CN113151222B

CN113151222B - 一种外切葡聚糖酶基因cel2及其在制备海带水解液中的应用

Info

Publication number: CN113151222B
Application number: CN202010074528.9A
Authority: CN
Inventors: 王本新; 姜周
Original assignee: Shandong Hongye Marine Technology Co ltd
Current assignee: Shandong Hongye Marine Technology Co ltd
Priority date: 2020-01-22
Filing date: 2020-01-22
Publication date: 2022-08-30
Anticipated expiration: 2040-01-22
Also published as: CN113151222A

Abstract

本发明公开了一种外切葡聚糖酶基因CEL2及其在制备海带水解液中的应用。本发明提供的新型外切葡聚糖酶为SEQ ID No.1或其经过一个或几个氨基酸残基取代和/或缺失和/或添加或与其具有80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质，或在其N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。利用本发明提供的外切葡聚糖酶及配套方法制备海带水解液，8h可获得0.7g/L还原糖。因此，利用本发明提供的方法具有重要的应用价值。

Description

一种外切葡聚糖酶基因CEL2及其在制备海带水解液中的应用

技术领域

本发明涉及海带加工、工业酶、食品工业领域，具体涉及一种外切葡聚糖酶基因CEL2及其在制备海带水解液中的应用。

背景技术

海带是一种在低温海水中生长的大型海生褐藻植物，属海藻类植物。海带不仅可以用于食用，同时因其富含丰富的矿物质和功能成分，在医疗、保健等领域均具有广泛的应用价值。在我国，海带的人工养殖模式建立于20世纪50年代，随着我国水产业的迅速发展和海带科技的进步，海带产业进入了持续、快速、健康发展阶段。近年来中国海带养殖规模迅速发展。中国海带年产量从1999年的398.26万吨提高至2008年的539.64万吨，中国海带年产量约占世界海带年产量的81％-88％，其养殖产量和规模在世界海藻养殖中均列首位。

海带含数十种营养成分，主要包括甘露醇、褐藻胶等。其中海带最主要的功能物质是多糖类物质。海带多糖具有多种生物活性及药用功能，包括增强免疫、抗肿瘤等。将海带加工成富含海带糖成分的水解液，能够促进对海带功能成分的吸收。海带水解液可以作为食品添加成分、营养液应用于海带酱油、功能饮料等诸多领域。传统海带水解液主要通过高温蒸煮、酸碱处理等方法，耗费能量较大，且排除大量的污水，无法适应绿色环保工艺的要求。以纤维素酶系(例如外切葡聚糖酶)为基础，结合蛋白酶、果胶酶等，建立高效的酶法加工海带水解液工艺，能够大幅减少酸、碱等化学试剂的使用量。但如何提高酶催化效率是降低成本的关键。因此，从元基因组挖掘新型外切葡聚糖酶等纤维素酶资源，并用于海带水解液的制备具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型外切葡聚糖酶基因及其在制备海带水解液中的应用。

第一方面，本发明要求保护一种蛋白质。

本发明要求保护的蛋白质，可为如下任一：

(A1)氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的蛋白质；

(A2)将(A1)所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；

(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。

上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

第二方面，本发明要求保护编码前文所述蛋白质的核酸分子。

本发明要求保护的所述核酸分子，可为如下任一所示DNA分子：

(B1)SEQ ID No.2所示的DNA分子；

(B2)在严格条件下与(B1)限定的DNA分子杂交且编码所述融合蛋白的DNA分子；

(B3)与(B1)-(B2)中任一限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码所述融合蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

