CN117603900B

CN117603900B - 基因工程菌及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN117603900B
Application number: CN202410080005.3A
Authority: CN
Inventors: 于慧敏; 魏宇文; 王苗苗; 陈博
Original assignee: Beijing Yanwei Technology Co ltd; Tsinghua University
Current assignee: Beijing Yanwei Technology Co ltd; Tsinghua University
Priority date: 2024-01-19
Filing date: 2024-01-19
Publication date: 2024-04-30
Anticipated expiration: 2044-01-19
Also published as: CN117603900A

Abstract

本申请属于生物技术和生物化工领域，具体涉及到基因工程菌及其构建方法和应用。本申请提供外源表达目标蛋白以及氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的第一分子伴侣或/和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的第二分子伴侣。相对于传统技术，本申请实施例的有益效果包括：本申请的发明人基于前期的基因文库挖掘，发现了能够提高多种低可溶表达目标蛋白在原核宿主中可溶表达的古菌分子伴侣热聚体，其能够用于原核宿主外源表达，提高目标蛋白可溶表达和活性，亦能在无细胞合成系统中提高目标酶活性和稳定性的应用。

Description

基因工程菌及其构建方法和应用

技术领域

本申请属于生物技术和生物化工领域，具体涉及到基因工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

大肠杆菌等常用原核宿主由于其培养方式简单、繁殖速度快、遗传背景清晰以及基因操作及蛋白表达工具丰富，被广泛应用于蛋白的异源表达，在生物催化和生物合成领域有重要的应用。例如，功能酶和蛋白的生产、作为全细胞催化剂用于化合物的生物合成、作为表达体系高通量合成和测试人工设计的蛋白等。以上领域均依赖于异源蛋白在原核宿主中以具有天然结构的可溶形式高效表达，然而受制于原核宿主自身的蛋白合成与折叠系统，许多蛋白表达时会形成无活性的包涵体，这限制了原核宿主蛋白表达系统在工业上的应用，原因大多是外源表达的蛋白在原核宿主中未能进行正确的折叠，从而影响了其结构与功能。对于这一问题，亟待提出新的解决方法。

发明内容

基于此，本申请一实施例涉及一种基因工程菌及其构建方法和应用。

在本申请实施例的第一方面，提供一种基因工程菌，其外源表达：

（a）分子伴侣，所述分子伴侣包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的第一分子伴侣或/和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的第二分子伴侣；以及，

（b）目标蛋白。

在本申请的一些实施方式中，编码所述第一分子伴侣的第一核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，或者与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列具有至少90%的同源性。

在本申请的一些实施方式中，编码所述第二分子伴侣的第二核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，或者与SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列具有至少90%的同源性。

在本申请的一些实施方式中，所述目标蛋白包括功能蛋白。

在本申请的一些实施方式中，所述功能蛋白包括酶。

在本申请的一些实施方式中，所述酶包括转氨酶、荧光素酶、脂肪酶和乙醛脱氢酶中的一种或者多种。

在本申请的一些实施方式中，所述基因工程菌包括细菌。

在本申请的一些实施方式中，所述细菌包括大肠杆菌、红色红球菌、谷氨酸棒状杆菌或者枯草芽孢杆菌。

在本申请的一些实施方式中，所述基因工程菌非融合表达所述分子伴侣以及所述目标蛋白。

在本申请的一些实施方式中，所述基因工程菌融合表达所述分子伴侣以及所述目标蛋白。

在本申请的一些实施方式中，所述分子伴侣以及所述目标蛋白的连接片段包括酶切位点。

在本申请实施例的第二方面，提供一种第一方面中所述的基因工程菌的构建方法，其包括在宿主中导入编码所述分子伴侣的核酸分子和编码所述目标蛋白的核酸分子构建所述基因工程菌。

在本申请实施例的第三方面，提供一种目标蛋白的生产方法，其包括如下步骤：培养第一方面中所述的基因工程菌；以及，从所得培养物中分离所述目标蛋白。

在本申请的一些实施方式中，培养的过程中添加诱导剂。

在本申请的一些实施方式中，从所得培养物中分离所述目标蛋白的步骤包括：使用蛋白酶在所述酶切位点进行切割，以及，从所得酶切产物中分离所述目标蛋白。

在本申请的一些实施方式中，所述蛋白酶包括凝血酶。

在本申请实施例的第四方面，提供一种目标蛋白的生产方法，其包括如下步骤：在无细胞蛋白合成体系中，采用分子伴侣合成目标蛋白；所述分子伴侣和所述目标蛋白如第一方面中定义。

在本申请的一些实施方式中，所述无细胞蛋白合成体系包含ATP。

相对于传统技术，本申请实施例的有益效果包括：

本申请的发明人基于前期的基因文库挖掘，发现了能够提高多种低可溶表达目标蛋白在原核宿主中可溶表达的古菌分子伴侣热聚体，其能够用于原核宿主外源表达，提高目标蛋白可溶表达和活性，亦能在无细胞合成系统中提高目标酶活性和稳定性的应用。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案、更完整地理解本申请及其有益效果，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为古菌热聚体Tms14-13提高目标蛋白可溶表达、酶活及稳定性应用方案示意图；

图2为古菌热聚体表达载体pACYCDuet-Tms14-Tms13的质粒图谱；

图3为目标蛋白表达载体pET28a-Fluc的质粒图谱；

图4为目标蛋白RbTA与古菌热聚体融合表达载体pET28a-Tms14-linker-RbTA的质粒图谱；

图5为目标蛋白CalB与古菌热聚体融合表达载体pET28a-Tms14-linker-CalB的质粒图谱；

图6为目标蛋白ALDH2与古菌热聚体融合表达载体pET28a-Tms14-linker-ALDH2的质粒图谱；

图7为共表达古菌热聚体时荧光素酶活性的变化；

图8为目标酶与古菌热聚体Tms14融合蛋白的表达及可溶性情况；

图9为无细胞体系中古菌热聚体提高荧光素酶活性及稳定性的实验结果；

图10为目标蛋白Fluc与古菌热聚体融合表达载体pET28a-Tms14-linker-Fluc的质粒图谱；

图11为古菌热聚体表达载体pACYCDuet-Tms14的质粒图谱；

图12为古菌热聚体表达载体pACYCDuet-Tms13的质粒图谱。

具体实施方式

下面结合附图、实施方式和实施例，对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本申请公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本申请更为充分地理解，应理解，本申请可以无需一个或多个这些细节而得以实施。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述实施方式和实施例的目的，不是旨在于限制本申请。

