CN107384989A

CN107384989A - 一种分支酶及其在抗性糊精制备中的应用

Info

Publication number: CN107384989A
Application number: CN201710594597.0A
Authority: CN
Inventors: 吴敬; 陈晟; 刘军
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2017-07-20
Filing date: 2017-07-20
Publication date: 2017-11-24

Abstract

本发明公开了一种分支酶及其在抗性糊精制备中的应用，属于生物工程技术领域。本发明的重组大肠杆菌，淀粉分支酶酶活达到2500U/mL，其生产的淀粉分支酶的最适pH 6.5，最适温度为40℃，在40℃条件下半衰期可达200h。利用本发明的淀粉分支酶以淀粉为底物，经过高温酸解后配成底物浓度为200g/L‑300g/L，当温度为35‑45℃，加酶量为1000‑1500U/g，反应时间为8‑12h条件下进行酶转化制备抗性糊精时，抗性成分可达60％，为实现抗性糊精的工业化生产奠定了基础。

Description

一种分支酶及其在抗性糊精制备中的应用

技术领域

本发明涉及一种分支酶及其在抗性糊精制备中的应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

抗性糊精又叫难消化糊精，它由玉米淀粉为原料加工制成，因为其含有抗性成分，能够抵抗人体消化酶的作用，在消化道中不会被消化吸收，能直接进入大肠。同时抗性糊精作为一种低分子水溶性膳食纤维，具有膳食纤维的生理作用，同时还具有食品原材料很多特点，易于添加到加工食品中。现在抗性糊精主要应用于清凉饮料、果汁饮料、调味料、果子酱等的生产；近年来国内外研究发现其在高血糖、高血脂疾病等方面也有治疗保健作用。抗性糊精的研究最早起源于日本，并很快申请发明专利，随后欧洲国家和美国也开始了对抗性糊精的研究，并且申请了专利，目前应用最多的抗性糊精仍然是日本生产的Fibersol-2，其抗性含量能达90％以上，并且颜色为无色。我国在20世纪九十年代才开始对抗性糊精进行研究，1995年林勤保等以淀粉为原料制备焦糊精，并将焦糊精用α-淀粉酶处理后再用葡萄糖淀粉酶处理制备抗性糊精，并对影响产品组成成分的因素进行阐述。2006年，广东省食品研究所申请了一种抗性麦芽糊精的制备工艺的专利，它先对焦糊精用α-淀粉酶水解，然后用普鲁兰酶处理，后进行脱色离子交换和喷雾干燥得到抗性麦芽糊精，但产率都不高，基本上都是在40％45％左右。

分支酶(Branching Enzyme，简称BE，EC 2.4.1.18)，属于糖苷水解酶家族(GH13)。该酶可以广泛应用于修饰淀粉，催化α-1,6糖苷键的生成；它的主要作用一方面催化供体线性α-1,4葡聚糖链的降解(直链淀粉和支链淀粉)，另一方面又可以通过α-1,6糖苷键将降解分子片段连接到受体上，形成更多的支链，从而改变淀粉的支化程度，具有重要的理化性质和生理功能。分支酶的来源主要有植物、动物和微生物。目前所发现的淀粉分支酶主要为植物来源，很难用于工业化生产。微生物来源的淀粉分支酶底物专一性高、酶活力强、分支化度大，在工业应用中具有无可比拟的优势。然而，天然菌株的产酶能力较低，限制了其在工业应用中的潜力。

发明内容

本发明第一个目的是提供一种产分支酶基因工程菌，是以大肠杆菌为宿主，表达SEQ ID NO.2所示分支酶。

在本发明的一种实施方式中，所述分支酶由SEQ ID NO.1所示基因编码。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主为E.coli BL21、E.coli JM109、E.coliDH5α或E.coli TOP10。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。

在本发明的一种实施方式中，所述表达是以pT7-7为载体。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌按下述方法构建：将核苷酸序列为SEQ ID NO.1的淀粉分支酶基因连接到表达载体pT7-7上，然后再转化到大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中，筛选正确的转化子，即得到基因工程菌PT7-7-T.fuBE/E.coli BL21(DE3)。

本发明的第二个目的是提供一种应用所述基因工程菌生产淀粉分支酶的方法，是将所述基因工程菌接种含有80-100mg/L卡那青霉素的LB中振荡培养8-10h，然后按体积计，以5％的接种量转接至含有卡那青霉素的TB培养基中培，加入终浓度为0.12-0.2mm/L的IPTG，诱导36-48h。

