CN101457218A - 一类具有蛋白质降解活性的聚乳酸降解酶 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一类具有蛋白质降解活性的聚乳酸降解酶，由无枝酸菌属和拟无枝酸菌属的菌种发酵纯化制得；所述酶包括聚乳酸降解酶I、聚乳酸降解酶II和聚乳酸降解酶III；其中所述聚乳酸降解酶I包含具有N－末端氨基酸序列为IVGGGTAPTVSWGAQ的蛋白质或其突变体变异蛋白质；聚乳酸降解酶II包含具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的蛋白质或其突变体变异蛋白质；聚乳酸降解酶III包含具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的蛋白质或其突变体变异蛋白质。本发明的降解酶具有蛋白质水解活性，同时对可降解塑料聚乳酸具有高效的降解能力，不但应用于去污剂、化妆品、皮革加工等传统蛋白酶工业，而且在聚乳酸产品的循环利用、及含有可降解塑料、毛发、角质等混合垃圾的处理上也具有应用潜力。
Description
技术领域
本发明涉及一类功能性的聚乳酸降解酶，尤其涉及一类具有蛋白质降解活性的聚乳酸降解酶，属于生物技术领域。
背景技术
聚乳酸是在人们对环境和能源可持续发展的要求下应运而生的一种可降解塑料，目前已经实现了在医疗、纺织和包装产业中的大量应用，成为最具潜力的替代现有塑料的高分子材料。虽然聚乳酸具有可降解性能，但它在自然界中的降解过程比较缓慢，快速完全降解存在一定困难，因此在使用聚乳酸产品的同时，需要开发聚乳酸的降解菌株和降解酶类来加速聚乳酸废弃产品的降解与回收，并在此基础上开发废弃物处理回收系统来实现产品的物料循环，进一步推动聚乳酸产品代替现有塑料。由于聚乳酸是一种新兴的非天然存在的人工合成化合物，对其的生物酶法降解必定是由生物体内已有的酶类来实现的，因此聚乳酸降解微生物和高效降解酶类都有一定的特殊性。近年来的研究发现某些来源于微生物的特定酶类对聚乳酸具有降解作用，但这些酶的分离纯化和性质研究目前均很有限。所以，研究和开发具有微生物的聚乳酸降解酶具有重要的理论意义和实践价值。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一类具有蛋白质降解活性的聚乳酸降解酶，更具体地说是来源于无枝酸菌属(Amycolate)和拟无枝酸菌属(Amycolatopsis)的三种具有蛋白质降解活性的聚乳酸降解酶——降解酶I(Plaase1)、降解酶II(Plaase2)和降解酶III(Plaase3)；同时本发明还提供了所述聚乳酸降解酶及其制品在聚乳酸产品循环利用及其垃圾处理中的应用。
本发明所述的一类具有蛋白质降解活性的聚乳酸降解酶由无枝酸菌属和拟无枝酸菌属的菌种通过菌株发酵而获得，或由该类菌种的基因在宿主细胞中重组表达而获得。
本发明所述的一类具有蛋白质降解活性的聚乳酸降解酶为上述产酶菌株或由重组菌所产的具有蛋白质降解活性的聚乳酸降解酶的任一蛋白组分。
本发明的一类具有蛋白质降解活性的聚乳酸降解酶，包括聚乳酸降解酶I、聚乳酸降解酶II和聚乳酸降解酶III；其中：聚乳酸降解酶I包含含有N-末端氨基酸序列为IVGGGTAPTVSWGAQ的蛋白质或其突变体变异蛋白质；聚乳酸降解酶II包含具有SEQID NO：3所示的氨基酸序列的蛋白质或其突变体变异蛋白质；聚乳酸降解酶III包含具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的蛋白质或其突变体变异蛋白质。优选的是所述聚乳酸降解酶具有SEQ ID NO：3序列1-241位、30-241位氨基酸或SEQ ID NO：4的1-176位氨基酸。信息学分析显示序列中具有丝氨酸蛋白酶保守的三联体位点。
酶的N端测序结果显示三种酶的N端分别为IVGGGTAPTVSWGAQ、IVGGGNATQVYSFMV和YDVRGGDAYYINNSS，将此序列在NCBI数据库中进行同源比对，发现与蛋白酶类同源性最高。
上述编码聚乳酸降解酶II的核苷酸序列plaase2，它包含显示于SEQ ID NO：1中的核苷酸序列或者含有与此序列至少80％同源性的核苷酸序列。
