CN113122490A

CN113122490A - 双基因缺陷型工程菌及其在提高n-乙酰氨基葡萄糖产量的应用

Info

Publication number: CN113122490A
Application number: CN202110324912.4A
Authority: CN
Inventors: 陆晓晴; 周佳; 田宝霞; 李相前
Original assignee: Huaiyin Institute of Technology
Current assignee: Huaiyin Institute of Technology
Priority date: 2021-03-25
Filing date: 2021-03-25
Publication date: 2021-07-16
Anticipated expiration: 2041-03-25
Also published as: CN113122490B

Abstract

本发明公开了一种双基因缺陷型工程菌，所述双基因缺陷型工程菌含有BsGlmS基因和GAN1基因，并通过敲除宿主菌的endA1基因和nagK1基因获得。本发明还公开了该菌株的制备方法及其应用。本发明通过敲除了核酸内切酶基因endA1和N‑乙酰氨基葡萄糖激酶基因nagK1提高含N‑乙酰氨基葡萄糖合成途径的工程菌的乙酰氨基葡萄糖产量。利用本发明获得的产乙酰氨基葡萄糖工程菌进行发酵，可显著提高其产量，具有产业化应用价值。

Description

双基因缺陷型工程菌及其在提高N-乙酰氨基葡萄糖产量的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及双基因缺陷型工程菌及其在提高N-乙酰氨基葡萄糖产量的应用。

背景技术

N-乙酰葡萄糖胺存在于所有生物体中，在人体中是透明质酸、硫酸软骨素及硫酸角质素等葡糖胺多糖的二糖单元前体。N-乙酰葡萄糖胺特异性地作用于关节软骨，对于维持软骨的健康和正常的关节功能具有重要作用；N-乙酰葡萄糖胺可以增加皮肤中透明质酸的含量；此外N-乙酰葡萄糖胺还是合成乙酰神经氨酸的前体物质。目前N-乙酰葡萄糖胺主要通过水解几丁质合成，化学法水解环境污染严重，水解几丁质的酶合成量低，不利于工业化生产。微生物发酵因其发酵周期短、产量高引起了越来越多的关注。

目前，已经实现了基于质粒表达系统的微生物工程菌用于N-乙酰氨基葡萄糖的发酵生产。质粒DNA的稳定性直接影响代谢途径蛋白质的表达水平。N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸是N-乙酰氨基葡萄糖的前体物质。在微生物细胞内存在将N-乙酰氨基葡萄糖磷酸后反向转化为其前体物质N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸的关键酶N-乙酰氨基葡萄糖激酶。现有技术主要还是基于质粒表达系统的工程菌，普遍存在产物产量不稳定的情况，且产物中容易残留较多的氨基葡萄糖致使终产物N-乙酰氨基葡萄糖的转化率降低，同时给N-乙酰氨基葡萄糖的分离纯化带来难度。

发明内容

发明目的：为解决现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供了一种核酸内切酶基因endA1和N-乙酰氨基葡萄糖激酶基因nagK1双缺陷型大肠杆菌工程菌。本发明通过敲除宿主细胞内核酸内切酶基因endA1和N-乙酰氨基葡萄糖激酶基因nagK1，一方面提高质粒DNA的稳定性，一方面阻断N-乙酰氨基葡萄的逆转化从而促使催化反应尽可能的朝合成N-乙酰氨基葡萄的方向进行，从而实现N-乙酰氨基葡萄糖产量的提高。

本发明还要解决的技术问题是提供了所述双基因缺陷型大肠杆菌工程菌的构建方法。

本发明还要解决的技术问题是提供了该双基因缺陷型大肠杆菌工程菌在生产N-乙酰氨基葡萄糖中的应用。

本发明最后要解决的技术问题是提供了一种生产N-乙酰氨基葡萄糖的方法。

技术方案：为解决上述技术问题，本发明提供了一种双基因缺陷型工程菌，所述双基因缺陷型工程菌含有BsGlmS基因和GAN1基因，并通过敲除宿主菌的endAl基因和nagK1基因获得。

本发明的由多基因构成的N-乙酰氨基葡萄糖合成途径中的多个基因包含源自枯草芽孢杆菌的编码氨基葡萄糖合成酶的基因BsGlmS和源自酵母菌的编码氨基葡萄糖转乙酰基酶的基因GAN1。

其中，所述宿主菌大肠杆菌包括但不仅限于Escherichia coli、BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、JM109、DH5α、TOP10、HB101、DH10B或其他野生型大肠杆菌。

