CN102787130B - 一种耐酸性高温α-淀粉酶及其基因、工程菌和制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种耐酸性高温α-淀粉酶及其基因、工程菌和制备方法，其技术方案是利用重组DNA技术定点突变地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因，得到耐高温α-淀粉酶耐酸性突变基因，即耐酸性高温α-淀粉酶基因，并利用枯草芽孢杆菌表达系统，分泌表达耐酸性高温α-淀粉酶的方法。本发明解决了现有耐高温α-淀粉酶耐酸性较差，耐高温与耐酸性无法同时兼顾，造成应用受限的问题，满足了一些在酸性和高温环境下进行淀粉原料液化工艺的要求，可提高产品收得率及质量，简化工艺。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及基因的定点突变和重组DNA技术，尤其是一种耐酸性高温α-淀粉酶及其基因、工程菌和制备方法。
背景技术
α-淀粉酶(α-1,4-glucan-4-glucanohyddrolase EC 3.2.1.1)能够以淀粉为底物，从淀粉内部水解α-1,4葡萄糖苷键，生成麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖。淀粉在α-淀粉酶的作用下，分离迅速降解，粘度下降，即完成液化。α-淀粉酶可由微生物发酵产生，也可由植物、动物提取。目前工业生产上大都以微生物发酵大规模生产α-淀粉酶。枯草杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、米曲霉、黑曲霉等都是具有使用价值的α-淀粉酶产生菌，其中地衣芽孢杆菌生产的α-淀粉酶因具有热稳定性而被优选使用。耐高温的α-淀粉酶由于具有相当高的热稳定性，因此自从1973年开始投入生产以来，可被广泛应用于制糖、酿造、有机酸等以淀粉为原料的深加工工业，是目前工业上用途最为广泛的酶种之一。
在实际生产中，淀粉经糊化后的自然pH常常在4.5左右，但一般α-淀粉酶最适pH为6.5，所以液化前需加要碱提高pH值。目前，国内外使用量最大的来源于黑曲霉的糖化酶最适pH为4.3-4.8，这就要求淀粉液化后，在进行糖化酶糖化前，必须再将pH值调回到4.5左右。且液化中低pH条件有利于减少影响糖液质量的糠醛、氨基葡萄糖等色素物质的形成，提高糖液质量。同时，pH的反复调节既增加了操作步骤，也增大了化学试剂的消耗，需要在最后的终产物处理中利用离子交换将多余的盐分除去。为了给淀粉原料深加工提供更好地工艺条件，提高产品质量和收得率、降低消耗、增加效益、特别是节约工业用粮，开发一种耐酸性高温α-淀粉酶，从而满足一些在酸性条件下进行淀粉原料液化工艺的要求，就显得势在必行。
目前，研究者主要通过菌种选育和基因工程手段，改善耐高温α-淀粉酶。德国Nielsen经定点突变后获得地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶突变体Y290E，在酸性条件下活力提高，但耐热性能降低。美国Richardson从各地深海及酸性土壤环境微生物构建的宏基因组文库中筛选得到三个α-淀粉酶突变体，BD5031及BD5064表现出高活性但并不耐酸或者耐高温，BD5063耐酸耐高温但是活性很低。印度Priyadharshini对部分地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶氨基酸序列进行随机突变，获得一个pH适用范围变宽的突变体I57S/W193R，但其催化活性及耐热性能均显著降低。
在我国，20世纪90年代中科院微生物研究所研究了嗜热真菌Thermomyces lanuginosus所产的α-淀粉酶，该酶的最适温度和pH分别为65℃和5.0，但其耐热性较差。目前商品化应用的真菌Aspergillus oryzae和Aspergillus awamori所产α-淀粉酶pH范围为5.0-6.0，但不耐高温。江南大学从淀粉加工厂的酸性土壤中筛选到的Bacillus stearothermopilius，能够产生两种酸性α-淀粉酶，最适pH分别为4.5和5.0，最适温度为60℃，可以应用于一定条件下酒糟利用和处理。