上述编码聚乳酸降解酶III的核苷酸序列plaase3，它包含显示于SEQ ID NO：2中的核苷酸序列或者含有与此序列至少80％同源性的核苷酸序列。
根据数据库的同源性比对发现，本发明所述SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中的序列应是新的，SEQ ID NO：1与Saccharopolyspora erythraea NRRL2338菌分泌的secretedtrypsin-like serine protease具有79％的一致性，SEQ ID NO：2与Saccharopolysporaerythraea NRRL2338菌的serine protease precursor具有70％的一致性。
其中：涉及的核苷酸序列plaase2，长度是726bp，共编码241个氨基酸残基，其中的1-87bp编码聚乳酸降解酶II的信号肽序列，88-723为成熟肽编码序列；plaase3长度为531bp，编码聚乳酸降解酶III176个氨基酸残基的成熟肽序列。
本发明所述具有蛋白质降解活性的聚乳酸降解酶的酶学特征：
本发明所述的具有蛋白质降解活性的聚乳酸降解酶，在SDS-PAGE测定时，为分子量在18.0-35.0kDa之间的任一聚乳酸降解酶组分。
本发明所述的具有蛋白质降解活性的聚乳酸降解酶为等电点≧9.1-10.0的碱性蛋白质。
进一步的，所述具有蛋白质降解活性的聚乳酸降解酶在SDS-PAGE测定时，聚乳酸降解酶I的分子量为24.0kD，聚乳酸降解酶II的分子量为19.5kD，聚乳酸降解酶III的分子量为18.0kDa；所述具有蛋白质降解活性的聚乳酸降解酶的等电点均为碱性；所述具有蛋白质降解活性的聚乳酸降解酶对聚乳酸、蛋白质或小肽底物如：N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide、N-succinyl-Gly-Gly-Phe-p-nitroanilide或N-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide均有降解活性，聚乳酸降解酶II还具有微弱的酯酶活性，但在N-succinyl-Gly-Gly-Gly-p-nitroanilide上没有活性；所述具有蛋白质降解活性的聚乳酸降解酶的蛋白酶活性和聚乳酸降解活性均受丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF的强烈抑制，但不受胃蛋白酶抑制剂和胰凝乳蛋白酶抑制剂的抑制。
本发明所述具有蛋白质降解活性的聚乳酸降解酶及其制品在聚乳酸产品循环利用及其垃圾处理中的应用。
其中：降解聚乳酸的最适酶反应温度在pH7条件下为50℃-60℃；最适酶反应pH在最适酶反应温度条件下为pH9.5-10.5，聚乳酸降解酶I和聚乳酸降解酶III在最适酶反应条件下在50℃和60℃，聚乳酸降解酶II在40℃和50℃时温度稳定性较好，保温8小时后残余酶活仍为原酶活的80％左右，在同样条件下三种酶在pH7-9之间pH稳定性较好(详见具体实施例)。
其他的，所述具有蛋白质降解活性的聚乳酸降解酶作为有效功能组分还可以在制备去污剂、化妆品中应用以及在皮革加工中应用。
具体的，如应用有效量的本发明所述具有蛋白质降解活性的聚乳酸降解酶和制剂上可接受的载体或辅料制备具有蛋白质降解活性的聚乳酸降解酶制剂；其中所述具有蛋白质降解活性的聚乳酸降解酶是指具有蛋白质降解活性的聚乳酸降解酶单一组分或多组分的纯酶制品和/或粗酶制品，和/或任一具有蛋白质降解活性的聚乳酸降解酶组分的发酵液。
生产上述具有蛋白质降解活性的聚乳酸降解酶和制备相应基因的方法。
为了分离本发明的聚乳酸降解酶，首先将产酶菌株(Amycolatopsis orientalis)在好氧条件下在营养培养基中进行培养，所说的培养基包含可同化的碳源和氮源及其它必须营养物，按现有技术组成，其中优选的是以葡萄糖为碳源，明胶或蛋白胨为有机氮源。