术语

除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：

本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项（也即均用“逻辑或”连接的技术方案），也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合（也即均用“逻辑与”连接的技术方案）。

本申请中涉及“多个”、“多种”、“多次”、“多元”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。

本文中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。

本文中，“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”，以能够实施本申请的技术方案、解决本申请的技术问题、实现本申请预期的技术效果为准。

本文中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本申请保护范围的限制。

本申请中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本申请保护范围的限制。

本申请中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。

本申请中，“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“第四方面”等中，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。

本申请中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。

本申请中，涉及到数值区间（也即数值范围），如无特别说明，可选的数值分布在上述数值区间内视为连续，且包括该数值范围的两个数值端点（即最小值及最大值），以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数，在本文中，相当于直接列举了每一个整数，比如t为选自1~10的整数，表示t为选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的整数组的任一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并这些范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。

本申请中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内存在变动。应当理解的是，所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。允许在如±5℃、±4℃、±3℃、±2℃、±1℃的范围内波动。

本申请中，%(w/w)与wt%均表示重量百分比，%(v/v)指体积百分比，%(w/v)指质量体积百分数。

在本申请提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非和本申请的申请目的和/或技术方案相冲突，否则，本申请涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。本申请中涉及引用文献时，相关技术特征、术语、名词、短语等在引用文献中的定义也一并被引用。本申请中涉及引用文献时，被引用的相关技术特征的举例、优选方式也可作为参考纳入本申请中，但以能够实施本申请为限。应当理解，当引用内容与本申请中的描述相冲突时，以本申请为准或者适应性地根据本申请的描述进行修正。

针对外源表达的蛋白在原核宿主中未能进行正确的折叠从而影响了其结构与功能这一问题，目前已提出了多种解决方法，包括：培养条件优化、密码子优化、尝试不同的蛋白表达体系、分子伴侣共表达、融合促溶标签等。目前最常用的解决方法是分子伴侣的共表达和融合表达策略。已被研究普遍证实，分子伴侣或称伴侣蛋白参与蛋白质的折叠过程，强化大肠杆菌的分子伴侣网络可以促进目标蛋白的可溶表达。有许多研究者通过共表达大肠杆菌的主要分子伴侣系统GroEL/ES和DnaK-DnaJ-GrpE，来提高重组人干扰素、α-糖基转移酶、亚油酸异构酶等异源目标酶的可溶表达（EP885967A2、CN108865962A、CN107988195A）。目前TAKARA等企业也已经推出了共表达大肠杆菌内源分子伴侣系统的商品化质粒pGro系列、pKJE系列和pTF系列。此外，也有研究验证了来自其他宿主的分子伴侣在促进目标蛋白活性和稳定性方面的应用可能性（Xu C. et al., Molecules, 2020, 25(4): 1002）。融合表达方面，许多研究尝试在目标蛋白氮端连接一个功能性短肽，从而提高目标蛋白的可溶产率。根据功能这些标签可以分为4类：1）带净电荷短肽阻止蛋白聚集，如SET标签等；2）快速折叠结构域促进蛋白初始折叠，如SUMO标签等；3）类分子伴侣活性蛋白，如MBP和NusA标签；4）分子伴侣标签。已有许多案例利用上述增溶标签实现异源蛋白在大肠杆菌中的高效可溶表达，但标签对不同蛋白的促溶效果各异，难以找到一个普适的标签用于多种目标的蛋白的可溶表达。

分子伴侣作为一类细胞内维持蛋白质稳态、辅助胞内蛋白折叠并阻止蛋白在各类胁迫下变性失活的天然分子元件，由于其优异的物理化学特性和生理性能，在提高目标酶活性、促进目标蛋白可溶表达、以及提高目标蛋白的稳定性方面有着重要的应用。古菌作为生物中三界之一，广泛分布在高温、高盐、酸碱等极端环境中，且具有较为独特的各类分子元件。其中的极端嗜热古菌可以在高达90℃的热泉环境中生存（J. Elkins et al. PNAS,2008, 105: 8102-07），其分子伴侣系统在具备其天然活性的同时还兼具高热稳定性。

热聚体（Thermosome）是古菌中特有的一类HSP60家族分子伴侣，主要由分子量60kDa左右的α亚基、β亚基构成。其中：在通常的温度下α亚基、β亚基交替组成十六聚体，形成中央的空腔用来容纳和折叠目标蛋白；在高温条件下，β亚基也能够自身组装形成十八聚体笼状结构独立发挥作用。当目标蛋白失活时，由热聚体α亚基、β亚基组成的折叠系统可以广泛地识别并重折叠蛋白使之恢复活性。此外，由于热聚体每个亚基自身均具有目标蛋白识别区域，可以识别并结合受热等条件下目标蛋白失活而暴露出来的疏水区域，因此单个亚基也体现出一定的分子伴侣活性。

利用古菌热聚体整体和亚基单独的辅助折叠活性，开发胞内表达和无细胞体系中促进目标蛋白可溶表达、提高酶活和稳定性的方法。相比于以上利用商业化分子伴侣或促溶标签提高可溶表达的方法，古菌热聚体共表达或融合表达有明显优势：1）古菌热聚体融合促进可溶表达可以更广泛地适用于多种目标蛋白；2）优化后的古菌热聚体共表达方案可以应用于多种不同原核宿主；3）古菌热聚体自身的高稳定性可以提高目标蛋白的稳定性；4）古菌热聚体的表达有利于蛋白表达宿主细胞的生长和热耐受性。此外，上述古菌热聚体还可应用于无细胞合成体系中，提高目标蛋白的活力和稳定性。