其中，所述BsGlmS基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述编码BsGlmS基因的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述GAN1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述编码GAN1基因的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明内容还包括所述的双基因缺陷型工程菌的构建方法，包括以下步骤：

1)含有BsGlmS基因和GAN1基因的重组表达载体的构建；

2)endA1基因缺失型的MGΔendA1菌株的构建：通过同源重组的方法将大肠杆菌的endA1基因敲除得到MGΔendA1菌株；

3)MGΔendA1ΔnagK1菌株的构建：通过同源重组的方法将步骤2)得到的MGΔendA1菌株的nagK1基因敲除得到MGΔendA1ΔnagK1菌株；

4)将步骤1)构建得到的重组表达载体转化到步骤3)得到的MGΔendA1ΔnagK1菌株中得到endA1和nagK1双基因缺陷型工程菌。

其中，步骤1)中所述重组表达载体为pTrc99A系列表达载体、pSTV28系列表达载体、pET21系列表达载体或pBR322系列载体中的一种或几种。

其中，步骤2)的具体步骤为：

2.1)以pKD13质粒为模板，将敲除目标基因endA1的引物对进行聚合酶链式反应，扩增得到线性同源重组片段；

2.2)以大肠杆菌为出发菌株，将携带Red重组酶的pKD46质粒转入大肠杆菌中，在含氨卞霉素平板培养基上筛选得到转化子；将转化子接入有Amp抗性的LB培养基，并加入诱导剂，制备MG1655/pKD46感受态；

2.3)将步骤2.1)得到的线性同源重组片段电转化进入MG1655/pKD46感受态细胞，倒置培养，挑选转化子，得到带有卡那霉素抗性基因的标记MGΔendAl菌株。

其中，步骤3)的具体步骤为：以pKD13质粒为模板，将敲除目标基因nagK1的引物对进行聚合酶链式反应，扩增得到线性同源重组片段；其余具体过程同步骤2.2)-2.3)。

本发明内容还包括所述的双基因缺陷型工程菌在生产N-乙酰氨基葡萄糖中的应用。

本发明内容还包括一种产乙酰氨基葡萄糖的方法，所述方法包括以下步骤：

1)种子培养：将单菌落菌种接种至种子培养基中培养得到种子液；

2)发酵培养：将种子液接种发酵培养基，不额外添加诱导剂，直接利用宿主菌渗漏表达进行代谢通路的基因表达。

其中，步骤2)中，所述在发酵过程中通入空气，所述发酵温度为25-38℃，所述发酵体系的pH值为6.5-7.5。

其中，步骤2)中所述发酵培养基中的碳源为甘油、葡萄糖和淀粉中的一种或几种；发酵培养基中的氮源为酵母粉和蛋白胨，无需添加诱导剂。

本发明的机理：本发明的endAl基因编码的是非特异性核酸内切酶，非特性核酸内切酶的功能是可降解所有形式的核酸，该功能缺失时，可增加转入的外源质粒DNA以及宿主DNA的稳定性，不易被降解。而nagK1基因编码N-乙酰氨基葡萄糖激酶，催化产物N-乙酰氨基葡萄向其磷酸化形式转化，减少终产物的积累。因此，本发明是基于质粒表达系统的N-乙酰氨基葡萄的合成代谢途径，质粒及宿主DNA的稳定性对合成途径工作的稳定性有直接影响，同时阻止以N-乙酰氨基葡萄的反向转化可能对于质粒表达系统的N-乙酰氨基葡萄有超过预期的效果。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明中过表达的编码组成N-乙酰氨基葡萄糖合成代谢途径中所有的酶的基因，同时敲除宿主基因组核酸内切酶基因endA1和N-乙酰氨基葡萄糖激酶基因nagK1，在兼性厌氧的条件下可利用含葡萄糖、甘油或其它碳源的丰富培养基为原料可提显著N-乙酰氨基葡萄糖产量，其增加幅度因不同基因型宿主菌株而异。

附图说明

图1为本发明中N-乙酰氨基葡萄糖合成代谢途径；

图2为本发明中pTrc99A3载体图；

图3质粒pT-BsGlmS-GNA1酶切验证图谱；

图4为本发明中pT-BsGlmS-GNA1的质粒图谱；

图5大肠杆菌工程菌产N-乙酰氨基葡萄糖的产量和细菌生长浓度图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

本发明实施例中的培养基组成：

LB(Luria-Bertani)培养基(g/l)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠5，pH为7.0，121℃灭菌20min。