在培养之后，分离菌体沉淀和上清液，浓缩上清液，然后进行树脂纯化。在优选的实施例中，使用pH7.0磷酸缓冲液处理的CM Sepharose Fast Flow阳离子交换树脂、Phenyl-5PW疏水介质及Sephadex G-50 fine凝胶过滤介质进行纯化，最后在纯化的聚乳酸降解酶纯品中任选地加入防腐剂。详见具体实施例。
制备上述编码聚乳酸降解酶II和聚乳酸降解酶III的核苷酸序列的方法，步骤如下：
1.利用CTAB/NaCl法提取Amycolatopsis orientalis的基因组DNA，
2.将聚乳酸降解酶的电泳条带转印至PVDF膜上，进行蛋白的N端测序，
3.根据测序结果及蛋白酶保守的丝氨酸活性位点设计兼并引物，利用PCR技术克隆编码聚乳酸降解酶的基因的一部分，
4.再根据获得的部分基因设计引物，利用SEFA-PCR染色体步移技术克隆已知基因的上下游序列，测序后进行拼接校对，在其中得到了含有编码序列的开放阅读框架，
5.根据开放阅读框架的两端设计引物，利用PCR技术从基因组DNA中克隆该基因并测序验证，结果证明克隆到的基因序列与利用PCR和SEFA-PCR技术克隆到的基因序列完全正确。
根据上述基因制备方法，分别得到了编码聚乳酸降解酶II和聚乳酸降解酶III的基因plaase2和plaase3。
本发明提供的编码聚乳酸降解酶的基因信息，为本领域人员利用熟知的常规DNA重组技术将其转入质粒、转化宿主细胞，生产相应的聚乳酸降解酶提供了信息。
本发明涉及的聚乳酸降解菌株和聚乳酸降解酶，对蛋白质及小肽类物质具有降解作用，因此可应用于传统的蛋白酶工业，而且发明涉及的聚乳酸降解酶具有特殊的聚乳酸降解活性，因此可应用于聚乳酸产品的回收与循环加工工业，另外，根据上述聚乳酸降解酶的广底物特异性，本发明还可应用在含有聚乳酸废弃物及毛发、角质等蛋白类物质的混合垃圾的处理上。
附图说明
图1.菌株在聚乳酸唯一碳源平板上生长且形成透明水解圈的情况
图2.粗酶液与三个纯聚乳酸降解酶组分的SDS-PAGE图谱。
其中1，粗酶液；M，分子量marker；2，聚乳酸降解酶I；3，聚乳酸降解酶II；4，聚乳酸降解酶III。
图3.聚乳酸降解酶分离纯化的流程图。
其中PLAase I代表聚乳酸降解酶I；PLAase II代表聚乳酸降解酶II；PLAaseIII代表聚乳酸降解酶III。
图4.聚乳酸降解酶MALDI-TOF分析的肽指纹图谱。
其中A，聚乳酸降解酶I的肽指纹图谱；B，聚乳酸降解酶II的肽指纹图谱；C，聚乳酸降解酶III的肽指纹图谱。
具体实施方式
借助下列实施例更详细的说明本发明，但显然，本发明的范围不受限于这些实施例。
实施例1 降解菌株的筛选
将活化的东方拟无枝酸菌菌种(菌种库，市售)、环境样品富集液点种或涂布于PLA乳化平板上，30℃恒温箱内倒置培养，15-30天观察菌株的生长和透明水解圈的形成情况，筛选能够在平板上生长并形成明显透明水解圈的菌株。为防止水分蒸发，定期补水，保持潮湿的环境。筛选培养基成分及制作方法如下：
基本培养基：250mg酵母膏，1g(NH4)2SO4，100mg NaCl，200mg MgSO4·7H2O，20mgCaCl2·2H2O，10mg FeSO4·7H2O，0.5mg Na2MoO4·2H2O，0.5mg Na2WO4，0.5mg MnSO4，1.6g K2HPO4，0.2g KH2PO4蒸馏水定容至1L，自然pH。
PLA乳化平板的制备：0.1g PLA粉末溶于2ml三氯甲烷中，将所得溶液与100ml含有0.1％Plysurf A210G的基本培养基混合，混合液经超声波处理，制得PLA乳化液，75℃加热60min左右去除三氯甲烷，得到含PLA的乳化培养基，加入1.5％琼脂制得乳化平板。
经筛选获得了对聚乳酸具有高效降解能力的菌株东方拟无枝酸菌，菌株在聚乳酸唯一碳源平板上生长且形成透明水解圈的情况见图1。
实施例2 酶的纯化
