CN114196609A - 从乳酸合成纯聚乳酸的大肠杆菌工程菌及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了从乳酸合成纯聚乳酸的大肠杆菌工程菌及其制备方法和应用，大肠杆菌工程菌构建了由丙酰辅酶A转移酶突变体基因和聚羟基脂肪酸酯合成酶突变体基因融合表达构成的聚乳酸合成途径而获得。本发明并能够实现在生物体内以乙酰辅酶A为起始代谢物向聚乳酸的转化。本发明提供的突变体菌株内表达本发明提供的编码组成聚乳酸合成代谢途径中所有的酶的基因获得。本发明所构建的重组大肠杆菌菌株在兼性厌氧的条件下可利用含葡萄糖或甘油的丰富培养基为原料合成16％细胞干重。

Description

从乳酸合成纯聚乳酸的大肠杆菌工程菌及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及从乳酸合成纯聚乳酸大肠杆菌工程菌及其制备方法和应用。

背景技术

聚乳酸(PLA)为一种聚合物。在传统工业中主要用于医药、纤维制品、可降解塑料、农业生产等领域。聚乳酸作为一种由植物作为原料经过微生物发酵以及化学合成所生产的新型可降解材料，具有良好的机械性能和优良的物理性能，可以以简单的加工方式，如吹塑、热塑使其成为各种各样的塑料制品。随着当今社会日益增长的环保需求，其在替代传统塑料应用方面有着卓越的前景。

目前聚乳酸的生产主要是基于乳酸为原料通过熔融聚合或直接缩聚的化工路线。化学合成法工艺常需高温高压并且需要化学催化剂，具有高能耗高物耗和化学残留的问题，合成成本和环境损害极高。

近年来，现有技术通过对聚羟基脂肪酸合成的研究，找到了对乳酸有特异活性的合成酶，该途径起始于乙酰辅酶A，经过乳酰辅酶A合成聚乳酸。首先，一分子的乙酰辅酶A和一分子D-乳酸在丙酰辅酶A转移酶(Pct)的催化下生成一分子D-乳酰辅酶A和一分子醋酸盐。之后，生成的乳酰辅酶A在PhaC合成酶(PhaC)的作用下聚合产生聚乳酸。该途径已被构建于用于合成3-羟基丁酸和乳酸的聚合物p(3HB-co-LA)。但Pha合成酶对于乳酸的特异性低，导致聚乳酸的产量和分子量很低。此外，该途径只能合成R构型的短羟基辅酶A((R)-HA-CoA)，即只能合成右旋聚乳酸(PDLA)，人体内分解出的D-乳酸无法被代谢而产生毒性，因此限制了应用方向。

发明内容

发明目的：本发明提供一种从乳酸合成纯聚乳酸的大肠杆菌工程菌。

本发明的另一目的是提供所述从乳酸合成纯聚乳酸的大肠杆菌工程菌的制备方法及应用。

本发明的环境友好型可再生的聚乳酸合成途径，引入大肠杆菌，通过丙酰辅酶A转移酶突变体基因和聚羟基脂肪酸酯合成酶突变体基因融合表达构成聚乳酸合成途径在胞内合成聚乳酸来达到可再生塑料的目的。

技术方案：本发明的从乳酸合成纯聚乳酸的大肠杆菌工程菌，所述大肠杆菌工程菌构建了由丙酰辅酶A转移酶基因和聚羟基脂肪酸酯合成酶基因融合表达构成的聚乳酸合成途径。

其中，所述编码丙酰辅酶A转移酶的基因为来自丙酸梭菌Clostridiumpropionicum的突变体，编码聚羟基脂肪酸酯合成酶的基因为来自食树脂假单孢菌Pseudomonas resinovorans的突变体。

其中，所述的融合基因，其特征在于，所述的融合蛋白由Pct(AEF)、一个连接短肽(L)和PhaC(DDDTSGK)组合而成，由Pct(AEF)-L-PhaC(DDDTSGK)或PhaC(DDDTSGK)-L-Pct(AEF)表示。

其中，本发明所述大肠杆菌工程菌通过敲除宿主大肠杆菌的醇醛脱氢酶的编码基因adhE获得。

其中，本发明所述宿主大肠杆菌包括Escherichia coli BL21、MG1655、JM109、DH5α、TOP10、HB101、DH10B或野生型大肠杆菌。

其中，本发明所述聚乳酸合成途径中编码该途径中所有基因的载体为pTrc99A系列表达载体、pSTV28系列表达载体、pET21系列表达载体或pBR322系列载体中的一种或几种。