目前α-淀粉酶难以兼顾耐高温、耐酸性及高活力的特性，因此不能适应我国制糖、酿造、有机酸等以淀粉为原料的深加工工业的要求。为了适应整个淀粉加工行业的需要，满足一些在酸性条件下以淀粉为原料液化工艺的要求，应开发一种在高温、低pH值下活力稳定的耐酸性高温α-淀粉酶。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种耐酸性高温α-淀粉酶及其基因、工程菌和制备方法，本发明制备获得的该耐酸性高温α-淀粉酶具有良好的酸稳定性，在pH4.5，90℃下保温60min残余活力仍保持在40%以上。
本发明实现目的的技术方案如下：
一种耐酸性高温α-淀粉酶基因，其基因序列为序列8。
一种耐酸性高温α-淀粉酶基因的构建方法，方法为：将耐高温α-淀粉酶基因进行定点突变，第1058位碱基C→T，第1199位碱基A→G，得到耐酸性高温α-淀粉酶基因；所述耐高温α-淀粉酶基因见序列7。
一种耐酸性高温α-淀粉酶工程菌，含有如权利要求1所述的耐酸性高温α-淀粉酶基因。
而且，所述工程菌的宿主细胞为枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。
而且，所述工程菌为6种胞外蛋白酶缺失的枯草芽孢杆菌B.subtilis WB600。
而且，所述工程菌中的表达载体为大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒pBSA43。
一种耐酸性高温α-淀粉酶，具有如权利要求1所述的基因编码的蛋白序列。
而且，所述的α-淀粉酶在温度90℃，pH4.5下活力稳定。
一种耐酸性高温α-淀粉酶的制备方法，其特征在于：步骤如下：
⑴将耐高温α-淀粉酶基因进行定点突变，第1058位碱基C→T，第1199位碱基A→G，得到耐酸性高温α-淀粉酶基因；所述耐高温α-淀粉酶基因见序列7；
⑵将上述耐酸性高温α-淀粉酶基因与表达载体连接，构建获得携带有耐酸性高温α-淀粉酶基因的重组载体；
⑶将重组载体转化入宿主菌株中，构建获得重组菌株；
⑷重组菌株分泌表达，发酵制备耐酸性高温α-淀粉酶。
而且，所述步骤⑵中的表达载体为大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒pBSA43。
本发明的优点和积极效果如下：
1、本发明利用重叠PCR技术，对耐高温α-淀粉酶基因进行定点突变，获得耐酸性高温α-淀粉酶基因（T353I/H400R），并通过分泌型表达载体，转化枯草芽孢杆菌，使耐酸性高温α-淀粉酶得以表达，制备获得的该耐酸性高温α-淀粉酶具有良好的酸稳定性，在pH4.5，90℃下保温60min残余活力仍保持在40%以上。
2、本发明制备的酶适用于一些淀粉深加工行业，对提高淀粉加工原料利用率和产品质量、简化工艺、降低消耗、减少环境污染具有显著效果，不仅具有明显的社会效益，也具有重要的经济效益。
附图说明
图1为本发明耐高温α-淀粉酶的PCR扩增电泳图，其中：1、DNA分子量标准，2、耐高温α-淀粉酶基因片段；
图2为本发明重组质粒pUC-amy酶切验证图，其中：1、DNA分子量标准，2、pUC-amy经BamHI和HindIII双酶切，3、pUC-amy经BamHI单酶切；
图3为本发明耐高温α-淀粉酶的定点突变示意图；
图4为本发明耐高温α-淀粉酶（amy）与耐酸性高温α-淀粉酶（amyd）基因序列比对突变位点示意图；
图5为本发明重组载体pBSA43-amyd构建示意图；
图6为本发明重组菌株分泌表达耐酸性高温α-淀粉酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，其中：1、蛋白分子量标准，2、重组菌株WB600/pBSA43-amyd发酵上清液，3、对照菌株WB600/pBSA43发酵上清液；
图7为本发明重组菌株分泌表达耐酸性高温α-淀粉酶纯化的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，其中：1、蛋白分子量标准，2、耐酸性高温α-淀粉酶，3、耐高温α-淀粉酶。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明利用定点突变技术对地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因进行定向改造获得耐酸性高温α-淀粉酶基因，具体为利用重叠PCR技术对耐高温α-淀粉酶基因进行定点突变，第1058位碱基C→T，第1199位碱基A→G，得到耐酸性高温α-淀粉酶基因，再克隆到大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭表达分泌表达型载体pBSA43，转化6种胞外蛋白酶缺失的枯草芽孢杆菌WB600，实现耐酸性高温α-淀粉酶分泌表达，成功制备获得一种耐酸性高温α-淀粉酶。
