CN108865962A

CN108865962A - 一种可高效可溶性表达4-α-糖基转移酶的大肠杆菌工程菌

Info

Publication number: CN108865962A
Application number: CN201810745221.XA
Authority: CN
Inventors: 段绪果; 张心怡; 沈镇炎; 周烽华; 苏二正
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2018-07-09
Filing date: 2018-07-09
Publication date: 2018-11-23
Anticipated expiration: 2038-07-09
Also published as: CN108865962B

Abstract

本发明公开了一种可高效可溶性表达4‑α‑糖基转移酶的大肠杆菌工程菌，属于基因工程以及微生物工程技术领域。本发明的工程菌以pETduet‑1载体或pET24a(+)载体为表达载体，以E.coli BL21(DE3)菌株为表达宿主菌株，同时表达来源于嗜热高温球菌(Thermococcus litoralis)的4‑α‑糖基转移酶以及分子伴侣蛋白GroES‑GroEL；将本发明的工程菌发酵培养24h，得到的发酵液中的酶活可高达82.2U/mL。

Description

一种可高效可溶性表达4-α-糖基转移酶的大肠杆菌工程菌

技术领域

本发明涉及一种可高效可溶性表达4-α-糖基转移酶的大肠杆菌工程菌，属于基因工程以及微生物工程技术领域。

背景技术

5-α-糖基转移酶是一种多功能酶，属于淀粉水解酶家族。由于4-α-糖基转移酶具有独特的催化特性，可以催化环化、歧化、水解和偶合四种反应，使其在改性淀粉、大环糊精等生产中具有广泛的用途。

如在淀粉改性方面，Cho K.H.等人应用来源于栖热水生菌的4-α-糖基转移酶对大米淀粉进行处理，结果表明经过该酶处理后，淀粉的回生现象得到很大程度的抑制，HaV.Do等人应用来源于栖热水生菌的4-α-糖基转移酶制备淀粉凝胶，分别测定不同加酶量、不同处理时间下玉米淀粉凝胶的质构特性，最终制备出粘弹性较好的理想凝胶，也有研究已经证实，采用微生物来源的4-α-糖基转移酶制备淀粉质凝胶，可以得到与明胶性质相似的淀粉质凝胶；在生产大环糊精方面，4-α-糖基转移酶可以通过其环化作用转化淀粉生成大环糊精，实现一步法制备大环糊精。

因此，如何实现4-α-糖基转移酶的工业生产以及高效生产一直是一个研究热点。

目前，Terada Y等人已经在E.coli中成功重组表达了来源于Thermus aquaticusATCC33923的4-α-糖基转移酶基因，并发现该酶能够以直链淀粉为底物，催化环化反应的发生以制备大环糊精；Srisimarat W等在E.coli中重组表达了来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)麦芽糖转糖基酶基因，证实了该酶能催化直链淀粉制备大环糊精，并对该基因中第172位Tyr进行定点突变，探究了其对直链淀粉制备大环糊精的转化率影响。

但是，上述研究构建的基因工程菌对4-α-糖基转移酶的表达依处在一个很低的水平，她们并没有实现4-α-糖基转移酶的高效表达，因此，如何实现4-α-糖基转移酶的工业生产以及高效生产仍需进一步研究。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种可高效可溶性表达4-α-糖基转移酶的大肠杆菌工程菌。此工程菌以pETduet-1载体或pET24a(+)载体为表达载体，以E.coli BL21(DE3)菌株为表达宿主菌株，同时表达来源于嗜热高温球菌(Thermococcus litoralis)的4-α-糖基转移酶以及分子伴侣蛋白GroES-GroEL；将此工程菌发酵培养24h，得到的发酵液中的酶活可高达82.2U/mL。

本发明技术方案如下：

本发明提供了一种可高效可溶性表达4-α-糖基转移酶的大肠杆菌工程菌，所述工程菌包含重组质粒以及大肠杆菌表达宿主；所述重组质粒包含目的基因、编码分子伴侣的基因以及表达载体；所述目的基因为编码4-α-糖基转移酶的基因或经密码子优化后的编码4-α-糖基转移酶的基因；所述编码分子伴侣的基因为编码分子伴侣GroES-GroEL的基因；所述表达载体为pETduet-1载体；

或所述工程菌包含重组质粒、分子伴侣质粒以及大肠杆菌表达宿主；所述重组质粒包含目的基因以及表达载体；所述目的基因为编码4-α-糖基转移酶的基因或经密码子优化后的编码4-α-糖基转移酶的基因；所述分子伴侣质粒为含有分子伴侣GroES-GroEL的质粒；所述表达载体为pET24a(+)载体。

