CN109266664B

CN109266664B - 一种利用融合截短表达策略提高谷氨酸氧化酶稳定性的方法

Info

Publication number: CN109266664B
Application number: CN201811239155.5A
Authority: CN
Inventors: 姜岷; 董维亮; 吕紫瑶; 周杰; 周鑫海
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2018-10-23
Filing date: 2018-10-23
Publication date: 2022-02-08
Anticipated expiration: 2038-10-23
Also published as: CN109266664A

Abstract

本发明公开了一种融合截短表达策略提高谷氨酸氧化酶稳定性的方法，利用融合截短表达策略，将位于谷氨酸氧化酶的α与β链之间的40个氨基酸残基进行删除，构建了新的重组蛋白(αβγ)₂，融合截短表达后的谷氨酸氧化酶基因，核苷酸序列如SEQ ID NO．1所示，融合截短表达后的谷氨酸氧化酶基因编码的谷氨酸氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其得到具有相同功能的蛋白质，且重组蛋白的比酶活和稳定性均得到提升。

Description

一种利用融合截短表达策略提高谷氨酸氧化酶稳定性的方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种利用融合截短表达策略提高谷氨酸氧化酶稳定性的方法。

背景技术

L－谷氨酸氧化酶（LGOX）可以催化L－谷氨酸氧化酶生成α-酮戊二酸，氨和过氧化氢。α-酮戊二酸是一种重要的生物化合物。作为三羧酸循环的重要中间代谢产物之，α-酮戊二酸参与氨基酸、糖类、蛋白质以及脂肪代谢等重要生理过程，并且在微生物的碳氮代谢调控中起着重要作用。由α-酮戊二酸在细胞代谢上的重要性，其被广泛用于食品、医药、精细化工和化妆品行业，市场需求量巨大。此外，LGOX还被用于测定谷氨酸或制成测定谷氨酸的生物传感器，用于发酵和食品工业中的成分分析等。尤其现阶段利用其高度的立体异构选择性设计的生物传感分析仪测定谷氨酰胺、血肌酐、L-谷氨酸、氨等指标以服务于人类的生产、生活研究。

来源于Streptomyces sp. X-19-6的LGOX含有六个亚基（α₂β₂γ₂），其中α亚基约为44 kDa，β亚基约为16 kDa，γ亚基约为10 kDa。该LGOX在大肠杆菌中重组表达后仅能获得LGOX前体，需通过特殊处理后才可获得成熟酶。

发明内容

本发明的目的是提供一种截短表达的谷氨酸氧化酶，使其酶活和稳定性均得到提升。获得突变菌株产生的LGOX，从而降低LGOX的生产成本，以满足α－酮戊二酸的酶法生产及生物传感器固定化酶膜的制备。使其广泛应用于食品、轻工、化工、医药、环保、能源和科研等领域。并且将其应用于生物传感分析仪测定谷氨酰胺、血肌酐、L-谷氨酸、氨等指标以服务于人类的生产、生活研究。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

融合截短表达后的谷氨酸氧化酶基因，核苷酸序列如 SEQ ID NO．1所示。

所述的融合截短表达后的谷氨酸氧化酶基因编码的谷氨酸氧化酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

含权利要求1所述谷氨酸氧化酶基因的重组质粒。所述的重组质粒是将谷氨酸氧化酶基因克隆到 pET-29a中所得。

含所述的重组质粒的重组微生物，优选以大肠杆菌E.coliBL21(DE3)为宿主菌。

所述的谷氨酸氧化酶基因在提高谷氨酸氧化酶稳定性方面的基因工程应用。

所述的谷氨酸氧化酶基因在在制备生物传感器中的应用。

所述的谷氨酸氧化酶在 α-酮戊二酸的生产上的应用。

所述的谷氨酸氧化酶在酶法生产α-酮戊二酸中的应用。

一种成熟L—谷氨酸氧化酶的生产方法，包括以下步骤：

（1）经过PCR扩增手段，分别得到a+γ和β片段，然后利用重叠PCR，得到a+γ+β片段；

（2）将重组表达载体pET-29a－LGOX（αβγ）和pET-29a用限制性内切酶线性化后转入到E.coliBL21( DE3)感受态细胞中，通过抗性筛选并结合酶活测定，获得能够高效表达LGOX的重组菌pET-29a－LGOX（αβγ）。

