CN113677794A - 抗微生物内溶素多肽、组合物和制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有抗微生物活性，优选具有针对产气荚膜梭菌的抗菌活性的新型内溶素多肽或其片段。本发明还涉及编码该内溶素多肽或片段的核酸分子、包含这种核酸分子的重组多核苷酸表达载体以及包含这种核酸分子或包含这种重组多核苷酸表达载体的宿主细胞。本发明还涉及包含该内溶素多肽或片段的组合物和食品及其在治疗动物的疾病或疾患中的用途。

Description

抗微生物内溶素多肽、组合物和制剂

技术领域

本发明涉及具有抗微生物活性，优选具有对产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)的抗菌活性的新型内溶素多肽或其片段。本发明还涉及编码该内溶素多肽或片段的核酸分子、包含这种核酸分子的重组多核苷酸表达载体以及包含这种核酸分子或包含这种重组多核苷酸表达载体的宿主细胞。本发明还涉及包含该内溶素多肽或片段的组合物和食品及其在治疗动物的疾病或疾患(disorder)中的用途。

背景技术

对抗生素耐药性的担忧已经导致了公众和监管的压力，以确保它们在人类医学和兽医领域的明智使用。在食用动物生产中，特别是由产气荚膜梭菌引起的动物疾病的预防已经成为一个更大的问题。为了实现同样高水平的食用动物生产，开发替代性抗微生物剂是必要的。专门为关注的相关微生物种类开发的试剂将作为用于控制经济上重要的疾病的有效工具，因此是治疗处理的理想候选者。

已经鉴定并表征了若干种对A型产气荚膜梭菌具有裂解活性的新型噬菌体衍生内溶素。还阐明了增加对单一菌株和广谱的A型产气荚膜梭菌菌株的抗微生物活性的某些内溶素之间的协同效应。

产气荚膜梭菌是一种革兰氏阳性、杆状、厌氧、产孢子的梭菌属(Clostridium)的细菌。它通常发现于腐烂的植被、海洋沉积物、人类和其它脊椎动物的肠道、昆虫以及土壤中。虽然产气荚膜梭菌普遍存在并且通常是良性的，然而它也是动物和人类的许多严重感染的原因。事实上，产气荚膜梭菌已知为食物中毒、气性坏疽(梭菌性肌坏死)、坏死性肠炎和非食源性胃肠道感染的原因。基于毒素表达的类型，产气荚膜梭菌菌株分为五种毒素类型：A、B、C、D和E。

A型产气荚膜梭菌是家禽业特别关注的问题。家禽(特别是肉鸡)的肠道中A型产气荚膜梭菌的存在，已与多种疾病有关，如肠道病变和坏死性肠炎，并且能够导致家禽的生长显著减少。除了如莫能菌素和盐霉素的离子载体外，如杆菌肽、维吉尼亚霉素和青霉素的抗生素，已经被用于减轻家禽的临床和亚临床坏死性肠炎。然而，近年来耐药性的增加已显著降低这些抗生素的可靠性。特别值得关注的是多重耐药菌株的流行和范围的增加。除了对常规抗生素的耐药性日益增加之外，大部分抗生素对一系列细菌群体具有广谱活性。因此，抗生素处理不仅影响病原体细菌，而且对鸡肠道中的有益的和保护性菌群产生不利影响。因此，非常需要开发特异性地杀死产气荚膜梭菌，尤其是A型产气荚膜梭菌的窄谱抗微生物剂，其对有益菌群几乎没有或没有附带影响。

噬菌体编码的内溶素能够用作对其宿主细菌种类具有特异性的抗微生物剂。噬菌体为感染细菌的病毒。对噬菌体生物学理解的扩展，包括细菌的耐抗生素菌株的增加，导致对这些特定溶菌酶的兴趣增加。内溶素被噬菌体使用，以从细菌内部降解细菌细胞壁肽聚糖，从而促进噬菌体后代的释放。研究表明，内溶素在外部应用于革兰氏阳性菌时也能够具有抗微生物效果。革兰氏阳性菌特异性的内溶素通常具有模块化组织。许多这些内溶素具有双结构域结构，其中N端催化结构域和C端细胞壁结合结构域通过接头连接。还发现了具有不同结构域构造的内溶素。

内溶素的N端催化结构域负责细胞壁的肽聚糖层的酶裂解。肽聚糖层由具有交替(β1-4)连接的N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰胞壁酸单体的线性碳水化合物骨架组成。碳水化合物骨架通过种类特异性肽侧链交联。取决于它们切割的键的类型，内溶素可以是N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷酶或N-乙酰基-β-D-胞壁酸酶。可替代地，一些内溶素具有肽链内切酶活性，切割肽侧链的特定键。最后，内溶素的第四种类型为N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶，其水解糖链和肽链之间的酰胺键。

C端细胞壁结合结构域主要负责内溶素对其目标物种或属的特异性。该结构域非共价结合至细胞被膜，其可以是肽聚糖或其它细胞壁相关分子的一部分。与细胞壁的结合是紧密且不可逆的，这也最小化内溶素对裂解的细菌的周围细胞的攻击。此外，催化结构域也对内溶素的特异性有影响。肽聚糖结构在革兰氏类型之间以及不同细菌物种之间不同。因此，特定目标键的存在或不存在将有助于内溶素的特异性。

由于它们的特异性和不太可能出现耐药菌株，内溶素可以是对产气荚膜梭菌，尤其是A型产气荚膜梭菌有利的抗微生物剂，并且它们可以成为控制动物疾病(如家禽的坏死性肠炎)发生的有效方法。为了这个目的，发明人已经鉴定并表征了对广谱产气荚膜梭菌菌株(如A型菌株)具有高特异性和溶菌活性的若干种新型源自噬菌体的内溶素。还发现了鉴定的内溶素之间的协同效应，表明内溶素的混合物的使用能够增强其抗微生物功效。

发明内容

发明人已经鉴定了内溶素多肽，其具有令人惊讶地有利的功能性抗微生物活性，包括如本文根据SEQ ID号所描述和定义的。因此，本发明涵盖任何这种特定内溶素多肽，以及包含这种内溶素多肽的片段或变体的任何多肽，或包含任何这种内溶素多肽的任何一个或多个片段的任何多肽以及包含其任何一个或多个序列变体的任何多肽，条件是任何这种内溶素多肽保留本文所描述和定义的任何抗微生物活性。

除了本文公开的和本文根据SEQ ID号定义的特定内溶素多肽外，本发明还提供了任何内溶素多肽和任何包含这种内溶素多肽的片段或变体的多肽，或任何包含任何这种内溶素多肽的任何一个或多个片段以及其任何一个或多个序列变体的多肽，条件是任何这种多肽具有本文所描述和定义的任何一种或多种令人惊奇的抗微生物活性。因此，任何这种内溶素多肽可以被认为在功能上等同于本文公开的和本文根据SEQ ID号定义的任何特定多肽。

发明人惊奇地确定，一起使用的多种本发明的内溶素多肽，如一起使用的两种或更多种本发明的内溶素多肽，可以具有协同效应。

发明人惊奇地确定，包括藻类细胞提取物的细胞提取物能够增强本发明的内溶素多肽的功能特性。因此，在细胞(如藻类细胞)中表达的本发明的内溶素多肽可以具有增强的功能特性，并且与细胞提取物(如藻类细胞提取物)混合的本发明的内溶素多肽可以具有增强的功能特性。

本发明的内溶素多肽为分离的具有抗微生物活性的内溶素多肽，并且其中，分离的多肽包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：

其为N端产气荚膜梭菌细胞壁肽聚糖催化结构域多肽，

或其为所述N端催化结构域多肽的片段；或

其与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8或11中所示的产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的N端细胞壁肽聚糖催化结构域的氨基酸序列至少80％相同，

或其为所述N端催化结构域多肽的片段，并且其与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8或11中所示序列的对应于所述片段的氨基酸序列的氨基酸序列至少80％相同。

所述分离的内溶素多肽可以包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：所述氨基酸序列为N端产气荚膜梭菌细胞壁肽聚糖催化结构域，并且与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8或11中所示的产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的氨基酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。

在所述氨基酸序列的片段的情况下，所述内溶素多肽可以包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8或11中所示序列的对应于所述片段的氨基酸序列的氨基酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。

根据SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8或11中所示序列的氨基酸序列定义的所述内溶素多肽的N端产气荚膜梭菌细胞壁肽聚糖催化结构域，分别由SEQ ID NO:12、13、14、15、16、17、19和20XX中所示的氨基酸序列表示。此外，根据SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列定义的所述内溶素多肽的N端产气荚膜梭菌细胞壁肽聚糖催化结构域可以由SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列表示。

上文定义的任何内溶素多肽可以具有本文定义的任何抗微生物活性。

本发明所述的内溶素多肽可以是具有如上定义的抗微生物活性的分离的内溶素多肽，进一步地，其中所述分离的多肽包含：N端产气荚膜梭菌细胞壁肽聚糖催化结构域多肽或其片段，C端产气荚膜梭菌细胞壁结合结构域多肽或其片段，以及任选地连接N端结构域和C端结构域的接头多肽或其片段；其中，所述分离的多肽包含：

a)与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8或11中所示产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的N端细胞壁肽聚糖催化结构域的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，或为所述N端催化结构域多肽的片段并且与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8或11中所示序列的对应于所述片段的氨基酸序列的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列；和

b)氨基酸序列：其与内溶素C端产气荚膜梭菌细胞壁结合结构域多肽或所述多肽的片段至少80％相同；或其为与SEQ ID NO:1、2、3、5、6或8中所示产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的C端细胞壁结合结构域的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，或为所述C端结合结构域多肽的片段并且与SEQ ID NO:1、2、3、5、6或8中所示序列的对应于所述片段的氨基酸序列的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列；和

c)任选的与内溶素多肽或所述多肽的片段的接头至少80％相同的接头氨基酸序列；或任选的与SEQ ID NO:1、2、3、5、6或8中所示产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的接头的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，或为所述接头的片段并且与SEQ ID NO:1、2、3、5、6或8中所示序列的对应于所述片段的氨基酸序列的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列；其中，所述接头氨基酸序列连接产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的N端细胞壁肽聚糖催化结构域或其片段和产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的C端细胞壁结合结构域或其片段的所述氨基酸序列。

本发明的内溶素多肽可以是具有如上定义的抗微生物活性的分离的内溶素多肽，其中，所述分离的多肽包含：包含N端产气荚膜梭菌细胞壁肽聚糖催化结构域多肽或其片段或者由N端产气荚膜梭菌细胞壁肽聚糖催化结构域多肽或其片段组成的氨基酸序列，包含C端产气荚膜梭菌细胞壁结合结构域多肽或其片段或者由C端产气荚膜梭菌细胞壁结合结构域多肽或其片段组成的氨基酸序列，以及包含连接N端和C端结构域的接头多肽或其片段或者由连接N端和C端结构域的接头多肽或其片段组成的氨基酸序列；其中，所述分离的多肽包含：

a)与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8或11中所示产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的N端细胞壁肽聚糖催化结构域的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，或为所述N端催化结构域多肽的片段并且与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8或11中所示序列的对应于所述片段的氨基酸序列的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列；和

b)与SEQ ID NO:1、2、3、5、6或8中所示产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的C端产气荚膜梭菌细胞壁结合结构域的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，或为所述C端结合结构域多肽的片段并且与SEQ ID NO:1、2、3、5、6或8中所示序列的对应于所述片段的氨基酸序列的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列；和

c)与SEQ ID NO:1、2、3、5、6或8中所示产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的接头的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，或为所述接头的片段并且与SEQ ID NO:1、2、3、5、6或8中所示序列的对应于所述片段的氨基酸序列的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列。

本发明所述的内溶素多肽可以是如上定义的具有抗微生物活性的分离的内溶素多肽，其中，所述分离的多肽由以下组成或包含以下：

a)由所述N端催化结构域的片段组成或包含所述N端催化结构域的片段并且与SEQID NO:1、2、3、4、5、6、7、8或11中所示序列的对应于所述片段的氨基酸序列的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列；和/或

b)由所述C端结合结构域的片段组成或包含所述C端结合结构域的片段并且与SEQID NO:1、2、3、5、6或8中所示序列的对应于所述片段的氨基酸序列的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列；和/或

c)由所述接头的片段组成或包含所述接头的片段并且与SEQ ID NO:1、2、3、5、6或8中所示序列的对应于所述片段的氨基酸序列的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列。

在具有N端产气荚膜梭菌细胞壁肽聚糖催化结构域或为其片段的氨基酸序列，和C端产气荚膜梭菌细胞壁结合结构域或为其片段的氨基酸序列，以及任选的接头氨基酸序列或为其片段的氨基酸序列的上述的本发明的任何内溶素多肽中，与参考序列的同一性百分比可以是80％或更高。因此，在任何这种分离的内溶素多肽中，所述内溶素多肽可以包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：所述氨基酸序列为N端产气荚膜梭菌细胞壁肽聚糖催化结构域并且其与已知的内溶素N端产气荚膜梭菌细胞壁肽聚糖催化结构域多肽的氨基酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在所述氨基酸序列的片段的情况下，所述内溶素多肽可以包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：所述氨基酸序列与已知内溶素N端产气荚膜梭菌细胞壁肽聚糖催化结构域多肽的序列的对应于所述片段的氨基酸序列的氨基酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在任何这种分离的内溶素多肽中，所述内溶素多肽可以包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：所述氨基酸序列为N端产气荚膜梭菌细胞壁肽聚糖催化结构域并且与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8或11中所示产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的氨基酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在氨基酸序列为所述氨基酸序列的片段的情况下，所述内溶素多肽可以包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8或11中所示序列的对应于所述片段的氨基酸序列的氨基酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在任何这种分离的内溶素多肽中，所述内溶素多肽可以包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：所述氨基酸序列为C端产气荚膜梭菌细胞壁结合结构域并且与已知的内溶素C端产气荚膜梭菌细胞壁结合结构域多肽的氨基酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在所述氨基酸序列的片段的情况下，所述内溶素多肽可以包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：所述氨基酸序列与已知的内溶素C端产气荚膜梭菌细胞壁结合结构域多肽的序列的对应于所述片段的氨基酸序列的氨基酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。可替代地，在任何这种分离的内溶素多肽中，所述内溶素多肽可以包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：所述氨基酸序列为C端产气荚膜梭菌细胞壁结合结构域并且其与SEQ ID NO:1、2、3、5、6或8中所示产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的氨基酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在所述氨基酸序列的片段的情况下，所述内溶素多肽可以包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1、2、3、5、6或8中所示序列的对应于所述片段的氨基酸序列的氨基酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在任何这种分离的内溶素多肽中，所述内溶素多肽可以任选地包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：所述氨基酸序列与已知的内溶素多肽的接头的氨基酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在所述氨基酸序列的片段的情况下，所述内溶素多肽可以包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：所述氨基酸序列与已知的内溶素多肽的接头的对应于所述片段的氨基酸序列的氨基酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。可替代地，在任何这种分离的内溶素多肽中，所述内溶素多肽可以包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1、2、3、5、6或8中所示产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的接头的氨基酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在所述氨基酸序列的片段的情况下，所述内溶素多肽可以包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1、2、3、5、6或8中所示序列的对应于所述片段的氨基酸序列的氨基酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。

本发明所述的内溶素多肽可以是具有如上定义的具有抗微生物活性的分离的内溶素多肽，其中，所述分离的多肽包含：一种氨基酸序列，其中，所述N端催化结构域、C端细胞壁结合结构域和接头都分别与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8或11中所示产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的N端结构域、C端结构域和接头的对应的氨基酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。

上文定义的任何内溶素多肽可以具有本文定义的任何抗微生物活性。

本发明的内溶素多肽可以是如上定义的具有抗微生物活性的分离的内溶素多肽，其中，所述多肽包含以下或由以下组成：

a)包含SEQ ID NO:1、2、3、6或8中所示产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的所有的所述N端结构域、所述C端结构域和所述接头的氨基酸序，或由SEQ ID NO:1、2、3、6或8中所示产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的所有的所述N端结构域、所述C端结构域和所述接头组成的氨基酸序列，并且其中，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1、2、3、6或8中所示产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的所述N端结构域、所述C端结构域和所述接头的序列100％相同；或

b)包含SEQ ID NO:1、2、3、6或8中所示产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的所有的所述N端结构域、所述C端结构域和所述接头的片段的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:1、2、3、6或8中所示产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的所有的所述N端结构域、所述C端结构域和所述接头的片段组成的氨基酸序列，并且其中，每个片段的所述氨基酸序列与对应于所述片段的氨基酸序列的SEQ ID NO:1、2、3、5、6或8中所示产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的对应于所述片段的氨基酸序列的序列100％相同。

本发明的内溶素多肽可以是如上定义的具有抗微生物活性的分离的内溶素多肽，其中，所述多肽包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：所述氨基酸序列与SEQ IDNO:1、2、3、4、5、6、7、8或11中所示产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的氨基酸序列80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。

本发明的内溶素多肽可以是如上定义的具有抗微生物活性的分离的内溶素多肽，其中，所述多肽包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：所述氨基酸序列与SEQ IDNO:1、2、3、4、5、6、7、8或11中所示产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的氨基酸序列100％相同。

本发明的内溶素多肽可以是如上定义的具有抗微生物活性的分离的内溶素多肽或片段，其中，所述抗微生物活性为溶菌活性和/或细菌生长抑制活性。

本发明的内溶素多肽可以是如上定义的具有抗微生物活性的分离的内溶素多肽或片段，其中，所述分离的多肽或片段具有针对产气荚膜梭菌的溶菌活性和/或细菌生长抑制活性。

本发明的内溶素多肽可以是如上定义的具有抗微生物活性的分离的内溶素多肽或片段，其中，所述分离的多肽或片段具有针对产气荚膜梭菌，优选产气荚膜梭菌的A型菌株的溶菌活性和/或细菌生长抑制活性。可替代地，或另外，如本文所述当任何这种多肽或片段在细胞活力测定中以5μg/ml的浓度针对产气荚膜梭菌菌株NCTC8237进行检测时，它可以表现出约0.40或更大、2.00或更大、或者3.70或更大的ΔLog10值。可替代地，或另外，如本文所述当任何这种多肽或片段在细胞活力测定中以5μg/ml的浓度针对产气荚膜梭菌菌株NCTC8237进行检测时，它可以表现出约60％或更大、70％或更大、80％或更大、90％或更大、或者100％的细胞活力降低％。可替代地，或另外，如本文所述当任何这种多肽或片段在细胞浊度降低测定中以5μg/ml的浓度针对产气荚膜梭菌菌株NCTC8237进行检测时，它可以表现出7分钟或更短的t50％裂解值；或它表现出3分钟或更短的t50％裂解值。可替代地，或另外，如本文所述当任何这种多肽或片段在最低抑制浓度(MIC)/最低杀菌浓度(MBC)测定中以2.1×10⁴个细胞/mL针对产气荚膜梭菌菌株Cp6进行检测时，它表现出17μg/mL或更小、优选1.7μg/mL或更小的MIC和/或MBC值；或它表现出0.65μM或更小、优选0.05μM或更小的MIC和/或MBC值。

可替代地，或另外，通过在体外评估纯化的肽聚糖(PGN)的降解速率，可以测试任何这种多肽或片段的内溶素活性(即水解活性)，并因此可以测试抗微生物活性，其中，如果所述内溶素多肽或片段促进体外纯化的PGN的降解速率在统计学上显著增加，则可以确定所述内溶素多肽或片段具有内溶素水解活性。体外纯化的PGN的降解速率可以参考PGN降解的背景速率进行评估，即参考不含内溶素多肽的对照制剂进行评估。体外纯化的PGN的降解速率可以通过参考参照多肽或对照多肽的PGN降解速率进行评估，其中，参照多肽或对照多肽为不能促进体外纯化的PGN的降解速率在统计学上显著增加的多肽，如为一种无PGN催化活性的内溶素的多肽，或任何不是内溶素的多肽，如牛血清白蛋白或溶菌酶。

可替代地，或另外，通过评估任何这种多肽或片段是否在PGN降解测定的终点促进体外纯化的PGN的绝对量在统计学上显著减少，可以测试任何这种多肽或片段的内溶素活性(即水解活性)，并因此可以测试抗微生物活性。在PGN降解测定的终点的体外纯化的PGN的降解量(减少的量)可以参考PGN降解的背景量进行评估，即参考不含内溶素多肽的对照制剂进行评估。在PGN降解测定的终点的体外纯化的PGN的降解量(减少的量)可以通过参考参照多肽或对照多肽的PGN降解量进行评估，其中，参照多肽或对照多肽为不能促进体外纯化的PGN的量在统计学上显著减少的多肽，如为一种无PGN催化活性的内溶素的多肽，或任何不是内溶素的多肽，如牛血清白蛋白或溶菌酶。

本发明提供了一种分离的重组核酸分子，其包含编码本发明的任何内溶素多肽或片段的第一核酸序列，任选地其中，所述分离的重组核酸分子还包含编码启动子的第二核酸序列，并且其中，所述第一核酸序列可操作地连接至所述第二核酸序列；任选地其中，所述分离的重组核酸分子的所述第一核酸序列编码cDNA。本发明提供了一种分离的重组多核苷酸表达载体，其包含所述核酸分子并且包含所述第一核酸序列和所述第二核酸序列。在包含所述第一核酸序列和所述第二核酸序列的任何这种分离的重组核酸分子中，或在包含所述第一核酸序列和所述第二核酸序列的任何这种分离的重组多核苷酸表达载体中，所述启动子可能够促进所述具有抗微生物活性的内溶素多肽或片段在单细胞微生物的细胞中的表达，该细胞任选地为酵母细胞、细菌细胞(如乳酸杆菌)、真菌细胞或藻类细胞，优选藻类细胞。编码内溶素多肽或片段的核酸序列可以进行密码子优化以在宿主细胞中表达，任选地其中，所述宿主细胞为单细胞微生物的细胞，任选地为酵母细胞、细菌细胞(如乳酸杆菌)、真菌细胞或藻类细胞，优选藻类细胞。

本发明还提供了一种宿主细胞，其包含：如上文所定义的核酸分子的群体，并且编码如上文所定义的内溶素多肽或片段，和/或编码如上文所定义的内溶素多肽或片段的如上文所定义的重组多核苷酸表达载体的群体，任选地其中，所述宿主细胞另外包含如上文所定义的内溶素多肽或片段并且内溶素多肽或片段已经从所述分子或载体表达，任选地其中，所述宿主细胞为单细胞微生物的细胞，任选地为酵母细胞、细菌细胞(如乳酸杆菌)、真菌细胞或藻类细胞，优选藻类细胞，或其中，所述宿主细胞为植物的细胞。在任何这种宿主细胞中，所述群体的每个分子或载体可以编码如上文所定义的相同的内溶素多肽或片段，或所述群体的分子或载体可以编码两种或更多种如上文所定义的不同的内溶素多肽或片段，任选地其中，所述宿主细胞另外包含所述内溶素多肽或片段并且其已经从所述分子或载体表达，任选地其中，所述宿主细胞为单细胞微生物的细胞，任选地为酵母细胞、细菌细胞(如乳酸杆菌)、真菌细胞或藻类细胞，优选藻类细胞，或其中，所述宿主细胞为植物的细胞。

本发明还提供了一种细胞裂解物，其包含：如上文所定义的内溶素多肽或片段的群体并且该内溶素多肽或片段已经从如上文所定义的核酸分子和/或如上文所定义的重组多核苷酸表达载体表达，任选地其中，所述群体由如上文所定义的相同的内溶素多肽或片段组成，或其中，所述群体由两种或更多种如上文所定义的不同的内溶素多肽或片段组成，任选地其中，在宿主细胞中表达所述内溶素多肽或片段之后产生裂解物，所述宿主细胞为单细胞微生物的细胞，任选地为酵母细胞、细菌细胞(如乳酸杆菌)、真菌细胞或藻类细胞，优选藻类细胞，或其中，所述宿主细胞为植物的细胞。

本发明还提供了一种组合物，其包含如上文所定义的具有抗微生物活性的内溶素多肽或片段的群体，任选地其中，所述群体由如上文所定义的相同的内溶素多肽或片段组成，或其中，所述群体由两种或更多种如上文所定义的不同的内溶素多肽或其片段组成。在任何这种组合物中，具有抗微生物活性的内溶素多肽或片段的群体可以(a)作为纯化的多肽或片段添加至所述组合物中；或(b)作为一种或多种细胞提取物的组分添加至所述组合物中；或(c)作为纯化的多肽或片段并作为一种或多种细胞提取物的组分添加至所述组合物中；任选地其中，(b)或(c)中所述的细胞提取物为单细胞微生物的提取物，单细胞微生物任选地为酵母细胞、细菌细胞(如乳酸杆菌)、真菌细胞或藻类细胞，优选藻类细胞，或其中，所述细胞为植物的细胞。在包含宿主细胞的群体的任何这种组合物中，所述群体的宿主细胞可以包含在所述宿主细胞中表达的如上文所定义的具有抗微生物活性的内溶素多肽或片段，其中，所述内溶素多肽或片段由如上文所定义的相同的内溶素多肽或片段组成，或其中，所述内溶素多肽或片段由两种或更多种如上文所定义的不同的内溶素多肽或其片段组成。

本发明还提供了一种全细胞组合物，其包含全部宿主细胞的群体，其中，所述群体的细胞包含在所述宿主细胞中表达的如上文所定义的具有抗微生物活性的内溶素多肽或片段，其中，所述内溶素多肽或片段由如上文所定义的相同的内溶素多肽或片段组成，或其中，所述内溶素多肽或片段由两种或更多种如上文所定义的不同的内溶素多肽或其片段组成。所述群体的宿主细胞可以是单细胞微生物的细胞，任选地为酵母细胞、细菌细胞(如乳酸杆菌)、真菌细胞或藻类细胞。所述群体的宿主细胞优选为单细胞藻类细胞，更优选衣藻(Chlamydomonas Sp.)细胞，还更优选莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)细胞。

上述组合物或全细胞组合物中的任何一种可以包含一种包含在藻类细胞中表达的具有抗微生物活性的内溶素多肽或片段的干燥的生物质，优选地，其中，所述组合物或全细胞组合物被喷雾干燥。

本发明还提供了一种干燥的生物质组合物，其包含如上文所定义的细胞裂解物，和/或包含如上文所定义的组合物和/或全细胞组合物，其中，所述干燥的生物质组合物包含：包含如上文所定义的具有抗微生物活性的内溶素多肽或片段的细胞裂解物和/或包含在宿主细胞中表达且如上文所定义的具有抗微生物活性的内溶素多肽或片段的宿主细胞。所述群体的宿主细胞为藻类细胞，优选单细胞藻类细胞，更优选衣藻细胞，还更优选莱茵衣藻细胞；优选地，其中，所述干燥的生物质组合物是喷雾干燥的。

本发明还提供了一种抗微生物制剂，其包含如上文所定义的具有抗微生物活性的内溶素多肽或片段和药学上可接受的载体/赋形剂。

任何这种抗微生物制剂可以包含宿主细胞的群体，其中，所述群体的宿主细胞如上文所定义，或其中，所述制剂包含如上文所定义的细胞裂解物，或其中，所述制剂包含如上文所定义的组合物，或其中，所述制剂包含如上文所定义的干燥的生物质组合物。

本发明还提供了一种动物食品，其包含：(a)一种或多种食品；和(b)如上文所定义的具有抗微生物活性的分离的内溶素多肽或片段。

本发明还提供了一种动物食品，其包含：

(a)一种或多种食品；和

(b)还包含：

(i)如上文所定义的任何宿主细胞；

(ii)如上文所定义的任何细胞裂解物；

(iii)如上文所定义的任何组合物；

(iv)如上文所定义的任何全细胞组合物；

(v)如上文所定义的任何干燥的生物质组合物；和/或

(vi)如上文所定义的任何抗微生物制剂。

所述食品可以适合家禽食用，家禽任选地为肉鸡，优选家鸡(Gallus gallusdomesticus)；或其中，所述食品适合猪、优选家猪(Sus scrofa domesticus)食用；或其中，所述食品适合啮齿动物、任选地小鼠或大鼠食用。

任何上述宿主细胞、细胞裂解物、组合物、全细胞组合物、干燥的生物质组合物、抗微生物制剂或动物食品可以包含两种或更多种与如上文所定义的不同的具有抗微生物活性的内溶素多肽或片段。由两种或更多种不同的内溶素多肽或片段提供的表现出的抗微生物活性可以是协同活性。

可以提供两种或更多种内溶素多肽或片段的任何组合。组合可以包含：具有如SEQID NO:1所示的氨基酸序列的内溶素多肽与具有如SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8或11中任一项所示的氨基酸序列的内溶素多肽的组合；具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的内溶素多肽与具有如SEQ ID NO:3、4、5、6、7、8或11中任一项所示的氨基酸序列的内溶素多肽的组合；具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的内溶素多肽与具有如SEQ ID NO:4、5、6、7、8或11中任一项所示的氨基酸序列的内溶素多肽的组合；具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的内溶素多肽与具有如SEQ ID NO:5、6、7、8或11中任一项所示的氨基酸序列的内溶素多肽的组合；具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的内溶素多肽与具有如SEQ ID NO:6、7、8或11中任一项所示的氨基酸序列的内溶素多肽的组合；具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的内溶素多肽与具有如SEQ ID NO:7、8或11中任一项所示的氨基酸序列的内溶素多肽的组合；具有如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的内溶素多肽与具有如SEQ ID NO:8或11中任一项所示的氨基酸序列的内溶素多肽的组合；以及具有如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的内溶素多肽与具有如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的内溶素多肽的组合。应当理解，上述组合可以包括一种或多种其它的内溶素多肽。还应理解，上述组合涉及所述内溶素多肽的片段的组合和所述内溶素多肽的全长内溶素多肽片段的组合。

任何上述宿主细胞、细胞裂解物、组合物、全细胞组合物、干燥的生物质组合物、抗微生物制剂或动物食品可以是喷雾干燥的、冻干的或呈粉末状。

在本发明的任何上述核酸、表达载体、宿主细胞、细胞裂解物、组合物、全细胞组合物、干燥的生物质组合物、抗微生物制剂或动物食品中，提及内溶素多肽、片段或变体涵盖一种或多种内溶素多肽和/或一种或多种片段和/或一种或多种变体的组合。

本发明还提供了本发明的任何上述核酸、表达载体、宿主细胞、细胞裂解物、组合物、全细胞组合物、干燥的生物质组合物、抗微生物制剂或动物食品，用作药物和用于治疗动物的细菌感染。细菌感染可以是产气荚膜梭菌感染，任选地为由产气荚膜梭菌的A型菌株引起的感染。

本发明还提供了本发明的任何上述核酸、表达载体、宿主细胞、细胞裂解物、组合物、全细胞组合物、干燥的生物质组合物、抗微生物制剂或动物食品，用于治疗由产气荚膜梭菌感染引起的疾病或疾患，任选地为由产气荚膜梭菌的A型菌株引起的感染。由产气荚膜梭菌感染引起的疾病或病症可以是食物中毒、气性坏疽、坏死性肠炎、肠道病变和/或胃肠道感染。

本发明还提供了一种预防或治疗动物的疾病或疾患的方法，所述方法包括：向动物施用预防或治疗有效量的本文公开的具有抗微生物活性的任何分离的内溶素多肽或片段、本文公开的任何宿主细胞、本文公开的任何细胞裂解物、本文公开的任何组合物、本文公开的任何全细胞组合物、本文公开的任何干燥的生物质组合物、本文公开的任何抗微生物制剂、或本文公开的动物食品，并且用于本文公开的动物的疾病或疾患的任何具体的预防或治疗。所述动物可以是家禽动物，任选地为肉鸡，优选家鸡；或所述动物可以是猪，优选家猪。

本发明还提供了一种获得本文定义的具有抗微生物活性的任何分离的多肽或片段的方法，包括：

(a)在培养系统中培养包含本文公开的任何核酸分子或任何重组多核苷酸表达载体的宿主细胞；

(b)收获培养的宿主细胞；并且

(c)从所述宿主细胞和/或培养液中分离所述多肽或片段。

本发明还提供了一种获得包含上文定义的具有抗微生物活性的任何分离的内溶素多肽或片段的干燥的生物质组合物的方法，所述方法包括：

(a)在表达具有抗微生物活性的内溶素多肽或片段的条件下，在培养系统中培养上文定义的任何宿主细胞；

(b)从培养系统中收获并分离所述宿主细胞；

(c)干燥所述宿主细胞以形成干燥的生物质；并且

(d)将干燥的生物质配制成组合物。

本发明还提供了一种获得包含上文定义的具有抗微生物活性的任何分离的内溶素多肽或片段的干燥的生物质组合物的方法，所述方法包括：

(a)在表达具有抗微生物活性的内溶素多肽或片段的条件下，在培养系统中培养上文定义的任何宿主细胞；

(b)从培养的宿主细胞中产生裂解物；

(c)干燥所述裂解物以形成干燥的生物质；并且

(d)将干燥的生物质配制成组合物；

其中，所述裂解物是通过在培养系统中原位裂解宿主细胞而产生的，或其中，所述裂解物是通过在从培养系统中已经收获并分离宿主细胞之后裂解宿主细胞而产生的。

在获得干燥的生物质组合物的任何这种方法中，所述宿主细胞可以是藻类细胞，优选单细胞藻类细胞，更优选衣藻细胞，还更优选莱茵衣藻细胞。在获得干燥的生物质组合物的任何这种方法中，干燥以形成干燥的生物质的步骤可以包括喷雾干燥。

附图说明

图1：示出允许用WTGG-TGA密码子翻译RFP编码序列的tRNA-Wtca分子的表达。

向培养基中加入IPTG 6小时后，用质粒ecAL002、ecAL003和ecAL004转化菌株的培养物。(A)用白光照明的培养物；(B)用紫外线照射的培养物；(C)使用InstantBlue蛋白质染色剂染色的来自用质粒ecAL002、ecAL003和ecAL004转化的培养物的蛋白质提取物的SDS-PAGE凝胶。在向培养基中加入IPTG后5小时收集细胞，并通过超声处理破碎。以15,000rpm离心5分钟后的总蛋白提取物(T)和上清液(S)在4-15％聚丙烯酰胺凝胶中溶解。箭头表示可能对应于RFP的蛋白质条带。

图2：示出bAL002和bAL007至bAL017澄清裂解物的SDS-PAGE分析。

蛋白质凝胶证实了除了AMI3phi24R(bAL014)之外的所有内溶素都被表达。对应于内溶素的条带以红色框起来。

图3：示出来自筛选组1的示例性点测定(spot assay)结果。

产气荚膜梭菌菌株(NCTC 8238)新铺的细胞(freshly-plated cell)和细胞苔(cell lawn)对大肠杆菌表达的内溶素进行筛选，包括各种阴性/阳性对照。琼脂板上的标记对应于所呈现的图例。20μg/ml氨苄青霉素显示出抑制新铺的细胞上Cp的生长，但对细胞苔没有表现出溶菌活性。在测试浓度下，溶菌酶、EDTA二钠及其组合对新铺的细胞和细胞苔均没有影响。相反，取决于特定的大肠杆菌表达的内溶素，在新铺的细胞和细胞苔上观察到了溶菌活性。例如，澄清的bAL016(GH25CPFORC3)裂解物能够在细胞苔和新铺的细胞上产生清除区。清除区的大小并不指示内溶素的比活性，因为澄清的裂解物点没有针对内溶素表达水平进行标准化。

图4：示出对来自筛选组2的产气荚膜梭菌菌株(NCTC 8237)的示例性点测定结果。

新铺的细胞和细胞苔对大肠杆菌表达的内溶素进行筛选，包括各种阴性/阳性对照。点检结果类似于筛选组1。测试的其它抗生素(氯霉素、卡那霉素和大观霉素)对指数期和稳定期细胞均没有影响。与筛选组1相比，更高浓度的EDTA二钠(10mM)对新铺的细胞显示出抑制效果，但对细胞苔没有抑制效果。类似于筛选组1，澄清的bAL016(GH25CPFORC3)裂解物在细胞苔和新铺的细胞上产生清除区。清除区的大小并不指示内溶素的比活性，因为澄清的裂解物点没有针对内溶素表达水平进行标准化。

图5：示出家禽肠道中常见的4种非产气荚膜梭菌物种(DSMZ 753、1351、6011和20083)的点测定结果。

新铺的细胞和细胞苔对大肠杆菌表达的内溶素进行筛选，包括各种阴性/阳性对照。样品和点布置类似于图4中所示的内容。取决于物种，20μg/ml氨苄青霉素和10mM EDTA二钠对新铺的细胞显示出抑制效果，但对细胞苔没有影响。氯霉素对新铺的细胞也表现出一些抑制效果。相反，所有大肠杆菌表达的内溶素对新铺的细胞和细胞苔均不显示溶菌活性。

图6：示出纯化的GH25CPFORC3、AMI2phiCPV4和AMI2phiZP2内溶素的SDS-PAGE分析和光密度测定。

蛋白质凝胶结果显示，内溶素从相应的大肠杆菌菌株中得到了适当的纯化，具有最少的污染蛋白质残留。使用BSA标准曲线的光密度测定分析确定了GH25CPFORC3、AMI2phiCPV4和AMI2phiZP2的纯化的内溶素储备浓度分别约为2400μg/mL、750μg/mL和1000μg/mL。

图7：示出用于评估纯化的内溶素对产气荚膜梭菌的抑制效果和溶菌活性的示例性点测定结果。

(A)新铺的细胞——用于测试内溶素对产气荚膜梭菌(APHA B00976)的抑制效果的示例性点测定。(B)细胞苔2——用于测试内溶素对产气荚膜梭菌(APHA B00976)的溶菌活性的示例性点测定。没有可见的生长检测用-表示，而+/-、+、++和+++对应于越来越清晰并越来越大的清除区。

图8：示出浊度降低测定板格式。96微孔板上的抗生酶的样品布置和有效加载浓度，每孔终体积为100μL。

对照样品包括PBS对照(100μL/孔PBS，仅pH 7.0；8次重复)和空白对照(10μL/孔PBS，pH 7.0+90μL/孔重悬细胞；8次重复)。除溶菌酶之外，GH25CPFORC3、AMI2phiCPV4和AMI2phiZP2内溶素对每个加载浓度进行3次重复测定。

图9：示出溶菌酶(A)和内溶素(GH25CPFORC3(B)、AMI2phiCPV4(C)和AMI2phiZP2(D))对NCTC 2837浊度降低的剂量反应。

图10：示出不同加载浓度(5、2.5、1.25和0.63μg/mL分别对应——A至D)下对NCTC2837的内溶素溶菌活性排序。

图11：示出溶菌酶(A)和内溶素(GH25CPFORC3(B)、AMI2phiCPV4(C)和AMI2phiZP2(D))对NCTC 8237浊度降低的剂量反应。

图12：示出不同加载浓度(5、2.5、1.25和0.63μg/mL分别对应——A至D)下对NCTC8237的内溶素溶菌活性排序。

图13：示出溶菌酶(A)和内溶素(GH25CPFORC3(B)、AMI2phiCPV4(C)和AMI2phiZP2(D))对NCTC 8238浊度降低的剂量反应。

图14：示出不同加载浓度(5、2.5、1.25和0.63μg/mL分别对应——A至D)下对NCTC8238的内溶素溶菌活性排序。

图15：示出溶菌酶(A)和内溶素(GH25CPFORC3(B)、AMI2phiCPV4(C)和AMI2phiZP2(D))对NCTC 8239浊度降低的剂量反应。

图16：示出不同加载浓度(5、2.5、1.25和0.63μg/mL分别对应——A至D)下对NCTC8239的内溶素溶菌活性排序。

图17：示出内溶素在不同加载浓度(5、2.5、1.25和0.63μg/mL)以及对不同产气荚膜梭菌参照菌株(NCTC 2837(A)、8237(B)、8238(C)、8239(D))的溶菌活性的汇总。

在散点图上绘制的提取的“t_50％裂解”值允许更简洁地描述内溶素的排序和剂量反应，包括对于不同菌株。散点图表明NCTC 8237对所测试的内溶素最敏感，而NCTC 8238的抗性最强。

图18：示出溶菌酶和内溶素对NCTC 8238的溶菌活性的汇总。

溶菌酶“t_50％裂解”值只能根据NCTC 8238的浊度降低测定结果确定。虽然溶菌酶显示出对NCTC 8238的溶菌活性高于其它3种菌株(NCTC 2837、8237、8239)，但是汇总图显示与内溶素相比其裂解活性仍然少得多。

图19：示出用加载浓度为1μg/mL和5μg/mL的内溶素处理的产气荚膜梭菌菌株的log10降低。

显示了用初始细菌加载量为1530万个细胞/mL的(A)GH25CPFORC3、(B)AMI2phiCPV4和(C)AMI2phiZP2内溶素处理的4种不同产气荚膜梭菌(NCTC 2837、8237、8238、8239)细胞的Δlog10值。Δlog10值计算为每种菌株的未处理的细胞对照反应与内溶素处理的细胞反应之间比率的log10。显示了三个生物学平行测定的平均Δlog10值和标准偏差。测定结果支持根据实施例12建立的内溶素性能排序，从最高性能到最低性能：1)GH25CPFORC3，2)AMI2phiCPV4，3)AMI2phiZP2。

图20：示出产气荚膜梭菌对内溶素的活力的剂量反应。根据图19的Δlog10值计算细胞活力降低的百分比，并针对测定中使用的内溶素浓度绘图。结果显示细胞活力降低的百分比随着添加的内溶素的增加而增加。

图20中的图形为图19中所示数据的替代图形。这些替代图形显示了作为内溶素加载浓度的函数的菌株活力的降低百分比。该图形显示增加内溶素浓度能够降低细胞的活力。然而，对于所有菌株，随着添加5倍多的内溶素，从1μg/mL到5μg/mL，内溶素和细胞活力剂量反应剂量反应没有线性变化，并没有使细胞活力降低5倍。鉴于目前的测定条件，内溶素的抗微生物活性可能被低估。

图21：示出示例性点测定结果，以研究GH25CPFORC3(‘FORC3)和AMI2phiCPV4(‘V4)内溶素之间的协同相互作用以及它们对产气荚膜梭菌的溶菌活性。根据样品布置在NCTC8238细胞苔上点样单种或组合的内溶素。没有可见的生长检测用-表示，而+/-、+、++和+++对应于越来越清晰并越来越大的清除区。观察到协同效应，因为与200ug/mLGH25CPFORC3或AMI2phiCPV4点相比，当GH25CPFORC3和AMI2phiCPV4各点样100ug/mL时产生更大的清除区。类似地，与100ug/mL GH25CPFORC3或AMI2phiCPV4点相比，当GH25CPFORC3和AMI2phiCPV4各点样50ug/mL时产生更大的清除区。

图22：6xHis标记的AMI2phiZP2、AMI2phiCPV4和GH25CPF4969内溶素的亲和纯化。SDS-PAGE凝胶和光密度测定表明，从相应的大肠杆菌菌株中适当纯化内溶素。使用BSA标准曲线的光密度测定分析确定了AMI2phiZP2、AMI2phiCPV4和GH25CPF4969的纯化的内溶素储备浓度分别约为1700μg/mL、1000μg/mL和3600μg/mL。

图23：示例性棋盘格PGN测定板布置和内溶素加载浓度。在一个96微孔板中进行了两次棋盘格PGN测定，其中示例性样本布置用于10μg/mL的1×内溶素起始浓度。10×列内溶素储备液(即内溶素1或3)经2倍连续稀释6次至1.6μg/mL，而10×行内溶素(即内溶素2或4)储备液经2倍连续稀释4次至6μg/mL。将10μL/孔的相应的内溶素1或3的10×储备液分配到适当的列中，并且类似地，将10μL/孔的相应的内溶素2或4的10×储备液分配到适当的行中。将10μL/孔PBS(pH 7.0)分别添加到内溶素1或3的仅对照列6和12中。类似地，将10μL/孔PBS(pH 7.0)添加到内溶素2或4的仅对照行H中。向孔H6和H12中添加额外的10μL/孔PBS(pH7.0)用于0μg/mL加载孔(即仅PGN对照)。通过分配80μL/孔的PGN测定储备液(如实施例20中所述制备)启动PGN测定，从而有效地将每种内溶素稀释10倍。孔H6和H12为“仅PGN”的对照孔，具有0μg/mL内溶素。每个孔中的内溶素加载量对应于指示的行和列加载浓度。

图24：纯化的GH25CPFORC3和AMI2phiZP2内溶素对产气荚膜梭菌菌株Cp6 PGN降解的协同效应。(A)2.5μg/mL GH25CPFORC3，2.5μg/mL AMI2phiZP2，以及2.5μg/mLGH25CPFORC3+2.5μg/mL AMI2phiZP2的PGN降解曲线。(B)2.5μg/mL GH25CPFORC3，0.63μg/mL AMI2phiZP2，以及2.5μg/mL GH25CPFORC3+0.63μg/mL AMI2phiZP2的PGN降解曲线。(C)1.25μg/mL GH25CPFORC3，2.5μg/mL AMI2phiZP2，以及1.25μg/mL GH25CPFORC3+2.5μg/mLAMI2phiZP2的PGN降解曲线。(D)初始PGN降解速率的汇总。降解曲线标记对应于纯化的内溶素及其加载量。此外，括号中伴随的标记描述了PGN降解曲线的初始降解速率(OD/hr)。当内溶素组合表现出1)与每种内溶素的单独速率的总和相比更高的PGN降解速率和/或2)与单独使用内溶素时相比更高的PGN降解至更低的OD的时候，协同效应被评估为存在。因此，结果表明该内溶素组合是协同的。

图25：纯化的GH25CPFORC3和AMI2phiCPV4内溶素对产气荚膜梭菌菌株Cp6 PGN降解的协同效应。(A)2.5μg/mL GH25CPFORC3，2.5μg/mL AMI2phiCPV4，以及2.5μg/mLGH25CPFORC3+2.5μg/mL AMI2phiCPV4的PGN降解曲线。(B)1.25μg/mL GH25CPFORC3，2.5μg/mL AMI2phiCPV4，以及1.25μg/mL GH25CPFORC3+2.5μg/mL AMI2phiCPV4的PGN降解曲线。(C)0.16μg/mL GH25CPFORC3，5μg/mL AMI2phiCPV4，以及0.16μg/mL GH25CPFORC3+5μg/mLAMI2phiCPV4的PGN降解曲线。(D)初始PGN降解速率的汇总。降解曲线标记对应于纯化的内溶素及其加载量。此外，括号中伴随的标记描述了PGN降解曲线的初始降解速率(OD/hr)。当内溶素组合表现出1)与每种内溶素的单独速率的总和相比更高的PGN降解速率和/或2)与单独使用内溶素时相比更高的PGN降解至更低的OD的时候，协同效应被评估为存在。因此，结果表明该内溶素组合是协同的。

图26：纯化的GH25CPF4969和AMI3CPF4969内溶素对产气荚膜梭菌菌株Cp6 PGN降解的协同效应。(A)10μg/mL GH25CPF4969，5μg/mL AMI3CPF4969，以及10μg/mLGH25CPF4969+5μg/mL AMI3CPF4969的PGN降解曲线。(B)10μg/mL GH25CPF4969，2.5μg/mLAMI3CPF4969，以及10μg/mL GH25CPF4969+2.5μg/mL AMI3CPF4969的PGN降解曲线。(C)5μg/mL GH25CPF4969，10μg/mL AMI3CPF4969，以及5μg/mL GH25CPF4969+10μg/mL AMI3CPF4969的PGN降解曲线。(D)0.16μg/mL GH25CPF4969，10μg/mL AMI3CPF4969，以及0.16μg/mLGH25CPF4969+10μg/mL AMI3CPF4969的PGN降解曲线。(E)初始PGN降解速率的汇总。降解曲线标记对应于纯化的内溶素及其加载量。此外，括号中伴随的标记描述了PGN降解曲线的初始降解速率(OD/hr)。当内溶素组合表现出1)与每种内溶素的单独速率的总和相比更高的PGN降解速率和/或2)与单独使用内溶素时相比更高的PGN降解至更低的OD的时候，协同效应被评估为存在。因此，结果表明该内溶素组合是协同的。

图27：纯化的GH25phiS63和GH25CPF4969内溶素对产气荚膜梭菌菌株Cp6 PGN降解的协同效应。(A)10μg/mL GH25phiS63，10μg/mL GH25CPF4969，以及10μg/mL GH25phiS63+10μg/mL GH25CPF4969的PGN降解曲线。(B)5μg/mL GH25phiS63，10μg/mL GH25CPF4969，以及5μg/mL GH25phiS63+10μg/mL GH25CPF4969的PGN降解曲线。(C)初始PGN降解速率的汇总。降解曲线标记对应于纯化的内溶素及其加载量。此外，括号中伴随的标记描述了PGN降解曲线的初始降解速率(OD/hr)。当内溶素组合表现出1)与每种内溶素的单独速率的总和相比更高的PGN降解速率和/或2)与单独使用内溶素时相比更高的PGN降解至更低的OD的时候，协同效应被评估为存在。因此，结果表明该内溶素组合是协同的。

图28：纯化的GH25CPFORC3和AMI3CPF4969内溶素对产气荚膜梭菌菌株Cp6 PGN降解的协同效应。(A)1.25μg/mL GH25CPFORC3，2.5μg/mL AMI3CPF4969，以及1.25μg/mLGH25CPFORC3+2.5μg/mL AMI3CPF4969的PGN降解曲线。(B)0.63μg/mL GH25CPFORC3，2.5μg/mL AMI3CPF4969，以及0.63μg/mL GH25CPFORC3+2.5μg/mL AMI3CPF4969的PGN降解曲线。(C)初始PGN降解速率的汇总。降解曲线标记对应于纯化的内溶素及其负载。此外，括号中伴随的标记描述了PGN降解曲线的初始降解速率(OD/hr)。当内溶素组合表现出1)与每种内溶素的单独速率的总和相比更高的PGN降解速率和/或2)与单独使用内溶素时相比更高的PGN降解至更低的OD的时候，协同效应被评估为存在。因此，结果表明该内溶素组合是协同的。

图29：纯化的GH25CPF4969和AMI2phiZP2内溶素对产气荚膜梭菌菌株Cp6 PGN降解的协同效应。(A)2.5μg/mL GH25CPF4969，2.5μg/mL AMI2phiZP2，以及2.5μg/mLGH25CPF4969+2.5μg/mL AMI2phiZP2的PGN降解曲线。(B)0.31μg/mL GH25CPF4969，10μg/mLAMI2phiZP2，以及0.31μg/mL GH25CPF4969+10μg/mL AMI2phiZP2的PGN降解曲线。(C)初始PGN降解速率的汇总。降解曲线标记对应于纯化的内溶素及其加载量。此外，括号中伴随的标记描述了PGN降解曲线的初始降解速率(OD/hr)。当内溶素组合表现出1)与每种内溶素的单独速率的总和相比更高的PGN降解速率和/或2)与单独使用内溶素时相比更高的PGN降解至更低的OD的时候，协同效应被评估为存在。因此，结果表明该内溶素组合是协同的。

