°C. Dalla coltura ottenuta una singola colonia à ̈ presa e fatta crescere in TYM broth a 37°C. Dalla coltura le cellule ottenute à ̈to trattate per ottenere cellule chimicamente competenti. Le cellule ottenute sono aliquotate e conservate a -80°C in un opportuno tampone di conservazione contenente glicerolo al 15%. Le trasformazioni sono svolte su questo stock di aliquote.

Escherichia coli strain BL21(DE3)(E. coli B F– dcm ompT hsdS(rB – mB–) gal λ(DE3)[26,27]), à ̈ stato utilizzato come ospite per il sistema di espressione del gene codificante la ialuronidasi di S.koganeiensis. Il ceppo batterico à ̈ fornito da Novagen con codice 69450-3. Le cellule sono state messe in coltura prima in pochi ml di terreno liquido e poi in terreno solido LB agar (10g/l peptone da caseina, 5g/l estratto di lievito, 10g/l NaCl) contenente 10mM di MgSO4 e fatti crescere per 18h a 37°C. Dalla coltura ottenuta, una singola colonia à ̈ presa e fatta crescere in TYM broth a 37°C. Dalla coltura le cellule ottenute sono trattate per ottenere cellule chimicamente competenti. Le cellule ottenute sono aliquotate e conservate a -80°C in un opportuno tampone di conservazione contenente glicerolo al 15%. Le trasformazioni sono svolte su questo stock di aliquote. Esempio 9: Trasformazione dei plasmidi pHTsk_HYAL , pHyal_sk e pHyal_sk_SL in cellule di espressione.

Le cellule DH5a contenenti rispettivamente i vettori pHTsk_HYAL , pHyal_sk e pHyal_sk_SL sono stati messi in coltura in circa 6ml di LB broth con ampicillina (50µg/ml) e fatti crescere per 16-18h. Le rispettive colture dopo la crescita delle cellule ingegnerizzate sono centrifugate a circa 5000g per 10 minuti. Dal pellet che ottenevamo sono estratti e purificati i rispettivi plasmidi pHTsk_HYAL , pHyal_sk e pHyal_sk_SL utilizzando il kit Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega). I vettori pHTsk_HYAL , pHyal_sk e pHyal_sk_SL purificati, sono separatamente trasformati in cellule di espressione. Il primo vettore à ̈ trasformato in cellule, rese competenti, di Bacillus subtilis (WB800N-MoBiTec) mentre gli ultimi due vettori sono trasformati in cellule, rese competenti, di E. coli strain BL21(DE3)e/o MG1655. Tutte le trasformazioni sono state eseguite mediante trasformazione chimica [13]. Le cellule di B.subtilis e di E.coli dopo trasformazione sono rispettivamente piastrati in LB agar contenente cloramfenicolo (10µM) più neomicina (10µM), e in LB agar contenente ampicillina (50µg/ml) per sviluppare la resistenza all’antibiotico, à ̈ messi ad incubare a 37°C per 16h. Le colonie ottenute dopo le rispettive trasformazioni sono state analizzate per verificare la presenza del corretto plasmide all’interno delle cellule di espressione, mediante PCR (denaturazione iniziale 94°C per 5 minuti; per 30 cicli: annealing 55°C per 30 secondi, estensione a 72°C per 60 secondi e seguente denaturazione 94°C per 1 minuto), grazie all’ausilio di primers specie-specifici (Forward:5’-TGTGGAATTGTGAGCGGATA-3’(SEQ ID NO:30),Reverse:5’ TTTCAACCATTTGTTCCAGGT -3’(SEQ ID NO:31)) per l’analisi dell’avvenuta trasformazione in B.subtilis e per verificare l’avvenuta trasformazione in E.coli. (T7-promoter: 5’- TAATACGACTCACTATAGGG-3’(SEQ ID NO:34), T7-terminator: 5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’(SEQ ID NO:35))I prodotti PCR ottenuti per le cellule trasformate con pHTsk_HYAL (927bp), pHyal_sk(940bp) e pHyal_sk_SL(874bp) sono stati analizzati mediante corsa elettroforetica in gel di agarosio 1%, utilizzando degli standards di riferimento per il peso molecolare (ΦX174 DNA e λDNA /HindIII della Fermentas). Per l’analisi del corretto frame del gene codificante per la ialuronidasi dopo essere stato legato al vettore, la sequenza dei prodotti PCR à ̈ sequenziata. La sequenza nucleotidica ottenuta dopo sequenziamento à ̈ analizzata usando i tool bioinformatici quali Vector NTI Advance 9 (Invitrogen), ClustalW, Traslate (ExPASy) e Chromas life.(Fig. 13 a,b,c).

Esempio 10: Valutazione del livello di espressione della ialuronidasi ricombinante.

I cloni sia di B.subtilis risultati positivi per la presenza dei vettori contenenti il frammento nucleotidico della ialuronidasi risultato geneticamente con la sequenza in frame per la corretta espressione (SEQ ID NO: 41), sono testati per il livello di espressione, quindi le cellule così ingegnerizzate sono inoculate in beute contenenti 500 ml di LB broth con cloramfenicolo(10µM, SIGMA) e neomicina(10µM, SIGMA), ed incubati a 37°C a 250 rpm. Quando il valore di crescita cellulare arrivava a OD600nm 0.8, sono indotti con IPTG (SIGMA, I6758) ad una concentrazione finale di 1mM. Dopo le 12 ore di induzione, la coltura batterica à ̈ centrifugata a 7500 giri per 10 minuti e raccolto il surnatante di coltura per valutare l’espressione in B.subtilis.

Successivamente il surnatante proveniente dalle prove di espressione in B.subtilis à ̈ stato concentrato (20 volte) e dializzato in fosfato buffer 1x mediante ultrafiltrazione su appositi filtri in polietersulfone con cut-off di 5kD.

In SDS-PAGE la ricombinante espressa presentava un peso molecolare di circa 24 kDa presentando la massima espressione, dopo induzione a OD600nm 0.8 con 1mM IPTG dopo 12 ore a 37°C.

L’espressione e la localizzazione dell’espressione della ialuronidasi nelle cellule di B.subtilis (SEQ ID NO: 21), nei diversi cloni analizzati, à ̈ stata determinata mediante corsa elettroforetica in SDS-PAGE (12%) dopo colorazione con Coomassie Brilliant Blue G-250 (BIO-RAD, 161-0406) e con un opportuno saggio enzimatico, ad esempio il saggio di Dorfman.

Esempio 11: Valutazione del livello di espressione della ialuronidasi ricombinante in E.coli

I cloni di E.coli risultati positivi per la rispettiva presenza dei vettori contenenti il frammento nucleotidico della ialuronidasi risultato geneticamente con la sequenza in frame (SEQ ID NO: 41) per la corretta espressione (SEQ ID NO: 21), sono testati per il livello di espressione, quindi inoculate in beute contenenti 500 ml di LB broth con ampicillina (50 µg/ml, SIGMA) ed incubati a 37°C a 250 rpm. Quando il valore di crescita cellulare arrivava a OD600nm 0.8, sono indotti con IPTG (SIGMA, I6758) ad una concentrazione finale di 1mM. Le cellule batteriche sono raccolte dopo 3-4 ore di induzione, mediante centrifugazione a 7500 giri per 10 minuti. Dopo centrifugazione à ̈ raccolto il pellet batterico per la valutazione dell’espressione nelle cellule ingegnerizzate di E.coli e per verificare in quale porzione della cellula à ̈ prodotta la ricombinante. Successivamente, i pellet provenienti dalle cellule di E.coli indotte con IPTG sono state trattate con B-PER Bacterial Protein (PIERCE), secondo le indicazioni fornite dal fornitore, per valutare l’espressione della ialuronidasi nella porzione periplasmatica e/o citoplasmatica e/o formanti corpi inclusi. Entrambi i cloni di E.coli contenenti rispettivamente i plasmidi pHyal_sk e pHyal_sk_SL esprimevano la ricombinante in forma solubile nella porzione periplasmatica:

E.coli BL21(DE3)contenente pHyal_sk. In SDS-PAGE la ricombinante espressa presenta un peso molecolare di circa 24 kDa costituendo circa il 40% delle totali proteine batteriche, dopo induzione a OD600nm 0.8 con 1mM IPTG per 3-4 ore a 37°C. Tuttavia, della quantità di ricombinante espressa solo il 18% (complessivamente solo il 7,2%) à ̈ presente in forma solubile nel periplasma il restante 82% presenta corpi inclusi (complessivamente solo il 32,8%). La porzione solubile periplasmatica risulta essere presente ad una concentrazione massima di 52 µg/ml coltura, con un’attività enzimatica paria a circa 2100 U/ml coltura.

E.coli BL21(DE3)contenente pHyal_sk_SL. In SDS-PAGE la ricombinante espressa presenta un peso molecolare di circa 24 kDa costituendo circa il 15% delle totali proteine batteriche, dopo induzione a OD 600 nm 0.8 con 1mM IPTG per 3-4 ore a 37°C. Inoltre, tutta la proteina espressa à ̈ presente in forma solubile nel periplasma. La porzione solubile periplasmatica risultava essere presente ad una concentrazione di circa 125µg/ml coltura, con un’attività enzimatica maggiore di 5000U/ml coltura. Sia l’espressione che la localizzazione dell’espressione della ialuronidasi nelle cellule di E.coli, nei diversi cloni analizzati, à ̈ stata determinata sia mediante corsa elettroforetica in SDS-PAGE (12%) dopo colorazione con Coomassie Brilliant Blue G-250 (BIO-RAD, 161-0406) sia con un opportuno saggio enzimatico, ad esempio il saggio di Dorfman.

