CN112921017B

CN112921017B - 一种嗜水气单胞菌麦芽糖α-淀粉酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN112921017B
Application number: CN202110443810.4A
Authority: CN
Inventors: 韦宇拓; 蔺小娅; 潘世优; 田芬; 杜丽琴
Original assignee: Guangxi University
Current assignee: Guangxi University
Priority date: 2021-04-23
Filing date: 2021-04-23
Publication date: 2022-09-02
Anticipated expiration: 2041-04-23
Also published as: CN112921017A

Abstract

本发明公开了一种嗜水气单胞菌麦芽糖α‑淀粉酶突变体，所述嗜水气单胞菌麦芽糖α‑淀粉酶突变体的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。本发明的麦芽糖α‑淀粉酶水解产物也更单一，主要产物为麦芽糖和少量的葡萄糖，没有低聚糖，水解淀粉产物中麦芽糖能达到99.79％左右，不含麦芽三糖及麦芽四糖，在水解淀粉制备麦芽糖浆上具有优势，极大简化了麦芽糖生产的步骤，能提高淀粉的利用率。

Description

一种嗜水气单胞菌麦芽糖α-淀粉酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及酶工程和基因工程领域，具体涉及一种嗜水气单胞菌麦芽糖α-淀粉酶的突变体及其应用。

背景技术

麦芽糖α-淀粉酶是最重要的工业酶制剂之一，对工业生产技术意义重大，广泛应用于食品、农业、发酵、纺织、制药、洗涤剂、酿造、烘焙和造纸等行业，约占25％的工业酶市场份额。根据淀粉酶的催化模式不同，大致上可以分为外切淀粉酶和内切淀粉酶两大类。作为最常见的酶制剂，麦芽糖α-淀粉酶的来源也十分广泛，包括动物、植物以及微生物，其中微生物来源的淀粉酶因其具有遗传可操作性和巨大的潜在经济应用价值而广受关注。其他潜在的应用包括淀粉加工处理废水、生产生物乙醇、制造低聚糖混合物以及用于生产粉状食品米糕等用的高分子量分支的糊精等。

根据麦芽糖的含量可将麦芽糖浆分为麦芽糖糖饴或M40(麦芽糖含量 <50％)、麦芽糖糖浆或M50(麦芽糖含量50-70％之间)、高麦芽糖糖浆或M70 (麦芽糖含量70-95％)、结晶麦芽糖(麦芽糖含量≥95％)。在淀粉行业，麦芽糖α-淀粉酶主要用于生产高麦芽糖浆，与β-淀粉酶或脱支酶一起使用的双酶法，也有多种酶配合使用的全酶法生产麦芽糖浆。目前，国内市场上麦芽糖产品以低纯度的麦芽糖饴、麦芽糖浆为主，但高纯度结晶麦芽糖的产品却比较少。工业上生产高纯度的麦芽糖，一般是先将原料预处理之后，经液化和糖化过程，浓缩得到普通麦芽糖浆，普通麦芽糖浆通过提纯可以进一步提高产品中麦芽糖含量，如除去糊精和寡糖一般用活性炭柱吸附，麦芽糖先利用阴离子交换树脂吸附，再将吸附柱上的麦芽糖洗脱下来能得到纯度97％以上麦芽糖浆；用有机溶剂(如30％-50％丙酮，v/v)沉淀糖液中糊精可获得95％麦芽糖浆，但是有机溶剂的消耗量大，危害严重；用超滤和反渗透膜等分离方法可获得纯度96％的麦芽糖浆。结晶法提纯麦芽糖，需要原料纯度高。目前工业上一般是先用阳离子交换树脂色层分离法或超滤膜分离法提纯后，再进行麦芽糖结晶操作。也有利用色谱法分离纯化获得高纯度的麦芽糖。张云茹等在温度60℃，pH 5.2条件下加入液化酶，麦芽糖酶和脱支酶、反应时间 72h得到的产率最高可达94.5％。黄伟红等利用淀粉经过液化、糖化、脱色、离子交换、浓缩工序，制备出麦芽糖浆，然后添加活性干酵母继续发酵利用其中的葡萄糖，经优化得到麦芽糖含量超过98％，但是该法操作繁琐，耗时长。

