CN109868297A - 利用大肠杆菌表达DavA、DavB、GabD、GabT和LGOX产戊二酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用大肠杆菌表达DavA、DavB、GabD、GabT和LGOX产戊二酸的方法。该方法先构建重组菌株E.coliBL‑22AB和E.coli‑YDT‑28LGOX；选取重组菌株E.coliBL‑22AB和E.coli‑YDT‑28LGOX分别用PBS重悬并浓缩后，加入催化体系中，再加入L‑赖氨酸和L‑谷氨酸钠催化反应生成戊二酸。本发明方法通过利用双细胞耦合以L‑赖氨酸和L‑谷氨酸钠为底物催化生产戊二酸，成功搭建α‑酮戊二酸和L‑谷氨酸钠循环体系，使得生产成本得到进一步降低，是一种成本低，产率高、利用谷氨酸循环催化生产戊二酸的方法。
Description
技术领域
本发明涉及到戊二酸的生产方法，具体涉及利用大肠杆菌表达DavA、DavB、GabD、GabT和 LGOX产戊二酸的方法。
背景技术
戊二酸及其衍生物是重要的化工原料和有机中间体，在化学、建筑、医药、农业等方面具有广泛的应用。戊二酸脱水产物是戊二酸酐，可用作合成树脂、合成橡胶和聚合时的引发剂。戊二酸或其酯也可用于聚酯多醇的合成、去垢剂的配制、含硫等烟道气的洗涤。合成戊二酸的传统方法主要为回收法和化学合成法，但这些方法具有操作繁琐流程长，原料昂贵不易得，试剂毒性大污染环境，产品收率低，合成路线复杂等缺点。
目前生产戊二酸的主要方法为发酵法和催化法。Jake Adkins等人以葡萄糖为碳源，经48h发酵培养,合成了0.8 g/L戊二酸。Si Jae Park等人采用过表达了davAB和gabDT的重组E.coliWL3110菌株，在含有赖氨酸，葡萄糖和α-酮戊二酸的培养基里共同发酵生产了1.7g/L戊二酸。发酵法周期长且转化率低，且需要添加昂贵的α-酮戊二酸作为氨基受体，大大增加了生产成本。Jia-Le Yu等人采用过表达了hgdH,、gctAB、hgdABC、ter和tesB的重组E.coli菌株，以α-酮戊二酸为底物厌氧培养得到了3.8mg/L戊二酸。此法反应体系复杂，原料昂贵且有副产物生成，戊二酸摩尔收率低。Jian Wang 等人建立了α-酮戊二酸的“+1”碳链延伸与α-酮酸脱羧结合途径生产了0.42g/L戊二酸。
经检索，一种利用谷氨酸循环双细胞耦合催化生产戊二酸的方法尚未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明的目的在于提供利用大肠杆菌表达DavA、DavB、GabD、GabT和 LGOX产戊二酸的方法,该方法以谷氨酸为原料，在保证产率不变的情况下，节约了生产成本，经济高效。
为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为：
利用大肠杆菌表达DavA、DavB、GabD、GabT和 LGOX产戊二酸的方法，包括以下步骤：
步骤1，构建重组菌株E.coliBL-22AB和E.coli-YDT-28LGOX；
步骤2，选取重组菌株E.coliBL-22AB和E.coli-YDT-28LGOX分别用pH7.0de PBS重悬并浓缩后，按照比例加入催化体系中，再加入底物L-赖氨酸和L-谷氨酸钠催化反应生成戊二酸。
作为改进的是，步骤1，将片段davA和davB与表达载体pET-22b相连，得到重组质粒pET22b–DavBA，将重组质粒pET22b-DavBA导入E.coliBL21的感受态细胞中，从平板上挑取重组菌株E.coliBL-22AB的单菌落接种到含有100mg/L氨苄青霉素抗性的5mlLB摇管中，培养6-8h后转接到含有100mg/L氨苄青霉素抗性的100mlLB培养基里，培养至OD600=0.3，离心收菌，得到过表达了davBA的重组菌E.coliBL-22AB；
