CN115873772A - 一种高效表达生淀粉α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌重组菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效表达生淀粉α‑淀粉酶的枯草芽孢杆菌重组菌及其应用。本发明枯草芽孢杆菌重组菌以pBHSS142为表达载体、以来源于Pontibacillussp.ZY的生淀粉α‑淀粉酶基因为目的基因、以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)WB600为表达宿主，在目的基因的上游插入了信号肽基因，改造了启动子、5'非翻译区序列和近端编码序列。利用本发明枯草芽孢杆菌重组菌可高效表达α‑淀粉酶，以其为生产菌株，摇瓶发酵48h，可将发酵液中α‑淀粉酶的酶活提高至2974U/mL。
Description
技术领域
本发明涉及一种高效表达生淀粉α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌重组菌及其应用，属于基因工程以及微生物工程技术领域。
背景技术
α-淀粉酶(α-amylase，EC 3.2.1.1)是糖苷水解酶类中一类重要的工业用酶，其来源广泛，在动物、植物和微生物均有分布。α-淀粉酶作用于淀粉、多糖及寡糖内部的α-1,4-葡萄糖苷键，产生α-异头物构型保留的低聚麦芽糖和葡糖糖。因此α-淀粉酶被广泛应用于食品加工、污水处理、制药工业、酿酒工业、新型生物能源应用方面。
在已发现的α-淀粉酶中，只有不足10％的酶具有降解生淀粉的能力。此类酶直接作用不经糊化的生淀粉，可有效的简化现代发酵工业中的生淀粉的前期处理过程，降低能量和成本。截止目前，多数生淀粉α-淀粉酶已经被克隆并异源表达，主要的表达宿主为大肠杆菌和芽孢杆菌。然而，目前生淀粉α-淀粉酶的表达水平仍然较低，除了缺乏高比酶活的生淀粉α-淀粉酶之外，高效的蛋白表达菌株仍是一个重要的限制因素。枯草芽孢杆菌已经被报道用来表达多种淀粉酶，相对于大肠杆菌而言，其不含有内毒素，是一种食品安全菌株，同时也可以将目的蛋白分泌至胞外，有利于后续蛋白的处理。生淀粉也被称为颗粒状淀粉，无需烹饪、低温、亚糊化温度或非常规淀粉水解被认为是淀粉加工行业的重大突破，因此，开发具有能够高效表达生淀粉α-淀粉酶的重组菌株表现出更大的应用前景。
发明内容
为了解决上述生淀粉酶生产中的问题，本发明提供了一种高效表达生淀粉α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌重组菌及其应用一种高效表达生淀粉α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌重组菌及其应用。利用本发明的枯草芽孢杆菌工程菌可高效表达α-淀粉酶，以其为生产菌株，摇瓶发酵48h，可将发酵液中α-淀粉酶的酶活提高至2974U/mL。
本发明高效表达生淀粉α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌重组菌，分类命名为Bacillussubtilis WB600/pBHSS142-C1-amyZ1，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国·武汉·武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2022980，保藏日期为2022年6月27日。
本发明高效表达生淀粉α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌重组菌，由重组质粒和表达宿主组成。所述重组质粒由目的基因、启动子序列、5'非翻译区、信号肽基因以及表达载体组成；所述表达宿主为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600。
进一步地，所述目的基因为α-淀粉酶基因；所述α-淀粉酶基因AmyZ1的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，或为SEQ ID No：1经同义突变几个核苷酸且编码相同蛋白质氨基酸序列的核苷酸序列。
进一步地，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述5'非翻译区的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述信号肽基因同义突变的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述表达载体为pHT43或以pHT43为基础构建获得的pBHE或pBHSS142。
