CN110684703A

CN110684703A - 一种胞内外分泌4-α-糖基转移酶的基因工程菌及其发酵方法和应用

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Publication number: CN110684703A
Application number: CN201910938663.0A
Authority: CN
Inventors: 黄静; 欧阳小英; 万惠惠; 施瑞; 杨婷; 朱锐
Original assignee: East China Normal University
Current assignee: East China Normal University
Priority date: 2019-09-30
Filing date: 2019-09-30
Publication date: 2020-01-14

Abstract

本发明公开了一种胞内外分泌4‑α‑糖基转移酶(4GT)的基因工程菌(重组大肠杆菌)，属于酶基因工程和酶工程领域。所述基因工程菌通过将来源于嗜热栖热菌HB8的编码4GT的基因通过质粒pET‑32a(+)导入到宿主细胞大肠杆菌中得到。本发明构建的基因工程菌株的胞外4GT酶活可达到167.47U/mL。该重组酶的最适温度为60℃，最适pH为7.0，所述4GT具有转苷活性，能使淀粉中支链淀粉的侧链长度延长，适合食品、化妆品和医药等工业应用的需要，能用于高支化淀粉的工业生产。本发明的优点在于以大肠杆菌为宿主，4GT不仅在其胞内进行了表达，而且在其胞外也能高效表达，这不仅减少了杂蛋白对4GT酶活及4GT纯化时的干扰，也可简化生产4GT的流程。

Description

一种胞内外分泌4-α-糖基转移酶的基因工程菌及其发酵方法和应用

技术领域

本发明属于酶基因工程和酶工程领域，涉及一种胞内外分泌4-α-糖基转移酶的基因工程菌及其发酵方法和应用。

背景技术

来自嗜热栖热菌HB8(Thermus thermophilus HB8，ATTC27634)的4-α-糖基转移酶(4-α-glycosyltransferase，简称4GT，EC 2.4.1.25)作用于淀粉，可断裂其α-1,4糖苷键，形成新的α-1,4糖苷键，致直链淀粉或支链淀粉的主链被分解，而支链淀粉的侧链长度将延长。与普通淀粉相比，这种被4GT改性过的淀粉，其回生特性改善，抗消化性提高，溶解性也增加，并且具有热可逆凝胶特性。这些性质提示4GT在食品、化妆品和医药等领域有较大的应用前景。

目前应用的4GT主要来源于细菌，已发现嗜热放线菌，牛链球菌、蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、栖热水生菌、海栖热袍菌、超嗜热古菌和嗜热栖热菌等多种细菌可产4GT。其中，源自嗜热栖热菌HB8的耐热4-α-糖基转移酶制剂4GT由于拥有催化效率高、酶促反应温度高，热稳定性好、底物范围广等独特优势，使得该菌在发酵工业上有着良好的应用前景。其中开发并应用嗜热酶成为国内外研究的焦点。

由于原有微生物体内4GT含量普遍较低，且提取困难，故实际生产应用中比较重视开发4GT基因工程菌。

大肠杆菌由于拥有遗传背景清楚、繁殖快和成本低等优点，是发展最早和应用最广泛的经典表达系统。4GT蛋白在大肠杆菌中是以胞内可溶性的形式表达，在利用大肠杆菌生产4GT蛋白时，需要对细胞进行破壁处理才能获得，不利于重组4GT的回收和使用。且4GT酶活普遍较低，胞内4GT纯化困难，这些均限制了其工业化应用。因此，实现4GT在大肠杆菌中的胞外分泌，简化制备4GT的流程，减少杂蛋白对4GT活性的影响对于工业化应用具有重要影响；通过优化其重组菌的发酵条件，如培养基成分、培养基pH、培养温度、接种量、装液量、诱导时间和IPTG浓度，以期提高4GT重组蛋白的胞外分泌，对推动4GT的工业化应用具有重要意义。

发明内容

本发明克服现有技术的上述缺陷，提供了一种4-α-糖基转移酶的克隆与高效表达方法。本发明提出了一种胞内外分泌4-α-糖基转移酶的基因工程菌(重组大肠杆菌)，通过将来源于嗜热栖热菌HB8(Thermus thermophilus HB8)的编码4GT的基因通过质粒pET-32a(+)导入大肠杆菌中得到。所述基因工程菌能够在胞内外高效分泌4GT。

其中，所述编码4GT的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

其中，所述基因工程菌的胞内与胞外均能分泌4GT。由已有报道可知，4GT在大肠杆菌克隆菌株中的表达几乎全部为胞内表达。而本发明中的4GT，在无外在信号肽的介导下，不仅在其胞内成功表达，且能以有活性的形式分泌至胞外，且在胞外进行高效表达。而这种胞外分泌4GT的形式，不仅减少了胞内杂蛋白对4GT酶活的干扰，也简化了生产4GT的流程。

本发明还提供了一种构建分泌表达4GT的基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)的方法，将来源于嗜热栖热菌HB8(Thermus thermophilus HB8)的编码4GT基因导入质粒pET-32a(+)中，构建得到pET32a-4GT，然后转入感受态细胞BL21(DE3)中，通过选择培养基挑选得到包含该质粒的基因工程菌；

具体包括以下步骤：

1)扩增SEQ ID NO.1所示的目的基因，连接到质粒pET-32a(+)上，转化至感受态的大肠杆菌DH5α，涂布于具有100μg/mL氨苄抗生素的固体培养基上，获取重组质粒pET32a-4GT；

2)将重组质粒pET32a-4GT通过CaCl₂转化法转化至感受态细胞大肠杆菌细胞BL21(DE3)中，涂布于具有100μg/mL氨苄抗生素的固体培养基上，获得包含该重组质粒pET32a-4GT的基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)。