2YT培养基(g/l)：胰蛋白胨16，酵母提取物10，氯化钠5，pH为7.0，121℃灭菌20min。

Amp LB固体培养基：在LB与2YT固体培养基灭菌后冷却低至50℃左右时添加终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素。

Kan LB固体培养基：在LB固体培养基灭菌后冷却低至50℃左右时添加终浓度为50μg/ml的硫酸霉素。

实施例1：

1、枯草芽孢杆菌基因组DNA的提取

接种平板划线的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168(购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)单菌落于3ml LB液体培养基，37℃，250rpm培养15小时后收集1.5ml菌液，并根据生工生物工程(上海)股份有限公司购买的细菌基因组DNA快速抽提试剂盒说明书进行操作抽提全基因组DNA，溶解于0.1mL超纯水，制得浓度为20ng/ul的基因组DNA溶液。

2、酵母基因组DNA的提取

接种平板划线的酵母菌Saccharomycopsis cerevisiae ATCC 38626(购自美国典型培养物保藏中心)单菌落于3ml LB液体培养基，30℃，250rpm培养20小时后收集1ml菌液，并根据生工生物工程(上海)股份有限公司购买的革酵母基因组DNA快速抽提试剂盒从抽提全基因组DNA，溶解于0.1mL超纯水，制得浓度为15ng/ul的基因组DNA溶液。

3、编码氨基葡萄糖合成酶基因BsGlmS的制备

可采用如下方法制备BsGlmS基因(SEQ ID No.1)，也可以采用人工合成的方式得到。

以提取的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168基因组DNA为模版PCR扩增。PCR所使用的引物在合成时Bsglms-Bm-F引入BamH I酶切位点，Bsglms-Pa-R引入Pac I酶切位点获得引物对，具体序列及酶切位点(下划线所示)如下：

Bsglms-Bm-F TTggatccAGGAGGAAGAAAAATATGTGTGG

Bsglms-Pa-R CATttaattaaTTACTCCACAGTAACACTCTTC

PCR反应体系如下：1μL BsGlmS基因组DNA(20ng)，1μL Bsglms-Bm-F，1μL Bsglms-Pa-R，25μL Premix ExTaq(购自TaKaRa；货号：RR390A)，22μL超纯水。

PCR反应条件：94℃变性5min；94℃变性30sec，54℃退火30sec，72℃延伸2min，30个循环，72℃延伸10min，4℃保温。

PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用PCR产物回收试剂盒进行纯化(生工生物工程(上海)股份有限公司)得到BsGlmS基因片段。

4、编码氨基葡萄糖转乙酰基酶的基因GAN1的制备

可采用如下方法制备GAN1基因(SEQ ID No.3)，也可以采用人工合成的方式得到。

以酵母菌Saccharomycopsis cerevisiae ATCC 38626基因组DNA为模版进行PCR扩增，用于PCR的引物合成时引入酶切位点。引物GNA1-Pa-F引入Pac I酶切位点，GNA1-Xb-R引入Xba I酶切位点，具体序列及酶切位点(下划线所示)如下：

GNA1-Pa-F：TAGttaattaaAAAGGAGGAAGGATCAATGAGCTTACCCGATGGATT

GNA1-Xb-R：TCtctagaCTATTTTCTAATTTGCATTTCCACG

PCR反应体系如下：1μL Saccharomycopsis cerevisiae ATCC 38626基因组DNA(15ng)，1μL GNA1-Pa-F，1μL GNA1-Xb-R，25μL Premix ExTaq(购自TaKaRa；货号：RR390A)，22μL超纯水。

PCR反应条件：94℃变性5min；94℃变性30sec，54℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸10min，4℃保温。

PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用PCR产物回收试剂盒进行纯化(生工生物工程(上海)股份有限公司)得到GAN1基因片段。

实施例2：表达载体pT-BsGlmS-GNA1的构建

N-乙酰氨基葡萄糖合成代谢途径由氨基葡萄糖合成酶和源自酵母菌的编码氨基葡萄糖转乙酰基酶组成(图1)。将N-乙酰氨基葡萄糖合成代谢途径相关基因构建于表达载体上，如pTrc99A3载体(图2)。各相关基因在表达载体上可以任意顺序排列。本例中以5’-BsGlmS-GNA1-3’的顺序排列在pTrc99A3载体上多克隆酶切位点处，形成pT-BsGlmS-GNA1。具体实施步骤如下：