图30：用于评估藻类提取物的裂解活性和抗微生物活性的PGN降解测定(A)和MIC测定(B)的板布置。

图31：表达内溶素的藻类提取物对产气荚膜梭菌Cp6细胞的溶菌活性(全细胞Cp6点测定)。收集来自衣藻菌株crAL035、crAL038、crAL039、crAL045、crAL057和crAL061的摇瓶培养物的样品以测定它们对产气荚膜梭菌Cp6细胞的裂解活性。从每种菌株制备的可溶性提取物被标准化为10mg TSP/mL，并且将10μL点样于嵌有产气荚膜梭菌Cp6细胞的固体琼脂培养基上。2次重复点样可溶性提取物。每个点中心的数字表示从中制备提取物的衣藻菌株。根据每个点周围的清除区的大小和清晰度，对裂解活性进行定性评估。将crAL035(一种通过用不含内溶素基因的载体转化产生的菌株)用作对照。

图32：表达内溶素的藻类提取物对产气荚膜梭菌Cp6细胞的裂解活性(PGN降解测定)。(A)来自仅表达GH25CPFORC3的藻类菌株(crAL045和crAL061)的提取物的PGN降解曲线。(B)来自仅表达AMI2phiZP2的藻类菌株(crAL038和crAL039)的提取物的PGN降解曲线。(C)菌株crAL057(其共表达GH25CPFORC3和AMI2phiZP2)、crAL038(仅AMI2phiZP2)和crAL061(仅GH25CPFORC3)的PGN降解曲线。(D)从图形A至C中提取的初始PGN降解速率的汇总。

图33：来自表达内溶素的藻类菌株的提取物对产气荚膜梭菌Cp6细胞的最低抑菌浓度(MIC)。从表达内溶素的衣藻菌株制备的可溶性提取物的MIC值。MIC表示为完全抑制细菌生长的可溶性提取物的总可溶性蛋白质，以微克每毫升(μg TSP/mL)为单位。误差线对应于1个标准误差。

图34：用于评估藻类提取物的裂解活性的PGN降解测定的板布置。将藻类提取物以10mg TSP/mL(10×储备液)制备，然后经2倍连续稀释多达7次至78μg TSP/mL。来自菌株crAL035的提取物经2倍连续稀释仅3次至1250μg TSP/mL。根据所示的板布置，将10μL/孔的提取物稀释液分配到96微孔板中。对于未加载提取物的“仅PGN”对照孔，分配10μL/孔PBS(pH7.0)。通过分配90μL/孔PGN测定储备液启动PGN测定。

图35：表达内溶素的菌株crAL075、crAL076、crAL077、crAL078、crAL079和crAL080对产气荚膜梭菌Cp6细胞的溶菌活性测定(全细胞Cp6点测定)。(A)点测定板布置。(B)不同藻类提取物的点测定结果。每个点中心的数字是指对应的菌株ID(例如，“58”指菌株crAL058)。后面跟着指稀释系数(1、2和4)的数字。所有藻类提取物均标准化为10mg TSP/mL的1×储备液。

图36：衣藻菌株crAL035、crAL038、crAL039、crAL041、crAL058、crAL075、crAL076、crAL077、crAL078、crAL079和crAL080生产的藻类提取物的PGN降解曲线。(A)来自不携带任何内溶素基因的crAL035的125、250、500和1000μg TSP/mL提取物的PGN降解曲线。(B)当与缓冲液(PBS，pH 7.0)而非藻类提取物(4次重复)混合时的背景PGN降解。(C)来自表达推定的GH25内溶素的菌株：crAL041(GH25CPFORC3)、crAL075(GH25phiS63)和crAL079(AMI3CPF4969)的提取物的PGN降解曲线。(D)来自表达推定的AMI2内溶素的菌株crAL038(AMI2phiZP2)和crAL080(GH25CPF4969)的提取物的PGN降解曲线。(E)来自表达推定的AMI3内溶素的菌株crAL076(AMI3CPFORC25)、crAL077(AMI3CPJP55)和crAL078(AMI3phi24R)的提取物的PGN降解曲线。(F)来自不表达内溶素基因的阴性对照crAL035菌株和来自无活性菌株crAL075和crAL077的提取物的PGN降解曲线。

图37：从衣藻菌株crAL035、crAL038、crAL039、crAL041、crAL045、crAL058、crAL075、crAL076、crAL077、crAL078、crAL079和crAL080生产的藻类提取物的裂解活性。(A)通过增加含有推定的GH25内溶素的提取物的量引起的PGN降解初始速率的剂量反应。(B)通过增加含有推定的AMI2内溶素的提取物的量引起的PGN降解初始速率的剂量反应。(C)通过增加含有推定的AMI3内溶素的提取物的量引起的PGN降解初始速率的剂量反应。(D)来自表达内溶素的莱茵衣藻菌株的提取物的活性的汇总，表示为600nm处的OD变化/(h×(μg TSP/ml)。

图38：在5L生物反应器中生长的莱茵衣藻菌株crAL045和crAL039的生长曲线。750nm处的光密度(OD750nm)用于跟踪细胞密度随时间的增加。在鼓气泡并控制pH的黑暗条件下，培养物于25℃生长。(A)示出菌株crAL045的生长曲线并且(B)示出菌株crAL039的生长曲线。在生长6天后在约41OD处收获菌株crAL045。细胞被喷雾干燥，得到总产量为25.8g的干燥的生物质。类似地，在生长5天后在约116OD处收获菌株crAL039，并在喷雾干燥后生成42g的干燥的生物质。

图39：MIC/MBC测定板布置和有效提取物加载浓度。相应地根据指示的板格式启动MIC/MBC测定。使用的crAL045和crAL039的可溶性提取物的TSP含量为30mg TSP/mL(10×储备液)。crAL045和crAL039可溶性提取物使用PBS(pH 7.0)缓冲液2×连续稀释11次，或至有效稀释2048×。为了启动MIC测定，根据板布置分配10μL/孔的2倍连续稀释的可溶性提取物，然后添加90μL/孔的～10⁵个细胞/mL Cp6，得到有效加载浓度。crAL045提取物的连续稀释液以3次重复进行测定，而crAL039提取物以2次重复进行测定。

图40：crAL045和crAL039喷雾干燥的生物质的抗微生物活性。来自crAL045和crAL039菌株的喷雾干燥的生物质用于生产可溶性提取物，用于抗微生物活性测定。使用2.5E5个细胞/mL的产气荚膜梭菌菌株CP6的低MIC值表明crAL045和crAL039干燥的生物质均具有高的抗微生物活性。MBC值比MIC值略微增加。抗微生物活性排序与使用来自湿摇瓶沉淀的可溶性提取物(实施例24)观察到的那些相匹配，其中crAL045比crAL039更有活性。有趣的是，与摇瓶提取物相比，来自喷雾干燥的生物质的提取物能够产生低得多的MIC值。

图41：显示代表性内溶素的藻类提取物增强的PGN降解测定的板布置。(A)用于显示GH25CPFORC3和AMI2phiZP2内溶素的35D、35L、53D和54D藻类提取物增强的PGN测定的布置。在PBS(pH 7.0)缓冲液或4种藻类提取物中稀释的内溶素的2×连续稀释液在没有重复的情况下进行了测定。(B)用于显示GH25CPFORC3、GH25CPF4969、AMI2phiZP2和AMI3CPF4969内溶素的54D藻类提取物增强的PGN测定的布置。在PBS(pH 7.0)缓冲液或54D藻类提取物中稀释的内溶素的2×连续稀释液以3次重复进行了测定。对于每个板布置，还包括加载0μg/mL内溶素的4次重复的“仅PGN”对照孔用于稀释，以确定它们的背景降解速率(如果有)。记录的有效提取物浓度仅仅对应于使用提取物稀释的孔。

图42：与PBS(pH 7.0)缓冲液中相比，藻类提取物中的内溶素的增强倍数计算。该方程用于计算与PBS(pH 7.0)缓冲液中相比，藻类提取物对内溶素的PGN降解活性的增强倍数。例如，v_2.5,ex对应于2.5μg/mL的加载浓度下在藻类提取物中稀释的内溶素的初始PGN降解速率。或者，v_0,ex对应于仅具有0μg/mL内溶素加载的藻类提取物的初始PGN降解速率(即背景降解速率)。

图43：浓度2.5μg/mL的莱茵衣藻提取物增强GH25CPFORC3内溶素的PGN降解活性。显示了与35D(A)、35L(B)、53D(C)和54D(D)莱茵衣藻提取物混合的2.5μg/mL纯化的GH25CPFORC3内溶素的PGN降解曲线，并且与仅与PBS(pH 7.0)缓冲液混合的纯化的内溶素的PGN降解曲线进行了比较。从PGN降解曲线中提取的初始速率汇总在条形图中(E)；误差线对应于1个标准误差。结果表明，所有4种莱茵衣藻提取物均增强GH25CPFORC3的PGN降解活性。此外，条形图显示莱茵衣藻提取物本身(0μg/mL内溶素)不能降解PGN。

图44：浓度1.25μg/mL的莱茵衣藻提取物增强GH25CPFORC3内溶素的PGN降解活性。显示了与35D(A)、35L(B)、53D(C)和54D(D)莱茵衣藻提取物混合的1.25μg/mL纯化的GH25CPFORC3内溶素的PGN降解曲线，并且与仅与PBS(pH 7.0)缓冲液混合的纯化的内溶素的PGN降解曲线进行了比较。从PGN降解曲线中提取的初始速率汇总在条形图中(E)；误差线对应于1个标准误差。结果表明，所有4种莱茵衣藻提取物均增强GH25CPFORC3的PGN降解活性。此外，条形图显示莱茵衣藻提取物本身(0μg/mL内溶素)不能降解PGN。

图45：浓度0.63μg/mL的莱茵衣藻提取物增强GH25CPFORC3内溶素的PGN降解活性。显示了与35D(A)、35L(B)、53D(C)和54D(D)莱茵衣藻提取物混合的0.63μg/mL纯化的GH25CPFORC3内溶素的PGN降解曲线，并且与仅与PBS(pH 7.0)缓冲液混合的纯化的内溶素的PGN降解曲线进行了比较。从PGN降解曲线中提取的初始速率汇总在条形图中(E)；误差线对应于1个标准误差。结果表明，所有4种莱茵衣藻提取物均增强GH25CPFORC3的PGN降解活性。此外，条形图显示莱茵衣藻提取物本身(0μg/mL内溶素)不能降解PGN。

图46：35D、35L、53D和54D藻类提取物对GH25CPFORC3内溶素的PGN降解活性的增强倍数。单次重复的结果表明，在指定的加载浓度下，并且根据藻类提取物，GH25CPFORC3内溶素比在PBS(pH 7.0)缓冲液中混合时增强至高达约2.5倍。

图47：浓度0.31、0.16和0.08μg/mL的莱茵衣藻提取物增强GH25CPFORC3内溶素的PGN降解活性。显示了与35D、35L、53D和54D莱茵衣藻提取物混合的0.31(A)、0.16(B)和0.08(C)μg/mL纯化的GH25CPFORC3内溶素的PGN降解曲线，并且与仅与PBS(pH 7.0)缓冲液混合的纯化的内溶素的PGN降解曲线进行了比较。降解曲线的比较表明，与仅在缓冲液中相比，在藻类提取物存在下，内溶素的PGN降解活性增强。

图48：莱茵衣藻提取物增强AMI2phiZP2内溶素的PGN降解活性。显示了与54D莱茵衣藻提取物混合的2.5(A)、1.25(B)和0.63(C)μg/mL纯化的AMI2phiZP2内溶素的PGN降解曲线，并且与仅与PBS(pH 7.0)缓冲液混合的纯化的内溶素的PGN降解曲线进行了比较。从PGN降解曲线中提取的初始速率汇总在条形图(D-2.5μg/mL)、(E-1.25μg/mL)和(F-0.63μg/mL)中；误差线对应于1个标准误差。结果表明，所有4种莱茵衣藻提取物均增强AMI2phiZP2的PGN降解活性。此外，条形图显示莱茵衣藻提取物本身(0μg/mL内溶素)不能降解PGN。

图49：35D、35L、53D和54D藻类提取物对AMI2phiZP2内溶素的PGN降解活性的增强倍数。单次重复的结果表明，在指定的加载浓度下，并且根据藻类提取物，AMI2phiZP2内溶素比在PBS(pH 7.0)缓冲液中混合时增强高达约2.2倍。

图50：54D莱茵衣藻提取物对GH25CPFORC3内溶素的PGN降解活性的增强是可重现的。显示了与54D莱茵衣藻提取物混合的2.5(A)、1.25(B)、0.63(C)、0.31(D)、0.16(E)和0(F)μg/mL纯化的GH25CPFORC3内溶素的代表性PGN降解曲线，并且与仅与PBS(pH 7.0)缓冲液混合的纯化的内溶素的代表性PGN降解曲线进行了比较。从PGN降解曲线中提取的初始速率汇总在条形图中(G)；误差线对应于1个标准误差。结果表明，藻类提取物对GH25CPFORC3内溶素的PGN降解活性的增强是可重现的，并且与3次重复一致。当在缓冲液中稀释的内溶素表现出几乎与背景(0μg/mL内溶素)一样低的降解活性时，特别是在降低的加载浓度下，增强是显著的，并且能够在例如0.16μg/mL的内溶素浓度下看到。

图51：54D莱茵衣藻提取物对AMI2phiZP2内溶素的PGN降解活性的增强是可重现的。显示了与54D莱茵衣藻提取物混合的1.25(A)、0.63(B)、0.31(C)、0.16(D)和0(E)μg/mL纯化的AMI2phiZP2内溶素的代表性PGN降解曲线，并且与仅与PBS(pH 7.0)缓冲液混合的纯化的内溶素的代表性PGN降解曲线进行了比较。从PGN降解曲线中提取的初始速率汇总在条形图中(F)；误差线对应于1个标准误差。结果表明，藻类提取物对AMI2phiZP2内溶素的PGN降解活性的增强是可重现的，并且与3次重复一致。

图52：54D莱茵衣藻提取物增强AMI3CPF4969内溶素的PGN降解活性。显示了与54D莱茵衣藻提取物混合的2.5(A)、1.25(B)、0.63(C)、0.31(D)、0.16(E)和0(F)μg/mL纯化的AMI3CPF4969内溶素的代表性PGN降解曲线，并且与仅与PBS(pH 7.0)缓冲液混合的纯化的内溶素的代表性PGN降解曲线进行了比较。从PGN降解曲线中提取的初始速率汇总在条形图中(G)；误差线对应于1个标准误差。结果与3次重复一致，并且表明藻类提取物的增强作用也扩展至AMI3CPF4969。当在缓冲液中稀释的内溶素表现接近背景水平(0μg/mL内溶素)的降解活性时，特别是在降低的加载浓度下，增强是显著的，并且能够在例如1.25、0.63、0.31和0.16μg/mL的内溶素浓度下看到。

图53：54D莱茵衣藻提取物增强GH25CPF4969内溶素的PGN降解活性。显示了与54D莱茵衣藻提取物混合的1.25(A)、0.63(B)、0.31(C)、0.16(D)和0(E)μg/mL纯化的GH25CPF4969内溶素的代表性PGN降解曲线，并且与仅与PBS(pH 7.0)缓冲液混合的纯化的内溶素的代表性PGN降解曲线进行了比较。从PGN降解曲线中提取的初始速率汇总在条形图中(F)；误差线对应于1个标准误差。结果与3次重复一致，并且表明藻类提取物的增强作用也扩展至GH25CPF4969。

图54：54D藻类提取物对内溶素的PGN降解活性的增强倍数。藻类提取物增强内溶素GH25CPFORC3和AMI3CPF4969以及内溶素AMI2phiZP2和GH25CPF4969的PGN降解活性。对于GH25CPFORC3和AMI3CPF4969内溶素提取物增强是显著的，对于GH25CPFORC3和AMI3CPF4969内溶素，增强分别高达约69倍和44倍。对于AMI33CPF4969的提取物增强也可以说是“无限地”增强，因为在缓冲液中稀释的内溶素在低于0.63μg/mL的浓度表现出与类似于背景的降解速率。AMI2phiZP2和GH25CPF4969内溶素都被藻类提取物增强了高达约2倍。

图55：藻类提取物增强GH25CPFORC3和AMI2phiZP2内溶素的抗微生物活性。(A)用于在PBS(pH 7.0)或从在黑暗中生长的菌株crAL054制备的藻类提取物(54D)中稀释的GH25CPFORC3和AMI2phiZP2的MIC测定的板布置。(B)在PBS(pH 7.0)缓冲液或500μg TSP/mL54D提取物中的GH25CPFORC3和AMI2phiZP2的MIC值。结果表明，与在缓冲液中时相比，提取物分别将纯化的GH25CPFORC3和AMI2phiZP2内溶素活性增强了约2.5倍和4倍。误差线对应于1个标准误差。

图56：测试的衣藻提取物的组合进行以研究协同效应。测试了9种不同的衣藻菌株的组合，以研究它们在组合使用时的协同效应。组合8-9使用crAL058提取物(共表达的GH25CPFORC3和AMI2phiZP2内溶素)，以及来自表达在crAL058中不表达的内溶素的第二菌株的提取物。还指出了在每种衣藻菌株中表达的相应内溶素。

图57：示例性棋盘格PGN测定板布置和提取物加载浓度。在一个96微孔板中启动了两次棋盘格PGN测定，其中一个示例性样品布局用于500μg/mL的1×内溶素起始浓度。10×列提取物储备液(即提取物1或3)经2倍连续稀释6次至78.1μg/mL，而10×行提取物储备液(即提取物2或4)经2倍连续稀释4次至313μg/mL。将10μL/孔的相应的提取物1或3的稀释液分配到适当的列中，并且类似地，将10μL/孔的相应的提取物2或4的稀释液分配到适当的行中。将10μL/孔PBS(pH 7.0)分别添加到列6和12(仅提取物1或3的稀释液)中。类似地，将10μL/孔PBS(pH 7.0)添加到行H孔(仅提取物2或4的稀释液)中。确保H6和H12(“仅PGN”对照，具有0μg/mL内溶素)孔含有总共20μL/孔的PBS(pH 7.0)。通过分配80μL/孔的PGN测定储备液启动PGN测定，从而有效地将每种提取物稀释10倍。每个孔中的提取物加载量对应于指示的行和列加载浓度。

图58：衣藻提取物crAL041(表达GH25CPFORC3)和crAL038(表达AMI2phiZP2)对产气荚膜梭菌菌株Cp6的PGN降解的协同效应。(A)使用500μg TSP/mL crAL041、500μg TSP/mLcrAL038和500μg TSP/mL crAL041+500μg TSP/mL crAL038的PGN降解曲线。(B)使用250μgTSP/mL crAL041、250μg TSP/mL crAL038和250μg TSP/mL crAL041+250μg TSP/mLcrAL038的PGN降解曲线。(C)使用125μg TSP/mL crAL041、125μg TSP/mL crAL038和125μgTSP/mL crAL041+125μg TSP/mL crAL038的PGN降解曲线。(D)使用62.5μg TSP/mLcrAL041、62.5μg TSP/mL crAL038和62.5μg TSP/mL crAL041+62.5μg TSP/mL crAL038的PGN降解曲线。(E)初始PGN降解速率的汇总。降解曲线标记对应于衣藻提取物及其加载量。此外，括号中伴随的标记描述了PGN降解曲线的初始速率。结果表明，crAL041和crAL038提取物在组合使用时是协同的。条形图中汇总的初始速率表明，两种提取物同时使用时的组合速率高于单独使用提取物时的速率的总和。

图59：衣藻提取物crAL041(表达GH25CPFORC3)和crAL080(表达GH25CPF4969)对产气荚膜梭菌菌株Cp6的PGN降解的协同效应。(A)使用250μg TSP/mL crAL041、250μg TSP/mLcrAL080和250μg TSP/mL crAL041+250μg TSP/mL crAL080的PGN降解曲线。(B)使用125μgTSP/mL crAL041、125μg TSP/mL crAL080和125μg TSP/mL crAL041+125μg TSP/mLcrAL080的PGN降解曲线。(C)初始PGN降解速率的汇总。降解曲线标记对应于衣藻提取物及其加载量。此外，括号中伴随的标记描述了PGN降解曲线的初始速率。结果表明，crAL041和crAL080提取物在组合使用时是协同的。条形图中汇总的初始速率表明，两种提取物同时使用时的组合速率高于单独使用提取物时的速率的总和。

图60：衣藻提取物crAL045(表达GH25CPFORC3)和crAL076(表达AMI3CPFORC25)对产气荚膜梭菌菌株Cp6的PGN降解的协同效应。(A)使用500μg TSP/mL crAL045、500μg TSP/mL crAL076和500μg TSP/mL crAL045+500μg TSP/mL crAL076的PGN降解曲线。(B)使用250μg TSP/mL crAL045、250μg TSP/mL crAL076和250μg TSP/mL crAL045+250μg TSP/mLcrAL076的PGN降解曲线。(C)使用125μg TSP/mL crAL045、125μg TSP/mL crAL076和125μgTSP/mL crAL045+125μg TSP/mL crAL076的PGN降解曲线。(D)初始PGN降解速率的汇总。降解曲线标记对应于衣藻提取物及其加载量。此外，括号中伴随的标记描述了PGN降解曲线的初始速率。结果表明，crAL045和crAL076提取物在组合使用时是协同的。条形图中总结的初始速率表明，两种提取物同时使用时的组合速率高于单独使用提取物时的速率的总和。

图61：衣藻提取物crAL045(表达GH25CPFORC3)和crAL078(表达AMI3phi24R)对产气荚膜梭菌菌株Cp6的PGN降解的协同效应。(A)使用500μg TSP/mL crAL045、500μg TSP/mLcrAL078和500μg TSP/mL crAL045+500μg TSP/mL crAL078的PGN降解曲线。(B)使用250μgTSP/mL crAL045、250μg TSP/mL crAL078和250μg TSP/mL crAL045+250μg TSP/mLcrAL078的PGN降解曲线。(C)使用125μg TSP/mL crAL045、125μg TSP/mL crAL078和125μgTSP/mL crAL045+125μg TSP/mL crAL078的PGN降解曲线。(D)使用62.5μg TSP/mLcrAL045、62.5μg TSP/mL crAL078和62.5μg TSP/mL crAL045+62.5μg TSP/mL crAL078的PGN降解曲线。(E)初始PGN降解速率的汇总。降解曲线标记对应于衣藻提取物及其加载量。此外，括号中伴随的标记描述了PGN降解曲线的初始速率。结果表明，crAL045和crAL078提取物在组合使用时是协同的。条形图中汇总的初始速率表明，两种提取物同时使用时的组合速率高于单独使用提取物时的速率的总和。

图62：衣藻提取物crAL079(表达AMI3CPF4969)和crAL076(表达AMI3CPFORC25)对产气荚膜梭菌菌株Cp6的PGN降解的协同效应。(A)使用500μg TSP/mL crAL079、500μg TSP/mL crAL076和500μg TSP/mL crAL079+500μg TSP/mL crAL076的PGN降解曲线。(B)使用250μg TSP/mL crAL079、250μg TSP/mL crAL076和250μg TSP/mL crAL079+250μg TSP/mLcrAL076的PGN降解曲线。(C)使用125μg TSP/mL crAL079、125μg TSP/mL crAL076和125μgTSP/mL crAL079+125μg TSP/mL crAL076的PGN降解曲线。(D)使用62.5μg TSP/mLcrAL079、62.5μg TSP/mL crAL076和62.5μg TSP/mL crAL079+62.5μg TSP/mL crAL076的PGN降解曲线。(E)初始PGN降解速率的汇总。降解曲线标记对应于衣藻提取物及其加载量。此外，括号中伴随的标记描述了PGN降解曲线的初始速率。结果表明，crAL079和crAL076提取物在组合使用时是协同的。条形图中汇总的初始速率表明，两种提取物同时使用时的组合速率高于单独使用提取物时的速率的总和。

图63：衣藻提取物crAL076(表达AMI3CPFORC25)和crAL038(表达AMI2phiZP2)对产气荚膜梭菌菌株Cp6的PGN降解的协同效应。(A)使用500μg TSP/mL crAL076、500μg TSP/mLcrAL038和500μg TSP/mL crAL076+500μg TSP/mL crAL038的PGN降解曲线。(B)使用250μgTSP/mL crAL076、250μg TSP/mL crAL038和250μg TSP/mL crAL076+250μg TSP/mLcrAL038的PGN降解曲线。(C)使用125μg TSP/mL crAL076、125μg TSP/mL crAL038和125μgTSP/mL crAL076+125μg TSP/mL crAL038的PGN降解曲线。(D)初始PGN降解速率的汇总。降解曲线标记对应于衣藻提取物及其加载量。此外，括号中伴随的标记描述了PGN降解曲线的初始速率。结果表明，crAL076和crAL038提取物在组合使用时是协同的。条形图中汇总的初始速率表明，两种提取物同时使用时的组合速率高于单独使用提取物时的速率的总和。

图64：衣藻提取物crAL080(表达GH25CPF4969)和crAL076(表达AMI3CPFORC25)对产气荚膜梭菌菌株Cp6的PGN降解的协同效应。(A)使用500μg TSP/mL crAL080、500μg TSP/mL crAL076和500μg TSP/mL crAL080+500μg TSP/mL crAL076的PGN降解曲线。(B)使用500μg TSP/mL crAL080、250μg TSP/mL crAL076和500μg TSP/mL crAL080+250μg TSP/mLcrAL076的PGN降解曲线。(C)使用250μg TSP/mL crAL080、500μg TSP/mL crAL076和250μgTSP/mL crAL080+500μg TSP/mL crAL076的PGN降解曲线。(D)使用250μg TSP/mL crAL080、250μg TSP/mL crAL076和250μg TSP/mL crAL080+250μg TSP/mL crAL076的PGN降解曲线。(E)初始PGN降解速率的汇总。降解曲线标记对应于衣藻提取物及其加载量。此外，括号中伴随的标记描述了PGN降解曲线的初始速率。结果表明，crAL080和crAL076提取物在组合使用时是协同的。条形图中汇总的初始速率表明，两种提取物同时使用时的组合速率高于单独使用提取物时的速率的总和。

图65：衣藻提取物crAL058(表达GH25CPFORC3和AMIphiZP2)和crAL080(表达GH25CPF4969)对产气荚膜梭菌菌株Cp6的PGN降解的协同效应。(A)使用500μg TSP/mLcrAL058、500μg TSP/mL crAL080和500μg TSP/mL crAL058+500μg TSP/mL crAL080的PGN降解曲线。(B)使用250μg TSP/mL crAL058、250μg TSP/mL crAL080和250μg TSP/mLcrAL058+250μg TSP/mL crAL080的PGN降解曲线。(C)使用125μg TSP/mL crAL058、125μgTSP/mL crAL080和125μg TSP/mL crAL058+125μg TSP/mL crAL080的PGN降解曲线。(D)初始PGN降解速率的汇总。降解曲线标记对应于衣藻提取物及其加载量。此外，括号中伴随的标记描述了PGN降解曲线的初始速率。结果表明，crAL058和crAL080提取物在组合使用时是协同的。条形图中汇总的初始速率表明，两种提取物同时使用时的组合速率高于单独使用提取物时的速率的总和。crAL058和crAL080之间存在协同效应表明三种内溶素GH25CPFORC3、AMI2phiZP2和GH25CPF4969在组合使用时也是协同的。

图66：衣藻提取物crAL058(表达GH25CPFORC3和AMIphiZP2)和crAL076(表达AMI3CPFORC25)对产气荚膜梭菌菌株Cp6的PGN降解的协同效应。(A)使用500μg TSP/mLcrAL058、500μg TSP/mL crAL076和500μg TSP/mL crAL058+500μg TSP/mL crAL076的PGN降解曲线。(B)使用250μg TSP/mL crAL058、250μg TSP/mL crAL076和250μg TSP/mLcrAL058+250μg TSP/mL crAL076的PGN降解曲线。(C)初始PGN降解速率的汇总。降解曲线标记对应于衣藻提取物及其加载量。此外，括号中伴随的标记描述了PGN降解曲线的初始速率。结果表明，crAL058和crAL076提取物在组合使用时是协同的。条形图中汇总的初始速率表明，两种提取物同时使用时的组合速率高于单独使用提取物时的速率的总和。crAL058和crAL076之间存在协同效应还表明三种内溶素GH25CPFORC3、AMI2phiZP2和AMI3CPFORC25在组合使用时是协同的。

图67：96微孔棋盘格设置和提取物加载浓度。棋盘格MIC测定用修改的提取物加载浓度和条件进行重复。类似地，制备每种提取物的20×浓缩的储备液并经2倍连续稀释。crAL045提取物被连续稀释至～7.3μg TSP/mL，而crAL039提取物被连续稀释至～104.7μgTSP/mL。将5μL/孔的相应crAL045储备液提取物分配到适当的列中，并且类似地，将5μL/孔的相应crAL039储备液提取物分配到适当的行中。通过将90μL/孔的～10⁴个细胞/mL的BHI+C培养基中的产气荚膜梭菌菌株Cp6分配到微孔板中并有效地将每种提取物稀释20倍来启动MIC测定。H行和第12列孔分别仅包含2倍连续稀释的加载浓度的crAL045和crAL039提取物。H12孔是未添加提取物的对照生长孔。每个孔中的crAL045和crAL039提取物加载量对应于指示的行和列加载浓度。

图68：部分抑制浓度指数值计算。部分抑菌浓度(FIC)指数计算用于确定抗微生物剂之间的协同效应。协同组合是指当组合导致FIC值≤0.5时的组合。累加效应定义为0.5<FIC≤4，而当FIC>4时则为拮抗效应。

图69：衣藻表达的内溶素提取物crAL045和crAL039的协同效应(棋盘格MIC测定)。将不同加载浓度的crAL045和crAL039提取物与～10⁴个细胞/mL的产气荚膜梭菌菌株Cp6过夜孵育证实它们在抑制产气荚膜梭菌细胞生长方面是协同的(A)。大于0.10OD620nm的孔值对应于用0.29OD620nm的生长对照孔(H12)的细胞生长。通过OD620nm读数以及目测评估抑制的孔。还观察到各种水平的部分抑制。单独crAL045提取物的MIC测定为23.4μg TSP/mL(H5，*)，而单独crAL039提取物的MIC测定为167.5μg TSP/mL(B12，**)。在5.9μg TSP/mLcrAL045提取物和41.9μg TSP/mL crAL039提取物(D7，***)的组合加载下，计算出该组合是协同的，其中部分抑制浓度为0.5(计算：5.9/23.4+41.9/167.5＝0.5)。(B)汇总条形图显示与单独使用每种提取物时相比，抑制Cp6细胞生长所需的每种提取物crAL045和crAL039显著下降。

具体实施方式

内溶素多肽、其片段及变体

发明人鉴定了能够用作抗微生物剂(“内溶素”)的新型噬菌体编码的内溶素多肽。本发明包括具有如本文公开的SEQ ID NO中所示的氨基酸序列的特定内溶素，它们中的每一个在本文中被鉴定为本发明的多肽。这些内溶素具有惊人且有利的功能性抗微生物特性。这些内溶素具有抗微生物活性。这些内溶素对产气荚膜梭菌物种具有抗菌活性。产气荚膜梭菌也可被称为“产气荚膜梭菌(C.perfringens)”或“Cp”。这些内溶素可以对产气荚膜梭菌的A型物种和菌株具有抗菌活性。

此外，本发明还包括具有如本文公开的SEQ ID NO中所示的氨基酸序列并且在本文中被鉴定为本发明的多肽的特定内溶素的变体。“变体”可以是特定内溶素的片段/截短体、突变体或衍生物，该特定内溶素具有如本文公开的SEQ ID NO中所示的氨基酸序列并且在本文中被鉴定为本发明的多肽。例如，变体可以通过一个或多个氨基酸取代而不同于具有如本文公开的SEQ ID NO中所示的氨基酸序列的特定内溶素。因此，内溶素变体的氨基酸序列可以通过参考同一性百分比与特定SEQ ID NO的氨基酸序列相关，如本文更详细地定义。在所有情况下，变体内溶素也具有抗微生物活性。所有变体内溶素均具有抗菌活性，尤其是针对产气荚膜梭菌物种的抗菌活性。变体内溶素可以针对产气荚膜梭菌的A型物种和菌株具有抗菌活性。不具有上述抗微生物和抗菌活性的变体内溶素不在本发明的范围之内。

如本文所述的内溶素多肽的“片段”或内溶素多肽的结构域的“片段”为具有比全长内溶素多肽或内溶素多肽的全长结构域短的氨基酸序列的任何多肽。内溶素为良好表征的酶，并且本领域技术人员可以容易地描绘出定义全长内溶素多肽或内溶素多肽的全长结构域的序列特征，如通过序列比对和分析。因此，本领域技术人员可以容易地描绘出这样的“片段”。

具有如本文公开的SEQ ID NO中所示的氨基酸序列并且在本文中被鉴定为本发明的多肽的特定的内溶素以及所有变体内溶素在本文中可以统称为“内溶素”和/或“本发明的内溶素”和/或“内溶素多肽”和/或“本发明的内溶素多肽”。

本文将提及“分离的”内溶素多肽或其片段。这仅仅是为了区分本发明的内溶素多肽或其片段与自然界中存在的内溶素多肽或其片段。在本发明的上下文中，当在宿主细胞中从核酸和/或从表达载体表达或者当存在于源自这种宿主细胞的裂解物与源自这种宿主细胞和裂解物的组合物等的情况下提及本发明的这种内溶素多肽或片段时，可以使用术语“分离的”。应当理解，在这种情况下，术语“分离的”不应按字面解释，而是与诸如“重组的”和“外源的”等术语同义地使用，意思是本发明的内溶素多肽或其片段已被人为地人工引入细胞、裂解物、组合物等中。

本发明的内溶素多肽——一般结构特征

本发明的内溶素具有N端产气荚膜梭菌细胞壁肽聚糖催化结构域，在本文中也称为N端催化结构域。本发明的内溶素可以具有一个或多个N端产气荚膜梭菌细胞壁肽聚糖催化结构域。

本发明的内溶素可以另外具有一个或多个C端产气荚膜梭菌细胞壁结合结构域，在本文中也称为C端结合结构域。

本发明的内溶素可以另外具有一个或多个连接N端催化结构域和C端结合结构域的接头，和/或一个或多个连接多个C端结合结构域的接头(如果存在)，和/或一个或多个连接多个N端催化结构域的接头(如果存在)。

N端催化结构域

如本文所描述的本发明的内溶素的N端催化结构域是负责酶切细菌细胞壁的肽聚糖层的催化结构域。因此，催化结构域对内溶素针对其目标物种、属或菌株的特异性具有影响。

N端催化结构域可以具有N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷酶活性、N-乙酰基-β-D-胞壁酸酶活性、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶活性和/或肽链内切酶活性。

C端结合结构域

如本文所描述的本发明的内溶素的C端细胞壁结合结构域包括细菌细胞壁结合结构域。因此，C端细胞壁结合结构域还负责内溶素对其目标物种、属或菌株的特异性。该结构域非共价结合至细胞被膜，其可以是肽聚糖或其它细胞壁相关的分子的一部分。

在某些多肽中，内溶素可以仅包含N端催化结构域，并且仍然对其目标菌种具有高度特异性。C端结合结构域可以增强内溶素的特异性，但它可以不是必需的。本发明的内溶素还可以在序列中具有多于一个的C端结合结构域，如在序列中具有两个C端结合结构域。据推测，C端结合结构域与细胞内部的细胞壁的结合起到了防止内溶素裂解产气荚膜梭菌噬菌体有待感染的其它细菌的作用。因此，C端结合结构域的存在可以是确保噬菌体后代存活的演化特征。

接头

在某些多肽中，本发明的内溶素可以包含一个或多个连接N端和C端结构域的接头，和/或一个或多个连接多个C端结合结构域的接头(如果存在)，和/或一个或多个连接多个N端催化结构域的接头(如果存在)。

连接结构域的接头优选为柔性接头区。

可以使用任何合适的接头以连接结构域。接头可以是天然存在的接头，如由本文SEQ ID NO定义的内溶素接头，或可以是人工接头。可以使用的接头的实例描述于Chen等Adv Drug Deliv Rev.2013年10月15日；65(10):1357–1369和Chichili等ProteinSci.2013年2月；22(2):153–167中。

接头可以是线性接头或分支接头。

接头可以包含烃链。烃链可以包含2至约2000或更多个碳原子。该烃链可以包含亚烷基，例如C2至约2000或更多个亚烷基。该烃链可具有-(CH2)n-的通式，其中n为2至约2000或更大。该烃链可以任选地被一个或多个酯基(即-C(O)-O-)或一个或多个酰胺基(即-C(O)-N(H)-)中断。

可以使用选自包含以下的组中的任何接头：PEG、聚丙烯酰胺、聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)、聚-2-甲基-2-恶唑啉(PMOXA)、两性离子聚合物(例如聚(羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯)(PCBMA)、聚[N-(3-磺丙基)-N-甲基丙烯酰氧乙基-N、N二甲基铵甜菜碱](PSBMA))、含糖聚合物(glycopolymer)和多肽的组。

接头可以包含具有以下通式的聚乙二醇(PEG)：-(CH2-CH2-O)n-，其中n为1至约600或更大。

接头可以包含具有以下通式的低聚乙二醇-磷酸酯单元：-[(CH2-CH2-O)n-PO2--O]m-，其中n为1至约600或更多，并且m可以为1-200或更多。

结构域/接头构造的变化

如本文所公开的，SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或8中任一项所示的“全长”产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽均具有N端产气荚膜梭菌细胞壁肽聚糖催化结构域，如本文所描述和定义的。

这些序列可以另外包含一个C端产气荚膜梭菌细胞壁结合结构域，和/或它们还可以包含多于一个的C端产气荚膜梭菌细胞壁结合结构域，如本文所描述和定义的。此外，它们还可以包含一个或多个如本文所描述和定义的接头序列。

连接本文定义的N端产气荚膜梭菌细胞壁肽聚糖催化结构域和本文定义的C端产气荚膜梭菌细胞壁结合结构域的任何氨基酸序列均可以定义为本文中的接头序列。

将一个本文定义的C端产气荚膜梭菌细胞壁结合结构域和另一个本文定义的C端产气荚膜梭菌细胞壁结合结构域连接的任何氨基酸序列均可以定义为本文中的接头序列。

在包含如本文定义的N端产气荚膜梭菌细胞壁肽聚糖催化结构域或其片段和如本文定义的一个或多个C端产气荚膜梭菌细胞壁结合结构域或其片段、以及任选地如本文定义的一个或多个接头序列或其片段的本发明的任何内溶素多肽中，该N端催化结构域或其片段、该C端结合结构域或其片段(如果存在)和该接头或其片段(如果存在)可以以任何顺序构造。

因此，例如，在天然存在的内溶素多肽中位于多肽的N端的产气荚膜梭菌细胞壁肽聚糖催化结构域(或其片段或变体)可以替代地位于本发明的多肽的C端。

类似地，在天然存在的内溶素多肽中位于多肽的C端的产气荚膜梭菌细胞壁结合结构域(或其片段或变体)可以替代地位于本发明的多肽的N端。

任何顺序的任何一个或多个接头序列或其片段可以连接任何顺序的任何两个或更多个N端结构域序列或其片段和任何顺序的任何两个或更多个C端结构域序列或其片段，或者何顺序的任何N端结构域序列或其片段和任何C端结构域序列或其片段。

本发明的内溶素多肽——结构特征

包含N端催化结构域的内溶素多肽

如上所述，本发明的内溶素具有N端产气荚膜梭菌细胞壁肽聚糖催化结构域(本文也称为N端催化结构域)或其片段。因此，本发明的内溶素可以是一种具有抗微生物活性的分离的内溶素多肽，并且其中，该分离的多肽包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：该氨基酸序列为N端产气荚膜梭菌细胞壁肽聚糖催化结构域多肽，并且与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或8中所示的产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的N端细胞壁肽聚糖催化结构域的氨基酸序列至少80％相同；或该氨基酸序列为所述N端催化结构域多肽的片段，并且与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或8中所示序列的对应于该片段的氨基酸序列的氨基酸序列至少80％相同。

分离的内溶素多肽可以包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：该氨基酸序列为N端产气荚膜梭菌细胞壁肽聚糖催化结构域并且与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或8中所示产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的氨基酸序列至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在该氨基酸序列的片段的情况下，该内溶素多肽可以包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：该氨基酸序列与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或8中所示序列的对应于该片段的氨基酸序列的氨基酸序列至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。

根据SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或8中所示氨基酸序列定义的内溶素多肽的N端产气荚膜梭菌细胞壁肽聚糖催化结构域分别由SEQ ID NO:12、13、14、15、16、17、19和20中所示的氨基酸序列表示。此外，根据SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列定义的内溶素多肽的N端产气荚膜梭菌细胞壁肽聚糖催化结构域可以由SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列表示。

上文定义的任何内溶素多肽可以具有本文定义的任何抗微生物活性。

包含N端催化结构域和C端结合结构域的内溶素多肽

如上所述，本发明的内溶素具有N端产气荚膜梭菌细胞壁肽聚糖催化结构域，并且另外可以具有一个或多个C端产气荚膜梭菌细胞壁结合结构域。

本发明的内溶素可以具有SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或8中所示的产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的“全长”N端产气荚膜梭菌细胞壁肽聚糖催化结构域或其片段，与SEQID NO:1、2、3、5、6或8中所示的产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的“全长”C端产气荚膜梭菌细胞壁结合结构域或其片段的组合，并且任选地，与SEQ ID NO:1、2、3、5、6或8中所示的产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的“全长”接头的组合或任选地与接头片段的组合。

根据SEQ ID NO:1、2、3、5、6或8中所示的氨基酸序列定义的内溶素多肽的C端产气荚膜梭菌细胞壁结合结构域分别由SEQ ID NO:33、36、37、38、41和43中所示的氨基酸序列表示。

此外，根据SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列定义的内溶素多肽的C端产气荚膜梭菌细胞壁结合结构域可以由SEQ ID NO:34中所示的氨基酸序列表示。此外，根据SEQ IDNO:1中所示的氨基酸序列定义的内溶素多肽的C端产气荚膜梭菌细胞壁结合结构域可以由两个如SEQ ID NO:35中所示的氨基酸序列定义的C端产气荚膜梭菌细胞壁结合结构域表示。

此外，根据SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列定义的内溶素多肽的C端产气荚膜梭菌细胞壁结合结构域可以由SEQ ID NO:39中所示的氨基酸序列表示。此外，根据SEQ IDNO:1中所示的氨基酸序列定义的内溶素多肽的C端产气荚膜梭菌细胞壁结合结构域可以由两个如SEQ ID NO:40中所示的氨基酸序列定义的C端产气荚膜梭菌细胞壁结合结构域表示。

此外，根据SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列定义的内溶素多肽的C端产气荚膜梭菌细胞壁结合结构域可以由SEQ ID NO:42中所示的氨基酸序列表示。

根据SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列定义的内溶素多肽的接头序列可以由SEQID NO:24或25中所示的氨基酸序列表示。根据SEQ ID NO:2和3中所示的氨基酸序列定义的内溶素多肽的接头序列可以分别由SEQ ID NO:26和27中所示的氨基酸序列表示。根据SEQID NO:5中所示的氨基酸序列定义的内溶素多肽的接头序列可以由SEQ ID NO:28或29中所示的氨基酸序列表示。根据SEQ ID NO:6和8中所示的氨基酸序列定义的内溶素多肽的接头序列可以分别由SEQ ID NO:30和31中所示的氨基酸序列表示。

在本公开中，SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或8中所示的任何多肽中公开的每一个N端产气荚膜梭菌细胞壁肽聚糖催化结构域、每一个C端产气荚膜梭菌细胞壁结合结构域(如果有)和每一个接头(如果有)是使用Pfam软件根据同源性搜索定义的。此外，SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或8中所示的任何多肽中公开的任一个N端产气荚膜梭菌细胞壁肽聚糖催化结构域、任一个C端产气荚膜梭菌细胞壁结合结构域(如果有)和任一个接头(如果有)可以是可替代地使用HHpred软件、InterProScan软件或蛋白质结构分类(StructuralClassification of Proteins,SCOP)数据库根据同源性搜索定义的。

因此，本发明的内溶素可以是如上定义的具有抗微生物活性的分离的内溶素多肽，进一步地，其中该分离的多肽包含：N端产气荚膜梭菌细胞壁肽聚糖催化结构域多肽或其片段、C端产气荚膜梭菌细胞壁结合结构域多肽或其片段以及任选地连接N端结构域和C端结构域的接头多肽或其片段；其中，该分离的多肽包含：

d)与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或8中所示的产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的N端细胞壁肽聚糖催化结构域的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，或为所述N端催化结构域多肽的片段并且与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或8中所示序列的对应于该片段的氨基酸序列的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列；和

e)与内溶素C端产气荚膜梭菌细胞壁结合结构域多肽或所述多肽的片段至少80％相同的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:1、2、3、5、6或8中所示的产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的C端细胞壁结合结构域的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，或为所述C端结合结构域多肽的片段并且与SEQ ID NO:1、2、3、5、6或8中所示序列的对应于该片段的氨基酸序列的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列；和

f)与内溶素多肽或该多肽的片段的接头至少80％相同的任选的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:1、2、3、5、6或8中所示的产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的接头的氨基酸序列至少80％相同的任选的氨基酸序列，或为所述接头的片段并且与SEQ ID NO:1、2、3、5、6或8中所示序列的对应于该片段的氨基酸序列的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列。

本发明的内溶素可以是如上定义的具有抗微生物活性的分离的内溶素多肽，其中，该分离的多肽包含：N端产气荚膜梭菌细胞壁肽聚糖催化结构域多肽或其片段、C端产气荚膜梭菌细胞壁结合结构域多肽或其片段和连接N端结构域和C端结构域的接头多肽或其片段；其中，该分离的多肽包含：

d)与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或8中所示的产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的N端细胞壁肽聚糖催化结构域的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，或为所述N端催化结构域多肽的片段并且与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或8中所示序列的对应于该片段的氨基酸序列的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列；和

e)与SEQ ID NO:1、2、3、5、6或8中所示的产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的C端产气荚膜梭菌细胞壁结合结构域的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，或为所述C端结合结构域多肽的片段并且与SEQ ID NO:1、2、3、5、6或8中所示序列的对应于该片段的氨基酸序列的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列；和

f)与SEQ ID NO:1、2、3、5、6或8中所示的产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的接头的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，或为所述接头的片段并且与SEQ ID NO:1、2、3、5、6或8中所示序列的对应于该片段的氨基酸序列的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列。

本发明的内溶素可以是如上定义的具有抗微生物活性的分离的内溶素多肽，其中，该分离的多肽包含：氨基酸序列，其中，N端催化结构域、C端细胞壁结合结构域和接头都分别与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或8中所示的产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的N端结构域、C端结构域和接头的相应的氨基酸序列至少80％相同。

本发明的内溶素可以是如上定义的具有抗微生物活性的分离的内溶素多肽，其中，该分离的多肽包含：

d)由所述N端催化结构域的片段组成并且与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或8中所示序列的对应于该片段的氨基酸序列的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列；和/或

e)由所述C端结合结构域的片段组成并且与SEQ ID NO:1、2、3、5、6或8中所示序列的对应于该片段的氨基酸序列的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列；和/或

f)由所述接头的片段组成并且与SEQ ID NO:1、2、3、5、6或8中所示序列的对应于该片段的氨基酸序列的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列。

在具有N端产气荚膜梭菌细胞壁肽聚糖催化结构域或为其片段的氨基酸序列和C端产气荚膜梭菌细胞壁结合结构域或为其片段的氨基酸序列，以及任选的接头或为其片段的氨基酸序列的上述的本发明的任何内溶素多肽中，与参考序列的同一性百分比可以为高于80％。

因此，在任何这种分离的内溶素多肽中，内溶素多肽可以包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：该氨基酸序列为N端产气荚膜梭菌细胞壁肽聚糖催化结构域并且与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或8中所示的产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的氨基酸序列至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在氨基酸序列为所述氨基酸序列的片段的情况下，内溶素多肽可以包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：该氨基酸序列与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或8中所示序列的对应于该片段的氨基酸序列的氨基酸序列至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在任何这种分离的内溶素多肽中，该内溶素多肽可以包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：该氨基酸序列为C端产气荚膜梭菌细胞壁结合结构域并且与已知的内溶素C端产气荚膜梭菌细胞壁结合结构域多肽的氨基酸序列至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在所述氨基酸序列的片段的情况下，内溶素多肽可以包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：该氨基酸序列与已知的内溶素C端产气荚膜梭菌细胞壁结合结构域多肽的序列的对应于该片段的氨基酸序列的氨基酸序列至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。可替代地，在任何这种分离的内溶素多肽中，该内溶素多肽可以包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：该氨基酸序列为C端产气荚膜梭菌细胞壁结合结构域并且与SEQ ID NO:1、2、3、5、6或8中所示的产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的氨基酸序列至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在所述氨基酸序列的片段的情况下，内溶素多肽可以包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：该氨基酸序列与SEQ ID NO:1、2、3、5、6或8中所示序列的对应于该片段的氨基酸序列的氨基酸序列至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在任何这种分离的内溶素多肽中，该内溶素多肽可以任选地包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：该氨基酸序列与已知的内溶素多肽的接头的氨基酸序列至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在所述氨基酸序列的片段的情况下，内溶素多肽可以包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：该氨基酸序列与已知的内溶素多肽的接头的对应于该片段的氨基酸序列的氨基酸序列至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。可替代地，在任何这种分离的内溶素多肽中，该内溶素多肽可以包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：该氨基酸序列与SEQ ID NO:1、2、3、5、6或8中所示的产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的接头的氨基酸序列至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在所述氨基酸序列的片段的情况下，内溶素多肽可以包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：该氨基酸序列与SEQ ID NO:1、2、3、5、6或8中所示序列的对应于该片段的氨基酸序列的氨基酸序列至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。

上文定义的任何内溶素多肽可以具有本文定义的任何抗微生物活性。

本发明的内溶素可以是如上定义的具有抗微生物活性的分离的内溶素多肽，其中

该多肽包含：

c)包含SEQ ID NO:1、2、3、6或8中所示的产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的所有的N端结构域、C端结构域和接头的氨基酸序列，并且其中，该氨基酸序列与SEQ ID NO:1、2、3、5、6或8中所示的产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的N端结构域、C端结构域和接头的序列100％相同；或

d)包含SEQ ID NO:1、2、3、5、6或8中所示的产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的所有的N端结构域、C端结构域和接头的片段的氨基酸序列，并且其中，每个片段的氨基酸序列与对应于该片段的氨基酸序列的SEQ ID NO:1、2、3、5、6或8中所示的产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的序列100％相同。