Esempio 12: Sviluppo della Master Cell Bank e Working Cell Bank dei ceppi ricombinanti

Master Cell Bank (MCB)

Sotto sterilità à ̈ stata prelevata una singola colonia dallo striscio di colonie appartenenti al ceppo produttore ed risospesa in una beuta sterile contenente 10ml di terreno liquido (LB broth con cloramfenicolo(10µM, SIGMA) e neomicina(10µM, SIGMA) per quanto riguarda le cellule ricombinanti di B.subtilis e LB broth con ampicillina (50µg/ml, SIGMA) per quanto riguarda le cellule ricombinanti di E.coli) e messi ad incubare a 200rpm a 37°C per circa 16 ore. Dopo il periodo di incubazione e dopo controlli opportuni sulla sterilità della coltura i 10ml di ciascuna coltura sono stati rispettivamente trasferiti in 100ml di terreno liquido (LB broth con cloramfenicolo(10µM, SIGMA) e neomicina(10µM, SIGMA) per quanto riguarda le cellule ricombinanti di B.subtilis e LB broth con ampicillina (50µg/ml, SIGMA) per quanto riguarda le cellule ricombinanti di E.coli) e posti ad incubare per 5-6 ore a 37°C a 200 rpm. Nuovamente, dopo il periodo di incubazione e dopo controlli opportuni sulla sterilità della coltura, sono stati aggiunti a freddo a ciascuna coltura una quantità di glicerolo sterile fino al raggiungimento di una concentrazione finale di glicerolo pari al 15%. La miscela à ̈ mescolata e aliquote da 2ml sono introdotte in fiale criogeniche (CORNING, 430659) che sono immediatamente poste a -80°C.

Lo sviluppo della Master Cell Bank à ̈ stato eseguito sotto massima sterilità e per i ceppi: strain B.subtilis (WB800N-MoBiTec) contenenti il plasmide ingegnerizzato con pHTsk_HYAL (Clone 105), strain E.coli (DH5α) contenenti il plasmide ingegnerizzato con pHTsk_HYAL (clone 105), strain E.coli(DH5α) e E.coli(BL21(DE3)) contenenti il plasmide ingegnerizzato con pHyal_sk (Clone 413), strain E.coli(DH5α) e E.coli(BL21(DE3)) contenenti il plasmide ingegnerizzato con pHyal_sk_SL (Clone 225) e strain E.coli (DH5α) e E.coli(BL21(DE3)) contenenti il plasmide ingegnerizzato con pRH_sk (Clone 600).

Working Cell Bank (WCB)

Sotto sterilità à ̈ stata prelevata da una fiala proveniente dalla Master Cell Bank un’aliquota, ed eseguito lo striscio in terreno solido LB broth con cloramfenicolo(10µM, SIGMA) e neomicina(10µM, SIGMA) per quanto riguarda le cellule ricombinanti di B.subtilis e LB broth con ampicillina (50µg/ml, SIGMA) o kanamicina (30µg/ml, SIGMA) per quanto riguarda le cellule ricombinanti di E.coli, e messi ad incubare a 37°C per circa 18 ore. Sotto cappa sterile à ̈ stata prelevata una singola colonia dallo striscio di colonie appartenenti al ceppo produttore ed risospesa in una beuta sterile contenente 10ml di terreno liquido (LB broth con cloramfenicolo(10µM, SIGMA) e neomicina(10µM, SIGMA) per quanto riguarda le cellule ricombinanti di B.subtilis e LB broth con ampicillina (50µg/ml, SIGMA) o kanamicina (30µg/ml, SIGMA) per quanto riguarda le cellule ricombinanti di E.coli) e messi ad incubare a 200rpm a 37°C per circa 16 ore. Dopo il periodo di incubazione e dopo controlli opportuni sulla sterilità della coltura i 10ml di ciascuna coltura sono stati rispettivamente trasferiti in 100ml di terreno liquido (LB broth con cloramfenicolo(10µM, SIGMA) e neomicina(10µM, SIGMA) per quanto riguarda le cellule ricombinanti di B.subtilis e LB broth con ampicillina (50µg/ml, SIGMA) o kanamicina (30µg/ml, SIGMA) per quanto riguarda le cellule ricombinanti di E.coli) e posti ad incubare per 5-6 ore a 37°C a 200rpm. Nuovamente, dopo il periodo di incubazione e dopo controlli opportuni sulla sterilità della coltura, sono stati aggiunti a freddo a ciascuna coltura una quantità di glicerolo sterile fino al raggiungimento di una concentrazione finale di glicerolo pari al 15%. La miscela à ̈ mescolata e aliquote da 2ml sono introdotte in fiale criogeniche (CORNING, 430659) che sono immediatamente poste a -80°C.

Lo sviluppo della Working Cell Bank à ̈ stato eseguito sotto massima sterilità e per i ceppi: strain B.subtilis (WB800N-MoBiTec) contenenti il plasmide ingegnerizzato con pHTsk_HYAL (rIaluronidasi clone 105), E.coli(BL21(DE3)) contenenti il plasmide ingegnerizzato con pHyal_sk (rIaluronidasi clone 413), strain E.coli(BL21(DE3) contenenti il plasmide ingegnerizzato con pHyal_sk_SL (clone rHyal_Sk) e per lo strain E.coli(BL21(DE3) contenenti il plasmide ingegnerizzato con pRH_sk (clone rH_sk).

Sia su MCB che sulla WCB sono stati eseguiti i seguenti tests per valutare la loro purezza: valutazione del numero di copie del plasmide dalle cellule della MCB e WCB, analisi del plasmide mediante enzimi di restrizione e separazione dei frammenti digeriti mediante gel di agarosio 1%, valutazione della conservazione in glicerolo delle cellule contenenti il plasmide di espressione nella MCB e WCB, valutazione della stabilità delle cellule contenenti il plasmide di espressione nella MCB e WCB, vitalità delle cellule ricombinanti in piastre LB, identità dei ceppi E.coli, purezza della coltura, Coli phage assay, valutazione del prodotto di espressione in SDS-PAGE, sequenziamento della regione codificante la proteina ricombinante.

Esempio 13: Fermentazioni in Batch della ialuronidasi ricombinante.

La capacità dei cloni di E.coli †BL21(DE3)- pHyal_sk e BL21(DE3)- pHyal_sk_SL†di produrre la ricombinante ialuronidasi à ̈ stata valutata mediante crescita in fermentatori mediante coltura in Batch.

L’inoculo à ̈ preparato inoculando una fiala (proveniente dalla working cell bank conservata a -80°C) in 400ml (rapporto 1/20 rispetto al volume di fermentazione) di terreno fresco LB, contenente 50µg/ml di ampicillina ed incubato a 37°C a 150 rpm per 16-18 ore. I cloni provenienti dai rispettivi inoculi (E.coli †BL21(DE3)-pHyal_sk e BL21(DE3)- pHyal_sk_SL†), separatamente sono stati fatti crescere in fermentatore su un terreno di coltura minimo la cui composizione per litro era data da: 2g di Na2HPO4*2H2O, 2g di KH2PO4, 4g di K2HPO4, 3,8g di acido citrico, 3,3g (NH4)2SO4, 40ml di glicerolo, 0,6 ml di PPG 2000 antifoam (Fluka Codice 81380). Il pH à ̈ stato corretto dopo sterilizzazione a 121°C a 6.8 con una soluzione di idrossido di ammonio al 25% (SIGMA) e solamente dopo avere aggiunto i seguenti componenti per litro di terreno, sterilizzati per filtrazione con filtri 0,2µm: 0,49g di MgSO4*7H2O, 0,0147g di CaCl2, 1ml di FeCl2 (0,2M), 2ml di elementi in Tracce (elementi in tracce per litro: 0,96g di citric acid, 0,25g di CoCl2*6H2O, 1,5g di MnCl2*4H2O, 0,15g di CuCl2*2H2O, 1,5g di H3BO3, 0,25g di Na2MoO4*2H2O, 1,3g di Zn(CH3COO)2*2H2O), 0,01g di tiamina, 5g di glucosio, 3g di estratto di lievito.

L’induzione con Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG) avà ̈ dopo 4-6 ore dall’inoculo e proseguiva per circa 16-18 ore. I paramentri di fermentazione messi a punto erano i seguenti: temperatura 37°C, agitazione 600rpm, flusso di aria 5-10 litri aria al minuto e pressione in testa di circa 0,8 bar.