将片段gabD 和gabT与表达载体pACYC相连，得到重组质粒pACYC-gabTD；将片段LGOX与表达载体pET-28a相连，得到重组质粒pET-28LGOX；将重组质粒pACYC-gabTD与重组质粒pET-28LGOX共同导入E.coli BL21（DE3）中，从平板上挑取重组菌株E.coli-YDT-28LGOX的单菌落接种到含有35mg/L氯霉素抗性和50mg/L卡那霉素抗性的5mlLB摇管中，培养6-8h后转接到含有和35mg/L氯霉素抗性和50mg/L卡那霉素抗性的100mlLB培养基中，培养至OD600=0.8，离心收菌，得到过表达了gabDT和LGOX的重组菌株E.coliBL-YDT-28LGOX；
作为改进的是，步骤2中催化反应的中底物L-赖氨酸和L-谷氨酸钠摩尔比例为1：3。
作为改进的是，步骤2中催化反应中诱导温度为25℃。
作为改进的是，步骤2中催化反应中所述的IPTG添加量为1.0mmol/L。
作为改进的是，步骤2中催化反应中E.coli BL-22AB细胞和E.coli BL-YDT-28LGOX细胞OD比例为1：4。
作为改进的是，步骤2中将重组菌株E.coli BL-22AB细胞和重组菌株E.coli BL-YDT-28LGOX细胞比例按照1:1混合，加入10g/L底物L-赖氨酸和10g/L底物L-谷氨酸钠，再添加0.5%表面活性剂TritonX-100，在37℃，转速200rpm条件下进行催化反应，定时取样，所述E.coli BL-22AB OD600=5。
有益效果
通过构建谷氨酸氧化酶（LGOX）催化L-谷氨酸钠生产α-酮戊二酸，解决价格昂贵的α-酮戊二酸供给问题，并且α-酮戊二酸在参与5-氨基戊酸生成戊二酸半醛的过程中，又可以生成L-谷氨酸钠，可以形成α-酮戊二酸和L-谷氨酸钠的循环利用。
通过利用重组菌株E.coliBL-22AB和重组菌株E.coli-YDT-28LGOX双细胞耦合以L-赖氨酸和L-谷氨酸钠为底物催化生产戊二酸，成功搭建α-酮戊二酸和L-谷氨酸钠循环体系，使得生产成本得到进一步降低。再者通过对产酶条件优化，催化体系的优化，表面活性剂优化等进一步提高戊二酸产量。最终得到了一种成本低廉，且产率高、利用谷氨酸循环催化生产戊二酸的方法。
附图说明
图1 为在不同条件下E.coli-YDT-28LGOX OD600=5单细胞催化生成戊二酸的情况，5-氨基戊酸浓度为8g/L，L-谷氨酸钠浓度为10g/L，（a）不同的OD，（b）不同的温度，（c）不同的IPTG浓度；
图2 为E.coli BL-22AB细胞OD600=5与E.coli-YDT-28LGOX细胞OD600=5双细胞耦合催化生产戊二酸，L-赖氨酸为10g/L，n(L-赖氨酸)：n(L-谷氨酸钠)分别为1:0.5、1:1、1:2和1:3时，戊二酸的积累情况；
图3为 E.coli BL-22AB细胞OD600=5与E.coli-YDT-28LGOX细胞OD600=5双细胞耦合催化生产戊二酸，L-赖氨酸为10g/L，L-谷氨酸钠为12 g/L，OD600（E.coli BL-22AB）：OD600（E.coli-YDT-28LGOX）分别为1:0.5、1:1、1:2和1：3时，戊二酸的积累情况；
图4为 E.coli BL-22AB细胞OD600=5与E.coli-YDT-28LGOX细胞OD600=5双细胞耦合催化生产戊二酸，L-赖氨酸为10g/L，L-谷氨酸钠为12 g/L时，添加0.5%表面活性剂TritonX-100对戊二酸的积累的影响。
具体实施方式
实施例1 过表达DavBA、GabDT和LGOX菌株的构建
（1）重组质粒pET22b–DavBA、pACYC-gabTD和pET28a-LGOX由本实验提供，质粒提取使用TIANGEN公司的质粒小提试剂盒进行质粒提取；
（2）将提取出来的重组质粒pET22b–DavBA和pACYC-gabTD以酶切位点NdeI经相对应的快速内切酶37℃酶切30min。将提取出来的重组质粒pET28a-LGOX以酶切位点XhoI经相对应的快速内切酶37℃酶切30min；
（3）将（2）中的转化液取微量进行琼脂糖凝胶电泳验证，电压80v-120v，电泳15-30min，结束后，在透射紫外灯下观察成像；