第三方面，本发明要求保护含有前文所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

第四方面，本发明要求保护前文所述蛋白质作为外切葡聚糖酶在制备海带水解液中的应用。

第五方面，本发明要求保护一种用于制备海带水解液的成套酶制剂。

本发明所要求保护的用于制备海带水解液的成套酶制剂，由所述外切葡聚糖酶和蛋白酶组成。所述外切葡聚糖酶为前文所述的蛋白质。

第六方面，本发明要求保护一种用于制备海带水解液的试剂盒。

本发明要求保护的用于制备海带水解液的试剂盒，可含有如下任一：

(C1)前文所述的成套酶制剂和海带粉；

(C2)前文所述核酸分子或表达盒或重组载体或重组菌或重组细胞，蛋白酶和海带粉。

第七方面，本发明要求保护前文所述的成套酶制剂或所述的试剂盒在制备海带水解液中的应用。

第八方面，本发明要求保护一种制备海带水解液的方法。

本发明所要求保护的制备海带水解液的方法，可包括如下步骤：向海带粉中加入外切葡聚糖酶和蛋白酶进行反应；所述外切葡聚糖酶为前文所述的蛋白质。

进行所述反应时采用的反应缓冲液的pH为4.5-5.5(如pH5.0)，反应温度为42-47℃(如45℃)。

在本发明的具体实施方式中，所述反应缓冲液具体为pH5.0的0.1M醋酸-醋酸钠缓冲液。

在所述方法中，反应时长可为6-8h(如8h)；反应过程中转速可为200rpm。

相应的，所述外切葡聚糖酶、所述蛋白酶和所述海带粉的配比可为10000IU(以纤维素酶酶活计):10000IU:50g。

在本发明的具体实施方式中，所述外切葡聚糖酶在反应体系中的终浓度为约10000IU/L(以纤维素酶酶活计)；所述蛋白酶在反应体系中的终浓度为约10000IU/L；所述海带粉在反应体系中的终浓度为50g/L。

在本发明的具体实施方式中，所述外切葡聚糖酶的纯度为95-99％(如96％)；所述蛋白酶具体为北京伊诺凯科技有限公司，货号为P0029的商品。

在上述各方面中，所述外切葡聚糖酶均可按照包括如下步骤的方法制备得到：将前文第二方面中所述的核酸分子(编码前文所述蛋白质的核酸分子)导入大肠杆菌受体细胞，得到重组大肠杆菌；培养所述重组大肠杆菌，获得所述外切葡聚糖酶。

其中，所述核酸分子可以以重组载体的形式导入到所述大肠杆菌受体细胞中。

在本发明的具体实施方式中，所述重组载体具体为将所述核酸分子(SEQ IDNo.2)替换pET28a载体的酶切位点NotI和BamHI之间的小片段后得到的重组质粒。

进一步地，对所述重组大肠杆菌进行培养的条件为30℃培养2h后接入IPTG至终浓度为0.1mM，然后培养16h。培养后收集菌体，超声破碎后镍亲和层析法提取蛋白，即得所述外切葡聚糖酶蛋白溶液。

在本发明中，所述海带粉的粒径小于40目。

进一步地，所述海带粉可为新鲜海带60℃烘干、粉碎后过40目筛子所得。

实验证明，利用本发明提供的外切葡聚糖酶及配套方法制备海带水解液，8小时可获得0.7g/L还原糖。因此，利用本发明提供的方法具有重要的应用价值。

附图说明

图1为利用外切葡聚糖酶CEL2生产海带水解液的结果。T1表示实验组；C表示对照组。纵坐标g/L指的是每升发酵液中的还原糖含量。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、外切葡聚糖酶cel2基因的获得

1、全基因合成SEQ ID No.2(南京金唯智生物科技有限公司)，获得cel2基因。基因序列来自于吉林松江河热泉微生物元基因组文库中。其中，SEQ ID No.2编码SEQ ID No.1所示氨基酸序列。

2、将cel2基因采用Gibson方法构建在pET28a质粒上

(1)cel2基因的PCR扩增。以南京金唯智生物科技有限公司提供的含有cel2基因(SEQ ID No.1)的质粒作为模板，以C2-F和C2-R为引物，用高保真TransStart FastPfu DNA聚合酶(北京全式金生物技术有限公司，货号AP221)PCR扩增出基因片段cel2。

C2-F：5’-GCCGCGCGGCAGCCAT-ATGCGCGAAAGCGGCCTGGGCACCGTGAC C-3’；

C2-R：5’-GTCGACGAGCTCGAATTCG-TTAATCTTTCGGTTTGCCGCCCGGGTTCGG-3’。

(2)构建含有cel2基因的重组表达载体。将上述步骤(1)得到的PCR扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段；同时用NotI和BamHI酶切载体pET28a(武汉淼灵生物科技有限公司，货号VT0331-01)，回收载体大片段ET28a。用Gibson组装方法(Gibson DG,YoungL,et al.Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundredkilobases.Nat.methods.2009；6(5):343-345)将上述cel2片段与ET28a片段进行连接反应。用CaCl₂法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司，货号CD201)。将其均匀涂布于含卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜。挑选克隆并测序，获得阳性质粒命名为pETC2。

pETC2的结构描述为：将SEQ ID No.2所示DNA片段替换pET28a载体的酶切位点NotI和BamHI之间的小片段后得到的重组质粒。

(3)大肠杆菌菌株EC2的构建：将pETC2质粒通过氯化钙转化法转化至Transetta(DE3)感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司，货号CD801-01)中，在含有卡那霉素的LB平板37℃过夜培养后挑选克隆，得到表达CEL2蛋白的大肠杆菌菌株EC2。