本发明的内溶素可以是如上定义的具有抗微生物活性的分离的内溶素多肽，其中，该多肽包含与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或8中所示的产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的氨基酸序列100％相同的氨基酸序列。

包含一种或多种片段和变体的内溶素多肽

任何上述片段可以相对于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或8中所示的全长氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或8中所示的氨基酸序列中定义的结构域/接头被截短，条件是任何这种片段具有本文定义的任何抗微生物活性。这种片段可以在多肽的N端和/或C端被截去任意数量的氨基酸。

根据本发明的内溶素多肽可以通过在任何位置替换、插入、缺失或添加任意数量的氨基酸(如1个或多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、30个或更多个、35个或更多个、40个或更多个、45个或更多个或50个或更多个氨基酸)，来源于SEQ IDNO:1、2、3、4、5、6、7或8中所示的任何一种产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽，条件是任何这种片段具有本文定义的任何抗微生物活性。一个以上或所有的氨基酸替换可以是保守氨基酸替换。

根据本发明的内溶素多肽可以通过添加一个或多个额外的N端或C端氨基酸或化学部分以增加稳定性、溶解性和活性而衍生自如本文所鉴定的序列中的一个序列。

根据本发明的内溶素多肽可以具有至少100个或更多个、150个或更多个、200个或更多个、250个或更多个、300个或更多个、350个或更多个、400个或更多个、450个或更多个、500个或更多个、550个或更多个、600个或更多个、650个或更多个、700或更多个、750个或更多个、800个或更多个、850个或更多个、900个或更多个、950个或更多个、1000个或更多个、1100个或更多个、1200个或更多个、1300个或更多个、1400个或更多个、1500个或更多个、或2000或更多个氨基酸的长度。

变体内溶素多肽可以是根据本发明的内溶素多肽的任何非天然存在的或基因工程化的形式，包括其任何片段或衍生物，条件是任何这种变体具有本文定义的任何抗微生物活性。内溶素多肽变体可以在一些工程化的方式上与本文参考SEQ ID NO公开的任何多肽不同。例如，根据本发明的变体内溶素多肽可以通过从编码由本文公开的任何一个SEQID NO定义的多肽的核苷酸序列开始定点诱变来制备。

根据本发明的变体内溶素多肽的片段可以根据相对于参照氨基酸序列或参照多核苷酸序列的同一性百分比来定义。例如，根据本发明的变体内溶素多肽的片段可以根据相对于由作为参照氨基酸序列的SEQ ID NO:1至8中任一项所示的序列或由作为参照氨基酸序列的SEQ ID NO:1至8中任一项所示的子序列(如其中定义的任何结构域或接头的序列或这种结构域或接头的序列部分)定义的内溶素多肽的氨基酸序列的同一性百分比来定义。

可以使用任何合适的算法计算氨基酸同一性。例如，PILEUP和BLAST算法可以用于计算同一性或排列序列(如识别对等或对应的序列(通常在它们的默认设置下)，例如，描述于Altschul S.F.,1993,J Mol Evol 36:290-300；Altschul,S,F等,1990,J Mol Biol215:403-10。用于实施BLAST分析的软件可以通过国家生物技术信息中心(National Centerfor Biotechnology Information)公开获得(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。此算法涉及首先通过识别查询序列中长度为W的短词来识别高评分序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的词对齐时，该词匹配或满足某个正值阈值得分T。T被称为邻域词得分阈值(Altschul等，同上)。这些最初的邻域词命中用于启动搜索以查找包含它们的HSP的种子。该词命中沿着每个序列在两个方向上扩展，只要能够增加累积对齐得分。在以下情况下，每个方向上的词命中的扩展将停止：累积对齐得分从其最大取得值下降了数量X；由于一个或多个负评分残基比对的累积，累积得分变为零或更低；或者到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLAST程序默认使用字长(W)11、BLOSUM62得分矩阵(见Henikoff和Henikoff,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915-10919)对齐(B)50、期望值(E)10、M＝5、N＝4以及两条链的比较。

BLAST算法对两个序列之间的相似性进行统计分析；参见例如Karlin和Altschul,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787。BLAST算法提供的一种相似性度量为最小和概率(P(N))，其提供了两个多核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果第一序列与第二序列的比较的最小和概率小于约1，优选小于约0.1，更优选小于约0.01，并且最优选小于约0.001，则认为一个序列与另一个序列相似。可替代地，UWGCG包提供了可用于计算同一性的BESTFIT程序(例如用于其默认设置)(Devereux等,1984NucleicAcids Research 12,387-395)。

如本文所描述的，本发明的多肽的氨基酸序列可以包含由SEQ ID NO定义的参照序列的全部或部分的氨基酸序列，其中，相对于该参照序列或其部分进行修饰，如氨基酸添加、缺失或替换。该修饰可以是保守的或非保守的氨基酸替换。在单个多肽中存在多个修饰的情况下，多肽序列中的修饰可以是保守的和非保守的氨基酸替换的组合。保守替换用相似化学结构、相似化学性质或相似侧链体积的其它氨基酸代替氨基酸。所引入的氨基酸可以与它们代替的氨基酸具有相似的极性、亲水性、疏水性、碱性、酸性、中性或电荷。可替代地，保守替换可以引入另一种芳香族或脂肪族氨基酸代替预先存在的芳香族或脂肪族氨基酸。保守氨基酸变化是本领域公知的，并且可以根据下表中定义的20种主要氨基酸的特性进行选择。

表——氨基酸的化学性质

在氨基酸具有相似极性的情况下，这可以通过参考下表中氨基酸侧链的亲水性等级来确定。

表——亲水性等级

本领域技术人员可以通过进行如本文进一步描述的抗微生物活性的功能测试来确定任何片段或变体内溶素是否具有抗微生物活性。

本发明的内溶素多肽——功能特征

本发明的内溶素可以提供可以通过溶菌活性定义的抗微生物效果。可以使用浊度降低测定、t50％裂解值(内溶素裂解其初始细胞群体的50％所需的时间)和/或细胞活力测定(相对于增加的内溶素浓度或内溶素处理的细胞反应的控制的比例绘制的log₁₀值，以计算每种内溶素的活细菌的降低百分比)来测量溶菌活性。溶菌活性可以通过最低杀菌浓度(MBC)来定义。

本发明的内溶素可以提供可以通过抑菌活性或生长抑制活性定义的抗微生物效果。抑菌活性或生长抑制活性可以通过最低抑制浓度(MIC)来定义。

本发明的内溶素可以提供相较于针对相关对照细菌所观察到的效果更高的针对产气荚膜梭菌细菌的抗微生物效果。相关对照可以是非产气荚膜梭菌(本文称为“非Cp”菌株)的任何细菌菌株。括号内具有其DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen)编号的非Cp菌株包括大肠梭状芽胞杆菌(Clostridium colinum)(DSMZ6011)、柔嫩梭菌(Clostridium leptum)(DSMZ 753)、产纤维二糖梭菌(Clostridiumcellobioparum)(DSMZ 1351)和青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)(DSMZ20083)(另见实施例6)。这些是家禽肠道中常见的四种非Cp细菌菌株，并且可以用于确定内溶素活性和抗微生物活性是否对产气荚膜梭菌具有特异性。

产气荚膜梭菌菌株可以用于确定本发明的内溶素的抗微生物活性。产气荚膜梭菌菌株包括NCTC(National Collection of Type Cultures，国家典型培养物保藏中心)A型菌株，其获自公共卫生英格兰培养物保藏中心(Public Health England culturecollection)，保藏号为：2837、8235、8237、8238、8239、8359、8678、10578。这些产气荚膜梭菌菌株在本文中可以称为“参照菌株”。产气荚膜梭菌菌株还可以包括从英国动植物卫生署(United Kingdom Animal and Plant Health Agency，APHA)获得的A型野外分离株，其保藏号为：B00907、B00917、B00954、B00964、B00976、G00033、W000101、W00102。这些产气荚膜梭菌A型野外分离株在本文中可以称为“野外分离株”。

本发明的内溶素多肽可以对本文公开的产气荚膜梭菌参照菌株和产气荚膜梭菌A型野外分离株中的一种或多种表现出抗微生物效果。本发明的内溶素可以表现出针对NCTC菌株2837、8235、287、823、8237、8238、8239、8359、8678和/或10578的抗微生物效果。

可以通过使用如本文公开的标准细胞活力测定以计算ΔLog₁₀值来确定抗微生物活性。可以针对产气荚膜梭菌参照菌株NCTC 8237使用浓度为5μg/ml的本发明的内溶素或片段确定内溶素多肽或片段表现出的ΔLog₁₀值。ΔLog₁₀值可以是约0.40或更大、2.00或更大或者3.70或更大。约是指+/-10％或+/-5％。

可以通过使用如本文公开的标准细胞活力测定以计算细胞活力降低％来确定抗微生物活性。可以针对产气荚膜梭菌参照菌株NCTC 8237使用浓度为5μg/ml的本发明的内溶素或片段确定本发明的内溶素多肽或片段表现出的细胞活力降低值％。细胞活力降低值％可以是约60％或更大、70％或更大、80％或更大、90％或更大、或者100％。约是指+/-10％或+/-5％。

可以通过使用如本文公开的标准细胞浊度降低测定以计算t50裂解值来确定抗微生物活性。针对产气荚膜梭菌参照菌株NCTC 8237使用浓度为5μg/ml的本发明的内溶素或片段确定内溶素多肽或片段表现出的t50裂解值。所提供的t50裂解值可以是约7分钟或更短；或它可以提供3分钟或更短的t50％裂解值。约是指+/-10％或+/-5％。

该抗微生物活性可以通过使用标准最低抑制浓度(MIC)测定和/或最低杀菌浓度(MBC)测定来确定。可以以2.1×10⁴个细胞/mL对产气荚膜梭菌菌株Cp6进行标准最低抑制浓度(MIC)测定或最低杀菌浓度(MBC)测定；其中，本发明的内溶素或片段表现出17μg/mL或更小、优选1.7μg/mL或更小的MIC值或MBC值；或它表现出0.65μM或更小、优选0.05μM或更小的MIC值或MBC值。约是指+/-10％或+/-5％。

通过评估纯化肽聚糖(PGN)的体外降解速率，可以确定内溶素活性(即水解活性)，并因此可以确定抗微生物活性。这可以通过测量在任何合适的缓冲液中PGN降解的自发速率来评估。纯化PGN的体外降解速率可以通过光密度来评估。为了在这种测定中使用，优选PGN是从细菌物种中纯化的，更优选从产气荚膜梭菌菌株、如产气荚膜梭菌Cp6菌株中纯化的。下面的实施例20中提供了从细菌物种中纯化PGN的方案。

如果本发明的内溶素多肽促进纯化PGN的体外降解速率在统计学上显著增加，则可以确定本发明的内溶素多肽具有内溶素水解活性，并因此具有抗微生物活性。给定的内溶素多肽促进纯化PGN的体外降解速率在统计学上显著增加的能力可以参考PGN降解的背景速率进行评估，即参考不含内溶素多肽的对照制剂。

给定的内溶素多肽促进纯化PGN的体外降解速率在统计学上显著增加的能力可以通过参考参照多肽或对照多肽的PGN降解速率进行评估。参照多肽或对照多肽应当为不能促进纯化PGN的体外降解速率在统计学上显著增加的多肽。参照多肽或对照多肽可以是一种多肽，其是无PGN催化活性的内溶素；或不是内溶素的任何其它合适的多肽，如牛血清白蛋白。

如果本发明的任何内溶素多肽在PGN降解测定的终点(完成)促进体外纯化PGN的绝对量在统计学上显著减少(即体外纯化PGN在统计学上显著降解)，则可以确定本发明的任何内溶素多肽具有内溶素水解活性，并因此具有抗微生物活性。

给定的内溶素多肽促进体外纯化PGN的绝对量在统计学上显著减少的能力也可以参考纯化PGN的绝对量的背景减少进行评估，即参考不含内溶素多肽的对照制剂。

给定的内溶素多肽促进体外纯化PGN的绝对量在统计学上显著减少的能力也可以参考参照多肽或对照多肽引起的纯化PGN降解的绝对量的减少进行评估。参照多肽或对照多肽应当为不能促进体外纯化PGN的绝对量在统计学上显著减少的多肽。参照多肽或对照多肽可以是一种多肽，其是无PGN催化活性的内溶素；或者不是内溶素的任何其它合适的多肽，如牛血清白蛋白。

对于纯化的内溶素，例如在实施例(包括例如以下实施例21)中所解释的，以及对于包含在细胞提取物中的内溶素，如在实施例(包括例如以下实施例24)中所解释的，可以以这种方式评估内溶素水解活性。

在纯化的内溶素的情况下，可以通过参考纯化PGN的降解的背景速率或绝对量的背景减少，即参考不含纯化的内溶素多肽的对照制剂来评估活性。可替代地，可以通过参考含有纯化的对照多肽的对照制剂来评估活性，该对照多肽可以是一种多肽，其是无PGN催化活性的内溶素；或者不是内溶素的任何其它合适的多肽，如牛血清白蛋白。在包含在细胞提取物中的内溶素的情况下，可以通过参考纯化PGN降解的背景速率或绝对量的背景减少来评估活性，即参考不含包含内溶素多肽的细胞提取物的对照制剂。优选地，该对照含有与测试样品相当但减去内溶素多肽的细胞提取物。可替代地，可以通过参考对照制剂来评估活性，该对照制剂含有包含在相当的细胞提取物中的对照多肽。对照多肽可以是一种多肽，其是无PGN催化活性的内溶素；或者不是内溶素的任何其它合适的多肽，如牛血清白蛋白。

抗微生物活性，如溶菌活性和抑菌活性，可以根据以下部分和任何相关实施例中描述的测定法来确定。

溶菌活性的测定方法包括点测定(见实施例8、11和16)，其中将本发明的内溶素多肽及其片段添加到已在合适培养基(例如琼脂板)上建立的产气荚膜梭菌细胞苔(lawn)中。可以使用任何相关的阴性对照，如PBS。可以使用任何阳性对照，如任何抗生素(例如，可以使用氨苄青霉素)或任何其它对产气荚膜梭菌表现出抗微生物和/或溶菌效果的产品。溶菌活性由清除区的存在来表示，并且可以由清除区的大小来确定溶菌活性的程度。

抑菌(生长抑制)活性可以如本文和实施例8、11和16中所述进行确定。抑菌活性的测定方法包括点测定，其中将产气荚膜梭菌菌株在合适的培养基(例如琼脂板)上新铺板，并且将不同浓度的本发明的内溶素多肽添加到新铺板的细菌中。抑菌活性的程度可以通过与未处理的对照或用不影响细菌生长的产品处理的对照相比的产气荚膜梭菌菌落的生长缺乏来确定。

可以通过任何合适的方式评估与相关对照菌株的参照内溶素多肽相比，与本发明的任何内溶素多肽相关的溶菌/log₁₀/t50％裂解值的相对增加，或与本发明的任何内溶素多肽相关的细胞活力的相对减少。与本发明的任何内溶素多肽相关的任何这种相对增加或任何这种相对减少，应当为与参照或对照相比被评估的相关特性在统计学上的显著增加或减少。参照或对照可以是对背景的参考，即参考不含内溶素多肽的对照制剂。参照或对照可以指包含参照多肽或对照多肽的参照制剂或对照制剂。参照多肽或对照多肽应当为不能增加或减少被评估的相关特性的多肽。参照多肽或对照多肽可以是一种多肽，其为无PGN催化活性的内溶素；或者不是内溶素的任何其它合适的多肽，如牛血清白蛋白。

可以通过将本发明的纯化蛋白质的内溶/溶菌/log₁₀/t50％裂解值/细胞活力活性与任何合适的对照蛋白进行比较来评估相对增加。例如，酶、溶菌酶或牛血清白蛋白可以用作对照蛋白。

优选地，当多肽在宿主细胞中，优选在大肠杆菌(E.coli)或藻类宿主细胞中单独表达时，可以通过比较澄清的裂解物中的内溶/溶菌/log₁₀/t50％裂解值/细胞活力活性来评估相对增加。

更具体地，本发明的内溶素多肽的抗微生物活性可以使用以下部分和实施例中概述的测定方法来确定：

内溶素的抗微生物效果(ΔLog10和细胞活力)的测定方法：

ΔLog10，其为未处理的细胞对照反应与内溶素处理的细胞反应之比的log₁₀，可以根据以下方法计算(也参见实施例13)：

1.将产气荚膜梭菌菌株NCTC 8237接种至BHI+C培养基中，并在厌氧条件下于37℃培养过夜至稳定期；

2.将过夜培养物接种至新鲜的BHI+C培养基中，并在厌氧条件下于37℃培养至OD600nm约0.6；

3.在厌氧条件下将1.8mL培养物于室温以16600×g离心5分钟；

4.去除上清液，并在厌氧条件下将细胞沉淀重悬于0.9mL重悬缓冲液(NaCl127mM、Na₂HPO₄ 70mM、NaH₂PO₄ 30mM pH 7.0)中；

5.在厌氧条件下用重悬缓冲液将细胞悬液稀释至OD 600nm 0.6；

6.在厌氧条件下添加纯化的内溶素多肽或片段至5μg/mL的浓度；

7.在厌氧条件下于25℃孵育1小时；

8.通过连续稀释、将细胞铺在RCM固体培养基上并在厌氧条件下于37℃孵育直至形成菌落来确定活细胞计数；并且

9.计算log10减少值作为未处理细胞对照与用内溶素多肽或片段处理的细胞之比的log10。

可以根据以下方法计算细胞活力(也参见实施例13和图20)：

1.将产气荚膜梭菌菌株NCTC 8237接种至BHI+C培养基中，并在厌氧条件下于37℃培养过夜至稳定期；

2.将过夜培养物接种至新鲜的BHI+C培养基中，并在厌氧条件下于37℃培养至OD600nm约0.6；

3.在厌氧条件下将1.8mL培养物于室温以16600×g离心5分钟；

4.去除上清液，并在厌氧条件下将细胞沉淀重悬于0.9mL重悬缓冲液(NaCl127mM、Na₂HPO₄ 70mM、NaH₂PO₄ 30mM pH 7.0)中；

5.在厌氧条件下用重悬缓冲液将细胞悬液稀释至OD 600nm 0.6；

6.在厌氧条件下添加纯化的内溶素多肽或片段至5μg/mL的浓度；

7.在厌氧条件下于25℃孵育1小时；

8.通过连续稀释、将细胞铺在RCM固体培养基上并在厌氧条件下于37℃孵育直至形成菌落来确定活细胞计数；

9.计算log10减少值作为未处理细胞对照与用内溶素多肽或片段处理的细胞之比的log10；并且

10.使用log10减少值来计算活细菌的减少百分比。

t50％裂解值，其被定义为内溶素裂解其初始细胞悬液的50％所需的时间，可以根据以下方法计算(也参见实施例12)：

1.将产气荚膜梭菌菌株NCTC 8237接种至BHI+C培养基中，并在厌氧条件下于37℃培养过夜至稳定期；

2.将过夜培养物接种至新鲜的BHI+C培养基中，并在厌氧条件下于37℃培养直至培养物达到指数期(OD 620nm约1.0)；

3.将一定体积的指数期培养物于10℃以3800×g离心30分钟，然后去除上清液；

4.将细胞重悬在一定体积的PBS(pH 7.0)中，该体积为初始预离心的培养物体积的一半，以浓缩细胞；

5.将90μL重悬细胞转移到96微孔板的孔中，并添加10μL的10倍浓缩的内溶素多肽或片段的PBS(pH 7.0)溶液至5μg/mL的终浓度；

6.通过在室温下在酶标仪上以合适的间隔进行OD 620nm动态读数来监测浊度的降低；

7.监测浊度30-60分钟，或直到OD 620nm降低到其开始趋于稳定的水平；

8.使用以下公式，从浊度降低曲线计算t50％裂解(分钟)，即裂解50％细胞的时间：

其中，ODb_t＝0为在添加内溶素多肽或片段之前，测试开始时初始细胞悬液的光密度；并且

其中，ODE_t50％裂解为在添加内溶素多肽或片段后对应于初始细胞密度降低50％的细胞悬液的光密度。

内溶素的最低抑制浓度(MIC)/最低杀菌浓度(MBC)的测定方法：

MIC/MBC值，其被定义为对于给定的产气荚膜梭菌细胞密度，导致细胞生长停滞的纯化内溶素的最低浓度，可以根据以下方法计算(也参见实施例15)：

1.将产气荚膜梭菌菌株Cp6接种至BHI+C培养基中，并在厌氧条件下于37℃培养过夜至稳定期；

2.在厌氧条件下将稳定期培养物稀释于新鲜的LB培养基中；

3.在厌氧条件下，在PBS(pH 7.0)中制备系列稀释的纯化内溶素储备液，至浓度比最终所需的蛋白质加载浓度高10倍；

4.在厌氧条件下，在微量滴定板的孔中将系列稀释的纯化内溶素与稀释的稳定期培养物混合，其中，对于每个孔，将45μL稀释的稳定期培养物与5μL的10倍浓缩且纯化的内溶素混合，至最终细胞负载量约为10⁴个细胞/mL；

5.在厌氧条件下于41℃将细胞过夜孵育12-20小时；

6.通过测量酶标仪上OD的变化来确定生长抑制的程度，并与培养基和生长对照进行比较；

7.确定内溶素的最低抑制浓度(MIC)，其中，MIC为使细胞生长停滞并且没有观察到可见的生长的内溶素的最低浓度；

8.在厌氧条件下，将5μL培养物从每个孔转移到分开的孔中并用BHI+C培养基补足至100μL；

9.将转移的培养物在厌氧条件下于41℃过夜孵育12-20小时；

10.通过测量孵育后的酶标仪上OD的变化，确定生长的程度并因此确定暴露于内溶素后残留存活的Cp细胞的程度，并与培养基和生长对照进行比较；

11.确定内溶素的最低杀菌浓度(MBC)，其中，MBC为杀死所有初始细胞负载并且没有观察到可见的生长的内溶素的最低浓度。

内溶素多肽之间的协同效应

本发明的内溶素变体也可以组合以产生协同的抗微生物效果(实施例16-18、实施例21、实施例30)。因此，本发明提供了一起使用的两种或更多种本发明的内溶素多肽的组合，其中表现出的抗微生物活性为协同活性。

一起使用的本发明的内溶素多肽的协同活性可以根据本文所述的任何合适的测定方法进行评估。本文所述的PGN降解测定是特别合适的测定方法。一起使用的本发明的多种内溶素多肽的协同活性已在本文所述的PGN降解测定中证明，既作为纯化的蛋白质(例如实施例21)又作为细胞提取物的组分(例如实施例30)。

本发明提供了如本文所描述和定义的任何宿主细胞、细胞裂解物、组合物、全细胞组合物、干燥的生物质组合物或抗微生物制剂，其中表现出的抗微生物活性为协同活性。

本发明还提供了如本文所描述和定义的任何宿主细胞、细胞裂解物、组合物、全细胞组合物或抗微生物制剂(其中表现出的抗微生物活性为协同活性)，包括根据SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列定义的并且表现出协同抗微生物活性的两种内溶素多肽，或根据SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列定义的并且表现出协同抗微生物活性的两种内溶素多肽的片段和变体的任意组合。

编码本发明的内溶素多肽的多核苷酸和载体

本发明还提供了编码本发明的多肽的核酸分子和载体。编码本文公开的多肽的示例性多核苷酸分子以SEQ ID NO:1至8提供。这些序列中的每一个都可以包括在5'端的N端甲硫氨酸(ATG)的密码子，以及在3'端的终止密码子(TAA)之前的3×甘氨酸接头和6×组氨酸标签的密码子，其任选地可以被排除。

本发明还提供了编码内溶素多肽的多核苷酸，使得该多核苷酸经过密码子优化以在特定宿主中高效表达。密码子优化可以根据实施例2实施，其中，用“TGA”终止密码子替换内源性色氨酸“TGG”密码子以最小化对大肠杆菌克隆菌株的潜在毒性作用。本领域技术人员还知晓如何优化密码子和/或密码子对。

术语“核酸分子”和“多核苷酸”在本文中可以互换使用，并且是指任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物)的聚合形式。多核苷酸的非限制性示例包括基因、基因片段、信使RNA(mRNA)、cDNA、重组多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。本发明的多核苷酸可以以分离的或基本上分离的形式提供。基本上分离是指可以从任何周围介质中基本上分离，但不是完全分离多肽。多核苷酸可以与载体或稀释剂混合，该载体或稀释剂不会干扰它们的预期用途并且仍被认为是基本上分离的。“编码”所选多肽的核酸序列是当置于合适调控序列的控制下时，例如在表达载体中，在体内转录(在DNA的情况下)并翻译(在mRNA的情况下)成多肽的核酸分子。编码序列的边界由5'(氨基)端的起始密码子和3'(羧基)端的翻译终止密码子确定。出于本发明的目的，这种核酸序列可包括但不限于来自病毒的cDNA，原核或真核mRNA，来自病毒或原核DNA或RNA的基因组序列，甚至合成的DNA序列。转录终止序列可以位于编码序列的3'处。

可以根据本领域众所周知的方法合成多核苷酸，如在Sambrook等(1989年，冷泉港出版社)分子克隆-实验室手册(Molecular Cloning-a laboratory manual)中举例所述。本发明的核酸分子可以表达盒的形式提供，该表达盒包括与插入序列可操作地连接的控制序列，从而允许本发明的多肽在体内表达。这些表达盒通常又在载体(例如，质粒或重组病毒载体)中提供。这种表达盒可以直接施用于宿主受试者。可替代地，可以将包含本发明的多核苷酸的载体施用于宿主受试者。优选地，使用遗传载体制备和/或施用该多核苷酸。合适的载体可以是能够携带足够量的遗传信息并允许本发明的多肽表达的任何载体。

用于表达本发明的多肽的表达载体可包含两个多克隆位点(MCS)，其将选择的DNA序列置于两个独立的T7聚合酶启动子的控制之下，其中，启动子被工程化以响应培养基中IPTG的存在，从而允许控制基因表达。这种载体可以是pETDuet(Merck Millipore)表达载体。载体可以包含控制基因表达的额外的或可替代的措施。此外，根据实施例2修饰表达载体，使得编码本发明的内溶素的核苷酸序列中存在的第一个色氨酸密码子“TGG”或第一和第二色氨酸密码子突变为“TGA”终止密码子，以防止由本发明的内溶素的不希望的表达引起的对大肠杆菌克隆菌株的毒性。在这些情况下，当在宿主细胞中表达该突变的内溶素多肽时，需要其中反密码子为“TCA”的t-RNA分子的共表达。该t-RNA分子可以是在大肠杆菌菌株中鉴定的一种分子。该t-RNA分子可以如实施例2中所述，如从大肠杆菌k-12菌株(GenBank登记号CP028306)中鉴定的，其中，反密码子“CCA”替换为“TCA”。任何多核苷酸序列，如本文公开的内溶素和t-RNA分子，可以进一步包含与MCS同源的额外序列以促进克隆到MCS中。

因此，本发明包括包含这种多核苷酸序列的表达载体。这种表达载体为分子生物学领域中常规构建的，并且例如可以涉及使用质粒DNA和合适的起始子、启动子、增强子和其它元件，比如可能是必需的并且在正确的方向上定位的聚腺苷酸化信号，以允许表达本发明的肽。其它合适的载体对本领域技术人员来而言是显而易见的。作为这方面的进一步例子，我们参考Sambrook等人。取决于所使用的宿主/载体系统，在表达载体中可以使用许多合适的转录和翻译控制元件中的任何一种，包括组成型和诱导型启动子、转录增强子元件、转录终止子等(例如，U6启动子、HI启动子等)。

因此，本发明可涉及包含根据本发明的核酸构建体或多核苷酸的表达载体。根据本发明的表达载体可以是重组表达载体。这种载体可以构成质粒、粘粒、噬菌体或病毒或其一部分，其通过引入根据本发明的核酸构建体或多核苷酸被转化。这种对待转化的宿主生物体具有特异性的转化载体为本领域技术人员熟知的并且在文献中广泛描述。为了在宿主中产生根据本发明的多核苷酸或内溶素多肽，用于宿主生物体的转化以及根据本发明的多核苷酸、核酸构建体或表达载体的整合的方法可以是合适的。这种转化可以通过在专业文献中广泛描述的并且本领域技术人员熟知的任何合适的已知方式实施。

如本文所使用的，“启动子”是能够结合RNA聚合酶并启动下游(3'方向)编码或非编码序列的转录的DNA调控区。出于定义本发明的目的，启动子序列在其3'端以转录起始位点为边界，并且向上游(5'方向)延伸，以包括以高于背景的可检测水平启动转录所必需的最少数量的碱基或元件。在启动子序列内会发现转录起始位点，以及负责结合RNA聚合酶的蛋白质结合结构域。合适的启动子的非限制性示例包括来自巨细胞病毒(CMV)立即早期、单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶、早期和晚期SV40、来自逆转录病毒的长末端重复序列(LTR)和小鼠金属硫蛋白-I的启动子。选择合适的载体和启动子完全在技术人员的水平之内。表达载体还可含有用于翻译起始和转录终止子的核糖体结合位点。表达载体还可包括用于扩增表达的合适序列。该表达载体还可包括编码与定点修饰多肽融合的蛋白质标签(例如，6xHis标签、血凝素标签、绿色荧光蛋白、硫氧还蛋白等)的核苷酸序列，因此导致嵌合多肽。这种标签也可以是可切割的，例如使用TEV蛋白酶。

启动子可以是组成型活跃启动子(即在组成上处于活跃/“ON(打开)”状态的启动子)，它可以是诱导型启动子(即，其状态-活跃/“ON”或不活跃/“OFF(关闭)”受外部刺激控制的启动子，例如特定温度、化合物或蛋白质的存在)，它可以是空间上限制的启动子(即转录控制元件、增强子等)(例如，亚组织或组织特异性启动子、细胞类型特异性启动子等)，并且它可以是时间上限制的启动子(即，启动子在发展的特定阶段或生物过程(例如细胞周期)的特定阶段期间处于“ON”状态或“OFF”状态)。

诱导型启动子的例子包括但不限于T7 RNA聚合酶启动子、T3 RNA聚合酶启动子、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)调节启动子、乳糖诱导启动子、热激启动子、四环素调节启动子、类固醇调节启动子、金属调节启动子、雌激素受体调节启动子等。因此，诱导型启动子可以被包括但不限于多西环素；RNA聚合酶，例如T7 RNA聚合酶；雌激素受体；雌激素受体融合体等的分子调节。

在本文中可以互换使用的术语“DNA调控序列”、“控制元件”和“调控元件”，指转录和翻译控制序列，如启动子、增强子、聚腺苷酸化信号、终止子、蛋白质降解信号等，其提供和/或调节非编码序列(例如启动子)或编码序列的转录和/或调节编码的多肽的翻译。

“载体”或“表达载体”为复制子，如质粒、噬菌体、病毒或粘粒，另一个DNA片段，即“插入片段”可以与其附接以造成附接的片段在细胞中的复制。“表达盒”包含与启动子可操作地连接的DNA编码序列。“可操作地连接”是指一种并置，其中，如此描述的组分处于一种允许它们以其预期方式发挥功能的关系中。例如，如果启动子影响其转录或表达，则启动子可操作地连接至编码序列。许多合适的表达载体是本领域技术人员已知的，并且许多是可商购获得的。以下的载体作为举例被提供用于真核宿主细胞：pXT1、pSG5(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG和pSVLSV40(Pharmacia)。然而，可以使用任何其它载体，只要它与宿主细胞相容。

术语“重组表达载体”或“DNA构建体”在本文中可以互换使用，以指包含载体和至少一个插入片段插入物的DNA分子。产生重组表达载体通常是为了表达和/或繁殖插入片段插入物，或用于构建其它重组核苷酸序列而生成。该插入物可以与或可以不与启动子序列可操作地连接，并且可以与或可以不与DNA调控序列可操作地连接。

亲和标签和信号肽序列

本发明的内溶素多肽还可以包含与在N端和/或C端的亲和标签一起的内溶素序列，以进一步协助从标准表达系统(如本文所述的那些)中分离。可以使用任何合适的亲和标签。

合适的亲和标记物亲和标签可以直接接合到多肽的N或C端，或通过任何合适的接头序列(如3、4或5个甘氨酸残基)间接接合，如3、4或5个甘氨酸残基。一种这样合适的亲和标记物亲和标签是组氨酸标签。该组氨酸标签通常由6个组氨酸残基组成，尽管它可以比这更长(例如高达7、8、9、10或20个氨基酸)或更短(例如5、4、3、2或1个氨基酸)。可替代的亲和标记物亲和标签包括AviTag、FLAG-标签、HA-标签、Myc-标签、Strep-标签、V5-标签、聚-arg、HAT-标签、钙调蛋白结合肽标签、GST标签、MBP标签、Fh8标签、Strep-II标签、纤维素结合肽标签、几丁质结合肽标签、蛋白A标签、泛素标签、DHFR标签、SBR标签。

本发明的每种内溶素还可以包含与表达增强肽序列一起的内溶素序列以进一步协助表达。协助表达意味着宿主细胞产生的内溶素多肽的总量可以增加，或宿主细胞产生的可溶性内溶素多肽的比例可以增加。因此，表达增强肽序列可以是能够促进由宿主细胞(如大肠杆菌或藻类宿主细胞)分泌到培养基中的内溶素的量增加的任何肽序列。任何合适的表达增强肽序列可以与本发明的任何内溶素一起使用，包括本文所描述的任何表达增强肽序列。该表达增强肽可以选自分泌增强肽，其包括：OmpA、emal、gIII、pelB、phoA、ompC、ompT、dsbA、torT、sufI、torA、STII、EOX、lamb、MglB、SfmC、TolB和MmAp。该表达增强肽可以选自溶解度增强肽PDI、GST、Trx、MBP、NusA-标签、SUMO、DsbC、Skp、Fh8、ZZ、GB1、T7PK、DsbA和SET。

本发明的任何内溶素可以包含与任何表达增强肽序列以及另外任何亲和标签一起的内溶素序列。

本发明的内溶素的亲和纯化可以用作生产纯化的且浓缩的内溶素储备液而不含污染物天然大肠杆菌裂解蛋白质的方式。

宿主细胞和表达系统

本发明还提供了一种宿主细胞，其包含根据本发明的多核苷酸、根据本发明的核酸构建体或根据本发明的表达构建体。根据本发明的宿主细胞可以是适合于本发明的多肽表达的任何微生物的、原核的或真核的细胞。优选地，该细胞为大肠杆菌或藻类细胞。

大肠杆菌细胞可以来自表达菌株Rosetta^TM(DE3)pLysS。因此，用于表达的大肠杆菌细胞可以是BL21大肠杆菌衍生株，其旨在增强含有很少用于大肠杆菌的密码子的真核蛋白质的表达，以及适用于通过IPTG诱导从pET载体中克隆的的靶基因生产蛋白质并表达T7溶菌酶的大肠杆菌细胞，其在诱导前进一步抑制T7 RNA聚合酶的基础表达。本发明的宿主细胞的例子是以下那些菌株：DH5alpha、HB101、JM 109 BL21菌株、C41(DE3)、C43(DE3)、DH10B、W3110、CyDisCo、K12菌株、Lemo21(DE3)、T7 Express菌株、Rosetta菌株、SHuffle菌株、Tuner菌株、Origami菌株、ArticExpress菌株、AD 494、BL21和trxB。

本发明的内溶素多肽能够在宿主细胞中，优选在大肠杆菌或藻类宿主细胞中以其可溶性和功能性(催化活性的)形式直接表达。因此，可以避免表达的蛋白质的增溶和/或重折叠的步骤。当本发明的多肽包含在任何合适的表达载体中时、当载体被转化到宿主细胞中时、当转化的宿主细胞随后在合适的条件下培养以促进多肽的表达时以及当评估多肽的活性时，揭示了表达本发明的可溶性和功能性内溶素多肽的能力。

本发明的内溶素多肽也可以在藻类表达系统中表达。例如，藻类表达系统可以使用藻类宿主细胞进行表达，如莱茵衣藻或细长聚球藻(Synechococcus elongatus)。包括相关载体的这类藻类系统是本领域已知的。本发明的多肽可以保留在藻类宿主细胞内，以产生包含该多肽的全细胞藻类组合物。可替代地，多肽可以在藻类细胞中表达之后进行纯化。这种藻类系统还允许使用已知标签(如本文公开的标签)用于本发明的内溶素多肽的亲和纯化。

藻类可以用作宿主细胞和/或表达系统，用于表达本文公开的本发明的任何多肽，并因此用于本文公开的任何组合物或制剂中。这种藻类涵盖原核藻类和真核藻类两者，它们优选为微型藻类并且更优选为单细胞藻类。单细胞藻类也称为微藻。因此，微藻可以用作宿主细胞和/或表达系统，用于表达本文公开的本发明的任何多肽，并且因此用于本文公开的任何组合物或制剂中。在某些优选的实施方案中，该藻类为绿藻(绿藻门(Chlorophyta))、褐藻(褐藻门(Phaeophyta))或硅藻(硅藻门(Bacillariophyta))。

特别适合使用的绿藻的示例包括衣藻属(Chlamydomonas)物种的成员，特别是莱茵衣藻；小球藻属(Chlorella)物种、团藻属(Volvox)物种和一些大型海草。

遗传转化的藻类物种的概述，其中任何一种都可以使用。

实施例14中提供了用于表达本发明的内溶素多肽的藻类表达系统的例子。有关使用藻类进行重组多肽表达的其它信息，请参见以下其它参考文献：

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因此，本发明提供了一种宿主细胞，其包含编码本发明的任何内溶素多肽的核酸分子的群体，任选地，其中，宿主细胞为单细胞微生物的细胞，任选地为酵母细胞、细菌细胞(如乳酸杆菌)、真菌细胞或藻类细胞。本发明另外提供了一种宿主细胞，其包含编码本发明的任何内溶素多肽的核酸分子的群体，任选地，其中，宿主细胞为植物细胞。

该宿主细胞可以另外包含本文定义的并且已经从所述载体表达的任何内溶素多肽或其片段。该群体的分子或载体中的每一个可以编码如本文所定义的相同的内溶素多肽或片段，或该群体的分子或载体可以编码两种或更多种与如本文所定义的不同的内溶素多肽或片段。

本发明另外提供了一种细胞裂解物，包含：本文所定义的任何内溶素多肽或其片段的群体，任选地其中，该群体由相同的内溶素多肽或片段组成，或其中，该群体由两种或更多种不同的内溶素多肽或片段组成。可以在如本文定义的宿主细胞中表达内溶素多肽或其片段后产生裂解物，该宿主细胞可以为单细胞微生物的细胞，任选地酵母细胞、细菌细胞(如乳酸杆菌)、真菌细胞、或藻类细胞或植物细胞的细胞。

在酵母中表达蛋白质的试剂和系统描述于：Protein expression-yeast,NielsenK.H.,Methods Enzymol.2014；536:133-47。

在真菌中表达蛋白质的试剂和系统描述于：Gene expression in fungi,Kalkanci,A等IMA Fungus.2011年6月；2(1):29-32。

在酵母中表达蛋白质的试剂和系统特别描述于：Micro-algae come of age as aplatform for recombinant protein production,Specht,E.等Biotechnol Lett.2010年10月；32(10):1373-1383。

在植物中表达蛋白质的试剂和系统描述于：Plants as Expression Systems forRecombinant Proteins,Kawaka等,Asian Journal of Biology 3(3):1-8,2017。

宿主细胞可以是作为GRAS生物体(“通常被认为是安全的”)的宿主生物体的细胞，或在欧洲食品安全局(European Food Safety Authority)公布的安全资格认定(Qualified Presumption of safety，QPS)清单中列出的宿主生物体的细胞，包括家禽饮食中常规包含的任何生物体。

包含本发明的内溶素的组合物和制剂

组合物和制剂

另一方面，本发明提供了包含本发明的任何内溶素多肽的组合物。

该组合物可以包含本文定义的任何内溶素多肽或片段的群体。该群体可以由本文定义的相同的内溶素多肽或片段组成。该群体可以由两种或更多种如本文定义的不同的内溶素多肽或片段组成，在这种情况下，表现出的抗微生物活性可以是协同活性。

该组合物可以包含宿主细胞的群体，其中，该群体的宿主细胞可以包含如本文定义的任何内溶素多肽或片段。

该组合物可以包含：包含全细胞的群体的全细胞组合物，其中该群体的细胞包含如本文定义的任何内溶素多肽或片段。该群体的细胞可以是单细胞微生物的细胞，任选地酵母细胞、细菌细胞(如乳酸杆菌)、真菌细胞或藻类细胞，或可以是植物细胞，并且该细胞包含如本文定义的任何内溶素多肽或片段，例如通过表达所述多肽或片段。

任何上述组合物可以包含多肽或片段、宿主细胞和全细胞以及合适的载体或赋形剂，如水或生理学可接受的缓冲剂。

在另一方面，本发明提供了包含本发明的任何内溶素多肽的制剂。优选地，该制剂为抗微生物制剂、抗菌制剂和/或药物制剂。

制剂可以包含宿主细胞的群体，其中该群体的宿主细胞包含本发明的任何内溶素多肽。制剂可以包含细胞裂解物，其中该裂解物包含本发明的任何内溶素多肽。

任何制剂都可以由如本文定义的相同的内溶素多肽或片段组成，或可以由两种或更多种如本文定义的不同的内溶素多肽或其片段组成。表现出的抗微生物活性可以是协同活性。

任何这种制剂可以包含本发明的任何内溶素多肽和至少一种药学上可接受的载体、稀释剂、溶媒或赋形剂。在与组合物的其它成分相容并且对施用组合物的受试者无害的意义上，载体、稀释剂、溶媒或赋形剂必须是“可接受的”。通常，载体和最终组合物是无菌且无热原的。

合适的组合物的制剂可以使用标准药物制剂化学和方法学进行，所有这些对于相当熟练的技术人员来说都是容易获得的。例如，试剂可以与一种或多种药学上可接受的赋形剂或溶媒组合。辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质、还原剂等，可以存在于赋形剂或溶媒中。合适的还原剂包括半胱氨酸、硫代甘油、硫代尿色素毒(thioreducin)、谷胱甘肽等。赋形剂、溶媒和辅助物质通常是不会在接受组合物的个体中引起免疫应答的药剂，并且可以在没有过度毒性的情况下施用。药学上可接受的赋形剂包括但不限于液体，如水、盐水、聚乙二醇、透明质酸、甘油、硫代甘油和乙醇。药学上可接受的盐也可以包括在其中，例如，无机酸盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；以及有机酸盐，如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。Remington的Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.,N.J.,1991)中对药学上可接受的赋形剂、溶媒和辅助物质进行了全面讨论。

这种组合物可以以适合于推注施用或连续施用的形式制备、包装或销售。可注射组合物可以单位剂量形式例如在安瓿或含有防腐剂的多剂量容器中制备、包装或销售。组合物包括但不限于油性或水性溶媒中的悬浮液、溶液、乳剂，糊剂和可植入的缓释或生物可降解制剂。这种组合物还可以包含一种或多种附加成分，其包括但不限于悬浮剂、稳定剂或分散剂。在用于肠胃外施用的组合物的一个实施方案中，活性成分以干燥(例如，粉末或颗粒)形式提供，用于在重构组合物肠胃外施用之前用合适的溶媒(例如无菌无热原水)重构。组合物可以以无菌可注射水性或油性悬浮液或溶液的形式制备、包装或销售。该悬浮液或溶液可以根据已知技术进行配制，并且除了活性成分之外还可以包含附加成分，如本文所描述的分散剂、润湿剂或悬浮剂。例如，可以使用无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂，如水或1，3-丁二醇来制备这种无菌可注射制剂。其它可接受的稀释剂和溶剂包括但不限于林格氏溶液、等渗氯化钠溶液和固定油，如合成甘油单酯或甘油二酯。

其它有用的可肠道外施用的(parentally-administrable)组合物包括包含微晶形式、脂质体制剂中或作为可生物降解聚合物系统的组分的活性成分的那些组合物。用于持续释放或植入的组合物可包含药学上可接受的聚合材料或疏水材料，如乳液、离子交换树脂、微溶聚合物或微溶盐。该组合物可以适合通过任何合适的途径施用，包括例如皮内、皮下、经皮、肌内、动脉内、腹膜内、关节内、骨内或其它合适的施用途径。优选的组合物适合通过静脉输注施用。

制剂的例子包括外用洗剂、乳膏、肥皂、擦拭物等。它们可以配制成脂质体，以降低毒性或提高生物利用度。其它递送方法包括需要将内溶素封装在微球或类蛋白中的口服方法、气溶胶递送(例如，至肺)或透皮递送(例如，通过离子电渗疗法或透皮电穿孔)。其它常规施用方法是本领域技术人员已知的。

适合口服施用的药物制剂可以方便的单位形式提供，包括胶囊、片剂、凝胶、糊剂、软膏等。

制剂和组合物可包含增稠剂。合适的增稠剂包括合成锂蒙脱石、爱尔兰苔藓、i-卡拉胶、黄蓍胶、淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、羟乙基丙基纤维素、羟丁基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素钠和硅溶胶。

制剂和组合物可包含增溶剂。增溶剂可以包括试剂，如湿润剂多元醇(如丙二醇、二丙二醇和己二醇)；溶纤剂(如甲基溶纤剂和乙基溶纤剂)；在直链中含有至少约12个碳的植物油和蜡，如橄榄油、蓖麻油和凡士林；以及酯，如乙酸戊酯、乙酸乙酯和苯甲酸苄酯。

适用于片剂制剂的药学上可接受的赋形剂包括：例如，惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；造粒剂和崩解剂，例如玉米淀粉或海藻酸；粘合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶；以及润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。片剂可以是未包衣的或者它们可以通过已知技术包衣以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，从而提供更长时间的持续作用。例如，可以使用延时材料，如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。

对于硬明胶胶囊制剂，活性成分可以与惰性固体稀释剂(例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合。对于软明胶胶囊制剂，活性成分可以与水或油介质(例如花生油、液体石蜡或橄榄油)混合。

适用于制造水性悬浮液的赋形剂包括悬浮剂，例如，羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯树胶；分散剂或润湿剂可以是天然存在的磷脂(例如卵磷脂)，或环氧烷烃与脂肪酸的缩合产物(例如聚氧乙烯硬脂酸酯)，或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物(例如十七亚乙基氧十六醇)，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物(如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯)，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(例如聚乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)。

水性悬浮液也可以含有一种或多种防腐剂，例如苯甲酸酯(如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯，)一种或多种着色剂，一种或多种调味剂和一种或多种甜味剂，(如蔗糖或糖精)。

油性悬浮剂可以通过将活性成分悬浮在植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)或矿物油(如液体石蜡)中来配制。油性悬浮剂可含有增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可以添加甜味剂和调味剂。这些组合物可以通过添加抗氧化剂(如抗坏血酸)来保存。

本文所描述的任何组合物或制剂还可以配制成用于肠胃外施用，如通过注射，例如推注或连续输注，并且可以以单位剂量形式在安瓿、预装注射器、小容量输液或多剂量容器中提供，例如具有添加的防腐剂。

用于本文所描述的制剂和组合物肠胃外施用的配制品包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮剂和乳剂。非水溶剂的例子为丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)和可注射的有机酯(例如油酸乙酯)。水性载体的例子包括水、盐水和缓冲介质、醇溶液/水溶液以及乳液或悬浮液。肠胃外溶媒的例子包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液(lactated Ringer's)和固定油。静脉内溶媒包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于林格氏葡萄糖的那些)等。还可以包括防腐剂和其它添加剂，如其它抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等。

对于向表皮局部施用，本文所描述的任何制剂和组合物可以配制成软膏、乳膏或洗剂。例如，软膏和乳膏可以用水性或油性基质并添加合适的增稠剂和/或胶凝剂来配制。洗剂可以用水性或油性基质配制并且通常还包含一种或多种乳化剂、稳定剂、悬浮剂、增稠剂或着色剂。适用于在口腔中局部施用的制剂包括锭剂，例如在调味基质中，通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶；包含在惰性基质(如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶)中的活性成分的含片；以及包含在合适的液体载体中的活性成分的漱口水。

对于眼部局部施用，本文所描述的任何制剂和组合物可以在合适的无菌水性或非水性溶媒中制成溶液或悬浮液。还可以包括添加剂，例如缓冲剂(如焦亚硫酸氢钠或依地酸二钠)和增稠剂(如羟丙甲纤维素)。

对于鼻内施用，本文所描述的任何制剂和组合物可以以液体喷雾剂或可分散粉剂或以滴剂的形式提供。滴剂可用也包含一种或多种分散剂、增溶剂或悬浮剂的水性或非水性基质配制。

对于吸入施用，本文所描述的任何制剂和组合物可以通过吹入器(例如喷雾器或加压包)递送，或其它方便的递送气溶胶喷雾的装置。加压包可包含合适的推进剂。在加压的气溶胶的情况下，剂量单位可以通过提供递送计量数量的值来确定。

本文所描述的任何制剂和组合物都可以采用干粉组合物的形式，例如活性组分和合适的粉末基质(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。粉末组合物可以以单位剂型的形式存在于例如胶囊、盒或明胶泡罩包装中，在吸入器或吹入器的帮助下，可以从其中施用粉末。

可以将本文所描述的任何制剂和组合物掺入液体消毒溶液中。这种溶液还可以包含抗微生物剂或抗真菌剂，如醇、聚维酮碘溶液和抗生素以及防腐剂。这些溶液可用作例如皮肤或周围区域的消毒剂，例如在插入或植入装置(如导管)之前，用作导管封锁和/或冲洗溶液，以及用作适用于任何医疗装置的消毒冲洗液，该医疗装置包括但不限于导管组件，如针头、Luer-Lok连接器、无针连接器和集线器(hubs)以及其它可植入装置。这些溶液还可用于涂覆或消毒手术器械。

用于治疗所需的内溶素多肽的量当然不仅随特定多肽而变化，而且随施用途径和形式、所治疗的病症的性质和严重程度以及生物体的类型、年龄和病症而变化。因此，掺入组合物和制剂中的活性剂的合适浓度可由本领域技术人员根据标准实践常规确定。

添加剂

任何上述组合物、裂解物或制剂可以进一步包含一种或多种具有抗微生物活性的添加剂，其中该添加剂不是内溶素多肽或片段。该一种或多种添加剂可以选自由抗生素剂、生物膜降解剂、生物膜抑制剂、螯合剂(如壳聚糖、EDTA和柠檬酸)、抑菌剂(如甘油)组成的组。该一种或多种添加剂可以选自由稳定剂、抗结块剂、益生剂、益生菌剂和可食用凝胶(如凝水营养基质)组成的组。

