CN105087520B - 一种促进重组极端耐热α-淀粉酶可溶性表达的方法 - Google Patents

一种促进重组极端耐热α-淀粉酶可溶性表达的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种促进重组极端耐热α‑淀粉酶可溶性表达的方法，将极端耐热α‑淀粉酶的编码基因与分子伴侣蛋白Prefoldin的编码基因共同表达，从而有效地提高了极端耐热α‑淀粉酶的可溶性表达与酶活性。

Description

一种促进重组极端耐热α-淀粉酶可溶性表达的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种促进重组极端耐热α-淀粉酶可溶性表达的方法。
背景技术
α-淀粉酶又称为淀粉1，4-糊精酶，是一种内切酶，能随机地切断淀粉、糖原、寡聚或多聚糖分子内的α-1，4-糖苷键，产生麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等，是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一。目前，α-淀粉酶已广泛应用于变性淀粉及淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、发酵以及纺织等许多行业和医药行业，是一种重要工业用酶。
耐高温α-淀粉酶是工业上最常用的酶制剂之一。工业上现今常用的耐热α-淀粉酶来源于Bacillus licheniformis(BLA)，其最适作用温度为90℃而且需要与Ca2+作用来维持其热稳定性。但该酶仍存在不足之处：首先，BLA的热稳定性仍不够高；其次，BLA的最适pH偏高为7.0-8.0；再次，BLA需要钙离子来维持其热稳定性。
重组极端耐热α-淀粉酶PFA来源于极端嗜热古菌P.furiosus，具有十分优秀的酶学性质与酶学特点，在多项关键指标方面远优于目前市场上的传统的耐热α-淀粉酶。例如其最适温度接近100℃，并具有极其优良的耐热性，在100℃数小时不丧失活性(一般耐热淀粉酶如BLA在接近100℃时的半衰期仅有数分钟)。同时，极端耐热α-淀粉酶PFA的活性与耐热性均不需要另外添加钙离子，且其最适pH为酸性，可以大大便利工业应用过程中的后续环节。另外，该酶的淀粉水解产物主要成分为麦芽寡糖，以G2-G7为主，单糖(葡萄糖)含量低于2％。这些优点与特点提示重组PFA有望在包括淀粉高温液化、超高纯度高麦芽糖浆的生产以及纺织印染等等多种工业化生产过程中发挥卓越的作用，具有极高的潜在工业应用价值。
P.furiosus是从海底火山温泉中的分离得到的绝对厌氧菌，最适生长温度100℃[Haruyuki Atomi等，Current Opinion in Biotechnology，2011，5(22)：618-626]，培养相对较为复杂，难以实现大规模工业培养，PFA的较大量制备只能通过外源重组表达方能够实现。迄今已有多家国内外实验室对PFA的蛋白结构、酶学性质以及重组表达等方面进行了研究，至今尚未有适合该酶大规模制备方法的报道。国外的研究结果与本发明人对PFA的研究结果发现当重组PFA在E.coli中大量表达时，表达的重组PFA主要是不溶性的包涵体，这为该酶的大规模纯化与制备等下游工程带来了极大的不便。
本发明人前期对重组极端耐热alpha-淀粉酶PFA进行了较为深入的研究。首先研究了重组PFA在大肠杆菌中进行大量表达，发现重组PFA主要以不溶性的包涵体形式表达。之后对PFA包涵体纯化复性的方法进行了研究，建立了碱变性-加热-稀释复性的纯化方法，获得了具有较高生物活性的重组PFA[Lisa Wang等，J Ind Microbiol Biotechnol.2007.(34):187–192；张毅等，中国发明专利：一种嗜热α-淀粉酶的制备纯化方法，专利号：ZL20061 0025974.0]。在进一步对纯化酶的稳定性研究过程中发现，一定浓度的去垢剂对重组PFA的酶活性没有影响，由此建立了采用去垢剂对重组PFA包涵体进行溶解复性与纯化的方法[张毅等，中国发明专利：重组极端耐热α-淀粉酶的复性与纯化方法，专利号：ZL200810039429.6]。