Le cellule batteriche sono raccolte dopo il periodo di induzione di circa 16 ore, mediante centrifugazione a 7500 giri per 25 minuti. Dopo la raccolta, le cellule batteriche sono conservate a –80°C, pronte per essere utilizzate per l’estrazione e la purificazione della ialuronidasi ricombinante. La proteina ricombinante espressa da E.coli, nei diversi parametri di fermentazione, à ̈ analizzata mediante corsa elettroforetica in SDS-PAGE (12%) dopo colorazione con Comassie Brilliant Blue G-250 (BIO-RAD, 161-0406), mentre l’attività enzimatica avà ̈ mediante saggio turbidimetrico [16].

Le cellule di E.coli BL21(DE3) trasformate con il vettore pHyal_sk sono indotte per esprimere la solubile proteina eterologa nel periplasma, in fermentatore con 8L di medium. In SDS-PAGE, la ricombinante espressa, presentava un peso molecolare di circa 24 kDa e una quantità di proteina espressa nel periplasma cellulare di circa 0,1 -0,15 g/L di coltura, massima quantità raggiunta dopo 16 ore di induzione con 1mM IPTG a 37°C.

Le cellule di E.coli BL21(DE3) trasformate con il vettore pHyal_sk_SL sono indotte per esprimere la solubile proteina eterologa nel periplasma, in fermentatore con 8L di medium. La porzione solubile periplasmatica risultava essere presente ad una concentrazione di circa 0,35-0,5g/L di coltura con un’attività enzimatica maggiore di 15050-21495 U/ml di coltura. In SDS-PAGE la ricombinante espressa presentava un peso molecolare di circa 24 kDa costituendo circa il 18% delle totali proteine batteriche, dopo induzione con IPTG 1mM alla 16° ora a 37°C.

Per entrambi i cloni,la stabilità del plasmide durante la fase di fermentazione risultava essere del 100% (Tabella 2). La stabilità del plasmide à ̈ monitorata fino alla fine della fermentazione mediante screening con la tecnica del Replica plating [29], che permette di replicare le colonie su piastre contenenti l’antibiotico.

Esempio 14: Fermentazioni Fed-batch della ialuronidasi ricombinante.

La capacità dei cloni di E.coli †BL21(DE3)- pHyal_sk e BL21(DE3)- pHyal_sk_SL†di produrre la ricombinante ialuronidasi à ̈ stata valutata mediante crescita in fermentatori mediante coltura Fed-Batch.

L’inoculo à ̈ preparato inoclulando una fiala (proveniente dalla working cell bank conservata a -80°C) in 500 ml (rapporto 1/20 rispetto al volume di fermentazione) di terreno fresco LB, contenente 50µg/ml di ampicillina ed incubato a 37°C a 150 rpm per 16-18 ore. I cloni provenienti dai rispettivi inoculi (E.coli †BL21(DE3)-pHyal_sk e BL21(DE3)- pHyal_sk_SL†), separatamente sono stati fatti crescere in fermentatore su un terreno di coltura minimo la cui composizione per litro era data da: 2g di Na2HPO4*2H2O, 2g di KH2PO4, 4g di K2HPO4, 3,8g di acido citrico, 3,3g (NH4)2SO4, 0,6 ml di PPG 2000 antifoam (Fluka Codice 81380). Il pH à ̈ stato corretto dopo sterilizzazione a 121°C a 6.8 con una soluzione di idrossido di ammonio al 25% (SIGMA) e solamente dopo avere aggiunto i seguenti componenti per litro di terreno, sterilizzati per filtrazione con filtri 0,2µm: 0,49g di MgSO4*7H2O, 0,0147g di CaCl2, 1ml di FeCl2 (0,2M), 2ml di elementi in Tracce (elementi in tracce per litro: 0,96g di citric acid, 0,25g di CoCl2*6H2O, 1,5g di MnCl2*4H2O, 0,15g di CuCl2*2H2O, 1,5g di H3BO3, 0,25g di Na2MoO4*2H2O, 1,3g di Zn(CH3COO)2*2H2O), 0,01g di tiamina, 5g di glucosio, 3g di estratto di lievito.

Come Feed à ̈ stata data una soluzione di glicerolo (~1,2kg per 10L di fermentazione) sterilizzata in autoclave e dopo aggiunti i seguenti componenti, filtrati 0,2µm, per litro di feed: 2g di Na2HPO4*2H2O, 3g di KH2PO4, 5,4g di K2HPO4 , 3,8g di acido citrico, 4g di (NH4)2SO4, 9g di MgSO4*7H2O, 0,047g di CaCl2, 1ml di FeCl2 (soluzione 0,2M), 2ml elementi in tracce (elementi in tracce per litro: 0,96g di citric acid, 0,25g di CoCl2*6H2O, 1,5g di MnCl2*4H2O, 0,15g di CuCl2*2H2O, 1,5g di H3BO3, 0,25g di Na2MoO4*2H2O, 1,3g di Zn(CH3COO)2*2H2O) e 0,01g di tiamina. Il feed à ̈ dato dopo 6 ore dall’inoculo fino alla diciannovesima ora con un rapporto di aggiunta esponenziale. La scelta di utilizzare il glicerolo come fonte di carbonio sta nel fatto che le cellule di espressione E. coli utilizzate generano acido acetico (acetato) come un sottoprodotto indesiderato che ha numerosi effetti negativi sulla produzione di proteine ricombinanti [14]. In particolare, le cellule di E.coli producono acido acetico come un co-prodotto extracellulare di fermentazione aerobica, il tasso di formazione di acetato à ̈ direttamente correlato al tasso con cui crescono le cellule o al tasso con il quale essi consumano il substrato solito come fonte di carbonio, il glucosio. In comuni sistemi di fermentazione a fed-batch , il tasso di crescita della cultura à ̈ determinata dalla velocità di alimentazione del nutriente limitante “il glucosio†con conseguente crescita cellulare sopra la soglia che porta ad una conseguente produzione di acetato e quindi ad una riduzione di espressione di proteine ricombinanti.

In questa invenzione, varie strategie sono state sviluppate per limitare l'accumulo di acetato al fine di ridurre gli effetti negativi e di aumentare la produttività della proteina ricombinante. Una strategia che ci ha permesso di ottenere ottimi risultati à ̈ stata quella di utilizzare il glicerolo come fonte di carbonio. Il glicerolo, diversamente dal glucosio, non viene fermentato ad acido acetico. I risultati ottenuti hanno dimostrato che l’utilizzo del glicerolo, e non di glucosio, nel processo di fermentazione a fed-batch messo a punto in questa invenzione, ha migliorato la resa della solubile proteina ricombinante ialuronidasi di circa 2 – 3 volte [15]. Inoltre, a differenza del glucosio che ha un effetto inibitorio sul promotore che regola la sintesi della proteina ricombinante di questa invenzione, il glicerolo può essere dato alla fermentazione anche dopo induzione con IPTG, permettendo di ridurre non solo la formazione di acetato ma anche di incrementare la formazione solubile della ialuronidasi ricombinante. Inoltre, il basso costo del glicerolo rispetto al glucosio lo rende preferenziale, come fonte di carbonio per la fermentazione di E. coli, in campo industriale. Dopo induzione con Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG), soluzione finale 1mM, il feed à ̈ somministrato alla coltura ogni ora e alla stessa quantità dell’ultima aggiunta per 5 ore. L’induzione avà ̈ dopo 24 ore dall’inoculo e proseguiva per 12 ore. I paramentri di fermentazione messi a punto erano i seguenti: temperatura 37°C, agitazione 600rpm, flusso di aria 5-10 litri aria al minuto e pressione in testa di circa 0,8 bar.

Le cellule batteriche sono raccolte dopo il periodo di induzione di 12 ore, mediante centrifugazione a 7500 giri per 25minuti. Dopo la raccolta, le cellule batteriche sono conservate a –80°C, pronte per essere utilizzate per l’estrazione e la purificazione della ialuronidasi ricombinante. La proteina ricombinante espressa da E.coli, nei diversi parametri di fermentazione, à ̈ analizzata mediante corsa elettroforetica in SDS-PAGE (12%) dopo colorazione con Comassie Brilliant Blue G-250 (BIO-RAD, 161-0406), mentre l’attività enzimatica avà ̈ mediante saggio turbidimetrico [16].

Le cellule di E.coli BL21(DE3) trasformate con il vettore pHyal_sk sono indotte per esprimere la solubile proteina eterologa nel periplasma, in fermentatore con 10L di medium. In SDS-PAGE, la ricombinante espressa, presentava un peso molecolare di circa 24 kDa e una quantità di proteina espressa nel periplasma di circa 0,4 g/L di coltura, massima quantità raggiunta dopo 6 ore di induzione con 1mM IPTG a 37°C (Figura 14).

Le cellule di E.coli BL21(DE3) trasformate con il vettore pHyal_sk_SL sono indotte per esprimere la solubile proteina eterologa nel periplasma, in fermentatore con 10L di medium. La porzione solubile periplasmatica risultava essere presente ad una concentrazione di circa 1,2g/L di coltura con un’attività enzimatica maggiore di 48000U/ml di coltura. In SDS-PAGE la ricombinante espressa presentava un peso molecolare di circa 24 kDa costituendo circa il 16%-18% delle totali proteine batteriche, dopo induzione con IPTG 1mM alla 12° ora a 37°C (Figura 15).