（3）重组菌pET-29a－LGOX（αβγ）使用诱导剂诱导表达重组蛋白，破碎细胞，离心，收集上清液，获得截短表达的LGOX。

本发明提供了编辑谷氨酸氧化酶的基因片段，和αβγ三个片段氨基酸序列组成的蛋白质；将完整氨基酸序列经过40氨基酸残基的缺失，使其得到具有相同功能的蛋白质。

本发明解决其技术问题所采用的关键步骤是：

(1)经过PCR扩增手段，分别得到a+γ和β片段，然后利用重叠PCR，得到a+γ+β片段；

(2)对pET-29a线性化的限制性内切酶为NdeⅠ, XhoⅠ。

(3) 获得能够高效表达LGOX的重组菌pET-29a－LGOX（αβγ）的抗性筛选使用的抗生素为Kan；

(4) 所述诱导剂为IPTG，诱导浓度为0.1mMol /L；

(5) 超声破碎细胞功率为550w，处理时间为1h；

(6) 缓冲液为pH7.2浓度100mM的磷酸钠缓冲液；

成熟的LGOX由一个寡聚的二聚体组成，每个结构域包含三个片段（αβγ）和一个的FAD。晶体不对称单元中的结构域形成了一种具有自身对称性的生物二聚体，在单个的结构域中，每个片段的链端都与另一个片段连接在一起。这一发现与蛋白质折叠后发生的内肽酶修饰是一致的。481-522氨基酸序列在晶体结构（PDB号：2E1M）是不可见的，晶体分析揭示了单肽LGOX上的近似裂解位点。辅酶FAD被掩盖在活性中心内部。它与蛋白质部分残基进行了广泛的相互作用。在LGOX结构中，该领域与FAD的“二核苷酸”相互作用，构成了该结构的六个不连续性区域。

有益效果：本发明利用截短表达谷氨酸氧化酶的氨基酸序列，将完整氨基酸序列经过40氨基酸残基的缺失，使其得到具有相同功能的蛋白质。其热稳定性和酶活都得到提高，从而提高LGOX的效率，原始表达的谷氨酸氧化酶酶活为38.7u/ml，而截短表达的谷氨酸可达到45u/ml。通过圆二色谱结果可知，截短表达的谷氨酸氧化酶变性温度为113℃，而原始表达的谷氨酸氧化酶变性温度为93℃，相对原始表达的谷氨酸氧化酶而言，截短表达的谷氨酸氧化酶的热稳定性更强，可以满足α－酮戊二酸的酶法生产及生物传感器固定化酶膜的制备。

附图说明

图1为重叠PCR(α+γ+β)示意图；

图2为谷氨酸氧化酶的目的基因片段；其中:1:DL5000核酸Marker；2：DL10000核酸Marker；3：α+γ+β 片段的PCR产物

图3为谷氨酸氧化酶的目的蛋白；

具体实施方式

实施例1对照-谷氨酸氧化酶的菌株构建和表达

1.1 对照-谷氨酸氧化酶基因的PCR扩增

以Streptomyces sp. X-19-6双链DNA分子为模板，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

体系成分	体积
		<i>Streptomyces</i> sp. X-19-6基因组	1 μl(20ng)
引物up，down	1 μl,1μl
		5 ×primestarBuffer	10 μl
2.5 mM dNTP	4 μl
		primestar	2 μl
ddH<sub>2</sub>O	32 μl
		总体积	50 μl

PCR 扩增条件如下

扩增条件
		预变性	94℃ 5min
变性	94℃ 30s
		退火	60℃ 30s 30cycles
延伸	72℃ 90s
		终末延伸	72℃ 10min
保温	4℃ 10min

