CN115011582B

CN115011582B - 一种β-葡萄糖苷酶突变体A354P及其应用

Info

Publication number: CN115011582B
Application number: CN202210525603.8A
Authority: CN
Inventors: 李玉; 路福平; 李庆刚; 杨子璇; 王茂军; 史超硕; 刘逸寒
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2022-05-06
Filing date: 2022-05-06
Publication date: 2023-08-08
Anticipated expiration: 2042-05-06
Also published as: CN115011582A

Abstract

本发明主要利用定点突变技术构建来源于特异腐质霉的β‑葡萄糖苷酶的突变体菌株，获得了一种葡萄糖耐受能力提高的β‑葡萄糖苷酶突变体A354P，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。相同条件下，突变体A354P的比活力为36.71U/mg，较野生型提高了40.28％；而且突变体A354P可在600mmol/L葡萄糖的激活下最高达到190.29％的相对活力，相比野生型具有显著提高的葡萄糖耐受能力；突变体A354P对于虎杖苷也具有更强的水解能力。本发明中的突变体在生物燃料、食品保健和生物合成等领域具有较高的应用价值。

Description

一种β-葡萄糖苷酶突变体A354P及其应用

技术领域

本发明属于微生物与基因工程技术领域，具体涉及一种酶活力和葡萄糖耐受性提高的β-葡萄糖苷酶突变体A354P及其应用。

背景技术

β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidases EC 3.2.1.21)，全称β-D-葡萄糖苷水解酶，属水解酶类，又称纤维二糖酶、龙胆二糖酶或苦杏仁苷酶。该酶可以水解结合于末端的非还原性的β-D-糖苷键，同时释放出β-D-葡萄糖以及相应的配基。β- 葡萄糖苷酶因对多种糖苷类化合物具有水解活性，可作用于多种生物活性物质，其水解产生的配基多为功能性苷元或芳香成分；有的β-葡萄糖苷酶还具有转糖苷活性，可转化生成功能性低聚糖，因此在食品保健，生物能源等领域具有广阔的应用前景。

近年来能源问题日益严峻，新型能源的开发至关重要，生物能源由于其来源广泛、可再生等优势已成为研究者的关注重点，被认为是未来能源的首选，对其进行研究开发已成为全球发展趋势。全球每年有约2千亿吨的光合作用的有机物产生，其中约有60％以上是木质纤维素。并且我国作为农业生产大国，有十分丰富的木质纤维素资源可以被利用。而纤维素是自然界中来源最广、含量最多的植物多糖。从结构上来说，其基本重复单元为纤维二糖，是 D-葡萄糖单体分子以β-1,4-糖苷键连接起来的线性多糖化合物。但是天然纤维素中，结晶区的纤维素结构紧致，不容易被分解，就使得天然纤维素水解较为困难。而酶解法降解纤维素，过程简单，成本低，基本不会存在环境污染问题。研究表明，β-葡萄糖苷酶是整个纤维素水解过程中的限速酶，在酶解法降解纤维素过程中其关键作用，因此提高β-葡萄糖苷酶酶活在生物能源领域具有重要意义。

同时，具有高耐受性的β-葡萄糖苷酶因其可降低葡萄糖对酶活力的抑制作用，而显示出独特的应用潜能。CN102220302A以来自海洋未培养微生物来源的β-葡萄糖苷酶为基础，通过PCR定点突变，获得突变基因，相对野生型β- 葡萄糖苷酶蛋白，获得的突变蛋白的葡萄糖耐受浓度提高了13倍。 CN103266096A通过将β-葡萄糖苷酶基因Pbgl的386位的色氨酸突变成半胱氨酸，得到β-葡萄糖苷酶突变体Pbgl-W386C，葡萄糖的耐受性是突变前的11.88 倍，提高了10.88倍。CN105754973A通过将链霉菌的β-葡萄糖苷酶S-bgl6分子上的233位色氨酸突变成天冬氨酸而得到β-葡萄糖苷酶突变体，和突变前相比，葡萄糖的耐受性提高了208.9倍。CN107142254A将来源于嗜酸耐热脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillussp.A4的β-葡萄糖苷酶的315位氨基酸由组氨酸突变为精氨酸，得到较高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶突变体，在相同条件下，葡萄糖对突变体和野生型的酶活促进作用分别为212％和163％。

发明内容

针对当前产业需求和现有技术的不足，本发明主要目的是通过定点突变技术构建一种酶活力和葡萄糖耐受性提高的β-葡萄糖苷酶突变体。

为了实现上述目的，本发明采取如下的技术方案：

第一方面，本发明提供一种β-葡萄糖苷酶突变体，所述β-葡萄糖苷酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