步骤1)中，所述大肠杆菌还可以为TOP10。

步骤1)或2)中，所述固体培养基为LB、TB、SOB和SOC固体培养基等；优选地，为LB。

其中，所述LB固体培养基的组成及含量为：胰蛋白胨(胰酪胨)：10g/L，酵母提取物：5g/L，NaCl：10g/L，琼脂粉：1g/L-2g/L；最后用蒸馏水补充体系至1L，调节pH至7.0，121℃高温高压灭菌20min。

其中，TB固体培养基的组成及含量为：胰蛋白胨：2g/L；酵母提取物：24g/L；甘油：4mL/L；KH₂PO₄：2.2g/L：K₂HPO₄：9.4g/L；琼脂粉：1g/L-2g/L；调节pH至7.0，115℃高温高压灭菌20min。

其中，SOB固体培养基的组成及含量为：胰蛋白胨：20g/L；酵母提取物：5g/L；NaCl：0.5g/mL；KCl：2.5mM；MgCl₂：2.5mM；琼脂粉：1g/L-2g/L；调节pH至7.0，115℃高温高压灭菌20min。

其中，SOC固体培养基的组成及含量为：胰蛋白胨：20g/L；酵母提取物：5g/L；NaCl：0.5g/mL；KCl：2.5mM；MgCl₂：2.5mM；葡萄糖：20mM；琼脂粉：1g/L-2g/L；调节pH至7.0，115℃高温高压灭菌20min。

步骤2)中，所述CaCl₂转化法可参考肖庚福《一种快速简便的CaCl2质粒转化方法》中所述方法。

步骤2)中，所述转化的方法还可以为电转法，可参考朱森康《制备高效大肠杆菌电转化感受态细胞和电转化条件的研究》中的方法。

本发明还提供了一种按如上所述方法构建得到的基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)。该基因工程菌是将4-α-糖基转移酶基因通过质粒pET-32a(+)导入到宿主细胞，其可将产生的4-α-糖基转移酶留在细胞内，也可将4-α-糖基转移酶在胞外进行高效分泌表达。其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种利用所述的基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)生产4GT的方法，包括如下步骤：

1)菌株的活化：将基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)接种至2mL-3mL的种子培养基中，并于37℃、200rpm的摇床上培养9h-12h。

2)粗酶液的制备：将步骤1)活化好的种子培养液接种至发酵培养基中，并于37℃、200rpm的摇床上培养菌液OD600值为0.4-0.6时，加0.2mM-1.5mM IPTG继续诱导表达9h-12h，停止发酵，离心，收集上清，弃沉淀，获得4-α-糖基转移酶的粗酶液。

其中，所述沉淀用超声破碎仪进行破碎获得粗酶液，最终得到上清与沉淀中的粗酶液。

步骤(1)中，所述种子培养液为LB液体培养基，其组成及含量为：胰蛋白胨(胰酪胨)：10g/L，酵母提取物：5g/L，NaCl：10g/L；最后用蒸馏水补充体系至1L，调节pH至7.0，121℃高温高压灭菌20min，以备用。

本发明还提供了一种大肠杆菌中高效分泌表达4GT的生产方法，包括如下发酵条件的优化：

所述的发酵培养基可以为LB、TB、SOB和SOC，优选为TB培养基。

其中，LB培养基的组成为：胰蛋白胨(胰酪胨)：10g/L，酵母提取物：5g/L，NaCl：10g/L，琼脂粉：1g/L-2g/L；最后用蒸馏水补充体系至1L，调节pH至7.0，121℃高温高压灭菌20min。

其中，TB培养基的组成为：胰蛋白胨：2g/L；酵母提取物：24g/L；甘油：4mL/L；KH₂PO₄：2.2g/L：K₂HPO₄：9.4g/L；琼脂粉：1g/L-2g/L；调节pH至7.0，115℃高温高压灭菌20min。

其中，SOB培养基的组成为：胰蛋白胨：20g/L；酵母提取物：5g/L；NaCl：0.5g/mL；KCl：2.5mM；MgCl₂：2.5mM；琼脂粉：1g/L-2g/L；调节pH至7.0，115℃高温高压灭菌20min。

其中，SOC培养基的组成为：胰蛋白胨：20g/L；酵母提取物：5g/L；NaCl：0.5g/mL；KCl：2.5mM；MgCl₂：2.5mM；葡萄糖：20mM；琼脂粉：1g/L-2g/L；调节pH至7.0，115℃高温高压灭菌20min。

所述的培养基初始pH可以为4.0～10.0，如4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，优选为pH7.0；

所述的培养温度可以为25℃～42℃，如25℃、30℃、37℃和42℃，优选为37℃；

所述的接种量可以为1％～7％，如1％、3％、5％、7％(v/v)，优选为5％；

所述的装液量可以为30mL、60mL、90mL、120mL和150mL，优选为30mL；

所述的诱导时间可以为1h～11h，如1h、3h、5h、7h、9h和11h，优选为9h；

所述的IPTG浓度可以为0.2mM～1.5mM，如0.2mM、0.5mM、0.8mM、1.0mM、1.2mM和1.5mM，优选为0.5mM。

所述的4GT来源于嗜热栖热菌HB8(Thermus thermophilus HB8)，GenBank登录号为BAD71084，其密码子经开源网站http://www.jcat.de/优化后人工合成得到4GT基因，所述4GT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在该优化的发酵条件下，基因工程菌有相对最高蛋白表达量及酶活。其中，胞外酶活为167.47U/mL，比初始发酵条件下的胞外酶活提高了0.82倍。

基因工程菌的初始发酵条件为：以1％的菌液接种量，培养菌液OD600值为0.4-0.6时，以0.1mM IPTG为诱导物，在37℃诱导表达12h时，停止发酵，离心，弃沉淀，收集上清，获得4-α-糖基转移酶的粗酶液。