尽管如此，对于重组酶而言，可溶性表达更具应用与生产的便利性及生产成本的可控性。由于重组极端耐热alpha-淀粉酶PFA自身的特性，现有技术中，对该酶实现可溶性的重组高表达十分困难。
因此，本领域还需要进一步研究适用于重组表达极端耐热alpha-淀粉酶PFA的表达系统以及表达方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种促进重组极端耐热α-淀粉酶可溶性表达的方法。
在本发明的第一方面，提供一种重组表达极端耐热α-淀粉酶的方法，所述方法包括：将极端耐热α-淀粉酶的编码基因与分子伴侣蛋白Prefoldin的编码基因共同表达，获得可溶性的极端耐热α-淀粉酶。
在一个优选例中，所述的共同表达的表达宿主包括：原核细胞，真核细胞。较佳地，所述的原核细胞包括但不限于大肠杆菌细胞；所述的真核细胞包括但不限于酵母细胞。优选地，所述的表达宿主是大肠杆菌细胞。
在另一优选例中，所述的分子伴侣蛋白Prefoldin来源于极端嗜热古菌P.furiosus。
在另一优选例中，所述的极端耐热α-淀粉酶来源于极端嗜热古菌P.furiosus。
在另一优选例中，所述的极端耐热α-淀粉酶的编码基因与分子伴侣蛋白Prefoldin的编码基因在大肠杆菌细胞中共同表达。
在另一优选例中，所述的共同表达的方法包括：
(1)提供表达载体，所述的表达载体含有极端耐热α-淀粉酶的表达盒和分子伴侣蛋白Prefoldin的表达盒；
(2)将(1)的表达载体转化大肠杆菌细胞，培养转化有所述表达载体的重组大肠杆菌细胞，获得可溶性的极端耐热α-淀粉酶。
在另一优选例中，所述的含有极端耐热α-淀粉酶的表达盒和分子伴侣蛋白Prefoldin的表达盒分别位于不同的表达载体中，或位于同一表达载体中。
在另一优选例中，所述的表达载体包括(但不限于)：pT7473，pACYC或pCDF。
在另一优选例中，所述的极端耐热α-淀粉酶是极端耐热α-淀粉酶PFA。
在本发明的另一方面，提供分子伴侣蛋白Prefoldin的用途，用于促进重组极端耐热α-淀粉酶可溶性表达。
在一个优选例中，所述的分子伴侣蛋白Prefoldin通过与极端耐热α-淀粉酶共同表达，促进极端耐热α-淀粉酶的可溶性表达。
在本发明的另一方面，提供重组的宿主细胞，所述的宿主细胞中含有极端耐热α-淀粉酶的表达盒和分子伴侣蛋白Prefoldin的表达盒。
在一个优选例中，所述的宿主细胞是大肠杆菌细胞。
在本发明的另一方面，提供一种重组表达极端耐热α-淀粉酶的试剂盒，所述试剂盒中包括：
表达载体，所述的表达载体含有极端耐热α-淀粉酶的表达盒和分子伴侣蛋白Prefoldin的表达盒。
在一个优选例中，所述的含有极端耐热α-淀粉酶的表达盒和分子伴侣蛋白Prefoldin的表达盒分别位于不同的表达载体中，或位于同一表达载体中。
在另一优选例中，所述的表达载体包括(但不限于)：pT7473，pACYC或pCDF。
在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括：大肠杆菌细胞。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、来源于P.furiosus的分子伴侣蛋白Prefoldin和Hsp60对重组极端耐热淀粉酶PFA可溶性表达的影响。
A为各菌株破碎后离心上清液中PFA的比活，BL21(DE3)为空宿主菌，PFA为重组PFA表达菌，PFA+pACYC为同时转化pACYC质粒与PFA表达质粒的菌株，PFA+pACYC-Prefoldin为同时转化pACYC-Prefoldin质粒与PFA表达质粒的菌株，PFA+pACYC-Hsp60为同时转化pACYC-Hsp60质粒与PFA表达质粒的菌株。
