CN1223676C - 一种高温α－淀粉酶,及其编码基因 - Google Patents

Abstract

由嗜热菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)MB4总DNA获得高温α-淀粉酶基因(α-amylase gene)，构建了原核表达质粒，转化大肠杆菌表达α-淀粉酶。通过氨基酸序列比较，该酶为一新型α-淀粉酶。

Description

一种高温α-淀粉酶，及其编码基因

技术领域

本发明属于酶基因工程和酶工程领域。具体地说，本发明涉及一DNA序列，编码嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)MB4的α-淀粉酶，涉及含有该酶基因的重组质粒和表达相应酶的重组菌株。

背景技术

α-淀粉酶(α-amylase，EC 3.2.1.1)是一种重要的工业用酶，其水解淀粉多糖分子中α-1，4-糖苷键，产生单糖和寡糖。高温α-淀粉酶具有：(1)降低淀粉醪粘度，减少输送时的动力消耗；(2)杂菌污染机会少；(3)热稳定性好，对钙离子的需要少等优点，从而在许多生产领域，特别是酶法生产葡萄糖及果葡糖浆、酒精及味精等生产中，耐高温α-淀粉酶正逐步取代常温α-淀粉酶。

α-淀粉酶已经从细菌、真菌、植物和动物等许多不同的来源中获得。高温α-淀粉酶主要是来自细菌包括中温菌[Takagi等，酶学中的细菌和霉菌淀粉酶(Bacterial and Mold Amylases，The Enzymes)，New York，AcademicPress，1971]，中度嗜热菌[Antranikian，应用生物化学和生物技术(AppliedBiochemistry and Biotechnology)20/21：267-279，1989；Glymph等，应用和环境微生物(Applied and Environmental Microbiology)34：391，1977；Hasegawa等，生物化学杂志(J.Biochem.)79：35-42，1976]和超嗜热菌[Koch等，微生物进展(Arch.Microbiol.)155：572-578，1991；Schumann等，FEBS通讯(FEBSLetters)282：122-126，1991]，如嗜热芽孢菌Bacillus stearothermophilus(Bramm等，美国专利US Patent 5612202,1997年3月18日)，Thermoanaerobacter finii和Thermobacteroides acetoethylicus(Antranikian等，美国专利US Patent 4929557，1990年5月29日)，Clostridiumthermohydrosulfuricum(Zeikus等，欧洲专利WO 8601831，1986年12月9日，Pyrococcus furiosus(Laderman等，美国专利US Patent 5578479，1996年11月26日；Kelly等，美国专利US Patent 6355467，2002年3月12日)。微生物产生α-淀粉酶种类多，不同来源的α-淀粉酶具有多方面不同性质，从而导致各具特色的应用范围。因而需要持续不断地开发新特性α-淀粉酶以更好地满足工业需要。

关于α-淀粉酶基因已有专利和文献报道。如：Kato等报道了Sulfolobussp.的α-淀粉酶基因(美国专利US Patent 6391595，2002年5月21日)；Ito等报道了Pseudomonas sp.的α-淀粉酶基因(美国专利US Patent 6087147，2000年7月11日)；Kidd等报道了Aeromonas hydrophila的α-淀粉酶基因[应用微生物杂志(J Appl Microbiol)92：289-96，2002]；Kim等报道了Thermus sp.的α-淀粉酶基因[应用和环境微生物学(Appl Environ Microbiol)65：1644-51，1999]；Liebl等报道了Thermotoga maritima的α-淀粉酶基因[细菌学杂志(J Bacteriol)179(3)：941-8，1997]；Dautor等报道了Bacillusstearothermophilus的α-淀粉酶基因[生物化学(Biochemistry)38(26)，8385-8392，1999]。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型α-淀粉酶的结构基因、含有该基因的重组质粒和重组菌体，该基因表达产物α-淀粉酶在高温条件下显示活性，可应用于淀粉加工等工业过程。同时本发明提供了一种方法，即通过分子生物学手段，将本发明涉及的酶基因克隆到其它受体菌，由其它菌株或在其它培养条件产生本发明涉及的α-淀粉酶。

本发明研究证明，嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)MB4(薛燕芬等，系统与环境微生物国际杂志IJSEM，51：1335-1341，2001)在高温条件下产生高温α-淀粉酶，其分泌的α-淀粉酶作用温度为60-90℃，最适作用条件为80℃，pH5.5。

本发明从嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)MB4获得α-淀粉酶的基因，它是1572bp的DNA，编码一个由524个氨基酸组成的蛋白质。通过分子生物学方法获得了含有该基因的重组质粒，转化大肠杆菌使重组菌株表达α-淀粉酶。因此本发明同时提供了一种可能性，即通过遗传工程或分子生物学手段，将本发明涉及的酶基因克隆到其它受体菌，由其它菌株或在其它培养条件产生本发明涉及的α-淀粉酶。