在一具体实施方式中，本发明首先构建了胞内外产4GT的基因工程菌。然后在IPTG诱导下，在基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)中成功实现胞外的分泌及胞内表达4GT。其全菌的总酶活为153.73U/mL；其中，胞外酶活为90.62U/mL，为总酶活的58.95％；胞内酶活为63.11U/mL，为总酶活的41.05％；胞外酶活比胞内酶活提高了43.59％。其菌体OD₆₀₀值从3.58增至8.85，菌体生长密度提高了1.47倍；全菌4GT酶活由140.32U/mL增至210.45U/mL，酶活提高了49.98％；菌株胞外4GT酶活由91.65U/mL增至167.47U/mL，酶活提高了82.73％。其中，所述基因工程菌在优化的发酵条件下进行发酵得到4GT：在37℃培养温度下，重组大肠杆菌pET32a-4GT/BL21(DE3)在pH值为7.0的TB培养基中，能相对最优化地提高基因工程菌的生长密度和分泌4GT的能力等。

本发明还提供了由所述基因工程菌在胞内外的分泌得到的4-α-糖基转移酶(4GT)，所述4GT的最适温度为60℃，最适pH为7.0。所述4GT具有转苷活性，能使淀粉中支链淀粉的侧链长度延长。与天然淀粉相比，这种被4GT改性过的淀粉，即改性淀粉，其回生特性得到改善，抗消化性得到提高，溶解性也增加，并且具有热可逆凝胶特性。这些性质提示4GT在食品、化妆品和医药等领域有较大的应用前景。如在食品工业中，生成的改性淀粉可应用于酸奶、冰淇凌和口香糖等的制作中，改善其质构特性；在医药行业中，生成的抗性淀粉如Promitor^TM RS60和RS75有类似于胰岛素的作用，能降低人体血糖；在化妆品行业中，生成的抗坏血酸糖苷具有美白和促进胶原蛋白生成等多种功效。

其中，编码所述4-α-糖基转移酶(4GT)的序列为SEQ ID NO.1。

本发明的有益效果在于，本发明通过将来源于嗜热栖热菌HB8的编码4GT的基因通过质粒pET-32a(+)导入大肠杆菌中，获得了胞内外高效分泌4GT的重组菌，即基因工程菌。本发明构建的基因工程菌的胞外4GT酶活可达到167.47U/mL。该重组酶的最适温度为60℃，最适pH为7.0，所述4GT具有转苷活性，能使淀粉中支链淀粉的侧链长度延长，适合食品、化妆品和医药等工业应用的需要，能用于高支化淀粉的工业生产。本发明的优点在于以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，导入质粒pET32a-4GT，实现4GT基因在基因工程菌中分泌性表达，其中4GT不仅在其胞内进行表达，而且在其胞外也能高效表达；而由于4GT在胞外的高效表达，不仅可以减少杂蛋白对4GT酶活及4GT纯化时的干扰，也可以简化制备4GT的流程，对于推动4GT的工业化应用有重要意义。

附图说明

图1：本发明基因工程菌pET32a-4GT-4GT/BL21(DE3)发酵液的SDS-PAGE电泳结果。图中：M：Unstained Protein MW Marker；1：IPTG诱导组的上清；2：IPTG诱导组的沉淀。

4GT的蛋白分子量为57.2kDa。由图可知，在IPTG诱导组的上清(编号1)及胞外(编号2)有与4GT蛋白大小相符的条带(黑色箭头处)。

图2：4GT纯化后的电泳图。其中，M：Unstainedprotein MW Marker(未预染的蛋白标记)；1：发酵上清的原液；2：纯化后的4GT。4GT的蛋白分子量为57.2kDa。由图可知，图中2号处的蛋白条带大小与预期4GT的蛋白分子量大小相符(黑色箭头处)。且纯化后的4GT蛋白在SDS-PAGE上仅显示一条带，说明成功制备了4GT蛋白的纯样品。

图3：pH对4GT酶活的影响。图中，由相对剩余酶活的结果可知，在pH值为7时，4GT有相对最高的酶活。因此，4GT酶活反应的最适pH值为7。

图4：温度对4GT酶活的影响。图中，由相对剩余酶活的结果可知，在温度为60℃时，4GT有相对最高的酶活。因此，4GT酶活反应的最适温度60℃。

图5：HPAEC-PAD分析：图中横坐标为淀粉的链长分布，纵坐标为相应的聚合度淀粉的含量百分比。反应时间为2h时，与对照组(Control)相比，实验组中(8U-2h)支链淀粉的聚合度可从DP11增至DP18。这进一步地证明了4GT有延长马铃薯淀粉中支链长度的催化功能。

图6：本发明基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)在不同培养基中的生长曲线。由图6可知，在TB培养基中，本发明基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)的对数生长期时间最长，生长速率与生长密度也相对最高，其OD₆₀₀值最高可增至12.61。因此，选择TB培养基来发酵该重组菌，能相对最优化地表达4GT。

图7：培养基初始pH对4GT酶活的影响。由图7可知，基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)在pH值为7的培养基中，胞外及全菌有相对最高的酶活。因此，选择培养基的初始pH为7.0来发酵该重组菌，能相对最优化地表达4GT。

图8：培养温度对4GT酶活的影响。由图8可知，基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)在培养温度为37℃时，胞外及全菌有相对最高的酶活。因此，选择培养温度为37℃来发酵该重组菌，能相对最优化地表达4GT。

图9：接种量对4GT酶活的影响。由图9可知，当基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)的接种量为5％时，全菌(202.10U/mL)及胞外(127.73U/mL)有最高的4GT酶活。当接种量为3％和7％时，4GT的酶活差异不明显。因此，选取5％作为该菌株诱导发酵的最优接种量。

