CN115386578A - 一种提高d-阿洛酮糖3-差向异构酶异源表达水平的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶异源表达水平的方法，属于生物工程技术领域。通过改造PamyE启动子分解代谢物响应元件(Catabolite responsive element，CRE)区域以提高枯草芽孢杆菌外源蛋白表达水平，及其在D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶(DPEase)异源表达中的应用。对启动子PamyE的CRE区域进行分子改造，可缓解B.subtilis的碳分解代谢物阻遏(Carbon catabolite repression，CCR)效应，提高碳源利用率与目的蛋白的表达量，其DPEase表达量为未改造组的97.9％～349.5％。
Description
技术领域
本发明涉及一种提高D-阿洛酮糖3-差向异构酶异源表达水平的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
近年来，因为过度食用高糖、高脂肪类食物导致导致肥胖症、糖尿病、高血脂和高血压等慢性疾病的发病率陡增。D-阿洛酮糖是一种新型功能性稀少糖，被美国食品药物管理局(FDA)认定为食品安全级GRAS。D-阿洛酮糖具有蔗糖甜度的70％，但热量仅为蔗糖热量的10％，且不易被消化吸收，在食品、营养保健等领域具有较高的应用潜力。
D-阿洛酮糖在自然界中含量极少，目前其工业化制备主要由D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase，DPEase)，将D-果糖进行C3位上可逆的羟基差向异构化来生产D-阿洛酮糖。目前已发现Agrobacterium tumefaciens、Clostridium cellulolyticum、Desmospora sp.、Ruminococcus sp.等多种来源的DPEase。
B.subtilis是一种好氧革兰氏阳性细菌，能形成芽孢，不含内毒素，是芽孢杆菌属中最早被用作基因工程宿主的菌种。B.subtilis亦被FDA认定GRAS，同时培养简单迅速、具有良好的发酵基础和生产技术等优势，是工业用酶的理想表达宿主。但在发酵过程中，重组菌受碳分解代谢物阻遏(carbon catabolite repression,CCR)效应的影响，无法高效利用碳源。在B.subtilis中，碳分解代谢物的控制是通过整体调控蛋白碳分解代谢物蛋白A(carbon catabolite proteinA，CcpA)实现的。CcpA以含有组氨酸的蛋白质的甲酰基磷酸化复合物的形式与DNA结合，其中基因的顺式作用元件位于启动子区域，或位于受调控基因和操纵子的开放阅读框内，称为分解代谢物响应元件(Catabolite responsive element，CRE)。1990年，Weickert等人根据遗传分析，推导了14bp的具有一定对称性的amyO共有序列：TGWAANC*GNTNWCA(用下划线标出最重要的碱基，N是任何碱基，W表示腺嘌呤或胸腺嘧啶，星号表示对称轴)(Proc Natl Acad Sci.1990,87(16):6238-42)。1997年，Jeong-HoKim等人发现CcpA保护了一个以amyO共有序列对称轴为中心的26bp区域，并对其中鸟嘌呤的作用亲和力高于对称轴附近的脱氧核苷酸。因此，编码链中–2和+5以及模板链中+4和+10的鸟嘌呤脱氧核苷酸，以及他们在DNA序列中的对称性定位，都对CcpA与amyO的结合至关重要(Nucleic Acids Research,1997,25(17):3490-3496)。
通过CRE区域分子改造，缓解CCR效应以提高B.subtilis的碳源利用率，提高外源蛋白DPEase表达量，对于D-阿洛酮糖酶法制备行业具有及其重要的意义。
发明内容
本发明的目的是针对异源表达DPEase的重组菌株B.subtilis，提供一种通过改造启动子PamyE的CRE区域来提高碳源利用率及DPE表达量的方案。
本发明提供一种启动子，所述启动子以核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的PamyE启动子为亲本，对PamyE启动子的CRE区域的-2、+3、+4、+5、+6或+10位点进行单突变。
在一种实施方式中，在CRE区域的+6位点单突变后，再针对-3、-6或-9位点引入碱基缺失。
在一种实施方式中，所述CRE区域是指具有对称性的amyO类似核苷酸区域TGTAAGCGTTAACA。
在一种实施方式中，CRE区域的-2位点从G突变为C，命名为G2C。
在一种实施方式中，CRE区域的-2位点从G突变为A，命名为G2A。
