KR101180419B1 - 어류의 세균성 질병에 대한 복합 불활화 백신 - Google Patents

어류의 세균성 질병에 대한 복합 불활화 백신 Download PDF

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Abstract

발명은 어류의 세균성 질병을 예방할 수 있는 복합 불활화 백신에 관한 것으로, 보다 상세하게는 Listonella anguillarum, Streptococcus iniae, Streptococcus parauberis 및 Tenacibaculum maritimum의 불활화균체를 유효성분으로 포함하는 어류의 세균성 질병에 대한 예방 백신 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 복합 백신은 높은 면역원성 및 백신 접종시의 안정성을 가지며, 연쇄구균증, 비브리오증, 활주세균증을 포함하는 어류의 세균성 질병을 1~2회의 예방접종으로 동시에 예방할 수 있기 때문에 백신접종 시 요구되는 노동력이 감소하고, 또한 항생제 투여 없이 어류의 세균성 질병을 효과적으로 차단할 수 있어 안전하면서도 경제적으로 어류의 생산 및 공급을 가능하게 한다.
넙치, 복합 백신, 불활화 백신, 연쇄구균증, 비브리오증, 활주세균증

Description

어류의 세균성 질병에 대한 복합 불활화 백신{COMBINED VACCINE AGAINST STREPTOCOCCOSIS, VIBRIOSIS, TENACIBACULOSIS}
본 발명은 Listonella anguillarum, Streptococcus iniae, Streptococcus parauberis 및 Tenacibaculum maritimum 의 불활화균체를 일정비율로 혼합한, 어류의 상기 세균성 질병을 예방할 수 있는 복합백신 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
어류는 여러 가지 질병에 감염될 가능성이 높고, 어류의 양식산업에서 가장 문제가 되고 있는 부분은 세균성 질병으로, 연쇄구균증, 비브리오증, 활주세규증등 다양한 질병이 존재한다(Sommerset I, et al., Expert Rev Vaccines. 2005 Feb;4(1):89-101).
어류의 질병의 치료에 대하여 종래에는 항생제를 사료와 함께 양식탱크에 투입하여 어류에 경구투여되도록 함으로써 치료하여왔으나, 이러한 방법은 조기치료시에는 효과가 높지만, 연쇄구균(Streptococcus sp.)등에 의한 세균성 질병이 발병 하면 병원균이 장관내에 정착하여 증식하고 반복적으로 발생하여 치료가 잘 되지 않으며, 다양한 항생제의 사용은 대량의 다제내성 병원체를 양산할 가능성이 높은 단점이 있다. 또한, 항생제 투여에 대한 현대 일반 소비자의 반감으로 어류 소비량이 저하되어 어류 양식업계의 경제적 손실이 매우 크므로 국민 건강과 양식어민 및 관련산업의 소득증대를 위해 상기 질병들에 대한 항생제 대체 치료제의 개발이 요구되어 왔다.
L. anguillarum은 초기에는 Vibrio anguillarum으로 불리웠으며, 그람음성간균인 Vibrionaceae(비브리오 나세에과)의 일종으로서, 출혈성 패혈증(vibriosis)의 원인균으로 다양한 어종에 감염된다. 상기 세균은 해수 중에 상존하며 주로 선별이나 이동시 취급 부주의로 인하여 상처가 생기면 감염이 일어나거나, 다른 질병에 의한 2차 감염을 유발시키는 기회 감염적 병원세균이다. 어패류의 패혈증을 제어하기 위한 대책으로서 과거 다양한 방법들이 시도되어 왔으나, 그 효과에 있어서는 뚜렷한 결과를 보여주지 못하고 있는 실정이다.
어류의 연쇄구균증은 세균성 질병 중에서 피해규모가 매우 큰 질병으로, 관련된 병원체가 다양하여, Streptococcus iniae, Streptococcus parauberis 등 다양한 원인체들이 보고되고 있다. 이러한 원인체 중 Streptococcus iniae는 전 세계의 다양한 어종에 연쇄구균증을 유발하는 전염성 질병의 원인체로서, 병원성도 강하여 양식어류에 대한 경제적 손실률이 높은 병원체이다. 연쇄구균증의 감염 증상을 보면, 체색흑화, 안구 이상(돌출. 백탁. 충혈), 아가미 퇴색, 출혈이 나타나며, 중증어에서는 복수의 저류에 의한 복부 팽만, 신장과 비장이 종대되어 폐사가 일어난 다. 국내에서 이 질병은 해수어류 양식장에서 수온이 18℃ 이상으로 상승하는 6월에서부터 10월까지의 고수온기에 주로 집단적으로 발병하여 50% 이상의 급성폐사를 일으키며, 치어에서 성어에 이르기까지 연령에 관계없이 감염된다. 또한 최근에는 넙치의 경우 S. iniae에 감염외에 S. parauberis 감염에 의한 연쇄구균증이 보고되고 있다.
활주세균증은 수온이 상승하기 시작하는 봄부터 고수온기인 여름에 걸쳐 자주 발생되며 넙치 자어와 치어에 큰 피해를 일으킨다. 원인체인 T.maritimum은 초기 Flexibacter maritimus로 불리웠으며, 그람 음성 장간균으로 증식적정온도는 15~20℃정도이다. 활주세균증에 감염되면 넙치의 체표면이 회색으로 변하거나 원형의 상처, 궤양이 관찰되며 지느러미가 부식되면서 골격만이 남는다. 아가미가 부식된 넙치는 체색이 검어지고 힘없이 떠다니는 현상을 보인다. 최근에는 넙치 성어의 아가미 부식을 일으키는 원인체로도 알려져 있다.
상기와 같은 어류의 세균성 질병을 치료하기 위한 수단으로, 본 발명자들은 면역원성 및 백신 접종시의 안정성을 가지며, 다양한 종류의 어류의 세균성 질병을 1~2회의 예방접종으로 동시에 예방할 수 있는 복합백신을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, L. anguillarum V189균주(기탁번호 : KCTC11446BP), Streptococcus iniae S1398균주(기탁번호 : KCTC11444BP), Streptococcus parauberis S1735균주(기탁번호: KCTC11445BP) 및 T. maritimum FL41균주(기탁번호 : KCTC11447BP)의 불활화균체를 일정비율로 혼합한 복합백신이 다양한 세균성 질병에 대한 방어능력을 어류에 부여할 수 있으며, 어류의 면역반응을 자극시킬 수 있음을 실험적으로 확 인함으로써 본 발명을 완성하였다. 특히 제주특별자치도해양수산연구원에서 최근의 넙치 질병발생동향을 조사한 결과 세균성 질병이 복합감염 위주로 발생하고 있으며 그 중에서도 연쇄구균증과 활주세균증 복합감염비율이 연쇄구균증 발생시료의 50%가 넘게 조사되고 있음을 감안하여 이에 대한 예방에 보다 중점을 두고 발명을 완성하였다. 또한 최근에 발병하는 넙치 연쇄구균증의 원인체는 대부분 Streptococcus parauberis로 그 분리 비율이 2007년과 2008년도에 각각 83.56%와 88.97%로 조사되고 있어 Streptococcus parauberis 균주를 강화하여 발명을 하였다.
넙치 연쇄구균증 진단건수 중 활주세균증 복합 감염 건수(07년)
월별 연쇄구균증
진단 건수		 연쇄구균증
단독감염 건수		 연쇄구균증 및 활주세균증
복합감염 건수		 연쇄구균증과 활주세균증외 복합감염건수
'07. 01 18 1 9 8
02 6 0 6 0
03 11 1 4 6
04 14 2 10 2
05 17 1 10 6
06 22 3 17 2
07 24 5 10 9
08 22 1 13 8
09 18 0 7 11
10 39 10 16 13
11 23 4 6 13
12 14 1 4 9
계 228 29 112 87
넙치 연쇄구균증 진단건수 중 활주세균증 복합 감염 건수(08년)
월별 연쇄구균증
진단 건수		 연쇄구균증
단독감염 건수		 연쇄구균증 및 활주세균증
복합감염 건수		 연쇄구균증과 활주세균증외 복합감염건수
'08. 01 17 1 14 2
02 6 0 3 3
03 4 0 2 2
04 7 3 2 2
05 2 1 1 0
06 11 1 8 2
07 18 3 7 8
08 17 4 10 3
09 11 2 7 2
10 18 6 9 3
11 11 2 6 3
12 10 2 6 1
계 132 25 75 31
본 발명의 목적은 Listonella anguillarum, Streptococcus iniae, Streptococcus parauberis 및 Tenacibaculum maritimum 의 불활화균체를 일정비율로 혼합한, 어류의 세균성 질병을 예방할 수 있는 복합백신을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 복합 백신의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위해서 Listonella anguillarum, Streptococcus iniae, Streptococcus parauberis 및 Tenacibaculum maritimum 의 불활화균체를 일정비율로 혼합한, 어류의 세균성 질병을 예방할 수 있는 복합백신을 제공한다. 보다 바람직하게는 상기 균체는 Listonella anguillarum V189균주(기탁번호 : KCTC11446BP), Streptococcus iniae S1398균주(기탁번호 : KCTC11444BP), Streptococcus parauberis S1735균주(기탁번호: KCTC11445BP) 및 T. maritimum FL41균주(기탁번호 : KCTC11447BP)로 특정된 불활화균체를 일정비율로 혼합한, 어류의 세균성 질병을 예방할 수 있는 복합백신을 제공한다.
본 발명의 Listonella anguillarum V189균주(기탁번호 : KCTC11446BP)는 16S rRNA 유전자 염기서열 비교분석 결과, L. anguillarum strain SMP 1(Accession No. EF091702), V. anguillarum strain LMG 4437(Accession No. X16895) 및 L. anguillarum strain NCMB 6(Accession No. AM235737)와 각각 97.62%, 96.85% 및 97.11%의 상동성을 가지며, Streptococcus iniae S1398균주(기탁번호 : KCTC11444BP)는 Streptococcus iniae strain ATCC 29178(Accession No. AF335572)와 99.27%의 상동성을 가짐을 확인하였다.
Streptococcus parauberis S1735균주(기탁번호: KCTC11445BP) 는 16S rRNA 유전자 염기서열 비교분석 결과, Streptococcus parauberis strain DSM 6631(Accession No. AY584477), Streptococcus parauberis strain LMG 14376(Accession No. AY942573) 및 Streptococcus parauberis strain 349(Accession No. AY942570)와 각각 99.86%, 99.86% 및 99.93%의 상동성을 가지며, Tenacibaculum maritimum FL41균주(기탁번호 : KCTC11447BP)는 T. maritimum strain IFO 15946(Accession No. AB078057)와 99.73%의 상동성을 가짐을 확인하였다.
따라서 Listonella anguillarum V189균주(기탁번호 : KCTC11446BP), Streptococcus iniae S1398균주(기탁번호 : KCTC11444BP), Streptococcus parauberis S1735균주(기탁번호: KCTC11445BP) 및 Tenacibaculm maritimum FL41균주(기탁번호 : KCTC11447BP)를 유효성분으로 포함하는 복합백신은 출혈성 패혈증, 연쇄구균증, 활주세균증과 같은 어류의 세균성 질병에 대한 항체 형성 및 방어가 가능하다.
