CN116200371B - 一种透明质酸酶突变体、突变基因及其在制备寡聚透明质酸中的应用 - Google Patents
一种透明质酸酶突变体、突变基因及其在制备寡聚透明质酸中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种透明质酸酶突变体、突变基因及其在制备寡聚透明质酸中的应用。该透明质酸酶突变体氨基酸序列相对于SEQ ID No.3所示序列仅存在下述突变：第110位的谷氨酸取代为赖氨酸、第409位色氨酸取代为半胱氨酸、第519位天冬酰胺取代为色氨酸、第525位丙氨酸取代为甘氨酸、第532位天冬氨酸取代为脯氨酸。本发明以肺炎链球菌Streptococcus pneumonia SP098的野生型透明质酸酶hyl为基础，选择第110位、第409位、第519位、第525位和第532位的氨基酸进行迭代饱和突变。与野生型透明质酸酶hyl相比，透明质酸酶突变体hyl‑E110K‑W409C‑D532P‑N519W‑A525G的酶活力提高了3.73倍，达到21.3×105U/mL，应用该透明质酸酶突变体进行寡聚透明质酸的生产，最高发酵产量可以达到50.5g/L。
Description
技术领域
本发明涉及一种透明质酸酶突变体、突变基因及其在制备寡聚透明质酸中的应用，属于生物技术领域。
背景技术
HA寡聚糖广泛应用于化妆品、医药及临床诊治、食品行业中，市场需求度高；常规HA制备方法得到透明质酸分子量较大，物理法和化学法水解获得寡糖过程随机，增加生产成本，影响产品收率，酶解法最适于制备寡聚透明质酸。微生物成为工业酶制剂的主要来源。但目前缺乏能够表达酶活高、热稳定性和pH稳定性好稳定的外源表达载体，同时寡聚糖的制备工艺尚处在优化与改进的阶段，获得、分离与纯化单一聚合度的寡聚透明质酸所需的凝胶材料造价太高，为工业化生产带来困难。
中国专利文献CN106636036A公开了一种透明质酸酶突变体及其应用。该发明将透明质酸酶突变体采用食品级安全的工业菌株枯草芽孢杆菌进行表达，获得了透明质酸酶生产菌株。以该重组枯草芽孢杆菌发酵，可在发酵上清液中收集得到透明质酸酶，该酶在pH4～9的范围内保持很好的活性，相比突变前，在耐酸性能上有了提高，温度25～40℃条件下保持良好活性，且耐受低温性能有显著提高。但是该专利得到的透明质酸酶突变体在偏酸偏热的环境中，对酶活的影响浮动很大，在应用于生产中存在明显不足。
中国专利文献CN111971387A公开了一种透明质酸水解酶突变体和包含其的药物组合，该发明涉及透明质酸酶PH20突变体或其片段，改善酶的热稳定性及酶活性。中国专利文献CN113444708A公开了一种用于药物皮下注射制剂的透明质酸酶突变体，该发明对人透明质酸酶PH20进行定点突变，根据特定位点在透明质酸二级结构预测的分布位置，和这些位点氨基酸的性质，最终确定突变序列及活性分析，得到了四个无糖基化修饰切保留催化活性的透明质酸酶突变体，有利于药物在皮下组织扩散。这两篇专利方法得到的透明质酸酶突变体更多应用于药物，并未见应用于寡聚透明质酸的生产，且改造的基因序列来源皆为PH20，具有一定的限制性。
发明内容
本发明涉及一种透明质酸酶突变体、突变基因及其在制备寡聚透明质酸中的应用。该酶能够应用于制备寡聚透明质酸过程中，可降低大规模生产制备纯化透明质酸酶及寡糖的成本，创造更大的经济效益，满足市场需求，减少环境污染。
本发明的技术方案如下：
首先，本发明提供一种透明质酸酶突变体，其氨基酸序列相对于SEQ ID No.3所示序列仅存在下述突变：第110位的谷氨酸取代为赖氨酸、第409位色氨酸取代为半胱氨酸、第519位天冬酰胺取代为色氨酸、第525位丙氨酸取代为甘氨酸、第532位天冬氨酸取代为脯氨酸。
根据本发明优选的，所述透明质酸酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
其次，本发明提供所述的透明质酸酶突变体的编码基因。
根据本发明优选地，所述透明质酸酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
相应地，本发明第三方面还提供含有所述透明质酸酶突变体的编码基因的表达盒、重组载体。所述重组载体对出发载体并没有特别的限制，可为本领域中已知的任何载体，只要它能够在宿主中进行复制即可。例如，所述载体包括但不限于质粒、噬菌体。一旦转化入合适的宿主之后，所述载体可以复制并独立于宿主基因组发挥功能，或者在某些情况下整合入基因组本身。
更优选地是重组表达载体，更优选原核重表达载体。最优选是适合于在大肠杆菌中进行表达的表达载体。
