CN104789516B - 一种产三羟基丙酸的集胞藻6803基因工程菌及构建方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种产三羟基丙酸的集胞藻6803基因工程菌及构建方法及应用，构建方法为：将橙色绿曲挠菌中丙二酰辅酶A还原酶基因克隆进入集胞藻6803，并将集胞藻6803中乙酰辅酶A羧化酶、生物素酰化酶以及NAD(P)转氢酶基因进行过表达，本发明通过合成生物学方法改造集胞藻6803，得到一种产三羟基丙酸集胞藻6803基因工程菌，实验证明，本发明的基因工程菌最终3‑HP产量达到837.18mg/L，这对光合微生物生产3‑HP具有重要的理论及实际意义。

Description

一种产三羟基丙酸的集胞藻6803基因工程菌及构建方法及 应用

技术领域

本发明属于工业微生物领域，具体涉及一种产三羟基丙酸的基因工程菌及构建方法及应用。

背景技术

3-羟基丙酸(3-hydroxypropionic acid，简称3-HP)，又名β-羟基丙酸，是一种无色无味的油状液体，可与水、醇、醚等多种有机溶剂互溶。其分子两端分别带有一个羟基和一个羧基，是较为活泼的分子。美国能源部能效和可再生资源办公室在2002年4月提出了6个关于生物质研究及能源、可再生资源、经济资源生产项目，这其中，美国Cargill公司和Codexis公司的共同合作研究以谷物类碳水化合物生产3-HP的发酵新工艺就是6个项目之一。2004年8月的美国能源部报告将3-HP列为当前世界上12种最具开发潜力的生物基产品名单第三名，作为一种具有重要经济价值的新兴平台化合物，对于它的合成方法研究有着极其重要的工业价值。

3-HP传统上主要通过化学合成法进行生产，但产品分离纯化较复杂，生产成本相应较高，只能够少量合成供实验室使用，离大规模产业化应用有很大的差距。为了解决这一难题，近年来通过生物工程法合成3-HP也有了广泛的研究。微生物发酵法和化学法相比成本低、操作简单、条件温和、副产物少、绿色环保，然而，这些现有的生物合成方法都需要大量生物质作为发酵碳源，存在着“与人争粮”的问题，大规模使用的前期尚待观察。

集胞藻6803作为一种光合蓝细菌，作为“自养型细胞工厂”的底盘细胞有着显著的优势。因此，利用集胞藻6803为宿主经过基因改造生产3-HP具有重大意义，但目前尚未有产三羟基丙酸蓝细菌基因工程菌报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种产三羟基丙酸集胞藻6803基因工程菌。

本发明的另一目的是提供产三羟基丙酸集胞藻6803基因工程菌的构建方法。

本发明的进一步目的是提供产三羟基丙酸集胞藻6803基因工程菌在生产三羟基丙酸中的应用。

本发明的技术方案概述如下：

一种产三羟基丙酸的集胞藻6803基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

1)以序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.9为上、下游引物以橙色绿曲挠菌基因组为模板，通过PCR扩增得到丙二酰辅酶A还原酶基因mcr，所述基因mcr的序列用SEQ IDNo.17所示，以SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQID No.7和SEQ ID No.8所示序列分别为上游引物，以SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ IDNo.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15和SEQ ID No.16所示序列分别为下游引物，以集胞藻6803基因组为模板PCR扩增得到PntA，PntB，AccA，AccB，AccC，AccD和BirA基因并依次用SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQ ID No.21、SEQ ID No.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24所示；

2)将步骤1)中得到的基因mcr与pZTS质粒用限制性内切酶BamHI和NotI进行消化，将pntA基因用限制性内切酶KpnI和NotI进行消化，将pntB基因用限制性内切酶KpnI和XhoI进行消化，并依次插入到表达载体pTZS中得到pTZS-MP载体；将accB基因用限制性内切酶EcoRI和SacI进行消化，将accC基因用限制性内切酶KpnI和SacI进行消化，将accA基因用限制性内切酶XhoI和KpnI进行消化，将accD基因用限制性内切酶XhoI和NotI进行消化，将birA基因用限制性内切酶NotI和SmaI进行消化，并依次连入pJA2表达载体中得到pJA-ACC载体；