其中，pBSA43是大肠杆菌－芽孢杆菌穿梭分泌表达型载体，含有一个强启动子P43启动突变基因的转录，一个编码果聚糖蔗糖酶基因sacB的信号肽用于指导合成α-淀粉酶分泌到胞外，适于在枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌中表达蛋白。
一、耐高温α-淀粉酶基因（amy）的扩增
提取地衣芽孢杆菌基因组，地衣芽孢杆菌在中国工业微生物菌种保藏管理中心CICC保藏，保藏号：CICC10181。设计如下引物：
上游引物F1：(5’-CGCGGATCCGGCAAATCTTAATGGGACGCT-3’)，
下游引物R1：(5’-CCCAAGCTTCTATCTTTGAACATAAATTGAAACC-3’)，
其中上游引物F15’端引入BamHI酶切位点（下划线部分），下游引物R15’端引入HindIII酶切位点（下划线部分）。以地衣芽孢杆菌基因组为模板，进行PCR，按以下次序，将各成分在灭菌薄壁离心管内混合，反应体系为：
10×buffer 5μL，
dNTPs(2.5mmol/L each) 2μL，
上游引物F1（20μmol/L） 2μL，
下游引物R1（20μmol/L） 2μL，
DNA模版 1μL，
Pyrobest高保真DNA聚合酶 0.5μL，
ddH2O 37.5μL，
总体积 50μL
扩增条件为：95℃5min，1个循环；94℃30s，53℃30s，72℃1min，30个循环；最后一个循环为72℃10min。
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测在约1.5kb处出现特异性条带，其大小与目的基因amy片段大小完全吻合。
将扩增得到的目的基因amy与pUC19（购自TAKARA公司）分别用BamHI和HindIII双酶切，经纯化后，通过连接试剂盒（购自TAKARA公司）在16℃连接12h，构建重组质粒pUC-amy。
将10μL的pUC-amy电转化40μL大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布在含氨苄青霉素（100μg/mL）的IPTG、X-gal的LA（LB：胰蛋白胨1%，酵母抽提物0.5%，氯化钠1%；琼脂粉2%）平板上，从蓝白选择平板上挑选验证正确的阳性转化子pUC-amy。测序（委托上海生工生物工程公司）结果表明扩增获得耐高温α-淀粉酶基因amy。
二、耐高温α-淀粉酶基因的定点突变
设计如下引物（委托上海英俊生物技术有限公司合成）：
重叠引物A：5’-TACGCTTTTATTCTCATAAGGGAATCT-3’
重叠引物B：5’-AGATTCCCTTATGAGAATAAAAGCGTA-3’
重叠引物C：5’-GGAGCACAGCGTGATTATTTCGACCA-3’
重叠引物D：5’-TGGTCGAAATAATCACGCTGTGCTCC-3’
重叠引物A与B中包含了对1058位核苷酸的突变（C→T），使其编码的353位氨基酸由苏氨酸突变为异亮氨酸，重叠引物C与D中包含了对1199位核苷酸的突变（A→G），使其编码的400位氨基酸由组氨酸突变成精氨酸。
以重组质粒pUC-amy为模板进行PCR扩增，按照如下顺序，将各组分在PCR管内混合；
PCR1，反应体系如下：
10×buffer 5μL，
dNTPs(2.5mmol/L each) 2μL，
上游引物F1（20μmol/L） 2μL，
重叠引物B（20μmol/L） 2μL，
DNA模板（pUC-amy） 1μL，
Pyrobest高保真DNA聚合酶 0.5μL，
ddH2O 37.5μL，
总体积 50μL
PCR2，反应体系如下：
10×buffer 5μL，
dNTPs(2.5mmol/L each) 2μL，
重叠引物A（20μmol/L） 2μL，
下游引物R1（20μmol/L） 2μL，
DNA模板（pUC-amy） 1μL，
Pyrobest高保真DNA聚合酶 0.5μL，
ddH2O 37.5μL，
总体积 50μL
PCR扩增程序：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min。接着进行第二步的PCR，按照如下顺序，将各组分在PCR管内混合；