第四方面，本发明提供含有所述透明质酸酶突变体的编码基因的重组宿主细胞。其中所述“宿主细胞”是具有本领域通常理解的含义，其能够导入本发明的突变体的编码基因的细胞，导入之后称为重组宿主细胞。本发明的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，优选为原核细胞，更优选为大肠杆菌，最优选的，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21。
第五方面，本发明还提供一株含有透明质酸酶突变体的编码基因的重组大肠杆菌(Escherichia coli)3203，于2022年12月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号CCTCC NO.M 20221943。
第六方面，本发明还提供一种透明质酸酶突变体的制备方法，包括步骤如下：
(1)将含有所述透明质酸酶突变体的编码基因的重组宿主细胞接种到含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃下培养12～18h，然后以体积浓度1.5～2.5％的接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/mL卡纳霉素的LB液体培养基中，在37℃、180～220rpm下培养2.5～3.5h，在向培养液中加入终浓度为0.05～0.15mM IPTG，在20℃下诱导培养12～18h，取发酵液，4℃、8000r/m离心30分钟，获得湿细胞；
(2)将湿细胞重悬于pH7.0的磷酸盐缓冲液中，在冰水中混合物上超声破碎20分钟，超声完毕后，取超声液在4℃、8000r/m下离心30分钟取上清液，即得透明质酸酶突变体；
所述超声破碎条件：功率300W，破碎10秒、暂停10秒。
第六方面，本发明提供透明质酸酶突变体、或其编码基因在制备寡聚透明质酸中的应用。
根据本发明优选的，所述应用，步骤如下：
(1)将马链球菌兽疫亚种ATCC39920接种至种子培养基中，在摇床转速为200～240rpm、37℃下培养20～25h，得到种子液；
(2)将种子液按照5～10％(V/V)的接种量接入发酵培养基中，在摇床转速为450～550rpm、37℃下发酵培养12～18h，然后加入上述透明质酸酶突变体酶液，在37℃下继续发酵培养18～24h，得到含寡聚透明质酸的发酵液。
进一步优选的，步骤(2)中，所述透明质酸酶突变体酶液的浓度为1000～3000U/L。
本发明的有益效果在于：
1、本发明以肺炎链球菌Streptococcus pneumonia SP098的野生型透明质酸酶hyl为基础，选择第110位、第409位、第519位、第525位和第532位的氨基酸进行迭代饱和突变，将大肠杆菌BL21中野生型透明质酸酶hyl第110位的谷氨酸取代为赖氨酸、第409位色氨酸取代为半胱氨酸、第519位天冬酰胺取代为色氨酸、第525位丙氨酸取代为甘氨酸、第532位天冬氨酸取代为脯氨酸。与野生型透明质酸酶hyl相比，透明质酸酶突变体
hyl-E110K-W409C-D532P-N519W-A525G的酶活力提高了3.73倍，达到21.3×105U/mL。
2、本发明通过在发酵过程添加不同酶活单位的透明质酸酶突变体透明质酸酶突变体hyl-E110K-W409C-D532P-N519W-A525G酶液，可获得特定分子量的寡聚透明质酸，分子量范围在0.4KDa-300KDa。并且添加透明质酸酶后，发酵液黏度下降，增强了传质，提高了溶解氧含量，带来透明质酸产量的提高，最高发酵产量可以达到50.5g/L，相比于不添加该酶透明质酸提高了3.39倍。此方法能够显著缩短生产低分子量或寡聚透明质酸生产时间，能够显著地降低生产成本，提高生产效率，因而在制备寡聚透明质酸中具有很大的应用价值。
附图说明
图1为透明质酸酶突变体hyl-E110K-W409C-D532P-N519W-A525G的电泳图；
图中，泳道1和2均为透明质酸酶突变体hyl-E110K-W409C-D532P-N519W-A525G。
具体实施方式
本发明的以下实施例和附图仅说明实现本发明的具体实施方案，这些方案和附图不可以理解为对本发明的限制，任何在不脱离本发明的原理和实质的情况下所做的任何改变，均落在本发明的保护范围之内。
本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。
本发明中使用的马链球菌兽疫亚种ATCC39920、大肠杆菌均为普通市售菌种，可从微生物保藏中心或菌种销售公司购得。
实施例1：肺炎链球菌Streptococcus pneumonia SP098的野生型透明质酸酶hyl突变体文库的构建