B为各菌株破碎后的离心上清与沉淀样品的SDS-PAGE电泳图，各泳道中样品如下：M为marker；1-2为BL21(DE3)菌体破碎后上清与沉淀，3-4为重组PFA表达菌体破碎上清与沉淀，5-6为同时转化pACYC质粒与PFA表达质粒的菌体破碎上清与沉淀(PFA+pACYC)，7-8为同时转化pACYC-Prefoldin质粒与PFA表达质粒的菌体破碎上清与沉淀(PFA+pACYC-Prefoldin)，9-10为同时转化pACYC-Hsp60质粒与PFA表达质粒的菌体破碎上清与沉淀(PFA+pACYC-Hsp60)。
图2、Prefoldin表达量的提高对PFA可溶性表达的影响。
A为各菌株破碎离心上清液中PFA的酶比活。BL21(DE3)为空宿主菌，PFA为重组PFA表达菌，PFA+pACYC为同时转化pACYC质粒与PFA表达质粒的菌株，PFA+pACYC-Prefoldin为同时转化pACYC-Prefoldin质粒与PFA表达质粒的菌株，PFA+pCDF为同时转化pCDF质粒与PFA表达质粒的菌株，PFA+pCDF-Prefoldin为同时转化pCDF-Prefoldin质粒与PFA表达质粒的菌株。
B为各菌株破碎后的上清与沉淀的SDS-PAGE电泳图，各泳道中样品如下：M为marker；1-3为PFA菌体、上清与沉淀样品，4-6为PFA+pACYC-Prefoldin菌体、上清与沉淀样品，7-9为PFA+pCDF-Prefoldin菌体、上清与沉淀样品。
图3、重组PFA与分子伴侣Prefoldin在一个质粒中共同表达时进一步提高了PFA的可溶性表达水平。a.各重组菌菌体破碎后离心上清中重组PFA的比活力。b.蛋白质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果。M：蛋白质分子量标准；1-3：BL21(DE3)全菌，破碎后上清，沉淀样品；4-6：pT7473-PFA菌株全菌，破碎后上清，沉淀样品；7-9：pACYC-PFA菌株全菌，破碎后上清，沉淀样品；10-12：pT7473-PFA+pCDF-prefoldin菌株全菌，破碎后上清，沉淀样品；13-15：pT7473-PFA+pACYC-prefoldin菌株全菌，破碎后上清，沉淀样品；16-18pCDF-PFA菌株全菌，破碎后上清，沉淀样品；19-21：pACYC-prefoldin-PFA菌株全菌，破碎后上清，沉淀样品；22-24：pCDF-prefoldin-PFA菌株全菌，破碎后上清，沉淀样品。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，通过进行多种表达系统以及大量表达方法的反复尝试，开发了一种促进重组极端耐热α-淀粉酶可溶性表达的方法。所述方法可有效地提高可溶性表达的极端耐热α-淀粉酶的量，且良好地保留了酶的生物活性。
本发明人长期致力于极端耐热α-淀粉酶的重组表达研究，尝试了各种表达系统以及各种促进其可溶性表达的方法。对于原核表达系统，本发明人考察与探讨了不同分子伴侣蛋白在菌体的共同表达是否有助于提高重组PFA的可溶性表达。实验结果发现，小热休克蛋白(sHSP)、HSP60等分子伴侣蛋白均不能有效促进极端耐热α-淀粉酶的可溶性表达。本发明人在实验中意外地发现，当将Prefoldin与PFA共同表达时，重组PFA的可溶性表达却有明显地提高。
进而，本发明人考察了重组Prefoldin的表达量对PFA的可溶性表达的影响，发现一种可显著提高Prefoldin表达量的方法，其表达量的进一步提高显著地促进了重组PFA可溶性表达。这一实验结果对于极端耐热α-淀粉酶(PFA)的未来工业化生产与应用具有重要意义。
重组极端耐热α-淀粉酶PFA
本发明的重组极端耐热α-淀粉酶PFA的氨基酸序列是本领域已知的。