3)将pTZS-MP载体转入集胞藻6803中，涂布含10μg/mL的氯霉素BG11平板培养基，挑取阳性转化子，并进行分子鉴定阳性克隆，筛选阳性克隆，得到重组集胞藻6803工程菌命名为SMP；将pJA-ACC载体转入重组集胞藻6803工程菌SMP中，涂布于含10μg/mL的卡那霉素BG11平板培养基，挑取阳性转化子，并进行分子鉴定阳性克隆，筛选阳性克隆，得到产三羟基丙酸的集胞藻6803基因工程菌命名为SMPA。

上述方法构建的产三羟基丙酸的集胞藻6803基因工程菌。

上述产三羟基丙酸的集胞藻6803基因工程菌在生产三羟基丙酸中的应用。

本发明的优点：

本发明通过合成生物学方法改造集胞藻6803，得到一种产三羟基丙酸的集胞藻6803基因工程菌命名为SMPA，实验证明，本发明的基因工程菌最终3-HP产量达到837.18mg/L，这对光合微生物生产3-HP具有重要的理论及实际意义。

附图说明

图1为本发明通过PCR方法扩增得到的基因电泳图，其中图1-1中，1-7分别为accA、accB、accC、accD、birA、pntA以及pntB基因，图1-2为MCR基因电泳图，M为DNAMaker。

图2为本发明的产三羟基丙酸集胞藻6803基因工程菌MCR,PntAB,ACCBirA基因PCR验证结果，1-3分别为mcr、pntAB以及accBCADbirA基因，M为DNAMaker。。

图3为本发明MCR蛋白表达SDS-PAGE分析图，其中，M为低分子量蛋白Marker。

图4为本发明高产3-HP集胞藻6803工程菌产量分析图。

具体实施方式

下面的实施例是为了使本领域的技术人员更好地理解本发明但并不用于限制本发明。

本发明各实施例使用集胞藻(Synechocystis sp.PCC 6803)，该菌购自美国菌株保藏中心ATCC，菌株代码ATCC 27184。购买于2012.5.30。橙色绿曲挠菌(Chloroflexusaurantiacus)该菌购自美国菌株保藏中心ATCC，菌株代码ATCC 29362。购买于2012.5.30。大肠感受态细胞购自全式金公司。

表达载体pTZS为本研究中构建的一种含有文献(Discovery of a super-strongpromoter enables efficient production of heterologous proteins incyanobacteria)中报道的超强启动子P_cpc560的载体，该表达载体以pTZ57R/T载体为基础，该载体购自美国Thermo Scientific公司，将同源臂slr1704、sll1575、氯霉素抗性基因、超强启动子(P_cpc560)以及终止子(TrbcL)通过酶切连入其中构成；

pJA2表达载体为文献(Using Transcriptomics To Improve Butanol Tolerancein Synechocystis sp.Strain PCC 6803)中报道。

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明：

实施例1

产三羟基丙酸的集胞藻6803基因工程菌SMPA的构建：

(1)目的基因的体外扩增：

采用细菌基因组提取试剂盒提取橙色绿曲挠菌基因组

以序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.9为上、下游引物以橙色绿曲挠菌基因组为模板，通过PCR扩增得到丙二酰辅酶A还原酶基因mcr，基因mcr的序列用SEQ ID No.17所示，以SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示序列分别为上游引物，以SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15和SEQ ID No.16所示序列分别为下游引物，采用细菌基因组提取试剂盒提取集胞藻6803基因组，以集胞藻6803基因组为模板PCR扩增得到PntA，PntB，AccA，AccB，AccC，AccD和BirA基因并依次用SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQ ID No.21、SEQ ID No.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24所示；乙酰辅酶A羧化酶由AccA，AccB，AccC和AccD组成；BirA基因是生物素酰化酶，NAD(P)转氢酶由PntA和PntB亚基组成。

步骤为：

取基因组溶液10ng，5×Phusion HF buffer 4μl，10μM的dNTP 0.4μl，10μM的上下游片段引物各1μl，Phusion酶0.2μl，无菌水12.4μl，在PCR管中混匀；将PCR管放入PCR仪中进行扩增循环，扩增程序为：98℃30s；98℃10s，72℃30s，72℃30s/kb，共30个循环，72℃10min，4℃5min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得上述目的基因片段。