본 발명의 일 실시예에 따른 복합백신은 바람직하게는 상기 불활화 균체 Listonella anguillarum V189균주(기탁번호 : KCTC11446BP), Streptococcus iniae S1398균주(기탁번호 : KCTC11444BP), Streptococcus parauberis S1735균주(기탁번호: KCTC11445BP) 및 Tenacibaculm maritimum FL41이 1:1:1:1 로 혼합되는 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 넙치의 세균성 질병에 대한 백신으로 기능할 수 있다.
본 발명에서 세균성 질병은 S. iniae 및 S. parauberis에 의한 연쇄구균증, T. maritimum에 의한 활주세균증, L. angullarum에 의한 비브리오증으로서, 본 발명에 사용된 각 균주는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 모든 방법으로 불활화 될 수 있으며, 바람직하게는 0.2%의 포르말린을 사용하여 불활화 할 수 있다.
본 발명은 또한 어류의 세균성 질병을 예방할 수 있는 복합백신의 제조방법을 제공한다.
상기 제조방법은 바람직하게는 하기의 단계를 포함할 수 있다.
a) Listonella anguillarum, Streptococcus iniae, Streptococcus parauberis 및 Tenacibaculum maritimum를 -40℃~-85℃에서 보존하는 단계;
b) 보존된 상기 균주들을 백신 제조용 종균으로 제조하는 단계;
c) 상기 b) 단계의 제조용 종균을 배지에 접종하여 배양하는 단계;
d) 상기 균주를 불활화시키는 단계;
e) 불활화된 각 균주배양액을 습중량 30~50mg/ml의 농도로 희석하여 0~10℃에 보관하는 단계; 및
f) 상기 단계의 균주배양액을 동일비율로 혼합하는 단계를 포함하는 어류의 세균성 질병에 대한 예방 백신의 제조방법.
보다 바람직하게는 상기 백신 제조방법은 다음과 같은 단계를 포함할 수 있다.
a) Listonella anguillarum V189균주(기탁번호 : KCTC11446BP), Streptococcus iniae S1398균주(기탁번호 : KCTC11444BP), Streptococcus parauberis S1735균주(기탁번호: KCTC11445BP) 및 Tenacibaculum maritimum FL41균주(기탁번호 : KCTC11447BP)를 -40℃~-85℃에서 보존하는 단계;
b) 보존된 Listonella anguillarum V189균주(기탁번호 : KCTC11446BP), Streptococcus iniae S1398균주(기탁번호 : KCTC11444BP) 및 Streptococcus parauberis S1735균주(기탁번호: KCTC11445BP)를 1.5% 염화나트륨을 첨가한 비에이치아이 고체배지(BHIA, Brain Heart Infusion Agar: Brain Heart-solids from infusion 8.0g, Pancreatic digest of casein 16.0g, Peptic digest of animal tissue 5.0g, Sodium chloride 5.0g, Dextrose 2.0g, Disodium phosphate 2.5g, Agar 13.5g, 탈이온수 1L)에 접종하여 29℃에서 18~26시간동안 배양한 후, 비에이치아이 액체배지(BHI, Brain Heart Infusion: Calf brain- infusion from 200g 7.7g, Beef Brains-Infusion from 250g 9.8g, Proteose Peptone 10.0g, Dextrose 2.0g, Sodium chloride 5.0g, Disodium Phosphate 2.5g, 탈이온수 1L) 액체 배지에 배양하여 Listonella anguillarum V189균주(기탁번호 : KCTC11446BP), Streptococcus iniae S1398균주(기탁번호 : KCTC11444BP) 및 Streptococcus parauberis S1735균주(기탁번호: KCTC11445BP)의 백신 제조용 종균을 제조하는 단계;
c) 보존된 Tenacibaculm maritimum FL41균주(기탁번호 : KCTC11447BP)를 Marine Agar 2216 배지(조성 : NaCl 19.45g, Agar 15.0g, MgCl2 8.8g, Peptone 5.0g, Na2SO3 3.24g, CaCl2 1.8g, yeast extract 1.0g, KCl 0.55g, NaHCO3 0.16g, Ferric citrate 0.1g, KBr 0.08g, SrCl2 0.03g, H3BO3 0.02g, Na2HPO4 8.0㎎, Na2SiO3 4.0㎎, NaF 2.4㎎, NH4NO3 1.6㎎, 탈이온수 1L)에 접종하여 29℃에서 18~26시간동안 배양한 후, Marine Broth 2216 배지 (조성: NaCl 19.45g, MgCl2 8.8g, Peptone 5.0g, Na2SO3 3.24g, CaCl2 1.8g, yeast extract 1.0g, KCl 0.55g, NaHCO3 0.16g, Ferric citrate 0.1g, KBr 0.08g, SrCl2 0.03g, H3BO3 0.02g, Na2HPO4 8.0㎎, Na2SiO3 4.0㎎, NaF 2.4㎎, NH4NO3 1.6㎎, 탈이온수 1L)에 배양하여 Tenacibaculm maritimum FL41균주(기탁번호 : KCTC11447BP)의 백신 제조용 종균을 제조하는 단계;
d) 상기 b) 단계 및 c) 단계의 제조용 종균을 하기의 배양배지에 각각 2%비율로 접종하고, pH 7.2, 150～200 rpm으로 교반하면서 24시간 배양하는 단계;
비에이치아이 액체배지(BHI, Brain Heart Infusion: Calf brain- infusion from 200g 7.7g, Beef Brains-Infusion from 250g 9.8g, Proteose Peptone 10.0g, Dextrose 2.0g, Sodium chloride 5.0g, Disodium Phosphate 2.5g, 탈이온수 1L),
Marine Broth 2216 배지 (조성: NaCl 19.45g, MgCl2 8.8g, Peptone 5.0g, Na2SO3 3.24g, CaCl2 1.8g, yeast extract 1.0g, KCl 0.55g, NaHCO3 0.16g, Ferric citrate 0.1g, KBr 0.08g, SrCl2 0.03g, H3BO3 0.02g, Na2HPO4 8.0㎎, Na2SiO3 4.0㎎, NaF 2.4㎎, NH4NO3 1.6㎎, 탈이온수 1L)
e) 각각의 균주배양액에 포르말린 농도가 0.3%가 되도록 첨가하고 실온에서 24시간동안 두어 상기 균주를 불활화시키는 단계;
f) 불활화된 각 균주배양액은 7,500rpm에서 연속원심분리하여 침천균체를 수거하고 습중량을 측정한 후 0.2% 포르말린이 첨가된 멸균 인산완충식염수에 습중량 40mg/ml의 농도로 희석하여 4℃에 보관하는 단계; 및
g) 상기 단계의 균주배양액을 동일비율로 혼합하는 단계.
본 발명의 일 실시예에서 넙치에 복합백신의 투여 후 시간경과에 따른 항체가 보유 시험을 실시한 결과, 1회 접종군의 경우에도 모든 실험구에서 백신 투여 후 2주째부터 높은 항체가가 관찰되었으며 L. anguillarum V189균주에 대한 항체가 는 12주째까지도 26 이상의 높은 항체가가 유지되며, 2회 접종군의 경우 14주째까지도 26 이상의 높은 항체가가 유지됨을 알 수 있다.
또한 본 발명에 따른 복합백신 접종에 따른 누적 폐사율 및 상대 생존율을 실험한 결과 넙치에 1회 접종한 경우, 백신 투여 후 21일 후 누적폐사율은 3.3~13.3%로서, 상대 생존율은 Listonella anguillarum V189균주(기탁번호 : KCTC11446BP), Tenacibaculum maritimum FL41균주(기탁번호 : KCTC11447BP)균주, Streptococcus iniae S1398균주(기탁번호 : KCTC11444BP) 및 Streptococcus parauberis S1735균주(기탁번호: KCTC11445BP) 각각에 대하여 94,5%, 84.7%, 85% 및 91.6%가 됨을 확인하였다.
이에 더하여, 본 발명에 따른 복합백신의 질병검사결과, 세균 , 기생충, 및 바이러스가 불검출 되었으며, 폐사된 실험군이 없기 때문에, 본 발명의 복합백신은 안정성을 가짐을 알 수 있다.
본 발명에 따른 복합 백신은 높은 면역원성 및 백신 접종시의 안정성을 가지며, S. iniae, S. parauberis, T. maritimum, 및 L. anguillarum을 포함하는 어류의 세균성 질병을 1회 또는 2회의 예방접종으로 동시에 예방할 수 있기 때문에 백신접종 시 요구되는 노동력이 감소하고, 또한 항생제 투여 없이 어류의 세균성 질병을 효과적으로 차단할 수 있어 안전하면서도 경제적으로 어류의 생산 및 공급을 가능하게 한다. 특히, 최근 늘어나고 있는 연쇄구균증과 활주세균증의 복합 세균성 질병의 예방에 있어서 본 발명에 따른 복합 백신은 하나의 백신 접종을 통하여 효율적으로 상기 복합 세균성 질병 감염을 차단할 수 있어 양식업계에 경제적 이득을 가져올 것으로 기대된다.
본 발명은 Listonella anguillarum, Streptococcus iniae, Streptococcus parauberis 및 Tenacibaculum maritimum의 불활화균체를 유효성분으로 포함하는 어류의 세균성 질병에 대한 복합 백신 및 이의 제조방법을 제공한다.
보다 바람직하게는, 본 발명은 상기 균체가 Listonella anguillarum V189균주(기탁번호 : KCTC11446BP), Streptococcus iniae S1398균주(기탁번호 : KCTC11444BP), Streptococcus parauberis S1735균주(기탁번호: KCTC11445BP) 및 Tenacibaculum maritimum FL41균주(기탁번호 : KCTC11447BP)인 것을 특징으로 하는 불활화균체를 일정비율로 혼합한, 어류의 세균성 질병을 예방할 수 있는 복합백신 및 이의 제조방법에 대한 것이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 백신 조제용 균주
본 발명에서 백신 제조용 균주로 제주특별자치도해양수산연구원과 녹십자수의약품주식회사에서 공동으로 분리한 Listonella anguillarum V189균주(기탁번호 : KCTC11446BP), Streptococcus iniae S1398균주(기탁번호 : KCTC11444BP), Streptococcus parauberis S1735균주(기탁번호: KCTC11445BP) 및 Tenacibaculum maritimum FL41균주(기탁번호 : KCTC11447BP)를 사용하였으며, 각 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열을 비교하였으며, 생화학적 성상 및 LD 70(균주 치사량)에 관하여 실험하였다.
1-1. 백신 조제용 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열 비교
각 균주의 분자생물학적 동정을 위해 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석하였다. 16S rRNA 유전자 염기서열 분석은 우선 각각의 해당 균주의 DNA를 추출한 후 27F (5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC A-3')와 1522R(5'-AAG GAG GTG ATC CAR CCG CA-3') primer set을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 수행조건은 95℃에서 5분간 변성 후 95℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 1분의 주기로 33회 반복 후 최종 72℃에서 10분간 확장하였고 유전자 증폭을 위한 중합효소는 Taq DNA polymerase(TaKaRa, Japan)를 사용하였다. 증폭된 PCR산물을 TOPO TA cloning kit(Invitrogen, USA)를 이용하여 제조회사의 방법에 따라 cloning을 실시하였고 각 균주별 clone을 SolGent사(한국)에 의뢰하여 염기서열을 분석하였다. 염기서열 분석결과를 미국국립생물공학정보센터(NCBI, National Center for Biotechnology Information)의 테이터베이스(Data base)에 등록된 동종균주들의 염기서열과 비교하기 위해 Clustal W program과 PHYLIP program을 이용하였으며 그 결과 Listonella anguillarum V189균주(기탁번호 : KCTC11446BP)는 L. anguillarum strain SMP 1(Accession No. EF091702), V. anguillarum strain LMG 4437(Accession No. X16895) 및 L. anguillarum strain NCMB 6(Accession No. AM235737)와 각각 97.62%, 96.85% 및 97.11%의 상동성을 가지며, Streptococcus iniae S1398균주(기탁번호 : KCTC11444BP)는 S. iniae strain ATCC 29178(Accession No. AF335572)와 99.27%의 상동성을 가짐을 확인하였다.
