CN114752581B - 一种α-半乳糖苷酶突变体及其应用 - Google Patents

一种α-半乳糖苷酶突变体及其应用 Download PDF

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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Y302/01022—Alpha-galactosidase (3.2.1.22)
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

本发明公开了一类高比活的α‑半乳糖苷酶突变体及其应用。本发明以来源于Anoxybacillus vitaminiphilus的α‑半乳糖苷酶AgaV为模板，采用分子生物学技术进行氨基酸突变，得到一类催化效率提高的突变体，包括G355D、G355E、G355F、G355H、G355I、G355K、G355L、G355N、G355Q、G355R、G355T、G355V和G355Y。本发明所述的突变体具有催化效率高的优良性质，对以D‑半乳糖和甘油为底物催化合成异红藻苷的效率提高了1.3‑3倍，有利于降低异红藻高合成的成本，提高了使用该酶生产异红藻苷的转化效率，具有广阔的应用前景。

Description

一种α-半乳糖苷酶突变体及其应用
技术领域
本发明属于功能基因改造技术领域，具体涉及一类α-半乳糖苷酶突变体及其应用。
背景技术
半乳糖基-甘油是一种由D-半乳糖基和甘油组成的醇溶性半乳糖苷，存在于许多红藻和海藻类当中。α-D-半乳糖基-甘油和β-D半乳糖基-甘油广泛用于化妆品、保健品、食品和药物。一般，α-D-半乳糖基-甘油有两种对映体形式：红藻糖苷和异红藻苷，在藻细胞中主要发挥抗渗透压等作用，同时具有化学抗氧化、抗炎、免疫调节及清除自由基等作用。研究表明，异红藻苷是红藻的主要光合产物，红藻(海萝和坛紫菜)已被证实含有高浓度的异红藻苷。
目前，异红藻苷尚未有化学合成法，主要采用醇提工艺从红藻中获得，但是这种方法存在提取工艺复杂，效率低等问题。
利用α-半乳糖苷酶催化甘油和D-半乳糖逆水解反应合成异红藻苷具有原子经济性高、成本低等优点，并且结合蛋白质工程手段提高α-半乳糖苷酶酶活对提高异红藻苷的产量具有重要意义。
发明内容
本发明通过定点饱和突变对来源于维生素芽孢杆菌Anoxybacillusvitaminiphilus的α-半乳糖苷酶进行理性改造，获得一系列α-半乳糖苷酶突变体，可以作为生物催化剂，催化底物甘油和D-半乳糖逆水解反应，生产异红藻苷，提高异红藻苷的转化率。
本发明具体技术方案如下：
一种α-半乳糖苷酶突变体，在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列基础上具有G355突变，第355位的甘氨酸突变为天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸、苏氨酸、缬氨酸或酪氨酸。
优选第355位的甘氨酸突变为组氨酸。本发明另一目的在于提供一种DNA分子，所述DNA分子编码本发明所述的α-半乳糖苷酶突变体。
本发明另一目的在于提供一种α-半乳糖苷酶突变体的表达载体，表达如本发明所述的α-半乳糖苷酶突变体。所述表达载体，含有编码本发明所述的α-半乳糖苷酶突变体的DNA分子。所述表达载体为质粒、噬菌体、病毒或宿主细胞。
所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞，可以为大肠杆菌、酵母、芽孢杆菌、乳酸杆菌、曲霉或木霉，优选大肠杆菌。
本发明另一目的是提供上述α-半乳糖苷酶突变体、DNA分子或α-半乳糖苷酶突变体的表达载体在制备异红藻苷中的应用。
综上所述，本发明优点如下：本发明以来源于Anoxybacillus vitaminiphilus的α-半乳糖苷酶AgaV(核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示)为模板，采用计算机辅助设计寻找潜在的氨基酸活性位点，共得到四个潜在的位点：I348、I591、V618和G355。进一步对这4个位点进行饱和突变，考察各突变体的酶活和合成异红藻苷的相对转化率。研究结果显示，I348、I591、V618饱和突变的突变体，对异红藻苷的转化率均没有显著提高，G355位点的若干突变体具有催化效率高的优良性质，对以D-半乳糖和甘油为底物催化合成异红藻苷的效率提高了1.3-3倍，其中G355H对异红藻苷的转化率提升幅度最为显著，为原始酶的3倍。本发明有利于降低异红藻高合成的成本，提高使用该酶生产异红藻苷的转化效率，大大降低了生产成本，具有重要的应用价值。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为α-半乳糖苷酶AgaV和4fnq三维对比。
图2为α-半乳糖苷酶AgaV与突变体的SDS-PAGE图。
图3为本发明所述突变体的相对酶活。