图10：装液量对4GT酶活的影响。由图10可知，当基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)发酵液的装液量为30mL时，全菌与胞外有最高的酶活。随着装液量的增加，全菌与胞外的酶活逐渐降低。因此，选择30mL作为该菌发酵的最佳装液量。

图11：诱导时间对4GT酶活的影响。由图11可知，当基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)在诱导时间为9h之前，随着诱导时间的延长，全菌与胞外的4GT的酶活逐渐增加。当诱导时间为9h，酶活达到最高值。而后，随着时间的延长，酶活逐渐降低。因此，选择9h作为该菌发酵的最优诱导时间。

图12：IPTG浓度对4GT酶活的影响。由图12可知，基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)的全菌与胞外的酶活无显著性变化。说明该范围内的IPTG浓度对该菌4GT的酶活无显著性的影响。

图13：优化前后的SDS-PAGE验证。由图13可知，与优化前的4GT蛋白表达量相比，优化后的全菌及胞外的4GT条带更显著(57.2kDa，黑色箭头处)。说明在该优化的发酵条件下，4GT的表达量比优化前有显著性的提高。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

以下实施例中采用的4GT基因是：根据来源于嗜热栖热菌HB8(Thermusthermophilus HB8)的4GT(GenBank登录号为BAD71084)在网站http://www.jcat.de/进行密码子优化后人工合成得到4GT基因，基因序列如SEQ IDNO.1所示。

实施例1 4GT编码基因的克隆及表达质粒的构建

将已活化的含质粒的重组菌pET32a/DH5α和含4GT基因合成的重组菌pUC19-4GT/DH5α分别接种至含100μg/mL氨苄抗生素的LB液体培养基中，于37℃、200rpm扩大培养12h后，进行质粒的抽提。以SEQ IDNO.3和SEQ IDNO.4作为4GT的特异性引物，以pUC19-4GT为模板，进行4GT的PCR扩增。扩增后的4GT大小为1535bp，将与预计大小相符的4GT片段进行琼脂糖DNA凝胶回收。

PCR条件：98℃预变性2min；随后30个循环(98℃10s，64℃15s，72℃90s)，72℃再延伸5min。

用NdeI和Xhol对回收后的4GT与质粒pET-32a(+)进行双酶切，酶切条件为37℃，2h。将符合预计大小的酶切产物进行DNA琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，利用T4 DNA连接酶将双酶切后的质粒pET-32a(+)与4GT进行连接，构建重组质粒pET32a-4GT，并将连接液转化至感受态的大肠杆菌DH5α中，并涂布于含100μg/mL氨苄抗生素的LB固体培养基平板上，构建重组菌pET32a-4GT/DH5α。用引物F1(SEQID NO.3)和引物F2(SEQID NO.4)进行菌落PCR、酶切验证及测序。挑取验证正确的重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)，并涂布于含100μg/mL氨苄抗生素的LB固体培养基平板上，筛选获得基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)。

LB培养基：胰蛋白胨(胰酪胨)：10g/L；酵母提取物：5g/L；NaCl：10g/L；琼脂粉(固体LB培养基则加入)：1g/L-2g/L；最后用蒸馏水补充体系至1L，调节pH至7.0，121℃高温高压灭菌20min。

引物序列如下表1所示：

实施例2摇瓶发酵产4GT

1)发酵培养

菌株的活化：取一环平板上的本发明实施例1筛选获得的基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)菌体接种至含100μg/mL氨苄抗生素的2mL LB液体培养基中，于37℃、200rpm扩大培养12h。

菌株的发酵：将已活化的基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)菌体培养液按1％接种量，接种至装有30mL、含100μg/mL氨苄抗生素的LB液体培养基中，200rpm，37℃发酵培养，待菌液OD₆₀₀增至0.6时，加入1mM IPTG诱导表达12h。停止发酵后，将发酵液经10000rpm离心10min，分别收集沉淀与上清，其中沉淀用超声破碎仪进行破碎，获得发酵上清(胞外)与胞内中的粗酶。

其中，LB液体培养基：胰蛋白胨(胰酪胨)：10g/L，酵母提取物：5g/L，NaCl：10g/L，最后用蒸馏水补充体系至1L，调节pH至7.0，121℃高温高压灭菌20min。

2)酶活的测定中主要试剂的配置：1％(w/v)马铃薯淀粉溶液的配置(底物)：1％(w/v)的马铃薯淀粉在60℃下糊化1h后进行冷却，加入100mM Tris-HCl(pH7.0)。显色液：碘液母液(I₂：0.26g；KI：2.6g；蒸馏水定容至10mL)：0.5mL；1N HCl：0.5mL；蒸馏水定容至130mL。显色液用锡箔纸包裹以避光，作为备用显色液。

样品的处理：

实验组(SY)：酶样品液与底物混匀后，于60℃反应30min，再加入显色液(碘液母液)，测其OD₆₆₀的值。

对照组(CK)：酶样品与显色液(碘液母液)反应30min后(避光)，再加入底物，测其OD₆₆₀的值。

酶活定义：在660nm处，吸光值每分钟降低1％所需的酶量为一个酶活单位。

由酶活的测定结果可知，基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)菌株的总酶活为153.73U/mL。其中，胞外酶活为90.62U/mL，为总酶活的58.95％；胞内酶活为63.11U/mL，为总酶活的41.05％；胞外酶活比胞内酶活高43.59％。

3)聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE电泳)

4GT蛋白序列SEQ ID NO.2的分子量为57.2kDa。由图1可知，在1mM IPTG诱导下，基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)的发酵上清及沉淀中均分泌有与4GT蛋白分子量大小一致的条带(黑色箭头处)。说明在IPTG诱导下，4GT在基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)的胞外与胞内均有表达。