Esempio 15: Fermentazione Fedbatch di E.coli BL21(DE3) trasformate con il vettore pHyal_sk_SL su 20L di Medium. Brevemente, le cellule di E.coli BL21(DE3) trasformate con il vettore pHyal_sk_SL sono indotte per esprimere la solubile proteina eterologa nel periplasma, in fermentatore con 20L di medium. La porzione solubile periplasmatica risultava essere presente ad una concentrazione di circa 2g/L di coltura (Tabella 2) con un’attività enzimatica maggiore di 87000U/ml di coltura (7,5x107-8,7x107 I.U./l di coltura), circa 670-750 volte più alta rispetto alla ialuronidasi autologa prodotta in fermentatore come descritto nel precedentemente brevetto[9]. In SDS-PAGE la ricombinante espressa presentava un peso molecolare di circa 24 kDa costituendo circa il 16%-18% delle totali proteine batteriche, dopo induzione con IPTG 1mM alla 12°ora a 37°C.

La stabilità del plasmide durante la fase di fermentazione, per tutti cloni testati con il metodo fedbatch, risultava essere del 100% (Tabella 2). La stabilità del plasmide à ̈ monitorata fino alla fine della fermentazione mediante screening con la tecnica del Replica plating [29], che permette di replicare le colonie su piastre contenenti l’antibiotico.

Infine, cloni ingegnerizzati geneticamente in modo diverso, sono stati testati per la loro capacità di produrre, in fermentatore, la ialuronidasi ricombinante codificata dal gene isolato secondo questa invenzione. I risultati sono stati sintetizzati in tabella 1.

Esempio 16: Analisi dell’attività della ricombinante ialuronidasi nel Brodo di fermentazione

Da 0,1ml di coltura, proveniente da tempi specifici di induzione o dal prodotto finale, à ̈ stato ricavato il pellet dopo centrifugazione 7500 RPM in centrifuga (eppendorf centrifuge 5402, rotore F-45-18-11) per 10 minuti. Il pellet cellulare à ̈ stato risospeso in 500µl di B-PER Bacterial Protein Extraction Reagent (PIERCE), e miscelato al vortex (Heidolph Reax top) al massimo della velocità per circa 1 minuto o comunque fino a completa risospensione del pellet. Il pellet opportunamente risospeso à ̈ stato centrifugato a 13000 RPM per 10 minuti per separare le proteine solubili dalle proteine insolubili. Il surnatante raccolto(proteine solubili) à ̈ stato testato per la presenza di attività ialuronidasi mediante il metodo turbidimetrico descritto da Di Ferrante [16] modificato per analisi su piastre a 96 pozzetti. Brevemente per singolo pozzetto, 31µl di incubation buffer [17], 8µl di BSA (0,2mg/ml), 8µl di acido ialuronico(2mg/ml), 13µl di H2O e 10µl di surnatante (proteine solubili) diluito 10, 100 e 1000 volte con PBS 1x (SIGMA-P4417), sono stati allestiti. La piastra à ̈ incubata a 37°C per un ora. Dopo un ora di incubazione 200µl di soluzione alcalina CTAB(2,5% (w/v) in 0,5M di NaOH) à ̈ stata aggiunta a ciascun pozzetto per precipitare l’acido ialuronico non digerito e la piastra à ̈ incubata per 20 minuti a temperatura ambiente. L’estensione della precipitazione à ̈ stata misurata mediante una densità ottica di 640nm.

In seguito, l’attività per ml di proteina ricombinante nel brodo di coltura à ̈ stata ottenuta utilizzando il seguente calcolo: attività su ml ottenuta dal test/2 x fattore di diluizione x 10 = attività su ml di prodotto proveniente da fermentazione.

Uno standard di Hyaluronidase (FIP) à ̈ stato utilizzato per costruire una curva standard, e l’attività della ialuronidasi ricombinante nella porzione periplasmatica à ̈ stata calcolata utilizzando questa curva.

Esempio 17: Estrazione su larga scala della frazione solubile

Dal pellet conservato a -80°C (proveniente dalla fermentazione di E.coli BL21(DE3) trasformate con il vettore pHyal_sk_SL) una quantità equivalente a 0,6 litri di prodotto di fermentazione (approssimativamente equivalente al range di 80-90g di pellet cellulare riflettendo approssimativamente una produzione di 1-1,2 g/L di ialuronidasi ricombinante)à ̈ posta ad equilibrare per 45 minuti a temperatura ambiente.

Primo metodo: Una volta equilibrato il pellet à ̈ stato trattato con 210 ml di soluzione fresca (5°C) per la dispersione del pellet (205,2g/L glucosio, 5,6g/L EDTA). Il pellet à ̈ risospeso, con la soluzione di dispersione, sotto agitazione magnetica per 15 minuti a temperatura ambiente e dopo per circa 1 ora a 5°C, utilizzando un agitatore magnetico Heidolph type MR2002 a velocità di 500rpm. Dopo circa 1 ora il pellet risospeso à ̈ aggiunto a freddo in 4,5L di una soluzione per lo shock osmotico (1,2g/L TRIS, 4ml/L HCl 2N,0,1g/L MgCl2) per l’estrazione della proteina periplasmatica. La miscela ottenuta à ̈ agitata per 4 ore a 4°C, utilizzando un agitatore magnetico Heidolph type MR2002 a velocità di 500rpm.

Dopo la fase di shock osmotico il prodotto ottenuto contenente le cellule di E.coli disperse à ̈ stato centrifugato a 5°C per 45 minuti a velocità di circa 7500rpm utilizzando una centrifuga Sorval Evolution Rc con rotore SLC-6000. Dopo centrifuga il surnatante à ̈ raccolto mentre il pellet à ̈ eliminato. Il surnatante a questo punto à ̈ stato omogenato utilizzando il sistema “Ultra Turrax†con il livello di velocità 2 per 15 secondi.

Il surnatante dopo trattamento con “Ultra Turrax†à ̈ stato portato a pH 8 e filtrato per gravità con filtri 0,65µm. Dopo filtrazione la concentrazione di Tris nel filtrato à ̈ stata portata da 10mM a 50mM con una soluzione 3M Tris-HCl e dopo portato a pH 8. La concentrazione della ialuronidasi estratta à ̈ stata valutata in SDS-PAGE risultando essere circa 750-850mg/totali (22-24% delle totali proteine periplasmatiche). L’attività della ialuronidasi ricombinante estratta invece à ̈ valutata mediante metodo turbidimetrico di Dorfman.

Secondo metodo: Una volta equilibrato, il pellet à ̈ stato trattato con 500 ml della soluzione B-PER Bacterial Protein Extraction Reagent (PIERCE) per la liberazione nel mezzo delle proteine periplasmatiche. Il pellet à ̈ risospeso, con la soluzione di B-PER, sotto agitazione magnetica per 30 minuti a temperatura ambiente e dopo per altri 30 minuti a 5°C, utilizzando un agitatore magnetico Heidolph type MR2002 a velocità di 1000rpm. Dopo circa 1 ora il pellet risospeso à ̈ centrifugato a 5°C per 45 minuti a velocità di circa 11000rpm utilizzando una centrifuga Sorval Rc-5B con rotore Sorvall. Dopo centrifugazione il surnatante risultante à ̈ stato aggiunto a freddo in 5L di una soluzione 50mM Tris-HCl, pH 8. La soluzione ottenuta à ̈ agitata per 10 minuti a 4°C, utilizzando un agitatore magnetico Heidolph type MR2002 a velocità di 200rpm. Dopo agitazione la soluzione à ̈ stata omogenata utilizzando il sistema “Ultra Turrax†con il livello di velocità 2 per 15 secondi. Il surnatante dopo trattamento con “Ultra Turrax†à ̈ stato portato a pH 8 e filtrato per gravità con filtri 0,65µm. La concentrazione della ialuronidasi estratta à ̈ stata valutata in SDS-PAGE risultando essere circa 0,9-1,1g/totali (16%-18% delle totali proteine periplasmatiche). L’attività della ialuronidasi ricombinante estratta invece à ̈ valutata mediante metodo turbidimetrico di Dorfman.

Esempio 18: Purificazione ricombinante

Le resine e le colonne cromatografiche sono state acquistate da GE Helthcare Life Sciences e mantenute secondo le specifiche fornite dal fornitore. Le fasi di equilibrazione ed eluizione sono state effettuate con un sistema Fast Performance Liquid Chromatography (FPLC; AKTA explorer 100, GE Healthcare) ad un flusso di 40-50 ml/min per tutte le 3 cromatografie. Al termine di ogni passaggio cromatografico l’attività ialuronidasica à ̈ stata controllata con il saggio di Dorfman modificato descritto [9]. Una volta estratta la frazione solubile dalla porzione periplasmatica à ̈ caricata sulla prima cromatografia a scambio anionico forte.

Cromatografia a scambio anionico forte (Q sepharose XL): L’estratto filtrato portato a 50mM di Tris-HCl e a pH 8 à ̈ stato caricato su 500 ml-600ml di resina Q sepharose XL (GE Healthcare) impaccata in una colonna XK-50 (GE Healthcare) ed equilibrata con 8 volumi di letto (bed volumes, BV) di tampone Tris-HCl a pH 8. Dopo il caricamento, la colonna à ̈ stata lavata, prima con 3 BV del medesimo tampone e dopo con 8BV di tampone Tris-HCl a pH 8 con 40mM NaCl, quindi le proteine legate sono state eluite con 5 BV di una soluzione tampone Tris-HCl a pH 8 con 110mM NaCl. Le proteine eluite sono state raccolte in un’unica frazione avente volume di circa 950 ml e sottoposte a saggio di attività ialuronidasica.

