CN116254249A - 一种表达几丁质酶的重组菌的构建及高酶活突变体的制备 - Google Patents
一种表达几丁质酶的重组菌的构建及高酶活突变体的制备 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种表达几丁质酶的重组菌的构建及高酶活突变体的制备，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明使用内源性强启动子SpoVG及信号肽YqxI实现了地衣芽孢杆菌来源的几丁质酶BlChiA在枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WS9中的分泌表达，并进一步定点突变，提高了几丁质酶的表达量与耐酸性。所得几丁质酶突变体E336K/A472T的发酵酶活达2.67U/mL，同时，该几丁质酶突变体最适反应pH为5.0，且在pH 3.0‑pH 6.0范围内有较好的稳定性，残余酶活达90％以上，具有稳定性好、酸耐受度强等优势，适用于工业化生产中获得高转化率的寡糖产物。
Description
技术领域
本发明涉及一种表达几丁质酶的重组菌的构建及高酶活突变体的制备，属于基因工程和酶工程技术领域。
背景技术
几丁质又称甲壳素、甲壳质、甲壳胺等，是N-乙酰-D-氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接而成的直链多糖，脱乙酰化程度在40％以上时可转化为壳聚糖，是海洋中含量最丰富、自然界中含量仅次于纤维素的第二大可再生资源。几丁质及其类似物的降解产物氨基寡糖具备优越的生理功能和生物活性，在农业、医药和食品等领域有广泛的应用。
几丁质酶(EC 3.2.1.14)是一类水解几丁质β-1,4-糖苷键生成几丁寡糖或单糖的糖基水解酶，大多数几丁质酶属于糖基水解酶18家族和19家族，还有少数分布在20、23和48家族。几丁质酶在几丁质的降解中应用广泛，由于几丁质只溶于强无机酸，因此，几丁质的降解过程中需要一种耐酸性强的几丁质酶，但是天然的几丁质酶表达量低、酶活力差、耐酸性差，普遍通过多种几丁质酶协同作用降解几丁质，限制了几丁质酶的生产和应用。重组表达获得高效表达的耐酸性强的几丁质酶是高效利用几丁质资源的良好途径。
在真菌表达系统重组表达的几丁质酶存在对真菌细胞壁降解的可能，进而影响宿主菌的生长，导致几丁质酶的产量偏低；在原核表达系统中，枯草芽孢杆菌具有非致病性的特点，安全性高，同时培养周期短，对于工业生产缩短发酵周期也具有重要意义，是一种目前食品、药品、畜牧等行业生产各种工业用酶的理想表达宿主，但是目前在枯草芽孢杆菌中重组表达几丁质酶的报道较少，且酶活低、耐酸性差，限制了其工业应用。薛家威等将杀鱼假交替单胞菌C923几丁质酶基因PpchiC在大肠杆菌BL 21中克隆表达，该酶对几丁质有较好的降解效果但可溶性表达量极少，重组蛋白主要以包涵体的形式存在；在pH为8.0时表现最高酶活力，当pH为3.5时，酶活性下降至最高酶活的10％。尹义旭等将棘孢木霉TD3104来源的几丁质酶基因gene02524在毕赤酵母中异源表达，对部分病原菌生长有一定的抑制作用；该酶重组表达的酶活较低，诱导表达5天后酶活约为0.15U/mL，在pH3.0的环境中活性下降至最高酶活的20％。针对上述现有技术中重组几丁质酶表达酶活低、耐酸性差的问题，寻找一种高表达酶活、高耐酸性且性质稳定的几丁质酶对于高效利用几丁质资源具有重要意义。
发明内容
本发明提供了一种18家族的几丁质酶BlChiA突变体，该突变体是将Bacilluslicheniformis来源的几丁质酶BlChiA经定点突变获得的。与野生型几丁质酶BlChiA相比，突变体对酸性条件有更好的耐受性和广泛的pH稳定性，在几丁质酶的工业生产上有广阔前景。
本发明提供了提高几丁质酶表达量的突变体，包含如下任一种突变：
将氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的几丁质酶的第336位的谷氨酸残基突变为赖氨酸残基，并命名为E336K；
将氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的几丁质酶的第472位的丙氨酸残基突变为苏氨酸残基，并命名为A472T；
将氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的几丁质酶的第336位的谷氨酸突变为赖氨酸，第472位的丙氨酸突变为苏氨酸，命名为E336K/A472T。