实施例3 4GT的纯化

将基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)于含100μg/mL LB液体培养基中发酵扩大培养，待菌液OD₆₀₀值增至0.6时，加入诱导物1mM IPTG，诱导表达培养12h。待发酵结束后，将发酵物于4℃，12000rpm离心机中离心，弃沉淀，取上清。借助镍柱亲和层析方法，对发酵上清中的4GT进行纯化。脱盐后，对样品进行SDS-PAGE分析及酶学性质分析。

由图2可知，纯化后的4GT蛋白在SDS-PAGE上仅显示一条带，说明成功得到了4GT的纯样品。且4GT的比酶活为438.06U/mg(如表2所示)。

表2：4GT纯化后的酶活：

实施例4 pH对4GT酶活的影响

分别配置不同pH的1％(w/v)马铃薯淀粉溶液：4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0。将实施例3纯化后的4GT与上述不同pH的底物混合，60℃反应30min。以最高酶活为100％，测定相对剩余酶活。

由结果(如图3所示)可知，在pH为7.0时，4GT的相对酶活最高。因此，选择pH值为7.0作为4GT酶活测定中的相对最适pH。

实施例5温度对4GT酶活的影响

分别在温度为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃和100℃下测定实施例3纯化后的4GT与1％(w/v)马铃薯淀粉的酶活。以最高酶活为100％，测定相对剩余酶活。

温度是影响酶转化反应的重要因素。由结果(如图4所示)可知，在反应温度为60℃，4GT的相对酶活最佳。因此，选择60℃作为4GT酶活测定中的相对最适温度。

实施例6 4GT的转苷活性

样品一共设置为三组。其中，实验组为经4GT和葡萄糖淀粉酶处理过的马铃薯淀粉样品，对照组为只经葡萄糖淀粉酶处理过的马铃薯淀粉样品，标准品组为已知某一特定葡萄糖聚合度(DP)的样品组。并取三个时间点(4GT与底物反应的时间)，分别为0.5h、2h和4h。实验流程如下：

样品处理：实验组：以1％(w/v)的马铃薯淀粉溶液为底物，与4GT混合；对照组：不加4GT的1％(w/v)马铃薯淀粉溶液。

操作流程：将实验组与对照组分别置于60°С反应2h后，混合物煮沸10min以终止样品的酶反应。然后用葡萄糖淀粉酶再次处理样品，在40°С反应3h。参照标准品的色谱条件，各样品通过高效阴离子交换色谱—脉冲安培检测器(HPAEC-PAD)分析样品吸收峰的情况。结合标准品的峰图，将实验组与对照组中样品的不同聚合度的峰面积进行比较分析，从而得到4GT对马铃薯淀粉的支化作用。

由图5可知，实验组中支链淀粉的聚合度可从DP11增至DP18，而对照组中相对高的聚合度的峰面积明显减少。这是由于4GT将初始马铃薯淀粉中的α-1,4糖苷键水解，从而生成新的α-1,4糖苷键，致使糖基供体淀粉的支链长度减少，而糖基受体淀粉的支链长度延长。这进一步地证明了4GT具有延长马铃薯淀粉中支链长度的催化功能。

实施例7产4GT菌株发酵条件的优化

1)培养基种类的优化

将已活化的基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)以1％的接种量分别转接于含100μg/mL氨苄抗生素的30mL LB、TB、SOB和SOC液体培养基中，并于37℃、200rpm的摇床中振荡培养。在时间点为2h，4h，6h，9h，10h，12h，16h，20h，24h，28h，32h，36h和46h时，分别进行取样，并测菌液OD₆₀₀的平均值(每个时间点取3瓶平行样)，绘制其生长曲线。其中，LB培养基：胰蛋白胨(胰酪胨)：10g/L，酵母提取物：5g/L，NaCl：10g/L；最后用蒸馏水补充体系至1L，调节pH至7.0，121℃高温高压灭菌20min。TB培养基：胰蛋白胨：2g/L；酵母提取物：24g/L；甘油：4mL/L；KH₂PO₄：2.2g/L：K₂HPO₄：9.4g/L；调节pH至7.0，115℃高温高压灭菌20min。SOB培养基：胰蛋白胨：20g/L；酵母提取物：5g/L；NaCl：0.5g/mL；KCl：2.5mM；MgCl₂：2.5mM；调节pH至7.0，115℃高温高压灭菌20min。SOC培养基：胰蛋白胨：20g/L；酵母提取物：5g/L；NaCl：0.5g/mL；KCl：2.5mM；MgCl₂：2.5mM；葡萄糖：20mM；调节pH至7.0，115℃高温高压灭菌20min。

由图6可知，在TB培养基中，基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)的对数生长期时间最长，生长速率与生长密度也相对最高，其OD₆₀₀值最高可增至12.61。该时期菌株的生长活力旺盛，菌体密度越高，有助于4GT蛋白的高效表达。因此，选择TB培养基来发酵该重组菌，能相对最优化地表达4GT。菌株生长相对较好的其它培养基依次为SOC、SOB和LB。

2)培养基初始pH的优化

设置培养基初始pH分别为4、5、6、7、8、9和10。将活化的基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)以1％的接种量分别转接于具有不同初始pH，且含100μg/mL氨苄抗生素的的30mLTB液体培养基中，每个条件下取3瓶平行样。待样品于37℃、200rpm的摇床中振荡培养至菌液OD₆₀₀为0.6时，加入1mM IPTG，诱导表达5h。将发酵完成后的各菌液进行OD₆₀₀值的测定，并测定发酵上清与破碎后全菌的酶活，并选出相对最优的初始培养基的pH。