本申请实施例的第一方面

本申请实施例提供一种基因工程菌，其外源表达：

（b）目标蛋白。

在其中一个示例中，编码所述第一分子伴侣的第一核酸分子的核苷酸序列如SEQID NO.3所示，或者与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列具有至少90%的同源性（例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%）。

在其中一个示例中，编码所述第二分子伴侣的第二核酸分子的核苷酸序列如SEQID NO.4所示，或者与SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列具有至少90%的同源性（例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%）。

本申请对目标蛋白的种类不做特别限定，可以根据需要选择表达合适的目标蛋白的基因工程菌。例如，所述目标蛋白包括功能蛋白。所述功能蛋白例如为酶、运输蛋白、免疫蛋白、调节蛋白。本申请对所述酶的种类不做特别限定，例如转氨酶、荧光素酶、脂肪酶和乙醛脱氢酶，包括但不限于：Photinus pyralis的荧光素酶（Conti, E. et al., Structure,1996, 4: 287-298）、来源于Candida Antarctica的脂肪酶（Uppenberg, J. et al.,Structure, 1994, 2: 293-308）、来源于Homo sapiens的线粒体乙醛脱氢酶（Buchman C.et al., J. Med. Chem., 2017, 60: 2439-2455）和来源于Rhodobacter sp. 140A的转氨酶（Li, F. et al., Adv. Synth. Catal., 2021, 363(19): 4582-4589.）。

本申请对基因工程菌的种类不做特别限定，例如可以是原核表达的细菌，例如为大肠杆菌、红色红球菌、谷氨酸棒状杆菌或者枯草芽孢杆菌，包括但不限于：Escherichiacoli B系列菌株、红色红球菌Rhodococcus ruber TH、谷氨酸棒状杆菌Corynebacteriumglutamicum、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis THY-7，可选地为E. coli BL21(DE3)。

在其中一个示例中，所述基因工程菌非融合表达所述分子伴侣以及所述目标蛋白。

在其中一个示例中，所述基因工程菌融合表达所述分子伴侣以及所述目标蛋白。

“融合表达”指将一个基因与另一基因构建成融合基因进行表达，可使克隆化基因表达为融合蛋白的一部分，该融合蛋白包括位于氨基端或羧基端的标签蛋白、能被蛋白酶等裂解的序列以及目的蛋白。

“非融合表达”与融合表达相对，是指目的蛋白不与任何蛋白标签进行融合表达，但这种表达方式表达出的蛋白在某些情况下不能进行正确的折叠而失去生物活性，需要与分子伴侣等蛋白共同表达才能得到具有活性的可溶蛋白。

在其中一个示例中，所述分子伴侣以及所述目标蛋白的连接片段包括酶切位点。该酶切位点经蛋白酶切开后，分子伴侣和目标蛋白的片段分开，便于对目标蛋白的分离纯化。应当理解的是，本申请对连接片段的序列不做特别限定，例如包括凝血酶的酶切位点。

本申请实施例的第二方面

本申请实施例提供一种第一方面中所述的基因工程菌的构建方法，其包括在宿主中导入编码所述分子伴侣的核酸分子和编码所述目标蛋白的核酸分子构建所述基因工程菌。

在其中一个示例中，可以通过如下步骤构建基因工程菌：1、对目标蛋白和分子伴侣的基因进行密码子优化，合成了优化后的DNA片段；2、设计引物，经过PCR扩增和Gibson连接，构建目标蛋白表达载体和分子伴侣表达载体；3、转化目标宿主，挑取成功构建的菌落进行诱导发酵；4、如需获得蛋白纯品，发酵后的菌体进行破碎，获得含有可溶表达目标蛋白的细胞破碎液；5、蛋白纯化得到目标蛋白纯品。采用该步骤构建基因工程菌的过程中，分子伴侣的表达载体可以选用但不限于pACYCDuet1，目标蛋白表达载体可以选用但不限于Novagen公司的pET系列，可选地为pET-28a(+)。

在其中一个示例中，可以通过如下步骤构建基因工程菌：1、对目标蛋白和分子伴侣的基因进行密码子优化，合成了优化后的DNA片段；2、设计引物，对目标蛋白和分子伴侣分别进行PCR扩增，并与质粒骨架进行Gibson连接，构建目标蛋白-分子伴侣融合表达的表达载体；3、转化目标宿主，挑取成功构建的菌落进行诱导发酵；4、如需获得蛋白纯品，发酵后的菌体进行破碎，获得含有可溶表达目标蛋白的细胞破碎液；5、细胞破碎液使用凝血酶进行酶切，蛋白纯化得到目标蛋白纯品。采用该步骤构建基因工程菌的过程中，可以构建N端连接的分子伴侣-POI或C端连接的POI-分子伴侣，中间使用含有酶切位点的连接片段连接，可选地为含凝血酶酶切位点的GS3柔性接头。融合表达的表达载体可以选用但不限于Novagen公司的pET系列，可选地为pET-28a(+)。

本申请实施例的第三方面

本申请实施例提供一种目标蛋白的生产方法，其包括如下步骤：培养第一方面中所述的基因工程菌；以及，从所得培养物中分离所述目标蛋白。

在其中一个示例中，培养的过程中添加诱导剂。

在其中一个示例中，从所得培养物中分离所述目标蛋白的步骤包括：使用蛋白酶在所述酶切位点进行切割，以及，从所得酶切产物中分离所述目标蛋白。

在其中一个示例中，所述蛋白酶包括凝血酶。

本申请实施例可以通过如下步骤生产目标蛋白：1、将种子液接种到发酵培养基中，一阶段培养到达生长的对数中期；2、加入诱导剂进行蛋白生产，最终得到含有可溶性目标蛋白的发酵液；进一步可进入下游分离纯化。

可选地，一阶段培养的条件包括：在35-40℃（例如为35、36、37、38、39、40℃）、转速170-220rpm（例如为170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220rpm）的条件下培养2-5h（例如为2、2.5、3、3.5、4、4.5、5h）。