本发明所述的聚乳酸合成途径的起始代谢物为乙酰辅酶A和乳酸。乙酰辅酶A和乳酸首先在融合蛋白中的丙酰辅酶A转移酶活性域作用下生成乳酰辅酶A；随后乳酰辅酶A在融合蛋白中的PhaC合成酶活性域的催化下生成聚乳酸(图1)。

由于醇醛脱氢酶的编码基因为adhE。使得乙酰辅酶A更倾向于向乙醇转化，不利于代谢产物聚乳酸的合成，本发明所述的聚乳酸合成涉及敲除宿主细菌基因组上的adhE基因。

本发明内容还包括所述的一种从乳酸合成纯聚乳酸大肠杆菌在生产化合物中的应用。其中，所述化合物包括p(3HB-co-LA)和聚乳酸，其中，聚乳酸为本发明的目标产物。

本发明包括一种生产聚乳酸的方法，将所述的大肠杆菌工程菌得到聚乳酸的步骤，具体地，将大肠杆菌工程菌株MG1655ΔadhE：pT-PhaC(DDDTSGK)-L-Pct(AEF)接种到发酵培养基中培养，在发酵过程中不通入空气，消耗甘油、葡萄糖或其它碳源，生产聚乳酸。其中：所述发酵温度为25-38℃；所述发酵体系的pH值为3.4-7.0；发酵培养基中的碳源为甘油、葡萄糖和淀粉中的一种或几种；发酵培养基中的氮源为酵母粉、蛋白胨、氨水、铵盐和尿素中的一种或几种。

有益效果：本发明与现有技术相比，具有如下优势：本发明提供的基因工程菌以大肠杆菌为出发菌株，导入由丙酰辅酶A转移酶突变体基因和聚羟基脂肪酸酯合成酶突变体基因的融合表达子，并敲除其基因组醇醛脱氢酶的编码基因adhE获得。本发明所构建的重组大肠杆菌菌株在兼性厌氧的条件下可利用含葡萄糖或甘油的丰富培养基为原料合成约占菌体干重16％的聚乳酸。

附图说明

图1为本发明中聚乳酸合成代谢途径；

图2为本发明中pT-PhaC(DDDTSGK)-L-Pct(AEF)的质粒图谱；

图3为本发明中大肠杆菌工程菌MG1655ΔadhE：：pT-PhaC(DDDTSGK)-L-Pct(AEF)产聚乳酸的时间曲线图。

具体实施方式

实施例1：融合基因PhaC(DDDTSGK)-L-Pct(AEF)的获得

编码丙酰辅酶A转移酶的基因为来自丙酸梭菌Clostridium propionicum的突变体，编码聚羟基脂肪酸酯合成酶的基因为来自食树脂假单孢菌Pseudomonas resinovorans的突变体。将来自于丙酸梭菌Clostridium propionicum的野生型丙酰辅酶A转移酶基因Pct(GenBank：CAB77207.1)进行重新设计，替换其编码的第193、345和366个氨基酸，分别为V193A、D345E、Y366F，由Pct(AEF)表示；来自于食树脂假单胞菌Pseudomonas resinovorans的野生型聚羟基脂肪酸酯合成酶基因(PhaC)(GenBank：NC_021499.1)进行重新设计，替换其编码的第116、130、272、325、454、477和481个氨基酸，分别为Q116D、E130D、Q272D、S325T、T454S、S477G、Q481K，由PhaC(DDDTSGK)表示；连接两个蛋白的短肽(L)为由甘氨酸和色氨酸组成的短肽GGGGSGGGGS；融合基因PhaC(DDDTSGK)-L-Pct(AEF)经过密码子优化、添加核糖体结合位点序列，并在两端分别加入了EcoRI和SacI酶切位点，之后由生工生物工程(上海)股份有限公司通过化学合成方法获，得具体核酸信息和氨基酸信息分别见SEQ ID No.2和SEQ ID No.4；

实施例2：表达载体pT-PhaC(DDDTSGK)-L-Pct(AEF)的构建

将聚乳酸合成代谢途径相关基因构建于表达载体上，如pTrc99A载体。采用质粒提取试剂盒(购自杭州倍沃医学科技有限公司)提取质粒pTrc99A，用构建时对应的限制性内切酶EcoR I/Sac I进行双酶切质粒和PhaC(DDDTSGK)-L-Pct(AEF)片段；琼脂糖电泳回收酶切产物，通过DNA连接酶将酶切后的基因片段于16℃连接于pTrc99A的对应酶切产物。用每次的连接反应产物转化大肠杆菌DH5α，然后涂于含100μg/mL Amp(氨苄青霉素)的培养皿，37℃培养10-12h。次日挑取单菌落采用上海生工质粒小量提取试剂盒提取质粒。获得的质粒双酶切验证并对获得的重组质粒进行测序。测序结果显示最终的表达载体pT-PhaC(DDDTSGK)-L-Pct(AEF)构建完全正确。本发明中pT-PhaC(DDDTSGK)-L-Pct(AEF)的质粒图谱参见图3。