在一种实施方式中，CRE区域的-2位点从G突变为T，命名为G2T。
在一种实施方式中，CRE区域的+3位点从G突变为C，命名为G3C。
在一种实施方式中，CRE区域的+3位点从G突变为T，命名为G3T。
在一种实施方式中，CRE区域的+3位点从G突变为A，命名为G3A。
在一种实施方式中，CRE区域的+4位点从C突变为G，命名为C4G。
在一种实施方式中，CRE区域的+4位点从C突变为A，命名为C4A。
在一种实施方式中，CRE区域的+4位点从C突变为T，命名为C4T。
在一种实施方式中，CRE区域的+5位点从G突变为C，命名为G5C。
在一种实施方式中，CRE区域的+5位点从G突变为A，命名为G5A。
在一种实施方式中，CRE区域的+5位点从G突变为T，命名为G5T。
在一种实施方式中，CRE区域的+6位点从T突变为A，命名为T6A。
在一种实施方式中，CRE区域的+6位点从T突变为G，命名为T6G。
在一种实施方式中，CRE区域的+6位点从T突变为C，命名为T6C。
在一种实施方式中，CRE区域的+10位点从C突变为G，命名为C10G。
在一种实施方式中，CRE区域的+10位点从C突变为T，命名为C10T。
在一种实施方式中，CRE区域的+6位点的T突变成A，并在-3位点引入碱基缺失，命名为T6AΔ3。
在一种实施方式中，CRE区域的+6位点的T突变成A，并在-6位点引入碱基缺失，命名为T6AΔ6。
在一种实施方式中，CRE区域的+6位点的T突变成A，并在-9位点引入碱基缺失，命名为T6AΔ9。
本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体携带上述的启动子。
在一种实施方式中，所述表达载体还包括目的基因；所述目的基因在启动子的下游。
在一种实施方式中，所述重组质粒以枯草芽孢杆菌表达载体为骨架，包括但不限于pHT01，或pHT304,或pHY300PLK，或pMA09，或pDG1663质粒。
在一种实施方式中，所述的目的基因为编码D-阿洛酮糖3-差向异构酶的基因dpe。
在一种实施方式中，所述基因dpe的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
携带上述重组质粒的微生物细胞。
本发明提供了一种提高目的基因表达量的方法。
在一种实施方式中，所述方法为利用上所述启动子诱导目的基因的表达。
本发明还提供了一种制备DPEase的方法，所述方法为将上述微生物细胞接种至培养基，35～38℃，180～220r·min-1培养1.5～2.5h后，转至31～34℃，180～220r·min-1发酵45～50h。
本发明提供了上述方法制备得到的DPEase在制备D-阿洛酮糖方面的应用。
本发明提供了上述表达载体及微生物细胞在表达DPEase并用于制备D-阿洛酮糖方面的应用。
有益效果：
将PamyE的CRE区域上相对保守的-2、+3、+4、+5、+6、+10位点进行突变(图1)，以及在+6位点引入点突变(T突变成A)并分别在-3、-6和-9位点引入碱基缺失。同时构建删除CRE区域的突变体ΔCre作为对照。在相同的发酵时间内，直接删除CRE区域的ΔCre突变体菌体几乎不生长，除C10A外，其他突变后的启动子菌浓和酶活均高于原始菌株。设计构建的CRE区域突变体，大多对缓解CCR效应有正面效果，本发明具有良好的工业应用潜力。
附图说明
图1是启动子PamyE的CRE区域。
具体实施方式
1、LB培养基(g/L)：酵母粉5.0，胰蛋白胨10.0，NaCl 10.0。
2、TB培养基(g·L-1)：酵母粉24.0，甘油5.0，胰蛋白胨12.0，K2HPO4·3H2O，KH2PO42.31。
实施例1：CRE突变体的构建
(1)构建重组质粒pHY300PLK-PamyE-dpe
合成了含有PamyE启动子(SEQ ID NO.1)和D-阿洛酮糖3-差向异构酶的基因dpe(SEQ ID NO.2)的基因片段，其中PamyE启动子在基因dpe的上游并调控基因dpe的表达，将基因片段插入到穿梭载体pHY300PLK并在枯草芽孢杆菌中表达，获得重组质粒pHY300PLK-PamyE-dpe。
(2)构建突变质粒
设计定点突变的突变引物，以携带PamyE启动子和编码D-阿洛酮糖3-差向异构酶的基因dpe的重组质粒pHY300PLK-PamyE-dpe为模板，在CRE区的不同位点引入突变。
以突变体G2C为例，构建方法如下：
1)单引物扩增PCR：以G2C的上游引物或下游引物分别单独进行PCR扩增反应，反应体系：12.5μL 2×Super Pfx MasterMix、25ng模板和0.5μL G2C-F/0.5μL G2C-R，用水补齐至25μL。反应程序：98℃预变性3min 30s，然后进行3个循环(98℃，30s；55℃，30s；72℃，1min)，4℃保温；得到2份PCR产物。