图4原始酶和本发明所述突变体合成异红藻苷的相对转化率。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明方案，下面结合附图和实施实例对本发明做进一步说明。需要指出的是，本实施例仅用于解释本发明，而非对本发明范围的限制。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1α-半乳糖苷酶AgaV酶活性架构中关键氨基酸的确定
本发明选取的α-半乳糖苷酶AgaV具有一定的合成活性，催化D-半乳糖和甘油逆水解反应合成异红藻苷。研究表明，α-半乳糖苷酶作为糖苷水解酶，主要催化糖苷类化合物的水解反应，仅有少部分可以催化合成反应。本发明通过BLAST搜索发现来源于Geobacillusstearothermophilus的α-半乳糖苷酶AgaB与AgaV具有较高的序列相似性(75％)，在PDB数据库中获取了AgaB的晶体结构(PDB：4fnq)，以其为模板，构建了α-半乳糖苷酶AgaV的三维结构模型(图1)。
通过序列比对发现，来源于Geobacillus stearothermophilus的α-半乳糖苷酶AgaA和AgaB同源性高达97％，但却具有不同的催化特性，AgaA具有较高的水解活性，而AgaB合成活性即转糖基活性较强。将AgaV与这两种酶的氨基酸序列进行比对，并将产物异红藻苷对接到AgaV的活性口袋，选取距离活性位点
Figure BDA0003606156240000031
以内的氨基酸，在此范围内AgaV和AgaA与AgAB具有共同差异的氨基酸位点有四个I348、I591、V618和G355。对这4个位点进行饱和突变，考察各突变体的酶活和合成异红藻苷的相对转化率。结果显示，I348、I591、V618饱和突变的突变体，对异红藻苷的转化率均没有显著提高。。
实施例2α-半乳糖苷酶AgaV G355突变体的构建
如实施例1所述，对α-半乳糖苷酶AgaV在355位置的氨基酸行饱和突变。其构建方法如下，所用引物见下表：
Primer Sequence(5′to 3′)
G355A-F CAGATCGCCGAAGCCGCAAAAGAACTGGGCATC SEQ ID NO：3
G355C-F CAGATCGCCGAAGCCTGTAAAGAACTGGGCATC SEQ ID NO：4
G355D-F CAGATCGCCGAAGCCGATAAAGAACTGGGCATC SEQ ID NO：5
G355E-F CAGATCGCCGAAGCCGAAAAAGAACTGGGCATC SEQ ID NO：6
G355F-F CAGATCGCCGAAGCCTTTAAAGAACTGGGCATC SEQ ID NO：7
G355H-F CAGATCGCCGAAGCCCATAAAGAACTGGGCATC SEQ ID NO：8
G355I-F CAGATCGCCGAAGCCATTAAAGAACTGGGCATC SEQ ID NO：9
G355K-F CAGATCGCCGAAGCCAAAAAAGAACTGGGCATC SEQ ID NO：10
G355L-F CAGATCGCCGAAGCCCTGAAAGAACTGGGCATC SEQ ID NO：11
G355M-F CAGATCGCCGAAGCCATGAAAGAACTGGGCATC SEQ ID NO：12
G355N-F CAGATCGCCGAAGCCAATAAAGAACTGGGCATC SEQ ID NO：13
G355P-F CAGATCGCCGAAGCCCCGAAAGAACTGGGCATC SEQ ID NO：14
G355Q-F CAGATCGCCGAAGCCCAGAAAGAACTGGGCATC SEQ ID NO：15
G355R-F CAGATCGCCGAAGCCCGTAAAGAACTGGGCATC SEQ ID NO：16
G355S-F CAGATCGCCGAAGCCAGCAAAGAACTGGGCATC SEQ ID NO：17
G355T-F CAGATCGCCGAAGCCACCAAAGAACTGGGCATC SEQ ID NO：18
G355V-F CAGATCGCCGAAGCCGTTAAAGAACTGGGCATC SEQ ID NO：19
G355W-F CAGATCGCCGAAGCCTGGAAAGAACTGGGCATC SEQ ID NO：20
G355Y-F CAGATCGCCGAAGCCTATAAAGAACTGGGCATC SEQ ID NO：21
G355-R GGCTTCGGCGATCTGCAGGATTTTT SEQ ID NO：22
以带有α-半乳糖苷酶AgaV基因序列的pET-28a(+)质粒为模版，参照Vazyme生物产品及操作手册，使用突变引物对，全质粒扩增出定点突变序列。PCR产物使用Dpn I进行酶切处理，模板消化结束后，采用热激法转化至大肠杆菌感受态细胞E.coli BL21(DE3)，并涂布于含有100μg/ml硫酸卡那霉素的LB琼脂平板上，37℃倒置培养过夜。突变结果由安徽通用生物公司进行序列测定完成验证。突变体的构建使用常规的PCR技术，以α-半乳糖苷酶AgaV表达载体为模板进行全质粒扩增引入突变，所得到的G355突变体库经测序验证构建成功。
实施例3重组α-半乳糖苷酶突变体在大肠杆菌中的发酵表达
具体表达方法如下：