由结果(如图7所示)可知，基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)在pH值为7的培养基中，胞外及全菌有相对最高的酶活。而在pH值为4和9的培养基中，胞外及全菌的酶活最低。这表明该菌在过酸或过碱的环境中生长对4GT的酶活有明显的抑制作用。

3)培养温度的优化

以1％的接种量，将已活化的基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)转接至含100μg/mL氨苄抗生素的30mL TB液体培养基中，每个条件下三瓶，并于37℃、200rpm的摇床中振荡培养。待其OD₆₀₀值为0.6时，加入1mM IPTG。再分别在25℃、30℃、37℃和42℃的摇床中，以200rpm的转速振荡培养5h。后期菌体取样及处理与上述2)培养基初始pH的优化中一样。

由结果(如图8所示)可知，基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)在培养温度为37℃时，胞内及胞外的4GT酶活为最高。在25℃和30℃时，菌株的胞外酶活则相对较低。这可能与低温影响了4GT蛋白的跨膜转运有关。

4)接种量的优化

分别以1％、3％、5％、7％(v/v)的接种量转接已活化的基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)至含100μg/mL氨苄抗生素的30mLTB液体培养基中，每个条件下3瓶。将各样品在37℃、200rpm的摇床中振荡培养，待其OD₆₀₀的值为0.6时，加入1mM IPTG，于同样培养条件下诱导培养5h。后期菌体取样及处理与所述2)培养基初始pH的优化中一样。

由结果(如图9所示)可知，当基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)的接种量为5％时，全菌(202.10U/mL)及胞外(127.73U/mL)有最高的4GT酶活。当接种量为3％和7％时，4GT酶活无显著性的差异。

5)装液量的优化

以5％(v/v)的接种量分别转接已活化的基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)至30mL、60mL、90mL、120mL和150mL的TB液体培养基中，培养基中含100μg/mL的氨苄抗生素，每个条件下3瓶平行样。并将其在37℃、200rpm的摇床中振荡培养。待其OD₆₀₀值增至0.4-0.6时，加入1mM IPTG，于同样培养条件下诱导培养5h。后期菌体取样及处理与2)培养基初始pH的优化中一样。

由结果(如图10所示)可知，当基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)发酵液的装液量为30mL时，全菌与胞外有最高的酶活。随着装液量的增加，全菌与胞外的酶活逐渐降低。这是因为，装液量的过多使细胞溶氧量不足，从而抑制了菌株的产酶能力。

6)诱导时间的优化

以5％(v/v)的接种量转接活化的基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)至含100μg/mL氨苄抗生素的30mL的TB液体培养基中，每个条件下3瓶。待样品于37℃、200rpm振荡培养至OD₆₀₀为0.4-0.6时，加入1mM IPTG诱导培养。在诱导表达时间为1h、3h、5h、7h、9h和11h。后期菌体取样及处理与2)培养基初始pH的优化中一样。

由结果(如图11所示)可知，基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)在诱导时间为9h之前，随着诱导时间的延长，全菌与胞外的4GT的酶活逐渐增加。当诱导时间为9h，酶活达到最高值。而后，随着时间的延长，酶活逐渐降低。

7)IPTG浓度的优化

以5％接种量转接活化的基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)至含100μg/mL氨苄抗生素的30mLTB液体培养基中。待样品于37℃、200rpm振荡培养至OD₆₀₀为0.4-0.6时，加入不同的IPTG浓度，分别为0.2mM、0.5mM、0.8mM、1.0mM、1.2mM和1.5mM。每个条件下3瓶，在相同培养条件下诱导培养9h。后期菌体取样及处理与2)培养基初始pH的优化中一样。

由结果(如图12所示)可知，在IPTG浓度分别为0.2mM、0.5mM、0.8mM、1mM、1.3mM和1.5mM时，基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)的全菌与胞外的酶活无显著性变化。说明该范围内的IPTG浓度对该菌4GT的酶活无显著性的影响。

最终确认，基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)以5％的接菌量接种至30mL TB培养基中(pH7.0)，以0.5mM IPTG作为诱导物，在37℃诱导发酵培养9h，由于发酵液中4GT的蛋白产量提高(如图13所示)，而使菌株发酵液中的4GT酶活相对最高。因此，选择该发酵条件作为基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)菌株制备4GT的最佳发酵条件。

表3为基因工程菌pET32a-4GT-/BL21(DE3)优化前后的发酵条件比较

表3

表4为优化前后的酶活比较。优化后，菌株密度由原来的3.58增至8.85，菌体生长密度提高了1.47倍；菌株胞外4GT的酶活由原来的91.65U/mL增加到167.47U/mL，酶活提高了82.73％；全菌4GT酶活由140.32U/mL提高到210.45U/mL，酶活提高了49.98％。

表4

由结果可知，当基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)发酵液的装液量为30mL时，全菌与胞外有最高的酶活。随着装液量的增加，全菌与胞外的酶活逐渐降低。这是因为，装液量的过多使细胞溶氧量不足，从而抑制了菌株的产酶能力。

最终确认，基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)以5％的接菌量接种至30mL TB培养基中(pH7.0)，以0.5mM IPTG作为诱导物，在37℃诱导发酵培养9h，能使4GT的蛋白表达量及酶活相对最高。因此，选择该发酵条件作为基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)菌株制备4GT的最佳发酵条件。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110>华东师范大学