2)反应结束后，将步骤1)获得的2份PCR产物混匀，依次在98℃预变性3min 30s；然后进行15个循环(98℃，30s；55℃，30s；72℃，1min/kb)；72℃复性5min后，在4℃保温；得到扩增产物。
3)取步骤2)获得的7.5μL扩增产物，加入1.5μLDpn I和1μL CutSmart混匀，在37℃水浴处理9h，消化体系中的模板用于后续转化。转化产物转化入Escherichia coli JM109感受态细胞，涂布至LB固体培养基(含30μg·mL-1氨苄青霉素)上，37℃过夜培养。挑选阳性克隆，提取质粒，进行测序验证。
4)将步骤3)中测序正确的质粒，电转至B.subtilis感受态中进行表达，获得含有突变体G2C的重组枯草芽孢杆菌。
同样的，构建突变体ΔCre、G2C、G2A、G2T、G3C、G3T、G3A、C4G、C4T、C4A、G5C、G5A、G5T、T6A、T6G、T6C、C10G、C10A、C10T、T6AΔ3、T6AΔ6和T6AΔ9。
表1引物序列
实施例2：重组枯草芽孢杆菌的摇瓶发酵
1)摇瓶发酵：将步骤1制备的重组枯草芽孢杆菌的单菌落或者甘油管以2‰接种率接入10mL LB(含30μg·mL-1四环素)中，在37℃，200r·min-1的条件下培养12h。获得的种子液以5％的接种率接入TB(含30μg·mL-1四环素)培养基中，37℃，200r·min-1培养2h后，转至33℃，200r·min-1发酵48h。
2)粗酶液的制备：摇瓶发酵结束后，在4℃，8000g下离心15min，弃置上清，收集菌体。用一定体积20mM的HEPES(pH 7.5，含0.1mM的Co2+)缓冲液重悬菌体。4℃下高压匀浆1000bar破壁，将菌液循环破壁三次。4℃将破壁后获得的悬液在8000g离心20min，取上清即为粗酶液。
实施例3：突变体酶活以及催化D-果糖的平衡转化率
菌浓测定：用去离子水稀释菌液，混匀后均匀取样，将样品放置在1cm玻璃比色皿中，读取600nm波长下吸光值，确保吸光值在0.2-0.8的有效范围内。菌浓(OD600)＝吸光值(0.2-0.8)×稀释倍数。
酶活测定：在60℃，pH 7.5的条件下，以缓冲液配制的800μL的100g·L-1的D-果糖为底物，添加200μL的用缓冲液稀释后的实施例2获得的粗酶液，混合均匀后精准反应10min，沸水浴10min终止反应。将样品在12000g离心5min，取上清，加去离子水稀释上清至合适的倍数，再用0.22μm的滤膜过滤处理，除去杂质，经高效液相色谱(HPLC)检测D-阿洛酮糖和D-果糖的含量。
D-果糖的平衡转化：在60℃，pH 7.5的条件下，以缓冲液配制的8mL的100g·L-1的D-果糖为底物，添加2mL的用缓冲液稀释后的实施例2获得的粗酶液，混合均匀后反应4h，沸水浴10min终止反应。将样品在12000g离心5min，取上清，加去离子水稀释上清至合适的倍数，再用0.22μm的滤膜过滤处理，除去杂质，经高效液相色谱(HPLC)检测D-阿洛酮糖和D-果糖的含量以及平衡转化率。
缓冲液：20mM的HEPES，pH 7.5，含0.1mM的Co2+。
HPLC色谱条件如下：Agilent 1200HPLC色谱仪，ShodexTMAsahipakNH2P-504E色谱柱，柱温设定在35℃，Agilent示差检测器，Agilent自动进样器，流动相75％乙腈(有机膜抽滤后超声处理5min)，流动相流速为0.8mL·min-1。根据D-阿洛酮糖的吸收峰面积和标准品峰面积计算DPE的酶活以及催化D-果糖的平衡转化率。
表2重组菌株在摇瓶中发酵48h后菌体量与CcDPE酶活情况
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种提高D-阿洛酮糖3-差向异构酶异源表达水平的方法
<130> BAA210753A
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 280
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cttacagaag agcggtaaaa gaagaaataa aaaagaaatc atcttttttg tttggaaagc 60
gagggaagcg ttcacagttt cgggcagctt tttttatagg aacattgatt tgtattcact 120
ctgccaagtt gttttgatag agtgattgtg ataattttaa atgtaagcgt taacaaaatt 180
ctccagtctt cacatcggtt tgaaaggagg aagcggaaga atgaagtaag agggattttt 240