Amycolatopsis orientalis采用3L的GBCS-5型生物发酵罐发酵培养，培养基为10g明胶，10g葡萄糖，2g酵母膏，5g NaCl，1.6g K2HPO4，0.2g KH2PO4，0.5g MgSO4定容至1L蒸馏水中。发酵液离心取上清得到的粗酶液，超滤浓缩后，经过CM SepharoseFast Flow阳离子交换层析，TSK-gel phenyl-5PW疏水层析，Sephadex G-50 fine分子筛层析进行分离纯化。具体地说，浓缩粗酶液用含10mM NaCl，pH7.0的20mM磷酸缓冲液透析除盐，进行CM Sepharose Fast Flow层析，电泳结果显示所得酶组分尚未分纯，将三个洗脱峰分别收集，并进行下一步分离。用硫酸铵调节上述洗脱峰收集液的盐浓度，进行TSK-gel phenyl-5PW疏水层析，硫酸铵梯度递降洗脱，分别透析层析后的蛋白峰收集液，测定其PLA降解活性。将活性蛋白TCA沉淀后进行SDS-PAGE，结果显示，其中两个活性蛋白组分已经达到了电泳纯，将其分别命名为聚乳酸降解酶II和聚乳酸降解酶III，而另一活性部分仍然还有部分小分子蛋白杂带，因此，将此活性部分收集进行Sephadex G-50 fine分子筛层析，得到了纯酶组分，命名为聚乳酸降解酶I。
综上所述，经过CM Sepharose Fast Flow阳离子交换层析，TSK-gel phenyl-5PW疏水层析和分子筛层析，获得了三个纯酶组分，分别命名为聚乳酸降解酶I，聚乳酸降解酶II和聚乳酸降解酶III。粗酶液与三个纯酶组分的电泳图谱如附图2所示，分离纯化的流程总结如附图3。
实施例3 酶的特性测定
1.酶的分子量的测定
用10％的SDS-PAGE分析纯化的降解酶组分，通过迁移率计算得到聚乳酸降解酶I、II和III的分子量分别为24.0、19.5和18.0kDa。
2.等电点测定
采用等电聚焦电泳对三个聚乳酸降解酶的等电点进行测定，电泳之后，切胶测定pH梯度，推测蛋白的等电点，同时以pI约为11的溶菌酶作对照。切胶pH梯度测定结果结合电泳图谱可以推测分离到的三种聚乳酸降解酶I、II和III的等电点均大于10，因此这三种酶均为碱性蛋白。
3.聚乳酸降解酶的N端测序
纯酶组分进行SDS-PAGE后转PVDF膜，考马斯亮蓝R250染色，将纯酶的电泳条带用氨基酸序列分析仪进行N端测序，测序结果如下：聚乳酸降解酶IIVGGGTAPTVSWGAQ；聚乳酸降解酶II IVGGGNATQVYSFMV；聚乳酸降解酶IIIYDVRGGDAYYINNSS。将三个N端测序结果在NCBI数据库中比对，PLAase I的N端显示出与来源于Amycolatopsis sp.K104-1的poly(L-lactic acid)depolymerase B具有93％的一致性；PLAase II的N端与来源于Saccharopolyspora erythraea NRRL 2338所分泌的一系列trypsin-like丝氨酸蛋白酶具有一定的66％一致性；PLAaseIII与来源Streptomyces lividans和Streptomyces coelicolor A3(2)的丝氨酸蛋白酶具有86％的一致性。
4.MALDI-TOF-PMF鉴定
纯化的酶组分进行SDS-PAGE，将目的条带切下胶内胰酶酶解，37℃反应16h后，进行激光辅助离子时间飞行质谱分析，质谱仪为AXIMA-CFRplus，SHIMADZU，选择合适的谱峰在MASCOT Peptide Mass Fingerprint数据库中进行比对分析
(www.matrixscience.com)。肽指纹图谱如附图4所示。比对结果并没有找到匹配程度较高的蛋白，暗示这三种聚乳酸降解酶可能是属于新的酶组分。同时肽指纹图谱还显示出这三个酶的酶解峰并不相同，所以，这三种酶并不是来源于同一前体的酶类，而是三个独立的酶组分。
5.聚乳酸降解酶聚乳酸降解活性的最适酶反应温度及温度稳定性
在本实验中，采用的反应时间为6h。在不同温度下测定其酶活，以最高点的酶活性为100％，以相对酶活性作图。测定结果显示：聚乳酸降解酶I，聚乳酸降解酶II和聚乳酸降解酶III的最适作用温度分别为60℃，50℃和60℃左右。
将聚乳酸降解酶I和聚乳酸降解酶III酶液分别在50℃、60℃和70℃，聚乳酸降解酶II酶液在40℃、50℃、60℃下保温0.5h、1h、2h、4h、6h、8h，以4℃保存的原酶液酶活为100％，测定保温后的残余酶活，聚乳酸降解酶I和聚乳酸降解酶III在50℃和60℃时，温度稳定性较好，保温8h后，仍然具有80％的残余酶活，而聚乳酸降解酶II在40℃和50℃时温度稳定性较好，在60℃保温8h后残余酶活会下降到原酶活的20％。