在本发明的一种实施方式中，所述4-α-糖基转移酶为来源于嗜热高温球菌(Thermococcus litoralis)的4-α-糖基转移酶。

在本发明的一种实施方式中，所述4-α-糖基转移酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

在本发明的一种实施方式中，所述经密码子优化后的编码4-α-糖基转移酶的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。

在本发明的一种实施方式中，所述编码分子伴侣GroES-GroEL的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.3。

在本发明的一种实施方式中，所述含有分子伴侣GroES-GroEL的质粒为pGro7质粒。

在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌表达宿主菌株为E.coli BL21(DE3)菌株。

本发明提供了上述一种可高效可溶性表达4-α-糖基转移酶的大肠杆菌工程菌的制备方法，所述方法为将编码4-α-糖基转移酶的基因通过酶切连接到表达载体pETduet-1上，得到质粒pETduet-4GT；通过PCR扩增得到的线性化质粒pETduet-4GT的DNA片段和编码GroES-GroEL的基因片段，并采用In-fusion连接两个片段，构建得到表达载体pETduet-GroES-GroEL-4GT；将表达载体pETduet-GroES-GroEL-4GT转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，获得基因工程菌；通过培养基因工程菌，诱导表达获得重组4-α-糖基转移酶；

或所述方法为所述方法为将编码4-α-糖基转移酶的基因通过酶切连接到表达载体pET24a(+)上，得到表达载体pET24-4GT；将表达载体pET24-4GT与含有分子伴侣GroES-GroEL的质粒同时转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，获得基因工程菌；通过培养基因工程菌，诱导表达获得重组4-α-糖基转移酶。

本发明提供了应用上述一种可高效可溶性表达4-α-糖基转移酶的大肠杆菌工程菌的制备方法制备得到的大肠杆菌工程菌。

本发明提供了上述一种可高效可溶性表达4-α-糖基转移酶的大肠杆菌工程菌或上述一种可高效可溶性表达4-α-糖基转移酶的大肠杆菌工程菌的制备方法或上述制备得到的大肠杆菌工程菌在淀粉改性、大环糊精生产方面的应用。

有益效果：

(1)本发明的工程菌以pETduet-1载体或pET24a(+)载体为表达载体，以E.coliBL21(DE3)菌株为表达宿主菌株，同时表达来源于嗜热高温球菌(Thermococcuslitoralis)的4-α-糖基转移酶以及分子伴侣蛋白GroES-GroEL；

(2)将本发明的工程菌发酵培养24h，得到的发酵液中的酶活可高达82.2U/mL。

附图说明

图1：重组质粒pET24-4GT的图谱；

图2：重组菌株E.coli BL21(DE3)/pET24-4GT的细胞破碎上清和破碎沉淀样品的SDS-PAGE电泳图；

其中，M为蛋白分子量标准，1为重组菌株BL21(DE3)/pET24-4GT破碎细胞上清，2为重组菌株BL21(DE3)/pET24-4GT破碎细胞沉淀；

图3：重组质粒pET24-4GT与不同的分子伴侣质粒在E.coli BL21(DE3)共表达后的细胞破碎上清的SDS-PAGE电泳图；

其中，M为蛋白分子量标准，1为重组菌株BL21(DE3)/pET24-4GT/pG-KJE8破碎细胞上清，2为重组菌株BL21(DE3)/pET24-4GT/pTf16破碎细胞上清，3为重组菌株BL21(DE3)/pET24-4GT/pKJE7破碎细胞上清，4为重组菌株BL21(DE3)/pET24-4GT/pG-Tf2破碎细胞上清，5为重组菌株BL21(DE3)/pET24-4GT/pGro7破碎细胞上清，6为重组菌株BL21(DE3)/pET24-4GT破碎细胞上清；

图4：重组质粒pETduet-GroES-GroEL-4GT的图谱。

具体实施方式

通过以下的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细解释及阐述。

下述实施例中涉及的培养基如下(以g/100mL计)：

LB固体培养基：酵母粉0.5、蛋白胨1.0、NaCl 0.5、琼脂1.5，pH值为7.0，1×10⁵Pa灭菌20min。

LB液体培养基：酵母粉0.5、蛋白胨1.0、NaCl 1.0，pH 7.0。

TB发酵培养基：蛋白胨12、酵母粉24、甘油5、K₂HPO₄·3H₂O 16.43、KH₂PO₄ 2.3。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

酶活力测定方法：

配制1％的麦芽糖溶液，即称取0.10g麦芽糖溶解PBS(20mM·L^-1、pH7.4)中，然后每个离心管分装300μL，放置75℃水浴锅加热5min；取出冰上加50μL的酶，空白对照管加50μL的去离子水，再放置75℃水浴锅加热30min；加热结束后，取出冰上，生物传感分析仪测定葡萄糖的量；以同样条件下用缓冲液代替酶液的反应体系作为空白。

酶活力(U)定义为：在上述分析测定条件下，1h水解麦芽糖产生1μM的葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位。