本发明高效表达生淀粉α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌重组菌，优选以pBHSS142为表达载体、以来源于Pontibacillus sp.ZY的生淀粉α-淀粉酶基因为目的基因、以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600为表达宿主，在目的基因的上游插入信号肽基因，改造了启动子、5'非翻译区序列和近端编码序列。
本发明高效表达生淀粉α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌重组菌的构建方法，包括如下步骤：
步骤1：以包含具有高比酶活力的生淀粉水解酶基因的Pontibacillus sp.ZY细菌基因组DNA为模板，以P1和P2为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，用BamH I和Xba I双酶切得到该双酶切片段amyZ1和质粒pHT43，然后用T4 DNA连接酶将酶切后的amyZ1与pHT43连接，得到连接产物；
步骤2：将得到的连接产物转化到大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞，筛选阳性克隆；从阳性克隆子中提取质粒，然后以此为模板，以P3和P4扩增AmyZ1表达盒元件；以质粒pBEP43为模板，P5和P6为引物扩增kan抗性基因和复制元件；采用POE-PCR的方法将上述两个片段连接，然后转化到枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞中，挑取阳性克隆，提取质粒并进行序列分析，获得正确的质粒为pBHE-amyZ1。
步骤3：以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168基因组为模板，P7和P8为引物扩增内源性启动子PspoVG，以P9和P10为引物扩增截短启动子PspoVG142，然后采用Overlap的方法将上述两个启动子连接为双启动子PSS142；以上述获得的质粒pBHE-amyZ1为模板，P13和P14为引物扩增骨架质粒，然后采用POE-PCR的方法将该骨架质粒与双启动子PSS142进行连接，然后转化到枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞中，挑取阳性克隆，提取质粒并进行序列分析，获得正确的质粒为pBHSS142-amyZ1。
步骤4：以质粒pBHSS142-amyZ1为模板，P15和P16为引物扩增信号肽SPYpuA，以P17和P18为引物扩增骨架质粒，然后采用POE-PCR的方法将该骨架质粒与信号肽SPYpuA进行连接，然后转化到枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞中，挑取阳性克隆，提取质粒并进行序列分析，获得正确的质粒为pBHSS142-SPYpuA-amyZ1。
步骤5：以质粒pBHSS142-SPYpuA-amyZ1为模板，以P19和P20为引物扩增5'非翻译区及amyZ1的同义突变体，以P21和P22为引物扩增骨架质粒，然后采用POE-PCR的方法将该骨架质粒与5'非翻译区进行连接，然后转化到枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞中，挑取阳性克隆，提取质粒并进行序列分析，获得正确的菌株即为重组表达菌株Bacillus subtilisWB600/pBHSS142-C1-amyZ1。
本发明枯草芽孢杆菌重组菌的应用，是通过对枯草芽孢杆菌重组菌发酵培养，生产生淀粉α-淀粉酶。
具体方法为将所述枯草芽孢杆菌重组菌先接种于种子培养基中培养，得到种子液；然后将所述种子液接种至发酵培养基中培养。
所述种子培养基的成分包含8～12g/L的蛋白胨、4～6g/L的酵母粉以及8～12g/L的氯化钠。
所述发酵培养基的成分包含14～18g/L的胰蛋白胨、8～12g/L的酵母浸粉以及4～6g/L的氯化钠；所述发酵培养基的初始pH为6.5～7.5。
具体地，挑取所述枯草芽孢杆菌重组菌单菌落先接种于种子培养基中，于35～38℃、180～220rpm下培养8-10h，得到种子液；然后将种子液以1：50的体积比接种至发酵培养基中，于30～37℃、180～220rpm下培养45～50h。
本发明的有益效果体现在：
本发明构建了以pHT43为基础的新型表达载体，以来源于Pontibacillus sp.ZY的生淀粉α-淀粉酶AmyZ1为目的基因，构建获得强启动，替换能高效表达AmyZ1的信号肽，通过优化翻译效率，最终在枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis WB600中获得了高效的表达，摇瓶发酵获得的上清液酶活达到2974U/mL，生产成本低。
本发明提供的重组菌在制备生淀粉α-淀粉酶、水解生淀粉制糖、食品烘焙和生物乙醇生产等方面有广泛的应用。
附图说明
图1为新型重组载体pBHE-amyZ1构建流程图。
图2为本发明重组载体pBHE-amyZ1经Kpn I和Xba I双酶切后的电泳图谱。
图3为本发明重组载体pBHSS142-C1-amyZ1构建流程图。