作为本发明的优选方式，重组极端耐热α-淀粉酶PFA是：(a)SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的蛋白；或(b)将SEQ ID NO:3所示氨基酸序列经过一个或多个(优选1-20个，更佳地1-10个，更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促进重组极端耐热α-淀粉酶可溶性表达功能的由(a)衍生的蛋白；或(c)SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的蛋白的生物活性片段。
PFA蛋白的编码基因是容易获得的，在蛋白已知的情况下，本领域人员均了解如何获得PFA的编码基因，例如可以采用PCR扩增的方式从基因组中获得，或者采用化学合成的方式。
Prefoldin
Prefoldin(PFD)也称为GimC/Gim蛋白质，是一种由两种亚基组成的六聚体分子伴侣蛋白复合物，存在于所有的真核生物与古细菌中。来源于极端嗜热古菌的Prefoldin由两个α亚基和四个β亚基组成类似“水母”形状的蛋白质寡聚体，其结构由两个β折叠桶构成，六个长长的卷曲的触手伸展到外面，触手顶端露出疏水区域。
Prefoldin蛋白的α亚基是：(a)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的蛋白；或(b)将SEQ ID NO:1所示氨基酸序列经过一个或多个(优选1-20个，更佳地1-10个，更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促进重组极端耐热α-淀粉酶可溶性表达功能的由(a)衍生的蛋白；或(c)SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白的生物活性片段。或者，Prefoldin蛋白β亚基是：(a)SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的蛋白；或(b)将SEQ IDNO:2所示氨基酸序列经过一个或多个(优选1-20个，更佳地1-10个，更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促进重组极端耐热α-淀粉酶可溶性表达功能的由(a)衍生的蛋白；或(c)SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白的生物活性片段。
所述的Prefoldin蛋白的α亚基的氨基酸序列还可参见Genbank登录号：NP_578104。所述的Prefoldin蛋白的β亚基的氨基酸序列还可参见Genbank登录号：NP_578111.1。
Prefoldin蛋白的编码基因是容易获得的，在蛋白已知的情况下，本领域人员均了解如何获得Prefoldin的编码基因，例如可以采用PCR扩增的方式从基因组中获得，或者采用化学合成的方式。例如，所述的Prefoldin蛋白α的亚基的编码基因可参见Genbank登录号：PF0375。所述的Prefoldin蛋白的β亚基的编码基因可参见Genbank登录号：PF0382。此外，与上述扩增获得的基因序列简并的序列也是可用的。
Prefoldin来源于极端嗜热古菌P.furiosus，本领域不确定其在原核表达体系中是否有助于蛋白的重组表达。
重组表达
本发明也涉及包含所述的极端耐热α-淀粉酶PFA的编码基因和/或Prefoldin的编码基因的表达载体，以及用本发明的载体经基因工程转化产生的宿主细胞。
本发明所述的表达载体是适用于宿主细胞(表达宿主)进行表达的表达载体，其中含有极端耐热α-淀粉酶PFA和/或Prefoldin的表达盒。如本文所用，所述的“表达盒”是指包含有表达目的多肽(本发明中为PFA和Prefoldin)所需的所有必要元件的基因表达系统，通常其包括一下元件：启动子、编码多肽的基因序列，终止子；此外还可选择性包括信号肽编码序列等；这些元件是操作性相连的。