（4）将（3）中验证无误的重组质粒pET22b–DavBA导入 E.coli BL21 （DE3 ）中，并涂布在含有100mg/L氨苄青霉素抗性的平板上，37℃过夜培养，得到重组菌株E.coli BL-22AB；
（5）将（3）中验证无误的重组质粒pACYC-gabTD和pET28a-LGOX共同导入 E.coli BL21（DE3 ）中，并涂布在含有35mg/L氯霉素抗性和50mg/L卡那霉素抗性的平板上，37℃过夜培养，得到重组菌株E.coli BL-YDT-28LGOX。
实施例2
在大肠杆菌中共表达GabDT和LGOX催化生产戊二酸的诱导OD条件优化
1. 从实例1中的平板上挑取重组菌株E.coli BL-YDT-28LGOX的单菌落接种到含有35mg/L氯霉素抗性和50mg/L卡那霉素抗性的5mlLB摇管里，37℃培养6-8h后，转接到含有35mg/L氯霉素抗性和50mg/L卡那霉素抗性的100ml摇瓶里，37℃分别培养至OD600为0.3、0.6、0.8和2.0，加入0.5mmol的IPTG，20℃诱导12h，7000g离心5min，得到重组菌株E.coliBL-YDT-28LGOX的细胞，将其作为催化剂，4℃保存；
2. 将（1）中收集好的细胞用pH 7.0的PBS重悬并浓缩共同加入到催化体系，使体系中E.coli BL-YDT-28LGOX的细胞OD600为5，并加入配制好的pH 7.0的5-氨基戊酸母液和L-谷氨酸钠母液，使体系中5-氨基戊酸的终浓为8g/L（5-氨基戊酸和L-谷氨酸钠母液的摩尔比为1：1）；
3. 催化反应体系在37℃，转速200rpm条件下进行，并定期取样（样品12000rpm，离心2min），并用液相检测戊二酸的生成情况和5-氨基戊酸以及L-谷氨酸钠的消耗情况。
其中戊二酸的检测方法为色谱柱：Bio-Rad Aminex HPX-87H (300 mm *7.8 mm)，柱温：55°C，流动相：8 mM H2SO4，流速：0.6 mL/min，检测器：紫外。5-氨基戊酸以及L-谷氨酸钠的检测方法为色谱柱：GRACE C18（5 ul，5μm，4.6 mm×25 mm），柱温：28.5 ºC，流动相：0.7% （v/v）三氟乙酸水溶液，流速：1ml/min，检测器温度：115 ºC ，载气：氮气（纯度99.9%），载气流速：3.2 L/min，检测器：蒸发光散射检测器（ELSD）；
4. 经检测，当细胞培养至OD600为0.8时，戊二酸的产量最高，见图1。
实施例3
在大肠杆菌中共表达GabDT和LGOX催化生产戊二酸的诱导温度条件优化
（1）从实例1中的平板上挑取重组菌株E.coli BL-YDT-28LGOX的单菌落接种到含有35mg/L氯霉素抗性和50mg/L卡那霉素抗性的5mlLB摇管里，37℃培养6-8h后，转接到含有35mg/L氯霉素抗性和50mg/L卡那霉素抗性的100ml摇瓶里，37℃培养至OD600 0.8，加入0.5mmol的IPTG，分别在15℃、20℃、25℃、30℃和37℃下诱导12h，7000g离心5min，得到重组菌株E.coli BL-YDT-28LGOX的细胞，将其作为催化剂，4℃保存；
（2）将（1）中收集好的细胞用PH 7.0的PBS重悬并浓缩共同加入到催化体系，使体系中E.coli BL-YDT-28LGOX的细胞OD600为5，并加入配制好的pH 7.0的5-氨基戊酸母液和L-谷氨酸钠母液，使体系中5-氨基戊酸的终浓为10g/L（5-氨基戊酸和L-谷氨酸钠母液的摩尔比为1：1）；
（3）按照实例2中的方法对产物的生成和底物的消耗进行检测；
（4）经检测，当诱导温度为25℃时，戊二酸的产量最高，见图1。
实施例4
在大肠杆菌中共表达GabDT和LGOX催化生产戊二酸的IPTG条件优化
（1）从实例1中的平板上挑取重组菌株E.coli BL-YDT-28LGOX的单菌落接种到含有35mg/L氯霉素抗性和50mg/L卡那霉素抗性的5mlLB摇管里，37℃培养6-8h后，转接到含有35mg/L氯霉素抗性和50mg/L卡那霉素抗性的100ml摇瓶里，37℃培养至OD600 0.8，分别加入0.1mmol/L、0.25mmol/L、0.5mmol/L和1.0mmol/L的IPTG，在25℃下诱导12h，7000g离心5min，得到重组菌株E.coli BL-YDT-28LGOX的细胞，将其作为催化剂，4℃保存；