本文所描述的任何制剂和组合物可以另外包括与内溶素一起的不是内溶素的抗微生物剂，如清洁剂和抗生素。合适的抗生素包括：氨基糖苷类(例如庆大霉素、卡那霉素和链霉素)、β-内酰胺类(例如青霉素、氨苄青霉素、亚胺培南和头孢菌素，如头孢他啶(Ceftazidime))、喹诺酮类(例如环丙沙星)、大环内酯类(如阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素、红霉素、罗红霉素和泰利霉素)、恶唑烷酮(如利奈唑胺)、安沙霉素(如利福霉素)、磺胺类、四环素类(如多西环素(Doxycycline))。附加的抗生素包括糖肽类(如万古霉素)、磺胺异恶唑、甲氧苄啶、新生霉素、达托霉素和利奈唑胺。

通常，抗微生物剂以杀微生物的量施用。然而，抗微生物剂也可以以抑菌的量施用。

可包含在本文所描述的制剂和组合物中的抗寄生虫化合物包括：苯并唑类(阿苯达唑、甲苯咪唑、噻苯达唑等)、唑类(甲硝唑、替硝唑等)、大环类(两性霉素B、利福平、伊维菌素等)和其它，如双羟萘酸噻嘧啶、乙胺嗪、氯硝柳胺、吡喹酮、美拉胂醇和依氟鸟氨酸。

可包含在本文所描述的制剂和组合物中的抗病毒化合物包括：核苷类似物逆转录酶抑制剂(阿昔洛韦、地达诺新、司他夫定、齐多夫定、拉米夫定、阿巴卡韦、恩曲他滨、恩替卡韦等)、脱壳抑制剂(金刚烷胺、金刚烷乙胺、普拉康纳利等)、蛋白酶抑制剂(沙奎那韦、利托那韦、茚地那韦、奈非那韦、安普那韦等)和其它，如扎那米韦、奥司他韦、利福平。

可包含在本文所描述的制剂和组合物中的抗病毒化合物包括：唑类，如咪康唑、酮康唑、克霉唑、益康唑、奥莫康唑、联苯苄唑、布康唑、芬替康唑、异康唑、舍他康唑、硫康唑、噻康唑、氟康唑、伊曲康唑、艾沙康唑(isavuconazole)、雷夫康唑(ravuconazole)、泊沙康唑、伏立康唑、特康唑和阿巴芬净(abafungin)；大环类，如游霉素、龟裂霉素(rimocidin)、菲律宾菌素(filipin)、制霉菌素、两性霉素B、坎底辛、哈霉素；烯丙胺，如特比萘芬、萘替芬和布替萘芬；棘球白素，如阿尼芬净、卡泊芬净和米卡芬净；或其它，如水蓼二醛(polygodial)、环吡酮、托萘酯、苯甲酸、十一碳烯酸、氟胞嘧啶和灰黄霉素。

可包含在本文所描述的制剂和组合物中的抗真菌化合物包括：唑，如咪康唑、酮康唑、克霉唑、益康唑、奥莫康唑、联苯苄唑、布康唑、芬替康唑、异康唑、舍他康唑、硫康唑、噻康唑、氟康唑、伊曲康唑、艾沙康唑、雷夫康唑、泊沙康唑、伏立康唑、特康唑和阿巴芬净；大环，如游霉素、龟裂霉素、菲律宾菌素、制霉菌素、两性霉素B、坎底辛、哈霉素；烯丙胺，如特比萘芬、萘替芬和布替萘芬；棘球白素，如阿尼芬净、卡泊芬净和米卡芬净；或其它，如水蓼二醛、环吡酮、托萘酯、苯甲酸、十一碳烯酸、氟胞嘧啶和灰黄霉素。

生物质组合物

本发明的任何内溶素多肽可以包含在生物质组合物中。

内溶素可以在宿主细胞、收获的宿主细胞和形成的生物质组合物中表达。例如，可以收获本文描述和定义的表达本发明的内溶素多肽的宿主细胞并用于形成包含宿主细胞的生物质组合物。

宿主细胞可以被裂解，裂解物可以用于形成包含裂解物的生物质组合物，例如可将裂解物干燥以形成包含干燥的裂解物的干燥的生物质组合物。裂解物可包括裂解后的宿主细胞碎片。可替代地，裂解物可包含宿主细胞提取物，其中去除了宿主细胞碎片，例如可以通过离心去除宿主细胞碎片，收集并使用上清液，同时丢弃沉淀的宿主细胞碎片。

生物质组合物可以包含裂解的和部分裂解的宿主细胞碎片。生物质组合物可以包含宿主细胞提取物，其中，宿主细胞碎片已被去除或基本去除。生物质组合物可以包含任意组合的裂解的宿主细胞碎片、部分裂解的宿主细胞碎片和宿主细胞提取物的混合物。

在本发明的方法中，如本文进一步描述的藻细胞为优选的宿主细胞。本发明的任何内溶素多肽可以在藻类宿主细胞中表达后包含在藻类宿主细胞中，或在藻类宿主细胞中表达后包含在藻类宿主细胞裂解物/提取物中。如上所述，这种细胞和裂解物/提取物可用于形成生物质组合物。

培养藻类生物质的方法包括光合自养的生产、异养的生产和兼养的生产。用于生产藻类生物质的培养系统包括开放式池塘，如未混合的(unmixed)开放式池塘、圆形池塘和开放式水道池塘。其它培养系统包括封闭式光生物反应器(PBR)，如管式PBR、平板式PBR、柱式PBR、连续搅拌釜式反应器和分批补料生物反应器。培养系统还包括混合生产系统。

培养后，可以使用诸如絮凝、化学混凝、联合絮凝、离心和重力沉降的方法收获藻类生物质。

可以干燥任何上述生物质组合物。干燥的生物质可以通过已知的方法，如喷雾干燥和冷冻干燥获得。例如，干燥的生物质，如莱茵衣藻的生物质，可以通过首先培养藻类获得(例如在发酵罐中)，然后收获藻类，离心沉淀并喷雾干燥生物质而获得(见例如Kightlinger等Elec.J.Biotech.第17卷,2014)。藻类细胞可以任选地被裂解，例如通过自溶作用。然后可以干燥裂解的细胞，例如在真空下在旋转蒸发器中干燥。然后，可以使用真空泵将所得产品干燥过夜并研磨以产生藻类提取物粉末。藻类提取物也可以由喷雾干燥的生物质通过在珠磨机中研磨或超声处理来制备。藻类提取物粉末可以适当使用，例如添加至动物食品中。

动物食品

本发明还提供了食品，优选动物食品，其包含：一种或多种食品和包含宿主细胞的群体的组合物。宿主细胞可以包含如本文所描述的内溶素多肽或片段。该食品还可以包含如本文所描述的任何宿主细胞、细胞裂解物、组合物或全细胞组合物。该食品还可以包含如本文所描述的抗微生物制剂。

本发明的食品适合动物食用，该动物包括家禽，任选地为肉鸡，优选家鸡；猪，优选家猪；或其中，该食品适合啮齿动物食用，啮齿动物任选地为小鼠或大鼠。食用该食品可以对动物具有预防或治疗作用。例如，食用可以减少在动物体内旺盛生长的产气荚膜梭菌的群体，从而治疗动物或由产气荚膜梭菌引起的感染。动物食用该食品还可以预防产气荚膜梭菌的感染，或者如果动物以前患有产气荚膜梭菌的感染，那么动物食用该食品将具有预防进一步感染以及治愈感染的作用。

包含本发明的内溶素的食品可以含有防腐剂或通常用在食品制备中用于消耗和/或延长保质期的任何添加剂。

包含本发明的内溶素的食品可以以任何合适的食用形式提供，如以粉末或研磨形式、动物饲料、动物糊状物或丸粒形式。包含本发明的内溶素的食品可以以用于饮用的可溶形式提供，如包含本发明的内溶素的可溶水性组合物。

使用本发明的内溶素多肽的方法

本发明提供了本发明多肽在各种方法中的用途。例如，根据本发明的多肽也可用于治疗或预防。在治疗应用中，将多肽或组合物以足以治愈、减轻或部分抑制病症或其一种或多种症状的量施用至已经患有疾患或病症的受试者。因此，本发明可以具有抑菌和/或杀菌的特性。

这种治疗性处理可以导致疾病症状的严重程度的下降，或无症状期的频率或持续时间的增加。足以实现这点的量被定义为“治疗有效量”。在预防应用中，将多肽或组合物以足以预防或延迟症状发展的量施用至尚未表现出疾患或病症的症状的受试者。这种量被定义为“预防有效量”。受试者可能已通过任何合适的方式被鉴定为处于发展疾病或病症的风险中。因此，本发明还提供了本发明的多肽用于治疗人体或动物体。

本文还提供了一种预防或治疗受试者的疾病或病症的方法，该方法包括：以预防或治疗有效量向受试者施用本发明的多肽。该多肽可以与另一种试剂共同施用。该多肽优选口服施用，但可以通过任何合适的途径施用，包括：例如静脉输注、皮内、皮下、经皮、肌内、动脉内、腹膜内、关节内、骨内或其它合适的施用途径。所施用的多肽的量可以是0.01mg/kg BW至2mg/kg BW，0.04mg/kg BW至2mg/kg BW，0.12mg/kg BW至2mg/kg BW，优选0.24mg/kg BW至2mg/kg BW，并且最优选1mg/kg BW至2mg/kg BW。多肽可以多次施用于同一受试者。

本发明的多肽可特别用于治疗或预防由细菌感染介导的疾病或病症，细菌感染如产气荚膜梭菌引起的细菌感染，例如由产气荚膜梭菌在胃肠道中定殖引起的细菌感染。因此，本发明提供了本发明的多肽，用于治疗或预防以存在产气荚膜梭菌为特征的疾病或病症，例如在胃肠道中。

本发明还提供了一种治疗或预防由产气荚膜梭菌介导的疾病或病症的方法，包括向个体施用本发明的多肽。该疾病或疾患可以是由产气荚膜梭菌感染引起的疾病或疾患，任选地由产气荚膜梭菌的A型菌株引起的感染，如食物中毒、气性坏疽、坏死性肠炎、肠道病变和/或胃肠道感染。

该方法可以包括重复施用所述多肽。本发明还提供了本发明的多肽，用于制造用于治疗或预防由产气荚膜梭菌介导的疾病或病症的药物。

可以使用本领域已知的多种方法中的一种或多种通过一种或多种施用途径施用本发明的多肽。施用途径和/或施用方式将根据所需结果而变化。优选的施用途径包括口服施用。其它施用途径包括静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊髓或其它肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。本文所用的短语“肠胃外施用”是指除肠内和局部施用以外的施用方式，通常通过注射。可替代地，多肽可以通过非肠胃外途径施用，如局部、表皮或粘膜施用途径。局部施用也是优选的，包括瘤周、瘤旁、瘤内、病灶内、病灶周围、腔内输注、膀胱内施用和吸入。在优选的实施方案中，本发明以食品的形式口服施用。其它有用的途径是能够用于将本发明的内溶素递送至受试者，优选递送至肠道的那些途径。

本发明的肽的合适剂量可由熟练的医学从业者确定。肽的实际剂量水平可以变化以获得活性成分的量，其有效实现特定患者、组合物和施用方式的所期望的治疗响应，而不会对患者产生毒性。所选择的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括：采用的特定抗体的活性、施用途径、施用时间、抗体的排泄率、治疗的持续时间、与采用的特定组合物组合使用的其它药物、化合物和/或材料、被治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康状况和既往病史，以及医学领域众所周知的类似因素。

肽的合适剂量可以例如在约0.1μg/kg至约100mg/kg待治疗患者体重的范围内。例如，合适剂量可以是从每天约1μg/kg至约10mg/kg体重或从每天约10μg/kg至约5mg/kg体重。

可以调整剂量方案以提供最佳期望应答(例如治疗应答)。例如，可以施用单次推注，或者在所需的间隔条件下，该方法可以包括随时间施用的若干个分次剂量，或可以根据治疗情况的紧急情况按比例减少或增加剂量。以剂量单位形式配制肠胃外组合物以易于剂量的施用和均匀性是特别有利的。本文所施用的剂量单位形式指适合作为待治疗受试者的单一剂量的物理离散单位；每个单位含有经计算产生期望的治疗效果的预定量的活性化合物以及所需的药物载体。

本文所描述的任何制剂和组合物均可配制成疫苗，待施用以进行预防。任何这种疫苗制剂都可以直接施用于动物以进行预防。例如，可以将疫苗制剂施用(例如注射)到由羊膜或卵黄囊限定的区域内的卵中。疫苗制剂可以被施用，例如注射入羊水中。任何这种疫苗制剂可以是包含在藻类宿主细胞中表达的本发明的内溶素多肽的组合物的形式。

用于治疗的内溶素/包含内溶素的组合物

根据本发明的组合物能够用于治疗产气荚膜梭菌感染的动物，包括人类，优选肉鸡，如家鸡。可以使用任何合适的施用途径来施用所述组合物，包括但不限于：口服、气溶胶或用于递送至肺部的其它装置、鼻腔喷雾、静脉内、肌内、腹膜内、鞘内、阴道的、直肠的、局部、腰椎穿刺、鞘内以及直接应用于脑和/或脑膜。

当根据本发明的包含根据本发明的多核苷酸或核酸构建体或内溶素多肽或载体或细胞的组合物降低患者或所述患者的细胞或细胞系或无细胞体外系统中存在的产气荚膜梭菌物种的量时，其优选地被称为是活性的、功能性的或治疗活性的或能够治疗、预防和/或延迟传染疾病，并且优选地指在治疗后产气荚膜梭菌物种的初始量的99％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％或更少是仍然可检测的。优选地，在治疗后检测不到产气荚膜梭菌物种。在本段中，表述“产气荚膜梭菌的量”优选指活的产气荚膜梭菌属。产气荚膜梭菌物种可以使用技术人员已知的标准技术进行检测，如使用产气荚膜梭菌特异性抗体的免疫组织化学技术。产气荚膜梭菌物种(活的和/或死的)可以使用技术人员已知的标准技术进行检测，如微生物细菌培养技术和/或实时定量逆转录聚合酶链反应测定细菌mRNA。如何检测产气荚膜梭菌的例子包括：使用标准平板计数法或PCR方法(如实时PCT或常规PCR)从受试者的肠道内容物和面部计数产气荚膜梭菌。对于基于PCR的方法，可以使用任何对产气荚膜梭菌具有特异性的探针。探针类型可以包括荧光和水解型(5'核酸酶)探针(见例如https://aem.asm.org/content/71/7/3911)。

产气荚膜梭菌治疗的有效性优选在来自受试者的样品(如来自受试者的粪便样品、组织或细胞)中通过与在用根据本发明的所述组合物或多肽治疗之前存在于所述受试者中的量进行比较来评估。可替代地，在治疗是局部的情况下，可以用尚未用所述组合物或多肽治疗的所述个体或患者的样品、组织或细胞进行比较。

包含根据本发明的多核苷酸或核酸构建体或多肽或载体或细胞的组合物可以施用于有需要的受试者或细胞、组织或器官或该患者至少一周、一个月、六个月、一年或更长时间。

因此，本发明提供了根据本发明的组合物用作治疗有需要的受试者的药剂。优选地，所述组合物用作治疗与受试者感染产气荚膜梭菌、优选A型菌株细菌相关的病症的药剂。

本发明还提供了一种治疗、延迟和/或预防与受试者感染产气荚膜梭菌(优选A型菌株的细菌)相关的病症的方法，包括施用根据本发明的内溶素多肽、或根据本发明的多核苷酸、或根据本发明的核酸构建体、或根据本发明的表达构建体、或根据本发明的宿主细胞、或根据本发明的组合物。因此，治疗可以包括治疗受试者的食物中毒。

本文所描述的医学用途可被表示为根据本发明的产品，用作用于治疗所述疾病的药剂，但同样可以被表示为使用根据本发明的产品治疗所述疾病的方法、根据本发明的产品用于制备用于治疗所述疾病的药剂、以及根据本发明的产品用于治疗所述疾病的用途。这些医学用途都能被本发明所设想。需要治疗、延迟和/或预防与感染相关的病症的受试者可以是任何动物受试者，优选哺乳动物，更优选肉鸡，如家鸡。因此，受试者可以包括家畜，如猪(例如家猪)。受试者的例子还包括狗或猫，或人类受试者。

特异性靶向细菌细胞的化合物可以是根据本发明的内溶素多肽、或根据本发明的多核苷酸、或根据本发明的核酸构建体、或根据本发明的表达构建体、或根据本发明的宿主细胞或根据本发明的组合物。

根据本发明的内溶素多肽、或根据本发明的多核苷酸、或根据本发明的核酸构建体、或根据本发明的表达构建体、或根据本发明的宿主细胞或根据本发明的组合物可以方便地用于治疗有需要的受试者的细胞内细菌感染的方法中，包括：

施用有效量的增加宿主细胞和/或宿主细胞的细胞内区室的细胞内pH值的试剂，并且施用有效量的抗微生物剂。所述方法在本文中被称为根据本发明的方法。

发明人已惊奇地识别出，动物中某些疾病或疾患的治疗可以通过包含全细胞组合物的抗微生物制剂实现，其中，组合物的全细胞为微藻宿主细胞，其包含具有抗微生物活性的内溶素多肽或包含内溶素多肽的片段或变体，其中该片段或变体具有抗微生物活性。内溶素多肽或内溶素多肽的片段或变体可以是本文公开的任何内溶素多肽，或内溶素多肽的片段或变体。可替代地，内溶素多肽或内溶素多肽的片段或变体可以是具有本文描述和定义的任何令人惊讶的有利的功能性抗微生物活性的任何内溶素多肽或内溶素多肽的任何片段或任何变体。任何这样的内溶素多肽、片段或变体因此可以被认为在功能上等同于本文公开的特定多肽。在任何这种抗微生物制剂中，提及的内溶素多肽、片段或变体涵盖一种或多种内溶素多肽和/或一种或多种片段和/或一种或多种变体的组合。

因此，本发明还提供了一种用作药剂的抗微生物制剂，该制剂包含全细胞组合物，其中该组合物的全细胞为微藻宿主细胞，其包含具有抗微生物活性的内溶素多肽，或包含内溶素多肽的片段或变体(其中该片段或变体具有抗微生物活性)。

任何这种抗微生物制剂可以用于治疗动物的细菌感染。任何这种抗微生物制剂可用于治疗为产气荚膜梭菌感染的细菌感染，任选地由产气荚膜梭菌A型菌株引起的感染。任何这种抗微生物制剂可以用于治疗由产气荚膜梭菌感染引起的疾病或疾患，产气荚膜梭菌感染任选地为由产气荚膜梭菌A型菌株引起的感染。由产气荚膜梭菌感染引起的疾病或疾患可以是食物中毒、气性坏疽、坏死性肠炎、肠道病变和/或胃肠道感染。

本发明还提供了一种预防或治疗动物的疾病或疾患的方法，该方法包括向动物施用预防或治疗有效量的抗微生物制剂，该制剂包含全细胞组合物，其中该组合物的全细胞为微藻宿主细胞，其包含具有抗微生物活性的内溶素多肽或包含内溶素多肽的片段或变体，其中该片段或变体具有抗微生物活性。

在任何这种方法中，疾病或疾患可以是动物的细菌感染。在任何这种方法中，细菌感染可以是产气荚膜梭菌感染，任选地由产气荚膜梭菌A型菌株引起的感染。在任何这种方法中，疾病或疾患可以由产气荚膜梭菌感染引起，任选地由产气荚膜梭菌A型菌株引起的感染引起。由产气荚膜梭菌感染引起的疾病或疾患可以是食物中毒、气性坏疽、坏死性肠炎、肠道病变和/或胃肠道感染。

在任何上述抗微生物制剂或方法中，动物可以是家禽动物，任选地为肉鸡，优选家鸡；或其中，动物为猪，优选家猪。

在任何上述抗微生物制剂或方法中，内溶素多肽、片段或变体的抗微生物活性可以是溶菌活性和/或细菌生长抑制活性。内溶素多肽、片段或变体的溶菌活性和/或细菌生长抑制活性可以是针对产气荚膜梭菌(优选产气荚膜梭菌的A型菌株)的溶菌活性和/或细菌生长抑制活性。

在任何上述抗微生物制剂或方法中，当在标准细胞活力测定中以5μg/ml的浓度对产气荚膜梭菌菌株NCTC8237测试内溶素多肽、片段或变体时，它可以表现出约0.40或更大、2.00或更大或者3.70或更大的ΔLog10值。在任何上述抗微生物制剂或方法中，当在标准细胞活力测定中以5μg/ml的浓度对产气荚膜梭菌菌株NCTC8237测试内溶素多肽、片段或变体时，它可以表现出约60％或更大、70％或更大、80％或更大、90％或更大或者100％的细胞活力降低％。在任何上述抗微生物制剂或方法中，当在标准细胞浊度降低测定中以5μg/ml的浓度对产气荚膜梭菌菌株NCTC8237测试内溶素多肽、片段或变体时，它可以表现出7分钟或更短的t50％裂解值；或它可以表现出3分钟或更短的t50％裂解值。在任何上述抗微生物制剂或方法中，当在标准最低抑制浓度(MIC)/最低杀菌浓度(MBC)测定中以2.1×10⁴个细胞/mL对产气荚膜梭菌菌株Cp6测试内溶素多肽、片段或变体时，它可以表现出17μg/mL或更小，优选1.7μg/mL或更小的MIC/MBC值；或它可以表现出0.65μM或更小，优选0.05μM或更小的MIC/MBC值。

获得本发明的内溶素的方法

本发明还提供了一种生产根据本发明的内溶素多肽的方法，包括：

在有助于生产内溶素多肽的条件下培养根据本发明的宿主细胞，任选地从培养液中分离并纯化内溶素多肽，并且任选地冷冻干燥内溶素多肽。

如本文所公开的多肽可以通过任何合适的方式生产。例如，该多肽可以使用本领域已知的标准技术直接合成，如Fmoc固相化学、Boc固相化学或通过溶液相肽合成。可替代地，多肽可以通过用编码所述多肽的核酸分子或载体转化宿主细胞(通常是细菌，例如大肠杆菌细胞)来产生。通过在细菌宿主细胞中表达来生产多肽在本文中进行描述并且在实施例中进行了概述(见实施例2)。本发明的多肽也可以通过转化到藻类宿主细胞中来生产。

当外源DNA已被引入宿主细胞内时，宿主细胞已被外源DNA(例如重组表达载体)“基因修饰”或“转化”或“转染”。外源DNA的存在导致永久性或暂时性的遗传变化。转化DNA可以或可以不整合(共价连接的)到细胞的基因组中。例如，在原核生物(例如大肠杆菌)、酵母和哺乳动物细胞中，转化DNA可以保持在诸如质粒的游离型元件上。对于真核细胞，稳定转化的细胞是转化DNA已整合到染色体中，从而其通过染色体复制由子细胞遗传的细胞。这种稳定性通过真核细胞建立包含含有转化DNA的子细胞的群体的细胞系或克隆的能力得以证明。“克隆”是通过有丝分裂从单个细胞或共同祖先衍生的细胞的群体。“细胞系”为能够在体外稳定生长多代的原代细胞的克隆。

合适的基因修饰(也称为“转化”)方法包括：例如病毒或噬菌体感染、转染、接合、原生质体融合、脂质转染、电穿孔、磷酸钙沉淀、聚乙烯亚胺(PEI)介导的转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接微注射、纳米粒子介导的核酸递送等。基因修饰方法的选择通常取决于被转化细胞的类型和发生转化的环境，并且对技术人员来说是显而易见的。

本发明还包括已被修饰以表达本发明的多肽的细胞。可以修饰此类细胞以携带编码本发明的多肽的表达载体。这类细胞通常包括原核细胞，如细菌细胞，例如大肠杆菌。可以使用常规方法培养这类细胞以生产本发明的多肽。优选地，本发明的细胞是藻类细胞的细胞。

多肽可以被衍生化或修饰以协助它们的生产、分离或纯化。例如，当本发明的多肽通过在细菌宿主细胞中重组表达生产时，该多肽的序列可包括在N端的额外的甲硫氨酸(M)残基以改善表达。

作为另一个实例，本发明的多肽可以通过添加能够直接和特异性结合分离工具的配体进行衍生化或修饰。可替代地，可以通过添加结合对的一个构件来衍生化或修饰多肽，并且分离工具包含通过添加结合对的另一个构件衍生化或修饰的试剂。可以使用任何合适的结合对。在用于本发明的多肽通过添加结合对的一个构件而被衍生化或修饰的优选实施方案中，该多肽优选为组氨酸标记的或生物素标记的。通常，在基因水平包含组氨酸或生物素标签的氨基酸编码序列包含在基因水平，并且多肽在大肠杆菌中重组表达。组氨酸或生物素标签通常存在于多肽的任一端，优选在C端。它可以直接连接至多肽或通过任何合适的接头序列(如3、4或5个甘氨酸残基)间接连接，如3、4或5个甘氨酸残基。该组氨酸标签通常由6个组氨酸残基组成，尽管它可以比这更长(通常高达7、8、9、10或20个氨基酸)或更短(例如5、4、3、2或1个氨基酸)。

多肽的氨基酸序列可以被修饰以包括非天然存在的氨基酸，例如以增加稳定性。当多肽通过合成方式生产时，这种氨基酸可在生产过程中引入。多肽也可以在合成或重组生产后进行修饰。多肽也可以使用D-氨基酸生产。在这些情况下，氨基酸将在C到N方向上以反向序列连接。这在本领域中对于生产这种多肽是常规的。

许多侧链修饰是本领域已知的，并且可以对多肽的侧链进行修饰，前提是多肽保留任何进一步需要的活性或如可在本文中指定的特征。还可以理解，多肽可以被化学修饰，例如翻译后修饰。例如，它们可以是糖基化的、磷酸化的或包含修饰的氨基酸残基。

多肽可以被聚乙二醇化。本发明的多肽可以是基本上分离的形式。它可以与不会干扰预期用途的载体或稀释剂(如下所述)混合，并且仍被认为是基本上分离的。它也可以是基本上纯化的形式，在这种情况下，它通常将占制剂中至少90％(例如至少95％、98％或99％)的蛋白质。

实施例

提供以下实施例以说明本发明，但不用于限制本发明。

实施例1：生物信息学搜索

存在许多可用的产气荚膜梭菌菌株和产气荚膜梭菌噬菌体的基因组序列。产气荚膜梭菌基因组NC_008261.1、NC_003366.1、CP000312.1、NZ_CP009557.1、NZ_CP010993.1、NZ_CP010994.1、NZ_AP017630.1、NZ_CP013101.1、NZ_CP023410.1，和噬菌体基因组NC_003524、NC_019506、NC_019496、NC_019508、NC_011318、NC_017980、NC_018083、NC_017978、NC_018084、NC_021325、JF767210、NC_008265被选择进行内溶素基因的序列相似性搜索。国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)的BLAST工具用于鉴定与以下内溶素基因(Ply3626、CP51L、PlyCP26F、Ply39O和plyS9)在氨基酸水平上的相似性序列，但是同一性低于75％。此外，使用PHASTER软件(phaster.ca)分析产气荚膜梭菌基因组序列以搜索潜在的原噬菌体区。随后筛选鉴定的原噬菌体区以发现潜在的内溶素序列。感兴趣的内溶素序列(SEQ ID NO:1至11)列于下表1中。

实施例2：共表达合成tRNA的大肠杆菌表达载体的构建

内溶素为具有抗微生物活性的蛋白质，并且可以对大肠杆菌克隆菌株具有潜在毒性。因此，实施克隆策略以最小化不需要的重组内溶素表达。内溶素编码序列被工程化为用“TGA”终止密码子替代内源性色氨酸“TGG”密码子。这是对内溶素编码序列的第一个Trp密码子或第一个和第二个Trp密码子进行的。因此，除非具有突变为“TCA”的反密码子序列的色氨酸tRNA(即tRNA-Wtca)与内溶素基因共表达，否则不应观察到重组内溶素的积累。

在成功克隆具有潜在毒性的内溶素基因之后，能够生产内溶素的大肠杆菌表达菌株也是必要的。选择表达载体系统pETDuet(Merck Millipore)用于大肠杆菌中的内溶素重组表达。此系统具有两个优点：(i)pETDuet载体具有2个多克隆位点(MCS)，它们将选择的DNA序列置于两个独立的T7聚合酶启动子的控制之下，和(ii)两个T7聚合酶启动子都经过工程化以响应于培养基中IPTG的存在，从而可以严格控制基因表达。后一个特征很重要，因为大肠杆菌中36％的终止密码子是TGA，如果表达不受控制，tRNA-Wtca的产生可能会引起额外的毒性作用。将突变体tRNA-Wtca DNA序列克隆到其中一个MCS中，而将具有突变的色氨酸密码子(TGG->TGA)的内溶素编码序列克隆到第二个MCS中。

对于tRNA-Wtca编码序列的克隆，在大肠杆菌k-12的基因组中鉴定了编码天然色氨酸tRNA的179-bp的DNA序列(GenBank登记号CP028306)。该tRNA的反密码子(“CCA”)被三联体“TCA”替代。此外，将两个18-bp序列添加到DNA序列的任一端，以通过重组方法促进其克隆到pETDuet载体中，其中整个序列为外部合成的(Eurofins Genomics)。5'端和3'端18-bp序列与pETDuet的MCS1序列同源，这允许使用Gibson组装方法(新英格兰生物实验室(NewEngland Biolabs))定向克隆合成的基因。所得质粒经过序列验证并命名为ecAL002。

为了测试克隆的tRNA-Wtca是功能性的，将在其编码序列中包含3个WTGG-TGA密码子的红色荧光蛋白(RFP)基因克隆到空ecAL002的MCS2中，产生质粒ecAL004。RFP序列是在外部合成的(Eurofins Genomics)，并在两端包含18-bp的侧翼序列。基因定向克隆到pETDuet载体的MCS2通过Gibson组装方法实现。作为额外的对照，构建了另一个质粒，其中从质粒ecAL004的MCS1中去除了tRNA-Wtca序列。此质粒被命名为ecAL003。将质粒ecAL002(仅tRNA-Wtca)、ecAL003(仅RFP)和ecAL004(RFP+tRNA-Wtca)转化到大肠杆菌表达菌株RosettaTM(DE3)pLysS(Merck)中。基于由存在于pETDuet-衍生质粒的主链上的bla基因赋予的氨苄青霉素抗性选择转化体。为了诱导RFP表达，这三种菌株在补充有100μg/ml氨苄青霉素和25μg/ml氯霉素的5ml Luria肉汤(LB)培养基中于37℃生长过夜。1mL过夜培养物用于接种100mL LB-氨苄青霉素-氯霉素培养基。培养物在37℃振荡生长2.5小时，然后以1mM的终浓度将IPTG添加到培养基中以诱导T7聚合酶启动子的表达。培养物在30℃振荡孵育，5小时后通过离心收集细胞。

通过目测和SDS-PAGE确定RFP的成功表达。简而言之，从每个细胞培养物中获得蛋白质提取物。将来自25mL培养物的细胞沉淀重悬于1mLpH 7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH7.4)中，并且使用Soniprep 150(MSE)进行10个超声处理循环(10秒开/关，按10μm振幅，持续10个循环)后裂解细胞。在超声处理期间将细胞在冰浴上孵育以防止样品过热。将粗裂解物在4℃以16600×g离心5分钟，然后收集澄清的裂解物(上清液)。使用mini-

3电泳系统(Bio-rad)通过SDS-PAGE分析澄清的裂解物样品以评估RFP表达水平。将澄清的裂解物样品与2×Laemmli缓冲液(Bio-rad)和100mM DTT以1:1的比例混合，然后在100℃变性5分钟。然后将变性的Laemmli样品装载并溶解于4-15％预制聚丙烯酰胺、15孔Mini-Protean TGX凝胶(Bio-rad)中。

关于三种菌株的生长，IPTG诱导后均达到相当的OD600nm，表明tRNA-Wtca的表达对细胞无明显毒性。当携带ecAL004质粒的细胞在诱导后6小时之后呈明显红色(图1A)并且在紫外光下照射时发出清晰的荧光(图1B)时，RFP表达在视觉上得到证实。与此不同，携带ecAL002或ecAL003质粒的细胞既不显示颜色也不显示荧光。澄清裂解物的SDS-PAGE分析提供了额外的证实。用InstantBlue(Expedeon)的凝胶染色显示在25kDa大小蛋白质标记物上的蛋白质条带，其仅存在于携带ecAL004质粒并且包含tRNA-Wtca和RFP编码序列的细胞提取物中(图1C)。由于RFP的预期分子量为27kDa，因此证实了RFP正在表达，因为样品也与指示的目测相一致。与此不同，从其它两种菌株获得的蛋白质提取物中不存在27kDa处的这个条带。因此，结果强烈表明克隆到pETDuet构建体中的tRNA-Wtca序列被正确转录和加工，而没有它，就无法观察到具有WTGG-TGA密码子的合成基因的表达。

实施例3：内溶素表达载体的构建及大肠杆菌转化

将实施例2中描述的ecAL002载体用作噬菌体来源的内溶素的表达载体。对实施例1中描述的内溶素编码序列进行修饰以用终止密码子“TGA”(即WTGG-TGA)替换一或两个色氨酸密码子“TGG”(即WTGG-TGA)。以这种方式，只有当修饰的tRNA-Wtca分子同时共表达时，重组内溶素才会被翻译，如实施例2中所述。此外，N端FLAG(DYKDDDDK)、C端HA(YPYDVPDYA)、C端Strep(WSHPQFEK)或C端6×HIS(HHHHHH)标签被添加到内溶素编码序列(表5)。将FLAG-标签添加到内溶素AMI3CPF4969(SEQ ID NO:11)、GH25CPFORC3(SEQ ID NO:1)和GH25phiS63(SEQ ID NO:5)的N端；将HA-标签添加到内溶素AMI2CPJP838(SEQ ID NO:9)、AMI2phiZP2(SEQ ID NO:3)、AMI2phiCPV4(SEQ ID NO:2)和GH25CPF4969(SEQ ID NO:8)的C端，；并且将Strep-标签添加到内溶素AMI3CPFORC25(SEQ ID NO:6)、AMI3CPJP55(SEQ IDNO:10)、AMI3CPSM101(SEQ ID NO:4)和AMI3phi24R(SEQ ID NO:7)的C端。构建了另外的表达载体以表达具有C端6×HIS-标签的AMI2phiCPV4(SEQ ID NO：2)和GH25CPF4969(SEQ IDNO：8)内溶素。对于C端HA-、Strep-和6×HIS-标签，‘GSAGSG’柔性接头也包含在标签和内溶素蛋白质之间。具有融合到与N端FLAG标签或C端HA和Strep标签融合的具有W(TGG->TGA)密码子修饰的内溶素编码序列是外部合成的(Eurofins Genomics)。然后使用与ecAL002上的MCS2的序列匹配的具有20-nt尾的特异性引物(表18)对合成的基因进行PCR扩增。这允许通过Gibson组装方法定向克隆到载体中。PCR条件由包括在94℃进行5分钟的初始变性步骤，然后在98℃10秒、63-68℃30秒和72℃50秒进行30个循环，以及在72℃进行10分钟最后的延伸步骤组成。按照制造商的说明，使用高保真DNA聚合酶Phusion(新英格兰生物实验室)进行PCR。按照制造商的说明，使用QIAquick Gel提取试剂盒(QIAgen)纯化扩增的DNA片段，并使用NEBuilder HiFi DNA组装试剂盒(新英格兰生物实验室)将其克隆到ecAL002载体中。将克隆反应物转化到

10-β感受态大肠杆菌细胞中，并且在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基上选择转化体。使用QIAprep Miniprep试剂盒(QIAgen)从转化体培养物中提取DNA质粒，并通过Sanger测序(Eurofins Genomics)进行序列验证。

修饰表5中描述的质粒ecAL006和ecAL007以用C端6×HIS标签替代融合至AMI2phiZP2和AMI2phiCPV4的C端HA标签。使用Q5定点诱变试剂盒(新英格兰生物实验室)通过定点诱变进行质粒修饰。表18中描述的引物对O_341/O_351和O_342/O_351分别用于通过PCR扩增全长的ecAL006和ecAL007。引物O_351携带合成6×HIS标签所需的序列。按照定点诱变试剂盒制造商的建议对扩增的DNA片段进行扩增和酶促修饰。将反应物转化到

10-β感受态大肠杆菌细胞中，并且在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基上选择转化体。使用QIAprep Miniprep试剂盒(QIAgen)从转化体培养物中提取所得的质粒plAL073(编码6×HIS-标记的AMI2phiZP2)和plAL071(编码6×HIS-标记的AMI2phiCPV4)，然后进行序列验证(Eurofins Genomics)。

表5列出了为在大肠杆菌中表达标记的内溶素而构建的载体，且表18列出了用于构建表达载体的引物序列。然后，按照制造商的说明将质粒转化到Rosetta^TM(DE3)pLysS大肠杆菌菌株(Merck Millipore)中。表5中还列出了相应的细菌菌株ID。

实施例4：来自大肠杆菌的内溶素表达

除了bAL002对照菌株外，如实施例3所示制备的大肠杆菌菌株bAL007至bAL017(表5)在进行任何生化分析之前被培养以确认内溶素表达。

通过用少量的冷冻50％甘油原液的刮取样品接种含有100μg/mL氨苄青霉素和25μg/mL氯霉素的5mL LB培养基，启动感兴趣的表达菌株的培养。将5mL接种物在培养箱中于37℃以275RPM振荡培养过夜(14-18小时)。过夜生长后，当大肠杆菌培养物已经达到稳定期时，将1mL过夜接种物接种至含有100μg/mL氨苄青霉素和25μg/mL氯霉素的100mL LB培养基中(即有效稀释100倍)。将500mL摇瓶中的100mL LB培养基于37℃以275RPM振荡培养。在预诱导前生长2.5小时后，通过向100mL培养物中加入1mM IPTG诱导内溶素表达。然后，将培养箱温度降低至30℃并继续孵育培养培养物另外的5小时。通过将每种培养物的25mL转移到50mL Falcon管中并在离心机中以3800×g在4℃离心15分钟来收获细胞。如果不立即使用，则去除该培养基并将该细胞沉淀在-20℃沉淀储存。通过超声裂解从源自25mL培养物的细胞沉淀中提取蛋白质。该细胞沉淀首先重悬于1mL PBS(pH 7.4)中，然后使用超声处理(10秒开/关，按10μm振幅，持续10个循环)进行裂解。然后，将粗裂解物于15℃以16600×g离心30分钟。随后将澄清的裂解物在pH 7.4的PBS中稀释，用于SDS-PAGE分析。

使用SDS-PAGE确认内溶素表达。通过以1:1与2×Laemmli缓冲液混合并添加100mMDTT，制备澄清的裂解物用于SDS-PAGE。然后，将样品在99℃煮沸15分钟。同样制备了500μg/ml BSA标准品作为参照。将10μL制备的样品和BSA标准品加载到在具有1×TGS运行缓冲液(Bio-rad)的Bio-rad Mini Protean凝胶槽(Bio-rad)中的4-15％，15孔TGX凝胶设置中(Bio-rad)。使用PowerPac Basic电源(Bio-rad)以恒定150V运行SDS-PAGE 60分钟。SDS-PAGE运行后，蛋白质凝胶用InstantBlue(Expedeon)染色，然后用MQ H2O脱色。脱色的凝胶在Vilber Bio-Print成像仪(Vilber)上用Bio-Vision软件(Vilber)成像。

SDS-PAGE结果显示，当与对照菌株bAL002的背景蛋白谱相比时，除bAL014之外的所有菌株中均表达内溶素(图2)。

实施例5：产气荚膜梭菌参照菌株的培养和储存

由于产气荚膜梭菌为厌氧菌，为了维持细菌的活力，所有塑料耗材、缓冲液、生长培养基和琼脂板都在Don Whitley MACS MG 500厌氧工作站(Don Whitley Scientific)中预还原，以排除暴露于生物体的氧气。除非另有说明，否则所有对细菌的操作也在该厌氧工作站中实施。

8种A型产气荚膜梭菌A型参照菌株(NCTC：2837、8235、8237、8238、8239、8359、8678、10578)获自Public Health England培养物收藏中心，并被储存以备将来用于抗生酶(enzybiotic)分析。简而言之，将冻干的培养物粉末重构并重悬于500μL RCM(Oxoid)中。之后，将150μL重构的混合物用于接种通用玻璃瓶中的双疱肉培养基(Southern GroupLaboratory)。培养物在厌氧工作站中于37℃生长过夜。将每种菌株的储备液储存于4℃。

实施例6：DSMZ菌株的培养和储存

由于获得的非产气荚膜梭菌菌株为厌氧菌并且为了维持细菌的活力，所有塑料耗材、缓冲液、生长培养基和琼脂板都在Don Whitley MACS MG 500厌氧工作站中预还原，以排除暴露于生物体的氧气。除非另有说明，否则所有对细菌的操作也在该厌氧工作站中实施。

大肠梭状芽胞杆菌(DSMZ 6011)、柔嫩梭菌(DSMZ 753)、产纤维二糖梭菌(DSMZ1351)和青春双歧杆菌(DSMZ 20083)获自莱布尼茨研究所DSMZ-德国微生物和细胞培养物中心(Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and CellCultures)，并被储存以备将来用于抗生酶分析。简而言之，将冻干的培养物粉末重构并重悬于500μLRCM中。之后，将150μL重构的混合物用于接种通用玻璃瓶中的双疱肉培养基。培养物在厌氧室中于37℃生长过夜。将每种菌株的储备液储存于4℃。

实施例7：产气荚膜梭菌野外分离株的培养和储存

由于产气荚膜梭菌为厌氧菌，并且为了维持细菌的活力，所有塑料耗材、缓冲液、生长培养基和琼脂板都在Don Whitley MACS MG 500厌氧工作站中预还原，以排除生物体的氧气暴露。除非另有说明，所有对细菌的操作也在厌氧室中实施。

8种产气荚膜梭菌A型野外分离株(APHA：B00907、B00917、B00954、B00964、B00976、G00033、W000101、W00102)获自英国动植物卫生署(United Kingdom Animal and PlantHealth Agency)，并被储存以备将来用于抗生酶分析。简而言之，将Amies琼脂中运输的培养物拭子用于接种15mL通用玻璃瓶中的双疱肉培养基。培养物在厌氧室中于37℃生长过夜。将每种菌株的储备液储存于4℃。

实施例8：使用澄清裂解物筛选产气荚膜梭菌参照菌株

使用点测定(spot assay)，针对实施例5中描述的8种产气荚膜梭菌参照菌株测试了从表达AMI2CPF4969、AMI2CPJP838、AMI2phiCPV4、AMI2phiZP2、AMI3CPFORC25、AMI3CPJP55、AMI3CPSM101、AMI3phi24R、GH25CPF4969和GH25CPFORC3的摇瓶培养物以及从用空白质粒ecAL002转化的培养物中获得的澄清裂解物的内溶素溶菌活性。因为内溶素可能仍会表达但不足以在蛋白质凝胶上被观察到，因此还筛选了来自表达AMI3phi24R的菌株的澄清裂解物。

每种参照菌株的工作储备培养物以100倍稀释度接种在BHI+C培养基中，并在DonWhitley MACS MG 500厌氧工作站中于37℃孵育过夜。对于每种菌株，使用RCM将过夜的稳定期Cp培养物稀释10倍，并将900μL稀释的培养物铺在RCM+1％琼脂板上。在厌氧工作站中于37℃孵育过夜后，使这些板生长细胞苔。这些板被命名为“细胞苔”板。此外，另一组RCM+1％琼脂板铺有900μL 10倍稀释的培养物。这些板被命名为“新铺的细胞”板，并立即用于点测定。来自20mL培养物的bAL002和bAL007–bAL017大肠杆菌细胞沉淀物重悬于500μL体外GIT缓冲液(2.4克/升牛肉提取物、5.0克/升酵母提取物、2.5克/升葡萄糖、10.0克/升胰蛋白胨、0.6克/升半胱氨酸盐酸盐和5.0克/升氯化钠；pH 6.4)中。用超声处理(10秒开/关，按10μm振幅，持续10个循环)裂解重悬细胞。然后，将粗裂解物在15℃以16600×g离心30分钟。将10μL澄清的裂解物分配到置于细胞苔或新铺的细胞上的Whatman滤纸上。将来自bAL002培养物的10μL澄清的裂解物点样在平板上作为阴性对照。另外点样的其它阴性对照包括PBS 7.4和体外GIT缓冲液，在厌氧室中有和没有过夜预还原。制备和点样的阳性对照包括20μg/ml氨苄青霉素、10μg/ml氯霉素、20μg/ml大观霉素、1mg/mL溶菌酶、1mg/mL或10mMEDTA二钠(pH 7.8)和1mg/mL溶菌酶+1mg/mL或10mM EDTA二钠。将10μL样品点样到从每种菌株制备的细胞苔和新铺的细胞上之后，将琼脂板在厌氧工作站中于37℃孵育过夜。点测定结果在Vilber Bio-Print上用Bio-vision软件成像。产气荚膜梭菌菌株分两组进行筛选：1)NCTC 2837、8235、8238、8678和10578；2)NCTC 8237、8239和8359。

根据新铺的细胞和细胞苔生成的清除区的存在和大小，定性评估了内溶素对8种参照菌株的相对抗微生物活性。对新铺的细胞(FP)的点测定用于评估内溶素对细菌生长的抑制效果。可替代地，对细胞苔(CL)的点测定用于评估内溶素的溶菌活性。在这两个测试中，如果内溶素表现出抑制效果或溶菌活性，则在添加了内溶素的滤纸周围会出现清除区。每个筛选组的示例性点测定结果分别显示在图3和图4中。各种产气荚膜梭菌菌株对大肠杆菌表达的内溶物裂解物的抗微生物应答的总结显示于表6中。筛选组1显示表达的内溶素通常对测试的菌株有活性，且它们的相对活性取决于筛选的菌株。内溶素的溶菌活性根据产气荚膜梭菌菌株是在新铺的细胞还是细胞苔上筛选而改变。这些差异可以由于菌株的生长速率、稳定期期间细胞壁的重塑和/或琼脂板表面上的细菌负载而引起。此外，组1结果表明，氨苄青霉素对新铺的细胞有效，但对已经生长的细胞苔无效。此结果与氨苄青霉素的抑菌活性一致。与此不同，一些内溶素对两种类型的铺板细胞均表现出抗微生物活性。氯霉素和大观霉素类抗生素普遍对抑制产气荚膜梭菌的生长没有影响，1mg/mL溶菌酶和1mg/mLEDTA二钠也没有影响。在筛选组2中观察到类似的结果。在该组中，未筛选裂解物bAL007和bAL012，这是因为它们在先前筛选中根本没有表现出活性。较高浓度的EDTA(10mM)显示对新铺的细胞具有抑制效果。1mg/mL溶菌酶对第2组中测试的菌株影响很小，但仅在新铺的情况下。从该半定量测定中，选择了五种内溶素(AMI2phiCPV4(bAL009)、AMI2phiZP2(bAL010)、AMI3phi24R(bAL014)、GH25CPFORC3(bAL016)和GH25phiS63(bAL017))进行额外的表征。基于它们对不同产气荚膜梭菌菌株的广谱抗微生物活性、对新铺的细胞和细胞苔的活性，包括根据实施例4中进行的SDS-PAGE分析估计它们的表达水平，选择它们。

实施例9：在4种非CP细菌物种上筛选大肠杆菌表达的内溶素

除了针对产气荚膜梭菌菌株的筛选外，还针对家禽肠道中常见的4种非Cp细菌物种对大肠杆菌表达的内溶素进行筛选，以确定所鉴定的内溶素是否仅对Cp具有特异性。4种非CP物种大肠梭状芽胞杆菌(DSMZ 6011)、柔嫩梭菌(DSMZ 753)、产纤维二糖梭菌(DSMZ1351)和青春双歧杆菌(DSMZ 20083)的筛选与实施例8中的筛选组2平行进行。因此，方法和点测定样品布局也如前所述。

大肠杆菌表达的内溶素对4种非目标细菌种类的筛选结果和汇总分别显示于图5和表7中。基于物种，20mM氨苄青霉素和10mM EDTA二钠对新铺的细胞均表现出抑制效果，但对细胞苔没有任何影响。这与氯霉素观察到的情况类似。内溶素澄清的裂解物和溶菌酶对筛选的任何非目标细菌物种都没有抗微生物活性。此结果表明所鉴定的内溶素可能仅对Cp菌株具有特异性。

实施例10：AMI2phiCPV4、AMI2phiZP2和GH25CPFORC3内溶素的亲和纯化

对来自bAL009(AMI2phiCPV4)、bAL010(AMI2phiZP2)和bAL016(GH25CPFORC3)大肠杆菌菌株的前3种内溶素进行了亲和纯化。这是为了生产不含污染物天然大肠杆菌裂解蛋白质的纯化的和浓缩的内溶素储备液，天然大肠杆菌裂解蛋白质被发现会干扰初步抗菌测定(未发表的结果)。

来自bAL009、bAL010和bAL016大肠杆菌菌株的各个内溶素的摇瓶表达如先前在实施例4中所描述的进行。200mL LB生长培养基代替1L摇瓶中的100mL用于每种内溶素表达。接种量和抗生素量也相应地按比例调节。收获后，对于每种菌株，获得4份分别源自约50mL培养物的细胞沉淀。通过超声裂解从每份细胞沉淀中提取蛋白质。细胞沉淀首先重悬于1mLPBS(pH 7.0)中，然后使用超声处理(5秒开/关，按10μm振幅，持续10个循环)进行裂解。然后，将粗裂解物于15℃以16600×g离心30分钟。在50mL Falcon管中，将来自每份沉淀的澄清裂解物与24mL PBS(pH 7.0)和10％甘油混合。向每管中加入一片cOmplete微型不含EDTA的蛋白酶抑制剂。单克隆抗HA琼脂糖，克隆HA-7亲和基质用于结合HA-标记的AMI2phiCPV4和AMI2phiZP2内溶素，而抗FLAG M2亲和凝胶用于结合FLAG-标记的GH25CPFORC3内溶素。按照供应商的说明清洗亲和基质之后，将400μL相应基质在PBS(pH 7.4)中的悬浮液与25mL裂解物/PBS/甘油溶液混合。标记的内溶素与亲和基质结合，在4℃轻轻混合过夜(～14-16小时)。结合过夜后，将每种蛋白质结合悬浮液于20℃以3800×g离心5分钟，以沉淀亲和基质。小心地从每个管中移除上清液，将亲和基质小心地重悬于500μL PBS(pH 7.0)缓冲液中，且转移到Pierce离心柱中(Thermofisher)。每个具有亲和基质的离心柱以8000RPM离心30秒以去除PBS。向该离心柱中加入500μL PBS(pH 7.0)缓冲液，再次离心以洗涤亲和基质。重复该过程6次。FLAG-标记的和HA-标记的内溶素分别通过在500μL 100μg/mL FLAG肽的PBS(pH7.0)或100μg/mL HA肽的PBS(pH 7.0)中孵育亲和基质来洗脱。每次洗脱均在室温轻柔混合孵育超过15分钟。通过以8000RPM对离心柱离心30秒，将洗脱级分收集在新的2mL微量离心管中。对于每个具有亲和基质的离心柱，重复该过程6次。使用Vivaspin 20,10MWCO PES膜浓缩器(Sartorius AG)汇集和浓缩源自相同内溶素表达的洗脱级分。将浓缩器于20℃以3000×g离心30分钟或直到浓缩物小于200μL。将10mL PBS(pH 7.0)缓冲液加入到浓缩物中并在相同条件下再次离心以去除残留的洗脱肽。将浓缩物浓缩直至其小于200μL，然后将其转移至1.5mL微量离心管中。在等分用于SDS-PAGE分析的纯化和浓缩的内溶素储备液之后，将5μL等分试样分配到8-孔条状管(strip tube)孔中，并在-80℃冷冻储存。