在本发明的一种实施方式中，诱导后离心收集菌体，破壁后离心收集上清液即为淀粉分支酶。

在本发明的一种实施方式中，诱导培养阶段是当菌体细胞浓度达到OD₆₀₀为0.6-0.8时，加入终浓度为0.12-0.2mm/L的IPTG。

在本发明的一种实施方式中，诱导培养阶段控制温度25-30℃。

本发明的第三个目的是提供一种抗性糊精制备方法，所述方法是以淀粉为底物，应用SEQ ID NO.2所示的分支酶进行酶法转化。

在本发明的一种实施方式中，所述的方法以淀粉为底物，先将底物进行高温酸解，再向酸解后的淀粉溶液中加入1000-1500U/g底物的淀粉分支酶，在35-50℃反应8-12小时。

在本发明的一种实施方式中，所述高温酶解后的淀粉溶液浓度为200g/L-300g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述高温酸解是：淀粉加入5％的1mol/L的HCl溶液后在160-200℃进行高温反应，冷却过筛后抗性成分已有40％-45％。

在本发明的一种实施方式中，所述分支酶为酶液、酶粉或表达SEQ ID NO.2所示分支酶的细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述分支酶是由表达SEQ ID NO.2所示分支酶的基因工程菌发酵生产的酶液。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程是表达所述分支酶的重组大肠杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程是携带重组质粒且表达编码所述分支酶基因的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。

在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒是pT7-7。

本发明还提供所述方法在制备含抗性糊精的产品中的应用。

本发明的有益效果：本发明将来源于Thermobifidafusca的淀粉分支酶异源表达到大肠杆菌中，构建了一种基因工程菌，以pT7-7为表达载体，以E.coli BL21(DE3)为表达宿主，提供了一种高产淀粉分支酶的重组大肠杆菌，本发明菌株生产的淀粉分支酶的最适pH 6-7、最适温度为35-50℃、在40℃条件下半衰期可达200h。利用本发明的淀粉分支酶以淀粉为底物，经过高温酸解后，配成200g/L-300g/L的底物浓度，然后在35℃-45℃条件下进行酶转化，反应时间为8-12小时，抗性糊精含量达60％。可用于食品添加剂行业。

附图说明

图1为5OD重组菌发酵破壁上清(摇瓶)SDS-PAGE电泳图；M:分子量标准蛋白；1，E.coli BL21(DE3)/pT7-7-t.fuBE细胞破壁上清；

图2为淀粉分支酶在不同温度下的酶活；

图3为淀粉分支酶在40℃下的热稳定性；

图4为淀粉分支酶在不同pH值下的酶活；

图5为淀粉中α-1.4糖苷键与α-1.6糖苷键比例；

图6为抗性糊精中α-1.4糖苷键与α-1.6糖苷键比例。

具体实施方式

1、酶活测定方法：

(1)配置50mm，pH 6.5的磷酸缓冲液(Na₂HPO₄.12H₂O和NaH₂PO₄.2H₂O)；

鲁戈碘液(母液)：0.26g碘与2.6g碘化钾溶于10mL的容量瓶中(提前3天配置，确保碘完全溶解)，避光室温保存(6个月)。

终止反应液：0.1mL的鲁戈碘液+50uL的2mol/L盐酸溶液，定容到26mL(现配现用)；

底物：0.01g直链淀粉(0.1g支链淀粉)+0.2mL96％乙醇。3-4分钟后加入0.5mL，2mol/L的NaoH溶液，加入10mL的水，搅拌10min溶解淀粉，再加入0.5mL 2mol/L的HCL溶液，加入pH 6.5的缓冲液定容到10mL调节pH为6.5。

(2)测定方法：50uL的酶液+50uL的底物，在40℃下水浴30min，在加入2mL的终止反应液，室温放置20min后660nm(直链淀粉)或530nm(支链淀粉)处测吸光值。

(3)酶活定义:常温下在660nm或530nm处，吸光值每分钟降低1％为一个酶活单位。

2、抗性糊精含量的测定方法：测定方法参照国标GB/T22224-2008《食品中膳食纤维的测定-酶重量法》，测定结果为质量占比，采用百分比表示，例如60g/L表示为60％。