（2）将（1）中收集好的细胞用pH 7.0的PBS重悬并浓缩共同加入到催化体系，使体系中E.coli BL-YDT-28LGOX的细胞OD600为5，并加入配制好的PH 7.0的5-氨基戊酸母液和L-谷氨酸钠母液，使体系中5-氨基戊酸的终浓为10g/L（5-氨基戊酸和L-谷氨酸钠母液的摩尔比为1：1）；
（3）按照实例2中的方法对产物的生成和底物的消耗进行检测；
（4）经检测，当IPTG添加量为1.0mmol/L时，戊二酸的产量最高，见图1。
实施例5
利用谷氨酸循环双细胞耦合催化生产戊二酸底物比例条件优化
（1）从实例1中的平板上挑取重组菌株E.coli BL-22AB的单菌落接种到含有100mg/L氨苄青霉素抗性的的5mlLB摇管里，37℃培养6-8h后，转接到含有100mg/L氨苄青霉素抗性的的100ml摇瓶里，37℃培养至OD600=0.3，加入1mmol的IPTG，20℃诱导12h，7000g离心5min，得到重组菌株E.coli BL-22AB的细胞，将其作为催化剂，4℃保存。按照实例2中的方法进行收集重组菌株E.coli BL-YDT-28LGOX的细胞。
（2）将收集好的细胞用pH 7.0的PBS重悬并浓缩加入到催化体系中，使体系中其他条件不变，改变L-赖氨酸和L-谷氨酸钠比例，控制L-赖氨酸和L-谷氨酸钠摩尔比例分别为1:0.5、1:1、1：2、1：3和1:4，然后在相同条件下进行催化反应，并且隔一定时间取样检测戊二酸的积累情况。
（3）经检测，当L-赖氨酸和L-谷氨酸钠摩尔比例为1：3的时候，戊二酸产量最高，为0.85g/L。见图2。
实施例6
利用谷氨酸循环双细胞耦合催化生产戊二酸细胞比例条件优化
（1）按照实例5（1）中的方法收集重组菌株E.coli BL-22AB和重组菌株E.coli BL-YDT-28LGOX的细胞，将其作为催化剂，4℃保存。
（2）将收集好的细胞用pH 7.0的PBS重悬并浓缩加入到催化体系中，使体系中其他条件不变，改变E.coli BL-22AB细胞和E.coli BL-YDT-28LGOX细胞OD比例，控制E.coliBL-22AB细胞OD600为5，改变E.coli BL-YDT-28LGOX细胞OD，依次为2.5、5、10、15、20和25，然后在相同条件下进行催化反应，并且隔一定时间取样检测戊二酸的积累情况。
（3）经检测，增加E.coli BL-YDT-28LGOX细胞比例能够提高戊二酸的产量，并且在E.coli BL-22AB细胞和E.coli BL-YDT-28LGOX细胞OD比例为1：4的时候，戊二酸产量最高，为0.54g/L。见图3。
实施例7
利用谷氨酸循环双细胞耦合催化生产戊二酸表面活性剂优化
（1）按照实例5（1）中的方法收集重组菌株E.coli BL-22AB和重组菌株E.coli BL-YDT-28LGOX的细胞，将其作为催化剂，4℃保存。
（2）将收集好的细胞用pH 7.0的PBS重悬并浓缩加入到催化体系中，使体系中L-赖氨酸和L-谷氨酸钠的浓度为10g/L，重组菌株E.coli BL-22AB和重组菌株E.coli BL-YDT-28LGOX的细胞OD600都为5，加入0.5%TritonX-100作为表面活性剂，在控制其他条件相同的情况下，另一个反应中不加表面活性剂作为空白对照。
（3）催化反应体系在37℃，转速200rpm条件下进行，并定期取样，按照实例2中的方法对产物的生成和底物的消耗进行检测。
（4）经检测，表面活性剂的添加使得戊二酸的产量提高了3.8倍，这表面细胞通透性是双细胞耦合催化反应的主要限速因素之一，见图4。