第二方面，本发明提供编码所述β-葡萄糖苷酶突变体的基因。

第三方面，本发明提供包含所述β-葡萄糖苷酶突变体的基因的载体。

第四方面，本发明提供包含如上所述基因或载体的重组菌株。

第五方面，本发明提供如上所述β-葡萄糖苷酶突变体的用途，其用于水解糖苷或寡糖化合物非还原性末端的β-D-葡萄糖苷键，产生β-D-葡萄糖与相应配基；并且，所述突变体相比野生型具有提高的酶活力和葡萄糖耐受性。

第六方面，本发明提供制备如上所述β-葡萄糖苷酶突变体的方法，该方法通过利用本发明所述β-葡萄糖苷酶突变体的编码基因或本发明所述载体进行基因重组和表达。

第七方面，本发明提供一种水解糖苷类化合物尤其是纤维二糖或纤维寡糖的方法，该方法包括使糖苷类化合物与本发明所述β-葡萄糖苷酶突变体或与本发明所述重组菌株接触的步骤，在能够通过所述β-葡萄糖苷酶突变体或所述重组菌株的酶促催化作用水解化合物的β-D-葡萄糖苷键的条件下进行。

有益效果：

本发明通过定点突变技术获得的β-葡萄糖苷酶突变体，通过基因工程技术在毕赤酵母系统中进行了重组和表达，相同条件下，本发明突变体A354P的比活力为36.71U/mg，较野生型提高了40.28％；而且突变体A354P可在600mmol/L 葡萄糖的激活下最高达到190.29％的相对活力，相比野生型具有显著提高的葡萄糖耐受能力；另外，突变体A354P相比野生型的特异性水解虎杖苷能力提升约为10％。本发明的突变体在生物燃料、食品保健和生物合成等领域具有较高的应用价值。

附图说明

图1：实施例中野生型β-葡萄糖苷酶基因的PCR扩增电泳图；其中：1为阴性对照，2为DNA Marker，3为野生型bglHi基因。

图2：实施例中蛋白浓度标准曲线。

图3：实施例中野生型与突变体A354P在相同条件下的酶活力对比。

图4：实施例中野生型与突变体A354P在不同浓度葡萄糖激活下的相对酶活力对比。

图5：实施例中野生型对不同底物的水解能力。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案进一步叙述本发明。除非特别说明，以下实施方案所涉及的技术手段、材料等均可以是本领域技术人员所公知的，可以在已知的能解决相应技术问题的手段和材料中选择合适的。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

根据本发明一种优选的实施方式，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO： 3所示。

第三方面，本发明提供包含所述β-葡萄糖苷酶突变体的基因的载体。所述载体可以是本领域技术人员已知的通过基因重组制备蛋白质的载体之一，例如表达载体。

根据本发明一种优选的实施方式，所述载体是pPIC9K质粒。

第四方面，本发明提供包含如上所述基因或载体的重组菌株。所述重组菌株可以是适合于从本发明的基因或载体生产本发明的β-葡萄糖苷酶突变体的任何宿主，例如毕赤酵母。

根据本发明一种优选的实施方式，所述宿主是毕赤酵母GS115。

根据本发明另一种具体实施方式，所述宿主是大肠杆菌JM109。

根据本发明一种优选的实施方式，所述β-葡萄糖苷酶突变体用于水解虎杖苷生成葡萄糖和白藜芦醇。

第六方面，本发明提供制备如上所述β-葡萄糖苷酶突变体的方法，该方法通过利用本发明所述β-葡萄糖苷酶突变体的编码基因或本发明所述载体进行基因重组和表达。可以使用本领域技术人员已知的基因重组方法和表达宿主，并选择适合于宿主表达的培养基和培养条件。所述方法还可以包括回收所述β-葡萄糖苷酶突变体的步骤，该回收步骤可能涉及了将β-葡萄糖苷酶突变体从宿主的培养物或表达产物中进行分离或纯化的步骤，可以使用本领域技术人员已知的任何方法进行。

根据本发明一种优选的实施方式，所述突变体的制备方法如下：将突变体基因与质粒pPIC9K进行经EcoR I和Avr II相同双酶切并连接获得重组载体，转化入大肠杆菌宿主JM109中，质粒经Sac I线性化后最终电转到毕赤酵母 GS115中进行表达，经阴离子交换柱等纯化蛋白并验证其酶活力，获得了一种相比野生型具有提高的酶活力和葡萄糖耐受性的β-葡萄糖苷酶突变体A354P。

本发明中采用如下定义：

1、氨基酸和DNA核酸序列的命名法

氨基酸残基使用公认IUPAC命名法，用三字母缩写或单字母符号形式。 DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。

2、β-葡萄糖苷酶突变体的标识

采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示β-葡萄糖苷酶突变体中突变的氨基酸。本发明突变体是如SEQ ID NO：2所示的β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列中第354位的丙氨酸(A)替换成脯氨酸(P)，以A354P或Ala354Pro表示。突变体的基因突变位点如下：