对纯化的内溶素储备液进行SDS-PAGE和光密度分析以量化纯化内溶素的浓度。制备由以下在2×Laemmli缓冲液中的终浓度组成的BSA标准曲线：12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL。使用2×Laemmli缓冲液对纯化内溶素储备液进行10倍、20倍和40倍稀释。将100mM DTT添加到BSA和稀释的内溶素Laemmli样品中，并在99℃煮沸15分钟。将10uL制备的样品和BSA标准品上样到在具有1×TGS运行缓冲液的Bio-rad Mini Protean凝胶槽中的4-15％、15孔TGX凝胶设置中。以恒定150V运行SDS-PAGE 80分钟。在SDS-PAGE运行后，蛋白质凝胶用InstantBlue染色，并用MQ H2O脱色。脱色的凝胶在Vilber Bio-Print上用Bio-Vision软件成像。用于量化纯化内溶素储备液浓度的光密度分析也使用机载软件进行。

缓冲液更换的和浓缩的洗脱级分的SDS-PAGE分析显示酶被纯化。内溶素蛋白质条带的SDS-PAGE迁移与GH25CPFORC3(～40kDa，泳道7-9)、AMI2phiCPV4(～26kDa，泳道10-12)和AMI2phiZP2(～26kDa，泳道13-15)的理论分子量并不完全一致。对此的原因没有进一步研究，但很明显，感兴趣的蛋白质被充分纯化，具有最小量的污染物蛋白质。BSA标准曲线用于纯化内溶素储备液的光密度测定分析和量化。虽然BSA标准品显示了一些降解的蛋白质片段，但与其在～66.5kDa的主要条带相比，它被认为可以忽略不计。光密度测定分析和量化显示，GH25CPFORC3、AMI2phiCPV4和AMI2phiZP2储备液浓度分别约为2400μg/mL、750μg/mL和1000μg/mL。

实施例11：使用纯化的内溶素对产气荚膜梭菌菌株的点测定

在实施例8中，使用澄清的裂解物进行点测定以筛选大肠杆菌表达的内溶素的抗微生物活性。在本实施例中，针对另外的产气荚膜梭菌菌株检查并测试了使用纯化的蛋白质的内溶素抗微生物活性。

NCTC参照菌株和APHA野外分离株分别如实施例5和7中所述进行培养。纯化的内溶素如实施例10中所述进行免疫纯化。使用新铺的细胞或细胞苔评估每种内溶素的抗微生物活性，并且制备方法与实施例8中所述相似，不同之处在于使用750μL稳定期培养物接种140mm直径的RCM，1％琼脂板。浓度为100μg/mL、50μg/mL和10μg/mL的内溶素也类似地被点样于新铺的细胞和细胞苔上。简而言之，将10mm纸盘放在新铺的细胞或细胞苔上面，并将10μL纯化的内溶素(100μg/mL、50μg/mL或10μg/mL)点样在盘上。还对缓冲液对照(PBS，pH7.4)和50μg/mL溶菌酶对照的两个重复进行点样。然后，将琼脂板于37℃孵育44-48小时以形成清除区。

点测定结果的汇总显示于表8和表9中。GH25CPFORC3内溶素能够抑制大多数菌株和分离株的细菌生长，而AMI2phiCPV4和AMI2phiZP2在测试浓度下不能抑制细菌生长(表8)。GH25CPFORC3的抑制水平因菌株而异，尽管野外分离株往往比参照菌株对内溶素作用更敏感。在测试的浓度下，GH25CPFORC3对参照菌株NCTC 8237和NCTC 8238没有表现出抑制效果。在大多数菌株中，所有三种内溶素均为溶菌的并产生清除区，其中GH25CPFORC3清除区最显著(表9)。一般而言，GH25CPFORC3似乎在三种测试的内溶素中表现出最大的抗微生物活性，并且还对筛选的产气荚膜梭菌菌株具有更广谱的抗微生物活性。目前的点测定结果还表明，AMI2phiCPV4和AMI2phiZP2的抗微生物活性相似。与纯化的内溶素相比，50μg/mL溶菌酶对任何测试菌株既没有显示出任何抑制效果，也没有显示出任何溶菌活性。

总之，GH25CPFORC3被评为性能最高的内溶素，而AMI2phiV4和AMI2phiZP2在点测定中的表现相似。另外，GH25FORC3对不同的产气荚膜梭菌菌株表现出广谱的抗微生物活性。

实施例12：浊度降低测定

在室温(即23℃)并在PBS缓冲液(pH 7.0)(在该情况下假设细胞生长最小)中，使用浊度降低测定评估纯化的内溶素GH25CPFORC3(即‘FORC3)、AMI2phiCPV4(即‘V4)和AMI2phiZP2(即‘ZP2)的相对溶菌活性。实施该测定以对3种内溶素之间的裂解性能进行排序，并表征每种内溶素对不同产气荚膜梭菌菌株的剂量反应。鸡蛋清溶菌酶(sigma，已知对产气荚膜梭菌具有溶菌效果，也包括在测定中作为参照酶。

如实施例8中所述，对4种参照菌株(NCTC 2837、8237、8238、8239)接种并过夜生长至稳定期。将来自每种培养物的稳定期细胞接种至新鲜的BHI+C培养基中，并在厌氧室中于37℃孵育1.5-2小时，以使培养物达到指数期。然后当OD620nm为～1.0时，将培养物以3800×g于10℃沉淀30分钟，并去除用过的BHI+C上清液。将细胞沉淀保持在室温，直到需要它们启动浊度降低测定。将细胞以一半体积重悬于PBS(pH 7.0)缓冲液中以浓缩细胞。随后使用重悬的产气荚膜梭菌细胞通过在以下96微孔板格式中将每孔90μL的重悬细胞与10μL的10倍浓缩的溶菌酶(Sigma)或内溶素(如本文所述制备)混合来启动浊度降低测定(图8)。除溶菌酶外，每种内溶素均在每个加载浓度下进行3次重复测定。使用PBS(pH 7.0)缓冲液制备2倍连续稀释的溶菌酶和内溶素储备液。第1列和第2列对应于PBS对照(仅每孔100μLPBS(pH7.0))和空白对照(每孔10μLPBS(pH 7.0)+90μL重悬细胞)。每个96微孔浊度降低测定板的有效加载浓度也显示于图8中。

通过在酶标仪上于23℃(即室温)以一定间隔进行OD620nm动态读数，来监测板的浊度降低。监测测定板30-60分钟，或直到OD620nm显著降低，使得其随着较高的内溶素加载量而开始趋于稳定。

浊度降低测定结果表明，所有3种内溶素都对测试的4种产气荚膜梭菌菌株(NCTC2837、8237、8238、8239)具有溶菌活性。因为观察到一些背景细胞裂解，故将其与空白孔(即细胞悬液对照)进行比较。为每种Cp菌株准备了两组分析(plot)：1)每个加载浓度下的内溶素排名(图10、图12、图14和图16)和2)每种内溶素的剂量反应(图9、图11、图13和图15)。在高内溶素加载量(即5μg/mL)下，3种内溶素之间的溶菌活性按以下次序排列：GH25CPFORC3、AMI2phiCPV4、AMI2phiZP2。然而，在低于1.25μg/mL的加载浓度下，AMI2phiCPV4通常表现出比GH25CPFORC3更高的裂解活性。内溶素对每种菌株的剂量反应是合适的，随着加载浓度的增加，浊度降低的下降更多。剂量反应因内溶素和产气荚膜梭菌菌株而异。对于0.31μg/mL的加载浓度，所有3种内溶素对4种产气荚膜梭菌菌株的溶菌活性与背景裂解实际上相似。除了菌株NCTC 2837和NCTC 8238之外，溶菌酶通常表现出最小的溶菌活性。另外，在高于31μg/mL的加载浓度下，溶菌酶储备液与在PBS(pH 7.0)缓冲液中的重悬细胞混合时沉淀。溶菌酶对NCTC 8238的溶菌活性最显著，但与3种内溶素相比，需要更高的加载量和孵育时间以达到相似的浊度降低水平。

浊度降低测定结果与实施例10中进行的点测定结果的比较表明，新铺细胞的生长和恢复可能对观察到的清除区的缺乏有影响。所有3种内溶素都对在其指数生长期收获的NCTC菌株表现出溶菌活性。这些包括AMI2phiCPV4和AMI2phiZP2内溶素，其对新铺的细胞没有呈现清除区。此外，在针对新铺细胞的点测定中似乎对GH25CPFORC3具有抗性的NCTC8237和NCTC 8238菌株，在此表现出对内溶素的敏感性。有趣的是，NCTC 8237和NCTC 8238被发现分别为在浊度降低测定中所测试的最敏感和最具抗性的产气荚膜梭菌菌株。类似地，在点测定中显示完全没有抗微生物活性的50μg/mL溶菌酶被发现对此处测试的参照菌株有轻微的活性。因此，在没有复杂因素(convoluting factor)的情况(如产气荚膜梭菌生长和回收率)下，对重悬细胞的浊度降低测定允许直接评估内溶素的溶菌活性。

每种内溶素对4种菌株的溶菌活性的汇总列于表10中，并绘制于图17中。表格和散点图汇总了t50％裂解参数，其定义为内溶素在特定加载浓度下裂解50％细胞悬液所需的时间。通过将内溶素的裂解曲线与动态读数开始时的空白对照OD(即t＝0h)和PBS对照OD(即0.03)(假设它对应于完全细胞裂解)进行比较来进行计算。下面的方程式1描述了从浊度降低曲线中提取t50％裂解参数所实施的计算。该参数能够更简洁地表达图17中内溶素之间的排名以及每种内溶素的剂量反应。散点图清楚地显示，NCTC 8237似乎对内溶素最敏感，而NCTC8238的抗性最强。除NCTC 8238之外，溶菌酶浊度降低分析无法获得t50％裂解值，因为它对溶菌酶最敏感。有趣的是，发现NCTC 8238为对3种内溶素最具抗性的菌株。

总之，与实施例11中的点测定结果类似，浊度降低测定结果证实GH25CPFORC3具有最高的抗微生物性能。该浊度降低测定也能够阐明AMI2phiCPV4比AMI2phiZP2更具溶菌性，这是点测定无法提供的。

方程式1

公式用于确定发生50％裂解的时间。该方程式用于求解OD_{E_t50％裂解}，其对应于在时间0h(即OD_{b_t＝0})时初始细胞悬液加载量的50％降低。当OD达到OD_{E_t50％裂解}时，根据浊度降低曲线确定发生50％裂解的时间(即t_50％裂解)。

实施例13：LOG₁₀降低测定

为了更好地表征纯化的内溶素的抗微生物活性，使用4种产气荚膜梭菌参照菌株(NCTC2837、NCTC8237、NCTC8238、NCTC8239)对每种内溶素实施log10降低测定。该测定提供了对内溶素的抗微生物活性的更准确的确定，因为它通过处理测试了参照菌株的活力水平。

该测定包括在内溶素处理后确定积极生长的细胞的活力降低。产气荚膜梭菌菌株在厌氧条件下在BHI+C中于37℃生长至约0.6OD600nm。将1.8mL培养物在室温以16600×g离心5分钟。去除培养基，并将细胞沉淀重悬于0.9mL重悬缓冲液(NaCl 127mM、Na₂HPO₄ 70mM、NaH₂PO₄ 30mM，pH 7.0)中。然后用缓冲液将细胞悬液稀释至0.6OD600nm(～10-20百万个细胞/ml)。将20μL纯化的内溶素以10μg/mL或50μg/mL的浓度，或PBS pH7.4(对于“未处理的”细胞对照)，添加到180μL细菌悬液中，产生终浓度为1μg/mL或5μg/mL的内溶素。反应于25℃孵育1小时，然后通过连续稀释和在RCM培养基上铺板来确定活细胞计数。

每种参照菌株的3种内溶素的log10降低测定结果的汇总显示于表11中。从～0.6OD600nm的稀释的培养物中，观察到用于log10降低测定的所有参照菌株的平均初始细菌加载量约为1530万个细胞/mL。然而，在重悬缓冲液中观察到自发细胞死亡1小时，范围为初始加载量的10-95％。虽然NCTC 8238和NCTC 8239细胞的活力在PBS(pH 7.0)缓冲液中重悬后似乎一直受到负面影响，但无法确定观察结果的明确相关性。为了校正测定过程中不依赖于内溶素的细胞死亡，log10降低值被计算作为未处理细胞对照与内溶素处理的细胞之比的log10。此外，log10降低值用于计算每种内溶素的活细菌的降低百分比。测定结果显示，3种内溶素对包括以最低浓度(1μg/ml)的所有4种测试菌株均具有活性，虽然具有不同的功效。log10降低值范围为0.03至3.76，其中GH25CPFORC3通常为对产气荚膜梭菌菌株具有最高活性的内溶素(图19)。在最高浓度(5μg/mL)下，对于GH25CPFORC3，所有菌株的中位数百分比降低为85.80％，而AMI2phiCPV4和AMI2phiZP2的中位数降低百分比分别为75.79％和51.37％。这些结果支持从实施例11建立的内溶素性能排名，从最高性能到最低性能：1)GH25CPFORC3，2)AMI2phiCPV4，3)AMI2phiZP2。

实施例14：用于内溶素表达的藻类表达系统

用于在微藻中表达内溶素基因的藻类表达系统包括以下步骤：

(1)莱茵衣藻的修饰菌株；

(2)旨在将内溶素基因整合至藻类的叶绿体基因组中的DNA载体；

(3)使用玻璃珠法进行藻类转化[1]；和

(4)基于适用于用含有内溶素的基因组替换所有原始叶绿体基因组拷贝(同质性(homoplasmy))的光合作用恢复的选择。

菌株

用于内溶素表达的受体莱茵衣藻菌株为TN72[1]。此菌株为野生型分离株137c，相当于CC-125的mt+细胞壁缺陷衍生物[2]。在TN72菌株中，叶绿体基因组的psbH基因通过用大观霉素抗性基因aadA进行基因替换而被删除[1]。psbH基因编码光合系统II的组件，该组件参与光合作用的光同化。因此，psbH蛋白的缺乏导致细胞不能光自养生长并且需要培养基中的乙酸盐才能生长。

载体

通过部分整合源自pAxi2.0的质粒或pL2_psbH质粒，将重组内溶素基因引入莱茵衣藻叶绿体。这些质粒携带与藻类叶绿体基因组的psbH基因的下游序列同源的0.8Kb序列，和与含有psbH基因和一些上游序列的区域同源的2.4Kb序列。内溶素编码序列，两侧是5'和3'调控序列，被克隆在两个同源序列之间。驱动内溶素基因表达的5'和3'调控序列来源于psbA、psaA、16S rDNA、atpA和rbcL叶绿体基因。另外，pAxi2.0和pL2_psbH质粒也携带tRNA-W_tca基因，该基因转录修饰的色氨酸tRNA分子，其允许将密码子“TGA”翻译为色氨酸而非STOP(终止)。体外合成内溶素基因，并且使用BsaI位点将其克隆到pAxi2.0和pL2_psbH质粒中。

转化方法(玻璃珠法)

对于转化，将TN72菌株在400mL TAP培养基中在恒定光照、25℃和165rpm回转式振荡下生长至光密度为0.3-0.6OD750 nm。然后将培养物以2000×g离心10分钟，并且将细胞沉淀重悬于1mL TAP培养基中。将0.5mL藻类悬液与40-100μg含有一种或两种内溶素基因的pAxi2.0或pL2_psbH衍生质粒混合。然后将混合物转移到含有600mg酸洗过的直径425-600μm的玻璃珠的15mL FALCON管中，并以最大速度在涡旋振荡器上振荡15秒。紧接着，将6mL已在42℃维持的0.5％(w/v)琼脂TAP加入玻璃珠/细胞悬液中，并且将混合物倾倒并铺在1％(w/v)琼脂HSM板上。在含有转化的细胞的顶层固化后，将板在黑暗中孵育24小时，然后转移到25℃连续光照的生长箱中。

选择和同质性驱动

基于光合作用恢复进行选择。TN72菌株无法在缺乏碳源的HSM培养基上生长。pAxi2.0或pL2_psbH衍生质粒部分整合后，psbH基因功能恢复，允许整合了质粒的转化体在HSM培养基上生长。内溶素基因被整合到psbH基因的3'UTR的下游。在HSM上维持细胞几代最终会取代原始的叶绿体基因组拷贝，用含有恢复的psbH和内溶素基因的修饰基因组重新入驻叶绿体。为了测试克隆是否达到同质性，其指细胞仅呈现一类叶绿体基因组的状态，用以下引物实施多重PCR反应：

O_53(GTAGGTATGATTAGCTTTACTAAGCTAGTCATTG)，

O_172(AAATAGTAACATACTAAAGCGGATGTAACTCAATC)和

O_328(CACTTTTACAACAAAGTACATTAGGAAAAACACG)。

PCR条件如下：在95℃1分钟；在95℃15秒、在61.9℃30秒和在72℃1分30秒，30个循环；以及在72℃最后延伸10分钟。另外，对大观霉素的抗性的缺失，也用于指示同质性。

菌株储存

表达内溶素的微藻菌株在室温和暗光下在TAP培养基上储存。使用GeneArt藻类冷冻保存试剂盒(Thermo Fisher Scientific)进行长期储存。

培养基组成

TAP和HSM培养基按照[3]和[4]中描述的方法进行制备。

参考文献

1.Wannathong,T.,Waterhouse,J.C.,Young,R.E.B.,Economou,C.K.&Purton,S.New tools for chloroplast genetic engineering allow the synthesis of humangrowth hormone in the green alga Chlamydomonas reinhardtii.Appl.Microbiol.Biotechnol.100,5467-5477(2016)

2.Davies,D.R.&Plaskitt,A.Genetical and structural analyses of cell-wall formation in Chlamydomonas reinhardi.Genet.Res.17,33-43(1971)

3.Kropat,J.等.A revised mineral nutrient supplement increases biomassand

4.The Chlamydomonas source book.(Elsevier,2008)。

实施例15：内溶素的最低抑制浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)的测定

在上文描述的实施例中，显示当Cp细胞生长最小时，GH25CPFORC3、AMI2phiCPV4和AMI2phiZP2内溶素对在室温(即～23C)且在PBS(pH 7.0)缓冲液中筛选的Cp菌株(NCTC2837、8237、8238、8239)表现出溶菌活性。还需要确定内溶素是否可以对液体培养物中活跃生长的Cp细胞表现出抗微生物活性。内溶素系列稀释液与已知初始细菌加载的共孵育允许确定所需的内溶素最低抑制浓度(MIC)。此外，内溶素的最低杀菌浓度(MBC)也可以确定。具体地，研究了针对Cp菌株Cp6(已知可诱发家禽的坏死性肠炎)的内溶素的MIC和MBC值。

如前所述，Cp6菌株进行接种并过夜生长至稳定期。将100uL的10⁴、10⁵和10⁶过夜培养物稀释液以3次重复接种在RCM+1％琼脂上，并在厌氧室中于41℃生长过夜。随后，在过夜琼脂板上完成菌落计数，以确定以下MIC测定板中使用的初始细菌加载量(即CFU/mL)。使用PBS(pH 7.0)缓冲液制备2倍连续稀释的溶菌酶阳性对照和内溶素储备液。使用LB培养基制备过夜稳定期Cp6培养物的1000倍稀释液。通过将45μL/孔的1000倍培养物稀释液与5uL 10倍浓缩的溶菌酶(Sigma，～89,000U/mg)或内溶素储备液(如上所述纯化的)在以下测定板格式中(表12)混合以启动MIC测定。除AMI2phiZP2之外，每个样品浓度均重复测定2次。孔A1-6(仅50μLLB培养基/孔)对应于培养基对照，而孔A7-12(5μLPBS/孔(pH 7.0)+45μL1000倍培养物稀释液/孔)对应于生长对照。MIC测定板的有效加载浓度也显示在表12中。

MIC测定板启动后，将板用Xtra-Clear高级聚烯烃StarSeal(Starlabs)密封，并在厌氧室中于41℃孵育13小时。使用酶标仪测量过夜MIC测定板上的相对生长抑制。为了确定哪些样品浓度能够完全杀死初始加载量的Cp6细胞，将5μL/孔的过夜MIC测定板重新接种到95μL/孔BHI+C培养基中，用Xtra-Clear高级聚烯烃StarSeal(Starlabs)密封，并在厌氧室中于41℃孵育过夜。随后在酶标仪上测量过夜重新接种的MBC测定板以评估在过夜MIC测定板中是否存在残留的活Cp细胞。

活Cp细胞与样品的过夜共孵育表明，3种内溶素都能够抑制过夜生长，而高达2.5mg/mL的溶菌酶加载量并未给予～2.1E4细胞/mL的初始细菌加载(表13)。基于重量，GH25CPFORC3、AMI2phiCPV4和AMI2phiZP2内溶素的MIC值分别确定为约1.6μg/mL、16μg/mL和16μg/mL的加载量。以摩尔为基础计算的MIC值也显示于表13中。与溶菌酶的比较表明，对于GH25CPFORC3、AMI2phiCPV4和AMI2phiZP2，内溶素分别比溶菌酶提高了1563、156和156倍。重新接种过夜MBC结果表明，相似抑制浓度的内溶素也为杀菌的(表13)。

实施例16：组合使用的内溶素的协同效应(点测定)

上述先前的实施例表明，所发现的内溶素在单独使用时对所测试的各种产气荚膜梭菌菌株表现出抑制和溶菌活性。众所周知，具有正交作用机制的试剂经常可以表现出令人惊讶的和改进的协同效应。同样适用于组合使用的内溶素，以协同增强它们各自的抗微生物效果。如果内溶素在结构上不同并且具有明显不同的作用机制，则尤其如此。当组合使用的内溶素具有不同的N端催化结构域和/或C端细胞壁结合结构域时，包括当存在多个不同的催化结构域和/或细胞壁结合结构域时，更有可能增强协同相互作用。已启动一项研究以确定GH25CPFORC3内溶素(N-乙酰基-β-D-胞壁酸酶)在与AMI2phiCPV4或AMI2phiZP2(均为N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶)组合使用时是否可以协同作用。测试这些内溶素组合的原因是生物信息学序列和结构分析暗示N-乙酰基-β-D-胞壁酸酶和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶之间的催化结构域在结构上不同，并在肽聚糖细胞壁上的不同键处切割。此外，GH25CPFORC3内溶素具有两个SH3细胞壁结合结构域，而AMI2phiCPV4和AMI2phiZP2内溶素均仅具有一个SH3细胞壁结合结构域。这些结构上不同的属性暗示内溶素之间的协同相互作用是可能的。GH25FORC3和AMI2phiCPV4之间存在协同作用的研究是利用与上述先前实施例中类似进行的点测定执行的。

如上述先前实施例中所述对NCTC参照菌株8237和8238进行培养。纯化的内溶素GH25CPFORC3和AMI2phiCPV4进行免疫纯化。使用新铺的细胞或细胞苔评估单独或组合施用的每种内溶素的抗微生物活性，制备方法与前面所描述的类似，不同之处在于使用750μL稳定期培养物接种直径140mm的RCM、1％琼脂、平板。制备浓度为200μg/mL、100μg/mL和50μg/mL的单个内溶素，然后将其类似地点样到新铺的细胞和细胞苔上。为了研究协同相互作用，还以类似的方式将预混合的各自浓度为100μg/mL或50μg/mL的内溶素GH25CPFORC3和AMI2phiCPV4的储备液点样到新铺的细胞和细胞苔上。简而言之，将10mm纸盘放在新铺的细胞或细胞苔上，并且将10μL纯化的内溶素(200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL)分别点样在圆盘上。组合施用的内溶素也被类似地点样，但使用10μL预混合的内溶素，每种浓度为100μg/mL或50μg/mL。每个样品重复点样2次。然后，将琼脂板于37℃过夜孵育16-24小时以形成清除区。

点测定结果显示GH25CPFORC3和AMI2phiCPV4内溶素之间的协同相互作用。根据组合的内溶素点(例如，GH25CPFORC3和AMI2phiCPV4各100μg/mL)产生的清除区是否大于单种内溶素点(例如，200μg/mLGH25FORC3或AMI2phiCPV4)的相同总加载量产生的清除区来评估协同效应的存在。用于研究内溶素对NCTC 8238细胞苔的协同相互作用的视觉评估和内溶素样品布置的实施例在图21中示出。NCTC 8238新铺的细胞和细胞苔上的点测定结果表明，组合的内溶素的清除区大于相同总加载量的单个点的清除区。然而，当在NCTC 8237新铺的细胞或细胞苔上点样内溶素时，未观察到协同相互作用。这些结果汇总于表14中。组合GH25CPFORC3和AMI2phiCPV4内溶素显示增强协同抗微生物活性是可能的，并且能够扩展到另外的Cp菌株。

实施例17：组合使用的内溶素的协同效应(96微孔液体培养物的MIC/MBC测定)

可替代的方法用于更加定量地确定不同内溶素之间的协同效应。该方法允许确定在给定初始细菌加载的过夜培养后抑制Cp生长所需的每种内溶素加载的量和单种内溶素加载比。

如前所述，Cp菌株进行接种并过夜生长至稳定期。将100uL的10⁴、10⁵和10⁶过夜培养物稀释液以3次重复接种在RCM+1％琼脂上，并在厌氧室中于41℃生长过夜。随后，在过夜琼脂板上进行菌落计数以确定用于以下MIC测定板的初始细菌加载量(即CFU/mL)。使用LB培养基制备2倍连续稀释的内溶素储备液。还使用LB培养基制备了1000倍稀释的过夜稳定期培养物。根据表15中96微孔板格式，MIC测定通过首先分配5μL/孔内溶素1和5μL/孔内溶素2的连续稀释储备液来启动。将10μL/孔和100μL/孔LB培养基分别分配到生长对照孔和培养基对照孔中。为了启动MIC测定，将90μL/孔1000倍过夜培养物稀释液分配到样品孔中。MIC测定板启动后，将板用Xtra-Clear高级聚烯烃StarSeal(Starlabs)密封并在厌氧室中于41℃孵育过夜。有效内溶素加载浓度以及内溶素2和内溶素1的uM加载比显示在表16中。

使用酶标仪测量过夜MIC测定板上的相对生长抑制。为了确定哪些内溶素浓度和比例为杀菌的，将5μL/孔的过夜MIC测定板重新接种到95μL/孔BHI+C培养基中，用Xtra-Clear高级聚烯烃StarSeal(Starlabs)密封，并在厌氧室中于41℃孵育过夜。随后在酶标仪上测量重新接种过夜的MBC测定板以评估在过夜MIC测定板中是否存在残留的活Cp细胞。

实施例18：组合使用的内溶素的协同效应(96微孔固体培养基上的点测定)

使用可替代的方法来更加定量地确定不同内溶素之间的协同效应，更具体地为GH25FORC3和AMI2phiCPV4之间的协同效应。该方法允许确定过夜培养后抑制Cp生长所需的每种内溶素的加载量和单种内溶素加载比。该方法也是对之前实施例中使用的点测定方法的改进，用于依靠OD620nm酶标仪读数而不是通过目测来获得更高准确度和精密度结果。

如前所述，Cp菌株进行接种并过夜生长至稳定期。将100uL的10⁴、10⁵和10⁶过夜培养物稀释液以3次重复铺在RCM+1％琼脂上，并在厌氧室中于41℃生长过夜。随后，在过夜琼脂板上进行菌落计数以确定用于以下MIC测定板的初始细菌负载量(即CFU/mL)。使用LB培养基制备2倍连续稀释的内溶素储备液。还使用LB培养基制备了1000倍稀释的过夜稳定期培养物。除琼脂对照孔之外，将50μL/孔过夜培养物稀释液分配到置于96微孔板中的100μL/孔RCM+1％琼脂上。制备了两个96微孔板。一个微孔板中的细胞是新铺的(FP)，另一个板中的细胞允许过夜生长成细胞苔(CL)。对于每个制备的板，通过分配10μL/孔预混合的内溶素1和内溶素2连续稀释的储备液启动测定，以提供表15中96微孔板格式的有效加载浓度。MIC测定板启动后，将板用Xtra-Clear高级聚烯烃StarSeal(Starlabs)密封并在厌氧室中于41℃孵育过夜。有效内溶素加载浓度以及内溶素2和内溶素1的uM加载比显示在表15中。分别通过目测新铺的细胞板和细胞苔板来评估内溶素组合的抑制效果和溶菌效果。

实施例19：6xHis标记的AMI2phiZP2、AMI2phiCPV4和GH25CPF4969内溶素的亲和纯 化

对在大肠杆菌菌株bAL187、bAL188和bAL198中表达的6xHis标记的AMI2phiZP2(SEQ ID NO:3)、AMI2phiCPV4(SEQ ID NO:2)和GH25CPF4969(SEQ ID NO:8)内溶素进行亲和纯化以用于后面的实施例。

在大肠杆菌中表达的6xHis标记的AMI2phiZP2、AMI2phiCPV4和GH25CPF4969内溶素的预培养在10mL LB培养基(+100μg/mL氨苄青霉素，25μg/mL氯霉素)中开始，并在37℃振荡(150rpm)孵育过夜。次日，用2mL预培养物接种200mL LB培养基(+100μg/mL氨苄青霉素，25μg/mL氯霉素)，并在37℃振荡(～150rpm)孵育约3小时。通过添加IPTG(异丙基-2-D-硫代吡喃半乳糖苷)(Merck)至1mM的终浓度来诱导蛋白质的表达，并将培养物在30℃再培养5小时。通过使用SIGMA 3-16KL离心机以3800×g离心10分钟来收获细菌细胞，并将细菌沉淀储存在-20℃直至次日。将沉淀重悬于5mL具有cOmplete微型不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物(Merck)的结合/洗涤缓冲液(20mM磷酸钠，0.5M NaCl，20mM咪唑，pH 7.4)中。使用MSESoniprep 150超声粉碎机通过超声处理(10μm振幅，10秒开/关，持续10个循环)裂解细胞。澄清的裂解物在Eppendorf 5430R离心机上以31,030×g离心澄清并收集上清液。使用Ni-sepharose^TM6快速流动树脂(GE Healthcare)进行亲和层析。在50mL Falcon管中将澄清的裂解物与1mL Ni-琼脂糖凝胶(Ni-sepharose)树脂混合，并将混合物在摇摆平台上的冰上孵育1小时。然后将裂解物/树脂悬液倒入空的PD-10柱(GE Healthcare)中并收集流出物供以后分析。结合蛋白的Ni-琼脂糖凝胶树脂用缓冲液(20mM磷酸钠，0.5M NaCl，20mM咪唑，pH7.4)洗涤，然后用由20mM磷酸钠、0.5M NaCl、0.5M咪唑组成的洗脱缓冲液(pH 7.4)洗脱蛋白质。测量280nm处的吸光度以确认洗脱级分中洗脱的蛋白质的存在。与实施例10类似地进行缓冲液更换和汇集的洗脱级分的浓缩。在Bio-Rad Mini-PROTEAN电泳系统中使用15-20％Mini-Protean TGX预制蛋白质凝胶(Bio-Rad)通过SDS-PAGE确定对蛋白质纯化的验证。SDS-PAGE样品和BSA标准曲线也与实施例10中所描述的类似地运行。所得蛋白质凝胶用InstantBlue^TM染色溶液(Expedeon)染色并用MQ H2O脱色。脱色凝胶使用Vilber Bio-print凝胶成像系统(documentation system)成像。使用机载软件进行用于量化纯化的内溶素的光密度分析。

SDS-PAGE和光密度分析(图22)显示内溶素高度富集少量的污染蛋白质。这些污染蛋白质不干扰随后的实验。感兴趣的蛋白质条带的量化表明，AMI2phiZP2、AMI2phiCPV4和GH25CPF4969的纯化储备液浓度分别为1700μg/mL、1000μg/mL和3600μg/mL。

实施例20：产气荚膜梭菌菌株Cp6肽聚糖的纯化

来自产气荚膜梭菌Cp6菌株的肽聚糖(PGN)被纯化用作用于评估内溶素活性的可替代的底物。由10mL BHI+C培养基组成的预培养物接种0.4mL肉汁中的产气荚膜梭菌Cp6菌株的培养物，并在MACS-MG-500厌氧室(Don Whitely)中于37℃孵育过夜。次日，1L BHI+C培养基接种0.5ml过夜预培养物，并在厌氧室中于37℃孵育约17小时。然后使用SIGMA 3-16KL离心机(SciQuip)将细胞以3,800×g离心10分钟，并且将沉淀的细胞用pH7.0的PBS洗涤两次并重悬于相同的缓冲液中，以获得600nm处约20的最终OD。在摇瓶中制备PBS(pH7.0)缓冲液中的20％(w/v)SDS溶液并在沸水浴中加热。将浓缩的产气荚膜梭菌Cp6细胞悬液缓慢滴加至沸腾的20％(w/v)SDS溶液中，同时持续搅拌，最终将该细胞悬液和该SDS溶液等份稀释(1:1)。将细胞/SDS悬液再煮沸2小时，然后继续搅拌过夜使悬液冷却。次日，将细胞/SDS悬液在Eppendorf 5430R离心机上以30,000×g离心30分钟以收获白色肽聚糖沉淀。弃去含有SDS的上清液，并且将白色沉淀用PBS(pH 7.0)缓冲液洗涤若干次以去除残留的SDS或直至在上清液中看不到更多气泡为止。将收获的肽聚糖沉淀重悬于缓冲液中以在600nm处得到约16-20的OD。将0.02％(w/v)的叠氮化钠添加到纯化的PGN悬浮液储备液中并在室温储存。

为了用于PGN降解测定，将纯化的PGN悬液在PBS(pH 7.0)缓冲液中稀释8至10倍以制成“PGN测定储备液”。

实施例21：组合使用的纯化的内溶素的协同效应(PGN测定)

使用PGN降解测定(即PGN测定)研究了以各种组合使用的6种纯化的内溶素的协同效应。测试的内溶素包括AMI3CPF4969(SEQ ID NO:11)、GH25CPFORC3(SEQ ID NO:1)、GH25phiS63(SEQ ID NO:5)、AMI2phiZP2(SEQ ID NO:3)、AMI2phiCPV4(SEQ ID NO:2)和GH25CPF4969(SEQ ID NO:8)。使用Pfam(https://pfam.xfam.org/)对该内溶素的序列比对表明它们对应的酶类别(基于它们的N端催化结构域)以及它们的C端结合结构域。然而，在没有纯化的内溶素的蛋白质结构比对和/或X射线晶体学实验的情况下，则无法验证这些推定结果。因此，以各种组合测试内溶素以确定它们在一起使用时是否可能显示协同效应。首先，如果内溶素来自不同的酶类别，则它们的组合可能对PGN降解显示协同效应，因为这些酶会对不同的PGN键具有水解活性。其次，即使内溶素来自相同的酶类别并且对相同的PGN键具有水解活性，它们的结合结构域在产气荚膜梭菌细胞壁配体上的不可逆结合也可能不同并影响PGN降解的效率。因此，测试这些组合以研究组合使用的内溶素是否会显示出令人惊讶的协同效应，该协同效应增加它们对产气荚膜梭菌细胞壁PGN的水解活性。

如下进行棋盘PGN测定以研究不同纯化的内溶素对之间的协同效应。测试的纯化的内溶素的组合包括：1)GH25CPFORC3和AMI2phiZP2，2)GH25CPFORC3和AMI2phiCPV4，3)AMI3CPF4969和GH25CPF4969，4)GH25phiS63和GH25CPF4969，5)GH25CPFORC3和AMI3CPF4969，以及6)AMI2phiZP2和GH25CPF4969。大肠杆菌表达的GH25CPFORC3、AMI3CPF4969、GH25phiS63与实施例10中所述类似地进行纯化和量化。大肠杆菌表达的AMI2phiZP2、AMI2phiCPV4和GH25CPF4969与实施例19中所述类似地进行纯化和量化。

所有纯化的内溶素储备液均在PBS(pH 7.0)缓冲液中标准化并稀释至25μg/mL或100μg/mL浓度(10×储备液)。在一个96微孔板中进行两次棋盘格PGN测定，其中示例性样品布置用于10μg/mL的1×内溶素起始浓度(图23)。10×列内溶素储备液(即内溶素1或3)经2倍连续稀释6次至1.6μg/mL，而10×行内溶素储备液(即内溶素2或4)经2倍连续稀释4次至6μg/mL。将10μL/孔的相应的内溶素1或3的10×储备液分配到适当的列中，并且类似地，将10μL/孔的相应的内溶素2或4的10×储备液分配到适当的行中。将10μL/孔的PBS(pH 7.0)分别添加到仅内溶素1或3的对照列6和12中。类似地，将10μL/孔PBS(pH7.0)仅添加到内溶素2或4的对照行H中。向孔H6和H12中添加额外的10μL/孔PBS(pH 7.0)用于0μg/mL加载孔。通过分配80μL/孔的PGN测定储备液启动PGN测定，从而有效地将每种内溶素稀释10倍。孔H6和H12为“仅PGN”的对照孔，具有0μg/mL内溶素。每个孔中的内溶素加载量对应于指示的行和列加载浓度。将测定板在平板振荡器上稍微混合，并且在室温(～23℃)使用Labtech LT-4500酶标仪上的动态读数功能在620nm连续监测3-4小时的浊度降低。

对纯化的内溶素的6种不同组合的评估表明所测试的组合为协同的。在本文研究的所有情况下，协同效应是基于两种内溶素组合使用时的初始PGN降解速率是否大于每种内溶素的初始PGN降解速率之和确定的。根据由光密度(OD)确定的测定的终点处的总体PGN降解，效应被确定为协同的，而与初始PGN降解速率无关。在这种情况下，如果与单独测试时观察到的单个内溶素降解的PGN的量相比，通过OD减少测量的内溶素组合的降解的PGN的最终量更大，则认为效应为协同的。在图24中可以看到表达来自不同酶类别的内溶素的提取物的协同效应的例子，其中使用了纯化的内溶素GH25CPFORC3和AMI2phiZP2。当使用2.5μg/mL GH25CPFORC3和2.5μg/mL AMI2phiZP2内溶素时，它们的组合降解速率(0.33OD/hr)大于它们的单个速率之和(0.28OD/hr)(参见图24D)。在以下GH25CPFORC3和AMI2phiZP2的加载浓度比2.5/0.63和1.25/2.5μg/mL下也观察到了类似的协同效应。此外，与单独使用两种内溶素中的任何一种相比，这对内溶素还能够在测定的终点(250分钟)实现更高的整体最大PGN降解。图24的图块(plot)A、B和C显示，在这些加载浓度比下，GH25CPFORC3/AMI2phiZP2组合能够将PGN降解为比GH25CPFORC3或AMI2phiZP2内溶素单独可以实现的更低的OD。在图24A所示的最高加载浓度比下，当单独使用时，GH25CPFORC3和AMI2phiZP2的PGN降解都稳定在～0.15OD并且不能进一步降解。然而，当2.5μg/mL GH25CPFORC3和2.5μg/mL AMI2phiZP2组合使用时，观察到更高的PGN降解至更低的OD。在图块B和C中也观察到组合使用时内溶素的类似的更高PGN降解。总之，结果表明GH25CPFORC3/AMI2phiZP2内溶素组合为协同的。

协同组合GH25CPFORC3和AMI2phiZP2提供了示例性PGN降解结果，表明当内溶素组合表现出1)与每种内溶素的单独速率的总和相比更高的PGN降解速率和/或2)与单独使用内溶素时相比更高的最大终点PGN降解(如通过上述PGN降解测定中OD测量确定的)的时候，则存在协同效应。通过相同的标准评估不同内溶素组合存在协同效应的条件。因此，此外发现以下内溶素组合为协同的：1)如图25所示的GH25CPFORC3/AMI2phiCPV4；2)如图26所示的AMI3CPF4969/GH25CPF4969；3)如图27所示的GH25phiS63/GH25CPF4969；

4)如图28所示的GH25CPFORC3/AMI3CPF4969；以及5)如图29所示的GH25CPF4969/AMI2phiZP2。

实施例22：内溶素表达载体构建及莱茵衣藻转化的概述

用于在微藻中产生内溶素基因的藻类表达系统具有以下组成部分：

(1)莱茵衣藻微藻宿主菌株。

(2)旨在将内溶素基因整合至微藻的叶绿体基因组中的DNA载体。

(3)藻类转化方法。

(4)包含含有内溶素的DNA载体的微藻克隆的选择与同质性驱动的方法。该方法基于光合作用恢复或抗生素抗性。

(1)微藻宿主菌株

用于内溶素表达的宿主莱茵衣藻菌株为TN72和crAL035。这两种菌株均为源自野生型菌株CC-125(相当于137c)的mt+细胞壁缺陷突变体。在TN72菌株中，叶绿体基因组的psbH基因已通过用大观霉素抗性基因aadA[1]进行替换而被删除。psbH编码光合系统II的光合作用过程中光同化所必需的组件。缺少psbH导致细胞不能光自养生长并且需要培养基中的乙酸盐才能生长。crAL035菌株来源于用质粒plAL010转化后的TN72。质粒plAL010携带psbH基因下游序列的0.8kb片段、含有psbH基因及其部分上游序列的2.4kb片段、lacZ基因和tRNA-Wtca基因。plAL010整合至叶绿体基因组中恢复psbH功能和光合作用。在没有乙酸盐的基本培养基上选择转化体，在该基本培养基上只有光自养克隆能够生长。转化体在基本培养基上传代两次，且构建体的同质性通过如下所述的PCR测试(点4)。

(2)DNA载体

通过整合源自pAxi2.0、plAL010或plAL009质粒的质粒，将重组内溶素基因引入莱茵衣藻叶绿体中。pAxi2.0和plAL010携带psbH基因下游序列的0.8kb片段，以及含有psbH基因及其部分上游序列的2.4kb片段。这些片段被基因合成(Eurofins Genomics)并克隆至携带卡那霉素抗性基因的质粒中。在两个psbH同源区之间设计多克隆位点(MCS)，其具有反向BsaI限制性内切酶位点，用于通过Golden Gate克隆来克隆内溶素基因。pAxi2.0和plAL010都具有插入MCS的tRNA-Wtca基因，其转录修饰的莱茵衣藻tRNA分子，该tRNA分子将TGA密码子翻译为色氨酸。另外，plAL010还具有克隆到MCS中的lacZ基因。plAL009携带与叶绿体基因组中petB基因的下游区同源的两个1Kb序列。类似于plAL010，plAL009在petB同源序列之间有MCS，侧翼有反向BsaI限制性内切酶位点，用于通过Golden Gate克隆内溶素基因。plAL009的MCS携带与plAL010所述相同修饰的tRNA-Wtca基因和lacZ基因。

融合到FLAG、HA、Strep或6xHis标签序列且侧翼有5'和3'基因表达调控序列的内溶素编码序列在pAxi2.0、plAL010和plAL009的MCS的BsaI限制性内切酶位点克隆。驱动内溶素基因表达的5'和3'调控序列来源于psbA、psaA、16S rDNA、atpA和rbcL叶绿体基因。内溶素编码序列和调控序列由基因合成(Eurofins Genomics)并通过Golden Gate克隆组装。

(3)通过玻璃珠法进行藻类转化

为了转化，宿主微藻菌株在400mL TAP培养基[2]、[3]中在恒定光照(50-500μmols^-1m^-2)、25℃和140rpm回转式振荡下生长至0.3-0.6OD750nm的光密度。然后将培养物在Sigma 3-16KL(SciQuip)离心机中以765×g离心10分钟，并且将细胞沉淀重悬于1mL TAP培养基中。将0.5mL藻类悬浮液与40-100μgDNA质粒混合，然后将混合物转移到含有600mg酸洗过的直径425-600μm的玻璃珠(Merck)的15mL锥形管(Starlab)中。以最大速度将该管在涡旋振荡器(SciQuip)中振荡15秒。对于基于光合作用恢复的选择，将6mL已在42℃预热的0.5％(w/v)琼脂TAP培养基加入玻璃珠/细胞悬液中，并且将混合物倾倒并铺在1％(w/v)琼脂HSM板上[2]、[3]。在含有转化的细胞的顶层固化后，将板在黑暗中孵育24小时，然后转移到25℃连续光照(50-500μmol s^-1m^-2)的生长箱(LEEC)中。对于基于抗生素抗性的选择，在用玻璃珠和DNA质粒振荡后，将细胞转移到5mL TAP中并在暗光中回转式振荡孵育过夜。次日，将培养物在离心机Sigma 3-16KL(SciQuip)中以765×g离心10分钟，将沉淀铺在含有补充有100μg/mL大观霉素(Merck)的TAP培养基的板上。将板在黑暗中孵育48小时，然后转移至恒定光照(50-500μmol s^-1m^-2)直至菌落生长。

(4)选择与同质性驱动的方法

选择含有内溶素基因的微藻克隆的方法是基于光合作用恢复或抗生素抗性。宿主菌株TN72用于光合作用恢复方法。此菌株自身不能在HSM培养基上生长，但在整合pAxi2.0或plAL010衍生质粒后，psbH基因功能恢复，且转化体能够在该培养基上生长。内溶素基因被整合到psbH基因的3'UTR的下游。在HSM上维持细胞几代最终会取代原始的叶绿体基因组拷贝，用含有恢复的psbH和内溶素基因的修饰基因组重新入驻叶绿体。为了测试克隆是否达到同质性，其指叶绿体仅由重组基因组入驻的状态，使用引物对O_53/O_328和O_53/O_172进行了两次诊断性PCR(表19)。PCR条件如下：在95℃1分钟，在95℃15秒、在61.9℃30秒和在72℃1分30秒的30个循环，以及在72℃最后延伸10分钟。按照制造商的建议，使用PCRBIO Taq(PCR Biosystems)在Prime热循环仪(Techne)中进行PCR。此外，大观霉素的抗性的缺失也用于确认同质克隆。

对于抗生素抗性选择方法，将大观霉素抗性基因aadA基因[4]与内溶素基因一起在质粒plAL009的MCS中克隆。在TAP培养基中转化和过夜恢复后，将细胞铺在含有补充有100μg/mL大观霉素(Merck)的TAP培养基的板上。在恒定光照(50-500μmol s^-1m^-2)下于25℃孵育两周后出现抗生素抗性菌落。转化体在TAP 100μg/mL大观霉素板上多次传代后被驱动为同质性。用引物对O_323/O_328和O_323/O_336进行两次诊断性PCR以筛选同质克隆(表19)。PCR条件如下：在95℃1分钟，在95℃15秒、在61.9℃30秒和在72℃1分30秒的30个循环，以及在72℃最后延伸10分钟。按照制造商的建议，使用PCRBIO Taq(PCR Biosystems)在Prime热循环仪(Techne)中进行PCR。

同质菌株在室温和暗光下在补充有1％(w/v)酵母提取物(Merck)的TAP培养基上储存。按照制造商的说明，使用GeneArt藻类冷冻保存试剂盒(Thermo Fisher Scientific)进行长期储存。

参考文献

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[3]J.Kropat等.,“A revised mineral nutrient supplement increasesbiomass and growth rate in Chlamydomonas reinhardtii,”Plant J.,vol.66,no.5,pp.770–780,2011.

[4]M.Goldschmidt-clermont,“Transgenic expression of aminoglycosideadenine transferase in the chloroplast:A selectable marker for site-directedtransformation of chlamydomonas,”Nucleic Acids Res.,vol.19,no.15,pp.4083–4089,1991.