(1)分别将实施例2构建的各G355突变体以及原始酶α-半乳糖苷酶AgaV接种至含有100μg/mL硫酸卡那霉素的50mL的LB液体培养基中，37℃，180rpm培养过夜，制备种子液。
(2)以2％的接种量将种子液接种至新鲜的50mL的LB液体培养基中，37℃，180rpm培养至OD600为0.6～1.0时，取出经冰水浴冷却5min，加入诱导剂IPTG(异丙基-β-D硫代半乳糖苷)(终浓度0.1mmol/L)，20℃，180rpm诱导表达20h。
(3)取诱导表达的发酵液，12000rpm离心20min，弃去上清，然后用50mM Na2HPO4-KH2PO4(pH 7.0)缓冲重悬清洗菌体，12000rpm离心20min，弃去上清，用缓冲再次重悬，然后超声破碎。破碎液离心12000rpm，20min，取上清进行SDS-PAGE电泳检测，浓缩胶浓度为4％，分离胶浓度为12.5％，样品与上样缓冲按照3:1的比例混合，沸水浴反应5min进行上样电泳。电泳仪设定初始电压为120V，当样品移动至分离胶时提高电压至230V，直至样品移动到电泳槽底部时结束电泳。
上述α-半乳糖苷酶AgaV各突变粗酶液SDS-PAGE电泳结果如图2所示(图中原始酶α-半乳糖苷酶AgaV以WT表示，下同)，目的蛋白分子量为80kDa，电泳图中各泳道在80kDa处均有明显条带，表明目的蛋白在各突变体中成功表达。
实施例4α-半乳糖苷酶酶活测定方法
本发明以pNPG为底物测定α-半乳糖苷酶AgaV各突变体酶活力。用KH2PO4-Na2HPO4缓冲配置10mM pNPG溶液，作为底物溶液。在酶标板中加入240μL底物溶液，10μL适当稀释的酶液，在酶标仪中进行反应，反应温度为35℃，反应时间10min，在410nm处，测定吸光值。对照用10μL相同稀释倍数的灭活酶液。
酶活单位的定义：在35℃，pH7.5条件下，每分钟催化pNPG水解生成1μmol pNP所需的酶量。
pNP标准曲线的制作方法如下：
准确称取0.139g pNP，用KH2PO4-Na2HPO4缓冲(100mM，pH7.5)溶解，容量瓶定容至100mL，用KH2PO4-Na2HPO4缓冲对配置好的母液进行稀释，配成不同浓度的pNP溶液。在酶标板中加入10μL缓冲液，然后依次加入不同浓度的pNP标准溶液各240μL，用酶标仪测定410nm波长吸光值。以标准物质的浓度作为横坐标(X)，吸光值作为纵坐标(Y)。作标准曲线，方程为：Y＝2.495X+0.0117，R2＝0.9984。
实施例5α-半乳糖苷酶各突变体酶活测定
参照实施例3的方法，以pNPG为底物测定α-半乳糖苷酶AgaV各突变及原始酶粗酶液酶活。各突变体的相对酶活力如图所示。图3显示，将355位的甘氨酸突变为丙氨酸和半胱氨酸时，酶活力比野生型有所下降，而突变为其他17种氨基酸时酶活力均有所提高，如突变为天冬氨酸，酶活提高了7.9倍；突变为谷氨酸，酶活提高了7.2倍；突变为组氨酸，酶活提高了5.8倍等。其中，将355位的色氨酸突变为酪氨酸，可使酶活达到野生型的8.2倍。
实施例5α-半乳糖苷酶突变体和野生型应用于制备异红藻苷
方法：不同反应器中分别加入等量经诱导表达的野生型、本发明不同突变型的α-半乳糖苷酶的酶液，各组分别加入等量的溶解于50mM Na2HPO4-KH2PO4(pH 7.0)缓冲3mmolD-半乳糖和30mmol甘油，α-半乳糖苷酶的终浓度为18％(V/V)。反应在35℃条件下反应24h。反应液经适当稀释后用微孔滤膜过滤，液相检测分析反应情况。液相检测使用Bio-RadAminex HPX-87H色谱柱(300mm×7.8mm)，进样量10μL，流动相5mM H2SO4，流速0.3ml·min-1；柱温：50℃，用示差折光检测器进行检测。异红藻苷出峰时间：18.4min，半乳糖出峰时间：19.5min，甘油出峰时间：27.7min。
结果：检测结果如图4所示，突变体G355A和G355C催化生成异红藻苷的转化率比野生型低，其他突变体均对底物的转化率有不同程度的提高，如G335D、G355E、G355F、G355H、G355I等。尤其是G355H，其对底物D-半乳糖和甘油转化生成异红藻苷的转化率是野生型的3.5倍，这对于异红藻苷的生产来说，将产生巨大的经济效益，具有重要的推广价值。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等。均应包含在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 南京工业大学
<120> 一种α-半乳糖苷酶突变体及其应用
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 728
<212> PRT
<213> Anoxybacillus vitaminiphilus
<400> 1
Met Gly Ile Ile Tyr Asn Asp Ser Thr Lys Thr Phe His Leu Gln Ala
1 5 10 15
Lys Asp Thr Ser Tyr Ile Met Gln Val Val Arg Ser Gly Tyr Leu Ala
20 25 30
His Leu Tyr Trp Gly Lys Lys Ile Arg Glu Val Asn Met Pro Arg Lys