以下将通过具体的实施例对本发明进行更详细描述。如无特别说明，以下实施例中：

本发明所用培养基及酶活测定方法：

LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，固体培养基加入琼脂18g/L，其他成分一致。

MD固体培养基：葡萄糖20g/L，琼脂18g/L。

YPD培养基：蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L，固体培养基加入琼脂18g/L，其他成分一致。

YPG培养基：蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，丙三醇20g/L。

BMGY培养基：酵母粉10g，蛋白胨20g溶于700mL水121℃灭菌20min，使用时60℃下加入100mL pH 6.0，1mol/L磷酸钾缓冲溶液，100mL 10×YNB，2mL 500×生物素，100mL 10×甘油。

BMMY培养基：酵母粉10g，蛋白胨20g溶于700mL水121℃灭菌20 min，使用时60℃下加入100mL 1mol/L磷酸钾缓冲液pH 6.0，100mL 10×YNB，2mL 500×生物素，2.5mL甲醇。

MES缓冲液：称重3.91gMES溶于水，用Tris碱溶液调节pH至6.5，加水定容至1L。

buffer A：终浓度为20mmol/L、pH 6.5MES缓冲液，过除菌膜备用。

buffer B：终浓度为20mmol/L、pH 6.5MES缓冲液和终浓度为1mol/L的 NaCl溶液，过0.22μm除菌膜备用。

G418筛选培养基：按照浓度(0.5mg/mL，1mg/mL，2mg/mL)融化YPD 培养基于55℃左右下加入混匀使用；其他抗性筛选培养基加入相应浓度的抗性。

大肠杆菌感受态制备培养基：

大肠杆菌复苏，LB培养基。

洗液培养基：每升中加入CaCl₂ 11.1g。

重悬液培养基：1.5mL甘油，8.5mL 11.1g/L CaCl₂溶液。

毕赤酵母感受态制备培养基：

YPD培养基：蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L；

无菌水：过膜水经121℃，20min灭菌；

1mol/L山梨醇：每100mL去离子水溶解18.21g山梨醇，121℃灭菌20 min，4℃保存备用。

本发明所用β-葡萄糖苷酶的酶活检测主要是基于酶解反应释放的配基与葡萄糖，以人工合成底物对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)为底物，其水解产物为对硝基苯(pNP)和葡萄糖，对硝基苯在400nm下有特异的吸光值。

具体检测方法如下：取100μL适当稀释的酶液与2.9mL底物溶液(pNPG 溶解在磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液，终浓度为3mmol/L，pH 5.0)混合，50℃下反应4min，加入1mL 1mol/L Na₂CO₃溶液终止反应。以100℃煮沸10min 的灭活发酵液上清液作为对照。测定反应液OD₄₀₀ nm的值，参照标准曲线计算 pNP的含量。将反应体系中每分钟产生1μmol对硝基苯(pNP)所需的酶量定义为1个酶活力单位(U)。

对硝基苯(pNP)标准曲线如下；配制0.1mg/mL对硝基苯酚母液，分别稀释到浓度为0.002mg/mL、0.004mg/mL、0.006mg/mL、0.008mg/mL、0.010 mg/mL的稀释液，以无菌水为空白，在400nm下测定吸光值。以OD值为纵坐标，pNP浓度(mg/mL)为横坐标，做出pNP标准曲线，其线性回归方程 Y＝40.8X-0.026；R²＝0.9988。

其中，酶液和底物溶液混合之前，底物溶液需在50℃水浴中预热2min以上。

β-葡萄糖苷酶酶活力计算公式：酶活力S＝X×V₁×1000×n/139×t×V₂

式中，X为p-NP的量(mg/mL)；V₁为反应液体积(mL)；V₂为酶液的体积(mL)；n为酶液稀释倍数；t为反应时间(min)。

酶活力定义：在50℃条件下将反应体系中每分钟产生1μmol对硝基苯 (pNP)所需的酶量定义为1个酶活力单位(U)。

实施例1：野生型β-葡萄糖苷酶bglHi重组菌株的构建

1.1合成并扩增野生型β-葡萄糖苷酶基因bglHi

根据GenBank:KF588650.1获得特异腐质霉(Humicola insolens)来源的野生型β-葡萄糖苷酶bglHi基因序列，为了适用于毕赤酵母表达，进行了密码子的优化，优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，委托生物公司合成其序列，并通过PCR进行扩增，引物序列如下：

引物P1：F 5’-ATGTCTTTGCCTCCAGACTTC-3’；

引物P2：R 5’-CGACTCTTTGATTAGAAAGGAGTAA-3’；

以P1和P2作为上、下游引物，以bglHi的野生型基因为模板进行扩增；

其扩增的反应体系为：

上游引物P1	1.5μL
		下游引物P2	1.5μL
DNA模板	2μL
		PrimeSTAR酶	25μL
ddH₂O	20μL

扩增程序的设置为：预变性：95℃5min；变性：98℃10s；退火：50℃20s；延伸：72℃10s；反应32个循环；延伸：72℃10min。

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，可以看到野生型β-葡萄糖苷酶基因的条带，共1431bp(如图1所示)，再由小量DNA回收试剂盒回收PCR产物，得到了野生型β-葡萄糖苷酶基因，即bglHi。