图4为重组菌Bacillus subtilisWB600/pBHSS142-C1-amyZ1摇瓶发酵SDS-PAGE电泳图。
具体实施方式
下列实施例中的实施方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中涉及的方法如下：
枯草芽孢杆菌WB600感受态制作方法：将WB600菌株在含1％可溶性淀粉的LB固体平板上划线，37℃过夜培养；用接种环挑取一个单克隆接于5mL GMⅠ溶液中，37℃、200r/min过夜振荡培养10-12h；次日取1mL新鲜培养液转接到9mL GMⅠ溶液中，37℃、200r/min振荡培养培养4.5h；再取1mL上一步骤的培养液转接到9mL GMⅡ中，37℃、200r/min振荡培养90min即为感受态细胞，可以直接用来转化。取0.5mL上述菌液，加入适量DNA(～1μg/ml)，于37℃缓慢振荡(80-120r/min)保温2.5h后涂布相应抗性平板，37℃过夜培养。
酶活检测方法：将0.3mL的2％的大米生淀粉溶液和0.27mL的50mM、pH7.0的磷酸缓冲液充分混匀，在40℃预热10min，加入0.03mL粗酶液，振荡混匀，反应10min后加入0.3mLDNS，振荡，煮沸15min后迅速冷却，12000g离心1min，540nm下测吸光度(以灭活的酶液为对照)。
在上述条件下，定义单位时间内产生1μmol麦芽糖所需要的酶量为1U。
下述实施例中所涉及的培养基如下：
种子培养基：8～12g/L的蛋白胨、4～6g/L的酵母粉以及8～12g/L的氯化钠。
发酵培养基：14～18g/L的胰蛋白胨、8～12g/L的酵母浸粉以及4～6g/L的氯化钠；所述发酵培养基的初始pH为6.5～7.5。
LB固体培养基：10g/L蛋白胨、5g/L的酵母浸粉、10g/L的NaCl、0.2g/L的琼脂粉。
LB液体培养基：10g/L蛋白胨、5g/L的酵母浸粉、10g/L的NaCl。
盐溶液(T-base)：2g/L的(NH4)2SO4、18.3g/L的K2HPO4·3H2O、6g/L的KH2PO4、1g/L的柠檬酸钠·2H2O。
GMI
GMII
注：GMI和GMII培养基的各成分中，除了盐溶液外，其余溶液都要单独灭菌，色氨酸滤灭，
在使用前将所有组分混合。
(一)新型重组表达载体pBHE-amyZ1的构建
具体实施步骤如下：
1、以前期实验室筛选获得的菌株Pontibacillus sp.ZY的基因组为模板，采用引物P1和P2扩增带有酶切位点BamH I和Xba I的AmyZ1序列，其中，在其3’端添加组氨酸标签。
P1：5’CGGGATCCATGGCAAGCAAGAATGGGAC 3’
P2：5’GCTCTAGATTAGTGATGGTGATGGTGATGCTTTTGTTTATATACCGAGAC 3’
注：下划线部分为酶切位点，组氨酸标签加粗显示。
PCR扩增程序如下：94℃预变性，5min；94℃变性，10s，55℃退火，10s，72℃延伸，100s，30个循环；72℃，10min。PCR产物用1％琼脂糖电泳回收。采用BamH I和Xba I酶切PCR产物和质粒pHT43，酶切体系见表1:
表1BamH I和Xba I双酶切体系
| 酶切组分 | 用量 |
| QuickCut<sup>TM</sup>BamHI | 2μL |
| QuickCut<sup>TM</sup>XbaI | 2μL |
| 10×QuickCut<sup>TM</sup>Buffer | 5μL |
| pHT43或PCR产物 | 2μg |
| ddH<sub>2</sub>O | 补齐50μL |
酶切条件：37℃，30min。
采用T4连接酶将上述酶切后的PCR产物和质粒pHT43进行连接并转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞，将转化产物均匀涂于含Amp抗性的筛选平板上，37℃过夜培养。挑单克隆于5mL含Amp抗性的LB培养基的试管中，37℃培养8h。按照试剂盒的说明书抽提菌液质粒，采用BamH I和Xba I双酶切进行验证，酶切正确的质粒即为pHT43-amyZ1。
2、以pHT43-amyZ1为模板，采用引物P3和P4扩增amyZ1的表达盒元件(A)，包括启动子，信号肽，目的基因和终止子。同时以质粒pBEP43位模板，采用引物P5和P6扩增kan抗性基因和复制元件(B)。引物序列如下：
P3：5’GAGGTTCGGATTCATCTATGGGTACCAGCTATTGTAAC 3’
P4：5’CAACGCACCTTTCAGCCCTTCCACCCTTTCGATCAATTC3’
P5：5’GAATTGATCGAAAGGGTGGAAGGGCTGAAAGGTGCGTTG 3’
P6：5’GTTACAATAGCTGGTACCCATAGATGAATCCGAACCTC 3’
PCR扩增程序如下：94℃预变性，5min；94℃变性，10s，60℃退火，10s，72℃延伸，150s，30个循环；72℃，10min。PCR产物用1％琼脂糖电泳回收。