可选地，蛋白生产的条件包括：加入终浓度0.1-1mM（例如为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1 mM）的诱导剂IPTG，在16-37℃（例如为16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37℃）、转速170-220rpm（例如为170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220rpm）的条件下培养12-24h（例如为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24h）。

可选地，所述发酵培养基的组成为：NaCl 8-12g/L（例如为8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12g/L）、有机氮源8-12g/L（例如为8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12g/L）、酵母粉3-7g/L（例如为3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7g/L）以及水，pH6.5-7.5（例如为6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5）。

可选地，所述的种子液的以初始OD₆₀₀=0.02（接种后的OD₆₀₀）接种至所述发酵培养基中。

可选地，所述种子液的制备步骤：将所述基因工程菌从划线平板或甘油管中接种到种子培养基，过夜培养（在35-39℃、180-220rpm条件下培养8-15h），制备种子液。进一步可选地，所述种子培养基包括含卡那霉素和氯霉素的LB液体培养基。

本申请实施例的第四方面

本申请实施例提供一种目标蛋白的生产方法，其包括如下步骤：在无细胞蛋白合成体系中，采用分子伴侣合成目标蛋白；所述分子伴侣和所述目标蛋白如第一方面中定义。

下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本申请中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。

下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。

所用pET和pACYCDuet系列质粒购买于Novagen公司，构建用的基因片段合成于华大青兰生物科技有限公司、引物片段合成于苏州金唯智生物技术有限公司。

实施例1、用于过表达各种古菌热聚体基因的pET28a-Tms质粒的构建

将古菌热聚体的氨基酸序列对Escherichia coli K-12进行双宿主密码子优化后，在5’端添加NcoI酶切位点、3’端添加XhoI酶切位点后进行全基因合成。表达载体pET-28a(+)的质粒骨架使用NcoI和XhoI在37℃下酶切0.5-2h，之后通过琼脂糖凝胶电泳分离，并利用OMEGA bio-tek的Gel Extraction Kit试剂盒进行DNA片段纯化。酶切纯化后的质粒骨架和合成的古菌热聚体基因通过T4 DNA连接酶在16℃连接12h后，将连接产物转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞（来自Transgene公司），涂布于含卡那霉素的LB固体培养基，倒置于37℃过夜培养。挑取平板上长出来的抗性克隆进行培养，提取质粒并测序验证（委托Azenta公司），得到用于基因过表达的质粒pET28a-Tms。质粒提取使用OMEGA公司的Plasmid Extraction Kit试剂盒进行。

LB固体培养基组成为：琼脂粉15g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母粉5g/L，水。

本实施例中，所选用的古菌热聚体为基于Candidatus Korarchaeum cryptofilumOPF8的热聚体或HSP60分子伴侣进行设计后的分子元件，根据亚基的不同命名为Tms13和Tms14，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。

本实施例中，所选用的古菌热聚体对常用的4种原核表达宿主（大肠杆菌、红色红球菌、谷氨酸棒状杆菌和枯草芽孢杆菌）进行了密码子优化，其基因序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。

SEQ ID NO.1：

MASAGEVSGGAIPVLILKEGTSRTRGREALRLNITVAKAIADTIRTSLSPKGMQKMLVDPFGDVIITHDGATIMKEIEVEHPTAKMMVDLAKSQEQEAGDGTTTVVLLAGELLSKAEDLLDLGIHPTVIISGYRKAAEKAIEYLNEIAMRVDWKDKELLKKIAKIAMGSKSIRVAQDYLADLVVDAALQVVEERDGRRIVDLENIKLEKKEGGSLFDTKLIRGIVVDKEVVHPRMPKRVEKARIALIESALEIKKPEISSKIRVTSPAQVKDFLDQEKQMLAELVEKIAAAGANVVFCQKGIDDVAQHFLAKHGILAVRRVRKSDMEKLAKATGAKIVVNVKEISEKDLGFAELVEERRVGEDKMVFVEGCKDPRAVSILIRGGEKQVIDEAERNLHDALSVVRNVIEDGKIVVGAGAAWMDLVLKLRNYSVQLSGKEQNVVEKFAEALESIPKTLIENAGHDPIIKLAELRKAHAEGKKEYGFNIYTGEVEDMYRRDIIEPERVLRRAIESAAEFATTILKIDDIIAAAGKKFEPGKGKGEKSESD。

SEQ ID NO.2：

MALATVGGRPVLILKEGTTRTRGDEARRINIMAARAIADAVKTTLGPKGMDKMIVDSIGDITVSNDGATILQEMEVAHPAAKLMVNLAKAQDKEVGDGTTTSVVLAGELLTEAESLLQKDIHPTVIVEGYEKALKFVEQELEKLAIKVNPDDEGWLMKVAETAMSSKLVSGEKRKLAEIAVKAVKAVEEMKGDKRYVDIDNVKIVKKKGKSLAETEFVKGIILDKEVVHGDMPKSVKNARIAILNVPLEIKKPEIDMEVQISSPQELREFIEQETKILREKVEKIHSVGANVVFCQKGIDEVAQHFLAKYGIMAVRRVSEKDMQRLEKATGGKIVNNLDDLTENELGRAGLVEERKIGDDKMIFIEECENPRAVTILLRAGADTILDEAERGLKDALYVIRNVVEDGKVFHGGGSIQEELAIRLREYAHSEKGKEQLAMEAFANALESIPRILAENAGMDAVDAIVELRNAHKSGKISAGIDVLNGKVGDMAELGVVDTYRGVKNAIAAATETAILIIKTDDIIAAKPYEEKGKEKGKGGEEEEGGGEFKSEFD。