二、CEL2蛋白的制备

将EC2菌株活化后，以1:100的接种量于5L发酵罐中(含3L的LB培养基30℃培养，转接后第2小时加入IPTG浓度至终浓度0.1mM)，培养16小时。5000rpm离心，收集菌体。菌体经超声破碎后用镍亲和层析法(北京全式金生物技术有限公司，货号DP101-01)提取蛋白(全部方法按照说明书)。然后采用SDS-PAGE分析蛋白的分子量大小及纯度。结果证实纯化所得蛋白分子量大小约为32KD，与SEQ ID No.1所示蛋白质的理论分子量大小基本相符。SDS-PAGE电泳结果显示纯化后产物无杂带(纯度达96％)。证明已经获得纯化后CEL2蛋白。然后，利用Brandford试剂测定CEL2蛋白的浓度(生工生物工程(上海)股份有限公司，货号C600641)，方法按照产品说明书进行。外切葡聚糖酶酶活测定采用pNPG法，按照文献进行(包蕾，中国牦牛瘤胃未培养微生物来源的纤维素降解酶的筛选、克隆和鉴定，复旦大学博士学位论文，2010)，经测定纯化后的CEL1蛋白具有外切葡聚糖酶酶活，酶活力可达32IU/mg(酶活力单位定义为在pH5、45℃条件下，每分钟催化pNPG水解生成1微摩尔对硝基苯酚的酶量为一个活力单位)。

实施例2、利用CEL2蛋白生产海带水解液

新鲜海带(威海等地)洗净置于60℃烘箱过夜烘干，于大功率粉碎机中粉碎，过40目筛子，获得海带粉。

5L反应罐中反应：

反应体系中含有如下成分：

实施例1中获得的CEL2蛋白，最终酶浓度：外切葡聚糖酶活力(纤维素酶活力)约10000IU/L，IU定义为在最适条件下(pH5、45℃)每分钟催化羧甲基纤维素钠水解生成1微摩尔还原糖的酶量为一个活力单位；

蛋白酶(北京伊诺凯科技有限公司，货号P0029)，最终酶浓度：约10000IU/L，IU定义为pH5、45℃条件下每分钟催化酪蛋白水解生成1微摩尔酪氨酸的酶量为一个活力单位；

海带粉50g/L。

反应罐反应条件：

反应缓冲液：0.1M醋酸钠/醋酸缓冲液(pH＝5)

反应温度：45℃；

反应时长：8h；

反应转速：200rpm。

含有全部成分的设为实验组T1，不含CEL2成分的设为对照组C。

还原糖检测方法：

取出样品13000rpm离心5min取上清沸水浴5min，取100μl上清加入100μl DNS溶液(配方：氢氧化钠21g、DNS 6.3g，充分溶解于500mL蒸馏水中，在溶液中加入酒石酸钾钠182g，苯酚5g，偏重亚硫酸钠5g，搅拌至全溶，定容至1000mL，避光保存)，沸水浴5min，离心取100μl上清加入96孔板中于酶标仪中测定还原糖含量。