采用POE-PCR的方法将上述片段A和B连接为多聚体质粒，A与B按照摩尔比1:1添加到反应体系中，然后将多聚体质粒转化至枯草芽孢杆菌WB600中，涂板后37℃过夜培养。
POE-PCR反应见表2：
表2POE-PCR反应体系
PCR扩增程序如下：94℃预变性，5min；94℃变性，10s，55℃退火，10s，72℃延伸，15min，30个循环；72℃，20min。采用双酶切Kpn I和Xba I进行双酶切验证，酶切结果见图2所示。酶切体系见表3：
表3Kpn I和Xba I双酶切体系
| 酶切组分 | 用量 |
| QuickCut<sup>TM</sup>KpnI | 0.5μL |
| QuickCut<sup>TM</sup>XbaI | 0.5μL |
| 10×QuickCut<sup>TM</sup>Buffer | 1μL |
| PCR产物 | 2μL |
| ddH<sub>2</sub>O | 补齐10μL |
从过夜培养的平板上挑取具有透明圈的单克隆，接菌到LB液体中进行培养，提取质粒后采用引物P3和P4进行扩增，条件2所述，将PCR产物送至上海生工生物测序，正确的序列对应的质粒即为pBHE-amyZ1。
(二)重组双启动子表达载体pBHSS142-amyZ1
具体实施步骤如下：
1、以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168基因组为模板，P7和P8为引物扩增内源性启动子PspoVG，以P9和P10为引物扩增截短启动子PspoVG142,引物序列如下：
P7：5’GGGGTACCTGCGGAAGTAAACG 3’
P8：5’CTATATAAAAGCATTAGTG 3’
P9：5’GATACACTAATGCTTTTATATAGCGAAATGAAAGCTTTATGA 3’
P10：5’CTATATAAAAGCATTAGTGTATC 3’
PCR扩增程序如下：94℃预变性，5min；94℃变性，10s，55℃退火，10s，72℃延伸，20s，30个循环；72℃，10min。PCR产物用1.5％琼脂糖电泳回收。
采用Overlap的方法将上述两个启动子PspoVG和PspoVG142连接为双启动子PSS142。PspoVG和PspoVG142按照摩尔比1:1添加到反应体系中，具体反应体系见表4：
表4Overlap反应体系
PCR扩增程序如下：94℃预变性，5min；94℃变性，10s，55℃退火，10s，72℃延伸，40s，30个循环；72℃，10min。PCR产物用1.5％琼脂糖电泳回收。
以上述(一)构建获得的质粒pBHE-amyZ1为模板，P13和P14为引物扩增骨架质粒pBH-amyZ1，具体步骤如下：
引物序列如下：
P13：5’CGTTTACTTCCGCAGGTACCCCCATAGATGAATCCGAACC 3’
P14：5’ACACTAATGCTTTTATATAGCTGCAGCCCAATTAAAGGAGGAAGGATCA3’
PCR扩增程序如下：94℃预变性，5min；94℃变性，10s，60℃退火，10s，72℃延伸，4min，30个循环；72℃，10min。PCR产物用1％琼脂糖电泳回收。然后采用POE-PCR的方法将该骨架质粒pBH-amyZ1与双启动子PSS142进行连接，然后将PCR产物转化到枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞中，挑取阳性克隆，提取质粒并进行序列分析，获得正确的质粒为双启动子表达载体pBHSS142-amyZ1(具体流程见图3)。
POE-PCR反应见表5：
表5POE-PCR反应体系
PCR扩增程序如下：94℃预变性，5min；94℃变性，10s，55℃退火，10s，72℃延伸，15min，30个循环；72℃，20min。
(三)重组菌Bacillus subtilis WB600/pBHSS142-C1-amyZ1的构建
以上述(二)构建的质粒pBHSS142-amyZ1为模板，以P17和P18为引物扩增骨架质粒pBHSS142-SP-amyZ1。以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168基因组为模板，P15和P16为引物扩增信号肽SPYpuA。
引物序列如下：
P15：5’TGATCCTTCCTCCTTTAATTGG 3’
P16：5’GTCAGTCTCGCGGATGCCGGATCCATGGCAAGCAAGAATG 3’
P17：
5’CCAATTAAAGGAGGAAGGATCAATGAAAAAAATATGGATTGGAATGCTGGCAGCAGC 3’
P18：5’GGCATCCGCGAGACTGAC3’
PCR扩增程序如下：94℃预变性，5min；94℃变性，10s，55℃退火，10s，72℃延伸，4min(骨架质粒)/20s(信号肽SPYpuA)，30个循环；72℃，10min。PCR产物用1％琼脂糖电泳回收。采用POE-PCR的方法将该骨架质粒pBHSS142-SP-amyZ1与信号肽SPYpuA进行连接，然后转化到枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞中，挑取阳性克隆，提取质粒并进行序列分析，获得正确的质粒为pBHSS142-SPYpuA-amyZ1。POE-PCR反应见表6：