SEQ ID NO.3：

ATGGTCATGGCCTCGGCAGGTGAGGTCAGCGGTGGTGCCATCCCGGTCCTGATCCTGAAGGAGGGCACCTCGCGCACCCGCGGACGCGAAGCACTGCGTCTGAACATCACCGTCGCCAAGGCCATCGCCGATACCATCCGCACCAGCCTGTCGCCGAAGGGCATGCAGAAGATGCTGGTCGACCCGTTCGGCGATGTCATCATCACCCACGACGGCGCCACCATCATGAAGGAAATCGAGGTGGAACACCCGACCGCCAAAATGATGGTGGACCTGGCAAAAAGCCAGGAGCAGGAAGCCGGAGATGGAACCACCACCGTGGTCCTGCTGGCCGGCGAGCTGCTGAGCAAGGCAGAGGACCTGCTGGATCTGGGAATCCACCCGACCGTGATCATCAGCGGTTACCGCAAGGCCGCAGAAAAAGCAATCGAGTACCTGAACGAGATCGCCATGCGCGTCGACTGGAAGGACAAGGAGCTGCTGAAAAAGATCGCAAAGATCGCGATGGGCAGCAAATCGATCCGCGTCGCCCAGGATTACCTGGCCGATCTGGTCGTCGATGCAGCCCTGCAGGTGGTCGAAGAACGCGATGGACGCCGCATCGTCGACCTGGAGAATATCAAGCTGGAGAAGAAGGAGGGTGGTAGCCTGTTCGACACCAAGCTGATCCGCGGCATCGTCGTCGACAAGGAGGTGGTCCATCCGCGCATGCCGAAGCGTGTCGAAAAAGCCCGTATCGCCCTGATCGAGAGCGCCCTGGAGATCAAAAAGCCGGAGATCAGCAGCAAGATCCGTGTGACCTCGCCGGCACAGGTCAAAGACTTCCTGGATCAGGAGAAGCAGATGCTGGCAGAGCTGGTCGAGAAAATCGCAGCCGCCGGAGCAAACGTCGTGTTCTGCCAGAAAGGCATCGATGACGTCGCCCAGCACTTCCTGGCCAAGCACGGCATCCTGGCCGTCCGTCGCGTCCGCAAAAGCGACATGGAGAAGCTGGCCAAAGCCACCGGCGCTAAGATCGTGGTGAACGTCAAGGAGATCAGCGAGAAGGACCTGGGCTTCGCCGAACTGGTCGAAGAGCGCCGCGTCGGAGAAGACAAGATGGTCTTCGTGGAGGGCTGCAAAGATCCGCGTGCCGTGAGCATCCTGATCCGCGGCGGTGAAAAGCAGGTCATCGATGAGGCCGAGCGCAATCTGCATGACGCCCTGTCGGTCGTGCGCAACGTGATCGAGGACGGTAAGATCGTGGTCGGAGCTGGAGCTGCCTGGATGGATCTGGTCCTGAAGCTGCGCAACTACAGCGTCCAGCTGAGCGGCAAAGAACAGAACGTGGTCGAAAAGTTCGCCGAGGCCCTGGAATCGATCCCGAAGACCCTGATCGAAAACGCTGGCCACGACCCGATCATCAAACTGGCCGAGCTGCGCAAAGCCCATGCCGAAGGCAAAAAGGAGTACGGCTTCAACATCTACACCGGCGAGGTGGAGGATATGTACCGTCGTGATATCATCGAACCGGAGCGCGTCCTGCGCCGCGCCATCGAGTCGGCTGCCGAGTTCGCCACCACCATCCTGAAGATCGACGACATCATCGCCGCCGCCGGTAAGAAATTCGAACCGGGCAAGGGCAAGGGCGAAAAAAGCGAAAGCGACTGA。

SEQ ID NO.4：

ATGGTCATGGCACTGGCTACCGTCGGAGGACGCCCGGTCCTGATCCTGAAGGAGGGTACCACCCGCACCCGCGGAGATGAAGCCCGCCGCATCAATATCATGGCCGCCCGCGCAATCGCTGATGCCGTGAAAACCACCCTGGGCCCGAAGGGCATGGATAAAATGATCGTCGACAGCATCGGCGACATCACCGTGAGTAATGACGGAGCCACCATCCTGCAGGAAATGGAGGTCGCTCATCCGGCCGCCAAGCTGATGGTCAATCTGGCCAAGGCACAGGACAAGGAAGTCGGGGACGGTACCACCACCAGTGTGGTCCTGGCCGGTGAACTGCTGACCGAAGCCGAGAGTCTGCTGCAGAAGGACATCCACCCGACCGTGATCGTCGAGGGCTACGAGAAGGCACTGAAGTTCGTCGAGCAGGAGCTGGAGAAGCTGGCCATCAAGGTCAACCCGGACGATGAGGGCTGGCTGATGAAAGTCGCCGAGACCGCCATGAGCAGTAAACTGGTCAGCGGCGAAAAGCGCAAGCTGGCCGAAATCGCCGTGAAAGCCGTCAAAGCCGTCGAGGAAATGAAGGGCGATAAACGCTACGTCGACATCGACAACGTGAAAATCGTGAAGAAGAAGGGCAAAAGCCTGGCCGAGACCGAATTCGTCAAGGGCATCATCCTGGATAAGGAGGTCGTCCACGGCGATATGCCGAAGAGCGTGAAGAACGCACGTATCGCCATCCTGAACGTCCCGCTGGAGATCAAGAAGCCGGAGATCGACATGGAAGTCCAGATCAGCAGCCCGCAGGAACTGCGCGAGTTCATCGAGCAGGAAACCAAAATCCTGCGCGAGAAGGTGGAGAAGATCCACAGCGTCGGCGCCAACGTCGTCTTCTGCCAGAAAGGTATCGACGAGGTCGCCCAGCACTTCCTGGCAAAGTATGGCATCATGGCCGTCCGCCGCGTGAGTGAGAAAGATATGCAGCGCCTGGAGAAAGCAACCGGTGGCAAAATCGTGAACAACCTGGACGACCTGACCGAAAACGAACTGGGCCGCGCCGGACTGGTCGAAGAACGCAAGATCGGCGATGACAAGATGATCTTCATCGAGGAGTGCGAGAACCCGCGTGCCGTGACCATCCTGCTGCGTGCCGGAGCCGACACCATCCTGGACGAGGCAGAGCGCGGCCTGAAAGATGCACTGTACGTCATCCGCAACGTCGTCGAAGACGGCAAAGTCTTCCATGGTGGCGGCAGCATCCAAGAGGAACTGGCAATCCGTCTGCGTGAGTACGCCCATAGCGAGAAAGGCAAGGAACAGCTGGCGATGGAAGCATTCGCCAACGCCCTGGAAAGCATCCCGCGCATCCTGGCAGAAAATGCCGGCATGGACGCCGTGGACGCAATCGTCGAGCTGCGTAATGCCCATAAGAGCGGTAAGATCAGCGCCGGCATCGATGTCCTGAATGGCAAGGTGGGCGACATGGCCGAACTGGGCGTGGTCGATACCTATCGTGGTGTGAAAAACGCCATCGCCGCCGCAACCGAAACCGCAATCCTGATCATCAAGACCGATGACATCATCGCCGCAAAGCCGTACGAGGAGAAAGGCAAGGAAAAGGGTAAGGGCGGCGAAGAAGAAGAAGGAGGCGGCGAATTCAAAAGCGAGTTCGACTGA。