将纯化过的PCR产物(实施例1步骤3、4制备的各个PCR产物BsGlmS基因片段和GAN1基因片段)及载体质粒pTrc99A2分别用PCR引入的酶切位点对应的限制性内切酶BamH I/Pac I，Pac I/Xba I进行双酶切；琼脂糖电泳回收酶切PCR及载体大片段，通过DNA连接酶将酶切后的基因片段依次于16℃连接于pTrc99A2的对应酶切产物。用每次的连接反应产物转化大肠杆菌DH5α，然后涂布于含100μg/mL Amp(氨苄青霉素)的培养皿，37℃培养10-12h。次日挑取单菌落采用上海生工质粒小量提取试剂盒提取质粒，并进行双酶切验证。琼脂糖凝胶电泳结果显示载体质粒pTrc99A3的线性化片段大小为4.2kb，BsGlmS-GNA1线性化片段大小为2.45kb，酶切结果符合实际片段大小(图3)。本发明中pT-BsGlmS-GNA1的质粒图谱参见图4。

实施例3：核酸内切酶基因endA1缺失突变体菌株工程菌的构建

本发明产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌工程菌所用的宿主大肠杆菌为核酸内切酶基因endAl缺失突变体菌株。宿主大肠杆菌可以为Escherichia coli BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、JM109、DH5α、TOP10、HB101、DH10B或野生型大肠杆菌。本例中使用的原始宿主菌为野生型大肠杆菌MG1655，并通过同源重组的方法将endA1从其基因组上敲除，该突变体菌株命名为MGΔendA1。具体操作方法如下：以含卡那霉素基因序列的pKD13质粒(购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心)为模板，用于敲除目标基因endA1的引物为endA1-KO-F(5’-AAACAGCTTTCGCTACGTTGCTGGCTCGTTTTAACACGGAGTAAGTGATGATTCCGGGGATCCGTCGAC-3’)和endA1-KO-R(5’-CGACGCGACAGCATAGCAACCTCTGTTGTTTAATCGGTTAGATGTAGGAATGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’)进行聚合酶链式反应，扩增得到中间为卡那抗性基因和FRT标记、两侧为endA1短同源臂的线性同源重组片段。以MG1655为出发菌株，将携带Red重组酶的氨卞霉素抗性质粒pKD46(购自优宝生物；产品货号VT1692)转入细胞中，在Amp LB固体培养基上筛选得到转化子；

将转化子接入Amp LB固体培养基，并加入终浓度为2mmol/L的阿拉伯糖作为诱导剂，30℃培养至OD₆₀₀＝0.6时收集菌体制备电转感受态。将PCR获得的带卡那霉素基因序列的线性同源重组片段电转化进入MG1655/pKD46感受态细胞，涂布于Kan LB固体培养基，30℃倒置培养20小时，挑选转化子，得到带有卡那霉素抗性基因的标记MGΔendAl菌株。采用42℃热激偶合抗生素抗性负筛选的策略，将替换突变的大肠杆菌中的pKD46质粒丢失。将辅助质粒pCP20(购自优宝生物；货号：VT1693)转化入带有卡那霉素抗性基因的标记MGΔendA1菌株中表达FLP重组酶用于卡那抗性基因的缺失突变，采用42℃热激偶合抗生素抗性负筛选的策略，将缺失突变的大肠杆菌中的pCP20质粒丢失，最终获得MGΔendA1菌株。将实施例2中的质粒pT-BsGlmS-GNA1转化MGΔendA1获得核酸内切酶基因endA1缺失突变体菌株工程菌MGΔendA1：pT-BsGlmS-GNA1。

实施例4：N-乙酰氨基葡萄糖激酶基因nagK1缺失突变体菌株工程菌的构建

本发明产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌工程菌所用的宿主大肠杆菌为核酸内切酶基因nagK1缺失突变体菌株(图1)。宿主大肠杆菌可以为Escherichia coli BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、JM109、DH5α、TOP10、HB101、DH10B或野生型大肠杆菌。本例中使用的原始宿主菌为野生型大肠杆菌MG1655，并通过同源重组的方法将nagK1从其基因组上敲除，该突变体菌株命名为MGΔnagK1。用于敲除目标基因nagK1的引物为nagK-KO-F(5’-AGTCCTTAGCGGCCAGTAAAGGCAGTACATTAAAACAAGGAGCGGCAATGATTCCGGGGATCCGTCGAC-3’)和nagK-KO-R(5’-CGACGCGACAGCATAGCAACCTCTGTTGTTTAATCGGTTAGATGTAGGAATGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’)。具体操作同实施例3，获得MGΔnagK1菌株。将实施例2中的质粒pT-BsGlmS-GNA1转化MGΔnagK1获得核酸内切酶基因nagK1缺失突变体菌株工程菌MGΔnagK1：pT-BsGlmS-GNA1。