用于筛选同质莱茵衣藻转化体的引物列于下表19中。

实施例23：表达内溶素的工程化莱茵衣藻菌株的构建

构建了表达一种或两种内溶素基因的莱茵衣藻的不同菌株。

使用实施例22中描述的基于光合作用恢复的选择方法构建菌株crAL036、crAL038、crAL039和crAL045。宿主菌株TN72通过玻璃珠法用表20中列出的质粒进行转化。这些质粒来源于pAxi2.0或plAL010，其携带psbH基因的同源区。质粒由各个部分(启动子、5'UTR、编码序列和3'UTR)按照分级策略并使用Golden Gate克隆组装而成。基因合成(Eurofins Genomics)的各个部分被克隆至分离的质粒中。在含有SapI(新英格兰生物实验室)和T4 DNA连接酶(新英格兰生物实验室)的反应中，基因单元由各个部分组装而成。然后使用BsaI(新英格兰生物实验室)和T4 DNA连接酶(新英格兰生物实验室)将基因单元组装成多基因构建体，装入pAxi2.0或plAL010质粒中。然后使用HiSpeed Plasmid Maxi试剂盒(Qiagen)对最终质粒进行测序验证和纯化。表21汇总了菌株特征。如实施例22所述进行转化、选择和同质性驱动。

使用基于抗生素抗性的选择方法如实施例14所述生成微藻菌株crAL041、crAL061、crAL075、crAL076、crAL077、crAL078、crAL079和crAL080。用质粒plAL163、plAL166、plAL168、plAL169、plAL170、plAL171、plAL172和plAL173分别转化宿主菌株crAL035(表21)。这些质粒来源于plAL009并且携带内溶素基因和aadA基因，aadA基因赋予藻类对抗生素大观霉素的抗性。这些质粒由各个部分(启动子、5'UTR、编码序列和3'UTR)按照分级策略并使用Golden Gate克隆[1]组装而成。基因合成(Eurofins Genomics)的各个部分被克隆至分离的质粒中。在含有SapI(新英格兰生物实验室)和T4 DNA连接酶(新英格兰生物实验室)的反应中，基因单元由各个部分组装而成。然后使用BsaI(新英格兰生物实验室)和T4DNA连接酶(新英格兰生物实验室)将基因单元组装成多基因构建体，装入plAL009中。然后使用HiSpeed Plasmid Maxi试剂盒(Qiagen)对最终质粒进行测序验证和纯化。如实施例22所述进行转化、选择和同质性驱动。使用引物O_323和O_336，通过gDNA提取和其中发生了整合的petB染色体基因座的扩增进一步验证了潜在的同质克隆(表19)。此PCR的条件为：在98℃30秒，在98℃10秒、在65℃20秒和在72℃5分钟的35个循环，以及在72℃最后延伸10分钟。按照制造商的说明，使用高保真DNA聚合酶Phusion(新英格兰生物实验室)在Prime热循环仪(Techne)中进行PCR。

通过两次连续转化生成共表达两种内溶素基因的藻类菌株。共表达AMI2phiZP2和GH25CPFORC3内溶素的菌株crAL057是通过用携带GH25CPFORC3基因的质粒plAL166转化表达AMI2phiZP2的菌株(crAL038)产生的(表21)。此外，质粒plAL166含有crCD-aadA基因，该基因赋予对抗生素大观霉素的抗性。使用plAL009通过Golden Gate构建质粒plAL166(表20)。用20-50μg质粒转化菌株crAL038，并且根据抗生素抗性选择克隆，如实施例22中所述。在选择性培养基上传代若干次后分离同质克隆。为了验证质粒plAL166与同质体的整合，从转化体中提取gDNA，并且使用引物O_323和O_336通过PCR扩增其中发生了整合的petB染色体基因座(表19)。此PCR的条件为：在98℃30秒，在98℃10秒、在65℃20秒和在72℃5分钟的35个循环，以及在72℃最后延伸10分钟。使用高保真DNA聚合酶Phusion(新英格兰生物实验室)在Prime热循环仪(Techne)中进行PCR。此外，使用针对AMI2phiZP2基因的特异性引物(O_197/O_106)(表19)进行PCR以测试GH25CPFORC3在petB位点的整合不破坏在psbH位点整合的AMI2phiZP2基因。

通过筛选crAL057菌株的克隆构建crAL058菌株，其中在crCD-aadA基因侧翼的两个相同序列之间发生了自发重组。通过在TAP板上铺有一系列在TAP光照(50-500μmol s^-1m^-2)下生长至饱和的crAL057菌株培养物的稀释液进行筛选。将板于25℃在恒定光照(50-500μmol s^-1m^-2)下孵育一周。然后，分离的菌落划线在TAP上，TAP补充有100μg/ml大观霉素(Merck)。不能在TAP大观霉素板上生长的克隆从TAP复制板中挑选出来。从这些克隆中提取gDNA，并且使用引物O_323/O_336(表19)和以下条件：在98℃30秒，在98℃10秒、在65℃20秒和在72℃5分钟的35个循环，以及在72℃最后延伸10分钟，通过PCR确认抗生素抗性基因的缺失。按照制造商的说明，使用高保真DNA聚合酶Phusion(新英格兰生物实验室)在Prime热循环仪(Techne)中进行PCR。

用于转化莱茵衣藻菌株的质粒列于下表20中。携带内溶素的微藻菌株的特征列于下表21中。

参考文献

[1]E.Weber,C.Engler,R.Gruetzner,S.Werner和S.Marillonnet,“A modularcloning system for standardized assembly of multigene constructs,”PLoS One,vol.6,no.2,2011.

实施例24：来自莱茵衣藻菌株crAL035、crAL038、crAL039、crAL045、crAL057和 crAL061提取物的表征

在此实施例中，评估了来源于表达内溶素基因的莱茵衣藻菌株的提取物的溶菌活性和抗微生物活性。实验过程总结如下：(1)菌株构建，如实施例22和23中所描述；(2)表达内溶素的微藻菌株的实验室规模培养；(3)来自收获的微藻生物质的提取物的制备；(4)提取物的溶菌活性和抗微生物活性测定。如下所述，溶菌活性通过PGN降解和清除区形成进行评估，而抗微生物活性则通过最低抑制浓度(MIC)测定进行评估。

此实施例中使用的菌株为crAL038、crAL039、crAL045、crAL057和crAL061，其表达AMI2phiZP2(SEQ ID NO:3)(crAL038和crAL039)或GH25CPFORC3(SEQ ID NO:1)内溶素(crAL045和crAL061)。不表达内溶素的菌株crAL035用作对照菌株。菌株crAL057表达AMI2phiZP2和GH25CPFORC3内溶素，并用于评估共表达对总的溶菌活性和抗微生物活性的影响。这些衣藻菌株的构建汇总于实施例22和23中。重组菌株是通过整合叶绿体基因组的psbH和/或petB基因下游的载体而产生的。整合的序列携带侧翼具有基因表达调控序列的内溶素基因(表20和表21)。AMI2phiZP2内溶素基因在psaA启动子和5'UTR控制下在crAL039中表达，而在crAL038中，它在16S启动子和psaA 5'UTR控制下被克隆。在这两种菌株中，构建体整合叶绿体基因组中psbH基因的下游。菌株crAL061在16S启动子和atpA5'UTR下表达GH25CPFORC3内溶素基因，并且该构建体整合petB基因的下游。菌株crAL045使用16S启动子和psaA 5'UTR表达GH25CPFORC3基因，并且表达盒整合在psbH基因的下游。共表达菌株crAL057具有在16S启动子和psaA 5'UTR下克隆的并且整合在psbH基因下游的AMI2phiZP2基因，以及在16S启动子和atpA 5'UTR下克隆的并且在petB基因下整合的GH25CPFORC3基因。

莱茵衣藻菌株的实验室规模培养物在500mL摇瓶中的200mL TAP培养基中生长。通过将～1cm2斑块中的细胞划线到TAP板上，从储存培养物(固体TAP培养基)中再生菌株。将板于25℃在恒定光照(50-500μmol s^-1m^-2)下在光照柜(LEEC)中孵育3-4天，或直至足够的细胞生长。然后将这些细胞用于接种50mL摇瓶中的20mL液体TAP培养基。将摇瓶在黑暗条件下(即仅环境光)在设置为140rpm的定轨振荡器上于25℃孵育3-5天。这些通常处于早期稳定生长期的预培养物用于在0.05-0.1的初始OD750nm接种200mL液体TAP培养基。摇瓶培养物在相同条件下于25℃孵育。在指数晚期至早期稳定生长期收获细胞，其中OD750nm从0.7到1.5不等。通过将～50mL培养物转移到50mL锥形管中并通过使用SIGMA3-16KL离心机(SciQuip)以765×g离心10分钟使细胞沉淀来收获培养物。弃去上清液，将具有残留的TAP培养基的沉淀转移到1.5mL试管中并再次离心。弃去残留的TAP培养基上清液，并且将沉淀储存在-20℃直至进一步处理。

为了制备可溶性提取物，将在-20℃储存的沉淀解冻并根据沉淀大小重悬于150-500μL PBS(pH 7.0)中。细胞悬液通过反复冻融循环(×3)然后在Soniprep 150超声粉碎机(MSE)中超声处理(10μm振幅，10秒开/关，持续10个循环)进行裂解。通过在5430R离心机(Eppendorf)中以31,030×g离心全细胞提取物30-45分钟获得可溶性提取物。根据制造商的说明，使用Bio-rad DC蛋白质测定法确定提取物的总可溶性蛋白质(TSP)含量。

全细胞Cp6点测定包括将表达内溶素的藻类提取物点样到用TAP琼脂和产气荚膜梭菌Cp6细胞悬液制备的固体琼脂培养基上。藻类提取物中内溶素活性的存在将通过固体培养基上的表示细胞裂解的清除区来证明。具有全细胞Cp6的TAP琼脂板按照如下制备。首先，在MACS-MG500厌氧室(Don Whitely)中于37℃在BHI+C培养基中生长的400mL产气荚膜梭菌菌株Cp6培养物过夜。使用SIGMA 3-16KL离心机(SciQuip)将产气荚膜梭菌细胞以3,800×g沉淀10分钟，并用pH 7.0的PBS缓冲液洗涤。将Cp6细胞沉淀重悬于40-50mL液体TAP培养基中，并以1:1的比例与1％(w/v)熔融的TAP琼脂混合。然后将混合物倾倒在皮氏培养皿上并使其固化。一旦固化，则使用PBS(pH 7.0)缓冲液将如前所述制备的藻类提取物稀释至10mg TSP/mL，并且将10μL标准化的提取物1式两份点样到全细胞Cp6 TAP琼脂板上。将点样的全细胞Cp6 TAP琼脂板于37℃孵育过夜，并且根据清除区的出现确定内溶素活性的存在。

在PGN降解测定中，来自产气荚膜梭菌Cp6细胞的纯化的肽聚糖(PGN)与藻类提取物混合，随着时间的推移的PGN的降解通过在620nm处读取溶液的光密度来追踪。藻类提取物在PBS(pH 7.0)缓冲液中连续稀释2倍，多达7倍，并根据图30A中所示的布置将10μL/孔分配到微量滴定板中。为了启动PGN测定，分配90μL/孔的PGN储备液以提供有效加载浓度。在室温(即～23℃)，使用Labtech LT-4500酶标仪上620nm处的动态读数功能立即追踪孔的浊度降低2小时。使用Labtech LT-4500酶标仪的分析软件计算PGN降解的初始速率。

除了以下修饰外，MIC测定方法和条件与实施例15相似：(1)将产气荚膜梭菌Cp6菌株的过夜培养物稀释在BHI+C培养基中，而不是LB培养基中；(2)用～10⁵个产气荚膜梭菌细胞/mL进行测定；以及(3)使用藻类提取物代替来自大肠杆菌的纯化的内溶素。为了启动MIC测定，根据图30B中所示的板格式分配10μL/孔的2倍连续稀释的藻类提取物，然后添加90μL/孔的～10⁵个细胞/mL的产气荚膜梭菌Cp6菌株，给出有效加载浓度。使用粘性铝密封件(Starlab)密封MIC测定板，并且在厌氧室中的平板振荡器上稍微混合，于41℃孵育过夜。如实施例15中所述类似地进行MIC测定中细菌加载量的确认。使用目测以及酶标仪上的OD620nm读数确定过夜孵育后的生长抑制。MIC值对应于完全抑制细菌生长的最低提取物浓度，表示为mg TSP/mL。图31示出全细胞Cp6点测定的结果。根据每个点周围清除区的大小和清晰度，对裂解活性进行定性评估。一种通过用不含内溶素基因的载体转化产生的菌株crAL035，用作对照。正如预期的那样，该菌株的提取物没有产生清除区。相反，点测定结果显示，从表达内溶素的衣藻菌株产生的提取物为活性的。表达GH25CPFORC3内溶素的菌株(crAL045、crAL057和crAL061)均产生大的清除区。尽管GH25CPFORC3基因在不同的启动子/5'UTR元件下表达，但是crAL045和crAL061裂解物引起的清除大小和程度看起来相似。与表达GH25CPFORC3的菌株相比，表达AMI2phiZP2内溶素的菌株(crAL038和crAL039)形成的清除区减少。与crAL038点相比，crAL039点显示出较弱的清除区。这种差异可能是由于用于表达AMI2phiZP2内溶素的启动子/5'UTR的强度不同。有趣的是，来自共表达GH25CPFORC3和AMI2phiZP2的crAL057的可溶性提取物，表现出比单独的crAL038或crAL061点更大的清除区，在与crAL057相同的表达元件中，crAL038和crAL061分别携带AMI2phiZP2和GH25CPFORC3。此结果表明，两种不同内溶素的共表达能够提高整体溶菌活性。

PGN降解测定的结果(图32)与全细胞CP6点测定结果有很好的相关性。从表达内溶素的菌株制备的提取物显示出比使用来自不表达内溶素基因的对照菌株crAL035的提取物测量的背景PGN降解更高的降解速率。携带GH25CPFORC3基因的菌株产生PGN降解速率最高的提取物，并且该降解速率比从含有AMI2phiZP2内溶素的提取物获得的降解速率高8倍以上。GH25CPFORC3和AMI2phiZP2共表达菌株crAL057表现出最高的PGN降解活性，高于单独表达GH25CPFORC3(crAL061)或AMI2phiZP2(crAL038)的菌株，进一步证实了两种内溶素共表达能够实现更高的裂解活性。

为了表征藻类提取物的抗微生物活性，对藻类提取物进行了MIC测定分析(图33)。MIC测定结果通常与点测定和PGN测定结果相关。除了MIC值无法在高于加载提取物的最高量(3mg TSP/mL)时确定的对照菌株crAL035和菌株crAL039(表达AMI2phiZP2)之外，可以从所有提取物中确定MIC值。GH25CPFORC3和AMI2phiZP2共表达菌株crAL057表现出最高的抗微生物活性，具有188μg TSP/ml的MIC值，并且证实了点测定和PGN测定结果：两种不同内溶素的多重表达是有利的。来自crAL038、crAL045和crAL61的提取物的MIC值被确定为在750-375μg TSP/ml的范围内。与PGN测定和点测定中观察到的不同，抗微生物活性测定表明，AMI2phiZP2表达菌株crAL038在抑制产气荚膜梭菌Cp6生长方面比GH25CPFORC3表达菌株crAL045和crAL061更有效。PGN测定结果已表明它们的裂解活性比crAL038高8-10倍，但在MIC测定中发现抗微生物活性较低。类似地，PGN测定结果表明crAL038的裂解活性仅比crAL039高2-3倍。然而，它们各自的MIC值表明，crAL038对产气荚膜梭菌CP6的抑制效果比crAL039高至少一个数量级。造成这些差异的原因可能是MIC测定中存在的各种不明确的因素并不存在于PGN测定中。例如，41℃的内溶素活性和稳定性、活的产气荚膜梭菌细胞引起的生长竞争和PGN修复、不同衣藻菌株产生的内源性抑制组分的相对量，和/或内溶素对键的不同切割对活细胞的细胞壁完整性具有不同的破坏性影响。然而，结果显示在衣藻菌株中表达并直接使用的内溶素对产气荚膜梭菌菌株CP6为抗微生物的。

实施例25：来自表达内溶素的莱茵衣藻菌株crAL075、crAL076、crAL077、crAL078、 crAL079和crAL080的提取物的表征

此实施例比较了从表达从生物信息学检索中发现的额外内溶素的莱茵衣藻菌株制备的提取物的裂解活性。构建和表征的菌株总结在表21中。基于表征的Pfam序列比对推定的GH25内溶素为GH25phiS63(crAL075)、AMI3CPF4969(crAL079)和GH25CPFORC3(crAL041和crAL045)。基于表征的Pfam序列比对推定的AMI2内溶素为AMI2phiZP2(crAL038和crAL039)和GH25CPF4969(crAL080)。基于表征的Pfam序列比对推定的AMI3内溶素为AMI3CPFORC25(crAL076)、AMI3CPJP55(crAL077)和AMI3phi24R(crAL078)。除了crAL045、crAL038和crAL039之外的所有菌株都是通过在16S启动子和psaA 5'UTR的调控下，将含有该内溶素基因的标记版本的基因盒整合到叶绿体基因组中petB基因的下游而构建的。crAL038菌株携带AMI2phiZP2基因，也在16S启动子和psaA 5'UTR的调控下，但该基因盒被整合到psbH基因的下游。实施例24中先前表征的菌株crAL035、crAL038、crAL039和crAL045用作对照。源自实施例24中描述的crAL057菌株并且共表达AMI2phiZP2和GH25CPFORC3的共表达菌株crAL058也包括在该组中作为对照菌株。

实验室规模的藻类培养、可溶性提取物制备、全细胞Cp6点测定和PGN降解测定以与实施例24中所描述的类似地进行。对于点测定，以5mg TSP/mL(1×储备液)制备藻类提取物，然后使用pH 7.0的PBS缓冲液进行2倍连续稀释，多达2次。将5μL每种提取物的1倍、2倍和4倍稀释液点样在嵌有产气荚膜梭菌Cp6细胞的固体琼脂培养基上，并在37℃孵育过夜用于清除区发展。对于PGN测定，每种藻类提取物以10mg TSP/mL(10×储备液)制备，然后经2倍连续稀释，多达7次至78μg TSP/mL。来自菌株crAL035的提取物经2倍连续稀释仅3次至1250μg TSP/mL。根据图34中所示的板布置，将10μL/孔的提取物稀释液分配到96微孔板中。对于未加载提取物的“仅PGN”对照，分配10μL/孔的PBS(pH 7.0)。通过分配90μL/孔PGN测定储备液启动PGN测定。将PGN测定板在平板振荡器上快速混合，并在酶标仪上在OD620nm处在室温(即～23℃)监测由于PGN降解导致的浊度降低长达4小时。使用Labtech LT-4500酶标仪的分析软件确定PGN降解曲线的初始速率。通过绘制初始PGN降解速率与提取物加载浓度并提取线性回归曲线的斜率来计算活性。

图35B示出全细胞CP6点测定结果。根据清除区的大小和清晰度对内溶素活性进行定性评估。对照提取物的表现与实施例24中观察到的相似。来自crAL078-crAL080的衣藻提取物均表现出与crAL038相似或更高的活性，但显著低于crAL041的活性。在测试的三种推定的GH25内溶素表达菌株中，GH25CPFORC3表达菌株(crAL041)产生的清除区明显大于没有显示活性的AMI3CPF4969表达菌株(crAL079)或GH25phiS63表达菌株(crAL075)。该最后结果令人惊讶，因为在实施例4中，GH25phiS63被确定为大肠杆菌中最高过表达的内溶素，并且其还显示出高活性。结果表明，表达宿主，无论是大肠杆菌还是莱茵衣藻，都会影响内溶素的表达和/或活性。在点测定中，crAL078(表达AMI3phi24R)似乎是比crAL076(表达AMI3CPFORC25)更有活性的表达AMI3的提取物。没有观察到在crAL077中表达的AMI3CPJP55内溶素的活性，类似于实施例8中当内溶素在大肠杆菌中表达时所见的结果。

PGN降解测定允许对不同藻类提取物的裂解活性进行量化和排序(图36和图37)。结果证实了从全细胞CP6点测定中得出的观察结果。PGN测定结果证实了crAL075和crAL077提取物缺乏活性。这些提取物的PGN降解曲线类似于crAL035对照提取物的降解曲线(图36F)，其又类似于仅悬浮在PBS(pH 7.0)中的PGN的背景降解(图36A和图36B)。此外，PGN测定有助于鉴定每种内溶素酶类中最有活性的提取物。crAL041为最有活性的推定的GH25表达提取物，crAL080为最有活性的AMI2表达提取物，crAL076为最有活性的推定的AMI3表达提取物。crAL041提取物的胞壁酸酶活性比crAL079提取物活性高约2倍。类似地，crAL076、crAL078和crAL080的L-丙氨酸酰胺酶活性比crAL038的该活性高约2.4、1.2和6.2倍。总之，表达内溶素的提取物可以以从最高到最低的PGN降解活性排序如下：crAL041、crAL079、crAL080、crAL076、crAL078和crAL038。crAL075和crAL077提取物没有表现出任何PGN降解活性，可能是因为表达的内溶素没有活性。该最后结果特别令人惊讶，因为GH25phiS63内溶素在大肠杆菌中过表达并显示出高活性。此结果强调了宿主对活性内溶素的表达的巨大影响。

实施例26：工程化的莱茵衣藻菌株crAL039和crAL045生物质的生物反应器培养和 喷雾干燥生产

实施工程化的衣藻菌株crAL039和crAL045的生物反应器培养和喷雾干燥生产，以了解其在大规模生产中的实用性，以及评估可从小规模生产中恢复的内溶素抗微生物活性的水平。

使用能够在分批补料条件下运行的5L叶轮驱动生物反应器(ApplikonBiotechnolgy)，用于莱茵衣藻的培养。该生物反应器填充有4.6L修饰的TAP培养基。这种修饰的TAP培养基是通过每升溶解以下物质制备的：576.4mg NH₄CH₃CO₂(Merck)、53.8mg(CH₃COO)₂Ca.H₂O(Merck)、100mg MgSO₄.7H₂O(Merck)、100mg K₂HPO₄(Merck)、60mg KH₂PO₄(Merck)、35mL 1×浓缩Kropat的微量金属[1]。随后将该生物反应器、所有连接的管道、过滤器、玻璃瓶和培养基在121℃以31.18psi高压灭菌20分钟，然后在AMA270高压釜(Astell)中使用。将88.67g NH₄CH₃CO₂、22.06g K₂HPO₄、11.17g KH₂PO₄、14.30g MgSO₄.7H₂O、7.69g(CH₃COO)₂Ca.H₂O加入到Kropat的微量金属溶液中以制成2L，通过将1171mL Milli-Q过滤水与620mL冰乙酸(Merck)和209mL 10×浓缩Kropat的微量金属溶液混合，制备模拟基础培养基的浓缩饲料。将饲料用0.22μm真空杯过滤器过滤除菌并在室温储存。在每次分批补料生物反应器培养之前，将1.5L饲料转移到连接至生物反应器的2L无菌玻璃瓶中。ApplikonBiotechnology控制单元用于自始至终保持培养温度(25℃)、pH(7.00)、搅拌(400RPM)和空气流速(3L/min)。根据需要用注射器手动注射少量消泡剂(聚丙二醇2000，ThermoFisherScientific)。

为了制备衣藻菌株接种物(crAL04或crAL039)，将来自TAP储存培养物并生长至稳定期的所需的菌株接种至含有50mL的TAP培养基[2]的摇瓶中，在恒定光照条件(50-500μmol m^-2s^-1)下在光照柜(LEEC)中以140rpm在定轨振荡器上持续3-4天。然后，通过在2L摇瓶中用40mL稳定期衣藻培养物接种400mL新鲜TAP培养基，以1:10稀释培养物，并且允许在相同条件下再生长3天。然后将400mL接种物无菌添加至预装有4.6L修饰的TAP培养基的生物反应器中，使得终体积达到5L。每天从取样口抽取30mL培养时间点，并测量750nm处的OD以监测培养物生长并估计细胞密度。分批补料的培养物在没有光照的情况下根据需求生长5-7天。

生物反应器培养物以1L增量进行收获，其中细胞通过在Sorvall Lynx 6000离心机(ThermoFisher Scientific)中以15,000×g离心15分钟而被沉淀，并去除上清液。汇集来自每个1L离心瓶的生物质并标准化至约300-400的OD750nm。随后使用实验室规模的Büchi-290喷雾干燥器(Büchi Labortechnik AG)对浓缩的生物质进行喷雾干燥。喷雾干燥条件如下：入口180℃、泵速6mL/min、吸气器气流速率38m³/h和喷雾气体流速667L/h。通过连接到位于旋风分离器下方以促进热量散失的延伸部分的收集罐收集生物质。一旦收集，则将生物质放入容器中，称重以确定产量，并在4℃储存。

图38示出在5L生物反应器中生长的莱茵衣藻菌株crAL045和crAL039的生长曲线。当培养物处于指数期晚期/稳定期早期时，在生长6天后在约41OD750nm处收获菌株crAL045(图38A)。细胞被喷雾干燥，得到总产量为25.8g的干燥的生物质。当培养物处于指数期晚期/稳定期早期时，在生长5天后在约116OD750nm处收获菌株crAL039(图38B)。培养物产量为42g的喷雾干燥的生物质。

参考文献

[1]J.Kropat等,“A revised mineral nutrient supplement increasesbiomass and growth rate in Chlamydomonas reinhardtii,”Plant J.,vol.66,no.5,pp.770–780,2011.

[2]E.H.Harris,The Chlamydomonas Sourcebook Volume1:Introduction toChlamydomonas and Its Laboratory Use,Second edi.Academic Press,2009.

实施例27：使用crAL039和crAL045生物质的产气荚膜梭菌Cp6菌株的MIC/MBC测定

使用MIC/MBC测定评估莱茵衣藻菌株crAL045和crAL039及其从实施例26生产的喷雾干燥的生物质的抗微生物活性。

与实施例15类似地进行评估由crAL045和crAL039生物质生产的可溶性提取物的抗微生物活性的MIC/MBC测定，但具有以下变化：1)Cp6过夜培养稀释液在BHI+C培养基中而不在LB培养基中；2)～10⁵个细胞/mL，与实施例15中加载的细菌悬液相比，加载了高一个数量级的细菌悬液；3)在厌氧室中过夜孵育包括适度振荡；以及4)使用由喷雾干燥的生物质生产的表达内溶素的衣藻可溶性提取物代替从大肠杆菌表达的纯化的内溶素。

为了从生物质中制备可溶性提取物，制备300mg/mL喷雾干燥的crAL045和crAL039生物质(来自实施例26)并重悬于2mL试管中的PBS(pH 7.0)中。通过3次冻融并使用Soniprep150超声仪(MSE)的超声处理(10μm振幅，10秒开/关，持续10个循环)来裂解悬浮液。全细胞提取物在5430R离心机(Eppendorf)中以31,030×g离心45分钟，并将可溶性提取物上清液转移到新试管中。可溶性提取物的TSP含量使用Bio-Rad DC蛋白质测定法确定。crAL045和crAL039的可溶性提取物均使用PBS(pH 7.0)缓冲液稀释至30mg TSP/mL，制成10×储备液。该可溶性提取物使用PBS(pH 7.0)缓冲液经2倍连续稀释11次，或有效稀释2048倍。为了启动MIC测定，根据图39中的布置将10μL/孔的2倍连续稀释的可溶性提取物分配到96孔微量滴定板(Starlab)中，接着分配90μL/孔的～10⁵个细胞/mL Cp6，得到有效加载浓度。crAL045提取物的连续稀释液以3次重复进行测定，而crAL039提取物以2次重复进行测定。使用粘性铝密封件(Starlab)密封MIC测定板，并且在MACS-MG500厌氧室(Don Whitely)中的平板振荡器上稍微混合，于41℃孵育过夜。如实施例15中所述类似地进行MIC测定中Cp6细菌加载的确认。使用目测以及在Labtech LT-4500酶标仪上的OD620nm读数确定过夜孵育(～16小时)后的生长抑制。基于发现没有可见的细菌生长的最低提取物浓度评估MIC值。为了评估提取物的杀菌效果，将5μL/孔的过夜MIC测定板接种到100μL/孔的BHI+C培养基中以制备MBC测定板。使用粘性铝密封件(Starlab)密封MBC测定板，并且在厌氧室中的平板振荡器上稍微混合，于37℃孵育过夜。过夜孵育(～20小时)后，通过目测孔来评估提取物的杀菌效果。基于发现没有可见的生长的最低提取物浓度评估MBC值。

使用MIC/MBC测定对从分批补料生物反应器培养物生产并喷雾干燥的菌株crAL045和crAL039的抗微生物活性确定，显示它们对产气荚膜梭菌菌株Cp6为高度活性的。crAL045和crAL039提取物的MIC值分别确定为47μg TSP/mL和375μg TSP/mL(图40)。对于crAL045和crAL039，每种提取物的MBC值与其相应的MIC值相比增加了2倍，分别达到94μgTSP/mL和750μg TSP/mL。结果还显示，它们的抗微生物活性排序与使用从湿摇瓶沉淀获得的可溶性提取物(实施例24)的那些相匹配，其中crAL045比crAL039活性高得多。MIC和MBC值显示crAL045提取物的活性比crAL039提取物高约10倍。有趣的是，生物反应器生产的提取物似乎比摇瓶提取物更有活性，这是因为生物反应器提取物能够以低得多的MIC值进行抑制。因此，结果表明，分批补料生物反应器培养和喷雾干燥为生产具有高抗微生物活性的工程化的衣藻菌株的可行方法。

实施例28：莱茵衣藻提取物增强纯化的内溶素的活性(PGN测定)

来自实施例24、25和26的结果表明，来自表达重组内溶素的莱茵衣藻菌株的提取物对产气荚膜梭菌细胞以及从这些细胞中分离的肽聚糖具有高活性。令人惊讶的是，这些提取物的活性高于基于藻类中重组蛋白质表达的水平和从大肠杆菌中纯化的纯化内溶素的活性所预期的活性。对这种高活性的一个合理解释是，藻类细胞提取物起到了增强内溶素活性的作用，这种作用以前没有报道过。为了确认莱茵衣藻提取物对内溶素活性的增强效果，并评估这是否也适用于来自不同酶类别的内溶素，从不同的莱茵衣藻菌株中制得的提取物与从大肠杆菌中重组表达和纯化的不同酶类别的内溶素组合。研究了藻类提取物对内溶素的增强效果，并且使用PGN降解测定确定其存在。

测试了四种不同的莱茵衣藻提取物，以研究它们对内溶素活性的增强效果。这些包括在黑暗和光照条件下培养的宿主菌株crAL035(在实施例22中描述的)和在黑暗中培养的野生型菌株crAL053和crAL054。菌株crAL053和crAL054分别对应于常用的莱茵衣藻实验室菌株CC-124和CC-1690。CC-124(137c)是1945年在美国马萨诸塞州阿默斯特附近分离的mt-野生型菌株。它是一种细胞壁菌株，是nit基因的突变体。该菌株购自衣藻资源中心(Chlamydomonas Resource Center)(www.chlamycollection.org)。CC-1690，也称为Sager21gr，是一种具有功能性nit基因的mt+野生型细胞壁菌株。此菌株为Saul Purton(UCL,伦敦,英国)赠送的礼物。三种莱茵衣藻菌株均不含内溶素基因。

莱茵衣藻菌株crAL035、crAL053和crAL054在黑暗条件下培养，与实施例24中所述类似(以下分别称为“35D”、“53D”和“54D”)。对于光照条件下培养的crAL035(以下简称“35L”)，将摇瓶培养物在光照柜(50-500μmol m^-2s^-1)中在设置为140RPM的定轨振荡器上于25℃孵育。摇瓶培养物的生长、收获和可溶性提取物的制备类似于实施例24。使用Bio-radDC蛋白质测定试剂盒确定总可溶性蛋白质(TSP)含量。使用PBS(pH 7.0)缓冲液将藻类提取物稀释至5mg TSP/mL。使用纯化的内溶素GH25CPFORC3(SEQ ID NO:1)、AMI3CPF4969(SEQID NO:11)、AMI2phiZP2(SEQ ID NO:3)和GH25CPF4969(SEQ ID NO:8)研究莱茵衣藻提取物的潜在增强效果。简而言之，大肠杆菌表达的GH25CPFORC3和AMI3CPF4969内溶素与FLAG标签融合，而AMI2phiZP2和GH25CPF4969内溶素与6×HIS标签融合以促进纯化。如先前在实施例10和实施例19中所述进行内溶素纯化。

使用与PBS(pH 7.0)缓冲液或莱茵衣藻提取物混合的纯化的内溶素进行PGN降解测定。在PBS(pH 7.0)缓冲液或莱茵衣藻提取物中制备纯化的内溶素的10×储备溶液(50-100μg/mL)，然后使用相应的稀释剂(缓冲液或5mg TSP/mL藻类提取物)连续稀释2倍多达6或7次。为了启动PGN测定，根据图41A或41B中的板布置分配10μL/孔的2倍连续稀释的内溶素，接着分配90μL/孔的PGN测定储备液，得到有效加载浓度。重复次数取决于PGN测定布置。对于“仅PGN”对照孔，将10μL/孔的每种稀释剂与90μL/孔的PGN测定储备液混合，重复4次。对于稀释液，包括加载了0μg/mL内溶素的仅PGN的对照，以确定它们的背景降解速率(如果有)。对于“PBS空白”对照孔，分配100μL/孔的PBS(pH 7.0)缓冲液，重复4次。将测定板在平板振荡器上简单混合，并使用Labtech LT-4500酶标仪上的动态读数功能在620nm在室温(即～23℃)连续监测PGN浊度的降低3-6小时，并且使用Labtech分析软件提取PGN降解曲线的初始速率。使用图42中描述的方程完成确定与在PBS(pH 7.0)缓冲液中相比藻类提取物对内溶素的PGN降解活性的增强倍数的计算。

首先，研究了四种不同的藻类提取物(35D、35L、53D和54D)对纯化的GH25CPFORC3和AMI2phiZP2内溶素的活性的影响。这些内溶素分别属于不同类别的酶，并且在细菌肽聚糖层的不同键处催化切割。需要确定藻类提取物是否增强两种内溶素酶类别。内溶素与不同浓度的缓冲液或藻类提取物混合，并监测PGN的相对降解速率。

图43、44和45中分别示出了2.5、1.25和0.63μg/mL加载浓度下GH25CPFORC3的PGN降解曲线。每幅图中的图形A-D比较了在PBS或不同藻类提取物中稀释的GH25CPFORC3的PGN降解。分析了2.5、1.25和0.63μg/mL浓度的降解曲线，用于评估与缓冲液中相比藻类提取物中内溶素的增强倍数(图42)。对于三种内溶素浓度(2.5、1.25、0.63μg/mL)，当内溶素在藻类提取物中稀释时PGN降解曲线的初始速率比内溶素在缓冲液中稀释时更高。藻类提取物对内溶素活性的增强效果在1.25或0.63μg/mL的降低的内溶素加载浓度下更明显且更高，并且根据藻类提取物，相对于其在缓冲液中的活性达到了～2.5增强倍数(图46)。在2.5μg/mL内溶素加载下，无法观察到藻类提取物对已经很快的PGN降解速率的增强。然而，该内溶素的额外稀释提高了用于检测藻类提取物提供的增强效果的测定灵敏度。在这些降低的加载浓度下，缓冲液中纯化的GH25CPFORC3内溶素表现出低的降解活性，但在1.25或0.63μg/mL浓度的藻类提取物存在下显著提高。也可以观察到藻类提取物在0.63μg/mL及以下时对内溶素的增强，但难以确定其增强倍数。在图47中给出GH25CPFORC3的加载浓度为0.31、0.16和0.08μg/mL时的PGN降解曲线。在此，比较在缓冲液或不同藻类提取物中稀释的内溶素的PGN降解曲线显示在每个浓度的单幅图形中，其中，图中的图形A、B和C分别对应于0.31、0.16和0.08μg/mL的加载浓度。很明显，在不同藻类提取物中稀释的内溶素的PGN降解比当内溶素仅在缓冲液中时增强。然而，由于在缓冲液中稀释的内溶素的陡峭的“悬崖状”降解行为，没有估计这些浓度下的增强倍数，在这些浓度下使初始速率拟合有问题，并指向未定义的3D网状PGN基质的复杂降解。从1.25至0.08μg/mL浓度的缓冲液中的内溶素可以看到PGN降解陡峭下跌的观察结果，其中，PGN降解陡峭下跌的开始随着浓度的降低而延迟。有趣的是，以2.5μg/mL加载时未观察到这种PGN降解的陡峭下跌。人们认为，曲线陡峭下跌的开始是由于在PGN的结构完整性突然失效之前，在减少的加载量下PGN降解的更加渐进的累积。随后，PGN降解以与内溶素的加载浓度相称的渐变速率继续。与此不同，在藻类提取物存在的情况下，对于内溶素根本没有观察到PGN降解的这种陡峭下跌，表明藻类提取物酶与内溶素同时有助于PGN降解。因此，测试的四种藻类提取物都能够类似地增强GH25CPFORC3的PGN降解活性，表明莱茵衣藻提取物的增强效果不限于单一物种。

与在缓冲液中稀释时相比，当在四种藻类提取物中稀释时，还观察到对于AMI2phiZP2内溶素的增强。图48示出，类似于GH25型内溶素GH25CPFORC3观察到的，该四种藻类提取物也能够增强AMI2phiZP2内溶素的活性。图48中的图形A至C示出了在缓冲液中稀释或在54D藻类提取物中稀释的内溶素的PGN降解曲线。该PGN降解曲线显示，在1.25μg/mL的较低内溶素浓度下，增强效果更加明显，其中取决于提取物，看到约2.2的增强倍数(图49)。由于AMI2phiZP2内溶素在缓冲液中稀释时的活性与背景降解速率(0μg/mL，图48C)实际上相同，因此无法完成在0.63μg/mL浓度及以下的增强倍数的估计。与此不同，稀释到相同浓度但在藻类提取物中的AMI2phiZP2的活性仍然为可以测量的，其甚至可以认为与在缓冲液中稀释的内溶素相比“无限”增强。因此，结果表明莱茵衣藻提取物能够增强来自两种不同酶类别的内溶素的活性，而与菌株和藻类生长条件无关。

其次，需要研究藻类提取物是否也会增强来自每种酶类别的其它内溶素。为此目的，纯化并测试了AMI3CPF4969和GH25CPF4969内溶素。先前测试的内溶素GH25CPFORC3和AMI2phiZP2内溶素也包括在内作为对照。PGN测定略有修改，以确保在降低的加载浓度时测定的重现性和更高的灵敏度，用于估计提取物增强倍数。在此，仅使用PBS(pH 7.0)缓冲液和5mg TSP/mL 54D提取物作为稀释剂。每种连续稀释的内溶素均进行3次重复测定，并使用新鲜纯化的CP6 PGN储备液以确保高重现性和平滑的降解曲线。

结果表明GH25CPFORC3(图50)和AMI2phiZP2(图51)的藻类提取物增强是可重现的并且使用3次重复是一致的。与之前观察到的类似，在降低的加载浓度下，提取物增强的程度更清楚地显示出来。有趣的是，比之前的PGN储备液相比，新鲜纯化的PGN储备液产生更平滑的降解曲线，并且似乎不那么难降解。这难以合理化，因为CP6 PGN分离是如实施例20中所述进行的。然而，可以理解，PGN纯化方案是粗略的，并且该PGN的许多特性是不确定的，包括其储存条件和长度如何可以影响其降解特性。新鲜PGN测定储备液的使用显示GH25CPFORC3的藻类提取物增强是显著的。图50的图形A-E示出了在不同加载浓度并在缓冲液或藻类提取物中稀释的内溶素的降解曲线。在0.31μg/mL浓度，可以观察到在缓冲液中稀释的内溶素与其在0.63μg/mL下的活性相比，PGN降解活性显著降低。这被认为与之前观察到的类似，其中，在降低的加载浓度下，降解以更渐进的速率发生，但不足以破坏PGN的结构完整性。并且，如果给予更多时间，会观察到PGN降解的“悬崖状”陡峭下跌。与此不同，在藻类提取物中稀释的内溶素在0.31μg/mL加载浓度甚至0.16μg/mL加载浓度时显示出快速的PGN降解。令人惊讶的是，在缓冲液中稀释的0.16μg/mL和0.31μg/mL浓度的GH25CPFORC3内溶素表现出几乎与背景降解速率一样低的降解速率，表明由藻类提取物引起的显著增强。还发现AMI2phiZP2内溶素的藻类提取物增强是可重现的，并且使用3次重复是一致的。然而，增强效果没有那么显著。这可能是由于AMI2型内溶素切割的PGN键的特定位点、丰度和/或可及性。然而，藻类提取物对GH25CPFORC3和AMI2phiZP2内溶素的增强效果被重现，并且根据内溶素而显著。

测试的其它内溶素AMI3CPF4969和GH25CPF4969也分别显示出图52和图53中藻类提取物的增强效果。可以进行类似的分析以评估藻类提取物对该内溶素的增强效果。AMI3CPF4969内溶素在藻类提取物的增强效果方面表现出类似于GH25CPFORC3内溶素的行为。在1.25μg/mL浓度，在缓冲液中稀释的AMI3CPF4969内溶素表现出比在2.5μg/mL显著降低的活性。与此不同，在藻类提取物中稀释的内溶素从2.5μg/mL到1.25μg/mL的浓度继续显示快速降解速率，并且显示出与低于0.63μg/mL浓度的背景相比也显著更高的降解速率。对于在缓冲液中稀释的内溶素而言，情况并非如此，因为0.63、0.31和0.16μg/mL的浓度都显示出与背景相似的降解速率。因此，结果表明藻类提取物显著增强了AMI3CPF4969的PGN降解活性。用另一种内溶素GH25CPF4969进行的PGN测定也显示出藻类提取物的增强效果(图53)。在低于1.25μg/mL的降低的内溶素浓度下观察到了增强。得出的结论是，藻类提取物增强了PGN降解活性，特别是GH25CPFORC3、AMI3CPF4969、AMI2phiZP2和GH25CPF4969内溶素的PGN降解活性，并且通常也对于两种内溶素类别。

总之，藻类提取物增强GH25CPFORC3、AMI3CPF4969、AMI2phiZP2和GH25CPF4969内溶素的PGN降解活性。来自不同类别的内溶素的增强倍数如图54所示。在测试的这个特定系统中，对于GH25CPFORC3和AMI3CPF4969内溶素的提取物增强分别高达约69倍和44倍。对于AMI3CPF4969的提取物增强也可以说是“无限”增强，因为在缓冲液中稀释的内溶素在低于0.63μg/mL的浓度下表现出与背景相似的降解速率。在测试的这个特定系统中，AMI2phiZP2和GH25CPF4969内溶素都被藻类提取物增强高达约2倍。

实施例29：莱茵衣藻提取物增强纯化的内溶素的活性(MIC测定)

实施例28表明，源自不同莱茵衣藻菌株的藻类提取物能够增强内溶素的PGN降解活性。需要确定这种增强的活性是否也会转化为对活跃生长的产气荚膜梭菌菌株Cp6细胞的更高的抗微生物活性。此外，已知莱茵衣藻提取物含有如脂肪酸的内源性非酶抑制化合物，且叶绿素衍生物具有可以进一步增强内溶素的活性的抗微生物活性。为了对此进行研究，选择内溶素GH25CPFORC3(SEQ ID NO:1)和AMI2phiZP2(SEQ ID NO:3)作为来自不同类别的代表性内溶素，并且在MIC测定中在crAL054藻类提取物存在下评估它们的抗微生物活性。

crAL054提取物如实施例28所述从在黑暗中生长的细胞制备，并使用PBS(pH 7.0)稀释至5mg TSP/mL。如前所述(分别为实施例10和实施例19)制备在大肠杆菌中表达的纯化的内溶素GH25CPFORC3和AMI2phiZP2。使用PBS(pH 7.0)或5mg TSP/mL 54D藻类提取物稀释剂将纯化的内溶素储备液稀释为850μg/mL GH25CPFORC3和900μg/mL AMI2phiZP2(10×内溶素储备溶液)。随后，使用相应的稀释剂将内溶素连续稀释2倍多达11次。

除了以下修改外，MIC测定方法和条件与实施例15相似：(1)将产气荚膜梭菌Cp6菌株的过夜培养物在BHI+C培养基中，而不是在LB培养基中稀释；(2)将纯化的内溶素在PBS(pH 7.0)缓冲液或5mg TSP/mL 54D藻类提取物中稀释。为了启动MIC测定，根据图55A中的板格式分配10μL/孔的2倍连续稀释的可溶性提取物，然后分配90μL/孔的～10⁴个细胞/mL的产气荚膜梭菌Cp6菌株培养物，得到有效加载浓度。对于每种稀释剂，“生长对照”与“培养基对照”孔也包括在3次重复中。对于生长对照，将10μL/孔稀释剂与90μL/孔10⁴倍稀释的细菌悬液混合。对于培养基对照，10μL/孔稀释剂与90μL/孔BHI+C培养基混合。使用粘性铝密封件密封MIC测定板，并且在厌氧室中的平板振荡器上稍微混合，于41℃孵育过夜。用于MIC测定的产气荚膜梭菌Cp6培养物的CFU测定与实施例15中所述类似地进行。使用目测以及酶标仪上的OD620nm读数确定过夜孵育后的生长抑制。MIC值对应于完全抑制细菌生长的最低内溶素浓度。MIC测定结果表明，与PBS(pH 7.0)相比，当存在500μg TSP/mL时纯化的内溶素GH25CPFORC3和AMI2phiZP2均得到增强。

图55B示出当GH25CPFORC3和AMI2phiZP2内溶素在PBS缓冲液中稀释时，它们的MIC值分别确定为1.1μg/mL和5.6μg/mL。有趣的是，当内溶素在藻类提取物中稀释时，GH25CPFORC3和AMI2phiZP2内溶素的MIC值分别下降至0.4μg/mL和1.4μg/mL。结果表明，在MIC测定中，与在缓冲液中时相比，该提取物将纯化的GH25CPFORC3和AMI2phiZP2内溶素活性分别增强了约2.5倍和4倍。PBS和藻类提取物的生长对照显示，500μg TSP/mL提取物本身对产气荚膜梭菌Cp6菌株没有抑制性。总之，此结果表明藻类提取物增强了内溶素的抗微生物活性。因为对于属于两种不同的内溶素家系的GH25CPFORC3和AMI2phiZP2内溶素都观察到了这种作用，所以可以可靠地得出结论：藻提取物的作用不限于一种特定类别的内溶素。

实施例30：组合使用的衣藻提取物的协同效应(PGN测定)

之前，使用PGN降解测定已经表明，当组合使用时，内溶素之间存在协同效应(实施例21)，并且衣藻提取物也增强了内溶素活性(实施例28和29)。因此，当直接地且组合使用表达内溶素的衣藻提取物时，需要评估这些协同效应是否仍然存在。此外，包括两种表达不同内溶素的衣藻提取物以及GH25CPFORC3/AMI2phiZP2共表达提取物，以增加用于协同效应的测试的组合的数量。在此，如果提取物组合的初始降解速率大于单独使用时每种提取物的速率之和，则确定提取物组合为协同的。

研究了不同衣藻提取物组合在PGN降解测定中的协同效应。它们包括来自以下组合中的表达内溶素的提取物：1)crAL041/crAL038，2)crAL041/crAL080，3)crAL045/crAL076，4)crAL045/crAL078，5)crAL079/crAL076，6)crAL038/crAL076，以及7)crAL076/crAL080。此外，将共表达GH25CPFORC3和AMI2phiZP2内溶素的crAL058提取物与crAL076提取物(仅表达AMI3CPFORC25)组合以制成组合8或与crAL080提取物(仅表达GH25CPF4969)组合以制成组合9，以研究组合使用的3种内溶素的协同效应。图56总结了组合的提取物与在每种提取物中表达的相应内溶素。

图56中示出的衣藻菌株于25℃在黑暗条件(即环境光)下在以～140rpm振荡的烧瓶内的TAP培养基中培养。如实施例24中所述，类似地制备可溶性提取物。使用Bio-rad DC蛋白质测定法确定可溶性提取物的TSP含量，并且使用pH7.0的PBS标准化为5mg TSP/mL(10×储备液)。除了使用衣藻提取物代替纯化的内溶素之外，棋盘PGN测定的设置与实施例21中所述类似。简而言之，在一个96微孔板中完成了两次棋盘PGN测定，具有用于500μg TSP/mL的1×提取物起始浓度的示例性样品布局(图57)。10×列提取物储备液(即提取物1或3)经2倍连续稀释6次至78.1μg/mL，而10×行提取物储备液(即提取物2或4)经2倍连续稀释4次至313μg/mL。将10μL/孔的相应的提取物1或3的稀释液分配到适当的列中，并且类似地，将10μL/孔的相应的提取物2或4的稀释液分配到适当的行中。将10μL/孔PBS(pH 7.0)添加到列6和12(分别仅提取物1或3的稀释液)中。类似地，将10μL/孔PBS(pH 7.0)添加到行H孔(仅提取物2或4的稀释液)中。确保H6和H12孔(“仅PGN”对照，具有0μg/mL内溶素)总共含有20μL/孔PBS(pH 7.0)。通过分配80μL/孔的PGN测定储备液启动PGN测定，从而有效地将每种提取物稀释10倍。每个孔中的提取物加载对应于指示的行和列加载浓度。将测定板在平板振荡器上稍微混合，并且在室温(即～23℃)使用Labtech LT-4500酶标仪的动态读数功能在620nm处连续监测2-4小时的PGN浊度的降低。

对衣藻提取物的9种不同组合的评估表明这些组合为协同的。这是基于当两种提取物一起使用时的组合速率是否大于每种提取物的初始PGN降解速率的总和，或由如前所述的测定的终点处的降解量确定的。发现各种衣藻提取物组合存在协同效应。两种不同提取物之间的协同效应的示例可见于图58，其中使用了crAL041(表达GH25CPFORC3)和crAL038(表达AMI2phiZP2)提取物。当500μg TSP/mL crAL041和500μg/mL crAL038提取物一起使用时，它们的组合的速率(0.111OD/hr)被确定为大于它们单个速率的总和(0.085OD/hr)。在crAL041和crAL038提取物的250/250、125/125和62.5/62.5μg TSP/mL加载浓度比下，观察到具有改善的组合速率的类似协同效应。对以下提取物组合类似地实施对提取物之间的协同效应存在的评估和定性：crAL041/crAL080(图59)、crAL045/crAL076(图60)、crAL045/crAL078(图61)、crAL079/crAL076(图62)、crAL038/crAL076(图63)和crAL076/crAL080(图64)。结果表明提取物组合确实为协同的。

这些结果证实了来自实施例21的证据，其中发现了不同的纯化的内溶素组合为协同的。例如，发现纯化的GH25CPFORC3和AMI2phiZP2内溶素的组合为协同的(图21)，并且还发现表达相同内溶素的它们相应的衣藻提取物crAL041和crAL038为协同的。这表明除了衣藻提取物的增强效果存在之外，内溶素组合的协同效继续存在。此外，未在实施例21中测试的纯化的内溶素组合也会为协同的。例如，未在实施例21中测试纯化的GH25CPFORC3和AMI3CPFORC25内溶素的组合，但是它们分别在相应衣藻提取物crAL045和crAL076中的表达显示为协同的。

衣藻提取物的测试还表明，3种内溶素的组合能够为协同的。如上所述，当组合使用时，纯化的GH25CPFORC3和AMI2phiZP2内溶素(实施例21)以及衣藻提取物crAL041(表达GH25CPFORC3)和crAL038(表达AMI2phiZP2)均被发现为协同的。因此，令人惊讶的是，当crAL058提取物(表达GH25CPFORC3和AMI2phiZP2)与在crAL080提取物中表达的第三种GH25CPF4969内溶素组合时，发现也为协同的(图65)。当共表达crAL058提取物和crAL076提取物(表达AMI3CPFORC25)组合使用时，也观察到了协同效应，如图66所示。因此，当前实施例中的结果表明内溶素之间的协同效应不会受到提取物增强效果的负面影响。另外，结果显示了组合使用3种内溶素时的协同效应的两个示例。

总体而言，当前实施例和实施例21中的结果表明，通过常规优化所用酶的特定组合及其加载浓度和内溶素比率，能够实现对内溶素之间的产气荚膜梭菌菌株CP6的PGN降解的协同效应。

实施例31：组合使用的衣藻表达的内溶素提取物的协同效应(MIC测定)

根据实施例30的结果，棋盘MIC测定也用于证实当组合使用时的来自藻类生物质的衣藻表达的内溶素提取物的协同效应。如实施例26中产生的分别表达GH25CPFORC3和AMI2phiZP2的生物质crAL045和crAL039用作代表性衣藻表达的内溶素提取物，以显示PGN测定结果与MIC测定相关。

该棋盘MIC测定按照如下执行。除了以下修改外，MIC测定方法和条件与实施例15相似：1)Cp6过夜培养稀释液在BHI+C培养基中而不在LB培养基中；2)使用生物质生产的衣藻可溶性提取物代替纯化的内溶素；以及3)使用棋盘板布置。