35 40 45
Leu Gln Phe Leu Asp Arg Ala Phe Ser Pro Asn Pro Glu Pro Ala Asp
50 55 60
Arg Ser Phe Ser Leu Asp Thr Leu Pro Gln Glu Tyr Pro Ala Tyr Gly
65 70 75 80
Asn Thr Asp Phe Arg Thr Pro Ala Tyr Gln Val Gln Phe Glu Asn Gly
85 90 95
Thr Thr Val Ser Asp Leu Arg Tyr Gln Ser His Arg Ile Phe Lys Gly
100 105 110
Lys Pro Lys Leu Glu Gly Leu Pro Ala Thr Tyr Ile Glu Asn Glu Asn
115 120 125
Glu Ala Glu Ser Leu Glu Ile Val Leu His Asp Val Val Ser Ser Leu
130 135 140
Lys Ala Val Leu Leu Tyr Thr Val Tyr Glu Asn Phe Asn Val Ile Thr
145 150 155 160
Arg Ser Val Arg Phe Glu Asn Glu Gly Glu Gln Thr Ile Lys Leu Leu
165 170 175
Arg Ala Leu Ser Met Asn Val Asp Phe Phe His Ala Asp Tyr Glu Leu
180 185 190
Leu His Leu Ser Gly Ala Trp Ala Arg Glu Arg His Ile Glu Arg Arg
195 200 205
Pro Leu Val Val Gly Thr Gln Ser Ile Glu Ser Arg Arg Gly Ala Ser
210 215 220
Ser His Gln His Asn Pro Phe Ile Ala Leu Leu Gln Lys Gly Ala Gly
225 230 235 240
Glu Tyr His Gly Glu Val Tyr Gly Phe Ser Leu Val Tyr Ser Gly Asn
245 250 255
Phe Leu Ala Gln Val Glu Val Asp Gln Tyr Lys Thr Ala Arg Val Ser
260 265 270
Leu Gly Ile Asn Pro Phe Asp Phe Thr Trp Leu Leu Glu Pro Gly Glu
275 280 285
Ser Phe Gln Thr Pro Glu Val Val Met Val Tyr Ser Ala Asn Gly Leu
290 295 300
Asn Asp Met Ser Asn Thr Tyr His Lys Leu Tyr Arg Thr Arg Leu Ala
305 310 315 320
Arg Gly Gln Tyr Arg Asp Gln Glu Arg Pro Ile Leu Ile Asn Asn Trp
325 330 335
Glu Ala Thr Tyr Phe His Phe Asn Glu Glu Lys Ile Leu Gln Ile Ala
340 345 350
Glu Ala Gly Lys Glu Leu Gly Ile Glu Leu Phe Val Leu Asp Asp Gly
355 360 365
Trp Phe Gly Lys Arg Asp Asn Asp Lys Ser Ser Leu Gly Asp Trp Phe
370 375 380
Val Asp Lys Asn Lys Leu Pro Asn Gly Met Glu Ser Leu Ala Arg Lys
385 390 395 400
Val Arg Ser Met Gly Met Gln Phe Gly Leu Trp Phe Glu Pro Glu Met
405 410 415
Ile Ser Val Asp Ser Glu Leu Tyr Arg Arg His Pro Asp Trp Cys Leu
420 425 430
His Val Pro Asn Arg Ser Arg Ser Glu Gly Arg Asn Gln Leu Ile Leu
435 440 445
Asp Tyr Ser Arg Arg Glu Val Cys Asp Tyr Val Ile Lys Ala Val Ser
450 455 460
Asp Ile Leu Lys Ser Ala Pro Ile Ser Tyr Val Lys Trp Asp Met Asn
465 470 475 480
Arg His Met Thr Glu Ile Gly Ser Ser Ala Leu Pro Pro Glu Arg Gln
485 490 495
Arg Glu Thr Ala His Arg Tyr Met Leu Gly Leu Tyr Arg Val Met Glu