Streptococcus parauberis S1735균주(기탁번호: KCTC11445BP) 는 16S rRNA 유전자 염기서열 비교분석 결과, S. parauberis strain DSM 6631(Accession No. AY584477), S. parauberis strain LMG 14376(Accession No. AY942573) 및 S. parauberis strain 349(Accession No. AY942570)와 각각 99.86%, 99.86% 및 99.93%의 상동성을 가지며, Tenacibaculum maritimum FL41균주(기탁번호 : KCTC11447BP)는 T. maritimum strain IFO 15946(Accession No. AB078057)와 99.73%의 상동성을 가짐을 확인하였다.
따라서, 각 균주들이 동일 strain에 대하여 높은 상동성을 나타냄을 확인함으로써 본 실험에서 사용된 균주 이외의 동일 유사 strain에 의한 어류의 세균성 질병에 대한 항체제조가 가능하게 됨을 알 수 있다.
(1) Listonella(Vibrio) anguillraum V189 16S rRNA gene sequence alignment
L. anguillarum strain SMP 1(Accession No. EF091702) : Homology 97.62%
V. anguillarum strain LMG 4437(Accession No. X16895): Homology 96.85%
L. anguillarum strain NCMB 6(Accession No. AM235737): Homology 97.11%
V189 GGACGGGAGAGTATTGCCTGTGACATTGACCTGATGGGGGTGATAACCGTTGGAAGGAAT
EF091702 GGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAAATTGCCCTGATGTGGGGGATAACCATTGGAAACGAT
X16895 GGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAAATTGCCCTGATGTGGGGGATAACCATTGGAAACGAT
AM235737 GGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAAATTGCCCTGATGTGGGGGATAACCATTGGAAACGAT
******* ***** ***** ** **** ******* *** ******* ****** **
V189 GCGCTAATTACGCATGATGCCTACGGGCCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTCGCGTCA
EF091702 G-GCTAATACCGCATGATGCCTACGGGCCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTCGCGTCA
X16895 G-GCTAATACCGCATGATGCCTACGGGCCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTCGCGTCA
AM235737 G-GCTAATACCGCATGATGCCTACGGGCCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTCGCGTCA
* ****** **************************************************
V189 GGATATGCCTAGGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCC
EF091702 GGATATGCCTAGGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCC
X16895 GGATATGCCTAGGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCC
AM235737 GGATATGCCTAGGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCC
************************************************************
V189 CTACCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCGCACTGGAACTGATACACGGTCCAGACTCCTAC
EF091702 CTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTAC
X16895 CTAGCTNGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTAC
AM235737 CTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTAC
*** ** ******************** ************ *******************
V189 GGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCTTGCCGCGT
EF091702 GGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGT
X16895 GGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTNATGCAGCCATGCCGCGT
AM235737 GGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGT
****************************************** ******** ********
V189 GTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGTCGTGAGGAAGGTGGTGTTGTTA
EF091702 GTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGTCGTGAGGAAGGTGGTGTTGTTA
X16895 GTATGAAGAAGGC-TTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGTCATGAGGAAGGTGGTGTTGTTA
AM235737 GTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGTCGTGAGGAAGGTGGTGTTGTTA
************* ************************* ********************
V189 ATAGCACCATCATTTGACGTTAGCGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGC
EF091702 ATAGCAGCATCATTTGACGTTAGCGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGC
X16895 ATAGCAGCATCATTTGACGTTAGCGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGC
AM235737 ATAGCAGCATCATTTGACGTTAGCGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGC
****** *****************************************************
V189 CGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAACCGCATGCAGG
EF091702 CGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCATGCAGG
X16895 CGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCATGCAGG
AM235737 CGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCATGCAGG
*********** ******** **************************** **********
V189 TGGTGGATTAAGTCATATGTCGAAATACCGGGGYTCAACCTCGGAACCGCATTTGAAMYT
EF091702 TGGTGGATTAAGTCAGATGT-GAAAGCCCGGGGCTCAACCTCGGAACCGCATTTGAAACT
X16895 TGGTGGATTAAGTCAGATGT-GAAAGCCCGGGTCTCAACCTCGGAACCGCATTTGAAACT
AM235737 TGGTGGATTAAGTCAGATGT-GAAAGCCCGGGGCTCAACCTCGGAACCGCATTTGAAACT
*************** **** **** ***** *********************** *
V189 GGTYCACTAGAGTACTGTAGAGGGGGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGA
EF091702 GGTTCACTAGAGTACTGTAGAGGGGGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGA
X16895 GGTTCACTAGAGTACTGTAGAGGGGGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGA
AM235737 GGTTCACTAGAGTACTGTAGAGGGGGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGA
*** ********************************************************
V189 GATCTGAAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAGATACTGACACTCAGATGC
EF091702 GATCTGAAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAGATACTGACACTCAGATGC
X16895 GATCTGAAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAGATACTGACACTCAGATGC
AM235737 GATCTGAAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAGATACTGACACTCAGATGC
************************************************************
V189 GAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCT
EF091702 GAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCT
X16895 GAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCT
AM235737 GAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCT
************************************************************
V189 ACTTGGAGGTTGTGGCCTTGAGCCGTGGCTTTCGGAGCTAACGCGTTAAGTAGACCGCCT
EF091702 ACTTGGAGGTTGTGGCCTTGAGCCGTGGCTTTCGGAGCTAACGCGTTAAGTAGACCGCCT
X16895 ACTTGGAGGTTGTGGCCTTGAGCCGTGGCTTTCGGAGCTAACGCGTTAAGTAGACCGCCT
AM235737 ACTTGGAGGTTGTGGCCTTGAGCCGTGGCTTTCGGAGCTAACGCGTTAAGTAGACCGCCT
************************************************************
V189 GGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGKTG
EF091702 GGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTG
X16895 GGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTG
AM235737 GGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTG
********************************************************* **
V189 GAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAGCCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGA
EF091702 GAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGA
X16895 GAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCTACAGA
AM235737 GAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCTACAGA
******************** ************ ******************** * ***
V189 AGCCAGCGGAGACGCAGGTGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGTTGCATGGCTGTCG
EF091702 AGCCAGCGGAGACGCAGGTGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCG
X16895 ATCCTGCGGAGACGCGGGAGTGC-TTCGGGAACTGTAAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCG
AM235737 ATCCTGCGGAGACGCGGGAGTGCCTTCGGGAACTGTAAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCG
* ** ********** ** **** ********** * ********* *************
V189 TCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTGT
EF091702 TCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTGT
X16895 TCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTGT
AM235737 TCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTGT
************************************************************
V189 TTGCCAGCGAGTAATGTCGGGAACTCCAGGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGT
EF091702 TTGCCAGCGAGTAATGTCGGGAACTCCAGGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGT
X16895 TTGCCAGCGAGTAATGTCGGGAACTCCAGGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGT
AM235737 TTGCCAGCGAGTAATGTCGGGAACTCCAGGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGT
************************************************************
V189 GGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGC
EF091702 GGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGC
X16895 GGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGC
AM235737 GGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGC
************************************************************
V189 GCATACAGAGGGCAGCAAGCTAGCGATAGTGAGCGAATCCCAAAAAGTGCGTCGTAGTCC
EF091702 GCATACAGAGGGCAGCAAGCTAGCGATAGTGAGCGAATCCCAAAAAGTGCGTCGTAGTCC
X16895 GCATACAGAGGGCAGCAAGCTAGCGATAGTGAGCGAATCCCAAAAAGTGCGTCGTAGTCC
AM235737 GCATACAGAGGGCAGCAAGCTAGCGATAGTGAGCGAATCCCAAAAAGTGCGTCGTAGTCC
************************************************************
V189 GGACTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCG
EF091702 GGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCG
X16895 GGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCG
AM235737 GGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCG
*** **********************************************
(2) Tenacibaculum maritimum FL41 16S rRNA gene sequence alignment
? T. maritimum strain IFO 15946(Accession No. AB078057): Homology 99.73%
FL41 GATGAACGCTAGCGGCAGGCTTAACACATGCAAGTCGAGGGGTAACATTGTAGCTTGCTA
AB078057 GATGAACGCTAGCGGCAGGCTTAACACATGCAAGTCGAGGGGTAACATTGTAGCTTGCTA
************************************************************
FL41 CAGATGACGACCGGCGCACGGGTGCGTAACGCGTATAGAATCTGCCTTCTACAGAGGGAT
AB078057 CAGATGACGACCGGCGCACGGGTGCGTAACGCGTATAGAATCTGCCTTCTACAGAGGGAT
************************************************************
FL41 AGCCTTTAGAAATGAAGATTAATACCTCATAACACTTTGGGATGGCATCGTTTTAAAGTT
AB078057 AGCCTTTAGAAATGAAGATTAATACCTCATAACACTTTGGAATGGCATCGTTTTAAAGTT
**************************************** *******************
FL41 AAAGATTTATCGGTAGAAGATGACTATGCGTCCTATTAGCTAGATGGTAAGGTAACGGCT
AB078057 AAAGATTTATCGGTAGAAGATGACTATGCGTCCTATTAGCTAGATGGTAAGGTAACGGCT
************************************************************
FL41 TACCATGGCAACGATAGGTAGGGGTCCTGAGAGGGAGATCCCCCACACTGGTACTGAGAC
AB078057 TACCATGGCAACGATAGGTAGGGGTCCTGAGAGGGAGATCCCCCACACTGGTACTGAGAC
************************************************************
FL41 ACGGACCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGGCAATGGAGGCAACTCTG
AB078057 ACGGACCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGGCAATGGAGGCAACTCTG
************************************************************
FL41 ACCCAGCCATGCCGCGTGCAGGAAGACTGCCCTATGGGTTGTAAACTGCTTTTATACAGG
AB078057 ACCCAGCCATGCCGCGTGCAGGAAGACTGCCCTATGGGTTGTAAACTGCTTTTATACAGG
************************************************************
FL41 AAGAAACGTACCTACGAGTAGGTATTTGACGGTACTGTAAGAATAAGGACCGGCTAACTC
AB078057 AAGAAACGTACCTACGAGTAGGTATTTGACGGTACTGTAAGAATAAGGACCGGCTAACTC
************************************************************
FL41 CGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTCCGAGCGTTATCCGGAATCATTGGGTTTAA
AB078057 CGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTCCGAGCGTTATCCGGAATCATTGGGTTTAA
************************************************************
FL41 AGGGTCCGCAGGCGGTCGATTAAGTCAGAGGTGAAATCCCATAGCTTAACTATGGAACTG
AB078057 AGGGTCCGCAGGCGGTCGATTAAGTCAGAGGTGAAATCCCATAGCTTAACTATGGAACTG
************************************************************
FL41 CCTTTGATACTGGTTGACTTGAGTGATACGGAAGTAGATAGAATATGTAGTGTAGCGGTG
AB078057 CCTTTGATACTGGTTGACTTGAGTAATACGGAAGTAGATAGAATATGTAGTGTAGCGGTG
************************ ***********************************
FL41 AAATGCATAGATATTACATAGAATACCGATTGCGAAGGCAGTCTACTACGTATTTACTGA