本发明还提供了一种表达几丁质酶BlChiA突变体的重组枯草芽孢杆菌，通过启动子优化、信号肽优化以及定点突变的表达策略，提高了突变体的表达酶活，为后续分子改造提高几丁质酶基因BlChiA的表达量或催化效率提供了基础。
在本发明的一种实施例中，所用对照菌株为WS9-pHY300PLK-PHpaⅡ-PamyQ-SPAmyE-BlChiA，以SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的PHpaⅡ-PamyQ为启动子，以SEQ ID NO.2所示核苷酸序列编码的AmyE为信号肽，重组表达地衣芽孢杆菌来源的几丁质酶基因BlChiA(将NCBI编号为WP_016886405的几丁质酶基因由上海捷瑞生物工程有限公司进行密码子优化并合成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)；所述几丁质酶BlChiA的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在本发明的一种实施方式中，所述载体为pHY300系列载体或pHY300PLK系列载体；所述宿主菌为枯草芽孢杆菌WS9，其构建方法公开于《Zhang K,Su L,Wu J.Enhancedextracellular pullulanase production in Bacillus subtilis using protease-deficient strains and optimal feeding.Appl Microbiol Biotechnol.2018Jun；102(12):5089-5103》。
在本发明的一种实施方式中，将几丁质酶的枯草芽孢杆菌工程菌的启动子进行优化，所述优化是指重组质粒的启动子为转录水平提高的启动子PSpoVG，其核苷酸序列为SEQID NO.5。
在本发明的一种实施方式中，将几丁质酶的枯草芽孢杆菌工程菌的信号肽进行优化，所述优化是指重组质粒的信号肽为分泌靶蛋白水平提高的YqxI，编码所述优化后的信号肽YqxI的核苷酸序列为SEQ ID NO.6。
本发明提供了一种高效表达几丁质酶的方法，此方法为使用上述枯草芽孢杆菌工程菌为生产菌株。
本发明的一种实施方式中，所述方法为将30-38℃、180-220rpm条件下培养6-12h的重组枯草芽孢杆菌以1-10％的接种量转入发酵培养基，于30～37℃培养至OD600为0.6～0.8，于30-35℃、200-220rpm条件下发酵36-60h。
本发明提供了上述高效表达几丁质酶BlChiA的方法制备得到几丁质酶BlChiA。
有益效果
(1)本发明提供了一种几丁质酶突变体E336K/A472T，其最适反应pH为5.0，且在酸性条件下有更高的酶活力；突变体在pH 3.0-pH 7.0范围内的稳定性更优，残余酶活达90％以上，对酸性条件有更好的耐受性和广泛的pH稳定性，在几丁质酶的工业生产上有广阔前景。
(2)本发明构建了一种高效表达几丁质酶突变体E336K/A472T的重组枯草芽孢杆菌WS9-pHY300PLK-PSpoVG-SPYqxI-BlchiAE336K/A472T，该重组枯草芽孢杆菌发酵得到的几丁质酶活性为2.67U/mL，在高效降解几丁质获得几丁寡糖方面具有较好应用价值。
附图说明
图1为质粒构建示意图。
图2为含有不同启动子的几丁质酶重组工程菌SDS-PAGE分析；其中M:Marker；P1:Phag；P2:PtufA；P3:P43；P4:PSpoVG；P5:PHpaⅡ-PamyQ；P6:PfusA；P7:PHpaⅡ-PamyQ’；P8:PamyE。a：发酵上清；b：破碎上清；c：破碎沉淀。
图3为含有不同信号肽的几丁质酶重组工程菌SDS-PAGE分析；其中M:Marker；SP1:AmyE；SP2:YqxI；SP3:PhrC。a：发酵上清；b：破碎上清；c：破碎沉淀。
图4为几丁质酶突变体E336K/A472T最适反应温度、热稳定、最适反应pH及pH稳定性图。
具体实施方式
以下实施例中未做具体说明的生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或按照试剂盒产品说明书进行。
下述实施例涉及的实验材料和试剂如下：
1、菌株与载体
本发明所用的枯草芽孢杆菌WB168，E.coli JM109，质粒pHY300PLK均为商业化宿主或载体。