制备50mg/mL喷雾干燥的crAL045和crAL039生物质(来自实施例26)并重悬于PBS(pH 7.0)中。将悬浮液通过反复冻融(3×)并使用Soniprep 150超声粉碎机进行超声处理(10μm振幅，5秒开/关，持续15个循环)来裂解。在Eppendorf 5430R离心机上以31,030×g离心全细胞提取物30-45分钟，并且将可溶性提取物上清液转移到单独的试管中。进行Bio-Rad DC蛋白质测定以确定可溶性提取物的TSP。纯crAL045和crAL039提取物(10×储备液)的TSP含量分别测定为7.5mg TSP/mL和6.7mg TSP/mL。根据图67中的96微孔样品布置设置棋盘MIC测定。纯crAL039提取物经2倍连续稀释6次至104.7μg/mL，而纯crAL045提取物经2倍连续稀释10次至7.3μg/mL。将5μL/孔的相应的crAL039提取物稀释液分配到适当的列中，并且类似地，将5μL/孔的相应的crAL045提取物稀释液分配到适当的行中。将5μL/孔PBS(pH7.0)添加到列12的孔(仅crAL039提取物稀释液)和行H的孔(仅crAL045提取物稀释液)中。确保孔H12(生长对照，具有0μg/mL内溶素)总共含有10μL/孔PBS(pH 7.0)。为了启动MIC测定，根据图67中的板格式分配10μL/孔的2倍连续稀释的可溶性提取物，然后分配90μL/孔的～10⁴个细胞/mL的Cp6，得到有效加载浓度。每个孔中的提取物加载量对应于指示的行和列加载浓度。使用粘性铝密封件密封MIC测定板，并且在MACS-MG500厌氧室(Don Whitely)中于41℃适度振荡，孵育过夜。使用目测以及在Labtech LT-4500酶标仪中的OD620nm读数确定过夜孵育后的生长抑制。单独使用的crAL045和crAL039的MIC值是基于发现没有可见的细菌生长的最低浓度来确定。crAL045和crAL039提取物之间的协同效应的存在是通过使用图68中描述的方程计算部分抑菌浓度(FIC)指数[1-4]来确定。协同组合是指组合导致FIC值≤0.5时的组合。累加效应定义为0.5<FIC≤4，而当FIC>4时则为拮抗效应。

棋盘MIC测定结果表明，组合使用的crAL045和crAL039内溶素提取物相对于它们各自对～2.1×10⁴个细胞/mL的产气荚膜梭菌菌株Cp6的MIC值协同提高(图69A)。单独crAL045提取物的MIC值为23.4μg TSP/mL(板布置中的孔H5)，而单独的crAL039提取物的MIC值为167.5μg TSP/mL(板布置中的孔B12)。然而，对于crAL045和crAL039提取物，当这两种提取物分别以5.9μg TSP/mL和41.9μg TSP/mL的加载浓度组合时(板布置中的孔D7)，在计算出它们的部分抑制浓度指数值为0.5(示例性计算：5.9/23.4+41.9/167.5＝0.5)后，发现该组合为协同的。图69B清楚汇总了与单独使用每种提取物时相比，抑制Cp6细胞生长所需的每种提取物crAL045和crAL039显著下降。由使用crAL045和crAL039提取物的棋盘PGN测定结果以及使用纯化的GH25CPFORC3和AMI2phiZP2内溶素的棋盘PGN测定结果证实了这种协同效应。这表明，当在实施例21和30中组合使用时显示为协同的内溶素在棋盘MIC测定中也会为协同的。

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表1

在生物信息学搜索过程中发现了11个全长内溶素序列。每个全长序列都有一个SEQ ID号，括号中提供了发明人的命名。

表2

所有11个全长序列都具有N端催化结构域。N端催化结构域的氨基酸序列列于下表中。

表3

由SEQ ID NO:1、2、3、5、6、8和9指定的全长序列各自具有C端细胞结合结构域，因此具有连接N端结构域和C端结构域以及连接两个C端结构域(如果存在两个C端结构域)的接头序列。接头序列的氨基酸序列列于下表中。

表4

由SEQ ID NO:1、2、3、5、6、8和9指定的全长序列各自具有一个或多个C端细胞结合结构域。C端结合结构域的氨基酸序列如下表所示。由SEQ ID NO:1和5指定的多肽具有两个C端细胞结合结构域。这些被单独和一起列出。

表5

为大肠杆菌表达菌株Rosetta^TM(DE3)pLysS中的内溶素重组表达而构建的质粒及其相应的细菌菌株ID的列表。使用亲本ecAL002质粒构建内溶素表达载体，其中将内溶素基因序列克隆到质粒的MCS2中。随后，将质粒转化到Rosetta^TM(DE3)pLysS表达菌株中。

质粒ID	内溶素	标签	接头序列<sup>1</sup>
				ecAL002	-	-	-
ecAL005	AMI2CPJP838	C端HA	GSAGSG
				ecAL006	AMI2phiCPV4	C端HA	GSAGSG
ecAL007	AMI2phiZP2	C端HA	GSAGSG
				ecAL008	AMI3CPFORC25	C端Strep	GSAGSG
ecAL009	AMI3CPJP55	C端Strep	GSAGSG
				ecAL010	AMI3CPSM101	C端Strep	GSAGSG
ecAL011	AMI3phi24R	C端Strep	GSAGSG
				ecAL012	AMI3CPF4969	N端FLAG	-
ecAL013	GH25CPFORC3	N端FLAG	-
				ecAL014	GH25phiS63	N端FLAG	-
ecAL015	GH25CPF4969	C端HA	GSAGSG
				plAL073	AMI2phiZP2	C端6×HIS	GSAGSG
plAL071	AMI2phiCPV4	C端6×HIS	GSAGSG
				plAL193	GH25CPF4969	C端6×HIS	GSAGSG

¹内溶素蛋白和标签之间的接头序列。

表6

大肠杆菌表达的内溶素及其对不同产气荚膜梭菌菌株(NCTC 2837、8235、8237、8238、8239、8359、8678和10578)的抗微生物活性的汇总。该表汇总了对不同的产气荚膜梭菌菌株以及新铺的细胞或细胞苔的点测定中澄清裂解物的抗微生物活性。还显示了大肠杆菌菌株和相应表达的内溶素。20μg/ml氨苄青霉素和1mg/mL溶菌酶的抗微生物活性也包括在内以供参考。抗微生物活性的存在用“+”表示，而抗微生物活性的缺乏用“-”表示。如果未对特定的澄清裂解物或菌株进行点测定，则将其表示为“n/a”。“CL”——细胞苔；“FP”——新铺的细胞。抗微生物活性评估仅基于清除区的存在，并未考虑晕圈的大小。这是因为点样澄清裂解物中的内溶素浓度(如从实施例4确定的)没有标准化。点测定结果普遍显示，在所测试的菌株中，20μg/ml的氨苄青霉素对新铺的细胞表现出抑制效果，但对细胞苔没有影响。1mg/mL的溶菌酶对受试菌株中的新铺的细胞和细胞苔通常没有影响。与此不同，取决于Cp菌株和特定的内溶素，某些内溶素对新铺的细胞和细胞苔都表现出溶菌活性。例如，bAL016(GH25CPFORC3)的澄清裂解物能够在新铺的细胞和细胞苔上以及所有筛选的Cp菌株上产生清除区。

表7

大肠杆菌表达的内溶素及其对不同非产气荚膜梭菌菌株(DSMZ 753、1351、6011、20083)的抗微生物活性的汇总。该表汇总了在指数生长期的细胞或稳定期细胞上测试的对不同的非产气荚膜梭菌物种的点测定中澄清裂解物的抗微生物活性。还显示了大肠杆菌菌株和相应表达的内溶素。20μg/ml氨苄青霉素和1mg/mL溶菌酶的抗微生物活性也包括在内作为抗微生物剂对照。抗微生物活性的存在用“+”表示，而抗微生物活性的缺乏用“-”表示。如果未对特定的澄清裂解物或菌株进行点测定，或者如果点测定结果不清楚，则将其表示为“n/a”。“CL”——细胞苔；“FP”——新铺的细胞。抗微生物活性评估与表6中所示的相似。点测定结果显示，20μg/ml的氨苄青霉素根据细菌物种对新铺的细胞表现出抑制效果，并且对细胞苔没有影响。1mg/mL的溶菌酶对受试细菌物种中的新铺的细胞和细胞苔通常没有影响。点测定结果也表明大肠杆菌表达的内溶素对筛选的非产气荚膜梭菌物种没有溶菌活性。

表8

纯化的内溶素对产气荚膜梭菌分离株和参照菌株(新铺的细胞)的生长抑制效果的汇总。(-)表示没有可检测到的细菌生长抑制，(+/-)表示可检测到的细菌生长抑制，(+)低的细菌生长抑制，(++)良好的细菌生长抑制，(+++)非常好的细菌生长抑制。在图7A中可以看到点测定板的示例。

表9

测试2总结了纯化的内溶素对产气荚膜梭菌分离株和参照菌株的溶菌活性。(-)表示无可见的裂解，+/-、+、++、+++对应纸盘周围越来越清晰的裂解晕圈。在图7B中可以看到点测定板的示例。

表10

内溶素在不同加载浓度(5、2.5、1.25和0.63μg/mL)和对不同产气荚膜梭菌参照菌株(NCTC2837、8237、8238、8239)的溶菌活性的总结。“t_50％裂解”参数定义为内溶素裂解其初始细胞悬液加载的50％所需的时间。平均值和标准偏差基于3次重复。除了AMI2phiCPV4以外，在较低的0.63μg/mL加载浓度下，不能从GH25CPFORC3和AMI2phiZP2裂解曲线中提取“t_50％裂解”值。这是因为浊度降低非常缓慢，并且OD620nm动态读数在裂解>50％之前终止。

t_50％裂解(分钟)，AVG

t_50％裂解(分钟)，STDEV

表11

对产气荚膜梭菌参照菌株的内溶素抗微生物效应的Δlog10、降低百分比和中值降低百分比值的总结。Log10降低值计算为未处理细胞对照反应与内溶素处理的细胞反应之比的log10。然后使用log10降低值来计算对于每种内溶素的活细菌的降低百分比。中值降低百分比值根据所有菌株的百分比降低值确定，包括在每个内溶素加载浓度下的三个生物学平行测定。

表12

过夜MIC测定样品布置。除了AMI2phiZP2之外，在每个加载浓度下，所有样品均重复2次进行测定。通过将5μL/孔的10倍浓缩样品与45μL/孔的1000倍稀释的稳定期培养物混合启动该测定。还包括培养基对照(5μL/孔PBS(pH 7.0)缓冲液+45uL的50μL/孔LB培养基)孔和生长对照(5μL/孔PBS(pH 7.0)缓冲液+45uL的1000倍稀释的稳定期培养物)孔的6次重复。

表13

GH25FORC3、AMI2phiCPV4和AMI2phiZP2内溶素对Cp6的最低抑制浓度和最低杀菌浓度。

MIC/MBC(ug/mL)

	溶菌酶	FORC3	V4	ZP2
					MIC	＞2500	1.6	16	16
MBC	＞2500	1.6	16	16

MIC/MBC(uM)

	溶菌酶	FORC3	V4	ZP2
					MIC	＞174	0.04	0.63	0.63
MBC	＞174	0.04	0.63	0.63

与溶菌酶相比的增强倍数

	溶菌酶	FORC3	V4	ZP2
					MIC	n/a	＞1563	＞156	＞156
MBC	n/a	＞1563	＞156	＞156

表14

纯化的内溶素对产气荚膜梭菌参照菌株的生长抑制和溶菌效果的总结。FP对应新铺的细胞，而CL对应于细胞苔。(-)表示没有可检测到的细菌生长抑制，(+/-)表示可检测到的细菌生长抑制，(+)低的细菌生长抑制，(++)良好的细菌生长抑制，(+++)非常好的细菌生长抑制。在图21中可以看到点测定板的示例。结果表明，GH25FORC3和AMI2phiCPV4之间协同相互作用的存在取决于Cp菌株。

表15

分配的连续稀释的内溶素储备液的96微孔板格式。根据96微孔板格式10μL/孔和100μL/孔LB培养基，将5μL/孔内溶素1和5μL/孔内溶素2连续稀释的储备液分别分配到生长对照孔和培养基对照孔中。

表16

96微孔MIC测定板中的有效单个内溶素加载量，以及加载的内溶素2与内溶素1的比率。加载的内溶素2与内溶素1的uM比率显示在它们各自的孔中。虚线描绘了在内溶素之间累加效应的情况下抑制线的形状。在该虚线下方和右侧没有生长的抑制孔表明存在增强的协同性抗微生物效果。

表17

96微孔MIC测定板中的有效单个内溶素加载量，以及加载的内溶素2与内溶素1的比率。加载的内溶素2与内溶素1的uM比率显示在它们各自的孔中。虚线描绘了在内溶素之间累加效应的情况下抑制线的形状。在该虚线下方和右侧没有生长的抑制孔表明存在增强的协同性抗微生物效果。

表18

用于构建大肠杆菌表达载体的引物序列。

表19

用于筛选同质莱茵衣藻转化体的引物。

表20

用于转化莱茵衣藻菌株的质粒。

表21

携带内溶素的微藻菌株的特征。

应当理解，所公开方法和产品的不同应用可以根据本领域的特定需要而调整。还应理解，本文所使用的术语仅出于对本发明的特定实施方案进行描述的目的而并非旨在限制。

如在本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一种(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”的使用包括复数的使用，除非上下文另外明确规定。因此，例如，提及“一种多肽”包括“多种多肽”等。

“多肽”在本文中在最广泛的含义使用以指两个或更多个亚基氨基酸、氨基酸类似物或其它肽模拟物的化合物。因此，术语“多肽”包括短肽序列以及更长的多肽和蛋白质。如本文所使用的，术语“多肽”与术语“蛋白质”可以互换使用。如本文所使用的，术语“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括D或L光学异构体，以及氨基酸类似物和肽模拟物。

本文引用的所有公开、专利和专利申请，无论是其上文还是下文，均通过引用其整体并入本文。

序列表

<110> 阿希坦有限公司

<120> 抗微生物内溶素多肽、组合物和制剂

<130> N415487WO

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<151> 2019-01-31

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<170> PatentIn版本3.5

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<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> GH25CPFORC3

<400> 1

Thr Lys Leu Arg Gly Ile Asp Val Ser Glu His Gln Gly Arg Ile Asn

1 5 10 15

Trp Glu Gln Val Lys Asp Gln Val Asp Phe Val Met Leu Arg Ala Gly

20 25 30

Tyr Gly Arg Asn Asn Ile Asp Lys Gln Phe Val Arg Asn Ile Gln Glu

35 40 45

Cys Asn Arg Leu Asn Ile Pro Val Gly Ile Tyr Trp Phe Ser Tyr Ala

50 55 60

Trp Asn Glu Glu Met Ala Lys Asn Glu Ala Lys Tyr Val Leu Glu Ala

65 70 75 80

Ile Lys Pro Tyr Lys Val Asp Tyr Pro Ile Ser Tyr Asp Leu Glu Tyr

85 90 95

Asp Thr Leu Asn Tyr Ala Lys Lys Asn Gly Val Thr Ile Gly Lys Arg

100 105 110

Leu Ala Thr Asp Met Ile Asn Val Phe Cys Ser Thr Ile Glu Asn Ala

115 120 125

Gly Tyr Lys Ala Met Asn Tyr Ala Asn Pro Asp Phe Ile Asn Asn Lys

130 135 140

Phe Tyr Ser Asn Glu Val Asn Tyr Pro Leu Trp Leu Ala Trp Tyr Gly

145 150 155 160

Val Ser Glu Asp Lys Ala Lys Ala Tyr Asn Ser Ala Ile Trp Gln Phe

165 170 175

Ser Glu Ser Gly Ser Met Asp Gly Ile Gly Thr Asn Ser Val Asp Met

180 185 190

Asn Tyr Cys Tyr Glu Asp Phe Leu Lys Lys Asp Phe Thr Leu Asp Asn

195 200 205

Ala Thr Thr Lys Asn Val Ser Thr Lys Leu Asn Ile Arg Ala Lys Gly

210 215 220

Thr Thr Asn Ser Arg Val Val Gly Ser Ile Pro Ala Asn Glu Lys Phe

225 230 235 240

Lys Ile Lys Trp Val Asp Glu Asp Tyr Leu Gly Trp Tyr Tyr Ile Glu

245 250 255

Tyr Asn Gly Ile Val Gly Tyr Val Asn Ala Asp Tyr Val Glu Lys Leu

260 265 270

Gln Met Ala Thr Thr His Asn Val Ser Thr Phe Leu Asn Val Arg Glu

275 280 285

Glu Gly Ser Leu Asn Ser Arg Ile Val Asp Lys Ile Asn Val Gly Asp

290 295 300

Ile Phe Arg Ile Asp Trp Val Asp Ser Asp Phe Ile Gly Trp Tyr Arg

305 310 315 320

Val Thr Thr Lys Asn Gly Lys Val Gly Phe Val Asn Ala Glu Phe Val

325 330 335

Lys Lys Leu

<210> 2

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> AMI2PHICPV4

<400> 2

Lys Ile Ile Gln Ser Asn Ile His Phe Asn Gly Asn Lys Ala Gly Gly

1 5 10 15

Asn Asn Pro Lys Glu Ile Ile Val His His Ser Glu His Ser Thr Ala

20 25 30

Asn Val Tyr Asp Ile Asp Arg Trp His Lys Asp Lys Gly Trp Cys Gly

35 40 45

Ile Gly Tyr His Tyr Phe Ile Asp Lys Gln Gly Asn Ile Tyr Thr Gly

50 55 60

Arg Pro Glu Asp Trp Thr Gly Ala His Cys Ile Asp His Asn Thr Lys

65 70 75 80

Ser Ile Gly Ile Cys Leu Gln Gly Arg Leu Gln Thr Glu Lys Val Thr

85 90 95

Asp Pro Gln Tyr Lys Ala Leu Leu Trp Leu Ile Gln Asp Ile Lys Asn

100 105 110

Arg Arg Gly Asn Met Pro Val Tyr Gly His Lys Glu Leu Asn Ser Thr

115 120 125

Asp Cys Pro Gly Asn Leu Asp Leu Asp Lys Leu Arg Arg Asp Leu Asn

130 135 140

Asn Glu Val Val Asp Thr Asn Asp Asp Glu Tyr Arg Glu Asn Ala Thr

145 150 155 160

Val Val Asn Val Ser Ser Tyr Leu Asn Val Arg Ser Lys Pro Ser Asp

165 170 175

Glu Ile Ile Gly Lys Leu Phe Pro Asn Glu Arg Leu Gln Val Asn Trp

180 185 190

Val Asp Ser Asp Tyr Leu Gly Trp Tyr Tyr Val Thr Tyr Arg Val Asn

195 200 205

Gly Thr Asn Lys Leu Lys Asn Gly Tyr Val Ser Ala Lys Tyr Ile Lys

210 215 220

Lys Asp

225

<210> 3

<211> 225

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> AMI2PHIZP2

<400> 3

Lys Ile Ile Gln Ser Asn Ile Tyr Phe Asn Gly Asn Lys Ala Gly Gly

1 5 10 15

Asn Asn Pro Lys Glu Ile Ile Val His His Ser Glu His Ser Thr Ala

20 25 30

Asn Val Tyr Asp Ile Asp Lys Trp His Lys Asp Lys Gly Trp Cys Gly

35 40 45

Ile Gly Tyr His Tyr Phe Ile Asp Lys Gln Gly Asn Ile Tyr Thr Gly

50 55 60

Arg Pro Glu Asp Trp Thr Gly Ala His Cys Ile Asn His Asn Thr Lys

65 70 75 80

Ser Ile Gly Ile Cys Leu Gln Gly Arg Leu Gln Ile Glu Lys Val Thr

85 90 95

Asp Ala Gln Tyr Lys Ala Leu Leu Trp Leu Ile Gln Asp Ile Arg Asn

100 105 110

Arg Arg Gly Asn Met Pro Val Tyr Gly His Lys Glu Leu Asn Ser Thr

115 120 125

Asp Cys Pro Gly Asn Leu Asp Leu Asn Lys Leu Arg Thr Asp Val Asn

130 135 140

Asn Lys Val Val Asp Ser Asn Gly Gly Tyr Thr Glu Asn Ala Thr Val

145 150 155 160

Val Asn Val Asn Ser Tyr Leu Asn Val Arg Ser Lys Pro Ser Asp Glu

165 170 175

Ile Ile Gly Lys Leu Phe Pro Asn Glu Arg Ile Gln Val Asn Trp Val

180 185 190

Asp Ser Asn Tyr Leu Gly Trp Tyr Tyr Ile Thr Tyr Arg Val Asn Glu

195 200 205

Thr Asn Lys Leu Lys Ser Gly Tyr Val Ser Ala Lys Tyr Ile Lys Lys

210 215 220

Asp

225

<210> 4

<211> 337

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> AMI3CPSM101

<400> 4

Lys Ile Ala Val Arg Gly Gly His Asn Phe Gln Ala Lys Gly Ser Ser

1 5 10 15

Ala Leu Ile Asp Glu Thr Ile Glu Asn Arg Lys Val Tyr Lys Ala Leu

20 25 30

Ile Lys Tyr Leu Ser Ile Ala Gly His Asn Val Ile Asp Val Thr Pro

35 40 45

Gly Glu Cys Asp Val Asn Thr Asp Leu Tyr Leu Gly Val Gln Lys Ala

50 55 60

Glu Asp Asn Asn Val Glu Leu Phe Ile Ser Ile His Phe Asp Lys Ala

65 70 75 80

Tyr Asp Lys Tyr Glu Gly Ala Leu Gly Thr Gly Thr Trp Ile Tyr Gly

85 90 95

Arg Gly Gly Lys Ala Glu Ile Tyr Ala Lys Arg Ile Val Asp Asn Leu

100 105 110

Ser Lys Gly Thr Gly Leu Lys Asn Arg Gly Val Lys Glu Asn Ser Lys

115 120 125

Leu Tyr Glu Leu Arg Lys Thr Ser Met Pro Ala Val Leu Val Glu Val

130 135 140

Cys Phe Cys Glu Ala Thr Glu Asp Val Arg Ile Tyr Lys Glu Lys Gly

145 150 155 160

Thr Asp Leu Ile Gly Lys Leu Ile Ala Glu Ala Ile Asn Gly Asp Glu

165 170 175

Ile Val Gly Gly Asp Thr Arg Pro Glu Asn Pro Glu Gly Ser Leu Lys

180 185 190

Glu Lys Phe Leu Lys Ser Thr Asn Ala Lys Ala Ile Ala Asn Leu Asp

195 200 205

Pro Arg Asp Asn Pro Ser Ser Ile Tyr Lys Asp Leu Gly Glu Ile Tyr

210 215 220

Lys Gly Glu Arg Ile Arg Val Leu Pro Glu Val Cys Asp Lys Lys Asp

225 230 235 240

Tyr Leu Pro Ile Ile Tyr Trp Lys Asp Thr Pro Asn Thr Glu Ser Gln

245 250 255

Lys Val Trp Val Asn Ala Asn Gln Asn Tyr Leu Lys Ile Asp Thr Asn

260 265 270

Ala Thr Val Ile Asn Val Val Thr Glu Leu Asp Ala Arg Tyr Thr Lys

275 280 285

Ser Lys Thr Ser Ser Lys Met Gly Tyr Val Lys Asn Gly Glu Arg Leu

290 295 300

Tyr Ile His Lys Ile Glu Asn Gly Tyr Ala Leu Gly Thr Tyr Phe Ala

305 310 315 320

Ser Asp Gly Tyr Lys Thr Ala Trp Phe Thr Ala Lys Tyr Ile Ser Leu

325 330 335

Asp

<210> 5

<211> 341

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> GH25PHIS63

<400> 5

Gln Ser Arg Asn Asn Asn Asn Leu Lys Gly Ile Asp Val Ser Asn Trp

1 5 10 15

Lys Gly Asn Ile Asn Phe Glu Ser Val Lys Asn Asp Gly Val Glu Val

20 25 30

Val Tyr Ile Lys Ala Thr Glu Gly Asn Tyr Phe Lys Asp Lys Tyr Ala

35 40 45

Lys Gln Asn Tyr Glu Gly Ala Lys Glu Gln Gly Leu Lys Val Gly Phe

50 55 60

Tyr His Phe Phe Arg Ala Asn Lys Gly Ala Lys Asp Gln Ala Asn Phe

65 70 75 80

Phe Ile Asp Tyr Leu Asn Glu Ile Gly Ala Val Asn Tyr Asp Cys Lys

85 90 95

Leu Ala Leu Asp Ile Glu Thr Thr Glu Gly Val Gly Val Arg Asp Leu

100 105 110

Thr Ser Met Cys Ile Glu Phe Leu Glu Glu Val Lys Arg Leu Thr Gly

115 120 125

Lys Glu Val Val Val Tyr Thr Tyr Thr Ser Phe Ala Asn Asn Asn Leu

130 135 140

Asp Ser Arg Leu Gly Asn Tyr Pro Val Trp Ile Ala His Tyr Gly Val

145 150 155 160

Asn Thr Pro Gly Ala Asn Asn Ile Trp Gly Ser Trp Val Gly Phe Gln

165 170 175

Tyr Ser Glu Asn Arg Ser Val Ala Gly Val Asn Gly Gly Cys Asp Met

180 185 190

Asn Glu Phe Thr Glu Glu Ile Phe Ile Asp Ser Ser Asn Phe Asn Leu

195 200 205

Asp Asn Ala Thr Thr Lys Asn Val Ser Thr Lys Leu Asn Ile Arg Ala

210 215 220

Lys Gly Thr Thr Asn Ser Lys Val Ile Gly Ser Ile Pro Ala Asp Glu

225 230 235 240

Thr Phe Lys Ile Lys Trp Val Asp Glu Asp Tyr Leu Gly Trp Tyr Tyr

245 250 255

Val Glu Tyr Asn Gly Val Val Gly Tyr Val Asn Ala Asp Tyr Val Glu

260 265 270

Lys Leu Gln Met Ala Thr Thr Tyr Asn Val Ser Thr Phe Leu Asn Val

275 280 285

Arg Glu Glu Gly Ser Leu Asn Ser Arg Ile Val Asp Lys Ile Asn Ser

290 295 300

Gly Asp Ile Phe Arg Ile Asp Trp Val Asp Ser Asp Phe Ile Gly Trp

305 310 315 320

Tyr Arg Ile Thr Thr Lys Asn Gly Lys Val Gly Phe Val Asn Ala Glu

325 330 335

Phe Val Lys Lys Leu

340

<210> 6

<211> 228

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> AMI3CPFORC25

<400> 6

Ser Lys Ile Phe Gly Leu Asp Ala Gly His Cys Thr Ser Gly Ala Asp

1 5 10 15

Thr Gly Ala Gln Gly Asn Gly Tyr Lys Glu Gln Asp Leu Thr Arg Gln

20 25 30

Val Val Thr Tyr Leu Ser Glu Tyr Leu Glu Lys Glu Gly His Thr Thr

35 40 45

Lys Tyr Cys His Cys Asn Ser Ala Ser Thr Val Asn Glu Ser Leu Arg

50 55 60

Tyr Arg Val Asn Lys Ala Asn Ser Ile Gly Val Asp Tyr Phe Val Ser

65 70 75 80

Ile His Leu Asn Ala Gly Gly Gly Val Gly Thr Glu Thr Tyr Ile Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Glu Ala Glu Arg Val Ala Lys Arg Val Asn Ser Lys

100 105 110

Leu Val Gln Tyr Gly Tyr Arg Asp Arg Gly Val Lys Val Gly Asn Leu

115 120 125

Tyr Val Ile Lys Asn Thr Asn Ala Pro Ala Ile Leu Val Glu Ile Cys

130 135 140

Phe Ile Asp Ser Ser Ser Asp Ile Ala Lys Phe Asn Ala Lys Ala Ile

145 150 155 160

Ala Lys Ala Ile Ala Glu Gly Leu Leu Asp Lys Thr Ile Asp Glu Val

165 170 175

Glu Lys Lys Pro Glu Ser Val Pro Asp Asn Thr Glu Asn Ser Asn Thr

180 185 190

Tyr Phe Arg Val Val Val Gly Ser Tyr Lys Asp Arg Glu Asn Ala Val

195 200 205

Lys Lys Gln Glu Glu Leu Lys Ala Lys Gly Glu Asp Ser Phe Leu Leu

210 215 220

Ala Tyr Lys Glu

225

<210> 7

<211> 211

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> AMI3PHI24R

<400> 7

Lys Ile Gly Ile Arg Asp Gly His Ser Pro Asn Cys Lys Gly Ala Ile

1 5 10 15

Gly Leu Arg Asp Glu Gln Ser Cys Met Arg Val Leu Cys Lys Glu Val

20 25 30

Ile Glu Ile Leu Glu Lys His Gly His Glu Val Val Tyr Cys Gly Ser

35 40 45

Asp Ala Ser Thr Gln Asn Ser Glu Leu Ser Glu Gly Val Arg Lys Ala

50 55 60

Asn Asn Ser Asn Val Asp Ile Phe Ile Ser Leu His Met Asn Ser Phe

65 70 75 80

Asn Gly Gln Ala Gln Gly Thr Glu Ser Leu Ile Ala Val Gly Ala Arg

85 90 95

Asn Ser Ile Lys Glu Ile Ala Ser Arg Leu Cys Lys Asn Phe Ala Ser

100 105 110

Leu Gly Leu Val Asn Arg Gly Val Lys Glu Val Asn Leu Tyr Glu Met

115 120 125

Lys Asn Val Lys Ala Pro Asn Ile Ile Phe Glu Thr Met Phe Cys Asp

130 135 140

Asn Glu His Asp Ile Asn Glu Val Trp Ser Pro Thr Pro Tyr Glu Lys

145 150 155 160

Met Ala Leu Leu Ile Ala Asn Ala Ile Asp Pro Thr Ile Lys Glu Asn

165 170 175

Glu Leu Tyr Arg Val Val Val Gln Tyr Phe Asn Ser Lys Lys Asp Ala

180 185 190

Glu Asn Cys Gln Gln Glu Ile Ala Lys Arg Trp Tyr Cys Phe Val Glu

195 200 205

Glu Cys Asn

210

<210> 8

<211> 388

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> GH25CPF4969

<400> 8

Lys Ile Asn Lys Arg Leu Ser Thr Thr Asn Val Thr Leu Asn Ala Asn

1 5 10 15

Asn Pro Lys His Ile Ile Ile His Glu Thr Asp Asn Thr Ser Lys Gly

20 25 30

Ala Gly Ala Glu Thr His Cys Lys Ala Gln Ala Asn Gly Asn Ile Gly

35 40 45

Lys Ala Ser Val His Tyr Tyr Val Asp Asp Thr Gly Val Tyr Gln Ala

50 55 60

Val Glu His Lys His Ala Thr Trp Asn Cys Gly Asp Gly Asn Asn Arg

65 70 75 80

Tyr Gly Ile Asn Asn Lys Asn Thr Ile Ser Ile Glu Ile Cys Val Asn

85 90 95

Ser Asp Ser Asp Tyr Asn Lys Ala Val Asp Asn Thr Val Glu Leu Val

100 105 110

Arg Tyr Leu Lys Asn Gly Tyr Tyr Ser Asn Cys Gln Val Val Arg His

115 120 125

Tyr Asp Ala Ser Arg Lys Asn Cys Pro Arg Arg Ile Leu Ala Asn Gly

130 135 140

Tyr Trp Asn Thr Phe Leu Glu Arg Val Asn Ser Lys Asp Ser Ser Ser

145 150 155 160

Gln Thr Pro Ala Asn Thr Ser Tyr Lys Gly Phe Tyr Glu Ser Ser Glu

165 170 175

Thr Arg Thr Asn Ala Thr Leu Val Gly Glu Gly Ser Ile Lys Val Leu

180 185 190

Asp Glu Glu Cys Asn His Val Ser Gly Arg Trp Ile Asp Ser Leu Asp

195 200 205

Arg Leu Phe Val Ile Gly Ile Tyr Pro Ser Arg Lys Phe Ile Glu Val

210 215 220

Val Tyr Pro Ala Gly Asp Lys Lys Tyr His Ala Tyr Ile Gly Ile Glu

225 230 235 240

Tyr Tyr Asn Arg Ile Leu Phe Asp Tyr His Lys Glu Tyr Ile Asn Asp

245 250 255

Asp Gly Val Thr Tyr Val Trp Trp Asn Ala Ser Asp Val Asn Val Lys

260 265 270

Asp His Asn Glu Glu Leu Gln Pro Asn Gln Lys Ala Ser Pro Met Tyr

275 280 285

Arg Thr Gly Glu Trp Leu Arg Ile Thr Phe Tyr Arg Glu Asn Gly Ile

290 295 300

Pro Ser Asp Gly Tyr Val Arg Tyr Glu Gly Ser Gln Asn Lys Lys Phe

305 310 315 320

Tyr Glu Asn Ile Gln Tyr Gly Ile Val Lys Val Asn Ser Ser Leu Asn

325 330 335

Val Arg Glu Asn Pro Asn Gly Glu Val Ile Gly Ser Val Tyr Lys Asp

340 345 350

Glu Lys Val Gln Val Leu Lys Glu Glu Asn Gly Trp Cys Tyr Ile Glu

355 360 365

Tyr Ser Thr Ser Lys Gly Glu Lys Arg Gly Tyr Val Ser Ser Lys Tyr

370 375 380

Ile Glu Leu Val

385

<210> 9

<211> 378

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> AMI2CPJP838

<400> 9

Tyr Ile Asn Gln Ser Asn Ile Lys Phe Asn Gly Leu Lys Tyr Gly Asn

1 5 10 15

Asn Pro Asn Lys Ile Ile Ile His Asn Ala Asp His Pro Asn Cys Ser

20 25 30

Val Tyr Asp Ile Asp Lys Trp His Lys Gly Asn Gly Trp Ser Gly Ile

35 40 45

Gly Tyr His Tyr Phe Ile Arg Lys Asp Gly Ser Ile Trp Thr Gly Arg

50 55 60

Pro Glu Asn Ala Ile Gly Ala His Thr Ile Gly Gln Asn Ser Ser Ser

65 70 75 80

Ile Gly Ile Cys Leu Glu Gly Ala Leu Met Arg Glu Lys Pro Thr Arg

85 90 95

Ala Gln Leu Asn Ser Ile Tyr Glu Leu Ile Ala Asp Val Arg Lys Arg

100 105 110

Arg Gly Asn Leu Pro Val Tyr Gly His Lys Asp Phe Asn Asn Thr Asp

115 120 125

Cys Pro Gly Lys Asn Phe Pro Leu Ser Glu Phe Lys Asn Asn Ser Tyr

130 135 140

Arg Pro Thr Gly Val Ser Ser Glu Thr Val Val Ser Glu Asn Gly Phe

145 150 155 160

Tyr Thr Ser Asn Glu Glu Arg Thr Asn Ala Thr Ile Val Gly Val Gly

165 170 175

Asp Ile Glu Val Leu Asp Glu Lys Gly Lys Val Ile Gln Gly Arg His

180 185 190

Ile Ser Ser Leu Asp Arg Val Phe Val Leu Gly Ile Tyr Pro Ser Arg

195 200 205

Asn His Ile Glu Leu Ile Tyr Pro Gly Lys Asp Glu Lys Tyr His Ala

210 215 220

Tyr Ile Ser Ile Glu Asn Tyr Ser Arg Leu Ser Phe Asp Tyr His Met

225 230 235 240

Gln Tyr Lys Asn Asp Asp Gly Val Thr Tyr Val Trp Trp Asp Ser Lys

245 250 255

Asn Val Asn Val Lys Glu His Asp Glu Glu Leu Gln Pro His Gln Lys

260 265 270

Ala Ser Pro Met Tyr Arg Thr Gly Gly Trp Leu Arg Ile Thr Phe Tyr

275 280 285

Arg Glu Asp Gly Thr Pro Ser Asp Gly Tyr Val Arg Tyr Glu Gly Glu

290 295 300

Gln Lys Glu Arg Phe Tyr Arg Lys Gly Lys Val Val Asn Val Arg Thr

305 310 315 320

Ser Leu Thr Val Arg Ser Gly Ala Gly Thr Asn Tyr Ser Ala Ile Gly

325 330 335

Ser Leu Glu Pro Asn Glu Asn Val Asp Ile Leu Gly Lys Ala Glu Gly

340 345 350

Trp Tyr Tyr Ile Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Gly Lys Lys Lys Gly Tyr

355 360 365

Val Ser Glu Lys Tyr Ile Glu Thr Ile Gln

370 375

<210> 10

<211> 346

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> AMI3CPJP55

<400> 10

Lys Ile Ser Glu Arg Gly Gly His Asn Phe Gln Ala Thr Gly Ala Val

1 5 10 15

Gly Leu Ile Asn Glu Thr Val Glu Asp Arg Lys Val Leu Ala Ala Ala

20 25 30

Tyr Lys Tyr Thr Lys Ala Ala Gly His Asp Val Leu Asn Val Thr Pro

35 40 45

Gly Asn Cys Asp Ala Asn Thr Asp Leu Ile Leu Gly Val Asn Lys Ala

50 55 60

Glu Ser Phe Gly Ala Glu Leu Phe Leu Ser Phe His Phe Asp Lys Cys

65 70 75 80

Tyr Asp Glu Tyr Asn Gly Ala Leu Gly Val Ala Cys Trp Ile Cys Glu

85 90 95

Glu Gly Gly Lys Ala Glu Lys Tyr Ala Arg Ser Ile Val Asn Thr Ile

100 105 110

Val Ala Gly Thr Gly Leu Ile Asn Arg Gly Val Lys Val Asn Pro Arg

115 120 125

Leu Tyr Glu Leu Arg Lys Thr Ser Met Pro Ala Val Ile Val Glu Val

130 135 140

Cys Phe Cys Glu Ala Thr Glu Asp Val Arg Ile Tyr Lys Glu Lys Gly

145 150 155 160

Pro Asp Leu Ile Gly Lys Leu Ile Ala Glu Gly Val Cys Lys Ile Ala

165 170 175

Gly Gly Gln Val Pro Gly Ala Val Pro Glu Thr Asp Asp Asn Lys Pro

180 185 190

Val Glu Pro Lys Pro Val Pro Val Tyr Asp Arg Asn Lys Phe Lys Thr

195 200 205

Asn Ala Arg Ala Leu Val Ala Leu Asp Pro Arg Asp Asn Ala Ser Glu

210 215 220

Val Tyr Glu Asp Leu Gly Glu Ile Tyr Glu Asn Glu Arg Phe Tyr Val

225 230 235 240

Leu Pro Glu Val Cys Asp Lys Gly Asn Tyr Leu Pro Val Leu Tyr Trp

245 250 255

Lys Asp Gly Ala Asn Arg Ala Ser Asn Lys Val Trp Val Lys Ser Lys

260 265 270

Gln Asn Tyr Met Met Ile Asp Thr Tyr His Lys Ile Val Asn Val Arg

275 280 285

Thr Glu Leu Asp Ala Arg Tyr Glu Pro Ser Pro Asp Ser Ser Arg Met

290 295 300

Gly Tyr Val Arg Asn Gly Glu Arg Leu Tyr Val His Arg Thr Glu Gly

305 310 315 320

Asn Tyr Ser Leu Cys Thr Tyr Phe Ala Gly Asp Gly Tyr Lys Thr Ala

325 330 335

Trp Phe Thr Ala Lys Tyr Leu Glu Arg Ile

340 345

<210> 11

<211> 349

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> AMI3CPF4969

<400> 11

Gln Ser Arg Ser Asp Ser Asn Phe Lys Gly Ile Asp Ile Ser Asn Trp

1 5 10 15

Gln Lys Gly Ile Asn Leu Asn Gln Leu Lys Glu Arg Gly Tyr Asp Val

20 25 30

Cys Tyr Ile Lys Ile Thr Glu Gly Lys Gly Tyr Val Asp Pro Cys Phe

35 40 45

Glu Glu Asn Tyr Asn Lys Ala Ile Ala Ala Gly Met Lys Val Gly Val

50 55 60

Tyr His Tyr Trp Arg Gly Thr Ser Ser Ala Ile Glu Gln Ala Asn Asn

65 70 75 80

Ile Val Arg Thr Leu Gly Asn Lys His Ile Asp Cys Lys Ile Ala Ile

85 90 95

Asp Val Glu Gln Thr Asp Gly Leu Ser Tyr Gly Glu Leu Asn Asn Ser

100 105 110

Val Leu Gln Leu Ala Glu Glu Leu Glu Arg Leu Ile Gly Ala Glu Val

115 120 125

Cys Ile Tyr Cys Asn Thr Asn Tyr Ala Arg Asn Val Leu Asp Ser Arg

130 135 140

Leu Gly Lys Tyr Ser Leu Trp Val Ala His Tyr Gly Val Asn Lys Pro

145 150 155 160

Gly Asp Asn Pro Ile Trp Asp Lys Trp Ala Gly Phe Gln Tyr Ser Glu

165 170 175

Asn Gly Thr Ser Asn Val Asn Gly Ser Leu Asp Leu Asp Glu Phe Thr

180 185 190

Glu Glu Ile Phe Ile Asn Lys Glu Ser Ser Lys Val Thr Glu Asn Lys

195 200 205

Leu Phe Ser Thr Asn Ala Arg Ala Leu Val Ala Leu Asp Pro Arg Asp

210 215 220

Asn Pro Ser Asp Asn Tyr Asn Asp Leu Gly Glu Ile Tyr Glu Gly Glu

225 230 235 240

Arg Ile Gln Val Leu Ala Glu Val Cys Asp Lys Glu Asp Tyr Leu Pro

245 250 255

Val Lys Tyr Trp Lys Asp Ser Glu Gly Arg Glu Ser Gly Lys Val Trp

260 265 270

Ile Arg Ser Lys Gln Asp Tyr Met Met Ile Asp Thr Tyr His Arg Val

275 280 285

Phe Asn Val Ile Thr Gln Leu Asp Ala Arg Tyr Glu Pro Ser Ser Asp

290 295 300

Ser Ala Thr Met Gly Tyr Val Lys Asn Gly Glu Arg Leu Tyr Val His

305 310 315 320

Arg Thr Glu Gly Asn Tyr Ser Leu Cys Thr Tyr Phe Ala Gly Asn Gly

325 330 335

Tyr Lys Thr Ala Trp Phe Thr Ala Lys Tyr Leu Glu Arg

340 345

<210> 12

<211> 180

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> N端催化结构域; SEQ ID NO: 1的氨基酸6-185

<400> 12

Ile Asp Val Ser Glu His Gln Gly Arg Ile Asn Trp Glu Gln Val Lys

1 5 10 15

Asp Gln Val Asp Phe Val Met Leu Arg Ala Gly Tyr Gly Arg Asn Asn

20 25 30

Ile Asp Lys Gln Phe Val Arg Asn Ile Gln Glu Cys Asn Arg Leu Asn

35 40 45

Ile Pro Val Gly Ile Tyr Trp Phe Ser Tyr Ala Trp Asn Glu Glu Met

50 55 60

Ala Lys Asn Glu Ala Lys Tyr Val Leu Glu Ala Ile Lys Pro Tyr Lys

65 70 75 80

Val Asp Tyr Pro Ile Ser Tyr Asp Leu Glu Tyr Asp Thr Leu Asn Tyr

85 90 95

Ala Lys Lys Asn Gly Val Thr Ile Gly Lys Arg Leu Ala Thr Asp Met

100 105 110

Ile Asn Val Phe Cys Ser Thr Ile Glu Asn Ala Gly Tyr Lys Ala Met

115 120 125

Asn Tyr Ala Asn Pro Asp Phe Ile Asn Asn Lys Phe Tyr Ser Asn Glu

130 135 140

Val Asn Tyr Pro Leu Trp Leu Ala Trp Tyr Gly Val Ser Glu Asp Lys

145 150 155 160

Ala Lys Ala Tyr Asn Ser Ala Ile Trp Gln Phe Ser Glu Ser Gly Ser

165 170 175

Met Asp Gly Ile

180

<210> 13

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> N端催化结构域; SEQ ID NO: 2的氨基酸17-132

<400> 13

Asn Asn Pro Lys Glu Ile Ile Val His His Ser Glu His Ser Thr Ala

1 5 10 15

Asn Val Tyr Asp Ile Asp Arg Trp His Lys Asp Lys Gly Trp Cys Gly

20 25 30

Ile Gly Tyr His Tyr Phe Ile Asp Lys Gln Gly Asn Ile Tyr Thr Gly

35 40 45

Arg Pro Glu Asp Trp Thr Gly Ala His Cys Ile Asp His Asn Thr Lys

50 55 60

Ser Ile Gly Ile Cys Leu Gln Gly Arg Leu Gln Thr Glu Lys Val Thr

65 70 75 80

Asp Pro Gln Tyr Lys Ala Leu Leu Trp Leu Ile Gln Asp Ile Lys Asn

85 90 95

Arg Arg Gly Asn Met Pro Val Tyr Gly His Lys Glu Leu Asn Ser Thr

100 105 110

Asp Cys Pro Gly

115

<210> 14

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> N端催化结构域; SEQ ID NO: 3的氨基酸17-132

<400> 14

Asn Asn Pro Lys Glu Ile Ile Val His His Ser Glu His Ser Thr Ala

1 5 10 15

Asn Val Tyr Asp Ile Asp Lys Trp His Lys Asp Lys Gly Trp Cys Gly

20 25 30

Ile Gly Tyr His Tyr Phe Ile Asp Lys Gln Gly Asn Ile Tyr Thr Gly

35 40 45

Arg Pro Glu Asp Trp Thr Gly Ala His Cys Ile Asn His Asn Thr Lys

50 55 60

Ser Ile Gly Ile Cys Leu Gln Gly Arg Leu Gln Ile Glu Lys Val Thr

65 70 75 80

Asp Ala Gln Tyr Lys Ala Leu Leu Trp Leu Ile Gln Asp Ile Arg Asn

85 90 95

Arg Arg Gly Asn Met Pro Val Tyr Gly His Lys Glu Leu Asn Ser Thr

100 105 110

Asp Cys Pro Gly

115

<210> 15

<211> 172

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> N端催化结构域; SEQ ID NO: 4的氨基酸2-173

<400> 15

Ile Ala Val Arg Gly Gly His Asn Phe Gln Ala Lys Gly Ser Ser Ala

1 5 10 15

Leu Ile Asp Glu Thr Ile Glu Asn Arg Lys Val Tyr Lys Ala Leu Ile

20 25 30

Lys Tyr Leu Ser Ile Ala Gly His Asn Val Ile Asp Val Thr Pro Gly

35 40 45

Glu Cys Asp Val Asn Thr Asp Leu Tyr Leu Gly Val Gln Lys Ala Glu

50 55 60

Asp Asn Asn Val Glu Leu Phe Ile Ser Ile His Phe Asp Lys Ala Tyr

65 70 75 80

Asp Lys Tyr Glu Gly Ala Leu Gly Thr Gly Thr Trp Ile Tyr Gly Arg

85 90 95

Gly Gly Lys Ala Glu Ile Tyr Ala Lys Arg Ile Val Asp Asn Leu Ser

100 105 110

Lys Gly Thr Gly Leu Lys Asn Arg Gly Val Lys Glu Asn Ser Lys Leu

115 120 125

Tyr Glu Leu Arg Lys Thr Ser Met Pro Ala Val Leu Val Glu Val Cys

130 135 140

Phe Cys Glu Ala Thr Glu Asp Val Arg Ile Tyr Lys Glu Lys Gly Thr

145 150 155 160

Asp Leu Ile Gly Lys Leu Ile Ala Glu Ala Ile Asn

165 170

<210> 16

<211> 176

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> N端催化结构域; SEQ ID NO: 5的氨基酸11-186

<400> 16

Ile Asp Val Ser Asn Trp Lys Gly Asn Ile Asn Phe Glu Ser Val Lys

1 5 10 15

Asn Asp Gly Val Glu Val Val Tyr Ile Lys Ala Thr Glu Gly Asn Tyr

20 25 30

Phe Lys Asp Lys Tyr Ala Lys Gln Asn Tyr Glu Gly Ala Lys Glu Gln

35 40 45

Gly Leu Lys Val Gly Phe Tyr His Phe Phe Arg Ala Asn Lys Gly Ala

50 55 60

Lys Asp Gln Ala Asn Phe Phe Ile Asp Tyr Leu Asn Glu Ile Gly Ala

65 70 75 80

Val Asn Tyr Asp Cys Lys Leu Ala Leu Asp Ile Glu Thr Thr Glu Gly

85 90 95

Val Gly Val Arg Asp Leu Thr Ser Met Cys Ile Glu Phe Leu Glu Glu

100 105 110

Val Lys Arg Leu Thr Gly Lys Glu Val Val Val Tyr Thr Tyr Thr Ser

115 120 125

Phe Ala Asn Asn Asn Leu Asp Ser Arg Leu Gly Asn Tyr Pro Val Trp

130 135 140

Ile Ala His Tyr Gly Val Asn Thr Pro Gly Ala Asn Asn Ile Trp Gly

145 150 155 160

Ser Trp Val Gly Phe Gln Tyr Ser Glu Asn Arg Ser Val Ala Gly Val

165 170 175

<210> 17

<211> 163

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> N端催化结构域; SEQ ID NO: 6的氨基酸6-168

<400> 17

Leu Asp Ala Gly His Cys Thr Ser Gly Ala Asp Thr Gly Ala Gln Gly

1 5 10 15

Asn Gly Tyr Lys Glu Gln Asp Leu Thr Arg Gln Val Val Thr Tyr Leu

20 25 30

Ser Glu Tyr Leu Glu Lys Glu Gly His Thr Thr Lys Tyr Cys His Cys

35 40 45

Asn Ser Ala Ser Thr Val Asn Glu Ser Leu Arg Tyr Arg Val Asn Lys

50 55 60

Ala Asn Ser Ile Gly Val Asp Tyr Phe Val Ser Ile His Leu Asn Ala

65 70 75 80

Gly Gly Gly Val Gly Thr Glu Thr Tyr Ile Cys Ala Arg Gly Gly Glu

85 90 95

Ala Glu Arg Val Ala Lys Arg Val Asn Ser Lys Leu Val Gln Tyr Gly

100 105 110

Tyr Arg Asp Arg Gly Val Lys Val Gly Asn Leu Tyr Val Ile Lys Asn

115 120 125

Thr Asn Ala Pro Ala Ile Leu Val Glu Ile Cys Phe Ile Asp Ser Ser

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Lys Phe Asn Ala Lys Ala Ile Ala Lys Ala Ile Ala

145 150 155 160

Glu Gly Leu

<210> 18

<211> 149

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> N端催化结构域; SEQ ID NO: 6的氨基酸6-154