实施例3醇醛脱氢酶基因缺失突变体菌株的构建

本发明产聚乳酸大肠杆菌工程菌所用的宿主大肠杆菌为醇醛脱氢酶基因缺失突变体菌株。宿主大肠杆菌可以为Escherichia coliBL21、MG1655、JM109、DH5α、TOP10、HB101、DH10B或野生型大肠杆菌。基因组上缺失醇醛脱氢酶的编码基因为adhE。本例中使用的原始宿主菌为野生型大肠杆菌MG1655，并通过同源重组的方法将醇醛脱氢酶的编码基因adhE其基因组上敲除，该突变体菌株命名为MG1655ΔadhE。具体操作方法如下：

以pKD13质粒(购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心)为模板，敲除目标基因adhE的引物EcadhE KO-F(5’-CGAGCAGATGATTTACTAAAAAAGTTTAACATTATCAGGAGAGCATTATGATTCCGGGGATCCGTCGAC-3’)和EcadhE KO-R(5’-CCGTTTATGTTGCCAGACAGCGCTACTGATTAAGCGGATTTTTTCGCTTTTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’)进行聚合酶链式反应，扩增得到中间为卡那抗性基因和FRT标记、两侧为adhE短同源臂的线性同源重组片段。

以MG1655为出发菌株，将携带Red重组酶的pKD46质粒转入细胞中，在含氨卞霉素平板培养基上筛选得到转化子；将转化子接入有Amp抗性的LB培养基，并加入终浓度为1mmol/L的IPTG作为诱导剂，30℃培养至OD₆₀₀＝0.6时收集菌体制备电转感受态。将PCR获得的线性同源重组片段电转化进入MG1655/pKD46感受态细胞，30℃倒置培养20小时，挑选转化子，得到带有卡那霉素抗性基因的标记MG1655ΔadhE(FRTKm)菌株。采用42℃热激偶合抗生素抗性负筛选的策略，将替换突变的大肠杆菌中的pKD46质粒丢失。

将辅助质粒pCP20(购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心)转化入MGl655ΔadhE (FRTKm)中表达FLP重组酶用于卡那抗性基因的缺失突变，采用42℃热激偶合抗生素抗性负筛选的策略，将缺失突变的大肠杆菌中的pCP20质粒丢失，最终获得MG1655ΔadhE菌株。

实施例4：聚乳酸合成菌株的构建及发酵

将实施例2中pT-PhaC(DDDTSGK)-L-Pct(AEF)质粒电转化到实施例3中的基因敲除大肠杆菌MG1655ΔadhE中，得到大肠杆菌工程菌株MG1655ΔadhE：pT-PhaC(DDDTSGK)-L-Pct(AEF)。将上述单菌落接种到含有100μg/mL氨卞霉素的5mL的LB试管培养基中37℃培养8小时，以1％(v/v)的接种量接种到含有100μg/mL氨卞霉素的1000ml的发酵培养基中。

发酵培养基配方(1L)：将20g甘油、10g蛋白胨、5g酵母粉及10g氯化钠溶解于800ml定容到980ml，121℃20min灭菌后，于超净台内加入0.5mol/L预先用0.22μm滤膜过滤的泛酸钙溶液。

在30℃，250rpm摇床中将接种后的大肠杆菌工程菌MG1655ΔadhE：pT-PhaC(DDDTSGK)-L-Pct(AEF)培养物发酵至OD₆₀₀为0.4-0.6时加入终浓度为0.1mM的异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂，并加入终浓度为0.2％的乳酸(每隔12h添加一次)。每培养12小时取一次样，用于分光光度法检测细菌生长浓度及液相色谱法检测聚乳酸产量。将细菌生长浓度及聚乳酸的液相色谱检测结果与取样时间点作曲线图(图3)。菌株培养到36小时后细菌生长及聚乳酸产量趋于平台期，48小时后细菌生长浓度为OD₆₀₀＝8，聚乳酸产量达到细胞干重的16％。