AB078057 AAATGCATAGATATTACATAGAATACCGATTGCGAAGGCAGTCTACTACGTATTTACTGA
************************************************************
FL41 CGCTCATGGACGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGT
AB078057 CGCTCATGGACGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGT
************************************************************
FL41 AAACGATGGACACTAGTTGTTGGGAAATATCTCAGTGACTAAGCGAAAGTGATAAGTGTC
AB078057 AAACGATGGACACTAGTTGTTGGGAAATGTCTCAGTGACTAAGCGAAAGTGATAAGTGTC
**************************** *******************************
FL41 CCACCTGGGGAGTACGATCGCAAGATTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAA
T. CCACCTGGGGAGTACGATCGCAAGATTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAA
************************************************************
FL41 GCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGATACGCGAGGAACCTTACCAGGGCTTAAATGT
AB078057 GCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGATACGCGAGGAACCTTACCAGGGCTTAAATGT
************************************************************
FL41 GGAATGACAGGGCTAGAGATAGCTTTTTCTTCGGACATTTCACAAGGTGCTGCATGGTTG
AB078057 GGAATGACAGGGCTAGAGATAGCTTTTTCTTCGGACATTTCACAAGGTGCTGCATGGTTG
************************************************************
FL41 TCGTCAGCTCGTGCCGTGAGGTGTCAGGTTAAGTCCTATAACGAGCGCAACCCCTATTGT
AB078057 TCGTCAGCTCGTGCCGTGAGGTGTCAGGTTAAGTCCTATAACGAGCGCAACCCCTATTGT
************************************************************
FL41 TAGTTGCTAGCAGGTAAAGCTGAGGACTCTAGCGAGACTGCCGGTGCAAACCGCGAGGAA
AB078057 TAGTTGCTAGCAGGTAAAGCTGAGGACTCTAGCGAGACTGCCGGTGCAAACCGTGAGGAA
***************************************************** ******
FL41 GGTGGGGATGACGTCAAATCATCACGGCCCTTACGTCCTGGGCTACACACGTGCTACAAT
AB078057 GGTGGGGATGACGTCAAATCATCACGGCCCTTACGTCCTGGGCTACACACGTGCTACAAT
************************************************************
FL41 GGTATGGACAATGAGCAGCCATCTGGCAACAGAGAGCGAATCTACAAACCATATCACAGT
AB078057 GGTATGGACAATGAGCAGCCATCTGGCAACAGAGAGCGAATCTACAAACCATATCACAGT
************************************************************
FL41 TCGGATCGGAGTCTGCAACTCGACTCCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGGATATCAG
AB078057 TCGGATCGGAGTCTGCAACTCGACTCCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGGATATCAG
************************************************************
FL41 CCATGATCCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGCCATGGAAGC
AB078057 CCATGATCCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGCCATGGAAGC
************************************************************
FL41 TGGGGGTGCCTGAAGTCGGTCACCGCAAGGAGCCGCCTAGGGTAAAACTGGTAACTAGGG
AB078057 TGGGGGTGCCTGAAGTCGGTCACCGCAAGGAGCCGCCTAGGGTAAAACTGGTAACTAGGG
************************************************************
FL41 CTAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGC
AB078057 CTAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGC
***********************************
(3) Streptococcus iniae S1398 16S rRNA gene sequence alignment
? S. iniae strain ATCC 29178(Accession No. AF335572): Homology 99.27%
S1398 AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTAGAAC
AF335572 AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTAGAAC
************************************************************
S1398 GCTGAA-AGAAGAGCTTGCTCTTCTGGAA-GAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGT
AF335572 GCTGAGGATTGGTGCTTGCACTAATCCAAAGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGT
***** * * ****** ** * ** ******************************
S1398 AACCTACCTCATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATGACACTAG
AF335572 AACCTACCTCATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATGACACTAG
************************************************************
S1398 AGTACACATGTACTTAAGTTAAAAGGAGCAATTGCTTCACTATGAGATGGACCTGCGTTG
AF335572 AGTACACATGTACTTAATTTAAAAGGAGCAATTGCTTCACTATGAGATGGACCTGCGTTG
***************** ******************************************
S1398 TATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAG
AF335572 TATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAG
************************************************************
S1398 GGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGG
AF335572 GGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGG
************************************************************
S1398 GAATCTTCGGCAATGGACGGAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTT
AF335572 GAATCTTCGGCAATGGACGGAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTT
************************************************************
S1398 CGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGAGAAGAACGGTAATGGGAGTGGAAAATCCATTACGT
AF335572 CGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGAGAAGAACGGTAATGGGAGTGGAAAATCCATTACGT
************************************************************
S1398 GACGGTAACTAACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAG
AF335572 GACGGTAACTAACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAG
************************************************************
S1398 GTCTCGAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTCTATAAGTCT
AF335572 GTCTCGAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTCTATAAGTCT
************************************************************
S1398 GAAGTAAAAGGCAGTGGCTCAACCATTGTATGCTTTGGAAACTGTAGAACTTGAGTGCAG
AF335572 GAAGTAAAAGGCAGTGGCTCAACCATTGTATGCTTTGGAAACTGTAGAACTTGAGTGCAG
************************************************************
S1398 AAGGGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCG
AF335572 AAGGGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCG
************************************************************
S1398 GTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAA
AF335572 GTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAA
************************************************************
S1398 ACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTAGGCCCT
AF335572 ACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTAGGCCCT
************************************************************
S1398 TTCCGGGGCTTAGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCA
AF335572 TTCCGGGGCTTAGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCA
************************************************************
S1398 AGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAAT
AF335572 AGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAAT
************************************************************
S1398 TCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCTCTGACCGTCCTAGAGATAG
AF335572 TCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCTCTGACCGTCCTAGAGATAG
************************************************************
S1398 GATTTTCCTTCGGGACAGAGGAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGA
AF335572 GATTTTCCTTCGGGACAGAGGAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGA
************************************************************
S1398 GATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATTGTTAGTTGCCATCATTAAGTT
AF335572 GATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATTGTTAGTTGCCATCATTAAGTT
************************************************************
S1398 GGGCACTCTAGCGAGACTGCCGGTAATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCA
AF335572 GGGCACTCTAGCGAGACTGCCGGTAATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCA
************************************************************
S1398 TCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTTGGTACAACGAGTCGCAA
AF335572 TCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTTGGTACAACGAGTCGCAA
************************************************************
S1398 GCCGGTGACGGCAAGCTAATCTCTTAAAGCCAATCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACT
AF335572 GCCGGTGACGGCAAGCTAATCTCTTAAAGCCAATCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACT
************************************************************
S1398 CGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTT
AF335572 CGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTT
************************************************************
S1398 CCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTG
AF335572 CCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTG
************************************************************
S1398 AGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGATAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAA
AF335572 AGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGATAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAA
************************************************************
S1398 CAAGGTAGCCGTATCGGAAG
AF335572 CAAGGTAGCCGTATCGGAAG
********************
(4) Streptococcus parauberis S1735 16S rRNA gene sequence alignment
? S. parauberis strain DSM 6631(Accession No. AY584477) : Homology 99.86%
? S. parauberis strain LMG 14376(Accession No. AY942573) : Homology 99.86%
? S. parauberis strain 349(Accession No. AY942570): Homology 99.93%
S1735 GTAGAACGCTGAAGACTGGTGCTTGCACTAGTCAGATGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACG
AY584477 GTAGAACGCTGAAGACTGGTGCTTGCACTAGTCAGATGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACG
AY942573 GTAGAACGCTGAAGACTGGTGCTTGCACTAGTCAGATGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACG
AY942570 GTAGAACGCTGAAGACTGGTGCTTGCACTAGTCAGATGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACG
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S1735 CGTAGGTAACCTACCTCATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATG
AY584477 CGTAGGTAACCTACCTTATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATG
AY942573 CGTAGGTAACCTACCTTATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATG
AY942570 CGTAGGTAACCTACCTCATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATG
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S1735 ACAATTAAGTACTCATGTACTAAATTTAAAAGGAGCAATTGCTTCACTATGAGATGGACC
AY584477 ACAATTAAGTACTCATGTACTAAATTTAAAAGGAGCAATTGCTTCACTATGAGATGGACC
AY942573 ACAATTAAGTACTCATGTACTAAATTTAAAAGGAGCAATTGCTTCACTATGAGATGGACC
AY942570 ACAATTAAGTACTCATGTACTAAATTTAAAAGGAGCAATTGCTTCACTATGAGATGGACC
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S1735 TGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCCACGATACATAGCCGAC
AY584477 TGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCCACGATACATAGCCGAC
AY942573 TGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCCACGATACATAGCCGAC
AY942570 TGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCCACGATACATAGCCGAC
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S1735 CTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAG
AY584477 CTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAG
AY942573 CTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAG
AY942570 CTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAG
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S1735 CAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGGGGCAACCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGA
AY584477 CAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGGGGCAACCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGA
AY942573 CAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGGGGCAACCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGA
AY942570 CAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGGGGCAACCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGA
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S1735 AGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGAGAAGAACGGTAATGGGAGTGGAAAATCC
AY584477 AGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGAGAAGAACGGTAATGGGAGTGGAAAATCC
AY942573 AGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGAGAAGAACGGTAATGGGAGTGGAAAATCC
AY942570 AGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGAGAAGAACGGTAATGGGAGTGGAAAATCC
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S1735 ATTACGTGACGGTAACTAACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAA
AY584477 ATTACGTGACGGTAACTAACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAA
AY942573 ATTACGTGACGGTAACTAACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAA
AY942570 ATTACGTGACGGTAACTAACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAA
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S1735 TACGTAGGTCTCGAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTATT
AY584477 TACGTAGGTCTCGAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTATT
AY942573 TACGTAGGTCTCGAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTATT
AY942570 TACGTAGGTCTCGAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTATT
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S1735 TAAGTCTGAAGTTAAAGGCCGTGGCTCAACCATGGTTCGCTTTGGAAACTGGATAACTTG
AY584477 TAAGTCTGAAGTTAAAGGCCGTGGCTCAACCATGGTTCGCTTTGGAAACTGGATAACTTG
AY942573 TAAGTCTGAAGTTAAAGGCCGTGGCTCAACCATGGTTCGCTTTGGAAACTGGATAACTTG
AY942570 TAAGTCTGAAGTTAAAGGCCGTGGCTCAACCATGGTTCGCTTTGGAAACTGGATAACTTG
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S1735 AGTGCAGAAGGGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGG
AY584477 AGTGCAGAAGGGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGG
AY942573 AGTGCAGAAGGGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGG
AY942570 AGTGCAGAAGGGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGG
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S1735 AACACCGGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTGG
AY584477 AACACCGGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTGG
AY942573 AACACCGGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTGG
AY942570 AACACCGGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTGG
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S1735 GGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTT
AY584477 GGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTT
AY942573 GGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTT
AY942570 GGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTT
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S1735 AGGCCCTTTCCGGGGCTTAGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTAC
AY584477 AGGCCCTTTCCGGGGCTTAGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTAC
AY942573 AGGCCCTTTCCGGGGCTTAGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTAC
AY942570 AGGCCCTTTCCGGGGCTTAGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTAC
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S1735 GACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTG
AY584477 GACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTG
AY942573 GACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTG
AY942570 GACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTG
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S1735 GTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCTCTGACCGTCCTA
AY584477 GTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCTCTGACCGTCCTA
AY942573 GTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCTCTGACCGTCCTA
AY942570 GTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCTCTGACCGTCCTA
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S1735 GAGATAGGACTTTCCTTCGGGACAGAGGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGT
AY584477 GAGATAGGACTTTCCTTCGGGACAGAGGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGT
AY942573 GAGATAGGACTTTCCTTCGGGACAGAGGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGT
AY942570 GAGATAGGACTTTCCTTCGGGACAGAGGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGT
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S1735 GTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATTGTTAGTTGCCATCA
AY584477 GTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATTGTTAGTTGCCATCA
AY942573 GTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATTGTTAGTTGCCATCA
AY942570 GTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATTGTTAGTTGCCATCA
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S1735 TTAAGTTGGGCACTCTAGCGAGACTGCCGGTAATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGT
AY584477 TTAAGTTGGGCACTCTAGCGAGACTGCCGGTAATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGT
AY942573 TTAAGTTGGGCACTCTAGCGAGACTGCCGGTAATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGT
AY942570 TTAAGTTGGGCACTCTAGCGAGACTGCCGGTAATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGT
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S1735 CAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTTGGTACAACGA
AY584477 CAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTTGGTACAACGA
AY942573 CAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTTGGTACAACGA
AY942570 CAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTTGGTACAACGA
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S1735 GTCGCAAGCCGGTGACGGCAAGCTAATCTCTTAAAGCCAATCTCAGTTCGGATTGTAGGC
AY584477 GTCGCAAGCCGGTGACGGCAAGCTAATCTCTTAAAGCCAATCTCAGTTCGGATTGTAGGC
AY942573 GTCGCAAGCCGGTGACGGCAAGCTAATCTCTTAAAGCCAATCTCAGTTCGGATTGTAGGC
AY942570 GTCGCAAGCCGGTGACGGCAAGCTAATCTCTTAAAGCCAATCTCAGTTCGGATTGTAGGC
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S1735 TGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGA
AY584477 TGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGA
AY942573 TGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGA
AY942570 TGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGA
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S1735 ATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAA
AY584477 ATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAA
AY942573 ATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAA
AY942570 ATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAA
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S1735 GTCGGTGAGGTAACCTAATAGGAGCCAGCCGCCTAAG
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AY942573 GTCGGTGAGGTAACCTATTAGGAGCCAGCCGCCTAAG
AY942570 GTCGGTGAGGTAACCTATTAGGAGCCAGCCGCCTAAG
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1-2. 백신 조제용 균주의 생화학적 성상 실험
본 발명의 균주들의 생화학적 특성 시험을 위해 Biomerieux(France)사의 API kit 3종(API 20E, API ZYM, API 20 strep)과 Biolog(USA)사의 Biolog kit 2종(GN2 microplate, GP2 microplate)를 사용하였다. 각각의 균주별 생화학 시험용 kit는 다음과 같다. 각 균주 중 L. anguillarum V189는 그람음성 균주임을 감안하여 API 20NE 및 GN2 microplate kit를 사용하였으며, S. iniae S1398과 S. paraubris는 그 람양성 연쇄상균임을 감안하여 API 20 Strep 및 GP2 microplate kit를 사용하였다. T. maritimum FL41은 그람음성균주임에도 API 20NE 및 GN2 microplate를 이용한 생화학시험결과 균주의 성장이 이루어지지 않아 API ZYM kit를 이용한 미생물의 효소활성 시험을 통한 생화학적 특성을 시험하였다. L. anguillarum V189균주의 생화학시험 시에는 해당균주가 호염균임을 감안하여 인공해수성분의 현탁액을 이용하여 생화학시험용 현탁액을 조제하였으며 나머지 균주들의 생화학시험을 위한 균주 현탁액은 제조사에서 제공하는 현탁액을 사용하였다.
각 균주별 생화학 시험 kit
균주 API kit Biolog kit
L. anguillarum V189 API 20E GN2 microplate
T. maritimum FL 41 API ZYM -
S. iniae S1398 API 20Strep GP2 microplate
S. parauberis S1735 API 20Strep GP2 microplate
API kit 및 Biolog kit를 이용한 생화학적 성상은 다음과 같다.
(1) Listonella anguillarum V189의 생화학적 성상
1) API 20 E(Biomerieux, France)을 이용한 L. anguillarum V189생화학적 성상
API 20E kit를 이용한 생화학시험을 위해 BHIA에서 순수배양 된 세균집락을 인공해수성분의 현탁액 2㎖에 현탁 시킨 후 0.5 McFarland의 탁도로 조절 한 후 API 20E kit의 각 well에 제조사의 방법에 따라 주입 한 후 29ㅁ 2℃에서 24시간 호기적으로 배양 한 후 배양성상을 판독하였다. 판독 결과 ONPG , MAN, SAC시험의 경우는 약한 양성을 나타내었고 ADH, IND, VP, GEL 시험은 양성을 나타내었으며 그 외 LDC, ODC, CIP, H2S, URE, TDA, GLU, INO, SOR, SAC, MEL, AMY, ARA시험은 음성으로 나타났다.
Figure 112009043309619-pat00001
2) GN2 microplate(Biolog Inc., USA)를 이용한 L. anguillarum V189 생화학적 성상
GN2 microplate(Biolog Inc., USA)를 이용한 L. anguillarum V189 생화학적 성상시험을 위해 인공해수성분의 현탁액에 BHIA배지에서 순수배양 된 L. anguillarum V189 균주 집락을 현탁 시킨 후 GN2 microplate의 각 well에 150㎕씩 주입 후 29ㅁ 2℃에서 약 20 시간 배양 후 Microstation 및 MicroLog 3 프로그램을 이용하여 95가지 탄소원 이용능을 분석한 결과 Dextrin, Glycogen, N-acetyl-D-galactosamine, N-acetyl-D-glucosamine, D-fructose, α-D-glucose, , Maltose, D-mannitol, D-mannose, D-sorbitol, Sucrose, D-trehalose, D-gluconic acid, D,L-lactic acid, Bromosuccinic acid, L-Asparagine, L-aspartic acid, L-Glutamic acid, L-Proline, Inosine, Uridine, Thymidine, Glycerol, α-D-Glucose-1-Phosphate, D-Glucose-6-Phosphate 이용능이 높게 나타났다.
Figure 112009043309619-pat00002
(2) Tenacibacullum maritium FL 41의 생화학적 성상
T. maritimum FL41 균주는 API 20E, API 20NE 및 GN2 microplate를 이용한 생화학 시험에서는 균주의 성장이 이루어지지 않아 생화학적 성상확인이 어려우므로 미생물 효소활성을 이용한 생화학적 성상시험을 수행하였다. 미생물 효소활성 시험방법을 이용한 생화학적 성상은 API ZYM(Biomerieux, France) kit을 이용하였다. API ZYM kit는 19가지 효소의 활성을 검사할 수 있는 kit로서 멸균 생리식염수 2㎖에 Marine agar 2216배지에서 순수 배양 된 T. maritimum FL41 균주를 현탁하여 약 5~6 McFarland로 탁도를 맞춘 후 API ZYM kit의 각 cupule에 65㎕씩 분주하였다. 그리고 나서 37℃에서 4시간 배양후 각 cupule내 균주접종액의 색깔변화로서 결과를 판독하였다. 판독결과 Alkaline phosphatase, Esterase, Esterase Lipase, Leucine arylamide, Valine arylamide, Typsine, Acid phosphatase, Naphtol-AS-BI-phosphohydrolase의 경우에는 강한 활성을 보였으며, Lipase, Crystine arylamidase, α-chymotrypsine의 경우에는 약한 활성을 보였으며 나머지 효소들은 활성을 나타내지 않았다.
Figure 112009043309619-pat00003
(3) Streptococcus iniae S1398의 생화학적 성상
1) API 20 strep(Biomerieux, France)을 이용한 S. iniae S1398 생화학적 성상
API 20 strep kit를 이용한 생화학 시험을 위해 BHIA 배지에서 순수배양된 S. iniae S1398 균주의 집락을 Suspension medium(kit내 제공) 2㎖에 현탁시켜 4 McFarland의 탁도로 균부유액을 만들어 VP test cupule 부터 ADH test cupule 까지 각각 분주하고 RIB ~ GLYG test cupule은 균부유액과 GP medium(kit 내 제공) 혼합액을 분주하고 35~37℃에서 24시간 배양 후 제조사에서 제공하는 방법으로 시약을 첨가한 후 cupule 내 균액의 색깔변화를 관찰하여 판독하였다. 판독결과 Esculin 분해능이 있으며 Alkaline phosphatase, Leucine arylamidase, Argine dihydrolase 활성이 있었고, Mannitol, Trehalose, Starch, Glycogen을 이용하였고, 혈액배지에서 배양시 베타 용혈능을 나타내었다. VP test 및 Hippurate hydrolysis test등은 음성으로 확인되었다.
Figure 112009043309619-pat00004
2) GP2 microplate(BioLog Inc., USA)를 이용한 S. iniae S 1398의 생화학 성상
GP2 microplate(Biolog Inc., USA)를 이용한 S. iniae S1398 생화학적 성상시험을 위해 Biolog사에 제공하는 균접종액에 BHIA 배지에서 순수배양된 S. iniae S1398 균주의 집락을 적정 탁도가 되도록 현탁시킨 후 약 150㎕씩 GP2 microplate의 각 well에 분주하였다. 균액이 접종된 microplate를 29ㅁ 2℃에서 약 20 시간 배양 후 Microstation 및 MicroLog 3 프로그램을 이용하여 탄소원 및 여러 가지 기질 이용성을 판독하였고 그중 N-acetyl-D-Glucosamine, α-D-Glucose, D-Mannitol, D-Mannose, Salicin, Sucrose, D-trehalose, Pyruvic Acid, Glycerol 이용성이 높은 것으로 나타났다.
Figure 112009043309619-pat00005
(4) Streptococcus parauberis S1735의 생화학적 성상
1) API 20 strep(Biomerieux, France)을 이용한 S. parauberis S1735 생화학적 성상
API 20 strep kit를 이용한 생화학 시험을 위해 BHIA 배지에서 순수배양된 S. iniae S1398 균주의 집락을 Suspension medium(kit내 제공) 2㎖에 현탁시켜 4 McFarland의 탁도로 균부유액을 만들어 VP test cupule 부터 ADH test cupule 까지 각각 분주하고 RIB ~ GLYG test cupule은 균부유액과 GP medium(kit 내 제공) 혼합액을 분주하고 35~37℃에서 24시간 배양 후 제조사에서 제공하는 방법으로 시약을 첨가한 후 cupule 내 균액의 색깔변화를 관찰하여 판독하였다. 판독결과 Esculin 분해능이 있으며 β-galactosidase, Alkaline phosphatase, Leucine arylamidase 활성이 있었고, 탄소원 이용능 시험에서는 Trehalose만을 이용하였고, 혈액배지에서 배양시 용혈능을 나타내지 않았다.