500 505 510
Glu Ile Thr Ser Ala Phe Pro His Val Leu Phe Glu Ser Cys Ser Gly
515 520 525
Gly Gly Gly Arg Phe Asp Pro Gly Ile Leu Tyr Tyr Met Pro Gln Thr
530 535 540
Trp Thr Ser Asp Asn Thr Asp Ala Val Ser Arg Leu Lys Ile Gln Tyr
545 550 555 560
Gly Thr Ser Leu Val Tyr Pro Ile Ser Ala Met Gly Ala His Val Ser
565 570 575
Ala Val Pro Asn His Gln Val His Arg Val Thr Ser Leu Asp Ile Arg
580 585 590
Gly Asn Val Ala Met Ser Gly Asn Phe Gly Tyr Glu Leu Asp Leu Thr
595 600 605
Lys Leu Thr Glu Gln Glu Lys Glu Lys Val Lys Glu Gln Val Ala Phe
610 615 620
Tyr Lys Glu Ile Arg His Leu Val Gln Tyr Gly Asp Phe Tyr Arg Ile
625 630 635 640
Leu Ser Pro Phe Glu Gly Asn Glu Thr Ala Trp Met Phe Val Ser Glu
645 650 655
Asp Lys Ser Glu Ala Phe Val Ala Tyr Phe Arg Val Leu Ala Glu Pro
660 665 670
Asn Ala Pro Leu Ser Phe Leu Arg Leu Lys Gly Leu Asp Pro Asn Lys
675 680 685
Asn Tyr Gln Leu Leu Glu Asn Gly Glu Val Tyr Gly Gly Asp Glu Leu
690 695 700
Met Tyr Ile Gly Leu Asn Ile Pro Gln Leu Gln Gly Asp Tyr Val Ser
705 710 715 720
Cys Val Trp Arg Leu Lys Val Cys
725
<210> 2
<211> 2187
<212> DNA
<213> Anoxybacillus vitaminiphilus
<400> 2
atgggcatca tctacaatga tagcaccaaa accttccatc tgcaggccaa agataccagc 60
tacatcatgc aggttgttcg cagcggctac ctggcccatc tgtactgggg caaaaaaatc 120
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ttccatttca atgaagaaaa aatcctgcag atcgccgaag ccggcaaaga actgggcatc 1080
gaactgttcg ttctggatga tggctggttc ggcaaacgcg ataatgataa aagcagcctg 1140
ggcgattggt tcgttgataa aaataaactg ccgaatggca tggaaagcct ggcccgcaaa 1200
gttcgcagca tgggcatgca gttcggcctg tggttcgaac cggaaatgat cagcgttgat 1260
agcgaactgt accgccgcca tccggattgg tgcctgcatg ttccgaatcg cagccgcagc 1320
gaaggccgca atcagctgat cctggattac agccgccgcg aagtttgcga ttatgtgatc 1380
aaagccgtta gcgatatcct gaaaagcgcc ccgatcagct acgttaaatg ggatatgaat 1440
cgccatatga ccgaaatcgg cagcagcgcc ctgccgccgg aacgccagcg cgaaaccgcc 1500
catcgctaca tgctgggcct gtaccgcgtt atggaagaaa tcaccagcgc cttcccgcat 1560
gttctgttcg aaagctgcag cggcggcggc ggccgcttcg atccgggcat cctgtactac 1620
atgccgcaga cctggaccag cgataatacc gacgcagtta gccgccttaa aatccagtac 1680
ggcaccagcc tggtctaccc tatcagcgcg atgggcgccc atgttagcgc cgttccgaat 1740
catcaggttc atcgcgttac cagcctggat atccgcggca atgttgccat gagtggtaat 1800