实施例5：聚乳酸的合成检测

利用液相色谱检测最终发酵代谢产物。将实施例4制备得到的待测发酵样品8000rpm离心10min后，取10ml上清液于新的EP管保存于-20℃冰箱备用，倒去上清液，收集菌体烘干至恒重，称量记录细胞干重，使用索氏提取器加入氯仿于100℃提取，在回流管回流20次后收集溶液，加入20倍体积的冷甲醇沉淀产物，使用0.22μm孔径的PTFE滤膜过滤，收集产物烘干至恒重，称量产物重量，取0.01-500mg的产物加入1ml浓硫酸90℃消化30min，在冰上冷却后加入4毫升体积的0.014当量浓度的硫酸快速混合，再使用0.014当量浓度的硫酸稀释5-100倍后，使用0.45μm孔径的PTFE滤膜过滤，最后进行液相色谱测定。检测仪器为Agilent 1260液相色谱仪、BIO-RAD公司的Ami nex HPX-87H色谱柱。

序列表

<110> 淮阴工学院

<120> 从乳酸合成纯聚乳酸的大肠杆菌工程菌及其制备方法和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3308

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaattcagga ggtaataaat atgcgcaaag tgccgattat taccgccgat gaagcagcca 60

agctgattaa ggatggcgat accgttacca ccagtggctt tgttggcaat gcaattccgg 120

aagcactgga tcgtgccgtt gaaaaacgtt ttctggaaac cggcgaaccg aaaaatatta 180

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atgaaggtct gctgaaacgc tatattgccg gtcattgggc aaccgttccg gccctgggca 300

aaatggccat ggaaaataag atggaagcat ataatgtgag ccagggtgcc ctgtgccatc 360

tgtttcgtga tattgccagt cataaaccgg gtgtttttac caaagtgggt attggtacct 420

ttattgatcc gcgcaatggc ggtggcaaag ttaatgatat taccaaagaa gatatcgtgg 480

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ccctgattcg cggtacctat gccgatgaaa gtggtaatat tacctttgaa aaggaagcag 600

ccccgctgga aggcaccagc gtgtgccagg ccgtgaaaaa tagcggtggc attgtggttg 660

tgcaggttga acgtgttgtt aaagccggta ccctggatcc gcgccatgtt aaagtgccgg 720

gtatctatgt ggattatgtt gttgttgccg atccggaaga tcatcagcag agtctggatt 780

gcgaatatga tccggccctg agtggcgaac atcgtcgtcc ggaagttgtt ggtgaaccgc 840

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gcggtgttcg ctttggtgcc agttataatg cagaagcact gattgatcag ggctatcagt 1080

ttgattatta tgatggcggc ggtctggatc tgtgttttct gggcctggcc gaatgcgatg 1140

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aggttaccta tattaccgaa cgctgtgtgt ttctgctgaa agaagatggt ctgcatctga 1440

gtgaaattgc accgggcatt gatctgcaga cccagattct ggatgtgatg gattttgcac 1500

cgattattga tcgtgatgca aatggtcaga ttaagctgat ggatgccgcc ctgtttgcgg 1560

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gtatgagtaa caagaacaac gaagatctgc agcatcaggc aagtgataat accctgaatc 1680

tgaatccggt tattggtatt cgtggcaaag atctgctgag tagcgcacgc atggtgctgc 1740

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gtggtcattt tgtgattaat ctgatgaccg atgcaatggc cccgaccaat agtatggcca 2040

atccggccgc agttaaacgt ttctttgaaa ccggcggcaa aagtctgctg gatggcctga 2100

gccatctggc caaagatatg gttaataatg gtggtatgcc gagtcaggtg aatatggatg 2160

catttgaagt gggccagaat gttgccacca ccgaaggcgc agtggtgtat cgcaatgatg 2220

ttctggaact gattcagtat aaaccgatta ccgaaagcgt gcatgaacgt ccgctgctgg 2280

ttgttccgcc gcagattaat aagttttatg tgtttgatct gagcccggaa aaaagtctgg 2340

cccgcttttg cctgcgcaat ggcctgcaga cctttattat tagttggcgt aatccgacca 2400

aagcacagcg tgaatggggt ctgagtacct atattgacgc cctgaaagat accattgatg 2460

tggttctgaa aattaccggc agcaaagatc tgaatatgct gggcgcctgt agcggtggta 2520

ttaccaccgt ggcactgctg ggccattatc aggcaattgg tgaaaataag gttaatgcct 2580

ttacccagat ggtgaccgtt ctggatttta atctggatac ccaggttgcc ctgtttgccg 2640

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aagatatggc caaagtgttt gcctggatgc gtccgaatga tctgatttgg aattattggg 2760

tgaataatta cctgctgggc aatgaaccgc cggcctttga tattctgtat tggaataatg 2820

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cctgcgattt ttattgtctg gccggtacca gcgatcatat tagcccgtgg gaagcctgct 3000