抗性糊精的得率(％)＝干燥后物质重量/反应前焦糊精重量*100。

实施例1：基因工程菌的构建

1、根据Tfu_0582的基因序列(Genbank登陆号NC_007333.1：663757-666006)设计一对引物P1和P2。下划线为酶切位点Nde Ⅰ和HindⅢ，

P1：5’-CCATATGACCGCCCGGCCTGCAGT-3’

P2：5’-CAAGCTTTCACGTCCCGTCGAACACCAGC-3’

以Thermuobifidafusca WSH03-11(公开于2008年，题为Identificationandcharacterization of bacterial cutinase的论文中)总DNA为模板，以P1、P2为引物，PCR扩增编码分支酶的基因(Genbank登陆号NC_007333.1：663757-666006)，然后克隆到pMD18-T simple载体(商业化工具载体)，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板。经37℃培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，8-10h后提取质粒，命名为Tfu_0582/pMD18-T simple，将此质粒进行序列测定。结果表明插入片段为一个2250bp的DNA片段，编码SEQ ID NO.2所示的酶。

2、用于构建大肠杆菌表达载体的质粒是pT7-7，将pT7-7质粒和Tfu_0582/pMD18-Tsimple分别进行Nde Ⅰ和HindⅢ双酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶连接，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，经37℃培养8h，挑转化子在含有100mg/L卡那青霉素的LB中振荡培养，提取质粒，酶切验证得到表达质粒Tfu_0582/pT7-7。

3、将质粒Tfu_0582/pT7-7转化E.coli BL21(DE3)宿主菌，涂布含卡那青霉素(100mg/L)的LB平板上，37℃培养8h。挑单菌落至液体LB中，37℃培养过夜，保存甘油管。

实施例2：发酵生产分支酶

1、将甘油管菌株转接LB培养基中37℃液体培养过夜，后接入TB发酵液体培养基(甘油5g/L，蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，K₂HPO₄ 12.54g/L，KH₂PO₄ 2.31g/L)，37℃培养至OD₆₀₀达0.6后用终浓度0.12-0.2mm/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导，然后转移至25℃培养48小时，离心菌体，用pH 6.5 0.05mol/L磷酸钠缓冲液悬浮细胞，超声破碎，离心后测定上清液中分支酶活力，重组分支酶发酵活力达到2500U/mL，重组分支酶蛋白SDS-PAGE电泳图见图1。

以直链淀粉为底物，在不同的温度下测酶活，结果表明淀粉分支酶的最适温度为40℃(图2)，且在40℃的半衰期为200h(图3),然后在最适温度条件下设置不同pH梯度测淀粉分支酶的酶活，得出该酶的最适pH为6.5(图4)。

实施例3：淀粉分支酶在抗性糊精制备中的应用

以淀粉为底物，向淀粉加入5％的1mol/L的HCl溶液后在160-200℃进行高温反应，冷却过筛后抗性成分已有40％-45％。经过高温酸解后配制成200g/L-300g/L的底物浓度在不同温度下进行酶转化，酶转化的温度在35-45℃，在不同pH条件下进行酶转化，发现酶转化的pH在6-7效率较高，再检测了加酶量和酶转化反应时间，得出加酶量为1000-1500U/g，酶转化反应时间为8-12h时，抗性糊精含量达到60％，较高温酸解后提高了10％以上。

将所得到的抗性糊精粗品和淀粉用核磁共振法检测前后的α-1.4糖苷键与α-1.6糖苷键的比例变化，如图5～6(相同信号强度下的两个局部图谱)，未加入淀粉分支酶前，α-1.4糖苷键：α-1.6糖苷键＝17.30:1，加入分支酶后，α-1.4糖苷键：α-1.6糖苷键＝7.95:1，α-1.4糖苷键在减少，而α-1.6糖苷键在增加。

实施例4：Thermus thermophiles的淀粉分支酶TtBE在抗性糊精中的应用

以淀粉为底物，经过高温酸解后配制成200g/L-300g/L的底物浓度，在60℃-65℃加入TtBE分支酶进行酶转化，当pH为6-7，加酶量为2500-3000U/g，反应时间为10-12h时，(抗性成分较高温酸解后增量仅为5％。