食品工业，尤其糖果业麦芽糖应用广泛，使用麦芽糖制造的硬糖，甜度柔和、透明度较高、抗砂性较好；在制造果酱、果冻时，利用麦芽糖浆的抗结晶性可防止蔗糖结晶析出提高产品质量；在饼干和麦乳精中，利用麦芽糖浆的低吸湿性可使其保持松脆性、货架期得以延长；麦芽糖也可应用于啤酒酿制、面包烘烤、软饮料的生产中；麦芽糖浆也可用作加工改进剂，能代替葡萄糖制成医药注射液，因其渗透压力只有葡萄糖的一半，能提高2倍注射液浓度，供热量比葡萄糖高2倍，并且麦芽糖的水解速度比葡萄糖更慢，适合于糖尿病和肥胖病患者使用；麦芽糖经葡萄糖苷转糖基反应，可以制成促进双歧杆茵生长的功能性低聚糖——低聚异麦芽糖。然而，麦芽糖在自然界中并不以游离的形式存在，采用酶法制备麦芽糖浆，但是里面还含有麦芽三糖、葡萄糖、寡糖、色素等，需要经过后期的分离纯化，才能得到高纯度的麦芽糖。常用的方法有活性炭吸附法、溶剂沉淀、结晶、膜分离法、纳滤法、离子交换树脂法]、色谱法等，这些方法不仅繁琐而且价格昂贵。高麦芽糖浆和结晶麦芽糖的应用日益扩大，需求也在日益扩增，如何提高麦芽糖浆中的麦芽糖含量，简化提取和纯化的步骤成亟待解决的问题。

据估计，2016年度工业酶市场价值为46亿1000万美元，预计将从2017 到2022年的复合年增长率为5.8％。按价值计算，水果和蔬菜加工酶市场2022 年底将达到413亿9000万美元，2016至2022年间的复合年增长率为6.7％。近些年来，我国在麦芽糖生产工业上取得了很大进步，但是酶制剂多依赖国外进口，麦芽糖淀粉酶的价格居高不下，生产高纯度的麦芽糖受到多方面的限制。

麦芽糖α-淀粉酶是指水解淀粉获得高麦芽糖含量糖浆的一类α-淀粉酶，它能提高水解淀粉麦芽糖的得率，大大降低生产麦芽糖糖浆的生产成本，因此寻找高产麦芽糖的麦芽糖α-淀粉酶成为国内外麦芽糖生产的研究热点，并开展了大量的研究工作。1989年Evelyn等将来自Penicillium expansum野生淀粉酶纯化出来，水解淀粉得到最高麦芽糖含量为74％的糖浆；1999年Hilary 等从Streptomyces sp IMD2679中分离得到三个淀粉酶，其中麦芽糖α-淀粉酶 III可以水解淀粉得到的麦芽糖含量高达79％的糖浆；1984年日本Outtrap团队最先克隆了来源于Bacillus stearothermuphilus的麦芽糖淀粉酶并将其在枯草芽孢杆菌表达，并将该酶应用于麦芽糖浆的制备，优化反应条件后的麦芽糖浆麦芽糖含量为75％，其中麦芽三糖含量高达11.5％；2015年江南大学Sun Y D等将Bacillusstearothermophilus的淀粉酶进行分子改造，其突变体W177S 水解淀粉得到麦芽糖产量均大于85％的糖浆；2016年Hye-Yeon J等将 Lactobacillus plantarum subsp.plantarumST-III的淀粉酶用大肠杆菌E.coli MC106表达，其水解淀粉产物麦芽糖含量为74％；2017年崔中利等发明申请 CN201610158814.7，公开了一种麦芽糖淀粉酶，其水解淀粉产物中麦芽糖产量大于90％。基于上述原因，对于麦芽糖淀粉酶的筛选、研究和改造，从根本上提高改变其性能具有极其重要的现实意义。

发明内容

本发明针对上述技术问题，提供一种嗜水气单胞菌麦芽糖α-淀粉酶的突变体及其应用，从嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila克隆到一个高产麦芽糖的麦芽糖α-淀粉酶基因，并利用基因工程和蛋白质工程技术对麦芽糖α-淀粉酶进行分子改造以及酶学性质研究，筛选到性能更加优良的麦芽糖α-淀粉酶突变体。