实施例1：重组菌株E.coli BL21(DE3)/pET24-4GT的构建

1、4-α-糖基转移酶编码基因密码子优化及合成

4-α-糖基转移酶氨基酸序列可由NCBI数据库获得，序列号为WP_004067291.1。

根据大肠杆菌密码子偏好性，通过人工设计并合成经过密码子优化的4-α-糖基转移酶编码核苷酸(DNA)序列，经过测序验证，获得目的基因片段(合成的时候在两端分别加上Nde I和Xho I酶切位点以便于基因克隆)。

4-α-糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其优化后的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。

2、重组质粒的构建

将经合成的基因片段，采用Nde I和Xho I双酶切，胶回收后与以相同的两个酶酶切并胶回收纯化的pET24a(+)载体(购自于Novagen公司)进行连接。

连接产物转化大肠杆菌E.coli JM109感受态细胞，将转化后感受态细胞涂布含30μg/mL卡那霉素抗性的LB-琼脂平板(含有LB固体培养基的平板培养基)，37℃培养过夜；挑取转化子转接到LB培养基中，37℃振荡培养8h，提取质粒；重组质粒经过酶切验证并且基因测序，确认重组载体pET24-4GT正确(重组质粒pET24-4GT的图谱如图1)。

pET24a(+)载体含有T7启动子，可以通过添加IPTG或者乳糖来诱导启动目的基因的表达。

3、重组菌株的构建

将重组表达质粒pET24-4GT转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(购自Invitrogen公司)感受态细胞，将转化后感受态细胞涂布含30μg/mL卡那霉素抗性的LB-琼脂平板(含有LB固体培养基的平板培养基)，37℃培养过夜((大肠杆菌感受态细胞制备及转化参照分子克隆实验室手册)。

挑取转化子转接到LB培养基中，37℃振荡培养8h作为发酵种子液；再取2.5mL LB种子液添加到TB培养基中(含有30μg/mL卡那霉素)，置于37℃200r·min^-1条件下振荡培养4h，加入0.2mM诱导剂IPTG，诱导培养24h。

4、样品处理及检测

将菌液样品稀释20倍，用分光光度计在波长600nm处测定菌液的吸光值，以去离子水作为空白对照(OD₆₀₀＝吸光值×稀释倍数)。

再将发酵菌液置于50mL离心管中，于4℃、6000rpm离心20min，弃去上清，收集菌体细胞；将离心后的菌体用等体积的磷酸盐缓冲液重悬，置于冰上进行超声破碎，功率采用130KW，超声3s，间歇5s，共20min；将破碎后细胞悬液置于4℃、10000rpm离心5min，分别收集离心上清(破碎细胞上清部分)和细胞碎片(破碎细胞沉淀组分)。

然后采用标准的SDS-PAGE电泳方法和酶活性检测确定重组蛋白的表达水平和酶活力，分析目的蛋白的在破碎细胞上清部分和破碎细胞沉淀部分的比例分布(结果如图2所示)，酶活力检测结果显示重组4-α-糖基转移酶活力为7.2U/mL。

实施例2：重组菌株E.coli BL21(DE3)/pET24-4GT/pGro7的构建

1、含有不同分子伴侣质粒的重组菌株的构建

将pG-KJE8、pGro7、pKJE7、pG-Tf2、pTf16五种分子伴侣质粒(购自Takara公司)导入到感受态细胞E.coli BL21(DE3)中，分别构建成含有pG-KJE8、pGro7、pKJE7、pG-Tf2、pTf16质粒的五种E.coli BL21(DE3)宿主菌，分别命名为E.coli BL21(DE3)/pG-KJE8、E.coliBL21(DE3)/pGro7、E.coli BL21(DE3)/pKJE7、E.coli BL21(DE3)/pG-Tf2、E.coliBL21(DE3)/pTf16。

然后将这五种宿主菌按照大肠杆菌感受态细胞制备的方法，分别制备成感受态细胞；再将重组质粒pET24a-4GT分别导入到含有五种分子伴侣的E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，构建成E.coli BL21(DE3)/pET24-4GT/pG-KJE8、E.coli BL21(DE3)/pET24-4GT/pGro7、E.coliBL21(DE3)/pET24-4GT/pKJE7、E.coli BL21(DE3)/pET24-4GT/pG-Tf2、E.coliBL21(DE3)/pET24-4GT/pTf16五种重组菌(大肠杆菌感受态细胞制备及转化参照分子克隆实验室手册)。

挑取转化子转接到LB培养基中，37℃振荡培养8h作为发酵种子液；再取2.5mL LB种子液添加到TB培养基中(含有30μg/mL卡那霉素和20μg/mL氯霉素)，置于28℃200r·min^-1条件下振荡培养4h，加入0.2mM诱导剂IPTG和4g/L阿拉伯糖，诱导培养24h。