实例1-3是对E.coli BL-YDT-28LGOX这株菌进行的产酶条件优化，我们将基因构建在质粒上，再将质粒导入大肠杆菌宿主细胞中进行表达，在菌株生长的过程中通过添加诱导剂来使得我们构建的菌株能够够表达我们需要的蛋白，诱导温度，IPTG添加量，菌株在生长到什么OD的时候进行诱导，这些条件都会影响我们的蛋白表达，做这些优化，是为了得到最佳的产酶条件。而E.coli BL-22AB的优化可参考申请号201811310272.6名称为一种双细胞耦合催化生产戊二酸的方法的专利内容。综上所述，通过利用重组菌株E.coliBL-22AB和重组菌株E.coli-YDT-28LGOX双细胞耦合以L-赖氨酸和L-谷氨酸钠为底物催化生产戊二酸，成功搭建α-酮戊二酸和L-谷氨酸钠循环体系，使得生产成本得到进一步降低。再者通过对产酶条件优化，催化体系的优化，表面活性剂优化等进一步提高戊二酸产量。最终得到了一种成本低廉，且产率高、利用谷氨酸循环催化生产戊二酸的方法。
Claims (7)
1.利用大肠杆菌表达DavA、DavB、GabD、GabT和 LGOX产戊二酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，构建重组菌株E.coli BL-22AB和E.coli-YDT-28LGOX；步骤2，选取重组菌株E.coli BL-22AB和E.coli-YDT-28LGOX分别用pH7.0的 PBS重悬并浓缩后，按照比例加入催化体系中，再加入底物L-赖氨酸和L-谷氨酸钠催化反应生成戊二酸。
2.根据权利要求1所述的利用大肠杆菌表达DavA、DavB、GabD、GabT和 LGOX产戊二酸的方法，其特征在于，步骤1，将片段davA和davB与表达载体pET-22b相连，得到重组质粒pET22b–DavBA，将重组质粒pET22b-DavBA导入E.coliBL21的感受态细胞中，从平板上挑取重组菌株E.coli BL-22AB的单菌落接种到含有100mg/L氨苄青霉素抗性的5mlLB摇管中，培养6-8h后转接到含有100mg/L氨苄青霉素抗性的100mlLB培养基里，培养至OD600=0.3，离心收菌，得到过表达了davBA的重组菌E.coliBL-22AB；将片段gabD 和gabT与表达载体pACYC相连，得到重组质粒pACYC-gabTD；将片段LGOX与表达载体pET-28a相连，得到重组质粒pET-28LGOX；将重组质粒pACYC-gabTD与重组质粒pET-28LGOX共同导入E.coli BL21（DE3）中，从平板上挑取重组菌株E.coli-YDT-28LGOX的单菌落接种到含有35mg/L氯霉素抗性和50mg/L卡那霉素抗性的5mlLB摇管中，培养6-8h后转接到含有和35mg/L氯霉素抗性和50mg/L卡那霉素抗性的100mlLB培养基中，培养至OD600=0.8，离心收菌，得到过表达了gabDT和LGOX的重组菌株E.coliBL-YDT-28LGOX。
3.根据权利要求1所述的利用大肠杆菌表达DavA、DavB、GabD、GabT和 LGOX产戊二酸的方法，其特征在于，步骤2中催化体系中底物L-赖氨酸和L-谷氨酸钠摩尔比为1：3。
4.根据权利要求1所述的利用大肠杆菌表达DavA、DavB、GabD、GabT和 LGOX产戊二酸的方法，其特征在于，步骤2中催化反应中诱导温度为25℃。
5.根据权利要求1所述的利用大肠杆菌表达DavA、DavB、GabD、GabT和 LGOX产戊二酸的方法，其特征在于，步骤2中催化反应中所述的IPTG添加量为1.0mmol/L。
6.根据权利要求1所述的利用大肠杆菌表达DavA、DavB、GabD、GabT和 LGOX产戊二酸的方法，其特征在于，步骤2中催化反应中E.coli BL-22AB细胞和E.coli BL-YDT-28LGOX细胞OD比例为1：4。
7.根据权利要求1所述的利用大肠杆菌表达DavA、DavB、GabD、GabT和 LGOX产戊二酸的方法，其特征在于，步骤2中将重组菌株E.coli BL-22AB细胞和重组菌株E.coli BL-YDT-28LGOX细胞比例按照1:1混合，加入10g/L底物L-赖氨酸和10g/L底物L-谷氨酸钠，在37℃，转速200rpm条件下进行催化反应，定时取样，所述E.coli BL-22AB OD600=5。
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