1.2表达载体的线性化

提取pPIC9K质粒，其提取过程参照试剂盒的操作手册进行。经EcoR I和 Avr II双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，再由DNA凝胶回收试剂盒回收产物，得到了线性化载体序列。

1.3重组菌株的构建

将经EcoR I和Avr II双酶切的目标片段(bglHi)和载体片段连接形成重组质粒pPIC9K-bglHi，将重组质粒转化进大肠杆菌JM109中，经测序验证序列如 SEQ ID NO：1。

实施例2：利用定点突变方法获得β-葡萄糖苷酶突变体

2.1基于定点突变技术进行定向突变，构建新型β-葡萄糖苷酶突变体，设计引物如下：

引物P3：F 5’-CCTCAAGGATTCAGAGACTTGTTGAATTGGTTG-3’；

引物P4：R 5’-GTGTGGACGCAACCAAAAGGATTGG-3’；

在定点突变PCR反应体系中，以P3和P4作为上下游引物，以重组质粒 pPIC9K-bglHi为模板，进行定向突变PCR。

其扩增的反应体系为：

上游引物P3	1.5μL
		下游引物P4	1.5μL
DNA模板	2μL
		PrimerSTAR酶	25μL
ddH₂O	20μL

扩增条件为：预变性：95℃5min；变性：98℃10s；退火：57℃20s；延伸：72℃1min；反应32个循环；延伸：72℃10min。

2.2将获得的带有β-葡萄糖苷酶突变体基因的线性质粒自连成环，得到重组质粒pPIC9K-bglHi-A354P，并化转入大肠杆菌JM109中，将重组质粒 pPIC9K-bglHi和pPIC9K-bglHi-A354P分别转化毕赤酵母中，获得了表达野生型β-葡萄糖苷酶的菌株WT以及表达β-葡萄糖苷酶突变体的重组菌株 GS115/pPIC9K-bglHim-A354P。

实施例3：β-葡萄糖苷酶突变体的摇瓶验证、纯化及酶活性研究

将实施例2获得的重组菌株与对照菌P.pastoris GS115/pPIC9K的单菌落分别接到30mL YPG培养基(含有终浓度为50μg/mL卡那霉素)中，30℃、180 r/min培养16-18h；按2％接种量分别将种子液接入50mL BMGY液体培养基中，30℃，180r/min培养至OD600达到5-6(约16-20h)；收集菌液于灭菌的 50mL离心管中，8000r/min，离心5min，倒掉上清，用20mLBMMY培养基重悬菌体进行细胞洗涤，重复洗涤3次，最后用BMMY培养基重悬菌体(菌体终浓度OD600＝1)；饥饿1h后开始添加诱导剂甲醇，每隔24h加入0.5％甲醇诱导表达，培养96h。将发酵液置于50mL无菌离心管中，于4℃，12000 r/min离心20min，除去菌体；将发酵液上清过0.22μm除菌膜后置于30kD超滤管中进行超滤浓缩，4℃，5000r/min离心60min，大约制取1mL浓缩液。将浓缩后的发酵液转移到透析袋中进行透析，将透析袋放入装有去离子水的烧杯中，在4℃磁力搅拌下透析除去发酵液中的盐离子。将透析好的酶液置于10 mL离心管中，8000r/min，4℃离心10min，去除不溶的底部杂质并过0.22μm 的水系膜除去不溶杂质；平衡阴离子交换柱(SourseS)：20mmol/L的MES 缓冲液作为buffer A，用buffer A冲洗柱子，冲洗3-5个柱体积，以平衡阴离子交换柱；上样：将样品全部上样至已平衡好的柱子中，上样流速设为0.5mL/min，用buffer A开始冲洗3-5个柱体积，自上样完成起即开始收集蛋白峰。样品平衡好后，用buffer B进行洗脱，并设置不同的梯度，直到达到100％NaCl浓度。洗脱流速设为1mL/min，每出现一个洗脱峰，换一个收集管，收集所有洗脱峰并分别编号。将纯化后的酶液测定酶活，将纯化后的酶液用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白含量，用酶标仪测定并根据标准曲线计算出蛋白浓度。使用温箱孵育时，应注意防止因水分蒸发影响检测结果。

首先，在562nm下用酶标仪测定其OD值，绘制蛋白浓度标准曲线图。蛋白浓度与OD₅₆₂ nm的线性关系如图2所示，线性回归方程为：Y＝1.103X+0.0461； R²＝0.9996。