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aagagctc 3308

<210> 2

<211> 3308

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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tctgcggcac ctttaccgca ggtggcctga aagtgaaaat tgaagatggt aaagtgatca 3000

ttgtgcagga aggcaaacag aaaaaatttc tgaaagccgt tgaacagatt acctttaatg 3060

gtgacgttgc cctggccaat aagcagcagg ttacctatat taccgaacgc tgtgtgtttc 3120

tgctgaaaga agatggtctg catctgagtg aaattgcacc gggcattgat ctgcagaccc 3180

agattctgga tgtgatggat tttgcaccga ttattgatcg tgatgcaaat ggtcagatta 3240

agctgatgga tgccgccctg tttgcggaag gtctgatggg tctgaaagaa atgaaaagtt 3300

aagagctc 3308

<210> 3

<211> 1093

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Arg Lys Val Pro Ile Ile Thr Ala Asp Glu Ala Ala Lys Leu Ile

1 5 10 15

Lys Asp Gly Asp Thr Val Thr Thr Ser Gly Phe Val Gly Asn Ala Ile

20 25 30

Pro Glu Ala Leu Asp Arg Ala Val Glu Lys Arg Phe Leu Glu Thr Gly

35 40 45

Glu Pro Lys Asn Ile Thr Tyr Val Tyr Cys Gly Ser Gln Gly Asn Arg

50 55 60

Asp Gly Arg Gly Ala Glu His Phe Ala His Glu Gly Leu Leu Lys Arg

65 70 75 80

Tyr Ile Ala Gly His Trp Ala Thr Val Pro Ala Leu Gly Lys Met Ala

85 90 95

Met Glu Asn Lys Met Glu Ala Tyr Asn Val Ser Gln Gly Ala Leu Cys

100 105 110

His Leu Phe Arg Asp Ile Ala Ser His Lys Pro Gly Val Phe Thr Lys

115 120 125

Val Gly Ile Gly Thr Phe Ile Asp Pro Arg Asn Gly Gly Gly Lys Val

130 135 140

Asn Asp Ile Thr Lys Glu Asp Ile Val Glu Leu Val Glu Ile Lys Gly

145 150 155 160

Gln Glu Tyr Leu Phe Tyr Pro Ala Phe Pro Ile His Val Ala Leu Ile

165 170 175

Arg Gly Thr Tyr Ala Asp Glu Ser Gly Asn Ile Thr Phe Glu Lys Glu

180 185 190

Ala Ala Pro Leu Glu Gly Thr Ser Val Cys Gln Ala Val Lys Asn Ser

195 200 205

Gly Gly Ile Val Val Val Gln Val Glu Arg Val Val Lys Ala Gly Thr

210 215 220

Leu Asp Pro Arg His Val Lys Val Pro Gly Ile Tyr Val Asp Tyr Val

225 230 235 240

Val Val Ala Asp Pro Glu Asp His Gln Gln Ser Leu Asp Cys Glu Tyr

245 250 255

Asp Pro Ala Leu Ser Gly Glu His Arg Arg Pro Glu Val Val Gly Glu

260 265 270

Pro Leu Pro Leu Ser Ala Lys Lys Val Ile Gly Arg Arg Gly Ala Ile

275 280 285

Glu Leu Glu Lys Asp Val Ala Val Asn Leu Gly Val Gly Ala Pro Glu

290 295 300

Tyr Val Ala Ser Val Ala Asp Glu Glu Gly Ile Val Asp Phe Met Thr

305 310 315 320

Leu Thr Ala Glu Ser Gly Ala Ile Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val

325 330 335

Arg Phe Gly Ala Ser Tyr Asn Ala Glu Ala Leu Ile Asp Gln Gly Tyr

340 345 350

Gln Phe Asp Tyr Tyr Asp Gly Gly Gly Leu Asp Leu Cys Phe Leu Gly

355 360 365

Leu Ala Glu Cys Asp Glu Lys Gly Asn Ile Asn Val Ser Arg Phe Gly

370 375 380

Pro Arg Ile Ala Gly Cys Gly Gly Phe Ile Asn Ile Thr Gln Asn Thr

385 390 395 400

Pro Lys Val Phe Phe Cys Gly Thr Phe Thr Ala Gly Gly Leu Lys Val

405 410 415

Lys Ile Glu Asp Gly Lys Val Ile Ile Val Gln Glu Gly Lys Gln Lys

420 425 430

Lys Phe Leu Lys Ala Val Glu Gln Ile Thr Phe Asn Gly Asp Val Ala

435 440 445

Leu Ala Asn Lys Gln Gln Val Thr Tyr Ile Thr Glu Arg Cys Val Phe

450 455 460

Leu Leu Lys Glu Asp Gly Leu His Leu Ser Glu Ile Ala Pro Gly Ile

465 470 475 480

Asp Leu Gln Thr Gln Ile Leu Asp Val Met Asp Phe Ala Pro Ile Ile

485 490 495

Asp Arg Asp Ala Asn Gly Gln Ile Lys Leu Met Asp Ala Ala Leu Phe

500 505 510

Ala Glu Gly Leu Met Gly Leu Lys Glu Met Lys Ser Gly Gly Gly Gly

515 520 525

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ser Asn Lys Asn Asn Glu Asp Leu Gln