<120>一种胞内外分泌4-α-糖基转移酶基因工程菌及其发酵方法和应用

<160> 4

<170>PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1503

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 1

atggaacttcctcgtgctttcggccttcttcttcatcctacatctcttcctggcccttac 60

ggcgttggcgttcttggccaagaagctcgtgatttccttcgtttccttaaagaagctggc 120

ggccgttactggcaagttcttcctcttggccctacaggctacggcgattctccttaccaa 180

tctttctctgctttcgctggcaacccttaccttatcgatcttcgtcctcttgctgaacgt 240

ggctacgttcgtcttgaagatcctggcttccctcaaggccgtgttgattacggccttctt 300

tacgcttggaaatggcctgctcttaaagaagctttccgtggcttcaaagaaaaagcttct 360

cctgaagaacgtgaagctttcgctgctttccgtgaacgtgaagcttggtggcttgaagat 420

tacgctcttttcatggctcttaaaggcgctcatggcggccttccttggaaccgttggcct 480

cttcctcttcgtaaacgtgaagaaaaagctcttcgtgaagctaaatctgctcttgctgaa 540

gaagttgctttccatgctttcacacaatggcttttcttccgtcaatggggcgctcttaaa 600

gctgaagctgaagctcttggcatccgtatcatcggcgatatgcctatcttcgttgctgaa 660

gattctgctgaagtttgggctcatcctgaatggttccatcttgatgaagaaggccgtcct 720

acagttgttgctggcgttcctcctgattacttctctgaaacaggccaacgttggggcaac 780

cctctttaccgttgggatgttcttgaacgtgaaggcttctctttctggatccgtcgtctt 840

gaaaaagctcttgaacttttccatcttgttcgtatcgatcatttccgtggcttcgaagct 900

tactgggaaatccctgcttcttgccctacagctgttgaaggccgttgggttaaagctcct 960

ggcgaaaaacttttccaaaaaatccaagaagttttcggcgaagttcctgttcttgctgaa 1020

gatcttggcgttatcacacctgaagttgaagctcttcgtgatcgtttcggccttcctggc 1080

atgaaagttcttcaattcgctttcgatgatggcatggaaaaccctttccttcctcataac 1140

taccctgctcatggccgtgttgttgtttacacaggcacacatgataacgatacaacactt 1200

ggctggtaccgtacagctacacctcatgaaaaagctttcatggctcgttaccttgctgat 1260

tggggcatcacattccgtgaagaagaagaagttccttgggctcttatgcatcttggcatg 1320

aaatctgttgctcgtcttgctgtttaccctgttcaagatgttcttgctcttggctctgaa 1380

gctcgtatgaactaccctggccgtccttctggcaactgggcttggcgtcttcttcctggc 1440

gaactttctcctgaacatggcgctcgtcttcgtgctatggctgaagctacagaacgtctt 1500

taa1503

<210> 2

<211> 500

<212> PRT

<213>人工合成

<400> 2

Met Glu Leu Pro Arg Ala Phe Gly Leu Leu Leu His Pro Thr Ser Leu

1 5 10 15

Pro Gly Pro Tyr Gly Val Gly Val Leu Gly Gln Glu Ala Arg Asp Phe

20 25 30

Leu Arg Phe Leu Lys Glu Ala Gly Gly Arg Tyr Trp Gln Val Leu Pro

35 40 45

Leu Gly Pro Thr Gly Tyr Gly Asp Ser Pro Tyr Gln Ser Phe Ser Ala

50 55 60

Phe Ala Gly Asn Pro Tyr Leu Ile Asp Leu Arg Pro Leu Ala Glu Arg

65 70 75 80

Gly Tyr Val Arg Leu Glu Asp Pro Gly Phe Pro Gln Gly Arg Val Asp

85 90 95

Tyr Gly Leu Leu Tyr Ala Trp Lys Trp Pro Ala Leu Lys Glu Ala Phe

100 105 110

Arg Gly Phe Lys Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Arg Glu Ala Phe Ala