作为本发明的优选方式，所述的表达载体包括但不限于pT7473，pACYC或pCDF。更优选地，应用pCDF表达载体表达Prefoldin，其可促进可溶性极端耐热α-淀粉酶PFA的增加。
将所述的表达载体转化表达宿主，培养转化有所述表达载体的重组表达宿主，从而可表达可溶性的极端耐热α-淀粉酶PFA。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。
所述的宿主细胞可以是原核细胞，真核细胞等。所述原核细胞的一个具体的例子是大肠杆菌。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
材料与方法
菌株与载体
pT7473-PFA表达载体构建：详见文献Lisa Wang等，J Ind MicrobiolBiotechnol.2007.(34):187-192。
pACYC-Prefoldin载体与pCDF-Prefoldin载体构建：抽提pPFD质粒(pPFD质粒构建详见Hui Chen等，Biotechnol Lett.2010.(32):429-434)，用NcoI、SalI两种限制型内切酶双酶切得到编码Prefoldin的基因表达片段，经琼脂糖凝胶电泳回收纯化待用。将pACYCDuet-1(Novagen公司)、pCDFDuet-1质粒(Novagen公司)分别用NcoI、SalI双酶切后琼脂糖凝胶电泳回收。双酶切后的Prefoldin编码基因分别与双酶切后的pACYCDuet-1、pCDFDuet-1质粒混合，加入T4 DNA连接酶，16℃反应16小时，分别获得pACYC-Prefoldin载体与pCDF-Prefoldin载体。
pACYC-PFA的构建：将两端带有PshBI/XhoI酶的PFA克隆入pACYC质粒相应位点中。
pCDF-PFA的构建：将两端带有PshBI/XhoI酶的PFA克隆入pCDF质粒相应位点中。
pACYC-Prefoldin-PFA的构建：如前获得pACYC-PFA，再将两端带有NcoI/SalI酶的Prefoldin克隆入该质粒相应位点中，获得pACYC-Prefoldin-PFA。
pCDF-Prefoldin-PFA的构建：如前获得pCDF-PFA，再将两端带有NcoI/SalI酶的Prefoldin克隆入该质粒相应位点中，获得pCDF-Prefoldin-PFA。
pACYC-Hsp60载体构建：抽提含有HSP60编码基因的pET21-PfCPN质粒(pET21-PfCPN质粒构建详见Hua-you Chen等，Journal of Basic Microbiology 2007.(47):132-137)，用Nde I与Xhol I双酶切，HSP60编码基因DNA片段经琼脂糖凝胶电泳回收纯化待用。pACYCDuet-1质粒经Nde I与Xhol I双酶切后与回收的HSP60编码基因DNA片段进行连接反应，获得pACYC-Hsp60载体。
将上述表达载体单独或以不同的组合转化Ecoli BL21(DE3)菌株，分别获得以下重组菌株：
携带pT7473-PFA表达载体的Ecoli BL21(DE3)表达菌株；
携带pACYC-Prefoldin载体的Ecoli BL21(DE3)表达菌株；
携带pCDF-Prefoldin载体的Ecoli BL21(DE3)表达菌株；
携带pT7473-PFA与pACYC-Prefoldin两种载体的Ecoli BL21(DE3)表达菌株；
携带pT7473-PFA与pCDF-Prefoldin两种载体的Ecoli BL21(DE3)表达菌株。
携带pT7473-PFA与pACYC-HSP60两种载体的Ecoli BL21(DE3)表达菌株。
携带pACYC-Prefoldin-PFA载体的Ecoli BL21(DE3)表达菌株。