Figure 112009043309619-pat00006
2) GP2 microplate(BioLog Inc., USA)를 이용한 S. parauberis S1735 생화학적 성상
GP2 microplate(Biolog Inc., USA)를 이용한 S. parauberis S1735 생화학적 성상시험을 위해 Biolog사에 제공하는 균접종액에 BHIA 배지에서 순수배양된 S. parauberis S1735 균주의 집락을 적정 탁도가 되도록 현탁시킨 후 약 150㎕씩 GP2 microplate의 각 well에 분주하였다. 균액이 접종된 microplate를 29±2℃에서 약 20 시간 배양 후 Microstation 및 MicroLog 3 프로그램을 이용하여 탄소원 및 여러 가지 기질 이용성을 판독하였고 그 중 N-acetyl-D-Glucosamine, N-acetyl-β-D-Mannosamine, Amygdalin, Arbutin, D-cellobiose, D-fructose, D-galactose, Gentiobiose, α-D-Glucose, Maltose, Maltotriose, D-Mannitol, D-Mannose, β-Methyl-D-Glucoside, Salicine, Sucrose, D-Trehalose, Pyruvatic Acid Methyl ester, Glycerol 이용능이 높게 나타났다 .
Figure 112009043309619-pat00007
1-3. LD70(균주 치사량)실험
각각의 균주에 대한 병원성 시험을 위해 LD70(70% lethal dose)을 이용하였다. 각 균주별 LD70을 설정하기 위해 먼저 각각의 균주를 3회씩 어체통과를 시킨 후 병원성 시험을 수행한다. 어체통과는 우선 각각의 균주를 고체배지를 이용하여 순수 배양한 후 생리식염수를 이용하여 균액의 농도가 최소 1×1010 cfu/㎖ 이상 되도록 균 현탁액을 제조하여 약 15㎝정도 크기의 넙치의 복강에 0.1㎖, 0.2㎖ 0.3㎖, 0.4㎖, 0.5㎖로 인위감염 시켜 탈장, 흑화등의 병증을 보이거나 폐사되는 개체를 관찰한다. 병증이 현저한 개체 또는 금방 죽은 개체의 신장으로부터 세균을 순수분리한 후 같은 방법으로 각각의 세균 현탁액을 만들어 인위감염 시키는 방법을 연속하여 3회 실시 한 후 어체로부터 최종 분리된 균주를 LD70설정을 위한 병원성 시험에 이용한다. S. iniae S1398, S. iniae S1735, L. anguillarum V189 균주는 혈액한천배지에 배양한 후 멸균 루우프를 이용하여 무균적으로 균을 회수한 후 멸균 생리식염수를 이용하여 균 현탁액을 조제한다. T. maritimum FL41은 Marine agar 2216배지에 순수배양 한 후 다른 균주들과 마찬가지 방법으로 균 현탁액을 만들어 병원성 시험에 이용한다. 균 현탁액을 만들때 멸균유리구슬을 넣어 고속 진탕시켜 각 균주들이 균괴(덩어리)를 형성 하지 않고 골고루 잘 현탁 되도록 한다. 이는 병원성 시험을 위한 인위감염 시 주사기 바늘이 막힘을 방지하기 위함이다.
1) L. anguillarum V189
전술한 바와 같이 혈액한천배지에서 배양된 L. anguillarum V189균주를 멸균생리식염수를 이용하여 균액의 농도가 1×106~1×109 CFU/㎖가 되도록 조절한다. 균액 농도의 조절은 사전에 균량(무게)를 측정하여 습중량 대비 균수를 미리 측정해 둔다. 조제된 균액을 약 15㎝(무게 약 50g 내외)의 넙치에 농도별 각 10마리씩에 인위감염시킨다. 인위감염은 넙치 복강에 각각의 균액을 0.1㎖씩 주사기를 이용하여 접종한다. 즉 어체당 공격균량은 각각 1×105~1×108CFU/fish가 되도록 한다. 이때 접종 2일전부터 절식을 시켜둔다. 접종 후 14일간 누적폐사율을 관찰 기록한다.
시험결과는 아래표와 같으며 L. anguillarum V189균주의 넙치에 대한 LD70은 1× 107.7CFU/㎖(1× 106.7CFU/Fish)로 나타났다.
Figure 112009043309619-pat00008
2) T. maritimum FL41
전술한 바와 같이 Marine agar2216배지에서 배양된 T. mritimum FL41균주를 멸균생리식염수를 이용하여 균액의 농도가 1×106~1×109 CFU/㎖가 되도록 조절한다. 균액 농도의 조절은 사전에 균량(무게)를 측정하여 습중량 대비 균수를 미리 측정해 둔다. 조제된 균액을 약 15㎝(무게 약 50g 내외)의 넙치에 농도별 각 10마리씩에 인위감염시킨다. 인위감염은 넙치 복강에 각각의 균액을 0.1㎖씩 주사기를 이용하여 접종한다. 즉 어체당 공격균량은 각각 1×105~1×108CFU/fish가 되도록 한다. 이때 접종 2일전부터 절식을 시켜둔다. 접종 후 21일간 누적폐사율을 관찰 기록한다.
시험결과는 아래표와 같으며 T. maritimum FL41 균주의 넙치에 대한 LD70은 1× 108.8CFU/㎖(1× 107.8CFU/Fish)로 나타났다.
Figure 112009043309619-pat00009
3) S.iniae S1398
전술한 바와 같이 혈액한천배지에서 배양된 S. iniae S1398균주를 멸균생리식염수를 이용하여 균액의 농도가 1×106~1×109 CFU/㎖가 되도록 조절한다. 균액 농도의 조절은 사전에 균량(무게)를 측정하여 습중량 대비 균수를 미리 측정해 둔다. 조제된 균액을 약 15㎝(무게 약 50g 내외)의 넙치에 농도별 각 10마리씩에 인위감염시킨다. 인위감염은 넙치 복강에 각각의 균액을 0.1㎖씩 주사기를 이용하여 접종한다. 즉 어체당 공격균량은 각각 1×105~1×108CFU/fish가 되도록 한다. 이때 접종 2일전부터 절식을 시켜둔다. 접종 후 14일간 누적폐사율을 관찰 기록한다.
시험결과는 아래표와 같으며 S.iniae S1398 균주의 넙치에 대한 LD70은 1× 108.3CFU/㎖(1× 107.3CFU/Fish)로 나타났다.
Figure 112009043309619-pat00010
4) S. parauberis S1735
전술한 바와 같이 혈액한천배지에서 배양된 S. parauberis S1735균주를 멸균생리식염수를 이용하여 균액의 농도가 1×107～1×1010 CFU/㎖가 되도록 조절한다. 균액 농도의 조절은 사전에 균량(무게)를 측정하여 습중량 대비 균수를 미리 측정해 둔다. 조제된 균액을 약 15㎝(무게 약 50g 내외)의 넙치에 농도별 각 10마리씩에 인위감염시킨다. 인위감염은 넙치 복강에 각각의 균액을 0.1㎖씩 주사기를 이용하여 접종한다. 즉 어체당 공격균량은 각각 1×106~1×109CFU/fish가 되도록 한다. 이때 접종 2일전부터 절식을 시켜둔다. 접종 후 14일간 누적폐사율을 관찰 기록한다.
시험결과는 아래표와 같으며 S. parauberis S1735 균주의 넙치에 대한 LD70은 1× 109.3CFU/㎖(1× 108.3CFU/Fish)로 나타났다.
Figure 112009043309619-pat00011
<실시예 2> 어류의 세균성 질병에 대한 복합 불활화 백신의 제조
2-1. L. anguillarum 준비
(1)원종균배양
균주를 1.5% NaCl첨가 Brain Heart Infusion agar(BHI agar)에 도말하여 30℃에서 24시간 배양하여 순수집락을 1.5% NaCl이 첨가된 Brain Heart Infusion broth(BHI broth)에 옮겨 접종하고 이것을 29℃에서 24시간 배양한 후 동결건조한 것을 원종균으로 -40℃이하에 보관하면서 사용한다.
(2)종균 배양
동결건조하여 보관중인 원종균을 1.5% NaCl첨가 BHI agar에 도말하고 29℃에서 24시간 배양하여 순수집락을 BHI broth에 옮겨 접종하고 이것을 29℃에서 24시간 배양하여 제조용 종균으로 이용한다. 배양된 제조용 종균에 대하여 순수시험을 실시한다.
(3)제조용 종균 접종
BHI broth에서 증식된 제조용 종균을 본 배양배지의 2/100되게 접종한다.
(4)본 배양
본 배양은 Fermenter에서 실시하며 Fermenter의 배지는 표 1과 같다.
O2를 충분히 공급하고, pH 7.2, 150～200 rpm으로 교반하면서 24시간 배양하고 OD값을 2시간 간격으로 측정하면서 증식극기가 지난 후 2시간 더 배양한다.
Figure 112009043309619-pat00012
본 배양용 배지 멸균 후 반드시 무균시험을 실시하여 이상이 없는지 확인한다.
(5)본 배양액의 불활화
배양완료 후 잡균 혼입 여부를 확인하고 배양균액에 포르말린을 0.3%되게 첨가한 후 실온에서 24시간 동안 불활화한다.
불활화 완료 후 불활화 확인시험(혈액배지 이용)을 실시하여 불활화 여부를 확인한다.
(6)채균 및 처리방법
불활화가 완료되면, 연속원심분리(12,000rpm)하여 침전 균체를 수거한다. 침전균체의 무게를 측정하고, 원심분리한 습균 40g당 0.2% 포르말린이 함유된 멸균 인산완충식염수 1,000㎖비율로 부유시킨 다음, 백신 제조시 까지 냉장보관한다.
2-2. S. iniae, S. parauberis 준비
(1)원종균 배양
균주를 1.5% NaCl첨가 Brain Heart Infusion agar(BHI agar)에 도말하여 29℃에서 24시간 배양하여 순수집락을 1.5% NaCl이 첨가된 Brain Heart Infusion broth(BHI broth)에 옮겨 접종하고 이것을 30℃에서 48시간 배양한 후 동결건조한 것을 원종균으로 -40℃이하에 보관하면서 사용한다.
(2)종균 배양
동결건조하여 보관중인 원종균을 1.5% NaCl첨가 BHI agar에 도말하고 29℃에서 24시간 배양하여 순수집락을 BHI broth에 옮겨 접종하고 이것을 29℃에서 48시간 배양하여 제조용 종균으로 이용한다. 배양된 제조용 종균에 대하여 순수시험을 실시한다.
(3)제조용 종균 접종
BHI broth에서 증식된 제조용 종균을 본 배양배지의 2/100되게 접종한다.
(4)본 배양
본 배양은 Fermenter에서 실시하며 Fermenter의 배지는 표 2와 같다.
O2를 충분히 공급하고, pH 7.2, 150～200 rpm으로 교반하면서 48시간 배양하고 OD값을 2시간 간격으로 측정하면서 증식극기가 지난 후 2시간 더 배양한다.
Figure 112009043309619-pat00013
본 배양용 배지 멸균 후 반드시 무균시험을 실시하여 이상이 없는지 확인한다.
(5)본 배양액의 불활화
배양완료 후 잡균 혼입 여부를 확인하고 배양균액에 포르말린을 0.3%되게 첨가한 후 실온에서 24시간 동안 불활화한다.
불활화 완료 후 불활화 확인시험(혈액배지 이용)을 실시하여 불활화 여부를 확인한다.