1.1 对照-谷氨酸氧化酶前体的表达

将谷氨酸氧化酶基因转入pET-29a中，获得将含有 pET-29a-LGOX的重组菌。随后将重组菌接入 LB 培养基中 37℃培养至 OD600 约为 0.6时，加入为0.1mMIPTG，于20℃下200rpm振荡培养约12-14h，然后8000g离心10min，收集菌体。将菌体用磷酸盐缓冲溶液（溶剂为pH7.5、20mM Tris-Cl缓冲液，含0.5M NaCl）重悬后在冰浴中进行超声破碎（总时间为30min,功率为550W，每工作2s停3s），4℃、9000g离心15min,收集上清液。在上清检测到目的蛋白的酶活，结果发现该酶在大肠杆菌中实现了表达。

实施例2 截短表达重组谷氨酸氧化酶的菌株构建

将截短表达技术应用在谷氨酸氧化酶的改造上。将来自Streptomyces sp. X-19-6的编码谷氨酸氧化酶的原始序列的120bp（1578-1698）进行删除。设计相应引物，利用重叠PCR将α+β+γ片段转到pET-29a中，然后将重组菌株进行诱导表达，得到改造后的谷氨酸氧化酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.1 α+β+γ 基因的PCR扩增

以Streptomyces sp. X-19-6双链DNA分子为模板，多对引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

(1)引物 Fα+γ和IR得到α+γ片段，PCR 扩增体系如下

Fα+γ：5’ATGGGTCGCGGATCCGAATTCATGCCAACGAGATGACCTACGAGC-3’；

IR：5’-GGTGGCCGGCCGCACCCCGCCCGCGGCCTCGGCGTCGTCCTC-3’

体系成分	体积
		<i>Streptomyces</i> sp. X-19-6基因组	1 μl(20ng)
引物 Fα+γ和IR	1 μl,1μl
		5 ×primestarBuffer	10 μl
2.5 mM dNTP	4 μl
		primestar	2 μl
ddH<sub>2</sub>O	32 μl
		总体积	50 μl

PCR 扩增条件如下：

（2）引物 β down 和IF：得到β片段，PCR 扩增体系如下

β up ：5’CGCGGCCTCGGCGTCGTCCTCGCCAAGCTTGGCGGGGTGCGGCCGGCC-3’

IF：5’-GGTGGCCGGCCGCACCCCGCCCGCGGCCTCGGCGTCGTCCTC-3’

体系成分	体积
		<i>Streptomyces</i> sp. X-19-6基因组	1 μl(20ng)
β down 和IF	1 μl,1μl
		5 ×primestarBuffer	10 μl
2.5 mM dNTP	4 μl
		primestar	2 μl
ddH<sub>2</sub>O	32 μl
		总体积	50 μl

PCR 扩增条件如下

扩增条件
		预变性	94℃ 5min
变性	94℃ 30s
		退火	55℃ 30s 30cycles
延伸	72℃ 90s
		终末延伸	72℃ 10min
保温	4℃ 10min

（3）引物a+γ-up和 β down得到a+γ+β片段，PCR 扩增体系如下

β down：5’-GGTGCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTACCGGCGGCCGCGGTGACGCC-3’

a+γ-up：5’AATGGGTCGCGGATCCGAATTCATGCCAACGAGATGACCTACGAGC-3’；

体系成分	体积
		a+γ，β片段	1 μl(20ng)
引物a+γ-up和 β down	1 μl(20ng)
		5 ×primestarBuffer	10 μl
2.5 mM dNTP	4 μl
		primestar	2 μl
ddH<sub>2</sub>O	32 μl
		总体积	50 μl