携带pCDF-Prefoldin-PFA载体的Ecoli BL21(DE3)表达菌株。
携带pCDF-PFA的Ecoli BL21(DE3)表达菌株。
携带pACYC-PFA的Ecoli BL21(DE3)表达菌株。
主要试剂与溶液
LB培养基：10g NaCl，5g酵母粉，10g蛋白胨溶于1000ml去离子水中；
超声破碎缓冲液：Tris.HCl(pH 8.0)50mM，EDTA 10mM，NaCl 100mM；
DNS试剂：1g 3,5-二硝基水杨酸溶解于20ml 2mol/L NaOH中，加入30g酒石酸钠钾，稀释至100ml；
铜-酒石酸盐-碳酸盐(CTC)：将20％(w/v)的碳酸钠溶液缓慢地加入硫酸铜-酒石酸溶液中缓慢搅拌至硫酸铜(五水化合物)的终浓度为0.1％(w/v)，酒石酸钾钠的终浓度为0.2％(w/v)，碳酸钠的终浓度为10％(w/v)；
10％SDS：将10g SDS溶于100ml去离子水中配成10％储液，使用时稀释需10倍；
0.8N NaOH；
Folin-酚试剂：从生工购买，浓度为2N；
0.15％(w/v)脱氧胆酸钠(DOC)；
72％(w/v)三氯酸钠(TCA)；
试剂A：将CTC、NaOH、SDS与水等量(按照体积)混合；
试剂B：将1体积的2N Folin-酚试剂与5体积的去离子水混合。
重组菌体的获得
首先接种-80℃甘油保存菌种于3ml无菌但含有相应抗性的LB培养基中37℃250rpm过夜培养。第二天按1％的接种量接种过夜培养的菌液于200ml含相应抗性的无菌LB中培养2h，2h后加入IPTG至终浓度为0.1mM诱导4h。4h后于5000rpm离心30min，弃上清，收集菌体并测菌体湿重。
以相同的方法收集BL21(DE3)、含pT7473-PFA重组质粒的BL21(DE3)、含pACYC与pT7473-PFA重组质粒的BL21(DE3)、含pACYC-Prefoldin与pT7473-PFA重组质粒的BL21(DE3)、含pCDF与pT7473-PFA重组质粒的BL21(DE3)、含pCDF-Prefoldin与pT7473-PFA重组质粒的BL21(DE3)菌种的菌体。
细胞破碎
将菌体用超声破碎液按其湿菌体重量以0.1g/ml悬浮，用超声破碎5min，间隔5min，再破碎5min，所有的操作都在冰浴上进行。所有样品的破碎操作均一致。破碎后于10,000rpm离心30min，收集上清与沉淀，沉淀用相同体积的破碎液重悬并充分摇匀。取相同体积(15ul)的上清与沉淀SDS-PAGE蛋白质电泳分析。另取样适度稀释后在100℃测定淀粉酶活性。其余的样品置于4℃冰箱中保存以进行后续实验。
高温淀粉酶活力测定方法(DNS法)
将获得的上清液进行定量的稀释，测定上清酶活。
将定量稀释的酶液加入到含1％(w/v)淀粉的50mmol/L pH为5.0的醋酸钠溶液中至终体积为500ul，100℃反应15min，迅速放入冰水浴中终止反应。加入500ul DNS试剂，于沸水中煮5分钟，迅速放入冰水中冷却，加入5ml水，摇匀，用紫外-可见光分光光度计测其在546nm处的吸光度值。以葡萄糖与DNS试剂的反应作标准曲线。定义1个酶活力单位为1分钟降解淀粉生成1umol还原性糖的酶量。
蛋白含量的测定方法(Folin-酚法)
将获得的上清液进行定量的稀释，对上清液蛋白浓度进行测定。
往1ml样品中加入0.1ml 0.15％(w/v)脱氢胆酸钠，室温下放置10min，加入0.1ml72％(w/v)的TCA溶液混合均匀，于3000转离心15min，弃上清。往沉淀中加入1ml去离子水，加入1ml试剂A，混合均匀并在室温下放置10min。加入0.5ml试剂B，立即混合均匀，30min后用分光光度计测其在750nm处的吸光度值。
实施例1、Prefoldin与HSP60对极端耐热淀粉酶PFA可溶性表达的影响
本发明人考察了多种来源的分子伴侣蛋白，将它们分别与极端耐热淀粉酶PFA共同表达时，考察是否有助于重组PFA的可溶性表达。经过筛选，最后将研究范围确定在：来源于极端嗜热古菌P.furiosus的两种分子伴侣蛋白Prefoldin及Hsp60。