为达到本发明的目的，实现本发明的具体技术步骤如下：从嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)MB4中提取总DNA，利用shot-gun技术，得到所需要的DNA片段，连接到pUC18载体上并转化大肠杆菌DH5α，获得含高温α-淀粉酶基因的重组质粒pAMYH及重组大肠杆菌菌株DH5αAMYH。该重组菌表达高温α-淀粉酶活性。在可使上述α-淀粉酶基因表达的条件下培养该重组菌，经活性测定，证明该重组菌表达高温α-淀粉酶活性。该蛋白质具有高温α-淀粉酶活性，作用温度60-90℃，最适作用条件为80℃，pH5.5，可水解淀粉产生葡萄糖和麦芽糖。测序表明，目的基因含有1572bp，编码一个由524个氨基酸组成的蛋白质。

本发明涉及的α-淀粉酶是一新型的a-淀粉酶，其一级结构与已知的α-淀粉酶不同，与其它已报道的α-淀粉酶的氨基酸序列相比，相似性小于48％。属于糖苷水解酶Family13家族中的一员。应当指出的是，对本发明的α-淀粉酶基因所表达的酶分子的氨基酸进行一个或多个氨基酸替换、插入或缺失所得到的功能类似物也能达到本发明的目的。因而本发明也包括与SEQ NO.2所示的氨基酸序列具有至少有80％的同源性，优选具有至少90％的同源性，但同时具有α-淀粉酶的活性的功能类似物。

本发明涉及的α-淀粉酶的热稳定性高，适合用于淀粉加工和其他相关工业，如：化工、纺织、食品、医药工业中应用。

本发明的主要技术特征在于：

(1)α-淀粉酶，是嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)MB4或其它衍生菌产生。衍生菌是指转化有本发明涉及的DNA片段的重组菌株；

(2)SEQ NO1.所示的DNA序列，编码α-淀粉酶；

(3)SEQ NO.2所示的氨基酸序列组成，是α-淀粉酶；

(4)含有SEQ NO1.所示的DNA序列重质粒pAMYH及重组大肠杆菌菌株DH5αAMYH；

(5)具有a-淀粉酶活性特性：作用温度60-90℃，最适作用条件为80℃，pH5.5，分子量56000道尔顿。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步详细描述。

图1.重组质粒pAMYH构建图。

具体实施方式

实施例1.

嗜热厌氧菌MB4总DNA的提取：

采用从中国云南腾冲热泉分离的嗜热厌氧菌Thermoanaerobactertengcongensis MB4，取其新鲜湿菌体20克，悬于10毫升50mMTris缓冲液中(pH8.0)，加入少量溶菌酶和8毫升0.25mMEDTA(pH8.0)，混匀后于37℃放置20min，之后加入2毫升10％SDS，55℃放置5min，分别用等体积酚、氯仿各抽提一次，取最后一次的上清溶液，加入2倍体积乙醇，回收DNA，分别用70％和无水乙醇洗，沉淀溶于0.5毫升TE缓冲液(pH8.0，10mM Tris，1mMEDTA)，加入10mg/ml RNase3μl，37℃保温1小时，分别用等体积酚、氯仿各抽提一次，上清液加入2倍体积乙醇，回收DNA，分别用70％和无水乙醇洗，真空干燥，用去离子水溶解。DNA溶液的紫外分光光度计测定结果为A260/A280＝1.98，A260/A230＝2.18。

α-淀粉酶基因的克隆：

取前面所述的总DNA溶液10μl(约50μgDNA)，用限制酶Sau3AI部分酶切，经琼脂糖凝胶电泳，电洗脱回收2-10kbDNA片段。取2μl(5μg)Sau3AI酶解DNA片段与1μl(1μg)经BamHI酶解并脱磷酸化的质粒pUC18DNA在20μl连接体系进行连接反应，其中含2μl(10X连接缓冲液)，1μl T4DNA连接酶，14μl水。连接体系在16℃反应16小时，转化感受态大肠杆菌DH5α后，涂于含50ug/ml Amp(氨苄青霉素)，0.5％淀粉的LB固体培养基上。37℃培养16-18小时，然后在60℃培养1-5小时，菌落周围有透明圈的即为阳性克隆。阳性克隆在Amp-LB培养基中37℃培养16-18小时，经活性测试具有耐热α-淀粉酶活性。对阳性菌落用碱法提取重组质粒，用各种限制酶水解重组质粒，根据电泳结果证实有DNA片段插入质粒，其大小约为3.0kb。含该DNA片段的重组质粒称为pAMYH，含此重组质粒pAMYH的重组大肠杆菌称为大肠杆菌DH5αAMYH。

此重组质粒pAMYH可高频转化大肠杆菌表达α-淀粉酶活性和抗氨苄性能。将重组质粒中的DNA插入片段用地高辛DNA标记检测试剂盒标记，与嗜热菌MB4的染色体DNA进行Southern blot DNA杂交实验，证实重组质粒pAMYH中插入的DNA片段来自嗜热菌MB4的染色体DNA。

采用Sanger双脱氧法对此DNA片段进行了测序。测序结果显示插入片段含有一个长1572bp的开放阅读框架(ORF)，编码一个由524个氨基酸组成的蛋白质。属糖苷水解酶13家族，最高相似性同Bacillusstearothermophilus的α-淀粉酶基因(48％)。

实施例2.