PCR 扩增条件如下

2.2 LGOX 基因表达载体的构建

将编码编码谷氨酸氧化酶的α与β链之间的120个核苷酸进行删除，利用重叠PCR将α与β链再次重新连接。

将扩增获得的基因片段进行 PCR 产物纯化后，用限制性内切酶XhoⅠ和NdeⅠ 双酶切pET-29a质粒（购自Novagen公司），回收线性化质粒载体产物。将酶连产物转入 E.coli感受态细胞中，冰浴30min，在42℃水浴锅中热激90s后。快速转移到冰水浴中冷却3min，向每管中加入液体800μl LB培养基，37℃摇床80－90rpm温育45min，复苏细胞。4000rpm离心3min，剩余200μl感受态细胞涂布于含LB /Amp平板上，平板倒置于37℃培养箱培养。阳性重组子采用菌落 PCR 和酶切鉴定。将阳性克隆子送金斯瑞有限公司进行测序，将重组质粒命名为pET-29a－LGOX（αβγ）。

体系成分	体积
		pET-29a（线性化）	4 μl
α+β+γ	1 μl
		5*buffer	2 μl
酶	1 μl
		ddH<sub>2</sub>O	2μl
总体积	10 μl

实施例3重组 LGOX 在大肠杆菌 BL21 中的诱导表达及其蛋白的纯化

3.1 重组pET-29a－LGOX（αβγ）在大肠杆菌 BL21 中的诱导表达

将含有 pET-29a－LGOX（αβγ）的重组菌接入 LB 培养基中 37℃培养至 OD600约为 0.6时，加入为0.1mMIPTG，于20℃下200rpm振荡培养约12-14h，然后8000g离心10min，收集菌体。将菌体用磷酸盐缓冲溶液（溶剂为pH7.5、20mM Tris-Cl缓冲液，含0.5M NaCl）重悬后在冰浴中进行超声破碎（总时间为30min,功率为550W，每工作2s停3s），4℃、9000g离心15min,收集上清液。在上清检测到目的蛋白的酶活，结果发现该酶在大肠杆菌中实现了表达。

3.2 重组蛋白pET-29a－LGOX（αβγ）的亲和层析纯化

镍柱：HisTrap^TM,5ml 体积，购于 GE 公司，产品目录号： lot:10037610。

纯化过程：先用8体积份蛋白纯化A液（溶剂为pH8.0、20mMTris-Cl缓冲液，含0.5MNaCl和0.25M咪唑）和2体积份蛋白纯化B液（溶剂为pH8.0、20mMTris-Cl缓冲液，含0.5MNaCl和0.5M咪唑）组成的混合液洗脱6个柱体积，以去除杂蛋白；然后用8体积份蛋白纯化A液和2体积份蛋白纯化B液组成的混合液洗脱10个柱体积，以收集目的蛋白，得到酶液。将蛋白进行15%SDS-PAGE进行鉴定，电泳图谱见图3，可以观察到电泳纯的蛋白条带，相对分子量约为68kDa，与预期大小相符。

实施例4重组蛋白酶活的测定及结构分析

4.1 重组蛋白酶活的测定

利用苯胺显色法进行检测(辣根过氧化物酶， 4-氨基安替吡啉，苯胺，谷氨酸、磷酸缓冲液和适量酶)，于37℃下反应 10 min，测定其在 550 nm 下的吸光值变化。以吸光值的变化来表示 L-谷氨酸氧化酶的酶活力大小。一个酶活力单位定义: 37℃下1 min反应生成1μmol过氧化氢所需的酶量，本实验研究发现相对比原始表达LGOX（38u/ml），截短表达LGOX酶活被提升，可达到45u/ml。

4.2 重组蛋白的结构分析

通过扫描圆二色谱可知：通过扫描圆二色谱可知：原始表达LGOX变性温度较低（91℃），截短表达LGOX变性温度较高(113℃ )，可知经过截短表达的谷氨酸氧化酶的热稳定性得到提高。（见表1）。