实施例5：Aquifex aeolicus的淀粉分支酶AaBE在抗性糊精中的应用

以淀粉为底物，经过高温酸解后配制成200g/L-300g/L的底物浓度，在70℃-80℃加入AaBE分支酶进行酶转化，当pH为7.0-7.5，加酶量为3000U/g左右，反应时间为10-12h时，抗性糊精增量(相比于高温酸解后的含量)仅为3％。

对照例1

具体实施方式同实施例3，区别在于，酶反应温度为30℃，抗性糊精增加量仅为高温酸解后抗性成分含量的6％-7％。

对照例2

具体实施方式同实施例3，区别在于，酶反应pH为5或8，抗性糊精增量为高温酸解后抗性成分含量的2.5％-3％。

对照例3

具体实施方式同实施例3，区别在于，酶反应时间小于8h，抗性糊精增量为高温酸解后抗性成分含量的2％-8％，而当酶反应时间大于12h时，抗性糊精增量基本不变。

对照例4

具体实施方式同实施例2，区别在于不进行IPTG诱导，结果显示，分支酶酶活约500U/mL。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种分支酶及其在抗性糊精制备中的应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2250

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtgaccgccc ggcctgcagt ccgccaaccc gctggcctgc cctgcccgca accctgcaac 60

cggtacggat atccgatgac caacgcactc ctcgctgaaa tcgacgccct ggtcgctggc 120

acccaccaca acccgcacgc cctgctcggc gcgcatcccg gcccggaagg ggtgtgggtg 180

cgtgccttgc gcccgctcgc ccgctccgtg cacgtgctcc tcgccaacgg cagccgggtc 240

gaacttcccc acctgcacaa aggcgtgttc gccggggtgg ttccgggtgc cgaagtcccc 300

gactaccggc tggtggtgcg ctacgacgac ggcaccgagc tcaccgtgga cgacccctac 360

cggcacctgc ccactctcgg agagctcgac atccacctca tccaggaagg gcggcacgaa 420

gaactgtggc gcgtgctcgg cgcgcacacc aaacgcttcc cttctgtcct gggcgacacg 480

gaagggaccg cgttcaccgt gtgggcgccc aacgcccgcg gggtacgggt gattggggac 540

ttcaaccact gggacggcac tgggcacccc atgcgttcgc tcggctcctg cggggtgtgg 600

gagctgttca tccccggggt cggcgacggt acccggtaca agtaccaggt gctcggcgcc 660

gacggagtgt ggcgggagaa agccgacccg gtggcgttcg ccacccaggc gccgccagag 720

accgcgtccg tggtgttcac ctcccgctac acctggcagg acgacgagtg gctgacgcag 780

cgcgccgccg ctgacctgca ccgcaagccg atgagcatct acgaggtgca cctcggttcg 840

tggcggcccg gcctgtccta ccgggagctt gccgaccagc tcgtggacta cgtccgcgag 900

ctggggttca cgcacgtgga attcctgccg gtcgcggagc acccgttcgg cggctcgtgg 960

ggctaccagg tcacctccta ttacgcgccc accgcccggt tcggctcccc cgacgacttc 1020

cggtacctgg tcgaccgcct ccaccaggcg gggatcgggg tgttcctgga ctgggtgccc 1080

gcgcacttcc cgaaagacga ctgggcgcta tcccgcttcg acggcaccgc cctgtacgag 1140

cacccggacc cgcgccgcgg catccacccc gactgggaca cgctgatctt caactacggc 1200

cgcaccgagg tccgcaactt tctggtcgcc aacgcactgt tctggctgga agagttccac 1260

atcgacgggc tgcgcgtgga cgcggtggct tccatgctct acctggacta ctcccgggag 1320

tccggccagt gggagcccaa cgcctacggc gggcgggaga acctggatgc catcgacttc 1380

ctgcgggagc tcaacgccac cgcctaccgc cgcaaccccg gaatcgcgat gatcgccgag 1440

gaatccaccg cctggcccgg ggtgacccgc agcaccgata cgggagggct cggcttcggg 1500

ttcaagtgga acatggggtg gatgcacgac accctgtcct acctgcagca cgaccccgtc 1560

caccggcagt accaccacaa cgaagtcacc ttctccatgg tgtacgccta cagcgagaac 1620

tatgtgctgc cgctctccca cgacgaagtc gtgcacggca agaggtcgct gctgtacaag 1680

atgccgggga acgagtggca gcgctgcgcg aacctgcggg cgctcctggc ctacatgtgg 1740

gcgcacccag gcaaacagct cctgttcatg ggcaacgaga tcgcccaagg cgacgagtgg 1800

tcgcacgacg ccggggtgca gtggtggctg ctgcgctacc cccaccatgc cgggatgcgc 1860

cggctcgtcg ccgacctcaa ccggctgtac cggaacacgc gggcgctgtg gagccaagac 1920

acggtcccgg aggggttcac ctggttggac ggcggtgacg cgagcggcaa cacgctgtcg 1980

tttctgcggt ggggagacga cgggtcggtc ctggcctgcc tcgtgaactt cagcggccgc 2040

ccgcacccgg agcgccgggt cggcctgccc tatgcgggcc ggtggcggga gatcctcaac 2100

acggacgccg tgctttacgg cggcagcggc gtctcgcagc cggggatcat cgaggcctcc 2160

gaggagacgc cgtggcaggg ccagcccgct tccgctctgg tgacctaccc gccgctgggg 2220

gtgtcctggc tggtgttcga cgggacgtga 2250

<210> 2

<211> 749

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Thr Ala Arg Pro Ala Val Arg Gln Pro Ala Gly Leu Pro Cys Pro