PCR3，反应体系如下：
10×buffer 5μL，
dNTPs(2.5mmol/L each) 2μL，
PCR1产物 1μL，
PCR2产物 1μL，
Pyrobest高保真DNA聚合酶 0.5μL，
ddH2O 40.5μL，
总体积 50μL
PCR扩增程序：95℃5min；1个循环；95℃30s，58℃30s，72℃10min，10个循环；72℃5min1个循环。
PCR4，反应体系如下：
10×buffer 5μL，
dNTPs(2.5mmol/L each) 2μL，
上游引物F1（20μmol/L） 2μL，
下游引物R1（20μmol/L） 2μL，
PCR3产物 1μL，
Pyrobest高保真DNA聚合酶 0.5μL，
ddH2O 37.5μL，
总体积 50μL
PCR扩增程序：95℃5min；1个循环；95℃30s，58℃30s，72℃1min，25个循环；72℃10min1个循环。
测序（委托上海生工生物工程公司）结果表明此时扩增得到的是对第1058位核苷酸突变（C→T）的基因片段amy1，以此基因为DNA模版进行下一轮PCR。
PCR5，反应体系如下：
10×buffer 5μL，
dNTPs(2.5mmol/L each) 2μL，
上游引物F1（20μmol/L） 2μL，
重叠引物D（20μmol/L） 2μL，
DNA模板（amy1） 1μL，
Pyrobest高保真DNA聚合酶 0.5μL，
ddH2O 37.5μL，
总体积 50μL
PCR6，反应体系如下：
10×buffer 5μL，
dNTPs(2.5mmol/L each) 2μL，
重叠引物C（20μmol/L） 2μL，
下游引物R1（20μmol/L） 2μL，
DNA模板（amy1） 1μL，
Pyrobest高保真DNA聚合酶 0.5μL，
ddH2O 37.5μL，
总体积 50μL
PCR扩增程序：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min。接着进行第二步的PCR，按照如下顺序，将各组分在PCR管内混合；
PCR7，反应体系如下：
10×buffer 5μL，
dNTPs(2.5mmol/L each) 4μL，
PCR5产物 1μL，
PCR6产物 2μL，
Pyrobest高保真DNA聚合酶 0.5μL，
ddH2O 37.5μL，
总体积 50μL
PCR扩增程序：95℃5min；1个循环；95℃30s，58℃30s，72℃10min，10个循环；72℃5min1个循环。
PCR8，反应体系如下：
10×buffer 5μL，
dNTPs(2.5mmol/L each) 2μL，
上游引物F1（20μmol/L） 2μL，
下游引物R1（20μmol/L） 2μL，
PCR7产物 1μL，
Pyrobest高保真DNA聚合酶 0.5μL，
ddH2O 37.5μL，
总体积 50μL
PCR扩增程序：95℃5min；1个循环；95℃30s，58℃30s，72℃1min，25个循环；72℃10min1个循环。
测序（委托上海生工生物工程公司）结果表明此时扩增得到的是对第1058位核苷酸突变（C→T）和对第1199位核苷酸突变（A→G）的基因片段amyd。
三、耐酸性高温α-淀粉酶表达载体pBSA43-amyd的构建
pBSA43为以大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭克隆载体pBE2为骨架，克隆入一个强的芽孢杆菌组成型启动子P43及能够使重组蛋白直接分泌到培养基中的果聚糖蔗糖酶信号序列sacB而获得。它同时含有枯草杆菌质粒pUB110的复制子和大肠杆菌质粒pGEM3的复制子，既能在大肠杆菌又能在枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌细胞中进行自主复制。它带有Ampr基因，可以在大肠杆菌中利用氨苄青霉素抗性作为筛选标记。同时又带有Kmr，可以在枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌中利用卡那霉素抗性作为筛选标记。