Prefoldin与Hsp60的编码序列分别被克隆至pACYC质粒中，分别标记为pACYC-Prefoldin及pACYC-Hsp60质粒。将BL21(DE3)宿主菌、含pT7473-PFA重组质粒的BL21(DE3)以及含pACYC与pT7473-PFA两种质粒的BL21(DE3)等菌株分别作为对照。将上述菌株从-80℃冻存的甘油管中取出，接种于3ml具有相应抗性的LB培养基中，37℃250rpm摇床过夜培养。按1％的接种量转接过夜培养的菌液于200ml含有相应抗性的LB培养基中37℃培养2-3小时，至OD600约为0.5-0.6时，加入IPTG进行诱导(IPTG终浓度为0.1mM)，继续培养37℃4小时。离心收集菌体，经超声波破碎后离心收获上清，测定重组PFA的可溶性表达情况。
图1A中实验数据显示，分子伴侣蛋白(无论是Prefoldin还是Hsp60)与极端耐热淀粉酶PFA的共同表达时均可以提高PFA的可溶性表达水平，其中Prefoldin的效果尤为明显。当伴侣蛋白Prefoldin与淀粉酶PFA共同表达时，破碎后上清液中PFA的比活较对照(PFA)有大幅度的提高，较同时表达伴侣蛋白Hsp60相比也提高了3倍以上。
图1B中的SDS-PAGE电泳结果也可以看出共表达Prefoldin与PFA后，菌体破碎后离心上清样品(7泳道)与其他样品及对照(3，5，9泳道)相比，PFA条带有较明显增加。
本实验重复了三次，所得结果趋势均一致，表明Prefoldin能够明显提高极端耐热淀粉酶PFA的可溶性表达水平。
实施例2、Prefoldin表达量的提高对重组PFA可溶性表达的影响
鉴于来源于极端嗜热古菌P.furiosus的分子伴侣蛋白Prefoldin的共同表达能够明显提高极端耐热淀粉酶PFA可溶性表达水平，本发明人期望了解当进一步增加伴侣蛋白Prefoldin的胞内表达水平时是否可以进一步的提高重组极端耐热淀粉酶PFA的可溶性表达水平。
在实施例1中伴侣蛋白Prefoldin所用的表达载体是pACYC。本发明人将伴侣蛋白Prefoldin的编码序列克隆至pCDF质粒，并与重组淀粉酶PFA表达质粒共转化于表达菌株。将菌株从-80℃冻存的甘油管中取出后，接种于3ml具有相应抗性的LB培养基中，37℃250rpm摇床过夜培养。按1％的接种量转接过夜培养的菌液于200ml含有相应抗性的LB培养基中37℃培养2-3小时，至OD600约为0.5-0.6时，加入IPTG进行诱导(IPTG终浓度为0.1mM)，继续培养37℃4小时。离心收集菌体，经超声波破碎后离心收获上清，测定重组PFA的可溶性表达情况。结果发现，pCDF-Prefoldin与重组PFA共表达菌株中Prefoldin的表达量有近2-4倍左右的提高。
如图2A中所示，pCDF-Prefoldin与淀粉酶PFA质粒共同表达的菌株培养破碎上清液中，PFA的酶活力较pACYC-Prefoldin与PFA共同表达的菌株中重组极端耐热淀粉酶PFA又有了近3倍以上的大幅度的提高。表明伴侣蛋白Prefoldin表达量的增加进一步提高了重组极端耐热淀粉酶PFA的可溶性表达水平。图2B中SDS-PAGE结果也显示，Prefoldin表达增加后，可溶性表达的重组淀粉酶PFA条带也有了大幅度的增加(泳道8，与泳道2及泳道5相比较)。
上述实验重复三次，结果均一致。
实施例3、共同表达极端耐热淀粉酶PFA与Prefoldin
本发明人进一步将极端耐热淀粉酶PFA编码基因与极端嗜热古菌P.furiosus分子伴侣蛋白Prefoldin的编码基因克隆在同一个质粒中，以实现PFA与Prefoldin基因拷贝数为1：1的共同表达。分别在pACYCDuet-1与pCDFDuet-1两个表达载体中同时共同表达极端耐热淀粉酶PFA与Prefoldin。