突变体单独水解淀粉得到麦芽糖糖浆中麦芽糖含量可以达到99.79％，比原始酶的75.73％提高了约24％，该突变体大幅提高麦芽糖浆的麦芽糖含量，在水解淀粉生产麦芽糖中发挥极大的作用。/

为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：

一种嗜水气单胞菌麦芽糖α-淀粉酶突变体，在克隆鉴定了嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila的一个麦芽糖α-淀粉酶的基础上，利用同源建模推测该淀粉酶的底物结合位点的关键氨基酸残基，然后利用定点饱和突变技术对该位点进行饱和突变，再进一步筛选获得一个高产麦芽糖的麦芽糖α-淀粉酶突变体；

所述嗜水气单胞菌麦芽糖α-淀粉酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1 所示，其中290位酪氨酸(Y)被替换成谷氨酰胺(Q)。

所述嗜水气单胞菌麦芽糖α-淀粉酶突变体在水解淀粉生产麦芽糖中的应用；水解淀粉得到的产物由麦芽糖和少量葡萄糖组成，其中麦芽糖含量 99.79％。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明的麦芽糖α-淀粉酶水解产物也更单一，主要产物为麦芽糖和少量的葡萄糖，没有低聚糖，水解淀粉产物中麦芽糖能达到99.79％左右，不含麦芽三糖及麦芽四糖，在水解淀粉制备麦芽糖浆上具有优势，极大简化了麦芽糖生产的步骤，能提高淀粉的利用率；

(2)本发明嗜水气单胞菌麦芽糖α-淀粉酶突变体和原酶相比，最适pH 没变，pH稳定性更好，在一个较宽的pH范围内保持稳定，对工业应用具有较大前景。

附图说明

图1是pH对酶水解淀粉活力的影响曲线图。

图2是pH对酶水解淀粉活力稳定性的影响。

图3是温度对酶水解淀粉活力的影响曲线图。

具体实施方式

下面结合附图具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。实施例中采用的原料、试剂若无特殊说明，皆为市售所得。

对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

实施例1

1.突变体的构建和筛选

通过在GenBank上同源比对分析，找到一个来自嗜水气单胞菌 (Aeromanashydrophila)基因组DNA序列中的一个假定为淀粉酶的ORF (AJQ53752.1)是一个淀粉酶基因，并进一步用SIWSS-MODEL对该淀粉酶 LD8A进行蛋白质3D结构分析，然后选择多个与底物结合相关额氨基酸残基进行饱和突变分析，利用PCR构建突变酶的基因，并将突变体的基因连接到表达载体pSE380构建重组表达载体，然后转化进大肠杆菌菌株中进行诱导表达，经镍柱纯化得到目的突变体基因的重组酶蛋白，将各种突变体和原始酶 LD8A进行水解淀粉比较分析，筛选出能水解淀粉高产麦芽糖的突变子，比较筛选结果如表1(酶LD8A为原始酶)，结果表明290位酪氨酸(Y)被替换成谷氨酰胺(Q)的突变体Y290Q，突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，能水解淀粉获得麦芽糖含量为99.79％的糖浆，比未突变的原始酶LD8A的75.3％提高了14.5％。

表1各突变体的水解产物比较

表1中除了酶LD8A为原始酶，其余都为突变体。

实施例2

2.酶的最适反应pH分析

用pH 4.5-9.0的缓冲液(pH 4.5-8.0为磷酸-柠檬酸缓冲液，pH 8.0-9.0为硼酸-硼砂缓冲液)配制1％(W/V)可溶性淀粉溶液作为反应底物，测定37℃时突变体Y290Q酶活力，并与原始酶LD8A对比，以最高酶活力为100％，计算其余pH下的相对酶活力，绘制pH-相对酶活力曲线，结果如图1所示(图1中突变酶即为突变体)，结果表明突变体Y290Q和原始酶LD8A的pH差异不明显，最适反应pH都为6.5。

3.酶的pH稳定性分析

将酶蛋白在不同pH条件下(pH 4.5-9.0)处理12h后测定残余酶活力，以未处理的酶活力为100％绘制酶的pH稳定性曲线，结果见图2(图2中突变酶即为突变体)，结果表明与原始酶LD8A相比，突变酶Y290Q在一个较宽的pH范围内保持稳定，pH在5.0-8.0之间都能保持80％以上的酶活，pH 稳定性比原始酶LD8A有广的适应性。