1、从NCBI获得如GenBank:KC416176.1所示肺炎链球菌Streptococcus pneumoniaSP098的野生型透明质酸酶hyl的核苷酸序列，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，氨基酸序列如SEQ IDNo.3所示。然后委托华大基因公司合成其全长基因，利用限制性酶Nhe I和Xho I将野生型透明质酸酶hyl序列连接至表达载体pET28A，得到重组质粒pET28A-hyl；然后将重组质粒pET28A-hy导入大肠杆菌BL21感受态细胞，得到含有野生型透明质酸酶的工程菌BL21-pET28A-hyl。
2、基于马链球菌兽疫亚种ATCC39920来源的透明质酸酶的肺炎链球菌Streptococcus pneumonia SP098的野生型透明质酸酶hyl结构及二者同源性预测，推断肺炎双球菌来源野生型透明质酸酶hyl的包内结构域，经过氨基酸序列的Blast比对，找出保守基因序列，在其附近进行突变，保守位点不变，选定区域进行组合突变，设计简并引物进行全质粒PCR扩增，PCR产物经过Dpn I消化模板后，转化大肠杆菌BL21感受态细胞。
本发明野生型透明质酸酶hyl突变体文库的制备通过5轮迭代饱和突变来实现，具体如下：
a、第一轮以含野生型透明质酸酶hyl的重组质粒pET28A-hyl为模板，以F110和R110为引物，经饱和突变PCR，将野生型透明质酸酶hyl氨基酸序列的第110位谷氨酸突变为其余19种氨基酸，然后转化大肠杆菌、涂布LB固体培养基，通过优势菌株筛选，获得菌株BL21-pET28A-hyl-E110K。
所述优势菌株筛选的具体方法如下：
从LB固体培养基上随机挑选突变的单菌落接种入装有600μL的LB液体培养基的96微孔板中，在37℃、200r/min培养16h，按照1％接种量接入新的装有600μL的LB液体培养基96微孔板中，在37℃、200r/min培养4h，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG后，在20℃下诱导培养16h；将96孔板以4500r/min离心10min，弃去上清，在沉淀中加入100μL浓度为2mg/mL的HA底物溶液，充分震荡悬浮，在PCR仪中设置程序：38℃反应10min后，100℃失活1min，取出50μL加入到另一块装有100μL的3，5-二硝基水杨酸(DNS)试剂的PCR板中，在100℃反应10min后加入去离子水350μL，测定520nm处吸光值，根据吸光值确定透明质酸酶酶活大小，酶活大的为优势菌株。
酶活定义为：在37℃，1mL酶1h生成的还原糖量(μg)为1U。
b、第二轮以从菌株BL21-pET28A-hyl-E110K中提取的重组质粒为模板，以F409和R409为引物，经饱和突变PCR，将该重组质粒的第409位色氨酸突变为其余的19种氨基酸，然后转化、涂布LB固体培养基，按照步骤a所述方法进行优势菌株筛选，获得菌株BL21-pET28A-hyl-E110K-W409C。
c、第三轮以从菌株BL21-pET28A-hyl-E110K-W409C中提取的重组质粒为模板，以F532和R532为引物，经饱和突变PCR，将该重组质粒的第532位天冬氨酸突变为其余的19种氨基酸，然后转化大肠杆菌、涂布LB固体培养基，按照步骤a所述方法进行优势菌株筛选，获得菌株BL21-pET28A-hyl-E110K-W409C-D532P。
d、第四轮以从菌株BL21-pET28A-hyl-E110K-W409C-D532P中提取的重组质粒为模板，以F519和R519为引物，经饱和突变PCR，将该重组质粒的第519位天冬酰胺突变为其余的19种氨基酸，然后转化大肠杆菌、涂布LB固体培养基，按照步骤a所述方法进行优势菌株筛选，获得菌株BL21-pET28A-hyl-E110K-W409C-D532P-N519W。
e、第五轮以从菌株BL21-pET28A-hyl-E110K-W409C-D532P-N519W中提取的重组质粒为模板，以F525和R525为引物，经饱和突变PCR，将该重组质粒的第525位丙氨酸突变为其余的19种氨基酸，然后转化大肠杆菌、涂布LB固体培养基，按照步骤a所述方法进行优势菌株筛选，获得菌株BL21-pET28A-hyl-E110K-W409C-D532P-N519W-A525G。
所述突变PCR体系(50μL)为：2倍Phanta Max缓冲液25μL，dNTPs 1μL，突变上下引物各1μL，模板1μL，Phanta Super-Fidelity DNA聚合酶0.5μL，补ddH2O至50μL。
PCR条件为：95℃预变性5分钟，经30个循环：90℃30秒，62℃30秒，72℃7分钟，最后72℃终延伸5分钟。具体扩增引物如表1所示。
从菌株BL21-pET28A-hyl-E110K-W409C-D532P-N519W-A525G中提取重组质粒，再进行DNA琼脂糖凝胶电泳阳性验证，结果如图1所示。由图1可知凝胶电泳图中出现目的条带且条带单一，说明透明质酸裂解酶基因突变并且表达成功。