枯草芽孢杆菌WS9是在枯草芽孢杆菌WS5(已公开于专利CN106754466，保藏号CCTCC M 2016536)的基础上，进一步敲除了nprB、bpr、mpr和epr，具体构建方法公开于《Zhang K,Su L,Wu J.Enhanced extracellular pullulanase production in Bacillussubtilis using protease-deficient strains and optimal feeding.Appl MicrobiolBiotechnol.2018Jun；102(12):5089-5103》。
2、酶与试剂盒
2×Phanta Max Master Mix高保真DNA聚合酶、无缝克隆试剂盒ClonExpress IIOne Step Cloning Kit购自诺唯赞生物公司，DpnⅠ购于NEB公司，限制性内切酶、B.subtilis Secretory Protein Expression System试剂盒购自Takara公司、质粒提取、胶回收及纯化试剂盒购于天根生化科技公司，蛋白浓度试剂盒购于碧云天生物技术公司。
下述实施例中涉及的培养基如下：
LB液体培养基：胰蛋白胨10g·L-1，酵母粉5g·L-1，氯化钠10g·L-1，
LB固体培养基：胰蛋白胨10g·L-1，酵母粉5g·L-1，氯化钠10g·L-1，琼脂粉20g·L-1
TB发酵培养基：胰蛋白胨12g·L-1，酵母粉24g·L-1，甘油5g·L-1，KH2PO4 2.31g·L-1，K2HPO4·3H2O 16.43g·L-1。
摇瓶发酵与粗酶液的获取：
在含100μg/mL四环素的LB液体培养基中培养得到种子液，于37℃，200rpm，培养10h后按5％的接种量将种子液转接至含100μg/mL四环素的TB发酵培养基中，在37℃，200rpm培养至OD600为0.6-0.8转移至33℃，200rpm培养48h得到发酵液，将发酵液于4℃、8000rpm离心10min除菌体，收集离心的上清液即为含有不同突变体的几丁质酶粗酶液。
下述实施例涉及的检测方法如下：
酶活测定方法：
采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定总还原糖量。以1％(w/v)的胶体几丁质底物，250μL胶体几丁质和150μL磷酸柠檬酸盐缓冲液(50mmol·L-1)在反应温度下预热10min，加入100μL适当稀释的发酵上清液/纯酶液混合均匀，60℃水浴反应1h，加入2mL的DNS混合均匀以终止反应，在沸水中煮沸10min，立即冷却至室温；以加入等量灭活的酶液作为空白对照。以12000r·min-1离心5min，取上清液于540nm检测吸光值。酶活定义：在60℃每分钟释放1μmol GlcNAc所需的酶量定义为一个酶活力单位(1U)。
蛋白浓度测定方法：
按照蛋白浓度试剂盒的说明方法制作蛋白标准曲线并测定纯酶的蛋白浓度，根据各样品在酶标仪A595nm的吸光度和标准曲线计算其蛋白浓度。
比活计算方法：
比活(U/mg)＝酶活(U/mL)/蛋白浓度(mg/mL)
下述实施例涉及的几丁质酶纯化方法如下：
(1)将粗酶液边搅拌边缓慢加入浓度为相对于酶液质量分数26％的硫酸铵，搅拌至硫酸铵溶解，在4℃条件下静置8-10h沉淀蛋白，得到混合物。
(2)将步骤(1)得到的混合物经离心(8000rpm，10min)收集沉淀，再用最小体积的pH6.5 20mM KH2PO4-Na2HPO4缓冲液(溶液A)复溶，复溶后经过再次离心除去固形物，收集上清，得到复溶液；在4℃下将复溶液置于缓冲液A中透析24h，透析后在12000rpm/min，4℃离心5min，收集上清液。
(3)将步骤(2)得到的上清液经过0.22μm有机膜过滤制成上样样品。用Ni-NTA柱对BlChiA进行纯化。蛋白洗脱步骤为：第一步，用2倍柱体积的A液(25mM Tris-HCl缓冲液，500mM NaCl，pH 7.4)以及含有15、30、45mM咪唑的A液梯度洗脱杂蛋白；第二步，用2倍柱体积的B液(25mM Tris-HCl缓冲液，500mM NaCl，300mM咪唑)洗脱BlChiA并收集。然后将收集的酶液用30KDa的超滤管去除咪唑，将缓冲液置换为50mM的磷酸盐缓冲液即为纯化的几丁质酶。
下述实施例所用引物如下表所示：
表1引物序列
实施例1：构建含不同启动子的重组枯草芽孢杆菌
1.载体pHY300PLK-SPAmyE-BlChiA的构建