tttggatacg aactggatct gaccaaactg accgaacagg aaaaagaaaa agttaaagaa 1860
caggttgcct tctacaaaga aatccgccat ctggttcagt acggcgattt ctaccgcatc 1920
ctgagcccgt tcgaaggcaa tgaaaccgcc tggatgttcg ttagcgaaga taaaagcgaa 1980
gccttcgttg cctacttccg cgttctggcc gaaccgaatg ccccgctgag cttcctgcgc 2040
ctgaaaggcc tggatccgaa taaaaattac cagctgctgg aaaatggcga agtatatgga 2100
ggcgatgaac tgatgtacat tggcctgaat atcccgcagc tgcagggcga ttacgtaagc 2160
tgcgtttggc gcctgaaagt ttgctaa 2187
<210> 3
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<212> DNA
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cagatcgccg aagccgcaaa agaactgggc atc 33
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cagatcgccg aagcctgtaa agaactgggc atc 33
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cagatcgccg aagccgataa agaactgggc atc 33
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cagatcgccg aagccgaaaa agaactgggc atc 33
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cagatcgccg aagcctttaa agaactgggc atc 33
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cagatcgccg aagcccataa agaactgggc atc 33
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cagatcgccg aagccattaa agaactgggc atc 33
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cagatcgccg aagccaaaaa agaactgggc atc 33
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cagatcgccg aagccctgaa agaactgggc atc 33
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cagatcgccg aagccatgaa agaactgggc atc 33
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cagatcgccg aagccaataa agaactgggc atc 33
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ggcttcggcg atctgcagga ttttt 25

Claims (8)

1.一种α-半乳糖苷酶突变体，其特征在于所述突变体的序列为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第355位甘氨酸突变为天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸、苏氨酸、缬氨酸或酪氨酸获得的序列。
2.一种DNA分子，其特征在于所述DNA分子编码权利要求1所述的α-半乳糖苷酶突变体。
3.一种α-半乳糖苷酶突变体的表达载体，其特征在于表达权利要求1所述的α-半乳糖苷酶突变体。
4.如权利要求3所述的表达载体，其特征在于包含权利要求2所述的DNA分子。
5.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于所述表达载体为质粒、噬菌体、病毒或宿主细胞。
6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于所述宿主细胞选自大肠杆菌、酵母、芽孢杆菌、乳酸杆菌、曲霉或木霉。
8.根据权利要求1所述的α-半乳糖苷酶突变体，权利要求2所述的DNA分子或权利要求3-7任一项所述的α-半乳糖苷酶突变体的表达载体在制备异红藻苷中的应用。
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