Diafiltrazione e cromatografia a scambio cationico debole (CM-Sepharose® Fast Flow):

La frazione ottenuta à ̈ concentrata fino a 100ml utilizzando il sistema di ultrafiltrazione tangenziale Labscale TFF system (Millipore) e utilizzando filtri in Polyethersulfone(PES) con cut-off compreso fra 3 e 8 kDA, preferibilmente di 5 kDa. Dopo concentrazione il campione à ̈ diluito 10 volte con tampone acetato di sodio 50 mM a pH 4. La frazione così ottenuta à ̈ stata caricata su 300ml-400ml di resina CM-Sepharose® Fast Flow (GE Healthcare), impaccata in una colonna XK-50 (GE Healthcare) ed equilibrata con 6 volumi di letto (bed volumes, BV) di tampone acetato di sodio 50 mM a pH 4.0. Dopo il caricamento (preferibilmente a temperatura di 4-5°C), la colonna à ̈ stata lavata con 3 BV del medesimo tampone, quindi le proteine legate sono state eluite con 8 BV di una soluzione tampone acetato di sodio 50 mM a pH 4.5. Le proteine eluite sono state raccolte in un’unica frazione avente volume di circa 380 ml e sottoposte a saggio di attività ialuronidasica.

Diafiltrazione e cromatografia a interazione idrofobica aromatica (Phenyl-Sepharose HP):

La frazione ottenuta e positiva al dosaggio enzimatico, à ̈ concentrata fino a 100ml utilizzando il sistema di ultrafiltrazione tangenziale Labscale TFF system (Millipore) e utilizzando filtri in Polyethersulfone(PES) con cut-off compreso fra 3 e 8 kDA, preferibilmente di 5 kDa. Dopo concentrazione il campione à ̈ diluito 10 volte con tampone 50mM sodio fosfato con 1,5M ammonio solfato, pH 7. La frazione così ottenuta à ̈ stata caricata su 300ml-400ml di resina Phenyl-Sepharose HP(GE Healthcare), impaccata in una colonna XK-50 (GE Healthcare) ed equilibrata con 8 volumi di letto (bed volumes, BV) di tampone 50mM sodio fosfato con 1,5M ammonio solfato, pH 7. Dopo il caricamento, la colonna à ̈ stata lavata con 3 BV del medesimo tampone, quindi le proteine legate sono state eluite con 5 BV di una soluzione tampone 50mM sodio fosfato con 0,8M ammonio solfato, pH 7 . Le proteine eluite sono state raccolte in un’unica frazione avente volume di circa 730 ml e sottoposte a saggio di attività ialuronidasica. Dopo l’analisi dell’attività enzimatica la frazione elutita à ̈ stata sottoposta ad ultrafiltrazione e a dialisi con 10 volumi di PBS 1x (SIGMA-P4417), utilizzando filtri in Polyethersulfone(PES) con cut-off compreso fra 3 e 8 kDA, preferibilmente di 5 kDa, portata alla concentrazione di circa 1mg/ml e filtrata con filtri di 0,2µm (la concentrazione proteica à ̈ determinata mediante BCA Protein Assay Reagent Kit,PIERCE). Durante le fasi di purificazione per ottenere un buon recupero del prodotto purificato, la ricombinante à ̈ caricata nelle colonne cromatografiche con un rapporto massimo di 1,5 mg di ialuronidasi per ml di resina. Tutte le frazioni proteiche eluite, sia quelle enzimaticamente attive che quelle non attive o poco attive, sono state quindi analizzate mediante SDS-PAGE al 12% e poi colorate con silver stain secondo le istruzioni fornite dal fornitore; in tutte le frazioni con l’attività ialuronidasica era presente una banda proteica marcata a circa 24 kDa (Fig.16). Nelle differenti fasi della purificazione la concentrazione proteica della ricombinante à ̈ stata stimata come descritto precedentemente in SDS-PAGE(12%) risultando essere di 0,45-0,5 g/totali nella prima cromatografia (Q sepharose XL), 0,45-0,50g/totali nella seconda cromatografia (CM-Sepharose® Fast Flow), 0,4-0,45 g/totali nella terza cromatografia (Phenyl-Sepharose HP) e 0,35-0,4 g/totali dopo DIA-filtrazione. Alla fine del processo di purificazione applicato su circa 1L di prodotto di fermentazione si ottiene circa 600-650mg (Attività enzimatica maggiore di 2,6x107 U/L di prodotto fermentazione purificato) di ialuronidasi ricombinante (Tabella 3).

Esempio 19: Analisi e caratterizzazione

Determinazione dell’attività ialuronidasica

L’attività ialuronidasica à ̈ stata misurata con il metodo Dorfman [10] modificato. Brevemente, il prodotto ottenuto dalle diverse fasi del processo à ̈ stato diluito in tampone fosfato 0,03 M, NaCl 0,82%, pH 6.3 e 1 ml della soluzione così ottenuta à ̈ stato miscelato con 1 ml di tampone substrato (tampone fosfato 0,03 M, NaC l0,82%, pH 6.3) contenente 0,5 mg di acido ialuronico. La digestione enzimatica à ̈ stata effettuata a 37°C per 30 minuti e alla fine del processo di incubazione à ̈ stata generata torbidità aggiungendo 4 ml di soluzione acida a base di siero di cavallo (SIGMA). La densità ottica a 640 nm à ̈ stata misurata esattamente 30 minuti dopo l’aggiunta della soluzione acida a base di siero di cavallo. Uno standard di ialuronidasi da testicolo di mammifero (EDQM, FIP Ialuronidasi, H1115000) contenente 328 U.I./mg à ̈ stato utilizzato per costruire una curva standard e l’attività (in unità) dei campioni à ̈ stata calcolata utilizzando questa curva.

Elettroforesi SDS-PAGE

Le analisi elettroforetiche su gel di poliacrilammide in presenza di sodio dodecil solfato (SDS-PAGE) sono state effettuate utilizzando il metodo di Laemmli [11] su gel di poliacrilammide al 12%, utilizzando un Mini-PROTEAN 3 (BIO-RAD) secondo le istruzioni del fornitore. La concentrazione e il peso molecolare della ialuronidasi nel prodotto di fermentazione e nelle diverse fasi di purificazione à ̈ stato stimato mediante confronto con le proteine standard a basso peso molecolare (GE Healthcare).

I gel di poliacrilammide opportunamente colorati con Coomassie(BIO-RAD) dopo la corsa elettroforetica, sono stati acquisiti con un acquisitore di immagine da laboratorio ImageQuant™ 300 TL (GE Healthcare), mentre le analisi (quantitative e qualitative) sono state effettuate impiegando il software di analisi dell’immagine ImageQuant TL (GE Healthcare).

Sequenziamento dell’estremità N-terminale

Il sequenziamento amminoacidico N-terminale à ̈ stato effettuato secondo il metodo degradazione di Edman utilizzando un sequenziatore automatico di proteine in fase liquida pulsata (ABI-Perkin Elmer Mod. 477A). Il software BLAST [18] à ̈ stato utilizzato per condurre ricerche di omologia sulla banca dati GenBank e su quella del progetto genoma delle specie Streptomyces disponibili sul web. Le frazioni, ottenute dalle purificazioni del ceppo di E.coli trasformato con il vettore pHyal_sk e del ceppo di E.coli trasformato con il vettore pHyal_sk_SL secondo l’invenzione, sono state sottoposte ad elettroforesi SDS-PAGE su gel al 12%, come descritto sopra, quindi a blotting su membrana di poliviniliden difluoruro (BIO-RAD) e colorata secondo le istruzioni fornite dal fornitore. La banda relativa alla ialuronidasi per entrambe le produzioni, à ̈ stata scissa con un bisturi, cercando di ottenere un pezzetto con le più piccole dimensioni possibili (3 mm x 10 mm) ed à ̈ stata caricata nella camera di reazione del sequenziatore.

Il sequenziamento dell’estremità N-terminale, condotto come descritto precedentemente, ha permesso di stabilire che le due ialuronidasi ricombinanti prodotte e provenienti dai due sistemi di ingegnerizzazione genetica e di espressione differenti utilizzati contengono delle differenze nella sequenza amminoacidica N-terminale. Nel caso del campione di E.coli trasformato con il vettore pHyal_sk_SL secondo l’invenzione, l'analisi ha fornito cromatogrammi nei quali à ̈ risultato presente in modo significativo una sola sequenza amminoacidica N-terminale, consentendo di ricostruire la sequenza sperimentale di seguito riportata: AGENGA (SEQ ID NO : 42). La suddetta sequenza determinata sperimentalmente corrisponde all'N-terminale della proteina isolata nella sua forma autologa descritta da [9] priva della metionina in posizione 1.