实验结果如图3。实验结果显示，无论是在pACYC还是pCDF载体中，在同一质粒中同时表达极端耐热淀粉酶PFA与Prefoldin时，可溶性表达的PFA表达水平均又有一定幅度的明显提高。在同一质粒中同时表达分子伴侣蛋白与重组PFA一方面提高了重组PFA的可溶性表达水平，另一方面也大大简化与方便了重组PFA可溶性表达的菌株构建，进一步为重组PFA的未来规模化生产提供了便利。
结论
本文发现了一种可以显著提高重组极端耐热α-淀粉酶PFA的可溶性表达的方法。通过在重组PFA表达菌中共同表达极端嗜热古菌P.furiosus的分子伴侣蛋白Prefoldin，使得原本主要以不溶性的包涵体形式表达的重组极端耐热α-淀粉酶PFA能够有近50％以上以可溶性的形式得以表达(图2B)。实验中发现，来源于极端嗜热古细菌P.furiosus的Prefoldin能够显著促进来源于极端嗜热古细菌P.furiosus的极端耐热α-淀粉酶的可溶性表达。该方法简便易行，且适宜于极端耐热α-淀粉酶的工业化较大规模的制备与应用。为未来重组极端耐热α-淀粉酶的工业化应用提供了有力的支持。本方法对于其他重组蛋白质与重组工业酶的可溶性表达亦具有重要的借鉴意义。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种重组表达极端耐热α-淀粉酶的方法，其特征在于，所述方法包括：将极端耐热α-淀粉酶的编码基因与分子伴侣蛋白Prefoldin的编码基因共同表达，获得可溶性的极端耐热α-淀粉酶；其中，所述的极端耐热α-淀粉酶是极端耐热α-淀粉酶PFA。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的极端耐热α-淀粉酶的编码基因与分子伴侣蛋白Prefoldin的编码基因在大肠杆菌细胞中共同表达。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的共同表达的方法包括：
(1)提供表达载体，所述的表达载体含有极端耐热α-淀粉酶的表达盒和分子伴侣蛋白Prefoldin的表达盒；
(2)将(1)的表达载体转化大肠杆菌细胞，培养转化有所述表达载体的重组大肠杆菌细胞，获得可溶性的极端耐热α-淀粉酶。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的含有极端耐热α-淀粉酶的表达盒和分子伴侣蛋白Prefoldin的表达盒分别位于不同的表达载体中。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的含有极端耐热α-淀粉酶的表达盒和分子伴侣蛋白Prefoldin的表达盒位于同一表达载体中。
6.分子伴侣蛋白Prefoldin的用途，用于与重组极端耐热α-淀粉酶共同表达，促进重组极端耐热α-淀粉酶可溶性表达。
7.重组的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞中含有极端耐热α-淀粉酶的表达盒和分子伴侣蛋白Prefoldin的表达盒；其中，所述的极端耐热α-淀粉酶是极端耐热α-淀粉酶PFA。
8.一种重组表达极端耐热α-淀粉酶的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：
表达载体，所述的表达载体含有极端耐热α-淀粉酶的表达盒和分子伴侣蛋白Prefoldin的表达盒；其中，所述的极端耐热α-淀粉酶是极端耐热α-淀粉酶PFA。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的表达载体包括：pT7473，pACYC或pCDF。
10.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括：大肠杆菌细胞。
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