实施例2、古菌热聚体共表达载体pACYCDuet-Tms14-Tms13的构建

以提取得到的pET28a-Tms14质粒作为模板，使用上下游引物Tms14-pCYC-G1和Tms14-pACYC-G2进行PCR扩增，得到NcoI-Tms14-BamH1片段，通过上述方法进行DNA片段纯化。合成得到的引物为干粉状态，需加入无菌水稀释至10μM备用。

PCR扩增所用DNA聚合酶、缓冲液和限制性内切酶均购自TAKARA公司。PCR扩增体系为：模板1μL，正向引物2μL，反向引物2μL，2×Phanta Mix 25μL，以及，ddH₂O 20μL。PCR循环条件为：95℃ 5min；95℃ 15sec，56℃15sec，34 cycle；72℃ 2min；72℃ 5min；4℃forever。

另外，将购买得到的pACYCDuet-1质粒干粉用无菌水溶解并稀释到100ng/μL。将质粒骨架用NcoI和BamHI进双酶切，电泳分离并纯化回收酶切后的骨架DNA片段。将纯化后的NcoI-Tms14-BamH1片段和pACYCDuet-1酶切后的骨架按摩尔比4：1混合，使用Gibson连接试剂盒（Clone Smarter Technologies）在50℃条件下恒温连接30min。将上述Gibson连接产物取10μL，热激转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞（来自Transgene公司），涂布于含氯霉素10μg/mL的LB平板上，37℃过夜培养长出菌落后，挑取单菌落使用引物pACYC-seq-F和T7-ter进行PCR并电泳验证，选取电泳条带正确的菌落进行测序（委托Azenta公司），得到测序正确的含有质粒pACYCDuet-Tms14的大肠杆菌。

以提取到的pET28a-Tms13质粒作为模板，使用上下游引物Tms13-pCYC2-G1和Tms13-pACYC2-G2进行PCR扩增，得到NdeI-Tms14-XhoI片段并纯化回收。将含有质粒pACYCDuet-Tms14的大肠杆菌进行过夜培养并提取质粒，使用NdeI和XhoI双酶切，电泳分离并纯化回收酶切后的含Tms14骨架DNA片段。按照之前相同的操作将NdeI-Tms14-XhoI片段和pACYCDuet-Tms14酶切后骨架进行Gibson连接后，转化BL21(DE3)，长出菌落验证并测序，得到含有古菌热聚体共表达载体pACYCDuet-Tms14-Tms13的大肠杆菌。构建完成的质粒图谱见附图2。

上述所用引物序列如下：

Tms14-pCYC-G1（SEQ ID NO.5）：

AACTTTAATAAGGAGATATACCATGGCACTGGCTACCGTTG；

Tms14-pCYC-G2（SEQ ID NO.6）：

GAGCTCGAATTCGGATCCTTCAGTCGAACTCGCTTTTGAATTC；

pACYC-seq-F（SEQ ID NO.7）：TCTCCCTTATGCGACTCCTG；

T7-ter（SEQ ID NO.8）：TGCTAGTTATTGCTCAGCGG；

Tms13-pCYC2-G1（SEQ ID NO.9）：

GTTAAGTATAAGAAGGAGATATACATATGGCCAGTGCAGGTGAG；

Tms13-pCYC2-G2（SEQ ID NO.10）：

GTTTCTTTACCAGACTCGAGGGTACCGACGTCAGCGATCTCAGTCGCTTTCGCTTTTTTCGC。

实施例3、古菌热聚体融合表达载体pET28a-Tms14-linker-CalB的构建

以含有脂肪酶CalB表达质粒pET28a-CalB的大肠杆菌BL21(DE3)作为模板，使用上游引物pET28a-G1和下游引物GS3-CalB-G2根据前述流程进行PCR扩增，得到引入凝血酶酶切位点（Thrombin site）的线性化pET28a-CalB骨架。同时利用前述提取的pET28a-Tms14质粒作为模板，使用上游引物RBS-ATG-G1和下游引物Tms14-GS3-G2进行PCR扩增，得到引入GS3接头的热聚体Tms14基因片段。将Tms14基因片段与线性化pET28a-CalB骨架进行电泳分离并纯化回收后，以摩尔比4：1混合，按前述方法进行Gibson连接后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。37℃过夜培养后挑取单菌落进行PCR验证并进行测序，得到含有古菌热聚体融合表达载体pET28a-Tms14-linker-CalB的大肠杆菌。融合表达载体质粒图谱见附图5。上述所用引物序列如下：

pET28a-G1（SEQ ID NO.11）：

CATGGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACAAAATTATTTCTAGAGGG；

GS3-CalB-G2（SEQ ID NO.12）

GGCTCGGGTGGTGGTGGTTCTCTGGTGCCGCGCGGCAGCCTGCCGTCTGGCTCTGAT；

RBS-ATG-G1（SEQ ID NO.13）：

AGGATCCGAATTCGAGCTCTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGTTATG；

Tms14-GS3-G2（SEQ ID NO.14）：

ACCACCACCACCCGAGCCACCACCGCCGGAGCCACCGCCACCGTCGAACTCGCTTTTGAATTCG。

实施例4、萤火虫荧光素酶与古菌热聚体的共表达及酶活表征（结合图1）

将实施例2中得到的古菌热聚体共表达载体pACYCDuet-Tms14-Tms13质粒与含有目标蛋白萤火虫荧光素酶FLuc的表达载体pET28a-FLuc质粒（质粒图谱见附图3）各100ng共同转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含有氯霉素和卡那霉素双重抗性的LB固体平板上过夜培养。待长出菌落后挑取单菌落如前述方法进行PCR验证、测序，测序结果正确的菌落即为可以表达目标蛋白FLuc和古菌热聚体的共表达菌株E.coli BL21(DE3)/FLuc&Tms14-Tms13。