将经重叠PCR构建获得的耐酸性高温α-淀粉酶基因amyd与pBSA43分别用BamHI、HindIII双酶切，经纯化后，通过连接试剂盒（购自TAKARA公司）在16℃连接12h，构建重组质粒pBSA43-amyd。将10μL的pBSA43-amyd电转化40μL大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布在含氨苄青霉素（100μg/mL）的LA平板上，挑选阳性转化子，提取质粒进行酶切验证，确定构建获得重组菌株JM109/pBSA43-amyd。
四、表达载体pBSA43-amyd转化枯草芽孢杆菌WB600
按下述方法制备枯草芽孢杆菌WB600（实验室保存）的感受态细胞。挑取一环孢子接种于少量生长培养基（LB+0.5mol/L山梨醇）中，过夜培养。将种子以1/16的接种量接种于生长培养基（LB+0.5mol/L山梨醇）中，37℃摇床震荡培养至OD600在0.85-0.95左右。冰水浴冷却培养物10min，于4℃，5000r/min，离心5min收集菌体。反复用冰冷的电击缓冲液（0.5mol/L山梨醇，0.5mol/L甘露醇，10%(V/V)甘油）洗涤细胞收集物4次。用原培养液1/40体积的电击缓冲液重新悬浮细胞收集物，细胞浓度应该在1-1.3×1010cfu/mL。感受态细胞分装为60μL/EP管保存在-80℃（不需要液氮预冻），在转化效率有所下降之前都可以正常使用。转化条件：60μL感受态细胞加入1μL（50ng/μL）pBSA43-amyd混匀并转移到冰冷的电转化杯（1mm）中，冰浴1-1.5min后，电击一次（25μF，200Ω，4.5-5.0ms）。电击完毕之后，立即加入1mL复苏培养基（LB+0.5mol/L山梨醇+0.38mol/L甘露醇）。37℃摇床震荡培养3h之后，将复苏物涂布在LB平板上，37℃培养24-36h，挑取阳性转化子，获得枯草芽孢杆菌重组菌株WB600/pBSA43-amyd。
五、耐酸性高温α-淀粉酶在枯草芽孢杆菌重组菌株中的表达及纯化耐酸性高温α-淀粉酶
将枯草芽孢杆菌重组菌株WB600/pBSA43-amyd接种于LB液体培养基(含卡纳霉素，30μg/mL)中，37℃，200r/min培养过夜，按1%接种量转接于50mL新鲜培养基中，200r/min培养24h，由于表达载体pBSA43为枯草芽孢杆菌组成型表达载体，不需额外加诱导剂诱导，培养24h后，即可制备获得耐酸性高温α-淀粉酶粗酶液。直接取样进行SDS-PAGE及活性检测。
纯化耐酸性高温α-淀粉酶的步骤如下：采用分级盐析法，先以30%饱和度的硫酸铵盐析除去杂蛋白，再把饱和度加大到70%，沉淀α-淀粉酶，收集30%-70%范围内蛋白质沉淀部分，溶解后，透析除盐。然后使用弱阴离子交换剂DEAE-Sepharose Fast Flow对硫酸铵盐析得到的活性组分进行分离（2mL上样量，上样后用0.02mol/L Tris-HCl(pH7.0)洗脱未吸附的蛋白，3mL/管分部收集，第51管开始梯度洗脱，缓冲液为0-1.0mol/L NaCl的0.02mol/L Tris-HCl(pH7.0)，流速1.5mL/min，3mL/管分步收集），经DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换后获得的活性组分再用Sephadex G-75凝胶过滤（2mL上样量，上样后用含0.15mol/L NaCl的0.02mol/LTris-HCl(pH7.0)洗脱，流速0.5mL/min，2mL/管分部收集），制备获得电泳纯的耐酸性高温α-淀粉酶。
产品性能测定：
1.α-淀粉酶活力的测定
将枯草芽孢杆菌重组菌株WB600/pBSA43-amyd发酵液，12000r/min离心10min去除细胞，测定上清液中的酶活（记为细胞外酶活）。酶活力单位定义：在70℃、相应pH条件下，1min液化1mg可溶性淀粉成为糊精所需要的酶量，即为1个酶活力单位，以U/mL（U/g）表示。测定方法如下：1．酶液制备：用缓冲液配制成酶溶液，使其最终酶浓度控制在65U/mL-70U/mL范围之内。2．测定：(1)吸取可溶性淀粉溶液（20g/L）20mL和磷酸缓冲液（相应pH）5mL于试管中。在70℃恒温水浴中预热3min-5min。(2)加入稀释好的待测酶液1.00mL，立即计时，摇匀，准确反应5min。(3)立即吸取1.00mL反应液移入预先装有0.1mol/L HCl0.5mL和5mL稀碘液的试管中摇匀。(4)以0.1mol/L HCl0.5mL和5mL稀碘液的混合液作空白，于660nm波长下，用10mm比色皿迅速测定吸光度(A)。根据吸光度查表，求得测试酶液的浓度(C)。3．计算：X=C×N×16.67式中：X-样品的酶活力U/mL（U/g）；C-测试的酶液浓度U/mL；N-样品的稀释倍数；16.67-换算常数。所得结果表示至整数。