Nel caso del campione E.coli trasformato con il vettore pHyal_sk secondo l’invenzione, l'analisi ha invece rilevato la presenza di almeno due sequenze di aminoacidi N-terminale, riportati di seguito l'elenco degli aminoacidi N-terminali rilevati dal sequenziamento:

Sequenza più rappresentata MAGENGA (SEQ ID NO: 43) che corrisponde all'N-terminale della proteina matura con la metionina in posizione 1, e una sequenza meno rappresentata AQPAMAMAGENGA (SEQ ID NO: 44) che corrisponde alla proteina parzialmente matura (contiene la sequenza AQPAMAM (SEQ ID NO: 45) appartenente al peptide segnale evidentemente non totalmente liberato dalla proteina dal sistema cellulare).

Confronto dell’attività ialuronidasica tra la forma eterologa e autologa.

Il potenziale enzimatico della ialuronidasi secondo l’invenzione (E.coli trasformato con il vettore pHyal_sk_SL) à ̈ stato valutato mediante confronto con l’attività enzimatica della ialuronidasi autologa [9], utilizzando il saggio enzimatico descritto [9] ed il valore di attività à ̈ stato riportato per essere in entrambi i casi maggiore di 4x10<4>U.I./mg (la concentrazione proteica à ̈ stata determinata mediante BCA Protein Assay Reagent Kit, PIERCE).

Il risultato di questo saggio dimostra che la ialuronidasi secondo l’invenzione, in particolare della forma proveniente dal ceppo di E.coli ingegnerizzato con il plasmide pHyal_sk_SL, presenta la stessa attività della forma autologa. Tuttavia, per mezzo del metodo di produzione e purificazione descritti nell’invenzione à ̈ stato possibile valutare in modo accurato il valore dell’attività enzimatica della ialuronidasi ricombinante secondo l’invenzione, che à ̈ risultato maggiore di 40000 U/mg di proteina.

Analisi spettri UV e paragone degli spettri del Dicroismo circolare della forma eterologa e di quella autologa.

Dicroismo circolare (CD) esperimenti: Spettri al dicroismo circolare Far-UV sono stati raccolti a temperatura ambiente su un modello spettropolarimetro Jasco J-715, con cella al quarzo avente lunghezza del percorso di 1 millimetro. Altre impostazioni sperimentali sono state: velocità di scansione, 10 nm / min, la sensibilità, 50 MDEG, costante di tempo, 16 s, larghezza di banda, 3 nm. Le misurazioni di dicroismo circolare sono state condotte su soluzioni di proteine (ialuronidasi autologa, ialuronidasi ricombinante secondo l’invenzione)<-6>a concentrazioni di 2,10 M. Tutti i campioni sono stati diluiti ad una concentrazione finale di 2,10<-6>M utilizzando acqua ultra-pura. Gli spettri CD sono stati raccolti a 260-195 nm corretti in bianco e regolati per la diluizione.

Gli spettri di dicroismo circolare sono riportati in figura 17.

I file di overlay corrispondono: la linea inferiore corrisponde alla ialuronidasi autologa [9] e quella superiore corrisponde alla ialuronidasi eterologa secondo l’invenzione. I due spettri presentano un profilo sovrapponibile, confermando la stessa struttura per entrambi i campioni (Fig. 17-a). La piccola differenza che si nota può essere attribuita nella non perfetta coincidenza delle concentrazioni delle due soluzioni.

Dagli spettri UV il campione di ialuronidasi ricombinante non presenta aggregazione. Da questo studio si può concludere che la preparazione secondo l’invenzione ha una struttura secondaria molto simile a quella della ialuronidasi autologa [9] e che la proteina prodotta secondo questa invenzione non presenta aggregazione (Fig. 17-b).

Spettrometria di massa

Le analisi di spettrometria di massa per la determinazione del peso molecolare sono state effettuate utilizzando lo spettrometro di massa mass spectrometer Quattro micro (Waters), mentre l’analisi al peptide mapping per confermare l’identità della struttura primaria della ricombinante à ̈ stata effettuata utilizzando i valori di massa accurati dei peptidi determinati mediante il sistema MALDI-MS Voyager DE-PRO (Applied Biosystems, Firmingham MA, USA) dopo separazione in RP-HPLC.

La frazione ottenuta dopo purificazione della ialuronidasi ricombinante secondo l’invenzione à ̈ stata sottoposta a digestione con tripsina, dopo separazione in RP-HPLC la miscela di peptidi prodotta per ciascun campione à ̈ stata analizzata mediante MALDI-MS in modalità reflector. Lo studio e l'interpretazione degli spettri MALDI acquisiti hanno così consentito di verificare rispettivamente il 97% di identità della struttura primaria della sequenza amminoacidica di riferimento [9] e oltre il 94% di identità della struttura primaria della sequenza amminoacidica teorica prodotta secondo l’invenzione (sequenza peptidica predetta mediante http://web.expasy.org/translate/) con la sequenza aminoacidica del campione prodotto secondo l’invenzione (SEQ ID NO: 21).

Inoltre, la frazione ottenuta dopo purificazione della ialuronidasi ricombinante secondo l’invenzione à ̈ stata sottoposta a determinazione del peso molecolare della proteina mediante spettrometria di massa e il risultato dell’analisi à ̈ stato riportato in figura 18.

Isoelettrofocalizzazione

La frazione proteica da analizzare (ialuronidasi ricombinante ottenuta secondo l’invenzione) viene miscelata in un opportuno tampone di caricamento e caricata su strisce IPG a pH 3-10 (ReadyStrips 7 cm, BIO-RAD); si incuba a 25°C fino ad assorbimento del campione e si carica la striscia sul PROTEAN IEF Cell (BIO-RAD) per l’isoelettrofocalizzazione (IEF). Al termine della corsa di isoelettrofocalizzazione la striscia viene colorata con IEF Gel Staining solution (BIO-RAD) per 45 minuti e dopo decolorata con Destain Solution (BIO-RAD). Le striscie di IPG decolorate, sono state acquisite con un acquisitore di immagine da laboratorio ImageQuant 300 TL (GE Healthcare), mentre le analisi (quantitative e qualitative) sono state effettuate impiegando il software di analisi dell’immagine ImageQuant TL (GE Healthcare). Il punto isoelettrico del campione à ̈ stato determinato mediante confronto con i punti isoelettrici degli standard di riferimento (IEF Marker pH 3-10, SERVA). Il risultato dell’analisi à ̈ riportato in figura 19.

Caratterizzazione mediante Elettroforesi Capillare della Ialuronidasi ricombinante e determinazione del coefficiente di estinzione molare.

L’analisi quali-quantitativa della frazione proteica da analizzare (ialuronidasi ricombinante ottenuta secondo l’invenzione) à ̈ stata effettuata da BIOTEKNET (Napoli, Italia) mediante elettroforesi capillare con uno strumento P/ACE MDQ Beckman-Coulter equipaggiato con rivelatore diode-array e lampada UV, utilizzando un capillare di silice fusa (50 cm di lunghezza effettiva, 60.2 cm di lunghezza totale, 50 µm di diametro interno) e un tampone di sodio citrato 20 mM, a pH 2.5, applicando una d.d.p. di 25 kV (assicurando una maggiore stabilità nel processo di separazione elettroforetico e della corrente utilizzata) per 15 min e rivelando l’assorbimento a 200 nm. Prima di procedere con l’analisi dei campioni, à ̈ stata opportunamente analizzata la BSA (bovine serum albumin) a tre concentrazioni differenti (1mg/mL; 0.8mg/mL; 0.4mg/mL), utilizzando il suddetto metodo e ottenendo in tal modo una retta di calibrazione. L’analisi à ̈ stata effettuata sul campione tal quale e diluito due volte(Fig. 20). In entrambi gli elettroferogrammi à ̈ possibile evidenziare la presenza di un singolo picco (Purezza 100%) avente tempo di migrazione di 7.7 ± 0.9 min e la quantificazione proteica, seppur inficiata da una calibrazione con standard esterno (BSA), e quindi non con la stessa proteina, restituisce un’elevata purezza, ed una quantificazione sovrapponibile a quella attesa (~1mg/ml). Il lavoro di ricerca sulla determinazione del coefficiente di estinzione molare della ialuronidasi ricombinante si può dividere in quattro momenti sperimentali: 1. Analisi densitometrica dei campioni di ialuronidasi dell’invenzione, 2. Analisi spettrofotometrica dei campioni di ialuronidasi dell’invenzione, 3. Identificazione dell’assorbanza teorica, 4. Identificazione del coefficiente di estinzione molare.

A questo punto, una volta raccolte le informazioni negli step precedenti, si applica la legge di Lambert-Beer:A = el* l * C dove el à ̈ detto coefficiente di assorbimento molare, C à ̈ la concentrazione molare della soluzione e l à ̈ il cammino ottico. In base a questa formula e alle nostre informazioni ottenute il coefficiente di assorbimento molare, alla lunghezza d’onda 280 nm, à ̈ il seguente: 12383 L*mol-1*cm-1 Abs 0,1%(=1g/L) 0,570 (Coefficiente di estinzione molare della ialuronidasi prodotta secondo questa invenzione).