<400> 18

Leu Asp Ala Gly His Cys Thr Ser Gly Ala Asp Thr Gly Ala Gln Gly

1 5 10 15

Asn Gly Tyr Lys Glu Gln Asp Leu Thr Arg Gln Val Val Thr Tyr Leu

20 25 30

Ser Glu Tyr Leu Glu Lys Glu Gly His Thr Thr Lys Tyr Cys His Cys

35 40 45

Asn Ser Ala Ser Thr Val Asn Glu Ser Leu Arg Tyr Arg Val Asn Lys

50 55 60

Ala Asn Ser Ile Gly Val Asp Tyr Phe Val Ser Ile His Leu Asn Ala

65 70 75 80

Gly Gly Gly Val Gly Thr Glu Thr Tyr Ile Cys Ala Arg Gly Gly Glu

85 90 95

Ala Glu Arg Val Ala Lys Arg Val Asn Ser Lys Leu Val Gln Tyr Gly

100 105 110

Tyr Arg Asp Arg Gly Val Lys Val Gly Asn Leu Tyr Val Ile Lys Asn

115 120 125

Thr Asn Ala Pro Ala Ile Leu Val Glu Ile Cys Phe Ile Asp Ser Ser

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Lys

145

<210> 19

<211> 168

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> N端催化结构域; SEQ ID NO: 7的氨基酸3-170

<400> 19

Gly Ile Arg Asp Gly His Ser Pro Asn Cys Lys Gly Ala Ile Gly Leu

1 5 10 15

Arg Asp Glu Gln Ser Cys Met Arg Val Leu Cys Lys Glu Val Ile Glu

20 25 30

Ile Leu Glu Lys His Gly His Glu Val Val Tyr Cys Gly Ser Asp Ala

35 40 45

Ser Thr Gln Asn Ser Glu Leu Ser Glu Gly Val Arg Lys Ala Asn Asn

50 55 60

Ser Asn Val Asp Ile Phe Ile Ser Leu His Met Asn Ser Phe Asn Gly

65 70 75 80

Gln Ala Gln Gly Thr Glu Ser Leu Ile Ala Val Gly Ala Arg Asn Ser

85 90 95

Ile Lys Glu Ile Ala Ser Arg Leu Cys Lys Asn Phe Ala Ser Leu Gly

100 105 110

Leu Val Asn Arg Gly Val Lys Glu Val Asn Leu Tyr Glu Met Lys Asn

115 120 125

Val Lys Ala Pro Asn Ile Ile Phe Glu Thr Met Phe Cys Asp Asn Glu

130 135 140

His Asp Ile Asn Glu Val Trp Ser Pro Thr Pro Tyr Glu Lys Met Ala

145 150 155 160

Leu Leu Ile Ala Asn Ala Ile Asp

165

<210> 20

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> N端催化结构域; SEQ ID NO: 8的氨基酸16-137

<400> 20

Asn Asn Pro Lys His Ile Ile Ile His Glu Thr Asp Asn Thr Ser Lys

1 5 10 15

Gly Ala Gly Ala Glu Thr His Cys Lys Ala Gln Ala Asn Gly Asn Ile

20 25 30

Gly Lys Ala Ser Val His Tyr Tyr Val Asp Asp Thr Gly Val Tyr Gln

35 40 45

Ala Val Glu His Lys His Ala Thr Trp Asn Cys Gly Asp Gly Asn Asn

50 55 60

Arg Tyr Gly Ile Asn Asn Lys Asn Thr Ile Ser Ile Glu Ile Cys Val

65 70 75 80

Asn Ser Asp Ser Asp Tyr Asn Lys Ala Val Asp Asn Thr Val Glu Leu

85 90 95

Val Arg Tyr Leu Lys Asn Gly Tyr Tyr Ser Asn Cys Gln Val Val Arg

100 105 110

His Tyr Asp Ala Ser Arg Lys Asn Cys Pro

115 120

<210> 21

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> N端催化结构域; SEQ ID NO: 9的氨基酸16-131

<400> 21

Asn Asn Pro Asn Lys Ile Ile Ile His Asn Ala Asp His Pro Asn Cys

1 5 10 15

Ser Val Tyr Asp Ile Asp Lys Trp His Lys Gly Asn Gly Trp Ser Gly

20 25 30

Ile Gly Tyr His Tyr Phe Ile Arg Lys Asp Gly Ser Ile Trp Thr Gly

35 40 45

Arg Pro Glu Asn Ala Ile Gly Ala His Thr Ile Gly Gln Asn Ser Ser

50 55 60

Ser Ile Gly Ile Cys Leu Glu Gly Ala Leu Met Arg Glu Lys Pro Thr

65 70 75 80

Arg Ala Gln Leu Asn Ser Ile Tyr Glu Leu Ile Ala Asp Val Arg Lys

85 90 95

Arg Arg Gly Asn Leu Pro Val Tyr Gly His Lys Asp Phe Asn Asn Thr

100 105 110

Asp Cys Pro Gly

115

<210> 22

<211> 166

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> N端催化结构域; SEQ ID NO: 10的氨基酸7-172

<400> 22

Gly His Asn Phe Gln Ala Thr Gly Ala Val Gly Leu Ile Asn Glu Thr

1 5 10 15

Val Glu Asp Arg Lys Val Leu Ala Ala Ala Tyr Lys Tyr Thr Lys Ala

20 25 30

Ala Gly His Asp Val Leu Asn Val Thr Pro Gly Asn Cys Asp Ala Asn

35 40 45

Thr Asp Leu Ile Leu Gly Val Asn Lys Ala Glu Ser Phe Gly Ala Glu

50 55 60

Leu Phe Leu Ser Phe His Phe Asp Lys Cys Tyr Asp Glu Tyr Asn Gly

65 70 75 80

Ala Leu Gly Val Ala Cys Trp Ile Cys Glu Glu Gly Gly Lys Ala Glu

85 90 95

Lys Tyr Ala Arg Ser Ile Val Asn Thr Ile Val Ala Gly Thr Gly Leu

100 105 110

Ile Asn Arg Gly Val Lys Val Asn Pro Arg Leu Tyr Glu Leu Arg Lys

115 120 125

Thr Ser Met Pro Ala Val Ile Val Glu Val Cys Phe Cys Glu Ala Thr

130 135 140

Glu Asp Val Arg Ile Tyr Lys Glu Lys Gly Pro Asp Leu Ile Gly Lys

145 150 155 160

Leu Ile Ala Glu Gly Val

165

<210> 23

<211> 169

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> N端催化结构域; SEQ ID NO: 11的氨基酸11-179

<400> 23

Ile Asp Ile Ser Asn Trp Gln Lys Gly Ile Asn Leu Asn Gln Leu Lys

1 5 10 15

Glu Arg Gly Tyr Asp Val Cys Tyr Ile Lys Ile Thr Glu Gly Lys Gly

20 25 30

Tyr Val Asp Pro Cys Phe Glu Glu Asn Tyr Asn Lys Ala Ile Ala Ala

35 40 45

Gly Met Lys Val Gly Val Tyr His Tyr Trp Arg Gly Thr Ser Ser Ala

50 55 60

Ile Glu Gln Ala Asn Asn Ile Val Arg Thr Leu Gly Asn Lys His Ile

65 70 75 80

Asp Cys Lys Ile Ala Ile Asp Val Glu Gln Thr Asp Gly Leu Ser Tyr

85 90 95

Gly Glu Leu Asn Asn Ser Val Leu Gln Leu Ala Glu Glu Leu Glu Arg

100 105 110

Leu Ile Gly Ala Glu Val Cys Ile Tyr Cys Asn Thr Asn Tyr Ala Arg

115 120 125

Asn Val Leu Asp Ser Arg Leu Gly Lys Tyr Ser Leu Trp Val Ala His

130 135 140

Tyr Gly Val Asn Lys Pro Gly Asp Asn Pro Ile Trp Asp Lys Trp Ala

145 150 155 160

Gly Phe Gln Tyr Ser Glu Asn Gly Thr

165

<210> 24

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 接头序列; SEQ ID NO: 1的氨基酸186-217

<400> 24

Gly Thr Asn Ser Val Asp Met Asn Tyr Cys Tyr Glu Asp Phe Leu Lys

1 5 10 15

Lys Asp Phe Thr Leu Asp Asn Ala Thr Thr Lys Asn Val Ser Thr Lys

20 25 30

<210> 25

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 接头序列; SEQ ID NO: 1的氨基酸271-283

<400> 25

Lys Leu Gln Met Ala Thr Thr His Asn Val Ser Thr Phe

1 5 10

<210> 26

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 接头序列; SEQ ID NO: 2的氨基酸133-165

<400> 26

Asn Leu Asp Leu Asp Lys Leu Arg Arg Asp Leu Asn Asn Glu Val Val

1 5 10 15

Asp Thr Asn Asp Asp Glu Tyr Arg Glu Asn Ala Thr Val Val Asn Val

20 25 30

Ser

<210> 27

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 接头序列; SEQ ID NO: 3的氨基酸133-164

<400> 27

Asn Leu Asp Leu Asn Lys Leu Arg Thr Asp Val Asn Asn Lys Val Val

1 5 10 15

Asp Ser Asn Gly Gly Tyr Thr Glu Asn Ala Thr Val Val Asn Val Asn

20 25 30

<210> 28

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 接头序列; SEQ ID NO: 5的氨基酸187-219

<400> 28

Asn Gly Gly Cys Asp Met Asn Glu Phe Thr Glu Glu Ile Phe Ile Asp

1 5 10 15

Ser Ser Asn Phe Asn Leu Asp Asn Ala Thr Thr Lys Asn Val Ser Thr

20 25 30

Lys

<210> 29

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 接头序列; SEQ ID NO: 5的氨基酸259-285

<400> 29

Tyr Asn Gly Val Val Gly Tyr Val Asn Ala Asp Tyr Val Glu Lys Leu

1 5 10 15

Gln Met Ala Thr Thr Tyr Asn Val Ser Thr Phe

20 25

<210> 30

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 接头序列; SEQ ID NO: 6的氨基酸155-168

<400> 30

Phe Asn Ala Lys Ala Ile Ala Lys Ala Ile Ala Glu Gly Leu

1 5 10

<210> 31

<211> 195

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 接头序列; SEQ ID NO: 8的氨基酸138-332

<400> 31

Arg Arg Ile Leu Ala Asn Gly Tyr Trp Asn Thr Phe Leu Glu Arg Val

1 5 10 15

Asn Ser Lys Asp Ser Ser Ser Gln Thr Pro Ala Asn Thr Ser Tyr Lys

20 25 30

Gly Phe Tyr Glu Ser Ser Glu Thr Arg Thr Asn Ala Thr Leu Val Gly

35 40 45

Glu Gly Ser Ile Lys Val Leu Asp Glu Glu Cys Asn His Val Ser Gly

50 55 60

Arg Trp Ile Asp Ser Leu Asp Arg Leu Phe Val Ile Gly Ile Tyr Pro

65 70 75 80

Ser Arg Lys Phe Ile Glu Val Val Tyr Pro Ala Gly Asp Lys Lys Tyr

85 90 95

His Ala Tyr Ile Gly Ile Glu Tyr Tyr Asn Arg Ile Leu Phe Asp Tyr

100 105 110

His Lys Glu Tyr Ile Asn Asp Asp Gly Val Thr Tyr Val Trp Trp Asn

115 120 125

Ala Ser Asp Val Asn Val Lys Asp His Asn Glu Glu Leu Gln Pro Asn

130 135 140

Gln Lys Ala Ser Pro Met Tyr Arg Thr Gly Glu Trp Leu Arg Ile Thr

145 150 155 160

Phe Tyr Arg Glu Asn Gly Ile Pro Ser Asp Gly Tyr Val Arg Tyr Glu

165 170 175

Gly Ser Gln Asn Lys Lys Phe Tyr Glu Asn Ile Gln Tyr Gly Ile Val

180 185 190

Lys Val Asn

195

<210> 32

<211> 189

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 接头序列; SEQ ID NO: 9的氨基酸132-320

<400> 32

Lys Asn Phe Pro Leu Ser Glu Phe Lys Asn Asn Ser Tyr Arg Pro Thr

1 5 10 15

Gly Val Ser Ser Glu Thr Val Val Ser Glu Asn Gly Phe Tyr Thr Ser

20 25 30

Asn Glu Glu Arg Thr Asn Ala Thr Ile Val Gly Val Gly Asp Ile Glu

35 40 45

Val Leu Asp Glu Lys Gly Lys Val Ile Gln Gly Arg His Ile Ser Ser

50 55 60

Leu Asp Arg Val Phe Val Leu Gly Ile Tyr Pro Ser Arg Asn His Ile

65 70 75 80

Glu Leu Ile Tyr Pro Gly Lys Asp Glu Lys Tyr His Ala Tyr Ile Ser

85 90 95

Ile Glu Asn Tyr Ser Arg Leu Ser Phe Asp Tyr His Met Gln Tyr Lys

100 105 110

Asn Asp Asp Gly Val Thr Tyr Val Trp Trp Asp Ser Lys Asn Val Asn

115 120 125

Val Lys Glu His Asp Glu Glu Leu Gln Pro His Gln Lys Ala Ser Pro

130 135 140

Met Tyr Arg Thr Gly Gly Trp Leu Arg Ile Thr Phe Tyr Arg Glu Asp

145 150 155 160

Gly Thr Pro Ser Asp Gly Tyr Val Arg Tyr Glu Gly Glu Gln Lys Glu

165 170 175

Arg Phe Tyr Arg Lys Gly Lys Val Val Asn Val Arg Thr

180 185

<210> 33

<211> 53

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> C端结合结构域; SEQ ID NO: 1的氨基酸218-270

<400> 33

Leu Asn Ile Arg Ala Lys Gly Thr Thr Asn Ser Arg Val Val Gly Ser

1 5 10 15

Ile Pro Ala Asn Glu Lys Phe Lys Ile Lys Trp Val Asp Glu Asp Tyr

20 25 30

Leu Gly Trp Tyr Tyr Ile Glu Tyr Asn Gly Ile Val Gly Tyr Val Asn

35 40 45

Ala Asp Tyr Val Glu

50

<210> 34

<211> 53

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> C端结合结构域; SEQ ID NO: 1的氨基酸284-336

<400> 34

Leu Asn Val Arg Glu Glu Gly Ser Leu Asn Ser Arg Ile Val Asp Lys

1 5 10 15

Ile Asn Val Gly Asp Ile Phe Arg Ile Asp Trp Val Asp Ser Asp Phe

20 25 30

Ile Gly Trp Tyr Arg Val Thr Thr Lys Asn Gly Lys Val Gly Phe Val

35 40 45

Asn Ala Glu Phe Val

50

<210> 35

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> C端结合结构域; SEQ ID NO: 1的氨基酸218-336

<400> 35

Leu Asn Ile Arg Ala Lys Gly Thr Thr Asn Ser Arg Val Val Gly Ser

1 5 10 15

Ile Pro Ala Asn Glu Lys Phe Lys Ile Lys Trp Val Asp Glu Asp Tyr

20 25 30

Leu Gly Trp Tyr Tyr Ile Glu Tyr Asn Gly Ile Val Gly Tyr Val Asn

35 40 45

Ala Asp Tyr Val Glu Lys Leu Gln Met Ala Thr Thr His Asn Val Ser

50 55 60

Thr Phe Leu Asn Val Arg Glu Glu Gly Ser Leu Asn Ser Arg Ile Val

65 70 75 80

Asp Lys Ile Asn Val Gly Asp Ile Phe Arg Ile Asp Trp Val Asp Ser

85 90 95

Asp Phe Ile Gly Trp Tyr Arg Val Thr Thr Lys Asn Gly Lys Val Gly

100 105 110

Phe Val Asn Ala Glu Phe Val

115

<210> 36

<211> 59

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> C端结合结构域; SEQ ID NO: 2的氨基酸166-224

<400> 36

Ser Tyr Leu Asn Val Arg Ser Lys Pro Ser Asp Glu Ile Ile Gly Lys

1 5 10 15

Leu Phe Pro Asn Glu Arg Leu Gln Val Asn Trp Val Asp Ser Asp Tyr

20 25 30

Leu Gly Trp Tyr Tyr Val Thr Tyr Arg Val Asn Gly Thr Asn Lys Leu

35 40 45

Lys Asn Gly Tyr Val Ser Ala Lys Tyr Ile Lys

50 55

<210> 37

<211> 59

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> C端结合结构域; SEQ ID NO: 3的氨基酸165-223

<400> 37

Ser Tyr Leu Asn Val Arg Ser Lys Pro Ser Asp Glu Ile Ile Gly Lys

1 5 10 15

Leu Phe Pro Asn Glu Arg Ile Gln Val Asn Trp Val Asp Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Gly Trp Tyr Tyr Ile Thr Tyr Arg Val Asn Glu Thr Asn Lys Leu

35 40 45

Lys Ser Gly Tyr Val Ser Ala Lys Tyr Ile Lys

50 55

<210> 38

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> C端结合结构域; SEQ ID NO: 5的氨基酸220-258

<400> 38

Leu Asn Ile Arg Ala Lys Gly Thr Thr Asn Ser Lys Val Ile Gly Ser

1 5 10 15

Ile Pro Ala Asp Glu Thr Phe Lys Ile Lys Trp Val Asp Glu Asp Tyr

20 25 30

Leu Gly Trp Tyr Tyr Val Glu

35

<210> 39

<211> 53

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> C端结合结构域; SEQ ID NO: 5的氨基酸286-338

<400> 39

Leu Asn Val Arg Glu Glu Gly Ser Leu Asn Ser Arg Ile Val Asp Lys

1 5 10 15

Ile Asn Ser Gly Asp Ile Phe Arg Ile Asp Trp Val Asp Ser Asp Phe

20 25 30

Ile Gly Trp Tyr Arg Ile Thr Thr Lys Asn Gly Lys Val Gly Phe Val

35 40 45

Asn Ala Glu Phe Val

50

<210> 40

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> C端结合结构域; SEQ ID NO: 5的氨基酸220-338

<400> 40

Leu Asn Ile Arg Ala Lys Gly Thr Thr Asn Ser Lys Val Ile Gly Ser

1 5 10 15

Ile Pro Ala Asp Glu Thr Phe Lys Ile Lys Trp Val Asp Glu Asp Tyr

20 25 30

Leu Gly Trp Tyr Tyr Val Glu Tyr Asn Gly Val Val Gly Tyr Val Asn

35 40 45

Ala Asp Tyr Val Glu Lys Leu Gln Met Ala Thr Thr Tyr Asn Val Ser

50 55 60

Thr Phe Leu Asn Val Arg Glu Glu Gly Ser Leu Asn Ser Arg Ile Val

65 70 75 80

Asp Lys Ile Asn Ser Gly Asp Ile Phe Arg Ile Asp Trp Val Asp Ser

85 90 95

Asp Phe Ile Gly Trp Tyr Arg Ile Thr Thr Lys Asn Gly Lys Val Gly

100 105 110

Phe Val Asn Ala Glu Phe Val

115

<210> 41

<211> 70

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> C端结合结构域; SEQ ID NO: 6的氨基酸155-224

<400> 41

Phe Asn Ala Lys Ala Ile Ala Lys Ala Ile Ala Glu Gly Leu Leu Asp

1 5 10 15

Lys Thr Ile Asp Glu Val Glu Lys Lys Pro Glu Ser Val Pro Asp Asn

20 25 30

Thr Glu Asn Ser Asn Thr Tyr Phe Arg Val Val Val Gly Ser Tyr Lys

35 40 45

Asp Arg Glu Asn Ala Val Lys Lys Gln Glu Glu Leu Lys Ala Lys Gly

50 55 60

Glu Asp Ser Phe Leu Leu

65 70

<210> 42

<211> 56

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> C端结合结构域; SEQ ID NO: 6的氨基酸169-224

<400> 42

Leu Asp Lys Thr Ile Asp Glu Val Glu Lys Lys Pro Glu Ser Val Pro

1 5 10 15

Asp Asn Thr Glu Asn Ser Asn Thr Tyr Phe Arg Val Val Val Gly Ser

20 25 30

Tyr Lys Asp Arg Glu Asn Ala Val Lys Lys Gln Glu Glu Leu Lys Ala

35 40 45

Lys Gly Glu Asp Ser Phe Leu Leu

50 55

<210> 43

<211> 54

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> C端结合结构域; SEQ ID NO: 8的氨基酸333-386

<400> 43

Ser Ser Leu Asn Val Arg Glu Asn Pro Asn Gly Glu Val Ile Gly Ser

1 5 10 15

Val Tyr Lys Asp Glu Lys Val Gln Val Leu Lys Glu Glu Asn Gly Trp

20 25 30

Cys Tyr Ile Glu Tyr Ser Thr Ser Lys Gly Glu Lys Arg Gly Tyr Val

35 40 45

Ser Ser Lys Tyr Ile Glu

50

<210> 44

<211> 55

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> C端结合结构域; SEQ ID NO: 9的氨基酸321-375

<400> 44

Ser Leu Thr Val Arg Ser Gly Ala Gly Thr Asn Tyr Ser Ala Ile Gly

1 5 10 15

Ser Leu Glu Pro Asn Glu Asn Val Asp Ile Leu Gly Lys Ala Glu Gly

20 25 30

Trp Tyr Tyr Ile Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Gly Lys Lys Lys Gly Tyr

35 40 45

Val Ser Glu Lys Tyr Ile Glu

50 55

<210> 45

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> O_53 引物

<400> 45

gtaggtatga ttagctttac taagctagtc attg 34

<210> 46

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> O_172 引物

<400> 46

aaatagtaac atactaaagc ggatgtaact caatc 35

<210> 47

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> O_328 引物

<400> 47

cacttttaca acaaagtaca ttaggaaaaa cacg 34

<210> 48

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> N端FLAG

<400> 48

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

1 5

<210> 49

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> C端HA

<400> 49

Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala

1 5

<210> 50

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> C端Strep

<400> 50

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

1 5

<210> 51

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> C端6×HIS

<400> 51

His His His His His His

1 5

<210> 52

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 柔性接头

<400> 52

Gly Ser Ala Gly Ser Gly

1 5

<210> 53

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> O_86 引物

<400> 53

tataagaagg agatatacat atgtatatca atcagtccaa cattaagttc aatggtc 57

<210> 54

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> O_211 引物

<400> 54

gtttctttac cagactcgag ttattatgcg taatctggaa catcataggg ataaccac 58

<210> 55

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> O_112 引物

<400> 55

tataagaagg agatatacat atgaaaatta tccaatccaa tattcatttt aatgggaac 59

<210> 56

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> O_231 引物

<400> 56

gtttctttac cagactcgag ttattaagcg taatctggta cgtcataagg ataacc 56

<210> 57

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> O_115 引物

<400> 57

tataagaagg agatatacat atgaaaatta tccagtcaaa tatttacttt aatgggaata 60

aagc 64

<210> 58

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> O_234 引物

<400> 58

gtttctttac cagactcgag ttattaagcg taatctggaa cgtcataagg atatcc 56

<210> 59

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> O_105

<400> 59

tttataggtc tcaacatatg tcgaaaattt tcggtttaga cgcaggtc 48

<210> 60

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> O_215 引物

<400> 60

gtttctttac cagactcgag ttattatttt tcaaattgtg gatgtgatca tcctgaacct 60

g 61

<210> 61

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> O_92 引物

<400> 61

tataagaagg agatatacat atgaaaattt cagaacgtgg tgg 43

<210> 62

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> O_212 引物

<400> 62

gtttctttac cagactcgag ttattacttt tcaaattgag gatgtgacca acctgaacc 59

<210> 63

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> O_93 引物

<400> 63

tataagaagg agatatacat atgaaaattg ctgttcgagg tggccataat ttcc 54

<210> 64

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> O_213 引物

<400> 64

gtttctttac cagactcgag ttattatttt tcaaattgtg gatgactcca acctgaacct 60

g 61

<210> 65

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> O_75 引物

<400> 65

tataagaagg agatatacat atgaaaatcg gtattagaga tggtcatagt cc 52

<210> 66

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> O_195 引物

<400> 66

gtttctttac cagactcgag ttattatttt tcgaattgtg gatgactcca acctg 55

<210> 67

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> O_82 引物

<400> 67

tataagaagg agatatacat atggactata aagatgatga tgacaaaatg caatcacg 58

<210> 68

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> O_205 引物

<400> 68

gtttctttac cagactcgag ttattagcgc tctaagtatt tagcagtaaa ccatgc 56

<210> 69

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> O_95 引物

<400> 69

tataagaagg agatatacat atggactata aagacgatga tgataaaatg acaaaattac 60

g 61

<210> 70

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> O_216 引物

<400> 70

gtttctttac cagactcgag ttattataat ttcttaacga attcagcatt tacaaagcct 60

actttgcc 68

<210> 71

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> O_74 引物

<400> 71

tataagaagg agatatacat atggattaca aagacgatga cgacaaaatg c 51

<210> 72

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> O_232 引物

<400> 72

gtttctttac cagactcgag ttattatagc tttttcacga attctgcgtt aacaaacc 58

<210> 73

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> O_341 引物

<400> 73

acctgaacca gcagaaccgt ctt 23

<210> 74

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> O_351 引物

<400> 74

caccatcatc atcatcatta ataactcgag tctggtaaag aaaccgctg 49

<210> 75

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> O_342 引物

<400> 75

tccgctacca gcagaaccat cttttttaat g 31

<210> 76

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> O_81 引物

<400> 76

tataagaagg agatatacat atgaaaataa acaagcgttt atcaactacg aatgtaacc 59

<210> 77

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> O_434 引物

<400> 77

gtttctttac cagactcgag ttattaatga tgatgatgat ggtgacctga accagcagaa 60

ccaactaatt c 71

<210> 78

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> O_323 引物

<400> 78

aaatttaaat tagcagaatc tttgtcttga ttaggtg 37

<210> 79

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> O_336 引物

<400> 79

caccctagta aagtaaataa aatatacaac tcaatgaatc 40

<210> 80

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> O_197 引物

<400> 80

aatataggtc tcaattaatc ttttttaatg tacttggcag aaacgtaacc tg 52

<210> 81

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> O_106 引物

<400> 81

tttataggtc tcaatgaaaa ttatccagtc aaatatttac tttaatgg 48

Claims (58)

1.一种具有抗微生物活性的分离的内溶素多肽，其中，所述分离的多肽包含以下氨基酸序列：

其为N端产气荚膜梭菌细胞壁肽聚糖催化结构域多肽，

或其为所述N端催化结构域多肽的片段；或

其与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8或11中所示的产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的N端细胞壁肽聚糖催化结构域的氨基酸序列至少80％相同，

或其为所述N端催化结构域多肽的片段，并且其与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8或11中所示序列的对应于所述片段的氨基酸序列的氨基酸序列至少80％相同。

2.根据权利要求1所述的具有抗微生物活性的分离的内溶素多肽或片段，其中，所述分离的多肽包含：N端产气荚膜梭菌细胞壁肽聚糖催化结构域多肽或其片段，C端产气荚膜梭菌细胞壁结合结构域多肽或其片段，以及任选地连接N端结构域和C端结构域的接头多肽或其片段；其中，所述分离的多肽包含：

a)与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8或11中所示的产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的N端细胞壁肽聚糖催化结构域的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，或为所述N端催化结构域多肽的片段并且与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8或11中所示序列的对应于所述片段的氨基酸序列的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列；和

b)氨基酸序列，其与内溶素C端产气荚膜梭菌细胞壁结合结构域多肽或所述多肽的片段至少80％相同；或其为与SEQ ID NO:1、2、3、5、6或8中所示的产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的C端细胞壁结合结构域的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，或其为所述C端结合结构域多肽的片段并且与SEQ ID NO:1、2、3、5、6或8中所示序列的对应于所述片段的氨基酸序列的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列；和

c)与内溶素多肽的接头或所述多肽的片段至少80％相同的任选的接头氨基酸序列；或与SEQ ID NO:1、2、3、5、6或8中所示的产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的接头的氨基酸序列至少80％相同的任选的氨基酸序列，或为所述接头的片段并且与SEQ ID NO:1、2、3、5、6或8中所示序列的对应于所述片段的氨基酸序列的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列；其中，所述接头氨基酸序列连接产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的N端细胞壁肽聚糖催化结构域或其片段和产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的C端细胞壁结合结构域或其片段的所述氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的具有抗微生物活性的分离的内溶素多肽或片段，其中，所述分离的多肽包含：包含N端产气荚膜梭菌细胞壁肽聚糖催化结构域多肽或其片段或者由N端产气荚膜梭菌细胞壁肽聚糖催化结构域多肽或其片段组成的氨基酸序列，包含C端产气荚膜梭菌细胞壁结合结构域多肽或其片段或者由C端产气荚膜梭菌细胞壁结合结构域多肽或其片段组成的氨基酸序列，以及包含连接N端结构域和C端结构域的接头多肽或其片段或者由连接N端结构域和C端结构域的接头多肽或其片段组成的氨基酸序列；其中，所述分离的多肽包含：

a)与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8或11中所示的产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的N端细胞壁肽聚糖催化结构域的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，或为所述N端催化结构域多肽的片段并且与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8或11中所示序列的对应于所述片段的氨基酸序列的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列；和

b)与SEQ ID NO:1、2、3、5、6或8中所示的产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的C端产气荚膜梭菌细胞壁结合结构域的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，或为所述C端结合结构域多肽的片段并且与SEQ ID NO:1、2、3、5、6或8中所示序列的对应于所述片段的氨基酸序列的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列；和

c)与SEQ ID NO:1、2、3、5、6或8中所示的产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的接头的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，或为所述接头的片段并且与SEQ ID NO:1、2、3、5、6或8中所示序列的对应于所述片段的氨基酸序列的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列。

4.根据权利要求3所述的具有抗微生物活性的分离的内溶素多肽，其中，所述分离的多肽由以下组成或包含以下：

a)由所述N端催化结构域的片段组成或包含所述N端催化结构域的片段并且与SEQ IDNO:1、2、3、4、5、6、7、8或11中所示序列的对应于所述片段的氨基酸序列的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列；和/或

b)由所述C端结合结构域的片段组成或包含所述C端结合结构域的片段并且与SEQ IDNO:1、2、3、5、6或8中所示序列的对应于所述片段的氨基酸序列的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列；和/或

c)由所述接头的片段组成或包含所述接头的片段并且与SEQ ID NO:1、2、3、5、6或8中所示序列的对应于所述片段的氨基酸序列的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列。

5.根据前述权利要求中任一项所述的具有抗微生物活性的分离的内溶素多肽或片段，其中，所述N端结构域和/或所述C端结构域和/或所述接头的氨基酸序列分别与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8或11中所示的产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的N端结构域、C端结构域和接头的氨基酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；或其中，为所述N端结构域的片段或所述C端结构域的片段或所述接头的片段的氨基酸序列与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8或11中所示序列的对应于所述片段的氨基酸序列的氨基酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。

6.根据权利要求3或4所述的具有抗微生物活性的分离的内溶素多肽或片段，其中，所述分离的多肽包含：氨基酸序列，其中所述N端催化结构域、C端细胞壁结合结构域和接头都分别与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8或11中所示的产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的N端结构域、C端结构域和接头的相应的氨基酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。

7.根据权利要求6所述的具有抗微生物活性的分离的内溶素多肽或片段，其中，所述多肽包含以下或由以下组成：

a)包含SEQ ID NO:1、2、3、6或8中所示的产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的所有的所述N端结构域、所述C端结构域和所述接头或由SEQ ID NO:1、2、3、6或8中所示的产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的所有的所述N端结构域、所述C端结构域和所述接头组成的氨基酸序列，并且其中，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1、2、3、6或8中所示的产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的所述N端结构域、所述C端结构域和所述接头的序列100％相同；或

b)包含SEQ ID NO:1、2、3、6或8中所示的产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的所有的所述N端结构域、所述C端结构域和所述接头的片段或由SEQ ID NO:1、2、3、6或8中所示的产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的所有的所述N端结构域、所述C端结构域和所述接头的片段组成的氨基酸序列，并且其中，每个片段的氨基酸序列与SEQ ID NO:1、2、3、5、6或8中所示产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的对应于所述片段的氨基酸序列的序列100％相同。

8.根据权利要求6所述的具有抗微生物活性的分离的内溶素多肽，其中，所述多肽包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8或11中所示的产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的氨基酸序列80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。

9.根据权利要求8所述的具有抗微生物活性的分离的内溶素多肽，其中，所述多肽包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8或11中所示的产气荚膜梭菌噬菌体内溶素多肽的氨基酸序列100％相同。

10.根据前述权利要求中任一项所述的具有抗微生物活性的分离的内溶素多肽或片段，其中，所述抗微生物活性为溶菌活性和/或细菌生长抑制活性。

11.根据前述权利要求中任一项所述的具有抗微生物活性的分离的内溶素多肽或片段，其中，所述分离的多肽或片段具有针对产气荚膜梭菌的溶菌活性和/或细菌生长抑制活性。

12.根据权利要求11所述的具有抗微生物活性的分离的内溶素多肽或片段，其中，所述分离的多肽或片段具有针对产气荚膜梭菌，优选产气荚膜梭菌的A型菌株的溶菌活性和/或细菌生长抑制活性。

13.根据权利要求12所述的具有抗微生物活性的分离的内溶素多肽或片段，其中，当在标准细胞活力测定中以5μg/ml的浓度针对产气荚膜梭菌菌株NCTC8237测试所述多肽或片段时，它表现出约0.40或更大、2.00或更大、或者3.70或更大的ΔLog10值。

14.根据权利要求12或13所述的具有抗微生物活性的分离的内溶素多肽或片段，其中，当在标准细胞活力测定中以5μg/ml的浓度针对产气荚膜梭菌菌株NCTC8237测试所述多肽或片段时，它表现出约60％或更大、70％或更大、80％或更大、90％或更大、或者100％的细胞活力降低％。

15.根据权利要求12或13或14所述的具有抗微生物活性的分离的内溶素多肽或片段，其中，当在标准细胞浊度降低测定中以5μg/ml的浓度针对产气荚膜梭菌菌株NCTC8237测试所述多肽或片段时，它表现出7分钟或更短的t50％裂解值；或它表现出3分钟或更短的t50％裂解值。

16.根据权利要求12至15中任一项所述的具有抗微生物活性的分离的内溶素多肽或片段，其中，当在标准最低抑制浓度(MIC)/最低杀菌浓度(MBC)测定中以2.1×10⁴个细胞/mL针对产气荚膜梭菌菌株Cp6测试所述多肽或片段时，它表现出17μg/mL或更小的MIC和/或MBC值，优选1.7μg/mL或更小的MIC和/或MBC值；或它表现出0.65μM或更小的MIC和/或MBC值，优选0.05μM或更小的MIC和/或MBC值。

17.一种分离的重组核酸分子，包含编码根据前述权利要求中任一项所述的具有抗微生物活性的内溶素多肽或片段的第一核酸序列，任选地其中，所述分离的重组核酸分子还包含编码启动子的第二核酸序列，并且其中，所述第一核酸序列可操作地连接至所述第二核酸序列；任选地其中，所述分离的重组核酸分子的第一核酸序列编码cDNA。

18.一种分离的重组多核苷酸表达载体，包含根据权利要求17所述的核酸分子并且包含所述第一核酸序列和所述第二核酸序列。

19.包含所述第一核酸序列和所述第二核酸序列的根据权利要求17所述的分离的重组核酸分子，或包含所述第一核酸序列和所述第二核酸序列的根据权利要求18所述的分离的重组多核苷酸表达载体，其中，所述启动子能够促进所述具有抗微生物活性的内溶素多肽或片段在单细胞微生物的细胞中的表达，所述细胞任选地为酵母细胞、细菌细胞(如乳酸杆菌)、真菌细胞或藻类细胞，优选藻类细胞。

20.根据权利要求17或19所述的核酸分子，或根据权利要求18或19所述的重组多核苷酸表达载体，其中，编码所述内溶素多肽或片段的核酸序列已经进行密码子优化以在宿主细胞中表达，任选地其中，所述宿主细胞为单细胞微生物的细胞，任选地为酵母细胞、细菌细胞(如乳酸杆菌)、真菌细胞或藻类细胞，优选藻类细胞。

21.一种宿主细胞，包含：如权利要求17、19或20中任一项所定义并且编码如权利要求1至16中任一项所定义的内溶素多肽或片段的核酸分子的群体，和/或编码如权利要求1至16中任一项所定义的内溶素多肽或片段的如权利要求18、19或20中所定义的重组多核苷酸表达载体的群体，任选地其中，所述宿主细胞另外包含如权利要求1至16中任一项所定义的内溶素多肽或片段并且其已经从所述分子或载体表达，任选地其中，所述宿主细胞为单细胞微生物的细胞，任选地为酵母细胞、细菌细胞(如乳酸杆菌)、真菌细胞或藻类细胞，优选藻类细胞，或其中，所述宿主细胞为植物的细胞。

22.根据权利要求21所述的宿主细胞，其中，所述群体的每个分子或载体编码如权利要求1至16中任一项所定义的相同的内溶素多肽或片段，或其中，所述群体的分子或载体编码两种或更多种如权利要求1至16中任一项所定义的不同的内溶素多肽或片段，任选地其中，所述宿主细胞另外包含所述内溶素多肽或片段并且其已经从所述分子或载体表达，任选地其中，所述宿主细胞为单细胞微生物的细胞，任选地为酵母细胞、细菌细胞(如乳酸杆菌)、真菌细胞或藻类细胞，优选藻类细胞，或其中，所述宿主细胞为植物的细胞。

23.一种细胞裂解物，包含：如权利要求1至16中任一项所定义的内溶素多肽或片段的群体并且其已经从如权利要求17、19或20中所定义的核酸分子和/或如权利要求18、19或20中所定义的重组多核苷酸表达载体表达，任选地其中，所述群体由如权利要求1至16中任一项所定义的相同的内溶素多肽或片段组成，或其中，所述群体由两种或更多种如权利要求1至16中任一项所定义的不同的内溶素多肽或片段组成，任选地其中，在宿主细胞中表达所述内溶素多肽或片段之后产生裂解物，所述宿主细胞为单细胞微生物的细胞，任选地为酵母细胞、细菌细胞(如乳酸杆菌)、真菌细胞或藻类细胞，优选藻类细胞，或其中，所述宿主细胞为植物的细胞。

24.一种组合物，包含如权利要求1至16中任一项所定义的具有抗微生物活性的内溶素多肽或片段的群体，任选地其中，所述群体由如权利要求1至16中任一项所定义的相同的内溶素多肽或片段组成，或其中，所述群体由两种或更多种如权利要求1至16中任一项所定义的不同的内溶素多肽或其片段组成。

25.根据权利要求24所述的组合物，其中，所述具有抗微生物活性的内溶素多肽或片段的群体：(a)作为纯化的多肽或片段添加至所述组合物中；或(b)其中，所述具有抗微生物活性的内溶素多肽或片段的群体作为一种或多种细胞提取物的组分添加至所述组合物中；或(c)其中，所述具有抗微生物活性的内溶素多肽或片段的群体作为纯化的多肽或片段并作为一种或多种细胞提取物的组分添加至所述组合物中；任选地其中，在(b)或(c)中所述细胞提取物为单细胞微生物的提取物，所述单细胞微生物任选地为酵母细胞、细菌细胞(如乳酸杆菌)、真菌细胞或藻类细胞，优选藻类细胞，或其中，所述细胞为植物的细胞。

26.一种组合物，包含宿主细胞的群体，其中，所述群体的宿主细胞包含在所述宿主细胞中表达的如权利要求1至16中任一项所定义的具有抗微生物活性的内溶素多肽或片段，其中，所述内溶素多肽或片段由如权利要求1至16中任一项所定义的相同的内溶素多肽或片段组成，或其中，所述内溶素多肽或片段由两种或更多种如权利要求1至16中任一项所定义的不同的内溶素多肽或其片段组成。

27.一种全细胞组合物，包含全宿主细胞的群体，其中，所述群体的细胞包含在所述宿主细胞中表达的如权利要求1至16中任一项所定义的具有抗微生物活性的内溶素多肽或片段，其中，所述内溶素多肽或片段由如权利要求1至16中任一项所定义的相同的内溶素多肽或片段组成，或其中，所述内溶素多肽或片段由两种或更多种如权利要求1至16中任一项所定义的不同的内溶素多肽或其片段组成。

28.根据权利要求26所述的组合物或根据权利要求27所述的全细胞组合物，其中，所述群体的宿主细胞为如权利要求21至22中任一项所定义的宿主细胞。

29.根据权利要求26所述的组合物或根据权利要求28所述的全细胞组合物，其中，所述群体的宿主细胞为单细胞微生物的细胞，任选地为酵母细胞、细菌细胞(如乳酸杆菌)、真菌细胞或藻类细胞。

30.根据权利要求26、28或29中任一项所述的组合物，或根据权利要求27、28或29中任一项所述的全细胞组合物，其中，所述群体的宿主细胞为藻类细胞，优选单细胞藻类细胞，更优选衣藻细胞，还更优选莱茵衣藻细胞。

31.根据权利要求30所述的组合物或全细胞组合物，其中，所述组合物包含干燥的生物质，所述干燥的生物质包含在藻类细胞中表达的所述具有抗微生物活性的内溶素多肽或片段，优选地，其中所述组合物或全细胞组合物是喷雾干燥的。

32.一种干燥的生物质组合物，包含如权利要求23中所定义的细胞裂解物，和/或包含如权利要求29或权利要求30中所定义的组合物和/或全细胞组合物，其中，所述干燥的生物质组合物包含：包含所述具有抗微生物活性的内溶素多肽或片段的细胞裂解物和/或包含在宿主细胞中表达的所述具有抗微生物活性的内溶素多肽或片段的宿主细胞。

33.根据权利要求32所述的干燥的生物质组合物，其中，所述群体的宿主细胞为藻类细胞，优选单细胞藻类细胞，更优选衣藻细胞，还更优选莱茵衣藻细胞；优选地，其中所述干燥的生物质组合物是喷雾干燥的。

34.一种抗微生物制剂，包含如权利要求1至16中任一项所定义的具有抗微生物活性的内溶素多肽或片段和药学上可接受的载体/赋形剂。

35.根据权利要求35所述的抗微生物制剂，其中，所述制剂包含宿主细胞的群体，其中，所述群体的宿主细胞根据权利要求21至22中任一项定义，或其中，所述制剂包含根据权利要求23所述的细胞裂解物，或其中，所述制剂包含根据权利要求24至31中任一项所述的组合物，或其中，所述制剂包含根据权利要求32或权利要求33所述的干燥的生物质组合物。

36.一种动物食品，包含：(a)一种或多种食品；和(b)根据权利要求1至16中任一项所述的具有抗微生物活性的分离的内溶素多肽或片段。

37.一种动物食品，包含：

(a)一种或多种食品；和

(b)还包含：

(i)根据权利要求21或22所述的宿主细胞；

(ii)根据权利要求23所述的细胞裂解物；

(iii)根据权利要求24至26中任一项或权利要求28至31中任一项所述的组合物；

(iv)根据权利要求27至31中任一项所述的全细胞组合物；

(v)根据权利要求32或权利要求33所述的干燥的生物质组合物；和/或

(vi)根据权利要求34或权利要求25所述的抗微生物制剂。

38.根据权利要求36或权利要求37所述的动物食品，其中，所述食品适合家禽食用，所述家禽任选地为肉鸡，优选家鸡；或其中，所述食品适合猪，优选家猪食用；或其中，所述食品适合啮齿动物，任选地小鼠或大鼠食用。

39.根据权利要求21或权利要求22所述的宿主细胞、根据权利要求23所述的细胞裂解物、根据权利要求24至26中任一项所述的组合物、根据权利要求27至31中任一项所述的全细胞组合物、根据权利要求32或权利要求33所述的干燥的生物质组合物、根据权利要求34或35所述的抗微生物制剂、或根据权利要求36至38中任一项所述的动物食品，包含两种或更多种与权利要求1至16中任一项所定义的不同的具有抗微生物活性的内溶素多肽或片段。

40.根据权利要求39所述的宿主细胞、细胞裂解物、组合物、全细胞组合物、干燥的生物质组合物、抗微生物制剂或动物食品，其中，由两种或更多种不同的内溶素多肽或片段提供的表现出的抗微生物活性为协同活性。

41.根据权利要求39或权利要求40所述的细胞裂解物、组合物、全细胞组合物、干燥的生物质组合物、抗微生物制剂或动物食品，还包含一种或多种具有抗微生物活性的添加剂，并且其中，所述添加剂不是内溶素多肽或片段。

42.根据权利要求41所述的细胞裂解物、组合物、全细胞组合物、干燥的生物质组合物、抗微生物制剂或动物食品，其中，一种或多种所述添加剂选自由抗生素剂、生物膜降解剂、生物膜抑制剂、诸如壳聚糖、EDTA和柠檬酸的螯合剂、诸如甘油的抑菌剂组成的组。

43.根据权利要求39至42中任一项所述的细胞裂解物、组合物、全细胞组合物、干燥的生物质组合物、抗微生物制剂或动物食品，还包含一种或多种选自由稳定剂、抗结块剂、益生剂、益生菌剂和诸如凝水营养基质的可食用凝胶组成的组中的添加剂。

44.根据权利要求39至43中任一项所述的细胞裂解物、组合物、全细胞组合物、干燥的生物质组合物、抗微生物制剂或动物食品，其中，所述细胞裂解物、组合物、全细胞组合物、抗微生物制剂或动物食品是喷雾干燥的、冻干的或呈粉末状。

45.根据权利要求1至16中任一项所述的分离的具有抗微生物活性的内溶素多肽或片段、根据权利要求21或权利要求22所述的宿主细胞、根据权利要求23所述的细胞裂解物、根据权利要求24至26中任一项所述的组合物、根据权利要求27至31中任一项所述的全细胞组合物、根据权利要求32或权利要求33所述的干燥的生物质组合物、根据权利要求34或35所述的抗微生物制剂、或根据权利要求36至38中任一项所述的动物食品，用作药物。

46.根据权利要求1至16中任一项所述的具有抗微生物活性的分离的内溶素多肽或片段、根据权利要求21或权利要求22所述的宿主细胞、根据权利要求23所述的细胞裂解物、根据权利要求24至26中任一项所述的组合物、根据权利要求27至31中任一项所述的全细胞组合物、根据权利要求32或权利要求33所述的干燥的生物质组合物、根据权利要求34或35所述的抗微生物制剂、或根据权利要求36至38中任一项所述的动物食品，用于治疗动物的细菌感染。

47.根据权利要求46所述的具有抗微生物活性的分离的内溶素多肽或片段、宿主细胞、细胞裂解物、组合物、全细胞组合物、干燥的生物质组合物、抗微生物制剂或动物食品的用途，其中，所述细菌感染为产气荚膜梭菌感染，任选地为由产气荚膜梭菌的A型菌株引起的感染。

48.根据权利要求1至16中任一项所述的具有抗微生物活性的分离的内溶素多肽或片段、根据权利要求21或权利要求22所述的宿主细胞、根据权利要求23所述的细胞裂解物、根据权利要求24至26中任一项所述的组合物、根据权利要求27至31中任一项所述的全细胞组合物、根据权利要求32或权利要求33所述的干燥的生物质组合物、根据权利要求34或35所述的抗微生物制剂、或根据权利要求36至38中任一项所述的动物食品，用于治疗由产气荚膜梭菌感染，任选地由产气荚膜梭菌的A型菌株引起的感染引起的疾病或疾患。

49.根据权利要求48所述的具有抗微生物活性的分离的内溶素多肽或片段、宿主细胞、细胞裂解物、组合物、全细胞组合物、干燥的生物质组合物、抗微生物制剂或动物食品的用途，其中，所述由产气荚膜梭菌感染引起的疾病或疾患为食物中毒、气性坏疽、坏死性肠炎、肠道病变和/或胃肠道感染。

50.一种预防或治疗动物的疾病或疾患的方法，所述方法包括：向动物施用预防或治疗有效量的根据权利要求1至16中任一项所述的具有抗微生物活性的分离的内溶素多肽或片段、根据权利要求21或权利要求22所述的宿主细胞、根据权利要求23所述的细胞裂解物、根据权利要求24至26中任一项所述的组合物、根据权利要求27至31中任一项所述的全细胞组合物、根据权利要求32或权利要求33所述的干燥的生物质组合物、根据权利要求34或35所述的抗微生物制剂、或根据权利要求36至38中任一项所述的动物食品。

51.一种预防或治疗养殖动物的疾病或疾患的方法，所述方法包括：向动物施用预防或治疗有效量的根据权利要求36至38中任一项所述的动物食品，任选地其中，所述动物为家禽动物，任选地为肉鸡，优选家鸡；或其中，所述动物为猪，优选家猪。

52.根据权利要求51所述的方法，其中，所述疾病或疾患为细菌感染，优选产气荚膜梭菌感染，任选地其中，所述产气荚膜梭菌病原体为产气荚膜梭菌的A型菌株。

53.根据权利要求51所述的方法，其中，所述疾病或疾患为由产气荚膜梭菌感染，任选地由产气荚膜梭菌的A型菌株引起的感染引起的疾病或疾患，如食物中毒、气性坏疽、坏死性肠炎、肠道病变和/或胃肠道感染。

54.一种获得根据权利要求1至16中任一项所述的具有抗微生物活性的分离的多肽或片段的方法，所述方法包括：

(d)在培养系统中培养包含根据权利要求17、19或20所述的核酸分子和/或根据权利要求18、19或20所述的重组多核苷酸表达载体的宿主细胞；

(e)收获培养的宿主细胞和/或培养液；并且

(f)从所述宿主细胞和/或培养液中分离所述多肽或片段。

55.一种获得包含根据权利要求1至16中任一项所述的具有抗微生物活性的分离的内溶素多肽或片段的干燥的生物质组合物的方法，所述方法包括：

(e)在表达所述具有抗微生物活性的内溶素多肽或片段的条件下，在培养系统中培养根据权利要求21或权利要求22所述的宿主细胞；

(f)从所述培养系统中收获并分离所述宿主细胞；

(g)干燥所述宿主细胞以形成干燥的生物质；并且

(h)将所述干燥的生物质配制成组合物。

56.一种获得包含根据权利要求1至16中任一项所述的具有抗微生物活性的分离的内溶素多肽或片段的干燥的生物质组合物的方法，所述方法包括：

(e)在表达所述具有抗微生物活性的内溶素多肽或片段的条件下，在培养系统中培养根据权利要求21或权利要求22所述的宿主细胞；

(f)从培养的宿主细胞中生成裂解物；

(g)干燥所述裂解物以形成干燥的生物质；并且

(h)将所述干燥的生物质配制成组合物；

其中，所述裂解物是通过在所述培养系统中原位裂解宿主细胞而生成的，或

其中，所述裂解物是通过在从所述培养系统中已经收获并分离宿主细胞之后裂解所述宿主细胞而生成的。

57.根据权利要求55或权利要求56所述的获得干燥的生物质组合物的方法，其中，所述宿主细胞为藻类细胞，优选单细胞藻类细胞，更优选衣藻细胞，还更优选莱茵衣藻细胞。

58.根据权利要求55至57中任一项所述的获得干燥的生物质组合物的方法，其中，干燥以形成干燥的生物质的步骤包括喷雾干燥。

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