gactccgaag taagtcttca aaaaatcaaa taaggagtgt 280
<210> 2
<211> 879
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgaagcacg gcatctacta cgcctactgg gagcaggagt gggaggccga ctacaagtac 60
tacatcgaga aggtggccaa gctgggcttc gacatcctgg agatcgccgc cagccccctg 120
cccttctaca gcgacatcca gatcaacgag ctgaaggcct gcgcccacgg caacggcatc 180
accctgaccg tgggccacgg ccccagcgcc gagcagaacc tgagcagccc cgaccccgac 240
atcaggaaga acgccaaggc cttctacacc gacctgctga agaggctgta caagctggac 300
gtgcacctga tcggcggcgc cctgtacagc tactggccca tcgactacac caagaccatc 360
gacaagaagg gcgactggga gaggagcgtg gagagcgtga gggaggtggc caaggtggcc 420
gaggcctgcg gcgtggactt ctgcctggag gtgctgaaca ggttcgagaa ctacctgatc 480
aacaccgccc aggagggcgt ggacttcgtg aagcaggtgg accacaacaa cgtgaaggtg 540
atgctggaca ccttccacat gaacatcgag gaggacagca tcggcggcgc catcaggacc 600
gccggcagct acctgggcca cctgcacacc ggcgagtgca acaggaaggt gcccggcagg 660
ggcaggatcc cctgggtgga gatcggcgag gccctggccg acatcggcta caacggcagc 720
gtggtgatgg agcccttcgt gaggatgggc ggcaccgtgg gcagcaacat caaggtgtgg 780
agggacatca gcaacggcgc cgacgagaag atgctggaca gggaggccca ggccgccctg 840
gacttcagca ggtacgtgct ggagtgccac aagcacagc 879
Claims (10)
1.启动子，其特征在于，以核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的PamyE启动子为亲本，对PamyE启动子的CRE区域的-2、+3、+4、+5、+6或+10位点进行单突变；所述CRE区域的核苷酸序列为TGTAAGCGTTAACA。
2.根据权利要求1所述的启动子，其特征在于，在CRE区域的+6位点单突变后，再针对-3、-6或-9位点引入碱基缺失。
3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体携带权利要求1或2所述的启动子。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体还包括目的基因；所述目的基因在启动子的下游。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体以枯草芽孢杆菌表达载体为骨架，包括但不限于pHT01，或pHT304，或pHY300PLK，或pMA09，或pDG1663质粒。
6.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述的目的基因为编码D-阿洛酮糖3-差向异构酶的基因dpe。
7.携带权利要求3～6所述表达载体的微生物细胞。
8.一种提高目的基因表达量的方法，其特征在于，所述方法为利用权利要求1或2所述启动子诱导目的基因的表达。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的目的基因为编码D-阿洛酮糖3-差向异构酶的基因dpe。
10.一种制备D-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法，其特征在于，将权利要求7所述的微生物细胞接种至培养基，35～38℃，180～220r·min-1培养1.5～2.5h后，转至31～34℃，180～220r·min-1发酵45～50h。
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