重组α-淀粉酶的纯化和特性：

重组菌E.coli DH5αAMYH的菌体悬于50mM磷酸缓冲液(pH6)中，利用超声波破碎细胞，离心上清液为重组α-淀粉酶的粗酶液。此上清酶液70oC加热15分钟，离心去除变性蛋白，上清酶液经离子交换柱层析，羟基磷灰石吸附柱层析和PAGE制备电泳等步骤进行纯化，得到的酶制剂在SDS-PAGE上显示一条带。利用已知的蛋白质化学标准方法测定此重组α-淀粉酶的基本特性。用SDS-PAGE测得的重组酶的分子量为56000道尔顿，与理论上推算的分子量(59600道尔顿)相似；重组酶反应的作用温度为60-80℃，最适作用条件为80℃，pH5.5。

实施例3

重组α-淀粉酶水解淀粉

向2％的可溶性淀粉溶液(用pH6，0.2M的磷酸钠缓冲液配制)中，加0.1V酶液，升温至60℃保温6小时。高压液相色谱法测得重组高温α-淀粉酶水解淀粉产生葡萄糖和麦芽糖。

                        SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院微生物研究所

<120>一种高温α-淀粉酶，及其编码基因

<130>IM021102

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1575

<212>DNA

<213>Thermoanaerobacter tengcongensis MB4

<400>1

atgagaaaaa atttaaaagc atttgtggcg ctttttgcag caattttgct gttctttagt      60

gggtgcagta gcaagcaaga ggcaaaagcc ccaaagtcag aagtcatata tcaggttatg     120

gtggataggt tttacaacgg agacccttca aatgacgacc cagaagtgag caaaggaatg     180

tttgacccca cccataccaa ctggaggatg tactggggag gggatttgaa aggactgaca     240

gaaaaaatcc cttatataaa ggggatgggg gtcactgcta tctggatttc tccagtagtg     300

gataatataa ataaaccagc cgtatataat ggcgagatta atgcccccta tcacggatac     360

tgggcaagag atttcaaaag agtagaagaa cactttggta catgggagga ctttgacaat     420

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tacggatttg agaggttaaa tgacacgtta gaggatacca ataaagatta cgaaaatcct    1020