530 535 540

His Gln Ala Ser Asp Asn Thr Leu Asn Leu Asn Pro Val Ile Gly Ile

545 550 555 560

Arg Gly Lys Asp Leu Leu Ser Ser Ala Arg Met Val Leu Leu Gln Ala

565 570 575

Ile Lys Gln Pro Phe His Ser Ala Lys His Val Ala His Phe Gly Leu

580 585 590

Glu Leu Lys Asn Val Leu Leu Gly Gln Ser Gly Leu His Pro Glu Ala

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Asp Asp Arg Arg Phe Asn Asp Pro Ala Trp Ser Gln Asn Pro Leu Tyr

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Arg Arg Tyr Leu Gln Thr Tyr Leu Ala Trp Arg Lys Glu Leu His Ser

625 630 635 640

Trp Ile Ser Glu Ser Asn Leu Ser Ser Asp Asp Ala Ser Arg Gly His

645 650 655

Phe Val Ile Asn Leu Met Thr Asp Ala Met Ala Pro Thr Asn Ser Met

660 665 670

Ala Asn Pro Ala Ala Val Lys Arg Phe Phe Glu Thr Gly Gly Lys Ser

675 680 685

Leu Leu Asp Gly Leu Ser His Leu Ala Lys Asp Met Val Asn Asn Gly

690 695 700

Gly Met Pro Ser Gln Val Asn Met Asp Ala Phe Glu Val Gly Gln Asn

705 710 715 720

Val Ala Thr Thr Glu Gly Ala Val Val Tyr Arg Asn Asp Val Leu Glu

725 730 735

Leu Ile Gln Tyr Lys Pro Ile Thr Glu Ser Val His Glu Arg Pro Leu

740 745 750

Leu Val Val Pro Pro Gln Ile Asn Lys Phe Tyr Val Phe Asp Leu Ser

755 760 765

Pro Glu Lys Ser Leu Ala Arg Phe Cys Leu Arg Asn Gly Leu Gln Thr

770 775 780

Phe Ile Ile Ser Trp Arg Asn Pro Thr Lys Ala Gln Arg Glu Trp Gly

785 790 795 800

Leu Ser Thr Tyr Ile Asp Ala Leu Lys Asp Thr Ile Asp Val Val Leu

805 810 815

Lys Ile Thr Gly Ser Lys Asp Leu Asn Met Leu Gly Ala Cys Ser Gly

820 825 830

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835 840 845

Asn Lys Val Asn Ala Phe Thr Gln Met Val Thr Val Leu Asp Phe Asn

850 855 860

Leu Asp Thr Gln Val Ala Leu Phe Ala Asp Glu Gln Thr Leu Glu Ala

865 870 875 880

Ala Lys Arg Arg Ser Tyr Gln Ala Gly Val Leu Glu Gly Lys Asp Met

885 890 895

Ala Lys Val Phe Ala Trp Met Arg Pro Asn Asp Leu Ile Trp Asn Tyr

900 905 910

Trp Val Asn Asn Tyr Leu Leu Gly Asn Glu Pro Pro Ala Phe Asp Ile

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930 935 940

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980 985 990

Cys Tyr Arg Ser Ala Arg Leu Leu Gly Gly Lys Cys Glu Phe Val Leu

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Gln Gln Trp Ile Gly Glu Arg Ser Gly Lys Thr Lys Lys Ala Asn Phe

1060 1065 1070

Thr Leu Gly Asn Lys Ala Phe Pro Ala Gly Glu Ala Ala Pro Gly Thr

1075 1080 1085

Tyr Val His Glu Arg

1090

<210> 4

<211> 1093

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Ser Asn Lys Asn Asn Glu Asp Leu Gln His Gln Ala Ser Asp Asn