6.聚乳酸降解酶聚乳酸降解活性的最适酶反应pH及酶pH稳定性
将酶液置于pH4-11的系列缓冲液环境中，测定不同pH条件下，不同酶的聚乳酸降解活力，结果显示，降解活性在碱性条件下要高于酸性和中性条件，因此使用甘氨酸-氢氧化钠缓冲液在pH8.5-11.5的缓冲液中，集中测定碱性条件下的最适pH。将最高点的酶活定义为100％，以相对酶活作图，结果显示：聚乳酸降解酶I，聚乳酸降解酶II和聚乳酸降解酶III的最适作用pH分别为pH9.5、pH10.5和pH9.5。
将酶液置于不同pH缓冲液中4℃放置24h后，测定其降解活性，将最高点的酶活性定义为100％，以相对酶活作图，结果显示：在pH7-9期间，三种酶的pH稳定性都较好，环境过酸或过碱都会使其活性明显下降。
7.降解酶的底物特异性
分别以聚乳酸、酪蛋白、pNPC8(典型的酯酶底物)、聚羟基丁酸酯、N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide、N-succinyl-Gly-Gly-Phe-p-nitroanilide、N-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide和N-succinyl-Gly-Gly-Gly-p-nitroanilide为底物进行检测。测定结果表明，聚乳酸降解酶I，聚乳酸降解酶II和聚乳酸降解酶III对聚乳酸、酪蛋白、N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide、N-succinyl-Gly-Gly-Phe-p-nitroanilide和N-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide都具有明显的活性，而且，聚乳酸降解酶II对pNPC8还呈现微弱的降解活性。另外，虽然聚羟基丁酸酯与聚乳酸同属于生物可降解塑料，而且结构单体上也存在着一定的相似性，但三种降解酶对聚羟基丁酸酯都没有明显的降解作用。
8.蛋白酶抑制剂对聚乳酸降解酶的作用
实验使用了Phenylmethanesulfonyl fluoride(PMSF)、Aprotinin、Chymostatin、Pepstatin和EDTA等蛋白酶抑制剂，其中PMSF属于丝氨酸蛋白酶的典型抑制剂，Aprotinin属于肽类抑制剂，能够抑制丝氨酸蛋白酶的活性，Chymostatin为胰凝乳蛋白酶抑制剂，Pepstatin为酸性蛋白酶胃蛋白酶的抑制剂，EDTA为金属蛋白酶的抑制剂。分别在工作浓度下测定各种抑制剂对三种聚乳酸降解酶聚乳酸降解活性及蛋白酶活性的抑制作用。实验结果显示出，三种酶均受PMSF的强烈抑制，进一步缩小范围测定PMSF对三种酶抑制作用的IC50值，推测其均在0.05-0.5mM之间。但这三种酶不论是聚乳酸降解活性还是蛋白降解活性都不受Chymostatin、Pepstatin和EDTA的抑制，这些结果显示出我们所发现的这三种聚乳酸降解酶可能是属于丝氨酸蛋白酶家族。另外，三种降解酶的PLA降解酶活性受Aprotinin的抑制，但蛋白酶活性却不受Aprotinin的影响，这种差别可能反映了同一种聚乳酸降解酶对不同底物降解特异性的差异。
实施例4 本发明中所述基因的克隆方法
1.东方拟无枝酸菌基因组的提取
按照本领域内人员熟知的提取技术进行，参照《精编分子生物学实验指南》的细菌基因组提取方法，优选提取之前加入溶菌酶破壁。
2.PCR扩增基因的部分序列
利用降解酶N端测序结果设计兼并引物，作为上游引物；利用丝氨酸蛋白酶保守位点设计下游兼并引物。
聚乳酸降解酶II和聚乳酸降解酶III的上游兼并引物：
聚乳酸降解酶IIF1：GGYAACGCBACSCAGGT
聚乳酸降解酶IIF2(嵌套引物)：ACSCAGGTBTAYWSITT
聚乳酸降解酶IIIF1：GGCGACGCSTAYTAYATCAA
聚乳酸降解酶IIIF2AG(嵌套引物)：GACGCSTAYTAYATCAACAACAG
聚乳酸降解酶IIIF2TC(嵌套引物)：GACGCSTAYTAYATCAACAACTC
根据丝氨酸保守位点设计下游兼并引物(聚乳酸降解酶II和聚乳酸降解酶III通用)：