2、样品处理及检测

参照实施例1中样品处理和检测方法，收集处理并检测样品。

结果显示当共表达pET24-4GT与pG-KJE8、pKJE7、pG-Tf2、pTf16共表达的时候，对重组4-α-糖基转移酶可溶性表达没有促进作用；只有pET24-4GT与pGro7共表达时，对4-α-糖基转移酶可溶性表达水平有显著提升(结果如图3)，此时4-α-糖基转移酶酶活力63.0U/mL，是单独表达酶活力的8.75倍。

实施例3：重组菌株E.coli BL21(DE3)/pETduet-GroES-GroEL-4GT的构建

1、重组质粒pETduet-4GT的构建

将pET24-4GT采用Nde I和Xho I双酶切，胶回收后与以相同的两个酶酶切并胶回收纯化的pETduet-1载体(购自Novagen公司产品)进行连接。

连接产物转化大肠杆菌E.coli JM109感受态细胞，将转化后感受态细胞涂布含100μg/mL氨苄青霉素抗性的LB-琼脂平板，37℃培养过夜；挑取转化子转接到LB培养基中，37℃振荡培养8h，提取质粒；重组质粒经过酶切验证并且基因测序，确认重组载体pETduet-4GT正确。

pETduet-1载体含有两个T7启动子，4GT位于其中一个T7启动子下游，可以通过添加IPTG或者乳糖来诱导启动4GT基因的表达。

2、重组质粒pETduet-GroES-GroEL-4GT的构建

以重组质粒pETduet-4GT为模板，设计引物，扩增得到7313bp的DNA片段；

PCR引物如下：

核苷酸序列为SEQ ID NO.4的pETduet-F：GCCAGGATCCGAATTCG

核苷酸序列为SEQ ID NO.5的pETduet-R：GGTATATCTCCTTCTTAAAG

PCR反应体系为50μL：ddH₂O 32.5μL，pETduet-4GT质粒DNA模板1μL，上游引物pETduet-F 1μL，下游引物pETduet-R 1μL，dNTP Mix 4μL，5×PrimeSTAR Buffer 10μL，PrimeSTAR 0.5μL；

PCR反应条件为94℃预变性4min，进行94℃10s，55℃5s，72℃7min 30s，共30个循环，最后72℃延伸10min；

反应结束后将PCR产物进行琼脂糖电泳，胶回收备用。

大肠杆菌E.coli K12(ATCC 27325)购于美国菌种保藏中心，以该菌株基因组作为模板，扩增得到分子伴侣蛋白GroES-GroEL编码基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

引物设计如下(引物中用下划线标注序列为与表达载体互补序列，用于In-fusion连接)：

核苷酸序列为SEQ ID NO.6的GroES-GroEL-FOR：AGAAGGAGATATACCATGAATATTCGTCCATTGCATGATCGC

核苷酸序列为SEQ ID NO.7的GroES-GroEL-REV：AATTCGGATCCTGGCTTACATCATGCCGCCCATGCCA

PCR反应体系为50μL：ddH₂O 32.5μL，E.coli K12基因组DNA模板1μL，上游引物pETduet-F 1μL，下游引物pETduet-R 1μL，dNTP Mix 4μL，5×PrimeSTAR Buffer 10μL，PrimeSTAR 0.5μL；

PCR反应条件为94℃预变性4min，进行94℃10s，55℃5s，72℃2min 10s，共30个循环，最后72℃延伸10min；

反应结束后将PCR产物进行琼脂糖电泳，胶回收备用。

将PCR扩增得到的质粒pETduet-4GT DNA片段和GroES-GroEL编码基因片段，采用如下连接方式连接：质粒DNA片段3μL，GroES-GroEL编码基因DNA片段5μL，5×In-fusionHD酶混合液2μL，混合均匀，置于50℃水浴锅中孵育15min，然后置于冰上冷却5min。

将连接产物全部转化大肠杆菌E.coli JM109感受态细胞中(大肠杆菌感受态细胞制备及转化参照分子克隆实验手册)，将转化后感受态细胞涂布含100μg/mL氨苄青霉素抗性的LB-琼脂平板，37℃培养过夜；挑取转化子转接到LB培养基中，37℃振荡培养8h，提取质粒；重组质粒经过酶切验证并且基因测序，确认正确的重组载体命名为pETduet-GroES-GroEL-4GT(重组质粒pETduet-GroES-GroEL-4GT的图谱如图4)。

3、重组菌株的构建

将重组表达质粒pETduet-GroES-GroEL-4GT转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(Invitrogen公司)感受态细胞，将转化后感受态细胞涂布含100μg/mL氨苄青霉素的LB-琼脂平板，37℃培养过夜；挑取转化子转接到LB培养基(含有100μg/mL氨苄青霉素)中，37℃振荡培养8h作为发酵种子液；再取2.5mL LB种子液添加到50mL TB培养基中(含有100μg/mL氨苄青霉素)，置于28℃200r·min^-1条件下振荡培养4h，加入0.2mM诱导剂IPTG，诱导培养24h。