实施例5：核酸内切酶基因endA1和N-乙酰氨基葡萄糖激酶基因nagK1双敲除突变体工程菌株的构建

本发明产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌工程菌所用的宿主大肠杆菌为核酸内切酶基因endAl和N-乙酰氨基葡萄糖激酶基因nagK1双敲除突变体菌株。宿主大肠杆菌可以为Escherichia coli BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、JM109、DH5α、TOP10、HB101、DH10B或野生型大肠杆菌。本例中使用的宿主菌为实施例3获得的MGΔendA1，并通过同源重组的方法将nagK1从其基因组上敲除。用于敲除目标基因nagK1的具体操作同实施例4，获得MGΔendA1ΔnagK1菌株。将实施例2中的质粒pT-BsGlmS-GNA1转化MGΔnagK1获得核酸内切酶基因nagK1缺失突变体菌株工程菌MGΔendA1ΔnagK1：pT-BsGlmS-GNA1。

实施例6：基于野生型大肠杆菌MG1655的N-乙酰氨基葡萄合成菌株的构建

将实施例2中pT-BsGlmS-GNA1质粒电转化到野生型大肠杆菌MG1655得到大肠杆菌工程菌株MG：pT-BsGlmS-GNA1。

实施例7：试管发酵实验

分别以上述实施例3、4、5、6所构建的菌株作为生产菌株生产N-乙酰氨基葡萄糖：

1)种子培养：将单菌落菌种接种至LB培养基中，30℃，250rpm培养12h。

2)发酵培养：按10％接种量接种2YT培养基，37℃，250rpm培养48h；以初始浓度为20g/L的甘油作为碳源进行发酵，不额外添加诱导剂，直接利用宿主菌渗漏表达进行代谢通路的基因表达；每培养24小时取一次样。

3)取制备得到的不同时间段的待测发酵样品的菌液，8000rpm离心8min，取上清液用无菌水稀释10倍，再用0.22μm的滤膜过滤后上样。用分光光度法检测细菌生长浓度及液相色谱法检测N-乙酰氨基葡萄糖产量(图5)。其中，液相色谱条件：所使用检测器为示差检测器；色谱柱为Analysis Column 4.6×150mm 5-Micron；流动相为超纯水-乙腈(25∶75，V/V)；流速为1ml/min；进样量为20μl；检测温度为30℃。

4)试管发酵48h后以野生型大肠杆菌MG1655为宿主的工程菌MG：pT-BsGlmS-GNA1的GlcNAc产量在发酵48小时后达到5.4g/L，突变体MGΔendA1：pT-BsGlmS-GNA1的GlcNAc产量在发酵48小时后达到7.0g/L；突变体MGΔnagK1：pT-BsGlmS-GNA1的GlcNAc产量在发酵48小时后达到6.3g/L；双突变体MGΔendA1ΔnagK1：pT-BsGlmS-GNA1的GlcNAc产量在发酵48小时后达到10.9g/L。由此可见，单基因突变体分别比野生型对照组增产1.6g/L和0.9g/L，而双突变体较野生型对照组增产5.5g/L，其增幅远高于任何一个单基因突变体或两个单突变体增幅的总和，该实施例说明双基因突变较单基因突变对产量产生了放大效果，带来了协同效应。

序列表

<110> 淮阴工学院

<120> 双基因缺陷型工程菌及其在提高N-乙酰氨基葡萄糖产量的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1803

<212> DNA

<213> BsGlmS基因(BsGlmS)