Analisi HPLC mediante gel filtrazione

Per le analisi di purezza mediante gel filtrazione à ̈ stato utilizzato lo strumento HPLC LC-10AD (SHIMADZU) con una colonna Bio-Sil SEC (BIO-RAD), eluendo con NaH2PO4 0,05M, Na2HPO4 0,05M, 0,15 M NaCl, pH 6.6, a 1 ml/min. La lunghezza d’onda d’assorbimento utilizzata era di 214 nm (SPD-10A, SHIMADZU). La purezza della proteina à ̈ stata determinata utilizzando il software LC solution 1.21 SP1. La frazione ottenuta dopo purificazione della ialuronidasi ricombinante come descritto dall’invenzione à ̈ stata sottoposta ad HPLC su colonna a gel filtrazione come descritto sopra. Il risultato dell’analisi sulla purezza della ricombinante à ̈ riportato dal cromatogramma in figura 21-a à ̈ del 100%.

Determinazione del livello di purezza mediante RP-HPLC. Per le analisi di purezza mediante Reversed-phase HPLC à ̈ stato utilizzato lo strumento HPLC LC-10AD (SHIMADZU) con una colonna Vydac 214ATP54 C4 (Grace Davison Discovery Sciences), eluendo con 50mM Tris pH 7.5 con 1-propanolo, a 0,5 ml/min. La lunghezza d’onda d’assorbimento utilizzata era di 220 nm (SPD-10A, SHIMADZU). La purezza della proteina à ̈ stata determinata utilizzando il software LC solution 1.21 SP1. La frazione ottenuta dopo purificazione della ialuronidasi ricombinante come descritto dall’invenzione à ̈ stata sottoposta ad RP-HPLC su colonna a fase idrofobica (reversed) come descritto sopra. Il risultato dell’analisi sulla purezza della ricombinante à ̈ riportato dal cromatogramma in figura 21-b à ̈ molto vicino al 100%.

Caratterizzazione della ricombinante ialuronidasi batterica mediante elettroforesi su gel di prolicrilammide.

Le analisi elettroforetiche su gel di poliacrilammide in presenza di sodio dodecil solfato (SDS-PAGE) sono state effettuate utilizzando il metodo di Laemmli [11] su gel di poliacrilammide al 12%, utilizzando un Mini-PROTEAN 3 (BIO-RAD) secondo le istruzioni del fornitore. La concentrazione e il peso molecolare della ialuronidasi nel prodotto di fermentazione e nelle diverse fasi di purificazione à ̈ stato stimato mediante confronto con le proteine standard a basso peso molecolare (GE Healthcare).

I gel di poliacrilammide, opportunamente colorati con Coomassie(BIO-RAD) dopo la corsa elettroforetica, sono stati acquisiti con un acquisitore di immagine da laboratorio ImageQuant 300 TL (GE Healthcare), mentre le analisi (quantitative e qualitative) sono state effettuate impiegando il software di analisi dell’immagine ImageQuant TL (GE Healthcare).

Invece, per l’analisi al western blot le proteine sono state frazionate in SDS-PAGE al 12% e trasferite su membrane di nitrocellulosa. Le proteine di interesse quindi sono state identificate mediante incubazione con una diluizione 1:2000 di anticorpo anti-ialuronidasi (Abnova) in 10% dry milk/PBS per 12h, e la reazione specifica à ̈ stata evidenziata mediante l’addizione per 1h di anticorpi secondari anti-IgGs di topo coniugati con la fosfatasi alcalina, seguita dalla rilevazione con il substrato BCIP/NBT (BUF045A, SEROTEC).

La produzione della ialuronidasi ricombinante secondo l’invenzione da cellule ingegnerizzate di E.coli BL21(DE3) e quindi senza la presenza di derivati animali ha permesso di produrre la proteina con un’attività enzimatica specifica alta (>40000 Unità/mg di proteina). La proteina ricombinante prodotta secondo l’invenzione presentava un livello di purezza 100 volte più alta rispetto allo standard di ialuronidasi da testicolo di mammifero (EDQM, FIP Ialuronidasi, H1115000) come mostrato in figura 22. Mentre la ialuronidasi ricombinante purificata secondo invenzione dopo migrazione su gel di SDS-PAGE al 12% e colorazione al coomassie GelMate Blue (EuroClone) presentava una singola banda, la ialuronidasi bovina, commercializzata, mostrava diverse impurità. Una minor banda (a circa 75-80kDa) nello smear di proteine della ialuronidasi bovina reagiva con un anticorpo policlonale anti-ialuronidasi (Abnova) mediante western blot, confermando che l’enzima ialuronidasi à ̈ una componente minore nelle preparazioni di ialuronidasi derivati da animali (Fig. 22).

Rilevamento di endotossine

Il Limulus Amebocyte Lysate Test (LAL),che utilizza il reagente preparato dal sangue del limulus Poliphemus, ha mostrato di essere il più sensibile e specifico test per rilevare e misurare il livello di endotossine batteriche in materie prime impiegate nella produzione e per il monitoraggio “in-process†dei livelli di endotossina. Le endotossone, più comunemente conosciute come pirogeni, provocano dalla febbre allo shock irreversibile, dalla difficoltà negli scambi fra sangue e tessuti fino a conseguenze letali.

La ialuronidasi ricombinante essendo prodotta secondo l’invenzione in cellule di E.coli à ̈ stato fondamentale andare a valutare nel prodotto finale il livello di endotossine. A tale scopo à ̈ stato utilizzato da noi il metodo del “Cromo-LAL†un test cinetico cromo genico per la rilevazione quantitativa delle endotossine prodotte dai batteri gram negativi.

Brevemente, nel “Cromo LAL (art 32427, PBI S.p.A -Italy)†test, il lisato ed il reagente substrato cromogenico coliofilizzati sono stati mescolati con il campione di ialuronidasi (prodotto secondo l’invenzione) in una micropiastra multipozzetto (96 pozzetti) ed incubati a 37±1°C in un apposito lettore (ELX 808 IU, BioTek). I valori di assorbanza letti, sono stati raccolti ed analizzati mediante un software dedicato. E’ stato calcolato il tempo richiesto dal campione di ialuronidasi per raggiungere uno specifico valore di assorbanza (densità ottica). Inoltre, à ̈ stata costruita una curva standard di taratura (CSE, lot.104, art.17078, PBI S.p.A - Italy) che mostra la correlazione lineare tra il log del “tempo di inizio†ed il log delle concentrazioni di endotossina standard. Il range massimo fra le concentrazioni di endotossina della curva standard à ̈ 0,005EU/ml-50 EU/ml. La sensibilità [19] del test à ̈ stata definita dalla più bassa concentrazione di endotossina utilizzata per la costruzione della curva standard. La sensibilità massima di questo test à ̈ 0,005 EU/ml.

La concentrazione di endotossina per il corrispondente “tempo di inizio†del campione di ialuronidasi à ̈ stata letta dalla curva standard che à ̈ un grafico log-log risultante dai punti ottenuti calcolando i “tempi di inizio†verso le concentrazioni standard.

Al termine, il valore stimato di endotossine nel campione di ialuronidasi prodotta secondo l’invenzione à ̈ stato calcolato dal software Gen5 (BioTek) risultando essere molto basso, cioà ̈ inferiore di 0,5 unità di endotossine per milligrammo di ialuronidasi ricombinante (Tabella 4). Determinazione di proteine e di DNA provenienti dalle cellule ospiti.

Per quanto riguarda la determinazione delle proteine provenienti dalle cellule ospiti di E.coli utilizzati per l’espressione eterologa della ialuronidasi ricombinante (come descritto da questa invenzione) à ̈ stato utilizzato il metodo ELISA in particolare il kit immunoenzimatico “E.coli HCP†della Cygnus technologies (F010). L’analisi si basa sull’utilizzo a sandwich di anticorpi purificati per affinità e diretti verso una miscela di sei strains di E.coli comunemente utilizzati per il clonaggio e l’espressione di proteine ricombinanti.

Il test à ̈ stato eseguito secondo le istruzioni del fornitore, sul campione purificato di ialuronidasi ricombinante, la concentrazione di proteine provenienti da E.coli (ceppo ospite) à ̈ direttamente proporzionale allo sviluppo del colore causato dalla reazione enzimatica della fosfatasi alcalina coniugata all’anticorpo.

La concentrazione di proteine provenienti dal ceppo ospite verso le concentrazioni standard à ̈ stato stimato (calcolo e calibrazione della curva à ̈ stato eseguito dal software GEN 5, BioTek) nel campione di ialuronidasi prodotta secondo l’invenzione per essere più basso di 10 ppm come mostrato in Tabella 4(Il limite approvato dalle autorità competenti à ̈ minore di 100 ppm).

Invece, la determinazione della quantità di DNA dal ceppo ospite di E.coli à ̈ stata determinata nel campione di ialuronidasi ricombinante (prodotta secondo l’invenzione), utilizzando il metodo del DNA Threshold. Questa analisi à ̈ stata eseguita presso i laboratori di Charles River Biopharmaceutical services GmbH, Germania. Gli studi indicati con il codice M1/F07/12 e M2/F07/12 hanno dato come risultato finale un livello molto basso di DNA proveniente dall’ospite cellulare, calcolato per essere inferiore di 20pg (Il limite approvato dalle autorità competenti à ̈ minore uguale di 300 pg/mg di proteina) su milligrammo di ialuronidasi ricombinante (Tabella 4).