4.水解淀粉最适的反应温度分析

取10μL稀释的酶液与190μL pH为6.5的1％可溶性淀粉溶液混合，在温度梯度条件下(25～65℃，每两个温度间隔5℃)分别测定淀粉酶酶活力，以最高酶活力为100％，绘制温度-相对酶活力曲线，酶活力最高的点所对应的温度为重组酶的最适反应温度，结果见图3所示(图3中突变酶即为突变体)，表明突变体(突变酶)Y290Q与原始酶的LD8A对比最适合反应温度相差不大，最适反应温度都是45℃。

5.突变体水解淀粉产物成分的比较分析

以原始酶为对照，比较分析突变体水解淀粉产物的组成

用超纯水配制终浓度为1％(W/V)的可溶性淀粉500μL作为底物，分别各自加入500μL纯化后过量的原始酶酶液、突变体酶液，在稳定性较好的 25℃水浴条件下反应，反应不同时间后取出样品后沸水浴5min，反应产物冷冻48h，在4℃条件下12000rpm离心30min，取上清液用HPLC分析反应产物的成分，其水解淀粉不同时间的产物组成百分比见表2，结果表明突变体水解淀粉36小时就可以得到麦芽糖含量93.5％，水解48小时就可以达到99.79％，麦芽糖糖浆中麦芽糖含量比原始酶提高了24％，且产物中不含低聚麦芽糖，只有少量葡萄糖。

表2.突变体和原始酶水解淀粉不同时间的产物组成

注：G1、G2、G3、G4、G5、G6分别表示葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖。

本发明技术经过对许多位点的预测分析，并对获得的多个候选位点进行突变研究和筛选比较获得，本发明所述的实施方法仅仅是对获得本发明突变体实验过程的描述，而不包括对其它候选位点的突变实验过程的陈述。PCR 定点饱和突变技术、基因表达技术和重组蛋白质的纯化技术，本实施方案中未作详细说明的分子生物学实验方法均为分子生物学专业人员熟悉的常规实验方法。