然后，根据标准曲线计算样品的蛋白含量，继而计算比酶活。

测定纯化后的酶液的β-葡萄糖苷酶比酶活力，如图3所示，相同条件下，突变体A354P的比活力为36.71U/mg，较野生型提高了40.28％；而且，突变体 A356P可在600mmol/L葡萄糖的激活下最高达到190.29％的相对活力，相比野生型具有更高的葡萄糖耐受性，如图4所示。

实施例4：野生型BglHi及其突变体A354P水解能力的检测

为考察BglHi的水解能力，检测了BglHi及其突变体A354P对不同底物(纤维二糖、水杨苷、熊果苷、京尼平苷、虎杖苷和罗汉果苷)的水解情况。

其中，一分子的纤维二糖的水解产物为两分子的葡萄糖，水杨苷的水解产物为葡萄糖和对苯二芬，京尼平苷的水解产物为葡萄糖和京尼平，虎杖苷的水解产物为葡萄糖和白藜芦醇，罗汉果苷V水解产生罗汉果醇或侧链所带葡萄糖更少的罗汉果苷。

在酶的最适反应条件下，按如下体系进行反应，在3mL的反应体系中加入5个活力单位的β-葡萄糖苷酶(以100℃煮沸10min的灭活发酵液上清液作为对照)，和质量分数为2％的底物，反应20min，采用HPLC高效液相色谱检测生成葡萄糖的量，计算转化率，同时检测在反应体系中添加终浓度为100 mmol/L和400mmol/L葡萄糖时对水解效率的影响。

因为水解罗汉果苷V时，每分子罗汉果苷V(带有五分子葡萄糖)可能会水解下不同分子的葡萄糖，产生不同的产物，故考察β-葡萄糖苷酶对该底物的水解能力时，采用HPLC检测除葡萄糖外可能的水解产物(罗汉果苷IV、罗汉果苷III、罗汉果苷II或罗汉果醇)。

其HPLC检测条件如下。

(1)葡萄糖的检测

检测器：蒸发光散射检测器

色谱柱：Prevail Carbohydrate ES(4.6mm×250mm，5μm)；

流动相：乙腈:水＝65:35(体积比)；

柱温：30℃；

流速：1.0mL/min。

(2)罗汉果苷类物质的检测

检测器：紫外检测器

检测波长：203nm

色谱柱：ZORBAX SB-Aq(4.6mm×150mm 5μm)；

流动相：水(A相)和乙腈(B相)；

梯度洗脱程序：0-3min 20％B；3-8min 30％B；8-9min 35％B；

柱温：30℃；

流速：0.8mL/min。

在酶的最适温度和pH下测定BglHi对不同底物的水解能力，图5显示了反应20min后BglHi对不同底物(纤维二糖、水杨苷、熊果苷、京尼平苷、虎杖苷和罗汉果苷V)的转化情况。由图5可知BglHi具有广泛的底物特异性，尤其对虎杖苷有较强的转化能力。之后分别检测了BglHi和突变体A354P在0 mmol/L、100mmol/L和400mmol/L葡萄糖存在时对虎杖苷的水解能力，结果如表1所示，在不同浓度葡萄糖存在时，BglHi水解虎杖苷反应30min时葡萄糖对酶的影响不高，但反应时间为1h时，添加100mmol/L葡萄糖会提高BglHi 对虎杖苷的水解能力；对于突变体A354P来说，其对虎杖苷的水解能力整体高于野生型BglHi，并且添加葡萄糖会对酶起激活作用。这些数据在一定程度上说明在水解虎杖苷时突变体A354P能够承载更多的葡萄糖，有利于延长酶的作用时间，提高对虎杖苷的水解能力。

表1

实施例5：β-葡萄糖苷酶突变体测序

将上述重组菌株提取β-葡萄糖苷酶基因序列，并进行测序(金唯智生物科技有限公司)，结果表明，扩增得到了β-葡萄糖苷酶突变体A354P基因核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，将该编码基因命名为bglHi-A354P。

将上述获得的β-葡萄糖苷酶突变体A354P的氨基酸序列与野生型β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列SEQ ID NO：2进行对比分析，结果显示：与野生型β-葡萄糖苷酶相比，突变体A354P的第354位氨基酸由Ala突变为Pro。

虽然本发明已经以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和原理的情况下，可以对这些实施例进行各种形式和细节的变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物所限定。

序列表

<120> 一种β-葡萄糖苷酶突变体A354P及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1431