将共表达菌株E.coli BL21(DE3)/FLuc&Tms14-Tms13接种于含卡那霉素和氯霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm条件下培养12h，得到共表达基因工程菌种子液。

按1%（v/v）的比例将种子液接入含有100mL LB液体培养基（含卡那霉素和氯霉素）的摇瓶中，37℃、200rpm条件下培养3h，加入终浓度0.5mM的IPTG，在16℃、200rpm的条件下低温培养16h诱导蛋白表达，得到过表达荧光素酶的大肠杆菌发酵液。

大肠杆菌发酵液中荧光素酶酶活的检测按照Transgene公司的TransDetect^®Single-Luciferase (Firefly) Reporter Assay Kit提供的方法进行。大肠杆菌发酵液离心收获菌体后，使用0.01M PBS缓冲液重悬菌体至所得重悬菌液吸光度OD₆₀₀=4.0。取2mL重悬菌液在冰上进行超声破碎得到释放胞内蛋白的细胞破碎液。在Corning黑色96孔板中将20μL稀释5倍后的破碎液与100μL底物溶液混合后，快速通过酶标仪测定化学发光。测得的化学发光信号即为破碎液中FLuc的酶活力。

胞内共表达古菌热聚体对荧光素酶活性的提升效果见附图7。相对于将Fluc单独在E.coli BL21(DE3)胞内共表达，将Tms13、Tms14单独或Tms14-Tms13同时与FLuc在E.coliBL21(DE3)胞内共表达，测定的荧光素酶酶活分别达到6.59×10⁸、6.85×10⁸和8.18×10⁸U/(OD₆₀₀·mL)。除共表达Tms13效果与对照组相当，共表达Tms14或Tms14-13使酶活分别提高了4.3%和19.4%。酶活力单位（U）定义为在反应测定条件下催化荧光素氧化产生1 RLU荧光所需的酶量。

实施例5、古菌热聚体Tms14与目标酶的融合蛋白表达及可溶性表征（结合图1）

将实施例3中构建的Tms14-CalB融合蛋白表达菌株（转化图5所示的融合表达载体）和以相同方法构建的Tms14-RbTA融合蛋白表达菌株（转化图4所示的融合表达载体）、Tms14-Fluc融合蛋白表达菌株（转化图10所示的融合表达载体）、Tms14-ALDH2融合蛋白表达菌株（转化图6所示的融合表达载体）接种到含50ng/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm条件下培养12h，得到融合表达基因工程菌种子液。

按1%（v/v）的比例将种子液接入含有100mLLB液体培养基（含卡那霉素）的摇瓶中，37℃、200rpm条件下培养3h，加入终浓度0.5mM的IPTG，在16℃、200rpm的条件下低温培养16h诱导融合蛋白表达，得到过表达融合蛋白的大肠杆菌发酵液。

将大肠杆菌发酵液在8000×g下离心10min收获菌体，加入0.01M PBS缓冲液将菌体重悬至所得重悬菌液OD₆₀₀=4.0。取2mL重悬菌液在冰上进行超声破碎得到释放胞内蛋白的细胞破碎液，4℃、13000×g条件下离心20min，得到蛋白上清液与不可溶沉淀物。将上清液取出备用，沉淀用PBS缓冲液洗涤后在加入2mL重悬。上清液和沉淀重悬液分别取40μL加入10μL 5×SDS-PAGE上样缓冲液中，在金属浴中100℃加热煮沸10min。之后各样品进行SDS-PAGE蛋白电泳，得到蛋白表达情况同时通过上清液和沉淀中目标蛋白的比例测定蛋白可溶性。

上述目标酶与Tms14融合蛋白的表达及可溶性情况见附图8，其中S和P的条带分别代表表达产物的可溶和不溶部分。在与古菌热聚体Tms14融合后，转氨酶RbTA、萤火虫荧光素酶FLuc、乙醛脱氢酶ALDH2、脂肪酶CalB的可溶表达量分别提高到165.3、149.1、141.8和173.1mg/L发酵液，可溶比例分别达到71.8%、78.9%、84.6%和93.2%，较融合前提高了22.2%、32.0%、65.6%和78.5%。其中，单独表达时基本完全不可溶的目标酶ALDH2和CalB在Tms14融合后可溶表达量分别提高了1.5倍和6.6倍。

实施例6、含古菌热聚体的细胞抽提物的制备及其在无细胞体系中的效果验证（结合图1）

将实施例2中构建的带有古菌分子伴侣双分子表达载体pACYCDuet-Tms14-Tms13以及通过相同方式构建的古菌分子伴侣单分子表达载体pACYCDuet-Tms14和pACYCDuet-Tms13的大肠杆菌表达菌株和不表达分子伴侣的对照菌株（大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞）单菌落接种到含50ng/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、200rpm条件下过夜培养约12h。之后以1%（v/v）的比例转接到1L的2×YTPG培养中进行37℃、200rpm培养。培养3h达到对数中期时加入终浓度0.5mM IPTG，37℃下继续培养3h诱导伴侣表达。之后收获培养液，离心收集菌体，使用清洗缓冲液冲洗3次，离心去除上清。用裂解缓冲液重悬细胞，通过超声破碎仪以30%功率破碎10min，之后将破碎液4℃、13000×g离心10min，去除细胞器和蛋白沉淀等杂质，得到破碎上清液。