从图1中可以观察到PntA，PntB，AccA，AccB，AccC，AccD和BirA基因以及MCR基因片段已经成功获得，其大小分别为1593，1443，981，465，1347，981，825和3663bp。(2)质粒载体的构建

将步骤1)中得到的目的基因mcr与pZTS质粒用限制性内切酶BamHI和NotI同时进行消化，取目的基因200ng，两种限制性内切酶各1μl，Fastdegist Buffer 2μl，无菌水补加至20μl，37℃反应1h后经DNA纯化试剂盒纯化使用T4DNA连接酶进行连接；质粒片段和目的基因片段按照摩尔比1:3混合，加入连接缓冲液2μl，T4DNA连接酶1μl，无菌水补加至总体系20μl，22℃连接1.5h后转化如大肠杆菌感受态细胞Trans5α进行质粒复制扩增。在验证无误之后将pntA基因用限制性内切酶KpnI和NotI酶切连接至mcr基因之后，再使用相同方法将pntB基因用限制性内切酶XhoI和NotI酶切连接至pntA基因之后得到pTZS-MP载体；将accB基因用限制性内切酶EcoRI和SacI进行消化，将accC基因用限制性内切酶KpnI和SacI进行消化，将accA基因用限制性内切酶XhoI和KpnI进行消化，将accD基因用限制性内切酶XhoI和NotI进行消化，将birA基因用限制性内切酶NotI和SmaI进行消化，并依次连入pJA2表达载体中得到pJA-ACC载体；

将accB基因用限制性内切酶EcoRI和SacI进行消化，将accC基因用限制性内切酶KpnI和SacI进行消化，将accA基因用限制性内切酶XhoI和KpnI进行消化，将accD基因用限制性内切酶XhoI和NotI进行消化，将birA基因用限制性内切酶NotI和SmaI进行消化，按次序连入pTZ57R/T载体中形成一个基因片段accBCADbirA，再将该片段用限制性内切酶XbaI和BamHI进行消化并依次连入pJA2表达载体中得到pJA-ACC载体。将上述构建完成的pZTS-MP以及pJA-ACC载体分别先转入大肠杆菌中进行质粒的扩增获得大量质粒。本发明中酶切连接的条件均相同。

(3)目的基因的转化

无菌条件下，接种集胞藻菌液于BG 11液体培养基中，放置于光照培养箱中培养，温度为30℃，光照强度为2000Lux，转速为130rpm,UV-1750分光光度计测其藻密度，待藻液OD₇₃₀nm值长到0.4～0.6时，取藻液1.5ml，3000g离心5min,去上清。将藻细胞收集后，加入200μl BG 11液体培养基将藻细胞打散，使藻细胞浓缩至OD₇₃₀nm值为2.5～3.0左右。加入步骤(2)所构建的质粒pZTS-MP 500ng，在恒温混匀器中30℃暗转化，6h后在含有氯霉素的固体培养基BG 11上进行涂布，在光照培养箱中培养，待10天左右阳性转化子长出后传代培养，获得纯净的构建株SMP。用同样的方法将构建的质粒pJA-ACC转入构建株SMP中得到构建株SMPA，并使用PCR对过表达基因进行验证，其验证结果如图2所示。

从图2中可以观察到MCR，PntAB和ACCBirA基因已经成功的转入集胞藻6803中，其大小分别为3663，3036和1599bp。所有基因都已通过基因测序进行验证无误，本发明中所有PCR条件与实施例1中条件相同。

所述液体培养基BG 11：NaNO₃1.5g，K₂HPO₄.3H₂O 0.04g，MgSO₄·7H₂O 0.075g，EDTA0.001g，N_a2CO₃0.02g，H₃BO₃2.86g，MnCl₂·4H₂O 1.81g，ZnSO₄·7H₂O 0.222g，NaMoO₄·5H₂O0.390g，CuSO₄·5H₂O 0.079g，Co(NO₃)₂·6H₂O 0.0494g，CaCl₂·2H₂O 0.036g，柠檬酸铁铵0.006g，加水至1L。