Rser：GGRCCRCCISWRTCRCC
PCR反应体系为：GC buffer I 25μl
10mMdNTP：1μl
10μM上游引物：2μl
10μM下游引物：2μl
基因组模板：0.5μl
pfu酶：0.5μl
ddH2O：19μl
总体积50μl
兼并引物的使用浓度与兼并度有关，一般要高于正常引物的浓度，本实验中摸索的合适引物浓度为2-4μM。
普通PCR扩增程序(聚乳酸降解酶II适用)：94℃，1min预变性后；94℃，30sec；60℃，30sec；72℃，1min；重复30个循环后，72℃延伸10min。同时做只加上游引物或下游引物的单引物对照。反应结束后，取3μl反应液在1％琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
Touch down PCR扩增程序(聚乳酸降解酶III适用)：94℃，1min预变性后；94℃，30sec；62℃，30sec；72℃，1min；重复5个循环后退火温度降低2℃再进行5个循环，依次下降，一直下降到50℃退火，结束循环，72℃延伸10min。
嵌套PCR：以上一步的PCR产物稀释50倍后为模板，使用嵌套引物进行相应的PCR反应。
PCR扩增得到的DNA片段先经过凝胶回收，然后使用T4多聚核苷酸激酶对其进行磷酸化处理；同时用限制性内切酶Sma I酶切载体pUC19，酶切后使用碱性磷酸酶对其进行去磷处理。之后将片段和载体分别纯化，16℃连接。其中涉及的回收纯化等步骤均按试剂盒说明书进行，酶的使用参照TaKaRa相应的
使用说明。
参照《分子克隆实验指南》，使用氯化钙法制备大肠杆菌DH5α的感受态细胞，将连接产物用热激法转化至DH5α的感受态细胞中，在含氨苄抗性的麦康凯琼脂平板上进行培养。挑选白色重组子，进行液体培养，提取质粒电泳检测，对明显滞后的质粒进行酶切及PCR验证，确认无误后，进行序列测定。
3.SEFA-PCR法扩增全基因序列
结合已经获得的聚乳酸降解酶II和聚乳酸降解酶III中间部分基因序列，分别设计引物如下：
聚乳酸降解酶II：3’方向 2Fsp1：GTCCGGGGCCGTCGGCACCG
2Fsp2：ACGCGGATCATCGGCTGGGG
2Fsp3：AGGGTGGCTGTGGCGNNNNNNNNNCCCTGC
5’方向 2Rsp1：AGTCGCCGTAGCAGGCGCCCGAG
2Rsp2：GGGGTTGTTGGTGCAGATCTCG
2Rsp3：GCCGCTGATGCCGAGNNNNNNNNNGTCGGA聚乳酸降解酶III：3’方向 3Fsp1：GCGCCTCGATCTGCAAGTCGGG
3Fsp2：TTCGACCACCGGCTGGACCTGC
3Fsp3：CCAAGAACCAGACCGNNNNNNNNNCCGAGG
5’方向 3Rsp1：GGGTGCCGTTGTTGATGATGCC
3Rsp2：GGCACCCAGTTGCTGTTGACCC
3Rsp3：GTGGCCGTAGTCGTTNNNNNNNNNACTGGC
SEFA-PCR程序
引物 循环次数 PCR反应条件
挑选特异且较长的SEFA-PCR片段，回收，与pMD19-T载体连接，pMD19-T带有LacZ，因此可以在IPTG+X-gal的抗性平板上进行蓝白斑筛选，挑取白色菌落培养，提质粒进行电泳检测，酶切和PCR验证后进行序列测定。
分析SEFA-PCR产物的测序结果，通过各自下游已确定序列的比对来验证获得的序列正确与否，将正确的序列拼接后进行阅读框分析，找到终止密码子，同时分析上游序列获得成熟肽基因的5’端以及信号肽，设计上下游引物以基因组为模板获得全长基因，测序后与拼接的序列进行比对，验证基因的正确性。从而得到了SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2所示的基因序列。
序列表
<110>山东大学
<120>一类具有蛋白质降解活性的聚乳酸降解酶
<141>2008-12-2
<160>4
<210>1
<211>726
<212>DNA
<213>东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)
