JP5757555B2 - 新規酸性プロテアーゼ及びその用途 - Google Patents
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Description
(1) 配列番号4に示すアミノ酸配列から成るポリペプチド
(2) 配列番号4に示すアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列から成り、酸性プロテアーゼ活性を有するポリペプチド
(3) (1)又は(2)のポリペプチドのアミノ酸配列を含み、酸性プロテアーゼ活性を有するポリペプチド
(1) 配列番号4に示すアミノ酸配列から成るポリペプチド
(2) 配列番号4に示すアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列から成り、酸性プロテアーゼ活性を有するポリペプチド
(3) (1)又は(2)のポリペプチドのアミノ酸配列を含み、酸性プロテアーゼ活性を有するポリペプチド
(a) アスパラギン酸プロテアーゼである
ペプスタチンAによってプロテアーゼ活性が顕著に阻害されることから、Cap1はアスパラギン酸プロテアーゼである。
(b) 反応最適pHが5.0、安定pH範囲が2.0〜7.0
タンパク質分解反応の最適pHは5.0である。また、プロテアーゼ活性が50%以上保たれる安定pH範囲は2.0〜7.0である。
(c) 反応最適温度が30℃であり、55℃以上で速やかに失活する
(d) カルシウムイオンで活性が上昇する
1 mMのCaイオンで、プロテアーゼ活性が1.4倍程度活性化される。
(e) タンパク質分解活性に対して凝乳活性の比率が高い
乳タンパク質と接触させると乳タンパク質の凝固沈殿が観察される。チーズの製造工程で用いられるレンネットのように、乳タンパク質のミセル構造を破壊して凝固・沈殿させる活性がある。
YM ブロスにより、25℃, 48 時間培養されたCryptococcus sp. S-2株を、OD660 = 0.1 となるように YG (1% Yeast extract, 2% Glucose) 液体培地に接種して、25℃, 120 rpm で振盪培養を行った。24 時間培養後、遠心 (7,000 rpm, 20min, 4℃) を行い、上清を回収した。得られた上清を Millipore lab scale TFF システム(ミリポア社)を用いて限外濾過を行い、得られた濾液を粗酵素液とした。
アゾカゼインを基質として本酵素の比活性を求めた。活性の測定は上記Freemanらの方法に従って行なった。また、タンパク質量は、Bradford法を用いて測定した。以上から、精製酵素の比活性は、0.050 U/μgである事が判明した。
反応最適pH及び50%以上活性が安定に保たれるpH範囲を調べた結果は以下の通りであった。
最適pH:5.0
安定pH範囲:2.0〜7.0
反応最適温度及び温度による失活の条件について調べた結果は以下の通りであった。
最適温度:30℃
温度による失活の条件:55℃以上で速やかに失活する
Ca, Rb, Mn, Mg, Zn, Cu, Cd, Co, Fe, Hgイオンが本酵素の活性に及ぼす影響を調べたところ、1 mMのCaイオンで、1.44倍活性化される事が明らかになった。
ペプスタチンAによって顕著に阻害された。これにより本酵素はアスパラギン酸プロテアーゼであることが判明した。
アスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子をクローニングするために、精製したアスパラギン酸プロテアーゼのN末端アミノ酸配列を決定した。また、内部アミノ酸配列については、タンパク質分解酵素(リジルエンドペプチダーゼ)で処理し断片化した後、そのいくつかの断片につきそのアミノ酸配列を決定した。
N末端配列: GSSATIGL(配列番号5)
内部配列: TPVTSRTYYEVGTNGMTV, FPAAIDTGT, NFGSNYVGFTPAHNY(配列番号6〜8)
1.10% (W/V) 脱脂乳の調整
10g脱脂乳粉末に20mM酢酸ナトリウム緩衝液pH5.5を加え、脱脂乳溶液のpHを5.5になるまで酢酸で調整し、100mlにメスアップした。
10% (W/V) 脱脂乳を基質として用い、35℃に保温した基質5mlに酵素液0.5mlを添加し、1 時間反応させた。コントロールとして酵素液の代わりに 20 mM 酢酸ナトリウム緩衝液 (pH 5.5) を用いた。その結果、脱脂乳と酵素液の混合液のみで乳タンパク質の凝固沈殿が観察された(図2)。分解活性より乳タンパク質を凝固させる活性の比率が高く、凝乳酵素としての機能を有していることが明らかになった。
実施例1で精製したCap1によるヒトInsulin B鎖の切断パターンを調べることにより、Cap1の基質特異性を調べた。実施例1で精製したCap1を以下の組成で混合して反応液を調製した。
<HPLC 条件>
カラム : μBondasphere (ウォーターズ社製) C18、5μm (3.9μmφ x 150 mm)
移動相流速: 1.0 ml / min
検出 : Absorption of 220 nm
移動相 : A ; 10% acetonitrile / 0.1% TFA, B ; 100% acetonitrile / 0.1% TFA
B=0%→100%(直線勾配)
1) シーラカンスペプシン1及び2
Tanji M et al., 2007. Comparative Biochemistry and Physiology, Part B 146 412-420.
2) サメペプシン
Nguyen, A.D. et al., 1998. J. Biochem. 124, 287-293.
3) カメペプシンA(accession No. AAB35842)
Hirasawa, A. et al., 1996. J. Biochem.120, 407-414.
4) ヒトペプシンA(accession No. AAA60061)、ヒトペプシンC(accession No. AAA60063)
Athauda, S.B.P. et al., 2002. Protein, Peptide Lett. 9, 289-294.
5) 各種植物アスパラギン酸プロテアーゼ(Cc AP: CAL07969, Hv AP: CAA39602, Ha AP: BAA76870)
Park, H. et al., 2000. Biosci. Biotechnol. Biochem., 64 (5), 931-939.
Claims (10)
- 以下の(1)〜(3)のいずれかであるポリペプチド。
(1) 配列番号4に示すアミノ酸配列から成るポリペプチド
(2) 配列番号4に示すアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列から成り、酸性プロテアーゼ活性を有するポリペプチド
(3) (1)又は(2)のポリペプチドのアミノ酸配列を含み、酸性プロテアーゼ活性を有するポリペプチド - 配列番号4に示すアミノ酸配列又は該アミノ酸配列を含むアミノ酸配列から成る請求項1記載のポリペプチド。
- 配列番号4に示すアミノ酸配列から成る請求項2記載のポリペプチド。
- 凝乳活性をさらに有する請求項1ないし3のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 請求項1ないし4のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 配列表の配列番号1若しくは3に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド、又は該塩基配列と90%以上の相同性を有し、酸性プロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項5又は6記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
- 請求項7記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
- 化学合成されたポリペプチド、又は組換えポリペプチドである請求項4記載のポリペプチドを添加してなる凝乳用酵素組成物。
- 化学合成されたポリペプチド、又は組換えポリペプチドである請求項4記載のポリペプチドを乳タンパク質と接触させることを含む凝乳方法。
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