4、样品处理及检测

参照实施例1中样品处理和检测方法，收集处理并检测样品。

结果显示当用单个质粒pETduet-GroES-GroEL-4GT，只用一种诱导剂诱导，同时表达分子伴侣蛋白GroES-GroEL和4-α-糖基转移酶时，4-α-糖基转移酶酶活力82.2U/mL，是重组菌株E.coli BL21(DE3)/pET24-4GT/pGro7酶活力的1.3倍，是非共表达菌株E.coliBL21(DE3)/pET24-4GT酶活力的11.4倍。

5、不同重组菌株质粒稳定性对比

分别接种E.coli BL21(DE3)/pET24-4GT、E.coli BL21(DE3)/pET24-4GT/pGro7和E.coliBL21(DE3)/pETduet-GroES-GroEL-4GT至含有相应菌株所需抗生素的LB液体培养基中，37℃振荡培养8h作为发酵种子液；再取2.5mL LB种子液添加到50mL TB培养基中(含有相应抗生素)，置于37℃200r·min^-1条件下振荡培养4h，加入0.2mM诱导剂IPTG或者同时加入4g/L阿拉伯糖，诱导培养36h。

在发酵过程中，每隔一段时间取一定量的发酵液，测定其OD₆₀₀，然后用无菌生理盐水将其稀释至OD₆₀₀约0.2，再将该稀释液稀释至10^-5倍，再各取100μL所得稀释液分别涂布于无抗性LB固体琼脂平板和含有对应抗生素抗性LB固体琼脂平板，于37℃培养箱中培养12h，统计各平板上长出的菌落数(质粒稳定性＝抗生素抗性平板上长出的菌落数/无抗性平板上长出的菌落数×100％)。

检测了不同时间短小芽孢杆菌质粒稳定性，结果如表1所示。

在4h以前，这三种重组菌株质粒稳定性都很好，这可能跟4h之前没有加诱导剂；而当加入诱导剂以后，发酵12h的时候，不同重组菌体稳定性发生明显变化，尤其是含有两个质粒的菌株E.coli BL21(DE3)/pET24-4GT/pGro7，质粒稳定性最差，只保留63.7％的稳定性，而另外两种菌株稳定性分别为98.1％和97.8％；当发酵时间为24h，两种只含有一个质粒的重组菌株稳定性仍然保留90％以上，而含有两个质粒的重组菌种稳定性至保留41.5％。

表1不同菌株质粒稳定性的对比

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 南京林业大学

<120> 一种可高效可溶性表达4-α-糖基转移酶的大肠杆菌工程菌

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 659

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Glu Arg Ile Asn Phe Ile Phe Gly Ile His Asn His Gln Pro Leu