Esempio 20: Analisi su gel di agarosio della depolimerizzazione dell’acido ialuronico

Per valutare, in vitro, la capacità della ialuronidasi ricombinante, prodotta secondo l’invenzione, di depolimerizzare l’acido ialuronico (Hyalgan®; Fidia S.p.A., Italy) nei suoi costituenti primari Nacetylglucosamine e acido glucuronico à ̈ stato utilizzato il metodo dell’analisi elettroforetica in gel d’agarosio [20] dopo che l’acido ialuronico à ̈ digerito con 1 unità di ialuronidasi ricombinante nei tempi indicati da 5 minuti a 24h.

Brevemente, i campioni di acido ialuronico (500kD-730kD) dopo aver reagito con la ialuronidasi ricombinante nei tempi indicati (da 5 minuti a 24h) sono stati separati utilizzando il sistema di elettroforesi Sub-CellGT(BIO-RAD) e gels all’ 1% di agarosio (25 cm di lunghezza). I campioni sono fatti migrare in elettroforesi per circa 12h a temperatura di circa 16°C con un voltaggio costante di 50 Volts. La colorazione à ̈ effettuata come descritto in studi precedenti [20].

I risultati mostrati in figura 23, indicavano che la ialuronidasi ricombinante, prodotta secondo l’invenzione, à ̈ in grado di digerire completamente il substrato fino ad ottenere livelli non rilevabili di acido ialuronico prima delle 24h.

Esempio 21: Stabilità contro enzimi proteolitici

La ialuronidasi à ̈ un enzima che idrolizza l’acido ialuronico, perciò aumenta la permeabilità del tessuto connettivo favorendo la diffusione e dispersione del farmaco, somministrato localmente sottocute, nei tessuti circostanti.

In alcuni trattamenti la ialuronidasi viene somministrata a dosi basse (tipica dose usata à ̈ di 15 unità), per ridurre i danni dallo stravaso di antibiotici, soluzioni iperosmotiche, soluzioni acide o basiche, oppure per la correzione di filler a base di acido ialuronico per evitare reazioni allergiche e anafilattiche. Quindi, à ̈ fondamentale che la ialuronidasi sia stabile a queste dosi verso gli enzimi proteolitici presenti nel tessuto connettivo, che potrebbero facilmente degradarla una volta iniettata, inibendo la sua azione. Per testare e confrontare la resistenza della ialuronidasi ricombinante nei confronti di quella bovina attualmente utilizzata in commercio, verso gli enzimi proteolitici, à ̈ stato messo a punto un modello turbidimetrico di analisi in vitro. Brevemente la ialuronidasi ricombinante (preparata secondo l’invenzione) alla concentrazione di 10U(< 250ng), e la ialuronidasi bovina 100U(300µg), sono state trattate separatamente con due diverse dosi di Pronase E (200 µg e 500 µg) in una soluzione di buffer fosfato (pH 7.0) a 37°C per 1 ora, 24 ore e 48 ore. L’attività enzimatica residua (espressa in percentuale) delle due concentrazioni di enzimi trattati e non trattati con Pronase E, à ̈ misurata secondo il metodo Dorfman come descritto nel brevetto. I risultati ottenuti sono messi su grafico e mostrati in figura 24.

Esempio 22: Effetto del siero umano e animale sull’attività della ialuronidasi

In questa invenzione, grazie alla messa a punto di un modello sperimentale in vitro utilizzando il metodo turbidimetrico, si à ̈ confermato quello che già era emerso dagli studi clinici precedenti, cioà ̈ che l’attività enzimatica della ialuronidase bovina (PH20 bovine) viene inibita da sangue umano e/o animale ma si à ̈ trovato invece che il sangue umano e/o animale non inibisce la ialuronidasi da S.koganeiensis ricombinante (Fig. 25). Il metodo utilizzato per valutare in questa invenzione l’inibizione dell’attività della ialuronidasi da sangue (animale/umano) à ̈ stato precedentemente descritto da Albert DORFMAN, et al[21]. Brevemente, le due concentrazioni di ialuronidasi ricombinante prodotta secondo l’invenzione (40 unità, 400 unità), e ialuronidasi bovina (40 unità, 400 unità), sono state trattate separatamente e rispettivamente con siero proveniente da sangue animale e siero proveniente da sangue umano in una soluzione di buffer fosfato (pH 7.0) miscelata con tampone substrato contenente 0,5 mg di acido ialuronico. La miscela così ottenuta à ̈ stata posta a 37°C per 30 minuti, 1 ora e 6 ore. L’attività enzimatica relativa delle due concentrazioni di enzimi trattati con i sieri à ̈ misurata alla fine di ogni tempistica stabilita dopo essere stata generata torbidità aggiungendo 4 ml di soluzione acida a base di siero di cavallo e proseguendo come il metodo Dorfman descritto in precedenza. Lo sviluppo della torbidità dovuta all’aggiunta del siero à ̈ stata corretta dal bianco contenente tutti i reagenti eccetto la ialuronidasi.

Quindi, da questi ultimi studi à ̈ stato dimostrato che la ialuronidasi ricombinante prodotta secondo l’invenzione, che ha un’elevata attività ialuronidasica e presenta un’alta stabilità agli enzimi proteolitici, à ̈ in grado di svolgere con la sua massima biodisponibilità la totale attività nel circolo sanguigno senza possibilità di riscontrare infezioni batteriche e virali, dimostrando di essere efficace anche per le terapie cardio-cerebro vascolari.

Riferimenti bibliografici

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Claims (12)

1. RIVENDICAZIONI 1. Un metodo per la produzione di ialuronidasi da Streptomyces koganeiensis ATCC 31394 comprendente la sequenza amminoacidica mostrata in SEQ. ID. No. 21 comprendente le seguenti fasi: a) inoculare un terreno di coltura batterica in un bioreattore con un inoculo di cellule ricombinanti che contengano almeno un vettore comprendente la sequenza mostrata come SEQ ID N. 41; b) sottoporre a fermentazione il contenuto del bireattore del passaggio a) ad un pH compreso tra 6,7 e 7,1 in presenza di una soluzione di nutrimento; c) aggiungere alla miscela del passaggio b) un induttore dei geni lac; d) sottoporre la miscela del passaggio b) ad un periodo di induzione tra 8 e 24 ore; e) centrifugare le cellule batteriche ottenute nel passaggio d); f) risospendere i pellet ottenuti nel passaggio e) e sottoporre la sospensione così ottenuta a shock osmotico; g) estrarre le proteine periplasmatiche tramite centrifugazione della sospensione del passaggio f); h) purificare la frazione proteica ad attività enzimatica ialuronidasica ottenuta nel passaggio g) tramite una sequenza di: i. cromatografia a scambio ionico forte ed isolamento della frazione ad attività enzimatica ialuronidasica; ii. cromatografia a scambio cationico debole ed isolamento della frazione ad attività enzimatica ialuronidasica; e iii. cromatografia a interazione idrofobica aromatica ed isolamento della frazione ad attività enzimatica ialuronidasica.
2. 2. Il metodo secondo la rivendicazione 1 in cui la cellula ricombinante del passaggio a) Ã ̈ selezionata tra una cellula di Escherichia coli e una di Bacillus subtilis.
3. 3. Il metodo secondo una delle rivendicazioni precedenti in cui nel passaggio b) come soluzione di nutrimento à ̈ usata una soluzione di glicerolo.
4. 4. Ialuronidasi da Streptomyces koganeiensis ATCC 31394 in forma purificata e comprendente la sequenza amminoacidica mostrata in SEQ. ID. No. 21.
5. 5. Un polinucleotide comprendente la sequenza nucleotidica mostrata in SEQ. ID. No. 17 che codifica per la ialuronidasi batterica secondo la rivendicazione 4.
6. 6. Un vettore ricombinante geneticamente ingegnerizzato comprendente il polnucleotide secondo la rivendicazione 5.
7. 7. Il vettore secondo la rivendicazione 6 in cui il vettore à ̈ un plasmide.
8. 8. Una cellula ospite comprendente il vettore secondo una delle rivendicazioni 6 o 7.
9. 9. Una composizione adatta all’uso farmaceutico o cosmetico comprendente la ialuronidasi secondo la rivendicazione 4.
10. 10. La ialuronidasi secondo la rivendicazione 4, o ottenibile tramite il metodo della rivendicazione 1, per uso nel trattamento e/o nella prevenzione di un disturbo o patologia, opzionalmente in associazione con almeno un altro principio attivo.
11. 11. La ialuronidasi per uso secondo la rivendicazione 10 in cui il disturbo o la patologia sono almeno uno tra edemi, stati infiammatori, geloni, tumori solidi, forme allergiche mediate da IgE, patologie del cavo orale, emorragie vitreali spontanee, arteriosclerosi, disturbi della pressione arteriosa, disturbi cardio-cerebro vascolari come stenosi delle arterie affluenti al cervello o ictus, o mastite bovina.
12. 12. Uso non terapeutico della ialuronidasi secondo la rivendicazione 4, o ottenibile tramite il metodo della rivendicazione 1, per applicazioni cosmetiche e/o di miglioramento dell’aspetto estetico.