<212> DNA

<213> 特异腐质霉（Humicola insolens）

<400> 1

atgtctttgc ctccagactt caagtgggga tttgctactg ccgcctacca gattgagggt 60

tccgttaacg aggatggtcg tggtccatct atctgggaca ccttctgcgc catcccagga 120

aagattgctg acggttcttc tggtgctgtc gcttgcgact cttacaagcg tactaaggaa 180

gatattgcct tgttgaagga attgggtgct aactcctacc gtttctccat ctcctggtcc 240

agaattatcc ctttgggtgg acgtaacgac ccaatcaatc aaaagggaat cgatcattac 300

gttaagttcg ttgatgactt gatcgaagcc ggtattaccc ctttcattac cttgttccac 360

tgggacttgc cagacgcttt ggacaaaaga tacggaggtt ttttgaacaa ggaagagttt 420

gccgctgact tcgagaacta cgctagaatt atgttcaagg ctatccctaa atgtaagcat 480

tggattacct ttaacgagcc atggtgctcc gccatcttgg gatacaacac cggttacttt 540

gccccaggtc acacttccga cagatccaag tctccagttg gtgattctgc cagagagcct 600

tggatcgttg gtcataacat cttgatcgcc cacgccagag ctgttaaggc ctaccgtgag 660

gatttcaagc caacccaggg tggtgagatc ggtatcaccc ttaacggaga cgctactttg 720

ccttgggatc cagaagaccc agctgacatt gaggcttgcg atagaaagat cgagttcgct 780

atctcctggt tcgccgaccc aatctacttc ggaaagtacc cagactccat gagaaagcag 840

ttgggagaca gattgccaga gttcactcca gaggaagtcg ccttggttaa gggttctaat 900

gatttttacg gtatgaacca ctacaccgcc aactacatca agcacaagac tggtgtccct 960

ccagaggacg actttttggg aaacttggag actttgttct acaacaagta cggtgattgt 1020

atcggtccag agacccaatc cttttggttg cgtccacacg ctcaaggatt cagagacttg 1080

ttgaattggt tgtctaagag atacggttac ccaaaaattt acgttactga gaacggtacc 1140

tccttgaagg gtgagaacga catgcctttg gagcaggtct tggaggacga cttcagagtt 1200

aagtacttta acgactacgt tagagctatg gctgccgctg ttgctgagga cggatgcaac 1260

gttcgtggtt atttggcctg gtctttgctt gacaactttg agtgggccga gggatacgag 1320

accagattcg gtgtcaccta cgttgattac gccaacgacc agaagcgtta cccaaagaag 1380

tccgctaagt ccttgaaacc acttttcgac tctttgatta gaaaggagta a 1431

<210> 2

<211> 476

<212> PRT

<213> 特异腐质霉（Humicola insolens）

<400> 2

Met Ser Leu Pro Pro Asp Phe Lys Trp Gly Phe Ala Thr Ala Ala Tyr

1 5 10 15

Gln Ile Glu Gly Ser Val Asn Glu Asp Gly Arg Gly Pro Ser Ile Trp

20 25 30

Asp Thr Phe Cys Ala Ile Pro Gly Lys Ile Ala Asp Gly Ser Ser Gly

35 40 45

Ala Val Ala Cys Asp Ser Tyr Lys Arg Thr Lys Glu Asp Ile Ala Leu

50 55 60

Leu Lys Glu Leu Gly Ala Asn Ser Tyr Arg Phe Ser Ile Ser Trp Ser

65 70 75 80

Arg Ile Ile Pro Leu Gly Gly Arg Asn Asp Pro Ile Asn Gln Lys Gly

85 90 95

Ile Asp His Tyr Val Lys Phe Val Asp Asp Leu Ile Glu Ala Gly Ile

100 105 110

Thr Pro Phe Ile Thr Leu Phe His Trp Asp Leu Pro Asp Ala Leu Asp

115 120 125

Lys Arg Tyr Gly Gly Phe Leu Asn Lys Glu Glu Phe Ala Ala Asp Phe

130 135 140

Glu Asn Tyr Ala Arg Ile Met Phe Lys Ala Ile Pro Lys Cys Lys His

145 150 155 160

Trp Ile Thr Phe Asn Glu Pro Trp Cys Ser Ala Ile Leu Gly Tyr Asn

165 170 175

Thr Gly Tyr Phe Ala Pro Gly His Thr Ser Asp Arg Ser Lys Ser Pro

180 185 190

Val Gly Asp Ser Ala Arg Glu Pro Trp Ile Val Gly His Asn Ile Leu

195 200 205

Ile Ala His Ala Arg Ala Val Lys Ala Tyr Arg Glu Asp Phe Lys Pro

210 215 220

Thr Gln Gly Gly Glu Ile Gly Ile Thr Leu Asn Gly Asp Ala Thr Leu

225 230 235 240

Pro Trp Asp Pro Glu Asp Pro Ala Asp Ile Glu Ala Cys Asp Arg Lys