tataagctgg ttgcttttat agacaaccat gacatgccta gatttctgtc cttgaacaat    1080

gacaaggata aattacacga agctattgct tttgtaatga cgactcgagg gatacctgta    1140

atatactatg gcactgagca gtaccttcat aacgacacaa atggcggtaa tgacccgtat    1200

aatagaccaa tgatggaaaa gttcgatgag agcacaaagg cttatacatt gataaaagag    1260

ctgtcaaggt taaggcagct cactccagcc ctacagtatg gaactactac ggcaaggtat    1320

atttctgacg atgtgtatat ttatgaaagg cagtatggaa aagatgtggt gctggttgcg    1380

ataaataaag gagagaaaac tactgttaag gcagtaaaaa catctttgag gaagggaatt    1440

tataaagact accttaaagg tctgttggag ggtgttgagt taaaagtcac aaaaggcaat    1500

ggagaaaacc tagtgcaagg tttgacttta cctggggaca gcgtaagtgt gtggacaaat    1560

gtgaaagcga agtaa                                                     1575

<210>2

<211>524

<212>PRT

<213>Thermoanaerobacter tengcongensis MB4

<400>2

Met Arg Lys Asn Leu Lys Ala Phe Val Ala Leu Phe Ala Ala Ile Leu

1               5                   10                  15

Leu Phe Phe Ser Gly Cys Ser Ser Lys Gln Glu Ala Lys Ala Pro Lys

            20                  25                  30

Ser Glu Val Ile Tyr Gln Val Met Val Asp Arg Phe Tyr Asn Gly Asp

        35                  40                  45

Pro Ser Asn Asp Asp Pro Glu Val Ser Lys Gly Met Phe Asp Pro Thr

    50                  55                  60

His Thr Asn Trp Arg Met Tyr Trp Gly Gly Asp Leu Lys Gly Leu Thr

65                  70                  75                  80

Glu Lys Ile Pro Tyr Ile Lys Gly Met Gly Val Thr Ala Ile Trp Ile

                85                  90                  95

Ser Pro Val Val Asp Asn Ile Asn Lys Pro Ala Val Tyr Asn Gly Glu

            100                 105                 110

Ile Asn Ala Pro Tyr His Gly Tyr Trp Ala Arg Asp Phe Lys Arg Val

        115                 120                 125

Glu Glu His Phe Gly Thr Trp Glu Asp Phe Asp Asn Phe Val Lys Val

    130                 135                 140

Ala His Glu Asn Gly Ile Lys Val Ile Leu Asp Phe Ala Pro Asn His

145                 150                 155                 160

Thr Ser Pro Ala Asp Glu Glu Asn Pro Asp Phe Ala Glu Asn Gly Ala

                165                 170                 175

Leu Tyr Asp Asp Gly Lys Leu Leu Gly Thr Tyr Ser Asn Asp Ser Leu

            180                 185                 190

Lys Leu Phe His His Asn Gly Ser Ile Ser Asn Trp Asn Asn Leu Lys

        195                 200                 205

Glu Leu Gln Asp Lys Asn Leu Phe Asp Leu Ala Asp Leu Asp Gln Ser

    210                 215                 220

Asn Pro Ile VaI Asp Lys Tyr Leu Lys Asp Ser Ile Lys Leu Trp Phe

225                 230                 235                 240

Asn His Glu Ile Asp Gly Val Arg Leu Asp Ala Ala Lys His Met Pro

                245                 250                 255

Met Glu Trp Val Lys Ser Phe Ala Asn Thr Ile Tyr Ser Ile Lys Lys

            260                 265                 270

Asp Val Leu Leu Phe Gly Glu Trp Met Leu Ser Gly Pro Thr Asp Pro

        275                 280                 285

Leu Tyr Gly Tyr Asn Ile Gln Phe Ala Asn Thr Thr Gly Phe Ser Val

    290                 295                 300

Leu Asp Phe Met Leu Asn Gly Ala Ile Arg Asp Val Phe Gly Lys Gly

305                 310                 315                 320

Tyr Gly Phe Glu Arg Leu Asn Asp Thr Leu Glu Asp Thr Asn Lys Asp

                325                 330                 335

Tyr Glu Asn Pro Tyr Lys Leu Val Ala Phe Ile Asp Asn His Asp Met

            340                 345                 350

Pro Arg Phe Leu Ser Leu Asn Asn Asp Lys Asp Lys Leu His Glu Ala

        355                 360                 365

Ile Ala Phe Val Met Thr Thr Arg Gly Ile Pro Val Ile Tyr Tyr Gly

    370                 375                 380

Thr Glu Gln Tyr Leu His Asn Asp Thr Asn Gly Gly Asn Asp Pro Tyr

385                 390                 395                 400

Asn Arg Pro Met Met Glu Lys Phe Asp Glu Ser Thr Lys Ala Tyr Thr

                405                 410                 415

Leu Ile Lys Glu Leu Ser Arg Leu Arg Gln Leu Thr Pro Ala Leu Gln

            420                 425                 430

Tyr Gly Thr Thr Thr Ala Arg Tyr Ile Ser Asp Asp Val Tyr Ile Tyr

        435                 440                 445

Glu Arg Gln Tyr Gly Lys Asp Val Val Leu Val Ala Ile Asn Lys Gly

    450                 455                 460

Glu Lys Thr Thr Val Lys Ala Val Lys Thr Ser Leu Arg Lys Gly Ile

465                 470                 475                 480

Tyr Lys Asp Tyr Leu Lys Gly Leu Leu Glu Gly Val Glu Leu Lys Val

                485                 490                 495

Thr Lys Gly Asn Gly Glu Asn Leu Val Gln Gly Leu Thr Leu Pro Gly

            500                 505                 510

Asp Ser Val Ser Val Trp Thr Asn Val Lys Ala Lys

        515                 520

Claims (9)

1.一种来源于嗜热菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)MB4的高温α-淀粉酶，其特征在于所述酶的氨基酸序列如SEQ NO.2所示。

2.一种编码权利要求1所述的高温α-淀粉酶的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列如SEQID NO：1所示。

4.一种含有权利要求2或3所述的基因的重组质粒，是pAMYH。

5.一种含有权利要求2或3所述基因的表达载体。

6.一种含有权利要求5所述表达载体的原核重组菌。

7.根据权利要求6的原核重组菌，其是重组大肠杆菌菌株DH5αAMYH。

8.一种制备权利要求1的高温α-淀粉酶的方法，其特征在于利用权利要求6或7的原核重组菌通过微生物发酵和酶工程制备。

9.通过权利要求8的方法得到的高温α-淀粉酶在化工、纺织、食品、医药工业方面应用。