将破碎上清液37℃孵育预处理30min后，装入截留分子量为14kDa的透析袋中，置于透析缓冲液室温过夜透析约12h，得到细胞粗提液。将得到的细胞粗提物在4℃、13000×g下离心10min，得到可用于无细胞蛋白表达的含/不含古菌热聚体分子伴侣的大肠杆菌细胞抽提物。将其分装放入液氮后迅速冷冻，之后置于-80℃冰箱保存。

清洗缓冲液成分为：氯化钾 60mM、醋酸镁 14mM、Tris 10mM、巯基乙醇6mM，pH=8.2。

裂解缓冲液成分为：氯化钾 60mM、醋酸镁14mM、Tris 10mM、DTT 1mM，pH=8.2。

透析缓冲液成分为：氯化钾 60mM、醋酸镁14mM、Tris 10mM、DTT 0.5mM，pH=8.2。

古菌热聚体在无细胞体系中的效果验证：使用大肠杆菌表达的萤火虫荧光素酶FLuc作为验证古菌热聚体在无细胞体系中促进蛋白稳定性的目标蛋白。将通过商业化RTS100 E.coli试剂盒加入FLuc表达载体按照标准流程得到的无细胞体系蛋白表达溶液，在37℃水浴处理20min使蛋白受热部分失活。之后按体积比1：1加入失活处理的FLuc无细胞表达溶液和含有各类热聚体分子伴侣的大肠杆菌细胞抽提物。在加入或不添加5mM ATP的情况下体系在25℃孵育30min，通过前述方法测定体系中荧光素酶的活性。结果显示（见附图9），在不添加ATP的情况下，加入含Tms14、Tms13和Tms14+13的细胞抽提物时，相较于加入不含分子伴侣细胞抽提物的对照组，体系酶活分别提升了21.5%、16.5%和24.8%；当加入ATP孵育时，古菌热聚体的分子伴侣活性被激活，使得加入含Tms14、Tms13和Tms14+13的细胞抽提物时相较对照酶活分别提高了16.4%、37.7%和52.4%。说明古菌分子伴侣在无细胞合成体系中对部分失活的FLuc具有重折叠活性，提高了其在无细胞合成体系中的酶活和稳定性。

综上所述，本申请实施例通过古菌基因元件文库的挖掘得到了一组来源于嗜热古菌的热聚体类分子伴侣Tms13和14，并通过人工适应性改造、与目标蛋白融合表达和共表达体系的构建和表达条件优化、无细胞合成体系构建，开发了利用古菌热聚体胞内表达提高多种目标蛋白在原核宿主中的可溶性表达量和总酶活，以及在无细胞合成体系中提高目标酶活性和稳定性的方法。以荧光素酶活性作为可溶表达指标，体内共表达荧光素酶与热聚体Tms13和Tms14，单位菌浓度对应的酶活力可提升19.4%。另外，以蛋白电泳中上清液目标蛋白的量占全细胞目标蛋白表达量的比例为指标，本申请提出的古菌热聚体Tms14融合表达方法，使得大肠杆菌中转氨酶RbTA、荧光素酶FLuc、乙醛脱氢酶ALDH2和脂肪酶CalB的可溶表达比例分别从49.6%、46.9%、19.0%和14.7%提升到了71.8%、78.9%、84.6%和93.2%。进一步，在构建的无细胞合成体系中引入热聚体Tms13和Tms14，可使提高体系中目标酶的热稳定性，37℃热失活后的酶活较对照提高52.4%。

以上所述实施方式和实施例的各技术特征可以进行任意合适方式的组合，为使描述简洁，未对上述实施方式和实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为在本说明书记载的范围中。

以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，便于具体和详细地理解本申请的技术方案，但并不能因此而理解为对申请专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。此外应理解，在阅读了本申请的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本申请作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。还应当理解，本领域技术人员在本申请提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本申请所附权利要求的保护范围内。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims

1.基因工程菌，其外源表达：

（a）分子伴侣，所述分子伴侣为氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的第二分子伴侣；以及，

（b）目标蛋白；

所述目标蛋白为转氨酶RbTA、萤火虫荧光素酶FLuc、脂肪酶CalB和乙醛脱氢酶ALDH2中的一种或者多种；

所述基因工程菌为大肠杆菌、红色红球菌、谷氨酸棒状杆菌或者枯草芽孢杆菌；

所述基因工程菌，其融合表达所述分子伴侣以及所述目标蛋白。

2. 根据权利要求1所述的基因工程菌，其中，编码所述第二分子伴侣的第二核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.根据权利要求1至2中任一项所述的基因工程菌，其中，所述分子伴侣以及所述目标蛋白的连接片段包括酶切位点。

4.权利要求1至3中任一项所述的基因工程菌的构建方法，其包括在宿主中导入编码所述分子伴侣的核酸分子和编码所述目标蛋白的核酸分子构建所述基因工程菌。

5.目标蛋白的生产方法，其包括如下步骤：培养权利要求3所述的基因工程菌；以及，从所得培养物中分离所述目标蛋白。

6.根据权利要求5所述的目标蛋白的生产方法，其中，培养的过程中添加诱导剂。

7.根据权利要求5或者6所述的目标蛋白的生产方法，其中，从所得培养物中分离所述目标蛋白的步骤包括：使用蛋白酶在所述酶切位点进行切割，以及，从所得酶切产物中分离所述目标蛋白。

8.根据权利要求7所述的目标蛋白的生产方法，其中，所述蛋白酶包括凝血酶。

9.目标蛋白的生产方法，其包括如下步骤：在无细胞蛋白合成体系中，采用分子伴侣合成目标蛋白；所述分子伴侣如权利要求1至2中任一项定义，所述目标蛋白为萤火虫荧光素酶FLuc。

10.根据权利要求9所述的目标蛋白的生产方法，其中，所述无细胞蛋白合成体系包含ATP。