(6)채균 및 처리방법
불활화가 완료되면, 연속원심분리(12,000rpm)하여 침전 균체를 수거한다. 침전균체의 무게를 측정하고, 원심분리한 습균 40g당 0.2% 포르말린이 함유된 멸균 인산완충식염수 1,000㎖비율로 부유시킨 다음, 백신 제조시 까지 냉장보관한다.
2-3. T. maritimum 준비
(1) 원종균 배양
균주를 Marine agar에 도말하여 29℃에서 24시간 배양하여 순수집락을 Marine broth에 옮겨 접종하고 이것을 29℃에서 48시간 배양한 후 동결건조한 것을 원종균으로 -40℃이하에 보관하면서 사용한다.
(2)종균 배양
동결건조하여 보관중인 원종균을 Marine agar에 도말하고 29℃에서 24시간 배양하여 순수집락을 Marine broth에 옮겨 접종하고 이것을 29℃에서 48시간 배양하여 제조용 종균으로 이용한다. 배양된 제조용 종균에 대하여 순수시험을 실시한다.
(3)제조용 종균 접종
Marine broth에서 증식된 제조용 종균을 본 배양배지의 2/100되게 접종한다.
(4)본 배양
본 배양은 Fermenter에서 실시하며 Fermenter의 배지는 표 3과 같다.
O2를 충분히 공급하고, pH 7.2, 150～200 rpm으로 교반하면서 48시간 배양하고 OD값을 2시간 간격으로 측정하면서 증식극기가 지난 후 2시간 더 배양한다.
Figure 112009043309619-pat00014
본 배양용 배지 멸균 후 반드시 무균시험을 실시하여 이상이 없는지 확인한다.
(5)본 배양액의 불활화
배양완료 후 잡균 혼입 여부를 확인하고 배양균액에 포르말린을 0.3%되게 첨가한 후 실온에서 24시간 동안 불활화한다.
불활화 완료 후 불활화 확인시험(혈액배지 이용)을 실시하여 불활화 여부를 확인한다.
(6)채균 및 처리방법
불활화가 완료되면, 연속원심분리(12,000rpm)하여 침전 균체를 수거한다. 침전균체의 무게를 측정하고, 원심분리한 습균 40g당 0.2% 포르말린이 함유된 멸균 인산완충식염수 1,000㎖비율로 부유시킨 다음, 백신 제조시 까지 냉장보관한다.
2-4. 복합백신의 제조 및 검사
상기 2-1 내지 2-1에서 희석 준비된 각 세균 벌크별로 동량(1:1:1:1)을 혼합하여 최종 농도가 10㎎/㎖되게 한다. 그 후 적량의 용기에 정량씩 분주한다.
상기 제조과정 모두에서 하기와 같은 검사가 수행되었다.
(1) 본 배양용 배지의 무균시험
배지 제조 후 종균을 접종하기 전 배지가 완전히 멸균되었는가 무균시험을 실시하여 확인한다.
(2)생균 벌크의 순수시험 및 균수시험
본 배양 완료 후 생균벌크에 대하여 순수시험과 균수시험을 실시한다.
(3)불활화 후 벌크의 불활화 확인시험
불활화된 벌크를 Nutrient agar, Nutrient broth, Fluid thioglycollate broth에 각각 접종하여 22℃, 37℃에서 7일간 배양한 후 관찰한 결과 어떠한 세균의 발육도 없어야 한다.
(4)백신균체 정량시험
혼합습균 40g당 1,000㎖의 비율로 멸균 인산완충식염수로 재부유된 백신에 대하여 무작위로 100㎖을 채취하고 8,000rpm에서 20분간 원심하여 상층액을 버린 침전균체의 무게를 측정하여 4g이상이어야 한다.
<실시예 3> 백신의 항체가 실험
3-1. 단일백신 항체가 실험
단일백신에 대한 항체가 시험은 5㎎/㎖, 10㎎/㎖, 15㎎/㎖의 농도로 조제된 단일백신을 시험어(넙치 약 15㎝내외)의 복강에 각각 0.1㎖씩 접종 하고 18ㅁ 1℃의 사육수온에서 2주간 사육 후에 단일백신 농도별 접종구에서 각각 10마리씩 채혈하여 혈청을 분리하고 microtiter법에 의한 응집항체가를 조사한다. 즉 96 well microplate에 분리된 혈청을 멸균 PBS(인산완충액)로 단계 희석한 후 각각의 시험백신(농도:5㎎/㎖)을 항원으로 동량씩 반응시킨다.반응 후 약 4℃에서 24시간 보관 후 다시 37℃에서 30분 처리 한 후 응집형성 유무를 관찰한다. 2회 접종구는 1회 접종 2주후에 동량의 백신을 반복 투여한다. 2회 접종구에 대한 항체가 시험은 2회 접종 후 2주후에 혈청을 분리 한 후 전술한 바와 동일한 방법으로 응집항체가를 측정한다. 대조군의 경우는 멸균생리식염수를 동일한 방법으로 접종한 후 채혈하여 시험에 이용한다.
시험결과 대조군의 경우는 항체가 형성이 확인되지 않았으며 1회 접종군에 대한 항체가 조사에서는 L. anguillarum V189는 백신 농도 5㎎/㎖, 10㎎/㎖, 15㎎/㎖ 접종시 각각 26.399, 26.597, 27.561로 나타났으며, T. maritimum FL41 백신은 26.263, 26.363, 26.766으로 나타났고, S. iniae S1398백신은 21, 21.293, 21.561로 나타났고, S. parauberis S1735백신은 21, 21.051, 21.293으로 조사되었다.
2회 접종군에 대한 항체가 조사결과는 L. anguillarum V189백신 접종군의 경우 백신농도는 5㎎/㎖, 10㎎/㎖, 15㎎/㎖ 접종시 각각 27.397, 28.0, 26.737로 나타났으며, T. maritimum FL41 백신은 26.192, 26.263, 25.704로 나타났고, S. iniae S1398백신은 21.939, 22.170, 22.945로 나타났고, S. parauberis S1735백신은 22.248, 22.485, 22.222로 조사되었다.
Figure 112009043309619-pat00015
3-2. 복합백신 항체가 실험
조제된 복합백신을 공시어(넙치 약 15㎝ 내외)의 복강에 0.1㎖씩 접종 한 후 18±1℃의 사육수온을 유지하면서 14주간 사육한다. 사육기간 동안 2주 간격으로 5마리씩 채집하여 미부정맥에서 채혈 후 혈청을 분리한 후 microtiter법에 의한 응집항체가를 측정한다.응집항체가는 96 well microplate에 채집된 혈청을 멸균된 PBS(인산완충액)로 단계 희석한 후 각 균주별 단일백신(농도:5㎎/㎖)을 항원으로 사용하여 동량씩 반응 시킨 후 4℃에서 24시간 처리후 다시 37℃에서 30분간 배양 후 응집형성 유무를 관찰한다.
2회 접종군의 경우는 1회 접종 2주후에 추가접종을 실시한 후 2주 간격으로 14주째 까지 1회 접종군과 동일한 방법으로 채혈하여 응집항체가를 조사한다. 1회 및 2회 접종군의 응집항체가는 각각의 시료에서 얻어진 수치를 평균 및 표준오차로 처리하였다.
복합백신 1회 접종군 및 2회 접종군의 L. anguillarum V189, T. maritimum FL41, S. iniae S1398, S. parauberis S1735균주에 대한 항체가 조사결과 1회 접종군에서는 L. anguillarum V189에 대한 항체가는 6주째 26.6ㅁ 2.07로 가장 높게 나타났으며, T. maritimum FL41은 4주째에 23.6ㅁ 2.07로 가장 높게 나타났다. S. iniae S1398과 S. parauberis S1735균주에 대한 항체가는 기간경과와 상관없이 동일하게 21 정도로 조사되었다. 복합백신 2회 접종군에 대한 각 균주별 항체가는 L. anguillarum V189에 대한 항체가는 8주째가 가장 높은 26. 8ㅁ 1.10으로 나타났으며, T. maritimum FL41은 8주째에 22.4ㅁ 1.67로 나타났다. S. iniae S1398 및 S. parauberis S1735에 대한 항체가는 대부분이 21으로 조사되었다.
Figure 112009043309619-pat00016
<실시예 4> 백신의 방어효과 실험
3-1. 단일백신 방어효과 실험
백신이 어체 방어력에 미치는 효과를 조사하기 위하여 각각의 단일 백신을 농도별(5㎎/㎖, 10㎎/㎖, 15㎎/㎖ )로 어체당 0.1㎖씩 접종하고 난 후 3주째에 각각의 균액을 조제하여 어류의 복강에 0.1㎖씩 인위감염 시킨다. 인위감염 시 균액의 농도는 L. anguillarum V189, T. maritimum FL41, S. iniae S1398, S. parauberis S1735 균주 각각의 LD70 균액 농도를 감안하여 각각 1×108CFU/㎖, 1×109CFU/㎖, 1×109CFU/㎖, 1×1010CFU/㎖가 되도록 조절한다. 균액조제 시 멸균 유리구슬을 균 현탁액에 넣어 고속진탕 시켜 균주가 골고루 잘 풀리도록 하여 인위감염 시 주사바늘이 막힘이 없도록 하여준다. 인위감염 2일전에 미리 시험어를 절식하여 둔다. 인위감염 후 15일~21일동안 관찰하면서 누적폐사율을 조사하여 대조구의 페사율이 60%이상 일때 백신 접종구의 상대생존율을 산출한다. 상대생존율의 산출은 아래와 같다.
상대생존율(Relative percent survive, RPS)(%)= 〔1-(백신접종구의 누적폐사율/대조구의 누적폐사율)〕× 100
2회 접종군의 경우는 각각의 단일백신 1회 접종 후 주후에 추가접종을 실시하고 이후 3주후에 전술한 방법과 같은 동일한 방법으로 방어효과 시험을 수행한다.
1) L. anguillarum V189 단일 백신의 방어효과 시험
혈액한천배지에서 순수배양 된 L. anguillarum V189균주를 병원성 회복을 위해 어체통과를 3회 시킨다. 3회째 어체 통과된 균주를 순수배양 후 멸균생리식염수를 이용하여 1×108CFU/㎖의 균수가 되도록 균액을 조제하여 백신구 및 접종구 각 20마리에 대해 전술한 바와 같이 방어효과시험을 실시한다.
방어효과 시험결과 L. anguillarum V189 단일백신 1회 접종구의 경우 백신농도 5㎎/㎖, 10㎎/㎖, 15㎎/㎖ 접종구의 상대생존율은 각각 93.3%, 93.3%, 100%로 나타났으며, 2회 접종구의 경우는 백신농도 5㎎/㎖, 10㎎/㎖, 15㎎/㎖ 접종구에서 상대생존율이 각각 83.3%, 88.9%, 100%로 나타났다.
Figure 112009043309619-pat00017
2) T. maritimum FL41 단일 백신의 방어효과 시험
Marine agar 2216배지에서 순수배양 된 T. maritimum FL41 균주를 병원성 회복을 위해 어체통과를 3회 시킨다. 3회째 어체 통과된 균주를 순수배양 후 멸균생리식염수를 이용하여 1×109CFU/㎖의 균수가 되도록 균액을 조제하여 백신구 및 접종구 각 20마리에 대해 전술한 바와 같이 방어효과시험을 실시한다.