1 5 10 15

Gln Pro Cys Asn Arg Tyr Gly Tyr Pro Met Thr Asn Ala Leu Leu Ala

20 25 30

Glu Ile Asp Ala Leu Val Ala Gly Thr His His Asn Pro His Ala Leu

35 40 45

Leu Gly Ala His Pro Gly Pro Glu Gly Val Trp Val Arg Ala Leu Arg

50 55 60

Pro Leu Ala Arg Ser Val His Val Leu Leu Ala Asn Gly Ser Arg Val

65 70 75 80

Glu Leu Pro His Leu His Lys Gly Val Phe Ala Gly Val Val Pro Gly

85 90 95

Ala Glu Val Pro Asp Tyr Arg Leu Val Val Arg Tyr Asp Asp Gly Thr

100 105 110

Glu Leu Thr Val Asp Asp Pro Tyr Arg His Leu Pro Thr Leu Gly Glu

115 120 125

Leu Asp Ile His Leu Ile Gln Glu Gly Arg His Glu Glu Leu Trp Arg

130 135 140

Val Leu Gly Ala His Thr Lys Arg Phe Pro Ser Val Leu Gly Asp Thr

145 150 155 160

Glu Gly Thr Ala Phe Thr Val Trp Ala Pro Asn Ala Arg Gly Val Arg

165 170 175

Val Ile Gly Asp Phe Asn His Trp Asp Gly Thr Gly His Pro Met Arg

180 185 190

Ser Leu Gly Ser Cys Gly Val Trp Glu Leu Phe Ile Pro Gly Val Gly

195 200 205

Asp Gly Thr Arg Tyr Lys Tyr Gln Val Leu Gly Ala Asp Gly Val Trp

210 215 220

Arg Glu Lys Ala Asp Pro Val Ala Phe Ala Thr Gln Ala Pro Pro Glu

225 230 235 240

Thr Ala Ser Val Val Phe Thr Ser Arg Tyr Thr Trp Gln Asp Asp Glu

245 250 255

Trp Leu Thr Gln Arg Ala Ala Ala Asp Leu His Arg Lys Pro Met Ser

260 265 270

Ile Tyr Glu Val His Leu Gly Ser Trp Arg Pro Gly Leu Ser Tyr Arg

275 280 285

Glu Leu Ala Asp Gln Leu Val Asp Tyr Val Arg Glu Leu Gly Phe Thr

290 295 300

His Val Glu Phe Leu Pro Val Ala Glu His Pro Phe Gly Gly Ser Trp

305 310 315 320

Gly Tyr Gln Val Thr Ser Tyr Tyr Ala Pro Thr Ala Arg Phe Gly Ser

325 330 335

Pro Asp Asp Phe Arg Tyr Leu Val Asp Arg Leu His Gln Ala Gly Ile

340 345 350

Gly Val Phe Leu Asp Trp Val Pro Ala His Phe Pro Lys Asp Asp Trp

355 360 365

Ala Leu Ser Arg Phe Asp Gly Thr Ala Leu Tyr Glu His Pro Asp Pro

370 375 380

Arg Arg Gly Ile His Pro Asp Trp Asp Thr Leu Ile Phe Asn Tyr Gly

385 390 395 400

Arg Thr Glu Val Arg Asn Phe Leu Val Ala Asn Ala Leu Phe Trp Leu

405 410 415

Glu Glu Phe His Ile Asp Gly Leu Arg Val Asp Ala Val Ala Ser Met

420 425 430

Leu Tyr Leu Asp Tyr Ser Arg Glu Ser Gly Gln Trp Glu Pro Asn Ala

435 440 445

Tyr Gly Gly Arg Glu Asn Leu Asp Ala Ile Asp Phe Leu Arg Glu Leu

450 455 460

Asn Ala Thr Ala Tyr Arg Arg Asn Pro Gly Ile Ala Met Ile Ala Glu

465 470 475 480

Glu Ser Thr Ala Trp Pro Gly Val Thr Arg Ser Thr Asp Thr Gly Gly