设计引物F0、R0以枯草芽孢杆菌淀粉酶amyE(Gene ID:938356)为模板PCR扩增其携带的信号肽AmyE的核苷酸片段并回收(如SEQ ID NO.2所示)，使用ClonExpress II OneStep Cloning Kit将AmyE片段连载在pHY300PLK载体的p15A ori片段之后，通过无缝连接获得pHY300PLK-SPAmyE载体。
地衣芽孢杆菌来源的几丁质酶基因BlChiA由上海捷瑞生物工程有限公司进行密码子优化并合成，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。将其连接至pHY300PLK-SPAmyE的NcoⅠ和HindⅢ两个位点之间，并转化E.coli JM109感受态细胞，培养过夜。在抗性平板上筛选，挑取阳性转化子提质粒并测序，提取测序正确的的阳性重组菌中的质粒，获得载体pHY300PLK-SPAmyE-BlChiA。
2.连接不同启动子的载体构建
本发明所用启动子的来源如下：以Bacillus subtilis 168基因组为模板，根据启动子的核苷酸序列设计引物(表1)，使用对应引物PCR扩增分别得到启动子Phag、PtufA、P43、PSpoVG、PfusA、PamyE片段。PHpaⅡ-PamyQ、PHpaⅡ-PamyQ’由本实验室前期构建并保存，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.7所示。
以载体pHY300PLK-Phag-SPAmyE-BlChiA构建过程为例，以载体pHY300PLK-SPAmyE-BlChiA为模板，使用引物F1和R1(见表1)PCR扩增获得线性化的pHY300PLK-SPAmyE-BlChiA载体片段，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后回收。以Bacillus subtilis 168基因组为模板，用引物Phag-F和Phag-R扩增得到启动子Phag片段。使用ClonExpress II One Step Cloning Kit将启动子片段和质粒骨架无缝连接，将连接产物pHY300PLK-Phag-SPAmyE-BlChiA转化E.coliJM109感受态细胞。在抗性平板上筛选，挑取阳性转化子提质粒并测序。
以上述相同方法，构建含不同启动子的载体pHY300PLK-PtufA-SPAmyE-BlChiA、pHY300PLK-P43-SPAmyE-BlChiA、pHY300PLK-PSpoVG-SPAmyE-BlChiA、pHY300PLK-PHpaⅡ-PamyQ-SPAmyE-BlChiA、pHY300PLK-PfusA-SPAmyE-BlChiA、pHY300PLK-PHpaⅡ-PamyQ’-SPAmyE-BlChiA与pHY300PLK-PamyE-SPAmyE-BlChiA。
将上述测序正确的质粒分别转化至宿主菌Bacillus subtilis WS9，所得菌株分别命名为WS9-pHY300PLK-Phag-SPAmyE-BlChiA、WS9-pHY300PLK-PtufA-SPAmyE-BlChiA、WS9-pHY300PLK-P43-SPAmyE-BlChiA、WS9-pHY300PLK-PSpoVG-SPAmyE-BlChiA、WS9-pHY300PLK-PHpaⅡ-PamyQ-SPAmyE-BlChiA、WS9-pHY300PLK-PfusA-SPAmyE-BlChiA、WS9-pHY300PLK-PHpaⅡ-PamyQ’-SPAmyE-BlChiA与WS9-pHY300PLK-PamyE-SPAmyE-BlChiA。
表2携带不同启动子的几丁质酶工程菌发酵液上清酶活
将上述所得各工程菌分别进行摇瓶发酵，并测定发酵液上清中粗酶液的酶活，其中工程菌WS9-pHY300PLK-PHpaⅡ-PamyQ-SPAmyE-BlChiA为本发明的对照菌株。酶活检测结果：对照菌株WS9-pHY300PLK-PHpaⅡ-PamyQ-SPAmyE-BlChiA几丁质酶工程菌所产酶活力为0.72U/mL；WS9-pHY300PLK-PSpoVG-SPAmyE-BlChiA几丁质酶工程菌所产酶活力为0.96U/mL，是前者的1.33倍。
实施例2：构建含不同信号肽的重组枯草芽孢杆菌