表6POE-PCR反应体系
PCR扩增程序如下：94℃预变性，5min；94℃变性，10s，55℃退火，10s，72℃延伸，15min，30个循环；72℃，20min。
以质粒pBHSS142-SPYpuA-amyZ1为模板，以P19和P20为引物扩增5'非翻译区及amyZ1的同义突变体C1，以P21和P22为引物扩增骨架质粒pBHSS142-C-amyZ1，引物序列如下：
P19：5’
CTGCAGATTATAGGTAAGAGAGGAATGTACACATGGTCGTCAACTATTAGCCCAATTAAAGGAGGAAGG3’
P20：5’GAATTCGCCCCAGCCGTCTTTG3’
P21：5’CAAAGACGGCTGGGGCGAATTC3’
P22：5’CATTCCTCTCTTACCTATAATCTGCAGCTATATAAAAGC 3’
PCR扩增程序如下：94℃预变性，5min；94℃变性，10s，55℃退火，10s，72℃延伸，2min，30个循环；72℃，10min。PCR产物用1％琼脂糖电泳回收。
采用POE-PCR的方法将该骨架质粒pBHSS142-C-amyZ1与C1进行连接，然后转化到枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞中，挑取阳性克隆，提取质粒并进行序列分析，获得正确的菌株即为重组表达菌株Bacillus subtilis WB600/pBHSS142-C1-amyZ1。POE-PCR反应见表7：
表7POE-PCR反应体系
PCR扩增程序如下：94℃预变性，5min；94℃变性，10s，55℃退火，10s，72℃延伸，15min，30个循环；72℃，20min。
(四)摇瓶发酵产酶及生淀粉α-淀粉酶活的测定
将(三)中获得的基因的工程菌株Bacillus subtilis WB600/pBHSS142-C1-amyZ1接种于含有卡那霉素的5ml种子培养基培养基中，放置于37℃、200rpm条件下培养至10-12h，然后将其转接至100mL发酵培养基中并于30℃、200rpm条件下培养48小时；然后8000rpm、4℃离心收集得到的上清即为粗酶液(粗酶液的SDS-PAGE电泳结果见图4)。
SEQ ID No：1genomic DNA
ATGTTGGGGATTAGTTTCGTATTCATTGTGTCGATGTTTCTACCTACAAGTCATGTGAATGCGGCAAGCAAGAATGGGACCATGATGCAGTATTTTGAGTGGTATTTGCCGAATAGTGGTACTCACTGGAACAATTTGAAGAATGATGCTGGACATCTCAATGATTTGGGGATTACAGCTGTGTGGATTCCGCCGGCTTATAAAGGGACCTCTCAGGATGATGTTGGATATGGGGCATACGATTTATACGATCTAGGGGAATTTAATCAAAAAGGAACCGTACGTACGAAATATGGAACGAAAGCACAATTGAAAAATGCGATTCAAACCTTACAGCAGCAAGGGATTCAAGTATACGGGGACGTGGTTATGAATCATAAAGGCGGTGCGGATTTCACAGAGCAAGTGACCGCTGTAGAAGTGAATTCAGGCAACCGAAATGTGCAAACATCTGGGGCGTATACAATTGAGGCGTGGACGGGATTCAACTTTCCAGGGCGTGGAGATGCGTATTCAAGCTTTGATTGGCACTGGTATCACTTCGACGGGACAGACTGGGACCAATCGAGAGGTCTTAACCGAATTTATCAGTTCCAAGGTACAGGGAAGGCTTGGGACTATGAAGTAGATACAGAGAATGGGAACTATGATTACTTAATGTTCGCGGATGTGGATTACGACCACCCTGATGTAGTAAACGAGATGAAGAACTGGGGGTCTTGGTACACGAATGAGTTAAACCTAGATGGATTCCGACTCGACGCAGTCAAGCACATAAAGCATAGCTTCTTAAAGGATTGGGTGAGCCATGTACGTAGTACGACTGGAAAGGAAATGTTCACAGTCGCAGAATATTGGAAGAACGATGTGGGAGAACTTCAGGATTATTTAAGTGACGTGGGGTACAACCACTCCCTCTTTGATGCGCCCCTTCATTACAACTTCTATGATGCATCAAGGTCAAGTGGAAACTACGACATGCGTAATTTGTTAAACGGGACGCTTGTAGCTAGTCAACCAACAAAAGCTGTCACACTAGTTGAGAATCATGATTCTCAACCCGGTCAAGCGCTGGAGTCAGTTGTTCAGTCTTGGTTCAAGCCTCTTGCCTATGCGTTTATTCTGACAAGGGAGGCGGGCTATCCATCTGTGTTCTACGGTGATTATTATGGAACAAAGGGGAACAGCGGATATGAGATTCCGAATTTAAGTCAGAAGTTAGATCCACTTCTCGAAGCTCGGGAAACGTATGCATACGGAATTCAACACGATTACTTAGATCATCAAGATTTAGTAGGCTGGACACGTGAAGGAGACAGTGCTCATGCAAATTCCGGACTTGCTACTTTGATTACAGACCGAAATGGCGGTTCGAAATGGATGTATGTAGGGAAACGTAATGCAGGAGAAACATGGGTCGACATGACAGGAAACCGTTCCAACCAAGTCGTCATTAACAAAGACGGATGGGGAGAATTCTTCGTGAACGGCGGGTCTGTCTCGGTATATAAACAAAAGTAA
SEQ ID No：2 genomic DNA
TGCGGAAGTAAACGAAGTGTACGGACAATATTTTGACACTCACAAACCGGCGAGATCTTGTGTTGAAGTCGCGAGACTCCCGAAGGATGCGTTAGTCGAGATCGAAGTTATTGCACTGGTGAAATAATAAGAAAAGTGATTCTGGGAGAGCCGGGATCACTTTTTTATTTACCTTATGCCCGAAATGAAAGCTTTATGACCTAATTGTGTAACTATATCCTATTTTTTCAAAAAATATTTTAAAAACGAGCAGGATTTCAGAAAAAATCGTGGAATTGATACACTAATGCTTTTATATAGCGAAATGAAAGCTTTATGACCTAATTGTGTAACTATATCCTATTTTTTTAAAAAATATTTTAAAAACGAGCAGGATTTCAGAAAAAATCGTGGAATTGATACACTAATGCTTTTATATAG
SEQ ID No：3 other DNA
CTGCAGATTATAGGTAAGAGAGGAATGTACACATGGTCGTCAACTATTAGCCCAATTAAAGGAGGAAGGATCA
SEQ ID No：4 genomic DNA
ATGAAAAAAATATGGATTGGAATGCTGGCAGCAGCAGTTTTGCTGCTGATGGTTCCGAAGGTCAGTCTCGCGGATGCC。
Claims (6)
1.一种高效表达生淀粉α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌重组菌，其特征在于：
所述枯草芽孢杆菌重组菌是以pBHSS142为表达载体、以来源于Pontibacillus sp.ZY的生淀粉α-淀粉酶基因AmyZ1为目的基因、以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600为表达宿主，在目的基因的上游插入信号肽基因YpuA，改造了启动子spoVG、5'非翻译区序列和5'近端编码序列；
所述枯草芽孢杆菌重组菌的分类命名为BacillussubtilisWB600/pBHSS142-C1-amyZ1，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国·武汉·武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2022980，保藏日期为2022年6月27日。
2.一种权利要求1所述的枯草芽孢杆菌重组菌的应用，其特征在于：
通过对枯草芽孢杆菌重组菌发酵培养，生产生淀粉α-淀粉酶。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：
将所述枯草芽孢杆菌重组菌先接种于种子培养基中培养，得到种子液；然后将所述种子液接种至发酵培养基中培养。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：
所述种子培养基的成分包含8～12g/L的蛋白胨、4～6g/L的酵母粉以及8～12g/L的氯化钠。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：
所述发酵培养基的成分包含14～18g/L的胰蛋白胨、8～12g/L的酵母浸粉以及4～6g/L的氯化钠；所述发酵培养基的初始pH为6.5～7.5。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：
挑取所述枯草芽孢杆菌重组菌单菌落接种于种子培养基中，于35～38℃、180～220rpm下培养8-10h，得到种子液；然后将种子液以1:50的比例接种至发酵培养基中，于30～37℃、180～220rpm下培养45～50h。
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