1 5 10 15

Gly Asn Phe Gly Trp Val Phe Glu Glu Ala Tyr Asn Arg Ser Tyr Arg

20 25 30

Pro Phe Met Glu Ile Leu Glu Glu Phe Pro Glu Met Lys Val Asn Val

35 40 45

His Phe Ser Gly Pro Leu Leu Glu Trp Ile Glu Glu Asn Lys Pro Asp

50 55 60

Tyr Leu Asp Leu Leu Arg Ser Leu Ile Lys Arg Gly Gln Leu Glu Ile

65 70 75 80

Val Val Ala Gly Phe Tyr Glu Pro Val Leu Ala Ala Ile Pro Lys Glu

85 90 95

Asp Arg Leu Val Gln Ile Glu Met Leu Lys Asp Tyr Ala Arg Lys Leu

100 105 110

Gly Tyr Asp Ala Lys Gly Val Trp Leu Thr Glu Arg Val Trp Gln Pro

115 120 125

Glu Leu Val Lys Ser Leu Arg Glu Ala Gly Ile Glu Tyr Val Val Val

130 135 140

Asp Asp Tyr His Phe Met Ser Ala Gly Leu Ser Lys Glu Glu Leu Phe

145 150 155 160

Trp Pro Tyr Tyr Thr Glu Asp Gly Gly Glu Val Ile Thr Val Phe Pro

165 170 175

Ile Asp Glu Lys Leu Arg Tyr Leu Ile Pro Phe Arg Pro Val Lys Lys

180 185 190

Thr Ile Glu Tyr Leu Glu Ser Leu Thr Ser Asp Asp Pro Ser Lys Val

195 200 205

Ala Val Phe His Asp Asp Gly Glu Lys Phe Gly Val Trp Pro Gly Thr

210 215 220

Tyr Glu Trp Val Tyr Glu Lys Gly Trp Leu Arg Glu Phe Phe Asp Ala

225 230 235 240

Ile Thr Ser Asn Glu Lys Ile Asn Leu Met Thr Tyr Ser Glu Tyr Leu

245 250 255

Ser Lys Phe Thr Pro Arg Gly Leu Val Tyr Leu Pro Ile Ala Ser Tyr

260 265 270

Phe Glu Met Ser Glu Trp Ser Leu Pro Ala Lys Gln Ala Lys Leu Phe

275 280 285

Val Glu Phe Val Glu Gln Leu Lys Glu Glu Gly Lys Phe Glu Lys Tyr

290 295 300

Arg Val Phe Val Arg Gly Gly Ile Trp Lys Asn Phe Phe Phe Lys Tyr

305 310 315 320

Pro Glu Ser Asn Phe Met His Lys Arg Met Leu Met Val Ser Lys Ala

325 330 335

Val Arg Asp Asn Pro Glu Ala Arg Lys Tyr Ile Leu Lys Ala Gln Cys

340 345 350

Asn Asp Ala Tyr Trp His Gly Val Phe Gly Gly Ile Tyr Leu Pro His

355 360 365

Leu Arg Arg Thr Val Trp Glu Asn Ile Ile Lys Ala Gln Arg Tyr Leu

370 375 380

Lys Pro Glu Asn Lys Ile Leu Asp Val Asp Phe Asp Gly Arg Ala Glu

385 390 395 400

Ile Met Val Glu Asn Asp Gly Phe Ile Ala Thr Ile Lys Pro His Tyr

405 410 415

Gly Gly Ser Ile Phe Glu Leu Ser Ser Lys Arg Lys Ala Val Asn Tyr

420 425 430

Asn Asp Val Leu Pro Arg Arg Trp Glu His Tyr His Glu Val Pro Glu

435 440 445

Ala Thr Lys Pro Glu Lys Glu Ser Glu Glu Gly Ile Ala Ser Ile His

450 455 460

Glu Leu Gly Lys Gln Ile Pro Glu Glu Ile Arg Arg Glu Leu Ala Tyr

465 470 475 480

Asp Trp Gln Leu Arg Ala Ile Leu Gln Asp His Phe Ile Lys Pro Glu

485 490 495

Glu Thr Leu Asp Asn Tyr Arg Leu Val Lys Tyr His Glu Leu Gly Asp

500 505 510

Phe Val Asn Gln Pro Tyr Glu Tyr Glu Met Ile Glu Asn Gly Val Lys

515 520 525

Leu Trp Arg Glu Gly Gly Val Tyr Ala Glu Glu Lys Ile Pro Ala Arg

530 535 540

Val Glu Lys Lys Ile Glu Leu Thr Glu Asp Gly Phe Ile Ala Lys Tyr

545 550 555 560

Arg Val Leu Leu Glu Lys Pro Tyr Lys Ala Leu Phe Gly Val Glu Ile

565 570 575

Asn Leu Ala Val His Ser Val Met Glu Lys Pro Glu Glu Phe Glu Ala

580 585 590

Lys Glu Phe Glu Val Asn Asp Pro Tyr Gly Ile Gly Lys Val Arg Ile