根据NCBI中信号肽YqxI和PhrC的序列信息设计并合成对应引物SPYqxI-F、SPYqxI-R和SPPhrC-F、SPPhrC-R，以pHY300PLK-PSpoVG-SPAmyE-BlChiA为模板进行PCR扩增获得含对应信号肽的质粒，扩增产物经DpnⅠ进行充分消化以去除模板，然后取适量消化后的产物转化E.coli JM109感受态细胞，在抗性平板上筛选获得挑取阳性转化子提质粒并测序。测序正确后分别转化至宿主菌Bacillus subtilis WS9，所得菌株分别命名为WS9-pHY300PLK-PSpoVG-SPYqxI-BlChiA和WS9-pHY300PLK-PSpoVG-SPPhrC-BlChiA。将上述菌株分别进行摇瓶发酵并测定粗酶液的酶活。
酶活检测结果：WS9-pHY300PLK-PSpoVG-SPAmyE-BlChiA工程菌产几丁质酶的酶活力为0.96U/mL。WS9-pHY300PLK-PSpoVG-SPPhrC-BlChiA工程菌产几丁质酶的酶活力为1.20U/mL；WS9-pHY300PLK-PSpoVG-SPYqxI-BlChiA工程菌产几丁质酶的酶活力为1.41U/mL。
重组工程菌WS9-pHY300PLK-PSpoVG-SPYqxI-BlChiA所产几丁质酶活力是信号肽优化前WS9-pHY300PLK-PSpoVG-SPAmyE-BlChiA所产酶活的1.47倍；是对照菌株WS9-pHY300PLK-PHpaⅡ-PamyQ-SPAmyE-BlChiA所产酶活的1.96倍。
实施例3：构建表达量提高的几丁质酶突变体
以重组质粒pHY300PLK-PSpoVG-SPYqxI-BlChiA为模板，设计引物F2、R2(表1)将几丁质酶第336位的谷氨酸残基突变为赖氨酸残基，所得质粒转化至宿主菌Bacillus subtilisWS9，所得菌株命名为WS9-pHY300PLK-PSpoVG-SPYqxI-BlChiAE336K。以重组质粒pHY300PLK-PSpoVG-SPYqxI-BlChiA为模板，设计引物F3、R3(表1)将第472位的丙氨酸残基突变为苏氨酸残基，所得质粒转化至宿主菌Bacillus subtilis WS9，所得菌株命名为WS9-pHY300PLK-PSpoVG-SPYqxI-BlChiAA472T。以携带突变体E336K的质粒pHY300PLK-PSpoVG-SPYqxI-BlChiAE336K为模板，使用引物F3、R3(表1)将第472的丙氨酸残基突变为苏氨酸残基，所得质粒转化至宿主菌Bacillus subtilis WS9，所得菌株命名为WS9-pHY300PLK-PSpoVG-SPYqxI-BlChiAE336K/A472T。
以组合突变体菌株WS9-pHY300PLK-PSpoVG-SPYqxI-BlChiAE336K/A472T的构建过程为例：
采用定点突变的方法，以重组质粒pHY300PLK-PSpoVG-SPYqxI-BlChiA为模板，设计引物F2、R2(表1)将几丁质酶第336位的谷氨酸残基突变为赖氨酸残基，对pHY300PLK-PSpoVG-SPYqxI-BlChiA质粒骨架进行PCR扩增，加入DpnⅠ在37℃水浴条件下对模板进行充分消化，取适量产物转化B.subtilis SCK6感受态细胞，挑取阳性转化子提取质粒并测序。以测序正确的质粒pHY300PLK-PSpoVG-SPYqxI-BlChiAE336K为模板，设计引物F3、R3(表1)将第472的丙氨酸残基突变为苏氨酸残基，对pHY300PLK-PSpoVG-SPYqxI-BlChiAE336K质粒骨架进行PCR扩增，加入DpnⅠ在37℃水浴条件下对模板进行充分消化，取适量产物转化B.subtilis SCK6感受态细胞，挑取阳性转化子提取质粒并测序。将如上测序正确的质粒pHY300PLK-PSpoVG-SPYqxI-BlChiAE336K/A472T转化至宿主菌Bacillus subtilis WS9，所得突变体菌株命名为WS9-pHY300PLK-PSpoVG-SPYqxI-BlChiAE336K/A472T。
表3PCR反应体系
PCR条件：98℃预变性5min；98℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1kb/min，25个循环，72℃延伸10min，4℃保温。
将上述重组菌分别进行摇瓶发酵，测定发酵上清粗酶液的酶活。