245 250 255

Ile Glu Phe Ala Ile Ser Trp Phe Ala Asp Pro Ile Tyr Phe Gly Lys

260 265 270

Tyr Pro Asp Ser Met Arg Lys Gln Leu Gly Asp Arg Leu Pro Glu Phe

275 280 285

Thr Pro Glu Glu Val Ala Leu Val Lys Gly Ser Asn Asp Phe Tyr Gly

290 295 300

Met Asn His Tyr Thr Ala Asn Tyr Ile Lys His Lys Thr Gly Val Pro

305 310 315 320

Pro Glu Asp Asp Phe Leu Gly Asn Leu Glu Thr Leu Phe Tyr Asn Lys

325 330 335

Tyr Gly Asp Cys Ile Gly Pro Glu Thr Gln Ser Phe Trp Leu Arg Pro

340 345 350

His Ala Gln Gly Phe Arg Asp Leu Leu Asn Trp Leu Ser Lys Arg Tyr

355 360 365

Gly Tyr Pro Lys Ile Tyr Val Thr Glu Asn Gly Thr Ser Leu Lys Gly

370 375 380

Glu Asn Asp Met Pro Leu Glu Gln Val Leu Glu Asp Asp Phe Arg Val

385 390 395 400

Lys Tyr Phe Asn Asp Tyr Val Arg Ala Met Ala Ala Ala Val Ala Glu

405 410 415

Asp Gly Cys Asn Val Arg Gly Tyr Leu Ala Trp Ser Leu Leu Asp Asn

420 425 430

Phe Glu Trp Ala Glu Gly Tyr Glu Thr Arg Phe Gly Val Thr Tyr Val

435 440 445

Asp Tyr Ala Asn Asp Gln Lys Arg Tyr Pro Lys Lys Ser Ala Lys Ser

450 455 460

Leu Lys Pro Leu Phe Asp Ser Leu Ile Arg Lys Glu

465 470 475

<210> 3

<211> 1431

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgtctttgc ctccagactt caagtgggga tttgctactg ccgcctacca gattgagggt 60

tccgttaacg aggatggtcg tggtccatct atctgggaca ccttctgcgc catcccagga 120

aagattgctg acggttcttc tggtgctgtc gcttgcgact cttacaagcg tactaaggaa 180

gatattgcct tgttgaagga attgggtgct aactcctacc gtttctccat ctcctggtcc 240

agaattatcc ctttgggtgg acgtaacgac ccaatcaatc aaaagggaat cgatcattac 300

gttaagttcg ttgatgactt gatcgaagcc ggtattaccc ctttcattac cttgttccac 360

tgggacttgc cagacgcttt ggacaaaaga tacggaggtt ttttgaacaa ggaagagttt 420

gccgctgact tcgagaacta cgctagaatt atgttcaagg ctatccctaa atgtaagcat 480

tggattacct ttaacgagcc atggtgctcc gccatcttgg gatacaacac cggttacttt 540

gccccaggtc acacttccga cagatccaag tctccagttg gtgattctgc cagagagcct 600

tggatcgttg gtcataacat cttgatcgcc cacgccagag ctgttaaggc ctaccgtgag 660

gatttcaagc caacccaggg tggtgagatc ggtatcaccc ttaacggaga cgctactttg 720

ccttgggatc cagaagaccc agctgacatt gaggcttgcg atagaaagat cgagttcgct 780

atctcctggt tcgccgaccc aatctacttc ggaaagtacc cagactccat gagaaagcag 840

ttgggagaca gattgccaga gttcactcca gaggaagtcg ccttggttaa gggttctaat 900

gatttttacg gtatgaacca ctacaccgcc aactacatca agcacaagac tggtgtccct 960

ccagaggacg actttttggg aaacttggag actttgttct acaacaagta cggtgattgt 1020

atcggtccag agacccaatc cttttggttg cgtccacacc ctcaaggatt cagagacttg 1080

ttgaattggt tgtctaagag atacggttac ccaaaaattt acgttactga gaacggtacc 1140

tccttgaagg gtgagaacga catgcctttg gagcaggtct tggaggacga cttcagagtt 1200

aagtacttta acgactacgt tagagctatg gctgccgctg ttgctgagga cggatgcaac 1260

gttcgtggtt atttggcctg gtctttgctt gacaactttg agtgggccga gggatacgag 1320

accagattcg gtgtcaccta cgttgattac gccaacgacc agaagcgtta cccaaagaag 1380

tccgctaagt ccttgaaacc acttttcgac tctttgatta gaaaggagta a 1431

<210> 4

<211> 476

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Ser Leu Pro Pro Asp Phe Lys Trp Gly Phe Ala Thr Ala Ala Tyr