表1：截短表达的LGOX和原始表达LGOX 的变性温度

性能	原始表达LGOX	截短表达LGOX
			变性温度Tm值	91℃	113℃
酶活	38u/ml	45u/ml

经过截短表达的谷氨酸氧化酶的热稳定性得到提高，在 α-酮戊二酸的生产上和生物传感器的应用，α-酮戊二酸（α-ketoglutaric acid, α-KG）作为三羧酸循环和氨基酸代谢中重要的二元氨基酸，在氨基酸形成和氮代谢中起关键作用。它也广泛用于各种医药和食品领域，如用作化学合成药物的前体物质，膳食补充剂等。α-KG 可经转氨基作用形成L-谷氨酸进入氮代谢，在某些微生物中 L-谷氨酸也可被氧化形成 α-KG。生物转化法通过谷氨酸氧化酶转转化合成α-酮戊二酸，生产条件更为简单，温和，且生产过程中基本无副产物的积累，便于后续分离提取，是最具应用前景的生产方式。因此提高谷氨酸氧化酶酶活可以很大提升α-酮戊二酸的效率和降低成本。此外谷氨酸氧化酶应用于生物传感分析仪测定谷氨酰胺、血肌酐、L-谷氨酸、氨等指标以服务于人类的生产、生活研究。