结果如图1所示：实验组T1可产约0.7g/L还原糖，而对照组C可产约0.1g/L还原糖。说明利用CEL2蛋白制备海带水解液具有明显的优势。

<110> 山东宏业海洋科技股份有限公司

<120> 一种外切葡聚糖酶基因CEL2及其在制备海带水解液中的应用

<130> GNCLN200366

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 280

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 1

Met Arg Glu Ser Gly Leu Gly Thr Val Thr Ser Gly Asn Thr Ala Cys

1 5 10 15

Ser Ser Ala Thr Thr Cys Ser Ala Leu Glu Gly Ala Asp Tyr Glu Gly

20 25 30

Leu His Ala Thr Thr Ala Gly Gly Ser Val Thr Ser Ala Pro Pro Ser

35 40 45

Gln Gln Thr Asn Val Gly Thr Arg Val Tyr Met Glu Ser Gly Lys Arg

50 55 60

Tyr Gln Met Phe Asp Leu Leu Asn Gln Glu Leu Thr Phe Asp Val Asp

65 70 75 80

Val Ser Lys Val Pro Cys Gly Gly Thr Asn Gly Ala Leu Tyr Phe Ile

85 90 95

Ser Leu Met Glu Asp Gly Gly Met Ser Lys Phe Ser Gly Asn Lys Ala

100 105 110

Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ser Gln Cys Pro Arg Asp

115 120 125

Ile Lys Phe Ile Asn Gly Glu Asn Trp Glu Ala Asn Asn Leu Asn Pro

130 135 140

Phe Arg Met Gly Asn Arg Glu Phe Tyr Gly Pro Gly Lys Ser Tyr Asp

145 150 155 160

Ile Asp Thr Asn Arg Lys Phe Ser Val Ile Thr Gln Phe Ile Thr Asp

165 170 175

Asn Asp Thr Glu Thr Asp Asp Arg Val Thr Glu Ser Asn Pro Asn Thr

180 185 190

Asn Phe Pro Gly Leu Met Gly Thr Asp Ser Ile Thr Asp Ala Met Cys

195 200 205

Asp Asp Ala Lys Ala Leu Phe Glu Asp His Pro Tyr Val Met Gly Gly

210 215 220

Leu Ala Gln Leu Ser Ser Leu Ala Lys Gly Thr Gly Leu Ala Leu Ser

225 230 235 240

Ile Trp Asn Asp His Thr Ala Asn Met Leu Trp Leu Asp Ser Phe Lys

245 250 255

Thr Gly Glu Asp Pro Lys Asp Pro Gly Ala Leu Arg Cys Thr Cys Pro

260 265 270

Asn Pro Gly Gly Lys Pro Lys Asp

275 280

<210> 2

<211> 840

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

atgcgcgaaa gcggcctggg caccgtgacc agcggcaaca ccgcgtgcag cagcgcgacc 60

acctgcagcg cgctggaagg cgcggattat gaaggcctgc atgcgaccac cgcgggcggc 120

agcgtgacca gcgcgccgcc gagccagcag accaacgtgg gcacccgcgt gtatatggaa 180

agcggcaaac gctatcagat gtttgatctg ctgaaccagg aactgacctt tgatgtggat 240

gtgagcaaag tgccgtgcgg cggcaccaac ggcgcgctgt attttattag cctgatggaa 300

gatggcggca tgagcaaatt tagcggcaac aaagcgggcg cgaaatatgg caccggctat 360

tgcgatagcc agtgcccgcg cgatattaaa tttattaacg gcgaaaactg ggaagcgaac 420

aacctgaacc cgtttcgcat gggcaaccgc gaattttatg gcccgggcaa aagctatgat 480

attgatacca accgcaaatt tagcgtgatt acccagttta ttaccgataa cgataccgaa 540

accgatgatc gcgtgaccga aagcaacccg aacaccaact ttccgggcct gatgggcacc 600

gatagcatta ccgatgcgat gtgcgatgat gcgaaagcgc tgtttgaaga tcatccgtat 660

gtgatgggcg gcctggcgca gctgagcagc ctggcgaaag gcaccggcct ggcgctgagc 720

atttggaacg atcataccgc gaacatgctg tggctggata gctttaaaac cggcgaagat 780

ccgaaagatc cgggcgcgct gcgctgcacc tgcccgaacc cgggcggcaa accgaaagat 840

Claims

1.蛋白质，为如下任一：

（A1）氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的蛋白质；

（A2）在（A1）所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。

2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为SEQ ID No.2所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒。

5.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体。

6.含有权利要求2或3所述核酸分子的转基因细胞系；所述转基因细胞系为非动物或植物品种。

7.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组菌。

8.权利要求1所述蛋白质作为外切葡聚糖酶在制备海带水解液中的应用。

9.权利要求2或3所述核酸分子或权利要求4所述的表达盒或权利要求5所述的重组载体或权利要求6所述的转基因细胞系或权利要求7所述的重组菌在制备海带水解液中的应用。

10.一种用于制备海带水解液的成套酶制剂，由外切葡聚糖酶和蛋白酶组成；所述外切葡聚糖酶为权利要求1所述的蛋白质。

11.一种用于制备海带水解液的试剂盒，含有如下任一：

（C1）权利要求10中所述的成套酶制剂和海带粉；

（C2）权利要求2或3所述核酸分子或权利要求4所述的表达盒或权利要求5所述的重组载体或权利要求6所述的转基因细胞系或权利要求7所述的重组菌，蛋白酶和海带粉。

12.权利要求10所述的成套酶制剂或权利要求11所述的试剂盒在制备海带水解液中的应用。

13.一种制备海带水解液的方法，包括如下步骤：向海带粉中加入外切葡聚糖酶和蛋白酶进行反应；

进行所述反应时采用的反应缓冲液的pH为4.5-5.5，反应温度为42-47℃；

所述外切葡聚糖酶为权利要求1所述的蛋白质。