表1透明质酸酶定点饱和突变引物设计
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) |
| F110 | CAAGCCCTNNKAAATTAAGGGCAGCGG |
| R110 | CTTAATTTNNKAGGGCTTGAGATAGTG |
| F409 | GAACTGGNNKGATTATGAAATCGGTACACC |
| R409 | ATAATCNNKCCAGTTCCCAACAATGCT |
| F532 | GTTTTGATTNNKGGCCTGTCTCAACTGTTGC |
| R532 | GGCCATCANNKAAAACATTCCCATAAG |
| F519 | CCACACCNNKGTTGCCTATACGGGTGC |
| R519 | AACNNKGGTGTGGTCGATATAGGATCC |
| F525 | CGGGTNNKTATGGGAATGTTTTGATTG |
| R525 | TANNKACCCGTATAGGCAACATTGGTGTGGTC |
实施例2：含透明质酸酶突变文库的菌株的筛选
1、将实施例1中5轮饱和突变PCR所得的PCR产物进行DpnI酶消化模板，37℃，1小时，220转/分钟，65℃，1分钟灭活，将PCR产物热击转化，涂布于含50μg/mL氨苄霉素抗性的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜。
从LB固体培养基上随机挑选突变的单菌落接种入装有600μL的LB液体培养基的96微孔板中，在37℃、200r/min培养16h，按照1％接种量接入新的装有600μL的LB液体培养基96微孔板中，在37℃、200r/min培养4h，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG后，在20℃下诱导培养16h；将96孔板以4500r/min离心10min，弃去上清，在沉淀中加入100μL浓度为2mg/mL的HA底物溶液，充分震荡悬浮，在PCR仪中设置程序：38℃反应10min后，100℃失活1min，取出50μL加入到另一块装有100μL的3，5-二硝基水杨酸(DNS)试剂的PCR板中，在100℃反应10min后加入去离子水350μL，测定520nm处吸光值。
酶活定义为：在37℃，1mL酶1h生成的还原糖量(μg)为1U。
2、与野生型对照相比，大部分突变后的HAase丧失了酶活或与对照差异不大，个别孔颜色很深，说明酶活有明显提高，经过五轮迭代饱和突变及筛选，筛选获得具有明显优势的正向突变株。
将酶标仪中读出的酶活比对照提高80％以上的突变体进行摇瓶复筛，并同时培养对照菌。种子液37℃、200r/min培养16h后按1％接种量转接至50mL(摇瓶容量为500mL)发酵培养基中，37℃、200r/min培养4h，然后加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG，20℃下诱导培养16h。取样后按上述方法测定酶活，经过验证后的酶活力和最适温度见表2。
表2、突变体与野生型酶的差异
由表2可知，含有透明质酸酶突变体的菌株中的透明质酸酶酶活均高于野生型透明质酸酶，最高酶活的菌株BL21-pET28A-hyl-E110K-W409C-D532P-N519W-A525G酶活达到了21.3×105U/mL，相较于野生型透明质酸酶酶活提高3.73倍。
将菌株BL21-pET28A-hyl-E110K-W409C-D532P-N519W-A525G命名为大肠杆菌(Escherichia coli)3203，于2022年12月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号CCTCC NO.M 20221943。
实施例3、透明质酸酶突变体的制备
一种透明质酸酶突变体hyl-E110K-W409C-D532P-N519W-A525G的制备方法，包括步骤如下
(1)将菌株BL21-pET28A-hyl-E110K-W409C-D532P-N519W-A525G接种到含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃下培养16小时，然后以体积浓度2％的接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/mL卡纳霉素的LB液体培养基中，在37℃、200r/m下培养3小时，在向培养液中加入终浓度为0.1mM IPTG，在20℃下诱导培养16小时，取发酵液，4℃、8000r/m离心30分钟，获得菌株BL21-pET28A-hyl-E110K-W409C-D532P-N519W-A525G的湿菌体细胞；