115 120 125

Ala Phe Arg Glu Arg Glu Ala Trp Trp Leu Glu Asp Tyr Ala Leu Phe

130 135 140

Met Ala Leu Lys Gly Ala His Gly Gly Leu Pro Trp Asn Arg Trp Pro

145 150 155 160

Leu Pro Leu Arg Lys Arg Glu Glu Lys Ala Leu Arg Glu Ala Lys Ser

165 170 175

Ala Leu Ala Glu Glu Val Ala Phe His Ala Phe Thr Gln Trp Leu Phe

180 185 190

Phe Arg Gln Trp Gly Ala Leu Lys Ala Glu Ala Glu Ala Leu Gly Ile

195 200 205

Arg Ile Ile Gly Asp Met Pro Ile Phe Val Ala Glu Asp Ser Ala Glu

210 215 220

Val Trp Ala His Pro Glu Trp Phe His Leu Asp Glu Glu Gly Arg Pro

225 230 235 240

Thr Val Val Ala Gly Val Pro Pro Asp Tyr Phe Ser Glu Thr Gly Gln

245 250 255

Arg Trp Gly Asn Pro Leu Tyr Arg Trp Asp Val Leu Glu Arg Glu Gly

260 265 270

Phe Ser Phe Trp Ile Arg Arg Leu Glu Lys Ala Leu Glu Leu Phe His

275 280 285

Leu Val Arg Ile Asp His Phe Arg Gly Phe Glu Ala Tyr Trp Glu Ile

290 295 300

Pro Ala Ser Cys Pro Thr Ala Val Glu Gly Arg Trp Val Lys Ala Pro

305 310 315 320

Gly Glu Lys Leu Phe Gln Lys Ile Gln Glu Val Phe Gly Glu Val Pro

325 330 335

Val Leu Ala Glu Asp Leu Gly Val Ile Thr Pro Glu Val Glu Ala Leu

340 345 350

Arg Asp Arg Phe Gly Leu Pro Gly Met Lys Val Leu Gln Phe Ala Phe

355 360 365

Asp Asp Gly Met Glu Asn Pro Phe Leu Pro His Asn Tyr Pro Ala His

370 375 380

Gly Arg Val Val Val Tyr Thr Gly Thr His Asp Asn Asp Thr Thr Leu

385 390 395 400

Gly Trp Tyr Arg Thr Ala Thr Pro His Glu Lys Ala Phe Met Ala Arg

405 410 415

Tyr Leu Ala Asp Trp Gly Ile Thr Phe Arg Glu Glu Glu Glu Val Pro

420 425 430

Trp Ala Leu Met His Leu Gly Met Lys Ser Val Ala Arg Leu Ala Val

435 440 445

Tyr Pro Val Gln Asp Val Leu Ala Leu Gly Ser Glu Ala Arg Met Asn

450 455 460

Tyr Pro Gly Arg Pro Ser Gly Asn Trp Ala Trp Arg Leu Leu Pro Gly

465 470 475 480

Glu Leu Ser Pro Glu His Gly Ala Arg Leu Arg Ala Met Ala Glu Ala

485 490 495

Thr Glu Arg Leu

500

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 3

gccatatgcaccatcatcatcatcatgaacttcctcgtgctttcggcc 48

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 4

ccgctcgagttaaagacgttctgtagcttcagccatagc 39

Claims

1.一种胞内外分泌4-α-糖基转移酶的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌通过将来源于嗜热栖热菌HB8的编码4GT的基因通过质粒pET-32a(+)导入大肠杆菌中得到；所述基因工程菌的胞内与胞外均能分泌4GT。

2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述编码4GT的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种胞内外分泌4-α-糖基转移酶的基因工程菌的制备方法，其特征在于，将来源于嗜热栖热菌HB8的编码4GT基因导入质粒pET-32a(+)中，构建得到pET32a-4GT，然后转入感受态细胞BL21(DE3)中，通过选择培养基挑选得到包含该质粒的基因工程菌。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：

2)将步骤(1)所述的重组质粒pET32a-4GT通过CaCl₂转化法转化至感受态细胞大肠杆菌细胞BL21(DE3)中，涂布于具有100μg/mL氨苄抗生素的固体培养基上，获得包含该重组质粒pET32a-4GT的基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述固体培养基为LB、TB、SOB和SOC；

其中，所述LB固体培养基的组成及含量为：胰蛋白胨/胰酪胨：10g/L，酵母提取物：5g/L，NaCl：10g/L，琼脂粉：1g/L-2g/L；最后用蒸馏水补充体系至1L，调节pH至7.0，121℃高温高压灭菌20min；

其中，所述TB固体培养基的组成及含量为：胰蛋白胨：2g/L；酵母提取物：24g/L；甘油：4mL/L；KH₂PO₄：2.2g/L：K₂HPO₄：9.4g/L；琼脂粉：1g/L-2g/L；调节pH至7.0，115℃高温高压灭菌20min；

其中，所述SOB固体培养基的组成及含量为：胰蛋白胨：20g/L；酵母提取物：5g/L；NaCl：0.5g/mL；KCl：2.5mM；MgCl₂：2.5mM；琼脂粉：1g/L-2g/L；调节pH至7.0，115℃高温高压灭菌20min；

其中，所述SOC固体培养基的组成及含量为：胰蛋白胨：20g/L；酵母提取物：5g/L；NaCl：0.5g/mL；KCl：2.5mM；MgCl₂：2.5mM；葡萄糖：20mM；琼脂粉：1g/L-2g/L；调节pH至7.0，115℃高温高压灭菌20min。

6.根据权利要求3-5之任一项方法制备得到的基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)。

7.一种利用如权利要求6所述的基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)生产4GT的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：

1)菌株的活化：将基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)接种至2mL-3mL的种子培养基中，并于37℃、200rpm的摇床上培养9h-12h；

2)粗酶液的制备：将步骤1)活化好的种子培养液接种至发酵培养基中，在37℃、200rpm的摇床上培养菌液OD600值为0.4-0.6时，加0.2mM-1.5mM IPTG继续诱导表达9h-12h，停止发酵，离心，弃沉淀，收集上清，获得4-α-糖基转移酶的粗酶液。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述种子培养基为LB液体培养基，所述LB液体培养基的组成为：胰蛋白胨(胰酪胨)：10g/L，酵母提取物：5g/L，NaCl：10g/L，琼脂粉：1g/L-2g/L；最后用蒸馏水补充体系至1L，调节pH至7.0，121℃高温高压灭菌20min。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述发酵培养基为LB、TB、SOB和SOC液体培养基；

其中，所述LB液体培养基的组成为：胰蛋白胨/胰酪胨：10g/L，酵母提取物：5g/L，NaCl：10g/L，最后用蒸馏水补充体系至1L，调节pH至7.0，121℃高温高压灭菌20min；

所述TB液体培养基的组成为：胰蛋白胨：2g/L，酵母提取物：24g/L，甘油：4mL/L，KH₂PO₄：2.2g/L，K₂HPO₄：9.4g/L，调节pH至7.0，115℃高温高压灭菌20min；SOC固体培养基的主要成分：2g/L，酵母提取物：24g/L，甘油：4mL/L，KH₂PO₄：2.2g/L，K₂HP₄：9.4g/L，调节pH至7.0，115℃高温高压灭菌20min；SOC固体培养基的主要成分：2g/L，酵母提取物：24g/L

SOB培养基的组成为：胰蛋白胨：20g/L；酵母提取物：5g/L；NaCl：0.5g/mL；KCl：2.5mM；MgCl₂：2.5mM；琼脂粉：1g/L-2g/L；调节pH至7.0，115℃高温高压灭菌20min；

SOC培养基的组成为：胰蛋白胨：20g/L；酵母提取物：5g/L；NaCl：0.5g/mL；KCl：2.5mM；MgCl₂：2.5mM；葡萄糖：20mM；琼脂粉：1g/L-2g/L；调节pH至7.0，115℃高温高压灭菌20min。

10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述4-α-糖基转移酶在胞外的酶活为167.47U/mL。