<400> 1

atgtgtggaa tcgtaggtta tatcggtcag cttgatgcga aggaaatttt attaaaaggg 60

ttagagaagc ttgagtatcg cggttatgac tctgctggta ttgctgttgc caacgaacag 120

ggaatccatg tgttcaaaga aaaaggacgc attgcagatc ttcgtgaagt tgtggatgcc 180

aatgtagaag cgaaagccgg aattgggcat actcgctggg cgacacacgg cgaaccaagc 240

tatctgaacg ctcacccgca tcaaagcgca ctgggccgct ttacacttgt tcacaacggc 300

gtgatcgaga actatgttca gctgaagcaa gagtatttgc aagatgtaga gctcaaaagt 360

gacaccgata cagaagtagt cgttcaagta atcgagcaat tcgtcaatgg aggacttgag 420

acagaagaag cgttccgcaa aacacttaca ctgttaaaag gctcttatgc aattgcttta 480

ttcgataacg acaacagaga aacgattttt gtagcgaaaa acaaaagccc tctattagta 540

ggtcttggag atacattcaa cgtcgtagca tctgatgcga tggcgatgct tcaagtaacc 600

aacgaatacg tagagctgat ggataaagaa atggttatcg tcactgatga ccaagttgtc 660

atcaaaaacc ttgatggtga cgtgattaca cgtgcgtctt atattgctga gcttgatgcc 720

agtgatatcg aaaaaggcac gtaccctcac tacatgttga aagaaacgga tgagcagcct 780

gttgttatgc gcaaaatcat ccaaacgtat caagatgaaa acggcaagct gtctgtgcct 840

ggcgatatcg ctgccgctgt agcggaagcg gaccgcatct atatcattgg ctgcggaaca 900

agctaccatg caggacttgt cggtaaacaa tatattgaaa tgtgggcaaa cgtgccggtt 960

gaagtgcatg tagcgagtga attctcctac aacatgccgc ttctgtctaa gaaaccgctc 1020

ttcattttcc tttctcaaag cggagaaaca gcagacagcc gcgcggtact cgttcaagtc 1080

aaagcgctcg gacacaaagc cctgacaatc acaaacgtac ctggatcaac gctttctcgt 1140

gaagctgact atacattgct gcttcatgca ggccctgaga tcgctgttgc gtcaacgaaa 1200

gcatacactg cacaaatcgc agttctggcg gttcttgctt ctgtggctgc tgacaaaaat 1260

ggcatcaata tcggatttga cctcgtcaaa gaactcggta tcgctgcaaa cgcaatggaa 1320

gctctatgcg accagaaaga cgaaatggaa atgatcgctc gtgaatacct gactgtatcc 1380

agaaatgctt tcttcatcgg acgcggcctt gactacttcg tatgtgtcga aggcgcactg 1440

aagctgaaag agatttctta catccaggca gaaggttttg ccggcggtga gctaaagcac 1500

ggaacgattg ccttgatcga acaaggaaca ccagtattcg cactggcaac tcaagagcat 1560

gtaaacctaa gcatccgcgg aaacgtcaaa gaagttgctg ctcgcggagc aaacacatgc 1620

atcatctcac tgaaaggcct agacgatgcg gatgacagat tcgtattgcc ggaagtaaac 1680

ccagcgcttg ctccgttggt atctgttgtt ccattgcagc tgatcgctta ctatgctgca 1740

ctgcatcgcg gctgtgatgt ggataaacct cgtaaccttg cgaagagtgt tactgtggag 1800

taa 1803

<210> 2

<211> 600

<212> PRT

<213> BsGlmS蛋白(BsGlmS)