595 600 605

Glu Leu Asp Lys Ala Ala Lys Val Trp Lys Phe Pro Ile Lys Thr Leu

610 615 620

Ser Gln Ser Glu Ala Gly Trp Asp Phe Ile Gln Gln Gly Val Ser Tyr

625 630 635 640

Thr Met Leu Phe Pro Ile Glu Lys Glu Leu Glu Phe Thr Val Arg Phe

645 650 655

Arg Glu Leu

<210> 2

<211> 1986

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

catatggaac gtattaattt tatttttggt attcataatc atcagccgtt aggtaatttt 60

ggttgggtgt ttgaagaagc ctataatcgt agctatcgcc cgtttatgga aattctggaa 120

gaatttccgg agatgaaagt taatgttcat tttagcggtc cgctgttaga gtggattgaa 180

gaaaataagc cggattattt ggatctgctc cgtagcctga ttaaacgcgg tcagttagaa 240

attgttgttg caggctttta tgaaccggtg ctggccgcca ttccgaaaga agatcgctta 300

gttcagattg aaatgctgaa agattatgca cgcaaactgg gctatgatgc caaaggcgtt 360

tggctgaccg agagggtgtg gcagccggaa ctggttaaat cactgcgcga agcaggcatt 420

gaatatgtgg ttgtggatga ttatcatttt atgtcagcag gcctgagtaa agaagaactg 480

ttttggccgt attataccga agatggcggc gaagtgatta ccgtgtttcc gattgatgaa 540

aaactgcgct atctgattcc gtttcgcccg gttaagaaaa ccattgaata tctggaatct 600

ctgacctcag atgatccgag caaagttgca gtgtttcatg atgatggcga aaaatttggt 660

gtgtggccgg gcacttatga atgggtgtat gaaaaaggtt ggttacgcga atttttcgat 720

gccattacct ctaacgagaa aattaatctg atgacctata gcgaatatct gtctaagttc 780

accccgcgcg gcttagtgta tctgccgatt gcaagctatt ttgaaatgtc agagtggagt 840

ctgccggcaa aacaggccaa actgtttgtg gaatttgtgg aacagctgaa agaagaaggt 900

aaatttgaaa aatatcgtgt gtttgtgcgc ggcggtattt ggaaaaattt ctttttcaaa 960

tatccggaat ctaattttat gcataaacgg atgctgatgg tgagtaaagc agttcgcgat 1020

aatccggaag cacgcaaata tattctgaaa gcacagtgta atgatgccta ttggcatggt 1080

gtgtttggcg gcatatacct gccgcatctg cgtcgtaccg tgtgggaaaa tattattaaa 1140

gcacagcgct atctgaaacc ggaaaacaag attctggatg tggattttga tggtcgtgcc 1200

gaaattatgg tggaaaatga tggctttatt gccaccatta aaccgcatta tggtggtagt 1260

atttttgaac tgtctagtaa acgcaaagca gttaattata atgatgtgct gccgcgtcgt 1320

tgggaacatt atcatgaagt gccggaagcc accaaaccgg aaaaagaatc agaagaaggc 1380

attgcaagta ttcatgaact gggcaaacag attccggaag aaattcgtcg cgaactggcc 1440

tatgattggc agctgcgcgc cattttgcag gatcatttta ttaaaccgga agaaacctta 1500

gataattatc gcttagttaa atatcatgaa ctgggcgatt ttgttaatca gccgtatgaa 1560

tatgaaatga ttgaaaatgg cgttaaactg tggcgcgaag gcggcgtgta tgcagaagaa 1620

aaaattccgg cccgagtgga gaagaagata gaactgaccg aagatggctt tattgccaaa 1680

tatcgcgtgc tgttagaaaa accgtacaaa gccctgtttg gcgttgaaat taatctggca 1740

gttcatagcg tgatggaaaa accggaagaa tttgaagcca aagaatttga agttaatgat 1800

ccgtatggta ttggcaaagt gcgcattgaa ctggataaag ccgccaaagt gtggaaattt 1860

ccgattaaaa ccctgtcaca gagcgaagca ggttgggatt ttattcagca gggcgtgagc 1920

tataccatgc tgtttccgat tgaaaaagaa ctggagttta ccgttcgctt tcgcgaactg 1980

aagctt 1986

<210> 3

<211> 1984

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgaatattc gtccattgca tgatcgcgtg atcgtcaagc gtaaagaagt tgaaactaaa 60