1 5 10 15

Thr Leu Asn Leu Asn Pro Val Ile Gly Ile Arg Gly Lys Asp Leu Leu

20 25 30

Ser Ser Ala Arg Met Val Leu Leu Gln Ala Ile Lys Gln Pro Phe His

35 40 45

Ser Ala Lys His Val Ala His Phe Gly Leu Glu Leu Lys Asn Val Leu

50 55 60

Leu Gly Gln Ser Gly Leu His Pro Glu Ala Asp Asp Arg Arg Phe Asn

65 70 75 80

Asp Pro Ala Trp Ser Gln Asn Pro Leu Tyr Arg Arg Tyr Leu Gln Thr

85 90 95

Tyr Leu Ala Trp Arg Lys Glu Leu His Ser Trp Ile Ser Glu Ser Asn

100 105 110

Leu Ser Ser Asp Asp Ala Ser Arg Gly His Phe Val Ile Asn Leu Met

115 120 125

Thr Asp Ala Met Ala Pro Thr Asn Ser Met Ala Asn Pro Ala Ala Val

130 135 140

Lys Arg Phe Phe Glu Thr Gly Gly Lys Ser Leu Leu Asp Gly Leu Ser

145 150 155 160

His Leu Ala Lys Asp Met Val Asn Asn Gly Gly Met Pro Ser Gln Val

165 170 175

Asn Met Asp Ala Phe Glu Val Gly Gln Asn Val Ala Thr Thr Glu Gly

180 185 190

Ala Val Val Tyr Arg Asn Asp Val Leu Glu Leu Ile Gln Tyr Lys Pro

195 200 205

Ile Thr Glu Ser Val His Glu Arg Pro Leu Leu Val Val Pro Pro Gln

210 215 220

Ile Asn Lys Phe Tyr Val Phe Asp Leu Ser Pro Glu Lys Ser Leu Ala

225 230 235 240

Arg Phe Cys Leu Arg Asn Gly Leu Gln Thr Phe Ile Ile Ser Trp Arg

245 250 255

Asn Pro Thr Lys Ala Gln Arg Glu Trp Gly Leu Ser Thr Tyr Ile Asp

260 265 270

Ala Leu Lys Asp Thr Ile Asp Val Val Leu Lys Ile Thr Gly Ser Lys

275 280 285

Asp Leu Asn Met Leu Gly Ala Cys Ser Gly Gly Ile Thr Thr Val Ala

290 295 300

Leu Leu Gly His Tyr Gln Ala Ile Gly Glu Asn Lys Val Asn Ala Phe

305 310 315 320

Thr Gln Met Val Thr Val Leu Asp Phe Asn Leu Asp Thr Gln Val Ala

325 330 335

Leu Phe Ala Asp Glu Gln Thr Leu Glu Ala Ala Lys Arg Arg Ser Tyr

340 345 350

Gln Ala Gly Val Leu Glu Gly Lys Asp Met Ala Lys Val Phe Ala Trp

355 360 365

Met Arg Pro Asn Asp Leu Ile Trp Asn Tyr Trp Val Asn Asn Tyr Leu

370 375 380

Leu Gly Asn Glu Pro Pro Ala Phe Asp Ile Leu Tyr Trp Asn Asn Asp

385 390 395 400

Thr Thr Arg Leu Pro Ala Ala Phe His Gly Glu Leu Val Glu Met Phe

405 410 415

Lys Thr Asn Pro Leu Thr Arg Pro Asn Ala Leu Glu Val Cys Asp Thr

420 425 430

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435 440 445

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450 455 460

Leu Leu Gly Gly Lys Cys Glu Phe Val Leu Ser Asn Gly Gly His Ile

465 470 475 480

Lys Ser Ile Leu Asn Pro Pro Gly Asn Pro Lys Ala Arg Phe Ser Thr

485 490 495

Ser Ser Asp Met Pro Ala Asp Pro Lys Val Trp Leu Glu Asn Ala Thr

500 505 510

Lys His Ala Asp Ser Trp Trp Leu His Trp Gln Gln Trp Ile Gly Glu

515 520 525

Arg Ser Gly Lys Thr Lys Lys Ala Asn Phe Thr Leu Gly Asn Lys Ala

530 535 540

Phe Pro Ala Gly Glu Ala Ala Pro Gly Thr Tyr Val His Glu Arg Gly

545 550 555 560

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Arg Lys Val Pro Ile Ile

565 570 575

Thr Ala Asp Glu Ala Ala Lys Leu Ile Lys Asp Gly Asp Thr Val Thr

580 585 590

Thr Ser Gly Phe Val Gly Asn Ala Ile Pro Glu Ala Leu Asp Arg Ala

595 600 605

Val Glu Lys Arg Phe Leu Glu Thr Gly Glu Pro Lys Asn Ile Thr Tyr

610 615 620

Val Tyr Cys Gly Ser Gln Gly Asn Arg Asp Gly Arg Gly Ala Glu His

625 630 635 640

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645 650 655

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675 680 685

Ser His Lys Pro Gly Val Phe Thr Lys Val Gly Ile Gly Thr Phe Ile

690 695 700

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705 710 715 720

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785 790 795 800

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Glu Glu Gly Ile Val Asp Phe Met Thr Leu Thr Ala Glu Ser Gly Ala