酶活检测结果：WS9-pHY300PLK-PSpoVG-SPYqxI-BlChiAE336K工程菌的发酵上清液酶活为1.64U/mL，WS9-pHY300PLK-PSpoVG-SPYqxI-BlChiAA472T工程菌的发酵上清液酶活为1.66U/mL，WS9-pHY300PLK-PSpoVG-SPYqxI-BlChiAE336K/A472T工程菌的发酵上清液酶活最高，为2.67U/mL。纯化后测定其比活，突变体E336K/A472T与WS9-pHY300PLK-PSpoVG-SPYqxI-BlChiA所表达的野生型几丁质酶比活相比没有变化。
实施例4：几丁质酶突变体E336K/A472T酶学性质表征
使用DNS法测定重组酶的最适反应pH、pH稳定性、最适反应温度及热稳定性。
最适反应pH以及pH稳定性的测定范围为pH 3.0～10.0，酶液在4℃孵育24h后测定其pH稳定性；
在30～70℃下测定重组酶的最适反应温度，在其最适反应温度下孵育3h，每隔30min取样测定重组酶的热稳定性；
测定重组酶的最适反应pH和最适反应温度时，将所测得的最高酶活定义为100％，其余条件下测得酶活与最高酶活的比值定义为相对酶活；
测定重组酶的pH稳定性和热稳定性时，将未处理酶液的酶活定义为100％，处理后酶液的酶活与未处理酶液的酶活的比值定义为剩余酶活；
与野生型相比，几丁质酶突变体E336K/A472T具有更好的酸耐受性，最适反应pH降低至5.0且在酸性条件下有更高的酶活力；突变体在pH 3.0-pH 6.0范围内的稳定性更优，残余酶活达90％以上，对酸性环境的适应程度增强。同时突变体具备与野生型一致的较高的最适反应温度，有利于工业化生产并应用几丁质酶BlChiA。
对比例1：
如实施例3中构建的基因工程菌WS9-pHY300PLK-PSpoVG-SPYqxI-BlChiAE336K与WS9-pHY300PLK-PSpoVG-SPYqxI-BlChiAA472T按照相同的方法进行表达、纯化与酶学性质表征，结果显示，几丁质酶突变体E336K的最适pH为6.0，测定其pH稳定性发现突变体E336K在pH 5.0-pH 8.0的残余酶活在90％以上；突变体A472T的最适pH为5.0，测定其pH稳定性发现突变体A472T在pH 4.0-pH 8.0的残余酶活在90％以上。突变体E336K和A472T的pH稳定性与野生型均无显著差异。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种几丁质酶BlChiA突变体，其特征在于，将SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的第336位、472位中至少一个位点进行突变。
2.如权利要求1所述几丁质酶BlChiA突变体，其特征在于，所述突变体包括以下任一种：
(a)将SEQ ID NO.4所示氨基酸第336位的谷氨酸突变为赖氨酸；
(b)将SEQ ID NO.4所示氨基酸第472位的丙氨酸突变为苏氨酸；
(c)将SEQ ID NO.4所示氨基酸第336位的谷氨酸突变为赖氨酸，第472位的丙氨酸突变为苏氨酸。
3.编码如权利要求1或2所述突变体的基因。
4.携带如权利要求3所述基因的重组载体，其特征在于，所述载体为pHY300PLK系列载体。
5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于，含有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的启动子PSpoVG。
6.如权利要求5所述的重组载体，其特征在于，以SEQ ID NO.6所示核苷酸序列编码的YqxI为信号肽。
7.一种表达几丁质酶BlChiA的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，以Bacillus subtilisWS9为宿主，携带如权利要求4-6任一所述的重组载体。
8.一种表达几丁质酶的方法，其特征在于，采用权利要求7所述重组枯草芽孢杆菌进行发酵。
9.如权利要求8所述表达几丁质酶的方法，其特征在于，将30-38℃、180-220rpm条件下培养6-12h的重组枯草芽孢杆菌以1-10％的接种量转入发酵培养基，于30～37℃培养至OD600为0.6～0.8，于30-35℃、200-220rpm条件下发酵36-60h。
10.权利要求1或2所述几丁质酶BlChiA突变体，权利要求3所述基因，权利要求4-6任一所述重组载体，权利要求7所述重组枯草芽孢杆菌，或权利要求8或9所述表达几丁质酶的方法在降解几丁质及其类似物中的应用。
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