tctgctggcg gcatcgttct gaccggctct gcagcggcta aatccacccg cggcgaagtg 120

ctggctgtcg gcaatggccg tatccttgaa aatggcgaag tgaagccgct ggatgtgaaa 180

gttggcgaca tcgttatttt caacgatggc tacggtgtga aatctgagaa gatcgacaat 240

gaagaagtgt tgatcatgtc cgaaagcgac attctggcaa ttgttgaagc gtaatccgcg 300

cacgacactg aacatacgaa tttaaggaat aaagataatg gcagctaaag acgtaaaatt 360

cggtaacgac gctcgtgtga aaatgctgcg cggcgtaaac gtactggcag atgcagtgaa 420

agttaccctc ggtccaaaag gccgtaacgt agttctggat aaatctttcg gtgcaccgac 480

catcaccaaa gatggtgttt ccgttgctcg tgaaatcgaa ctggaagaca agttcgaaaa 540

tatgggtgcg cagatggtga aagaagttgc ctctaaagca aacgacgctg caggcgacgg 600

taccaccact gcaaccgtac tggctcaggc tatcatcact gaaggtctga aagctgttgc 660

tgcgggcatg aacccgatgg acctgaaacg tggtatcgac aaagcggtta ccgctgcagt 720

tgaagaactg aaagcgctgt ccgtaccatg ctctgactct aaagcgattg ctcaggttgg 780

taccatctcc gctaactccg acgaaaccgt aggtaaactg atcgctgaag cgatggacaa 840

agtcggtaaa gaaggcgtta tcaccgttga agacggtacc ggtctgcagg acgaactgga 900

cgtggttgaa ggtatgcagt tcgaccgtgg ctacctgtct ccttacttca tcaacaagcc 960

ggaaactggc gcagtagaac tggaaagccc gttcatcctg ctggctgaca agaaaatctc 1020

caacatccgc gaaatgctgc cggttctgga agctgttgcc aaagcaggca aaccgctgct 1080

gatcatcgct gaagatgtag aaggcgaagc gctggcaact ctggttgtta acaccatgcg 1140

tggcatcgtg aaagtcgctg cggttaaagc accgggcttc ggcgatcgtc gtaaagctat 1200

gctgcaggat atcgcaaccc tgactggcgg taccgtgatc tctgaagaga tcggtatgga 1260

gctggaaaaa gcaaccctgg aagacctggg tcaggctaaa cgtgttgtga tcaacaaaga 1320

caccaccact atcatcgatg gcgtgggtga agaagctgca atccagggcc gtgttgctca 1380

gatccgtcag cagattgaag aagcaacttc tgactacgac cgtgaaaaac tgcaggaacg 1440

cgtagcgaaa ctggcaggcg gcgttgcagt tatcaaagtg ggtgctgcta ccgaagttga 1500

aatgaaagag aaaaaagcac gcgttgaaga tgccctgcac gcgacccgtg ctgcggtaga 1560

agaaggcgtg gttgctggtg gtggtgttgc gctgatccgc gtagcgtcta aactggctga 1620

cctgcgtggt cagaacgaag accagaacgt gggtatcaaa gttgcactgc gtgcaatgga 1680

agctccgctg cgtcagatcg tattgaactg cggcgaagaa ccgtctgttg ttgctaacac 1740

cgttaaaggc ggcgacggca actacggtta caacgcagca accgaagaat acggcaacat 1800

gatcgacatg ggtatcctgg atccaaccaa agtaactcgt tctgctctgc agtacgcagc 1860

ttctgtggct ggcctgatga tcaccaccga atgcatggtt accgacctgc cgaaaaacga 1920

tgcagctgac ttaggcgctg ctggcggtat gggcggcatg ggtggcatgg gcggcatgat 1980

gtaa 1984

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gccaggatcc gaattcg 17

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggtatatctc cttcttaaag 20

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

agaaggagat ataccatgaa tattcgtcca ttgcatgatc gc 42

<210> 7

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aattcggatc ctggcttaca tcatgccgcc catgcca 37

Claims

1.一种可高效可溶性表达4-α-糖基转移酶的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述工程菌包含重组质粒以及大肠杆菌表达宿主；所述重组质粒包含目的基因、编码分子伴侣的基因以及表达载体；所述目的基因为编码4-α-糖基转移酶的基因或经密码子优化后的编码4-α-糖基转移酶的基因；所述编码分子伴侣的基因为编码分子伴侣GroES-GroEL的基因；所述表达载体为pETduet-1载体；

2.如权利要求1所述的一种可高效可溶性表达4-α-糖基转移酶的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述4-α-糖基转移酶为来源于嗜热高温球菌(Thermococcus litoralis)的4-α-糖基转移酶。

3.如权利要求1或2所述的一种可高效可溶性表达4-α-糖基转移酶的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述4-α-糖基转移酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

4.如权利要求1-3任一所述的一种可高效可溶性表达4-α-糖基转移酶的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述经密码子优化后的编码4-α-糖基转移酶的基因的核苷酸序列为SEQID NO.2。

5.如权利要求1-4任一所述的一种可高效可溶性表达4-α-糖基转移酶的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述编码分子伴侣GroES-GroEL的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.3。

6.如权利要求1-5任一所述的一种可高效可溶性表达4-α-糖基转移酶的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述含有分子伴侣GroES-GroEL的质粒为pGro7质粒。

7.如权利要求1-6任一所述的一种可高效可溶性表达4-α-糖基转移酶的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌表达宿主菌株为E.coli BL21(DE3)菌株。

8.权利要求1-7任一所述的一种可高效可溶性表达4-α-糖基转移酶的大肠杆菌工程菌的制备方法，其特征在于，所述方法为将编码4-α-糖基转移酶的基因通过酶切连接到表达载体pETduet-1上，得到质粒pETduet-4GT；通过PCR扩增得到的线性化质粒pETduet-4GT的DNA片段和编码GroES-GroEL的基因片段，并采用In-fusion连接两个片段，构建得到表达载体pETduet-GroES-GroEL-4GT；将表达载体pETduet-GroES-GroEL-4GT转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，获得基因工程菌；通过培养基因工程菌，诱导表达获得重组4-α-糖基转移酶；

9.应用权利要求8所述的一种可高效可溶性表达4-α-糖基转移酶的大肠杆菌工程菌的制备方法制备得到的大肠杆菌工程菌。

10.权利要求1-7任一所述的一种可高效可溶性表达4-α-糖基转移酶的大肠杆菌工程菌或权利要求8所述的一种可高效可溶性表达4-α-糖基转移酶的大肠杆菌工程菌的制备方法或权利要求9所述的制备得到的大肠杆菌工程菌在淀粉改性、大环糊精生产方面的应用。