序列表

<110> 广西大学

<120> 一种嗜水气单胞菌麦芽糖α-淀粉酶突变体及其应用

<130> JC

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 702

<212> PRT

<213> Aeromanas hydrophila

<400> 1

Met Arg Arg Thr Pro Ser Val Ser Ser Leu Trp Leu Ala Leu Leu Ala

1 5 10 15

Ser Pro Leu Phe Leu His Gln Ala Met Ala Ala Glu Val Arg Leu Tyr

20 25 30

Val Asp Asp Gln Pro Val Gly Ala Pro Leu Ala Leu Asp Lys Gly Ala

35 40 45

Val Gln Leu Thr His Pro Leu Thr Lys Gly Ser His Gln Ile Arg Ile

50 55 60

Ser Asp Ala Gly Asn Ser Cys Gly Thr Ser Phe Gly Pro Asn Glu Ala

65 70 75 80

Lys Pro Leu Pro Phe Gly Thr Ala Gln Pro Met Asp Lys Cys Ser Lys

85 90 95

Gly Gln His Phe Asn Leu Arg Val Met Leu Ala Gly Asp Tyr Gln Phe

100 105 110

Thr Phe Asn Pro Asp Thr Pro Ser Leu Lys Val Leu Arg Ala Thr Lys

115 120 125

Lys Ser Glu Phe Lys Arg Gln Pro Pro Val Glu Pro Cys Ile Ser Trp

130 135 140

Asp Gly Gly Pro Val Thr Val Ser Leu Lys Gly Val Trp Pro Asp Gly

145 150 155 160

Thr Gln Leu Arg Asp Ala Tyr Ser Gly Gln Gln Gly Val Val Lys Gly

165 170 175

Gly Lys Leu Thr Leu Thr Pro Ser Lys Glu Ser Gly Gly Leu Leu Leu

180 185 190

Leu Glu Pro Val Lys Ala Ala Thr Ala Ala Pro Phe Ser Trp Asp Gln

195 200 205

Ala Ser Val Tyr Phe Leu Leu Thr Asp Arg Phe Asn Asn Gly Asp Pro

210 215 220

Ala Asn Asp His Ser Phe Gly Arg Gln Lys Asp Gly Gln Asp Glu Val

225 230 235 240

Ala Thr Trp His Gly Gly Asp Phe Lys Gly Leu Thr Ala Lys Leu Asp

245 250 255

Tyr Ile Lys Gln Leu Gly Ile Asn Ala Ile Trp Ile Thr Pro Met Val

260 265 270

Glu Gln Val His Gly Phe Ile Gly Gly Gly Glu Gln Gly Asn Phe Pro

275 280 285

Phe Gln Ala Tyr His Gly Tyr Trp Ala Leu Asp Phe Thr Lys Ile Asp

290 295 300

Pro Asn Tyr Gly Asp Glu Glu Ser Leu Lys Thr Leu Val Asp Glu Ala

305 310 315 320

His Lys Arg Gly Met Arg Ile Ile Leu Asp Val Val Met Asn His Ala

325 330 335

Gly Tyr Ala Thr Leu Ala Asp Leu Gln Asp Leu Gly Leu Thr Asp Leu

340 345 350

Thr Gln Asn Thr Gly Lys Leu Pro Ala Arg Trp Asn Gln Trp Arg Pro

355 360 365

Ser Gly Gly Leu Asn Trp His Gly Tyr Asn Gln Phe Ile Asp Tyr Gln

370 375 380

Ser Pro Lys Trp Asp Gln Trp Trp Ser Gly Asp Trp Val Arg Ala Gly

385 390 395 400

Leu Pro Gly Tyr Pro Gln Pro Gly Thr Asp Asp Val Thr Gly Ser Val

405 410 415

Ala Gly Leu Pro Asp Phe Leu Thr Glu Ser Thr Lys Pro Val Gly Leu

420 425 430

Pro Pro Leu Leu Ala Ala Lys Gln Asp Thr Arg Ala Lys Pro Leu Pro

435 440 445

Asn Ala Thr Val Ser Asp Tyr Leu Ile Ala Trp His Thr Asp Trp Val

450 455 460

Arg Arg Phe Gly Ile Asp Gly Phe Arg Ala Asp Thr Val Lys His Leu

465 470 475 480

Glu Pro Glu Val Trp Ala Arg Leu Lys Gln Ala Gly Thr Ala Ala Leu

485 490 495

Lys Glu Trp Lys Ala Ala Asn Pro Thr Lys Lys Leu Asp Asp Leu Pro

500 505 510

Phe Tyr Met Val Gly Glu Val Trp Asp His Gly Val Ala Lys Asp Phe

515 520 525

Trp Tyr Gln Asn Gly Phe Asp Ser Leu Ile Asn Phe Asp Tyr Gln Arg

530 535 540

Glu Phe Ala Leu Pro Gln Ala Gln Cys Leu Ala Ser Ala Glu Pro Thr

545 550 555 560

Tyr Ala Gly Tyr Ala Ser Arg Ile Asn Gln Asp Pro Glu Phe Asn Val

565 570 575

Leu Ser Tyr Ile Ser Ser His Asp Thr Lys Leu Phe Phe Gly Asp Tyr

580 585 590

Gln Asp Val Pro Leu Gln Arg Arg Val Ala Ser Ser Phe Met Leu Leu

595 600 605

Pro Gly Gly Ile Gln Ile Tyr Tyr Gly Asp Glu Ser Gly Arg Gly Leu

610 615 620

Ala Lys Asp Gly Gly Val Phe Asp Gln Ala Leu Arg Ser Asp Met Asn

625 630 635 640

Trp Gln Glu Leu Ala Gly Gly Glu Lys Ala Glu Leu Val Lys His Trp

645 650 655

Gln Arg Leu Gly Gln Phe Arg Ala Ala His Pro Ala Val Ala Ala Gly

660 665 670

Ser His Lys Lys Leu Ala Asp Ser Pro Tyr Ala Phe Val Arg Glu Lys

675 680 685

Gly Asp Asp Lys Val Val Val Val Phe Ala Gly Arg Gln Pro

690 695 700

Claims

1.一种嗜水气单胞菌麦芽糖α-淀粉酶突变体在水解淀粉生产麦芽糖中的应用，其特征在于：嗜水气单胞菌麦芽糖α-淀粉酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中290位酪氨酸被替换成谷氨酰胺。