<221>编码聚乳酸降解酶II的核苷酸序列plaase2
<222>(1)…(726)
<400>1
<210>2
<211>531
<212>DNA
<213>东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)
<221>编码聚乳酸降解酶III的核苷酸序列plaase3
<222>(1)…(531)
<400>2
<210>3
<211>241
<212>PRT
<213>东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)
<221>聚乳酸降解酶II包含的氨基酸序列
<222>(1)…(241)
<400>3
<210>4
<211>176
<212>PRT
<213>东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)
<221>聚乳酸降解酶III包含的氨基酸序列
<222>(1)…(176)
<400>4
Claims (10)
1.一类来源于无枝酸菌属和拟无枝酸菌属的菌种通过菌株发酵或来源于该类菌种的基因在宿主细胞中重组表达而获得的具有蛋白质降解活性的聚乳酸降解酶。
2.如权利要求1所述的具有蛋白质降解活性的聚乳酸降解酶，其特征是：该酶为所述产酶菌株或由重组菌所产的具有蛋白质降解活性的聚乳酸降解酶的任一蛋白组分。
3.如权利要求1或2所述的具有蛋白质降解活性的聚乳酸降解酶，其特征是：所述酶包括聚乳酸降解酶I、聚乳酸降解酶II和聚乳酸降解酶III；其中：聚乳酸降解酶I包含具有N-末端氨基酸序列为IVGGGTAPTVSWGAQ的蛋白质或其突变体变异蛋白质；聚乳酸降解酶II包含具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的蛋白质或其突变体变异蛋白质；聚乳酸降解酶III包含具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的蛋白质或其突变体变异蛋白质。
4.如权利要求3所述的具有蛋白质降解活性的聚乳酸降解酶，其特征是：所述酶在SDS-PAGE测定时，为分子量在18.0-35.0kDa之间的任一聚乳酸降解酶组分。
5.如权利要求3所述的具有蛋白质降解活性的聚乳酸降解酶，其特征是：所述酶为等电点≧9.1-10.0的碱性蛋白质。
6.如权利要求3所述的具有蛋白质降解活性的聚乳酸降解酶，其特征是：所述酶对聚乳酸、蛋白质或小肽底物如：N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide、N-succinyl-Gly-Gly-Phe-p-nitroanilide或N-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide均有活性，但在N-succinyl-Gly-Gly-Gly-p-nitroanilide上没有活性。
7.如权利要求3所述的具有蛋白质降解活性的聚乳酸降解酶，其特征是：所述酶的蛋白酶活性和聚乳酸降解活性均受丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF的强烈抑制，但不受胃蛋白酶抑制剂和胰凝乳蛋白酶抑制剂的抑制。
8.权利要求1所述具有蛋白质降解活性的聚乳酸降解酶在聚乳酸产品循环利用及其垃圾处理中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征是：降解聚乳酸的酶反应温度为50℃-60℃，酶反应pH为pH9.5-10.5。
10.一种具有蛋白质降解活性的聚乳酸降解酶制剂，其特征在于：所述酶制剂含有有效量的权利要求1所述的具有蛋白质降解活性的聚乳酸降解酶和制剂上可接受的载体或辅料；其中所述具有蛋白质降解活性的聚乳酸降解酶是指具有蛋白质降解活性的聚乳酸降解酶单一组分或多组分的纯酶制品和/或粗酶制品，和/或任一具有蛋白质降解活性的聚乳酸降解酶组分的发酵液。
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