表1
| pH | 耐酸性高温α-淀粉酶活力（U/mL） | 耐高温α-淀粉酶活力（U/mL） |
| 4.0 | 1120 | 130 |
| 4.5 | 1470 | 220 |
| 5.0 | 1860 | 450 |
| 5.5 | 2170 | 1130 |
| 6.0 | 1770 | 1810 |
| 6.5 | 1520 | 2160 |
| 7.0 | 1490 | 1930 |
如表1所示，在高温条件70℃、酸性环境pH4.0-5.5之间时，耐酸性高温α-淀粉酶活力明显高于耐高温α-淀粉酶活力，说明制备获得的耐酸性高温α-淀粉酶在酸性条件下活力明显得到提高。
2.耐酸性高温α-淀粉酶性质的研究
经硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephadex G-75凝胶层析分离纯化后，得到电泳纯的耐酸性高温α-淀粉酶，以原始耐高温α-淀粉酶为对照，对其进行酶学性质研究。
⑴温度对酶活力的影响
最适反应温度的测定：在不同温度(60℃、70℃、80℃、90℃、95℃、100℃)，pH6.0的条件下测定重组酶纯化酶液的酶活，将最高活力定为100%。
热稳定性的测定：将重组酶纯化酶液在90℃，pH6.0下保温2h，每隔20min取出，于冰上迅速冷却，各自测定其残余酶活力，以未保温的酶液活力为100%。
⑵pH对酶活力的影响酶
最适反应pH的测定：在不同pH值(3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)，70℃下测定重组酶纯化酶液的酶活，将最高活力定为100%。
pH稳定性的测定：将重组酶纯化酶液在pH4.5下，90℃保温60min，每隔10min取出，于冰上迅速冷却，各自测定其残余酶活力，以未保温的酶活力为100%。
重组酶性质的分析：
通过研究可知，耐酸性高温α-淀粉酶和耐高温α-淀粉酶最适作用温度均为95℃；于pH6.0下，90℃保温60min，耐酸性高温α-淀粉酶和耐高温α-淀粉酶残余酶活力均为80%左右，说明突变位点并没有影响突变酶的耐高温性能。耐酸性高温α-淀粉酶最适作用pH为5.5，耐高温α-淀粉酶最适作用pH为6.5；于pH4.5下，90℃保温60min，耐酸性高温α-淀粉酶残余酶活力为40%，于pH4.5下，90℃保温10min，耐高温α-淀粉酶残余酶活力仅为27%，保温40min后完全失活，说明突变位点显著提高了突变酶的耐酸性能。
由此说明，耐高温α-淀粉酶由原353位的L-苏氨酸变为L-异亮氨酸(ACA→ATA)，原400位的L-丝氨酸变为L-丙氨酸(CAT→CGT)后，可提高耐高温α-淀粉酶在酸性环境中的稳定性，说明耐高温α-淀粉酶基因经定点突变后，构建获得耐酸性高温α-淀粉酶基因，经克隆到大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭表达分泌表达型载体pBSA43，转化6种胞外蛋白酶缺失的枯草芽孢杆菌WB600，实现耐酸性高温α-淀粉酶分泌表达，成功制备获得一种耐酸性高温α-淀粉酶。
Claims (2)
1.一种耐酸性高温α-淀粉酶工程菌，其特征在于：含有基因序列为序列8的耐酸性高温α-淀粉酶基因；
所述工程菌的宿主细胞为枯草芽孢杆菌；
所述枯草芽孢杆菌为B.subtilisWB600；
所述工程菌中的表达载体为大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒pBSA43；
所述pBSA43载体为以穿梭载体pBE2为骨架，克隆入一个芽孢杆菌组成型启动子P43以及果聚糖蔗糖酶的信号序列sacB获得。
2.一种如权利要求1所述的耐酸性高温α-淀粉酶工程菌构建方法，其特征在于：步骤如下：
⑴将耐高温α-淀粉酶基因进行定点突变，第1058位碱基C→T，第1199位碱基A→G，得到耐酸性高温α-淀粉酶基因；所述耐高温α-淀粉酶基因见序列7；
⑵将上述耐酸性高温α-淀粉酶基因与表达载体连接，构建获得携带有耐酸性高温α-淀粉酶基因的重组载体；
⑶将重组载体转化入宿主菌株中，构建获得重组菌株；
⑷重组菌株分泌表达，发酵制备耐酸性高温α-淀粉酶。
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