所述固体培养基BG 11：NaNO₃1.5g，K₂HPO₄.3H₂O 0.04g，MgSO₄·7H₂O 0.075g，EDTA0.001g，N_a2CO₃0.02g，H₃BO₃2.86g，MnCl₂·4H₂O 1.81g，ZnSO₄·7H₂O 0.222g，NaMoO₄·5H₂O0.390g，CuSO₄·5H₂O 0.079g，Co(NO₃)₂·6H₂O 0.0494g，CaCl₂·2H₂O 0.036g，柠檬酸铁铵0.006g，琼脂15g，加水至1L。

实施例2

构建株SMPA中生产3-HP条件

构建株SMPA在正常BG 11中培养，摇床设置参数为光照强度2000Lux，转速130rpm，温度30℃。接种时取OD_730nm为0.2的新鲜细胞5mL加入20mL培养基中，每组做3个平行样，用UV-1750分光光度计测定波长为730nm下的吸光值，当OD_730nm为1.0时，将25mL菌液在900xg离心15min，用10mL新鲜BG11培养基重悬，培养生产3-HP，每天补加1M NaHCO₃0.5mL，6天后检测3-HP产量。

实施例3

丙二酰辅酶A还原酶表达鉴定

细胞收集，7600rpm离心10min,留取菌体于100℃条件下沸水浴10min，之后进行SDS-PAGE电泳(图3)。

从图3中构建株与野生型菌株总蛋白的对比可以观察到，丙二酰辅酶A还原酶得到了表达，其大小为132KD。

3-HP产量检测

细胞收集，7600rpm 4℃离心10min,留上清进行样品衍生化，取100μl上清液，干燥完全后加入10μl甲氧氨基盐酸盐吡啶溶液(4mg/ml)30℃750rpm恒温震荡90min。加入90μlMSTFA 37℃450rpm恒温震荡30min。13000rpm常温离心10min，取70～75μl上样注意不要吸取到底部白色絮状物。GC-MS分析使用GC 7890系统与MSD 5975偶联系统。3-HP产量检测结果如图4所示，最终3-HP产量达到837.18mg/L。

Claims (3)

1.一种产三羟基丙酸的集胞藻6803基因工程菌的构建方法，其特征是包括如下步骤：

1)以序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.9为上、下游引物以橙色绿曲挠菌基因组为模板，通过PCR扩增得到丙二酰辅酶A还原酶基因mcr，所述基因mcr的序列为SEQ ID No.17所示，以SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示序列分别为上游引物，以SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15和SEQ ID No.16所示序列分别为下游引物，以集胞藻6803基因组为模板PCR扩增得到PntA，PntB，AccA，AccB，AccC，AccD和BirA基因并依次用SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQ ID No.21、SEQ ID No.22、SEQ IDNo.23、SEQ ID No.24所示；

2)将步骤1)中得到的基因mcr与pZTS质粒用限制性内切酶BamHI和NotI进行消化，将pntA基因用限制性内切酶KpnI和NotI进行消化，将pntB基因用限制性内切酶KpnI和XhoI进行消化，并依次插入到表达载体pTZS中得到pTZS-MP载体；将accB基因用限制性内切酶EcoRI和SacI进行消化，将accC基因用限制性内切酶KpnI和SacI进行消化，将accA基因用限制性内切酶XhoI和KpnI进行消化，将accD基因用限制性内切酶XhoI和NotI进行消化，将birA基因用限制性内切酶NotI和SmaI进行消化，并依次连入pJA2表达载体中得到pJA-ACC载体；

3)将pTZS-MP载体转入集胞藻6803中，涂布含10μg/mL的氯霉素BG11平板培养基，挑取阳性转化子，并进行分子鉴定阳性克隆，筛选阳性克隆，得到重组集胞藻6803工程菌命名为SMP；将pJA-ACC载体转入重组集胞藻6803工程菌SMP中，涂布于含10μg/mL的卡那霉素BG11平板培养基，挑取阳性转化子，并进行分子鉴定阳性克隆，筛选阳性克隆，得到产三羟基丙酸的集胞藻6803基因工程菌命名为SMPA。

2.权利要求1的方法构建的产三羟基丙酸的集胞藻6803基因工程菌。

3.权利要求2的产三羟基丙酸的集胞藻6803基因工程菌在生产三羟基丙酸中的应用。