방어효과 시험결과 T. maritimum FL41 단일백신 1회 접종구의 경우 백신농도 5㎎/㎖, 10㎎/㎖, 15㎎/㎖ 접종구의 상대생존율은 각각 76.9%, 84.6%, 92.3%로 나타났으며, 2회 접종구의 경우는 백신농도 5㎎/㎖, 10㎎/㎖, 15㎎/㎖ 접종구에서 상대생존율이 각각 85.7%, 78.6%, 85.7%로 나타났다.
Figure 112009043309619-pat00018
3) S. iniea S1398 단일 백신의 방어효과 시험
혈액한천배지에서 순수배양 된 S. iniea S1398 균주를 병원성 회복을 위해 어체통과를 3회 시킨다. 3회째 어체 통과된 균주를 순수배양 후 멸균생리식염수를 이용하여 1×109CFU/㎖의 균수가 되도록 균액을 조제하여 백신구 및 접종구 각 20마리에 대해 전술한 바와 같이 방어효과시험을 실시한다.
방어효과 시험결과 S. iniea S1398 단일백신 1회 접종구의 경우 백신농도 5㎎/㎖, 10㎎/㎖, 15㎎/㎖ 접종구의 상대생존율은 각각 66.7%, 80%, 86.7%로 나타났으며, 2회 접종구의 경우는 백신농도 5㎎/㎖, 10㎎/㎖, 15㎎/㎖ 접종구에서 상대생존율이 각각 71.4%, 71.4%, 92.8%로 나타났다.
Figure 112009043309619-pat00019
4) S. parauberis S1735 단일 백신의 방어효과 시험
혈액한천배지에서 순수배양 된 S. parauberis S1735 균주를 병원성 회복을 위해 어체통과를 3회 시킨다. 3회째 어체 통과된 균주를 순수배양 후 멸균생리식염수를 이용하여 1×1010CFU/㎖의 균수가 되도록 균액을 조제하여 백신구 및 접종구 각 20마리에 대해 전술한 바와 같이 방어효과시험을 실시한다.
방어효과 시험결과 S. parauberis S1735 단일백신 1회 접종구의 경우 백신농도 5㎎/㎖, 10㎎/㎖, 15㎎/㎖ 접종구의 상대생존율은 각각 78.6%, 85.7%, 85.7%로 나타났으며, 2회 접종구의 경우는 백신농도 5㎎/㎖, 10㎎/㎖, 15㎎/㎖ 접종구에서 상대생존율이 각각 69.2%, 84.6%, 76.9%로 나타났다.
Figure 112009043309619-pat00020
3-2. 복합백신 방어효과 실험
L. anguillarum V189, T. maritimum FL41, S. iniae S1398, S. parauberis S1735 균주가 각 10㎎/㎖가 되도록 조제된 복합백신을 어체당 0.1㎖씩 접종하고 난 후 3주째에 L. anguillarum V189, T. maritimum FL41, S. iniae S1398, S. parauberis S1735 균주 각각에 대하여 균액을 조제하여 어류의 복강에 0.1㎖씩 인위감염 시킨다. 인위감염 시 균액의 농도는 L. anguillarum V189, T. maritimum FL41, S. iniae S1398, S. parauberis S1735를 각각 1×108CFU/㎖, 1×109CFU/㎖, 1×109CFU/㎖, 1×1010CFU/㎖가 되도록 조절한다. 균액조제시 멸균 유리구슬을 균 현탁액에 넣어 고속진탕 시켜 균주가 골고루 잘 풀리도록 하여 인위감염시 주사바늘이 막힘이 없도록 하여준다. 인위감염 2일전에 미리 시험어를 절식하여 둔다. 인위감염 후 15일~21일동안 관찰하면서 누적폐사율을 조사하여 대조구의 페사율이 60%이상 일때 백신 접종구의 상대생존율을 산출한다. 상대생존율의 산출은 아래와 같다.
상대생존율(Relative percent survive, RPS)(%)= 〔1-(백신접종구의 누적폐사율/대조구의 누적폐사율)〕× 100
복합백신 2회 접종구에 대한 방어효과시험은 복합백신 1회 접종 2주후에 추가접종을 실시하고 추가접종일로부터 3주후에 1회 접종구와 동일한 방법으로 방어효과시험을 수행한다. 복합백신 1회 접종구 및 2회 접종구에 대한 방어효과 시험기간은 14일~28일 기간 수행한다. S. parauberis S1735균주의 경우 균주의 특성상 방어효과 시험을 위한 인위감염 시 병원성 발현 시간이 늦는 경우가 있어 대조구의 폐사가 지연되는 경우가 발생하므로 시험기간을 28일로 한다.
복합백신에 대한 방어효과시험결과 L. anguillarum V189에 대한 방어효과 시험결과 복합백신 1회 접종구에서는 94.5%의 상대생존율을 보였으며, 2회 접종구에서는 90%의 상대생존율 보였다. T. maritimum FL41에 대한 방어효과 시험에서는 복합백신 1회 및 2회 접종구에서 각각 84.7%, 89.4%의 상대생존율을 보였으며, S. iniae S1398에 대한 방어효과시험에서는 1회 접종구 및 2회 접종구에서 각각 85%, 100%의 상대생존율을 보였고, S. parauberis S1735균주에 대해서는 1회, 2회 접종구에서 각각 91.6%, 85.2%의 상대생존율을 보였다.
Figure 112009043309619-pat00021
<실시예 5> 복합백신의 안전성 실험
백신의 안전성을 확인하기 위하여 복합백신을 0.1㎖, 0.2㎖, 0.4㎖를 공시어(넙치 약 15㎝) 각각 20마리의 복강에 주사하고 3주간 주사부위의 화농 및 괴사 여부등을 확인하고 폐사율은 확인한다. 또한 백신 자체의 오염유무를 확인하기 위하여 복합백신 1㎖를 멸균페트리디쉬에 주입하고 미리 조제되어 준비된 약 50℃ 정도의 BHIA 배지를 약 15~20㎖를 첨가하여 굳인 다음 29ㅁ 0.5℃에서 48시간 배양 후 세균성장 유무를 관찰한다.
안전성 시험을 위해 0.1㎖, 0.2㎖, 0.4㎖를 공시어에 접종 후 3주간 관찰하는 동안 폐사는 관찰되지 않았으며 접종부위에 특이한 소견도 관찰되지 않았다. 또한 복합백신의 세균오염여부 조사를 위한 시험에서도 세균이 검출되지 않았다.

Claims (14)

  1. Listonella anguillarum, Streptococcus iniae, Streptococcus parauberis 및 Tenacibaculum maritimum 의 불활화균체를 1:1:1:1의 농도(mg/ml)비로 포함하는 어류의 세균성 질병에 대한 예방 백신.
  2. 제1항에 있어서, 상기 불활화균체는 Listonella anguillarum V189균주(기탁번호 : KCTC11446BP), Streptococcus iniae S1398균주(기탁번호 : KCTC11444BP), Streptococcus parauberis S1735균주(기탁번호: KCTC11445BP) 및 Tenacibaculum maritimum FL41균주(기탁번호 : KCTC11447BP)인 것을 특징으로 하는 어류의 세균성 질병에 대한 예방 백신.
  3. 삭제
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 세균성 질병은 연쇄구균증, 비브리오증, 활주세균증인 것을 특징으로 하는 백신.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 어류는 넙치인 것을 특징으로 하는 백신.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 백신의 항원농도는 1~100㎎/ml인 것을 특징으로 하는 백신.
  7. 어류 세균성 질병을 동시에 예방하는 다가불활화 백신의 제조방법에 있어서
    a) Listonella anguillarum, Streptococcus iniae, Streptococcus parauberis 및 Tenacibaculum maritimum 를 -40℃~-85℃에서 보존하는 단계;
    b) 보존된 상기 균주들을 백신 제조용 종균으로 제조하는 단계;
    c) 상기 b) 단계의 백신 제조용 종균을 배지에 접종하여 배양하는 단계;
    d) 상기 균주를 불활화시키는 단계;
    e) 불활화된 각 균주배양액을 습중량 30~50mg/ml의 농도로 희석하여 0~10℃에 보관하는 단계; 및
    f) 상기 단계의 균주배양액을 1:1:1:1 농도(mg/ml)비로 혼합하는 단계를 포함하는 어류의 세균성 질병에 대한 예방 백신의 제조방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 불활화균체는 Listonella anguillarum V189균주(기탁번호 : KCTC11446BP), Streptococcus iniae S1398균주(기탁번호 : KCTC11444BP), Streptococcus parauberis S1735균주(기탁번호: KCTC11445BP) 및 Tenacibaculum maritimum FL41균주(기탁번호 : KCTC11447BP)인 것을 특징으로 하는 어류의 세균성 질병에 대한 예방 백신의 제조방법.
  9. 제7항에 있어서 b)단계의 백신 제조용 종균의 제조 단계는
    ⅰ) 보존된 Listonella anguillarum, Streptococcus iniae 및 Streptococcus parauberis 를 1.5% 염화나트륨을 첨가한 비에이치아이(BHI : Brain Heart Infusion) 고체배지에 접종하여 26~32℃에서 18~26시간동안 배양한 후, 비에이치아이(BHI : Brain Heart Infusion) 액체 배지에 배양하여 Listonella anguillarum, Streptococcus iniae 및 Streptococcus parauberis 의 백신 제조용 종균을 제조하는 단계;
    ⅱ) 보존된 Tenacibaculum maritimum 를 Marine agar 2216 고체배지에 접종하여 26~32℃에서 18~26시간동안 배양한 후, marine 액체 배지에 배양하여 Tenacibaculum maritimum 의 백신 제조용 종균을 제조하는 단계; 로 이루어진 것을 특징으로 하는 어류의 세균성 질병에 대한 예방 백신의 제조방법.
  10. 제7항에 있어서 c)단계의 종균 배양 단계는 b)단계의 제조용 종균을 하기의 배양배지에 각각 2%비율로 접종하고, pH 7.2, 150～200 rpm으로 교반하면서 24시간 배양하는 것을 특징으로 하는 어류의 세균성 질병에 대한 예방 백신의 제조 방법.
    비에이치아이 액체배지(BHI, Brain Heart Infusion: Calf brain- infusion from 200g 7.7g, Beef Brains-Infusion from 250g 9.8g, Proteose Peptone 10.0g, Dextrose 2.0g, Sodium chloride 5.0g, Disodium Phosphate 2.5g, 탈이온수 1L),
    Marine Broth 2216 배지 (조성: NaCl 19.45g, MgCl2 8.8g, Peptone 5.0g, Na2SO3 3.24g, CaCl2 1.8g, yeast extract 1.0g, KCl 0.55g, NaHCO3 0.16g, Ferric citrate 0.1g, KBr 0.08g, SrCl2 0.03g, H3BO3 0.02g, Na2HPO4 8.0㎎, Na2SiO3 4.0㎎, NaF 2.4㎎, NH4NO3 1.6㎎, 탈이온수 1L)
  11. 삭제
  12. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세균성 질병은 연쇄구균증, 비브리오증, 활주세균증인 것을 특징으로 하는 어류의 세균성 질병에 대한 예방 백신의 제조방법.
  13. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 어류는 넙치인 것을 특징으로 하는 어류의 세균성 질병에 대한 예방 백신의 제조방법.
  14. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 의하여 제조되는 것을 특징으로 하는 어류의 세균성 질병에 대한 예방 백신.
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