485 490 495

Leu Gly Phe Gly Phe Lys Trp Asn Met Gly Trp Met His Asp Thr Leu

500 505 510

Ser Tyr Leu Gln His Asp Pro Val His Arg Gln Tyr His His Asn Glu

515 520 525

Val Thr Phe Ser Met Val Tyr Ala Tyr Ser Glu Asn Tyr Val Leu Pro

530 535 540

Leu Ser His Asp Glu Val Val His Gly Lys Arg Ser Leu Leu Tyr Lys

545 550 555 560

Met Pro Gly Asn Glu Trp Gln Arg Cys Ala Asn Leu Arg Ala Leu Leu

565 570 575

Ala Tyr Met Trp Ala His Pro Gly Lys Gln Leu Leu Phe Met Gly Asn

580 585 590

Glu Ile Ala Gln Gly Asp Glu Trp Ser His Asp Ala Gly Val Gln Trp

595 600 605

Trp Leu Leu Arg Tyr Pro His His Ala Gly Met Arg Arg Leu Val Ala

610 615 620

Asp Leu Asn Arg Leu Tyr Arg Asn Thr Arg Ala Leu Trp Ser Gln Asp

625 630 635 640

Thr Val Pro Glu Gly Phe Thr Trp Leu Asp Gly Gly Asp Ala Ser Gly

645 650 655

Asn Thr Leu Ser Phe Leu Arg Trp Gly Asp Asp Gly Ser Val Leu Ala

660 665 670

Cys Leu Val Asn Phe Ser Gly Arg Pro His Pro Glu Arg Arg Val Gly

675 680 685

Leu Pro Tyr Ala Gly Arg Trp Arg Glu Ile Leu Asn Thr Asp Ala Val

690 695 700

Leu Tyr Gly Gly Ser Gly Val Ser Gln Pro Gly Ile Ile Glu Ala Ser

705 710 715 720

Glu Glu Thr Pro Trp Gln Gly Gln Pro Ala Ser Ala Leu Val Thr Tyr

725 730 735

Pro Pro Leu Gly Val Ser Trp Leu Val Phe Asp Gly Thr

740 745

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccatatgacc gcccggcctg cagt 24

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

caagctttca cgtcccgtcg aacaccagc 29

Claims

1.一种抗性糊精制备方法，其特征在于，以淀粉为底物，应用SEQ ID NO.2所示的分支酶进行酶法转化。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法以淀粉为底物，先将底物进行高温酸解，再向酸解后的淀粉溶液中加入1000-1500U/g底物的分支酶，在35-50℃反应8-12小时。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述分支酶为酶液、酶粉或表达分支酶的细胞。

4.一种产分支酶的基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，表达SEQ ID NO.2所示分支酶。

5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述分支酶由SEQ ID NO.1所示基因编码。

6.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述宿主为E.coli BL21、E.coliJM109、E.coli DH5α或E.coli TOP10。

7.构建权利要求4所述基因工程菌的方法，其特征在于，将核苷酸序列为SEQ ID NO.1的淀粉分支酶基因连接到表达载体上，然后再转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中。

8.一种生产淀粉分支酶的方法，其特征在于，将权利要求4所述的基因工程菌接种至培养基中，加入终浓度为0.12-0.2mm/L的IPTG，诱导36-48h。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，当菌体细胞浓度达到OD₆₀₀为0.6-0.8时加入IPTG进行诱导，诱导温度为25-30℃。

10.权利要求4所述基因工程菌在制备含抗性糊精的产品中的应用。