序列表

<110> 南京工业大学

<120> 一种利用融合截短表达策略提高谷氨酸氧化酶稳定性的方法

<141> 2018-10-23

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1983

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

atgaccaccg acaccgcccg ccgccacacc ggggccgagc gcgccaacga gatgacctac 60

gagcagctgg cccgcgaact gctgctggtc ggccccgcgc ccaccaacga ggacctcaag 120

ctgcggtacc tcgacgtgct gatcgacaac ggactcaatc cccccggacc gcccaagcgc 180

atcctgatcg tcggcgccgg tatcgccggc ctggtcgccg gtgacctgct gacccgcgcc 240

ggacacgacg tgacgatcct ggaggccaac gccaaccggg tcggcgggcg gatcaagacc 300

ttccacgcca agaagggcga gccgtcgccg ttcgccgacc ccgcgcagta cgcggaggcg 360

ggcgcgatgc gcctgcccag cttccacccg ctgaccctgg cgctgatcga caaactcggc 420

ctgaagcgac ggctgttctt caacgtcgac atcgatccgc agaccggcaa ccaggacgcg 480

ccggtccccc cggtgttcta caagtcgttc aaggacggca agacctggac caacggcgcg 540

cccagcccgg agttcaagga gccggacaag cgcaaccaca cctggatccg caccaaccgc 600

gagcaggtgc ggcgcgccca gtacgccacg gacccctcca gcatcaacga gggcttccac 660

ctcaccggct gcgagacccg gctgaccgtc tcggacatgg tcaaccaggc gctggagccg 720

gtgcgcgact actactccgt gaagcaggac gacggaacgc gggtcaacaa gccgttcaag 780

gaatggctgg cgggctgggc cgacgtcgtc cgcgacttcg acggctattc gatggggcgc 840

ttcctgcgcg agtacgcgga gttcagcgac gaggccgtcg aggcgatcgg caccatcgag 900

aacatgacct cgcgcctcca cctggcgttc ttccacagct tcctggggcg cagcgacatc 960

gacccccgcg ccacgtactg ggagatcgag ggcggcagcc gcatgctgcc ggaaacgctg 1020

gccaaggacc tgcgggacca gatcgtgatg ggccagcgaa tggtgcggct ggagtactac 1080

gaccccggcc gcgacgggca ccacggcgaa ctcaccggtc ccggcggacc ggccgtcgcc 1140

atccagaccg tccccgaggg cgaaccgtac gcggcgaccc agacctggac cggtgacctg 1200

gcgatcgtca ccatcccgtt ctccagcctg cggttcgtca aggtgacccc gccgttctcg 1260

tacaagaagc gccgcgccgt catcgagacc cactacgacc aggccaccaa ggtgctgctg 1320

gagttctcgc ggcgctggtg ggagttcacc gaggcggact ggaagcggga gctggacgcg 1380

atcgcaccgg gtctgtacga ctactaccag cagtggggcg aggacgacgc cgaggccgcg 1440

ggcggggtgc ggccggccac caacgcctac ggcggcggtt ccaccaccga caaccccaac 1500

cgcttcatgt actacccctc ccacccggtg cccgggaccc agggcggtgt ggtgctggcc 1560

gcctactcct ggtcggacga cgccgcccgc tgggactcct tcgacgacgc cgagcgctac 1620

ggctacgccc tggagaacct ccagtcggtg cacggccgcc ggatcgaggt cttctacacc 1680

ggcgccggcc agacccagag ttggctgcgc gacccgtacg cgtgcggaga ggcggcggtc 1740

tacaccccgc accagatgac cgccttccac ctcgacgtgg tccggcccga ggggccggtg 1800

tacttcgccg gtgagcacgt gtcgctgaag cacgcctgga tcgagggagc ggtggaaacc 1860

gccgtacggg ccgccatcgc cgtcaacgag gcacccgtgg gggacacggg cgtcaccgcg 1920

gccgccggtc gccgcggggc cgccgcggca acggaaccga tgcgagagga agcactgacg 1980

tca 1983

<210> 2

<211> 661

<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2

Met Thr Thr Asp Thr Ala Arg Arg His Thr Gly Ala Glu Arg Ala Asn

1 5 10 15

Glu Met Thr Tyr Glu Gln Leu Ala Arg Glu Leu Leu Leu Val Gly Pro

20 25 30

Ala Pro Thr Asn Glu Asp Leu Lys Leu Arg Tyr Leu Asp Val Leu Ile

35 40 45

Asp Asn Gly Leu Asn Pro Pro Gly Pro Pro Lys Arg Ile Leu Ile Val

50 55 60

Gly Ala Gly Ile Ala Gly Leu Val Ala Gly Asp Leu Leu Thr Arg Ala

65 70 75 80

Gly His Asp Val Thr Ile Leu Glu Ala Asn Ala Asn Arg Val Gly Gly

85 90 95

Arg Ile Lys Thr Phe His Ala Lys Lys Gly Glu Pro Ser Pro Phe Ala

100 105 110

Asp Pro Ala Gln Tyr Ala Glu Ala Gly Ala Met Arg Leu Pro Ser Phe

115 120 125

His Pro Leu Thr Leu Ala Leu Ile Asp Lys Leu Gly Leu Lys Arg Arg

130 135 140

Leu Phe Phe Asn Val Asp Ile Asp Pro Gln Thr Gly Asn Gln Asp Ala

145 150 155 160

Pro Val Pro Pro Val Phe Tyr Lys Ser Phe Lys Asp Gly Lys Thr Trp