(2)将菌株BL21-pET28A-hyl-E110K-W409C-D532P-N519W-A525G的湿菌体细胞重悬于pH7.0的磷酸盐缓冲液中，在冰水中混合物上超声破碎20分钟，超声破碎条件：功率300W，破碎10秒、暂停10秒；超声完毕后，取超声液在4℃、8000r/m下离心30分钟取上清液，即得透明质酸酶突变体hyl-E110K-W409C-D532P-N519W-A525G。
本实施例制备的透明质酸酶突变体hyl-E110K-W409C-D532P-N519W-A525G核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，其酶活达到21.3×105U/mL，相比于野生型酶，其酶活单位提高3.73倍。本发明提供的大肠杆菌(Escherichia coli)3203可以用于透明质酸酶突变体的制备。
实施例4：透明质酸酶突变体hyl-E110K-W409C-D532P-N519W-A525G在制备寡聚透明质酸中应用
选取马链球菌兽疫亚种ATCC39920为透明质酸生产菌株，通过透明质酸酶突变体hyl-E110K-W409C-D532P-N519W-A525G制备寡聚透明质酸，具体步骤如下。
(1)将马链球菌兽疫亚种ATCC39920接种至种子培养基中，在摇床转速为220rpm、37℃下培养24h，得到种子液；
(2)将种子液按照10％(V/V)的接种量接入发酵培养基中，在摇床转速为500rpm、37℃下发酵培养16h，然后分别按照梯度终浓度为0U/L、1000U/L、2000U/L和3000U/L加入经过0.22μm过滤膜除菌过滤的实施例3所制备的透明质酸酶突变体
hyl-E110K-W409C-D532P-N519W-A525G酶液，继续在37℃下发酵培养20小时，得到发酵液
取发酵液分别测定其透明质酸含量和透明质酸分子量，结果见表3。
表3添加透明质酸酶突变体对透明质酸发酵的影响
由表3可知，通过在发酵过程添加不同酶活单位的透明质酸酶突变体
hyl-E110K-W409C-D532P-N519W-A525G酶液，可获得特定分子量的寡聚透明质酸，分子量范围在0.4KDa-300KDa。并且添加透明质酸酶后，发酵液黏度下降，增强了传质，提高了溶解氧，带来透明质酸产量的提高以及分子量的下降，最高发酵产量可以达到50.5g/L，相比于对照组提高了3.39倍，其寡聚透明质酸的分子量为0.4～1.2KDa，以上说明通过本发明提供的透明质酸酶突变体可大幅度提高寡聚透明质酸的产量，进而降低大规模生产制备透明质酸寡糖成本。
Claims (8)
1.一种透明质酸酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列相对于SEQ ID No.3所示序列仅存在下述突变：第110位的谷氨酸取代为赖氨酸、第409位色氨酸取代为半胱氨酸、第519位天冬酰胺取代为色氨酸、第525位丙氨酸取代为甘氨酸、第532位天冬氨酸取代为脯氨酸。
2.如权利要求1所述的透明质酸酶突变体，其特征在于，所述透明质酸酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
3.如权利要求1所述的透明质酸酶突变体的编码基因。
4.如权利要求3所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如 SEQ IDNO.2 所示。
5.一种含有权利要求3所述的透明质酸酶突变体的编码基因的重组载体。
6.一种含有权利要求3所述的透明质酸酶突变体的编码基因的重组大肠杆菌。
7.如权利要求6所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌于2022年12月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号CCTCC NO. M 20221943。
8.权利要求1所述的透明质酸酶突变体、或权利要求3所述的透明质酸酶突变体的编码基因、或权利要求7所述的重组大肠杆菌在制备寡聚透明质酸中的应用。
Priority Applications (1)
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| CN202211687722.XA CN116200371B (zh) | 2022-12-27 | 2022-12-27 | 一种透明质酸酶突变体、突变基因及其在制备寡聚透明质酸中的应用 |
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