1 5 10 15

Gln Ile Glu Gly Ser Val Asn Glu Asp Gly Arg Gly Pro Ser Ile Trp

20 25 30

Asp Thr Phe Cys Ala Ile Pro Gly Lys Ile Ala Asp Gly Ser Ser Gly

35 40 45

Ala Val Ala Cys Asp Ser Tyr Lys Arg Thr Lys Glu Asp Ile Ala Leu

50 55 60

Leu Lys Glu Leu Gly Ala Asn Ser Tyr Arg Phe Ser Ile Ser Trp Ser

65 70 75 80

Arg Ile Ile Pro Leu Gly Gly Arg Asn Asp Pro Ile Asn Gln Lys Gly

85 90 95

Ile Asp His Tyr Val Lys Phe Val Asp Asp Leu Ile Glu Ala Gly Ile

100 105 110

Thr Pro Phe Ile Thr Leu Phe His Trp Asp Leu Pro Asp Ala Leu Asp

115 120 125

Lys Arg Tyr Gly Gly Phe Leu Asn Lys Glu Glu Phe Ala Ala Asp Phe

130 135 140

Glu Asn Tyr Ala Arg Ile Met Phe Lys Ala Ile Pro Lys Cys Lys His

145 150 155 160

Trp Ile Thr Phe Asn Glu Pro Trp Cys Ser Ala Ile Leu Gly Tyr Asn

165 170 175

Thr Gly Tyr Phe Ala Pro Gly His Thr Ser Asp Arg Ser Lys Ser Pro

180 185 190

Val Gly Asp Ser Ala Arg Glu Pro Trp Ile Val Gly His Asn Ile Leu

195 200 205

Ile Ala His Ala Arg Ala Val Lys Ala Tyr Arg Glu Asp Phe Lys Pro

210 215 220

Thr Gln Gly Gly Glu Ile Gly Ile Thr Leu Asn Gly Asp Ala Thr Leu

225 230 235 240

Pro Trp Asp Pro Glu Asp Pro Ala Asp Ile Glu Ala Cys Asp Arg Lys

245 250 255

Ile Glu Phe Ala Ile Ser Trp Phe Ala Asp Pro Ile Tyr Phe Gly Lys

260 265 270

Tyr Pro Asp Ser Met Arg Lys Gln Leu Gly Asp Arg Leu Pro Glu Phe

275 280 285

Thr Pro Glu Glu Val Ala Leu Val Lys Gly Ser Asn Asp Phe Tyr Gly

290 295 300

Met Asn His Tyr Thr Ala Asn Tyr Ile Lys His Lys Thr Gly Val Pro

305 310 315 320

Pro Glu Asp Asp Phe Leu Gly Asn Leu Glu Thr Leu Phe Tyr Asn Lys

325 330 335

Tyr Gly Asp Cys Ile Gly Pro Glu Thr Gln Ser Phe Trp Leu Arg Pro

340 345 350

His Pro Gln Gly Phe Arg Asp Leu Leu Asn Trp Leu Ser Lys Arg Tyr

355 360 365

Gly Tyr Pro Lys Ile Tyr Val Thr Glu Asn Gly Thr Ser Leu Lys Gly

370 375 380

Glu Asn Asp Met Pro Leu Glu Gln Val Leu Glu Asp Asp Phe Arg Val

385 390 395 400

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405 410 415

Asp Gly Cys Asn Val Arg Gly Tyr Leu Ala Trp Ser Leu Leu Asp Asn

420 425 430

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435 440 445

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450 455 460

Leu Lys Pro Leu Phe Asp Ser Leu Ile Arg Lys Glu

465 470 475

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgtctttgc ctccagactt c 21

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgactctttg attagaaagg agtaa 25

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cctcaaggat tcagagactt gttgaattgg ttg 33

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtgtggacgc aaccaaaagg attgg 25

Claims

1.一种β-葡萄糖苷酶突变体，其特征在于，所述β-葡萄糖苷酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

2.编码权利要求1所述β-葡萄糖苷酶突变体的基因。

3.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求2所述基因。

4.如权利要求3所述重组载体，其特征在于，所述载体是pPIC9K质粒。

5.一种重组菌株，其特征在于，包含权利要求2所述基因或权利要求3所述重组载体。

6.如权利要求5所述重组菌株，其特征在于，所述菌株是毕赤酵母GS115或大肠杆菌JM109。

7.权利要求1所述β-葡萄糖苷酶突变体用于水解糖苷或寡糖化合物非还原性末端的β-D-葡萄糖苷键生成β-D-葡萄糖和相应配基的用途。

8.权利要求1所述β-葡萄糖苷酶突变体用于水解虎杖苷生成葡萄糖和白藜芦醇的用途。

9.一种制备权利要求1所述β-葡萄糖苷酶突变体的方法，包括如下步骤：

(1)将核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的β-葡萄糖苷酶突变体基因与线性化载体pPIC9K经EcoR I和Avr II双酶切后连接，得到含有β-葡萄糖苷酶突变体基因的重组载体；

(2)所述重组载体转化入毕赤酵母GS115中，得到含有β-葡萄糖苷酶突变体基因的重组菌株；

(3)在适宜条件下培养所述重组菌株，诱导表达，从表达产物中收集并纯化获得β-葡萄糖苷酶突变体。

10.一种水解糖苷类化合物的方法，该方法包括使糖苷类化合物与权利要求1所述β-葡萄糖苷酶突变体接触的步骤，在能够通过所述β-葡萄糖苷酶突变体的酶促催化作用水解化合物的β-D-葡萄糖苷键的条件下进行。