885 890 895

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900 905 910

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915 920 925

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945 950 955 960

Gly Phe Ile Asn Ile Thr Gln Asn Thr Pro Lys Val Phe Phe Cys Gly

965 970 975

Thr Phe Thr Ala Gly Gly Leu Lys Val Lys Ile Glu Asp Gly Lys Val

980 985 990

Ile Ile Val Gln Glu Gly Lys Gln Lys Lys Phe Leu Lys Ala Val Glu

995 1000 1005

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1010 1015 1020

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1025 1030 1035 1040

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1045 1050 1055

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1060 1065 1070

Ile Lys Leu Met Asp Ala Ala Leu Phe Ala Glu Gly Leu Met Gly Leu

1075 1080 1085

Lys Glu Met Lys Ser

1090

Claims (10)

1.一种从乳酸合成纯聚乳酸的大肠杆菌工程菌，其特征在于：所述大肠杆菌工程菌构建了由丙酰辅酶A转移酶突变体基因和聚羟基脂肪酸酯合成酶突变体基因融合表达构成的聚乳酸合成途径。

2.根据权利要求1所述的从乳酸合成纯聚乳酸的大肠杆菌工程菌，其特征在于：所述编码丙酰辅酶A转移酶的基因为来自丙酸梭菌Clostridium propionicum的突变体，编码聚羟基脂肪酸酯合成酶的基因为来自食树脂假单孢菌Pseudomonas resinovorans的突变体。

3.根据权利要求2所述的从乳酸合成纯聚乳酸的大肠杆菌工程菌，其特征在于：所述的丙酰辅酶A转移酶和野生型相比包含三个氨基酸突变，分别为V193A、D345E、Y366F，由Pct(AEF)表示；聚羟基脂肪酸酯合成酶和野生型相比包含七个氨基酸突变，分别为Q116D、E130D、Q272D、S325T、T454S、S477G、Q481K，由PhaC(DDDTSGK)表示。

4.根据权利要求1所述的从乳酸合成纯聚乳酸的大肠杆菌工程菌，其特征在于：融合蛋白由Pct(AEF)、一个连接短肽(L)和PhaC(DDDTSGK)组合而成，由Pct(AEF)-L-PhaC(DDDTSGK)或PhaC(DDDTSGK)-L-Pct(AEF)表示。

5.根据权利要求4所述的从乳酸合成纯聚乳酸的大肠杆菌工程菌，其特征在于：Pct(AEF)-L-PhaC(DDDTSGK)的核苷酸序列经密码子优化后由序列表SEQ ID No.1所示；

PhaC(DDDTSGK)-L-Pct(AEF)的核苷酸序列经密码子优化后由序列表SEQ ID No.2所示；

Pct(AEF)-L-PhaC(DDDTSGK)编码的氨基酸序列由序列表SEQ ID No.3所示；

PhaC(DDDTSGK)-L-Pct(AEF)编码的氨基酸序列由序列表SEQ ID No.4所示。

6.根据权利要求1所述的从乳酸合成纯聚乳酸的大肠杆菌工程菌，其特征在于：所述大肠杆菌工程菌通过敲除宿主大肠杆菌的醇醛脱氢酶的编码基因adhE获得。

7.根据权利要求6所述的从乳酸合成纯聚乳酸的大肠杆菌工程菌，其特征在于：所述宿主大肠杆菌包括Escherichia coliBL21、MG1655、JM109、DH5α、TOP10、HB101、DH10B或野生型大肠杆菌。

8.根据权利要求1所述的从乳酸合成纯聚乳酸的大肠杆菌工程菌，其特征在于：所述聚乳酸合成途径中编码该途径中所有基因的载体为pTrc99A系列表达载体、pSTV28系列表达载体、pET21系列表达载体或pBR322系列载体中的一种或几种；增强该途径中所有基因的启动子为trc、T7、lac、trp、tac、λPL启动子中的一种或几种。

9.权利要求1～8任一项所述的从乳酸合成纯聚乳酸的大肠杆菌工程菌在生产聚羟基脂肪酸酯或聚乳酸中的一种或2种化合物方面的应用。

10.一种生产聚乳酸的方法，其特征在于：将大肠杆菌工程菌株MG1655ΔadhE：pT-PhaC(DDDTSGK)-L-Pct(AEF)接种到发酵培养基中培养，在发酵过程中限制空气进入，消耗碳源，生产聚乳酸，发酵温度为25-38℃；发酵体系的pH值为3.4-7.0；发酵培养基中的碳源为甘油、葡萄糖和淀粉中的一种或几种；发酵培养基中的氮源为酵母粉、蛋白胨、氨水、铵盐和尿素中的一种或几种。

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