165 170 175

Thr Asn Gly Ala Pro Ser Pro Glu Phe Lys Glu Pro Asp Lys Arg Asn

180 185 190

His Thr Trp Ile Arg Thr Asn Arg Glu Gln Val Arg Arg Ala Gln Tyr

195 200 205

Ala Thr Asp Pro Ser Ser Ile Asn Glu Gly Phe His Leu Thr Gly Cys

210 215 220

Glu Thr Arg Leu Thr Val Ser Asp Met Val Asn Gln Ala Leu Glu Pro

225 230 235 240

Val Arg Asp Tyr Tyr Ser Val Lys Gln Asp Asp Gly Thr Arg Val Asn

245 250 255

Lys Pro Phe Lys Glu Trp Leu Ala Gly Trp Ala Asp Val Val Arg Asp

260 265 270

Phe Asp Gly Tyr Ser Met Gly Arg Phe Leu Arg Glu Tyr Ala Glu Phe

275 280 285

Ser Asp Glu Ala Val Glu Ala Ile Gly Thr Ile Glu Asn Met Thr Ser

290 295 300

Arg Leu His Leu Ala Phe Phe His Ser Phe Leu Gly Arg Ser Asp Ile

305 310 315 320

Asp Pro Arg Ala Thr Tyr Trp Glu Ile Glu Gly Gly Ser Arg Met Leu

325 330 335

Pro Glu Thr Leu Ala Lys Asp Leu Arg Asp Gln Ile Val Met Gly Gln

340 345 350

Arg Met Val Arg Leu Glu Tyr Tyr Asp Pro Gly Arg Asp Gly His His

355 360 365

Gly Glu Leu Thr Gly Pro Gly Gly Pro Ala Val Ala Ile Gln Thr Val

370 375 380

Pro Glu Gly Glu Pro Tyr Ala Ala Thr Gln Thr Trp Thr Gly Asp Leu

385 390 395 400

Ala Ile Val Thr Ile Pro Phe Ser Ser Leu Arg Phe Val Lys Val Thr

405 410 415

Pro Pro Phe Ser Tyr Lys Lys Arg Arg Ala Val Ile Glu Thr His Tyr

420 425 430

Asp Gln Ala Thr Lys Val Leu Leu Glu Phe Ser Arg Arg Trp Trp Glu

435 440 445

Phe Thr Glu Ala Asp Trp Lys Arg Glu Leu Asp Ala Ile Ala Pro Gly

450 455 460

Leu Tyr Asp Tyr Tyr Gln Gln Trp Gly Glu Asp Asp Ala Glu Ala Ala

465 470 475 480

Gly Gly Val Arg Pro Ala Thr Asn Ala Tyr Gly Gly Gly Ser Thr Thr

485 490 495

Asp Asn Pro Asn Arg Phe Met Tyr Tyr Pro Ser His Pro Val Pro Gly

500 505 510

Thr Gln Gly Gly Val Val Leu Ala Ala Tyr Ser Trp Ser Asp Asp Ala

515 520 525

Ala Arg Trp Asp Ser Phe Asp Asp Ala Glu Arg Tyr Gly Tyr Ala Leu

530 535 540

Glu Asn Leu Gln Ser Val His Gly Arg Arg Ile Glu Val Phe Tyr Thr

545 550 555 560

Gly Ala Gly Gln Thr Gln Ser Trp Leu Arg Asp Pro Tyr Ala Cys Gly

565 570 575

Glu Ala Ala Val Tyr Thr Pro His Gln Met Thr Ala Phe His Leu Asp

580 585 590

Val Val Arg Pro Glu Gly Pro Val Tyr Phe Ala Gly Glu His Val Ser

595 600 605

Leu Lys His Ala Trp Ile Glu Gly Ala Val Glu Thr Ala Val Arg Ala

610 615 620

Ala Ile Ala Val Asn Glu Ala Pro Val Gly Asp Thr Gly Val Thr Ala

625 630 635 640

Ala Ala Gly Arg Arg Gly Ala Ala Ala Ala Thr Glu Pro Met Arg Glu

645 650 655

Glu Ala Leu Thr Ser

660

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 3

aatgggtcgc ggatccgaat tcatgccaac gagatgacct acgagc 46

<210> 4

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 4

cgcggcctcg gcgtcgtcct cgccaagctt ggcggggtgc ggccggcc 48

<210> 5

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 5

ggtgctcgag tgcggccgca agcttaccgg cggccgcggt gacgcc 46

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 6

gaggacgacg ccgaggccgc gggcggggtg cggccggcca cc 42

<210> 7

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 7

ggtggccggc cgcaccccgc ccgcggcctc ggcgtcgtcc tc 42

Claims

1.融合截短表达后的谷氨酸氧化酶基因，其特征在于，核苷酸序列如 SEQ ID NO．1所示。

2.权利要求1所述的融合截短表达后的谷氨酸氧化酶基因编码的谷氨酸氧化酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.含权利要求1所述谷氨酸氧化酶基因的重组质粒。

4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒是将权利要求1所述谷氨酸氧化酶基因克隆到 pET-29a中所得。

5.含权利要求3所述的重组质粒的重组微生物。

6.根据权利要求5所述的重组微生物，其特征在于，以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)为宿主菌。

7.权利要求1所述的谷氨酸氧化酶基因在在制备生物传感器中的应用。

8.权利要求2所述的谷氨酸氧化酶在 α-酮戊二酸的生产上的应用。