<400> 2

Met Cys Gly Ile Val Gly Tyr Ile Gly Gln Leu Asp Ala Lys Glu Ile

1 5 10 15

Leu Leu Lys Gly Leu Glu Lys Leu Glu Tyr Arg Gly Tyr Asp Ser Ala

20 25 30

Gly Ile Ala Val Ala Asn Glu Gln Gly Ile His Val Phe Lys Glu Lys

35 40 45

Gly Arg Ile Ala Asp Leu Arg Glu Val Val Asp Ala Asn Val Glu Ala

50 55 60

Lys Ala Gly Ile Gly His Thr Arg Trp Ala Thr His Gly Glu Pro Ser

65 70 75 80

Tyr Leu Asn Ala His Pro His Gln Ser Ala Leu Gly Arg Phe Thr Leu

85 90 95

Val His Asn Gly Val Ile Glu Asn Tyr Val Gln Leu Lys Gln Glu Tyr

100 105 110

Leu Gln Asp Val Glu Leu Lys Ser Asp Thr Asp Thr Glu Val Val Val

115 120 125

Gln Val Ile Glu Gln Phe Val Asn Gly Gly Leu Glu Thr Glu Glu Ala

130 135 140

Phe Arg Lys Thr Leu Thr Leu Leu Lys Gly Ser Tyr Ala Ile Ala Leu

145 150 155 160

Phe Asp Asn Asp Asn Arg Glu Thr Ile Phe Val Ala Lys Asn Lys Ser

165 170 175

Pro Leu Leu Val Gly Leu Gly Asp Thr Phe Asn Val Val Ala Ser Asp

180 185 190

Ala Met Ala Met Leu Gln Val Thr Asn Glu Tyr Val Glu Leu Met Asp

195 200 205

Lys Glu Met Val Ile Val Thr Asp Asp Gln Val Val Ile Lys Asn Leu

210 215 220

Asp Gly Asp Val Ile Thr Arg Ala Ser Tyr Ile Ala Glu Leu Asp Ala

225 230 235 240

Ser Asp Ile Glu Lys Gly Thr Tyr Pro His Tyr Met Leu Lys Glu Thr

245 250 255

Asp Glu Gln Pro Val Val Met Arg Lys Ile Ile Gln Thr Tyr Gln Asp

260 265 270

Glu Asn Gly Lys Leu Ser Val Pro Gly Asp Ile Ala Ala Ala Val Ala

275 280 285

Glu Ala Asp Arg Ile Tyr Ile Ile Gly Cys Gly Thr Ser Tyr His Ala

290 295 300

Gly Leu Val Gly Lys Gln Tyr Ile Glu Met Trp Ala Asn Val Pro Val

305 310 315 320

Glu Val His Val Ala Ser Glu Phe Ser Tyr Asn Met Pro Leu Leu Ser

325 330 335

Lys Lys Pro Leu Phe Ile Phe Leu Ser Gln Ser Gly Glu Thr Ala Asp

340 345 350

Ser Arg Ala Val Leu Val Gln Val Lys Ala Leu Gly His Lys Ala Leu

355 360 365

Thr Ile Thr Asn Val Pro Gly Ser Thr Leu Ser Arg Glu Ala Asp Tyr

370 375 380

Thr Leu Leu Leu His Ala Gly Pro Glu Ile Ala Val Ala Ser Thr Lys

385 390 395 400

Ala Tyr Thr Ala Gln Ile Ala Val Leu Ala Val Leu Ala Ser Val Ala

405 410 415

Ala Asp Lys Asn Gly Ile Asn Ile Gly Phe Asp Leu Val Lys Glu Leu

420 425 430

Gly Ile Ala Ala Asn Ala Met Glu Ala Leu Cys Asp Gln Lys Asp Glu

435 440 445

Met Glu Met Ile Ala Arg Glu Tyr Leu Thr Val Ser Arg Asn Ala Phe

450 455 460

Phe Ile Gly Arg Gly Leu Asp Tyr Phe Val Cys Val Glu Gly Ala Leu

465 470 475 480

Lys Leu Lys Glu Ile Ser Tyr Ile Gln Ala Glu Gly Phe Ala Gly Gly

485 490 495

Glu Leu Lys His Gly Thr Ile Ala Leu Ile Glu Gln Gly Thr Pro Val

500 505 510

Phe Ala Leu Ala Thr Gln Glu His Val Asn Leu Ser Ile Arg Gly Asn

515 520 525

Val Lys Glu Val Ala Ala Arg Gly Ala Asn Thr Cys Ile Ile Ser Leu

530 535 540

Lys Gly Leu Asp Asp Ala Asp Asp Arg Phe Val Leu Pro Glu Val Asn

545 550 555 560

Pro Ala Leu Ala Pro Leu Val Ser Val Val Pro Leu Gln Leu Ile Ala

565 570 575

Tyr Tyr Ala Ala Leu His Arg Gly Cys Asp Val Asp Lys Pro Arg Asn

580 585 590

Leu Ala Lys Ser Val Thr Val Glu

595 600

<210> 3

<211> 480

<212> DNA

<213> GNA1基因(GNA1)

<400> 3

atgagcttac ccgatggatt ttatataagg cgaatggaag agggggattt ggaacaggtc 60

actgagacgc taaaggtttt gaccaccgtg ggcactatta cccccgaatc cttcagcaaa 120

ctcataaaat actggaatga agccacagta tggaatgata acgaagataa aaaaataatg 180

caatataacc ccatggtgat tgtggacaag cgcaccgaga cggttgccgc tacggggaat 240

atcatcatcg aaagaaagat cattcatgaa ctggggctat gtggccacat cgaggacatt 300

gcagtaaact ccaagtatca gggccaaggt ttgggcaagc tcttgattga tcaattggta 360

actatcggct ttgactacgg ttgttataag attattttag attgcgatga gaaaaatgtc 420

aaattctatg aaaaatgtgg gtttagcaac gcaggcgtgg aaatgcaaat tagaaaatag 480

<210> 4

<211> 159

<212> PRT

<213> GNA1蛋白(GNA1)

<400> 4

Met Ser Leu Pro Asp Gly Phe Tyr Ile Arg Arg Met Glu Glu Gly Asp

1 5 10 15

Leu Glu Gln Val Thr Glu Thr Leu Lys Val Leu Thr Thr Val Gly Thr

20 25 30

Ile Thr Pro Glu Ser Phe Ser Lys Leu Ile Lys Tyr Trp Asn Glu Ala

35 40 45

Thr Val Trp Asn Asp Asn Glu Asp Lys Lys Ile Met Gln Tyr Asn Pro

50 55 60

Met Val Ile Val Asp Lys Arg Thr Glu Thr Val Ala Ala Thr Gly Asn

65 70 75 80

Ile Ile Ile Glu Arg Lys Ile Ile His Glu Leu Gly Leu Cys Gly His

85 90 95

Ile Glu Asp Ile Ala Val Asn Ser Lys Tyr Gln Gly Gln Gly Leu Gly

100 105 110

Lys Leu Leu Ile Asp Gln Leu Val Thr Ile Gly Phe Asp Tyr Gly Cys

115 120 125

Tyr Lys Ile Ile Leu Asp Cys Asp Glu Lys Asn Val Lys Phe Tyr Glu

130 135 140

Lys Cys Gly Phe Ser Asn Ala Gly Val Glu Met Gln Ile Arg Lys

145 150 155

Claims

1.一种双基因缺陷型工程菌，其特征在于，所述双基因缺陷型工程菌含有BsGlmS基因和GAN1基因，并通过敲除宿主菌的endA1基因和nagK1基因获得。

2.根据权利要求1所述的双基因缺陷型工程菌，其特征在于，所述宿主菌为大肠杆菌。

3.根据权利要求1所述的双基因缺陷型工程菌，其特征在于，所述BsGlmS基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述编码BsGlmS基因的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述GAN1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述编码GAN1基因的氨基酸序列如SEQ IDNo.4所示。

4.权利要求1-3任一项所述的双基因缺陷型工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）含有BsGlmS基因和GAN1基因的重组表达载体的构建；

2）endA1基因缺失型的MG∆endA1菌株的构建：通过同源重组的方法将大肠杆菌的endA1基因敲除得到MG∆endA1菌株；

3）MG∆endA1∆nagK1菌株的构建：通过同源重组的方法将步骤2）得到的MG∆endA1菌株的nagK1基因敲除得到MG∆endA1∆nagK1菌株；

4）将步骤1）构建得到的表达载体转化到步骤3）得到的MG∆endA1∆nagK1菌株中得到endA1和 nagK1双基因缺陷型工程菌。

5.根据权利要求4所述的双基因缺陷型工程菌的构建方法，其特征在于，步骤1）中所述重组表达载体为pTrc99A系列表达载体、pSTV28系列表达载体、pET21系列表达载体或pBR322系列载体中的一种或几种。

6.根据权利要求4所述的双基因缺陷型工程菌的构建方法，其特征在于，步骤2）的具体步骤为：

2.1）以pKD13质粒为模板，将敲除目标基因endA1的引物对进行聚合酶链式反应，扩增得到线性同源重组片段；

2.2）以大肠杆菌为出发菌株，将携带Red重组酶的pKD46质粒转入大肠杆菌中，在含氨卞霉素平板培养基上筛选得到转化子；将转化子接入有Amp抗性的LB培养基，并加入诱导剂，制备MG1655/pKD46感受态；

2.3）将步骤2.1）得到的线性同源重组片段电转化进入MG1655/pKD46感受态细胞，倒置培养，挑选转化子，得到带有卡那霉素抗性基因的标记MG∆endA1菌株。

7.权利要求1~3任一项所述的双基因缺陷型工程菌在生产N-乙酰氨基葡萄糖中的应用。

8.一种产乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1）种子培养：将单菌落菌种接种至种子培养基中培养得到种子液；

2）发酵培养：将种子液接种发酵培养基，不额外添加诱导剂，直接利用宿主菌渗漏表达进行代谢通路的基因表达。

9.根据权利要求8所述的产乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于，步骤2）中，所述在发酵过程中通入空气，所述发酵温度为25-38℃，所述发酵体系的pH值为6.5-7.5。

10.根据权利要求8所述的产乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于，步骤2）中所述发酵培养基中的碳源为甘油、葡萄糖和淀粉中的一种或几种；所述发酵培养基中的氮源为酵母粉和蛋白胨。